Molekuláris genetikai vizsgálatok jelentısége endokrin daganatok megelızésében

Átírás

1 Molekuláris genetikai vizsgálatok jelentısége endokrin daganatok megelızésében Doktori tézisek Dr. Sallai Ágnes Éva Semmelweis Egyetem Klinikai Orvostudományok Doktori Iskola Témavezetı: Dr. Rácz Károly egyetemi tanár, az MTA doktora Hivatalos bírálók: Dr. Sólyom Enikı osztályvezetı fıorvos, Ph.D. Dr. Takács István egyetemi docens, Ph.D. Szigorlati bizottság elnöke: Dr. Szabó András egyetemi tanár, az MTA doktora tagjai: Dr. Péter Ferenc egyetemi tanár, az MTA doktora Dr. Siklósi György egyetemi tanár, az MTA doktora Budapest, 2009

2 BEVEZETÉS Dysgenetikus gonadok jelenléte esetén, így Turner-szindrómában (TS) is, az Y- kromoszómaszekvencia hordozása fokozott veszélyt jelent gonad neoplasia kialakulására. Ha Y-kromoszómaanyag csak a sejtek néhány százalékában van jelen, akkor hagyományos cytogenetikai analízissel, kevés metafázist vizsgálva nem mindig mutatható ki. Számos nemzetközi közleményben hangsúlyozzák a molekuláris biológiai vizsgálatok alkalmazásának jelentıségét a rejtett Y- kromoszómaszekvencia szőrésére. Értekezésemben beszámolok a hazai TS betegek munkacsoportunk által kifejlesztett szemikvantitatív real-time PCR módszerrel történt vizsgálati eredményérıl. Dolgozatom második részében egy agresszív daganatos betegség, a medullaris pajzsmirigy carcinoma (MTC) örökletes formájának jellegzetességeit, megelızési lehetıségét tekintem át egy érintett család több generációját elemezve. A multiplex endokrin neoplasia (MEN) szindróma 2-es típusában az autoszomális domináns módon öröklıdı daganatokat a RET protoonkogén csírasejtes mutációi okozzák. Az irodalmi adatok szerint a molekuláris genetikai vizsgálat bevezetése elıtt, a klinikai tünetek alapján a betegek átlagéletkora 33 év volt a MEN2A kórkép diagnózisának felállításakor, az ezredfordulóra a széleskörő prospektív szőrésekkel már ötéves kor elıtt, legtöbbször még tünetmentes állapotban igazolódik a szindróma. Hazánkban is elérhetı a RET protoonkogén mutációanalízise, lehetséges az érintett betegek családtagjainak genetikai szőrése, és a génhibát hordozó családtagokban a MTC nagy kockázata miatt a nemzetközileg javasolt preventív thyreoidectomia elvégzése. A legagresszívebb MTC MEN2B szindrómában fordul elı. Ebben a tünetegyüttesben gyakori a RET protoonkogén de novo mutációja, ugyanakkor a fenotípus jellegzetes: marfanoid alkat, vaskos ajkak és szemhéjak, a nyelven 2

3 neuromák elıfordulása. A szembetőnı megjelenés ellenére gyakran késik a diagnózis, és emiatt jelentıs mértékben csökken a betegek túlélési esélye. A fenotípus megfigyelésének, értékelésének fontosságát két MEN2B szindrómában szenvedı tinédzser beteg kórtörténetének bemutatásával ecsetelem. A nem autoimmun primer hyperthyreosist okozó betegség molekuláris genetikai vizsgálattal igazolt sporadikus, illetve herediter formáiról 1994 óta jelennek meg közlemények. A kórképet a TSH-receptor (TSHR) gén csírasejtes aktivációs mutációja okozza. A megnagyobbodott pajzsmirigyben multiplex adenomák alakulhatnak ki. Munkám harmadik részében egy nem autoimmun primer hyperthyreosisban szenvedı betegünk kórtörténetét ismertetem, akinek a genetikai vizsgálatát munkacsoportunk 2008-ban végezte el vérmintából és paraffinba ágyazott pajzsmirigyszövetbıl. Az eset kapcsán összegyőjtöttem és elemeztem a nemzetközi közleményekben korábban megjelent esetek klinikai jellemzıit. CÉLKITŐZÉSEK Munkám során elsısorban azokat az endokrin daganatokat vizsgáltam, amelyek kialakulása profilaktikus mőtéttel megelızhetı. Célkitőzéseimet az alábbi 9 pontban fogalmaztam meg: Az irodalmi adatok szerint Y-kromoszómát vagy annak egy részét tartalmazó, hibásan differenciálódott gonadban gyakran malignus tumor képzıdik, aminek a valószínősége az életkorral elırehaladva növekszik. Gonad dysgenesis a leggyakrabban Turner-szindrómában fordul elı, ezért vizsgálataim elsı részében a következı kérdésekre kerestem választ: 3

4 1. Hazai TS betegek körében milyen arányban fordul elı teljes vagy részleges Y-kromoszómafragmentum hagyományos cytogenetikai módszerrel történı karyotípus meghatározáskor? 2. A Semmelweis Egyetem II. sz. Gyermekklinika és a Szegedi Lombikbébi Alapítvány Molekuláris Genetikai Laboratóriumának kooperációjában kidolgozott aspecifikus DNS-kötı fluoreszcens festéket alkalmazó real-time PCR alapú módszer alkalmas-e az irodalomban és a Klinikán használt FISH és a hagyományos PCR-t követı agaróz gélelektroforézissel történı detektálás kiváltására? 3. Hogyan módosul a vizsgált TS betegek körében az Y-kromoszómaanyag elıfordulási aránya, ha molekuláris biológiai módszert is alkalmazunk a rejtett Y-kromoszóma DNS szekvencia kimutatására? 4. Y-kromoszómaanyagot hordozó TS betegekben észlelhetı-e gonadoblastoma? 5. Az eltávolított gonadokból nyert DNS mintákban milyen arányban található Y-kromoszómaanyag, és ez hogyan viszonyul a perifériás vérmintában észlelt arányhoz? Betegség-okozó RET mutációt hordozó családtagoknál a nemzetközi ajánlásoknak megfelelıen preventív thyreoidectomia javasolt, mert ezáltal jelentıs mértékben javulhatnak az életkilátásaik. 6. Dolgozatom célkitőzése volt, hogy bemutassam a gyermekendokrinológus munkáját a familiáris MTC kialakulásának megelızésében egy a RET gén V804M mutációját hordozó család negyedik generációjának gondozási feladatai kapcsán. 7. Munkámban célul tőztem ki, hogy a Semmelweis Egyetem II. sz. Gyermekklinikán felismert és gondozott MEN2B szindrómás betegek 4

5 kórtörténetének elemzésével felhívjam a figyelmet a betegségre jellemzı specifikus tünetekre, valamint a korai diagnózis fontosságára. Munkám harmadik témájaként a csecsemı- és gyermekkori primer hyperthyreosis hátterében álló egyik ritka kórkép, a TSH-receptor (TSHR) gén csírasejtes aktivációs mutációja következtében kialakult hyperthyreosis diagnosztikai és terápiás vonatkozásait dolgoztam fel az elsı, genetikai vizsgálattal is alátámasztott hazai eset bemutatásával, az alábbi célokkal: 8. Igazolható-e a csecsemıkorban kialakuló nem autoimmun primer hyperthyreosis hátterében familiáris kórkép, amely szükségessé teheti az érintett család számára a genetikai tanácsadást? 9. A TSH-receptor gén mutációkhoz társuló primer hyperthyreosis sporadikus és familiaris formái eltérnek-e a klinikai tünetek megjelenési idejében, ezek súlyosságában, a diagnózis felállításának idejében és a követési idı során alkalmazott kezelések eredményességében? BETEGEK ÉS MÓDSZEREK Turner-szindrómás betegek A klinikai tünetek alapján cytogenetikai vizsgálattal igazolt TS betegekrıl kérdıív alapján győjtöttem adatokat a hazai gyermekendokrin centrumok segítségével. Vizsgálatomba 130 beteget vontam be, életkoruk egy hónapos kortól húszéves korig terjedt. A betegektıl DNS izolálás céljából perifériás vérmintákat gyüjtöttünk Y-kromoszóma DNS szekvencia vizsgálatára. Munkámat a Semmelweis Egyetem Regionális, Intézményi Tudományos és Kutatásetikai Bizottsága jóváhagyta, TUKEB szám: 11/

6 MEN2A szindrómás család gyermekkorú tagjai Egy a RET gén V804M mutációját hordozó család negyedik generációjának hét gyermekkorú (2 hó 9,2 év) tagját vizsgáltam. Közülük egy 6,7 éves fiú háziorvosi beutalóval obesitas, hypothyreosis gyanúja miatt jelentkezett. Az anamnézis felvétele során derült ki édesapja örökletes betegsége, ezt követıen felállítottam a családfát, majd megszerveztem a vérrokon gyerekek genetikai szőrıvizsgálatát. A gyermekek anamnézisében említésre méltó betegség nem szerepelt, az elsı endokrinológiai szakvizsgálatukon panaszmentesek voltak. MEN2B szindrómás betegek Az 1. beteg vontatott ütemő szomatikus fejlıdése kisded korában tőnt fel. Hatéves korától haspuffadásra, recidiváló köldök körüli hasfájásra, idınként jelentkezı hasmenésre panaszkodott. Gasztroenterológiai kivizsgálás felvetette Crohn-betegség lehetıségét. Multiplex neurinomák okozta macroglossia és gingiva hypertrophia miatt több szájsebészeti plasztikai mőtéten, valamint fogszabályozáson is átesett. Echocardiographiás vizsgálat a szív mitrális billentyőjének enyhe prolapsusára derített fényt. Klinikánk genetikai szakrendelésére a több szervet érintı rendellenességei miatt tizenhét éves korában utalták. A fiatalember elsı klinikai vizsgálati státuszából említésre méltó viszonylagos magassága és sovány testalkata. A kéz ujjai hosszabbak, a gerincen enyhe kypho-scoliosis, valamint pectus excavatum is észlelhetı, azaz a Marfan-szindrómához hasonló megjelenéső. Az arcon enyhe minor anomáliák: vaskos szemöldökök és ajkak. A fogíny hyperplasiás, a nyelv megnagyobbodott, a papillák kiemelkednek. Összegezve: a marfanoid alkat, a nyálkahártya neuromák és a gastrointestinalis tünetek (bél-ganglioneuromatosis okozta?) alapján MEN2B szindróma volt valószínősithetı. A 2. beteget a nyakán észlelt kemény göb miatt tízéves korában utalta a háziorvosa endokrin szakrendelésre. A jó általános állapotú leány elsı vizsgálatakor 6

7 testmagassága és testtömege egyaránt pc között volt. Vaskos ajkakat, a nyelvén kiemelkedı papillákat, a pajzsmirigy jobb lebenyében kemény göböt észleltünk. A pajzsmirigygöb aspirációs cytológiai vizsgálata MTC-t valószínősített. A nem autoimmun primer hyperthyreosisban szenvedı beteg Az 1991-ben született fiú tíz hónapos korában thyreotoxikus krízis miatt került endokrin gondozásba. Folyamatos thyreosztatikus kezelést igényelt, de a szérumából pajzsmirigy autoantitesteket nem lehetett kimutatni. Tizenegy éves korában a trachea kompresszióját okozó golyva miatt szubtotális thyreoidectomia történt. A mőtét után két hónappal hyperthyreosisa kiújult, folytatni kellett a gyógyszeres kezelést. Tizenöt éves korában a recidív strúma miatt újra légzési nehezítettsége jelentkezett, ezért az irodalmi ajánlásoknak megfelelıen radioaktív jódkezelésre került sor. Azóta euthyreotikus, serdülése fiziológiás ütemben lezajlott. Jó általános állapotú és átlagos intelligenciájú. Trachea kompresszióra utaló tünete nem volt, a korábban kiújult golyvája részben visszahúzódott. Molekuláris biológiai vizsgálatok Az Y-kromoszóma DNS szekvencia vizsgálata a Semmelweis Egyetem II. sz. Gyermekklinika és a Szegedi Lombikbébi Alapítvány Molekuláris Genetikai Laboratóriumának kooperációjában kidolgozott aspecifikus DNS-kötı fluoreszcens festéket alkalmazó real-time PCR (RT-PCR) alapú módszerrel történt. A vizsgálatokhoz a gyermekek szülei, illetve tízéves kor fölött a betegek is írásos beleegyezésüket adták. A betegektıl 2 ml-es EDTA-val alvadásgátolt vérvételi csıbe perifériás vérmintát vettünk. A fehérvérsejtekbıl standard kit segítségével (QIAamp DNA Blood Midi Kit, Qiagen Inc, Hilden, Germany) genomikus DNS-t izoláltunk. A gonadectomián átesett betegek paraffinba ágyazott gonadszövetébıl QIAmp Tissue Kit (Qiagen Inc.) alkalmazásával szintén DNS-t szeparáltunk. A 7

8 DNS mintákat a felhasználásig 80ºC-on tároltuk. A DNS mintákból 4 Y specifikus szekvencia szőrése történt. A rövid karon az SRY és a TSPY1 régiót, a hosszú karon pedig a DDX3Y és a HSFY1 régiókat amplifikáltuk kétszálú DNS-hez kötıdı fluoreszcens festék (SYBRGreen) jelenlétében. A specifikus primer kötést BLAST search tool programmal analizáltuk ( BLAST/). Pozitív kontroll a β-actint kódoló gén volt. A géntermékek kimutatására valós idejő PCR reakciót alkalmaztunk és LightCycler készüléket használtunk (Roche Diagnostics GmbH, Mannhein, Germany). A PCR termékeink specificitásának igazolására a PCR-hez felhasznált primerek mindegyikével kétirányú szekvenciaanalízist végeztünk. A PCR reakció kivitelezéséhez PE9600 Thermal Cycler (Perkin Elmer, Waltham, Mass., USA) készüléket használtunk. A PCR termékeket QIAquick PCR Purification Kit -tel (Qiagen Inc.) tisztítottuk. A szekvenálási reakciót BigDye Terminator v 3.1 Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) felhasználásával, PE9600 Thermal Cycler készüléken végeztük. A szekvenciák detektálása ABI PRISM 3130xl Genetic Analyzer-rel (Applied Biosystems) történt. A RET protoonkogén (14-es, 16-os exon) mutáció vizsgálata a Semmelweis Egyetem II. sz. Belgyógyászati Klinika Molekuláris Endokrinológiai Laboratóriumában történt. A vizsgálatokhoz a gyermekek szülei írásos beleegyezésüket adták. A gyerekektıl, illetve a korábban még nem vizsgált szülıktıl két, egyenként 9 ml-es EDTA-val alvadásgátolt vérvételi csıbe perifériás vérmintát vettünk. A fehérvérsejtekbıl standard kit-ek segítségével (Boehringer Mannheim Corporation, Indianapolis, IN, USA, illetve QIAamp DNA Blood MiniKit, Qiagen, CA, USA) genomikus DNS-t izoláltunk. A DNS mintákat a felhasználásig 80ºC-on tároltuk. A vérmintából DNS szeparálást követıen a MEN2A szindrómás család gyermekkorú tagjai esetében a RET protoonkogén 14-8

9 es exonját PCR-rel amplifikáltuk, majd bidirekcionális direkt szekvenálásssal analizáltuk. A fenotípusuk alapján MEN2B szindrómásnak vélt betegeknél a RET protoonkogén 16-es exonját amplifikáltuk PCR-rel, majd bidirekcionális direkt szekvenálásssal analizáltuk. A PCR reakcióhoz használt primerek szekvenciái, valamint a molekuláris biológiai protokollok a Semmelweis Egyetem II. sz. Belgyógyászati Klinika Molekuláris Endokrinológiai Laboratórium korábbi közleményeiben megtalálhatóak. A TSHR gén mutáció vizsgálata a Semmelweis Egyetem II. sz. Belgyógyászati Klinika Molekuláris Endokrinológiai Laboratóriumában történt a beteg és szülei vérébıl (QIAamp Blood Kit), illetve paraffinba ágyazott pajzsmirigyszövetbıl (QIAmp Tissue Kit) szeparált DNS-bıl. A vizsgálatokhoz a beteg és szülei írásos beleegyezésüket adták. A humán TSHR gén mutációs hot spotjaként ismert 10-es exon amplifikálására került sor öt primer szettel, amelyeket a Primer3 software segítségével terveztünk. A PCR amplifikációt követıen a kétirányú DNS szekvenálás ABI Prism 3130 Genetic Analyserrel történt. EREDMÉNYEK Az aspecifikus DNS-kötı fluoreszcens festéket alkalmazó RT-PCR alapú módszer analitikai jellemzıi Az RT-PCR hasznos és megbízható módszer kis mennyiségő DNS specifikus kimutatására. Szenzitivitása megegyezik a hagyományos PCR eljárással Egyszerősége, gyorsasága, költséghatékonysága tömegszőrésre is alkalmassá teszi. 9

10 Az Y-kromoszómaanyag hígítási sorozatát megvizsgálva azt találtuk, hogy saját módszerünkkel Y specifikus termék kimutatása férfi és nıi DNS minta elegybıl a férfi DNS minta 1:1000 arányú hígításáig lehetséges. A gyakorlatban ez azt jelenti, hogy a vizsgáló módszerünk szenzitivitása 5 pg DNS felhasználásával 100 %, (a vizsgálat pozitív, ha az Y-kromoszómafragmentum a sejtek minimum 0,1%-ában jelen van). Módszerünk specificitása is 100%, mivel a RT-PCR során kapott termékek szekvenciája minden esetben megegyezett az NCBI és GeneBank-ban tárolt referencia szekvenciákkal. A TS betegek Y-kromoszómaanyag hordozása A hagyományos cytogenetikai módszerrel történı karyotípus meghatározáskor a 130 TS beteg közül 37 esetben fordult elı mozaicizmus, és közülük három esetben derült fény Y-kromoszómaanyag hordozásra. RT-PCR analízissel további hat, azaz összesen kilenc esetben tudtunk Y-kromoszóma DNS szekvenciát kimutatni a perifériás vérmintából. Ezen betegek klinikai tünetei nem különböznek a többi TS beteg morfológiai anomáliáitól, illetve belszervi rendellenességeitıl, virilizációra utaló tüneteik sincsenek. A kilenc Y-pozitív betegnél a szakmai ajánlásnak megfelelıen profilaktikus gonadectomiára került sor. Egy klinikailag teljesen tünetmentes ötéves leánynál az eltávolított gonadokban kétoldali gonadoblastoma igazolódott. Három beteg paraffinba ágyazott szövettani mintáiból sikerült a gonadalis DNS szeparálása. Ezen minták RT-PCR analízisének az eredménye szerint az egyes betegek gonadjában 100, 30, illetve 10%-os volt az Y-kromoszóma DNS szekvencia elıfordulási gyakorisága, ugyanakor a perifériás vérmintáikban 36, 52, illetve 36%-os volt az Y-kromoszómaanyag hordozása. 10

11 A MEN2A szindrómás család gyermek tagjainak molekuláris genetikai és klinikai vizsgálati eredménye A RET protoonkogén 14-es exonjában az egyenesági rokonban kimutatott heterozigóta V804M mutációt hét gyermek közül kettınél tudtuk igazolni. Esetükben a klinikai, a hormonális, illetve a képalkotó vizsgálatok nem utaltak pajzsmirigy betegségre. Mindkettejüknél megtörtént a preventív thyreoidectomia. A 2,5 éves kislány eltávolított pajzsmirigyében malignitásra utaló eltérés nem volt, de a 9,3 éves leány pajzsmirigyének kórszövettani vizsgálata során mindkét lebenyt érintı, több gócú, diffúz és noduláris C-sejtes hyperplasiát diagnosztizáltak. A MEN2B szindrómás betegek molekuláris genetikai és klinikai vizsgálati eredménye Mindkét, nem vérrokon beteg esetében a molekuláris genetikai vizsgálat igazolta a feltételezett RET-protoonkogén 16-os exon M918T mutáció heterozigóta formájú meglétét. Egyik gyermek szülei sem hordozták a vizsgált mutációt. A hormonális és képalkotó vizsgálatok mindkét beteg esetében MTC-re utaltak. Mindkettejüknél totalis thyreoidectomia és regionalis (paratracheális) lymphadenectomia történt. A hisztológiai lelet a környezı szöveteket is infiltráló MTC-t és nyirokcsomó metasztázisokat igazolt. A fiú beteg elsı mőtétje után a kezdeti magas plazma calcitonin szint alig csökkent, ezért 4 hónap múlva kétoldali módosított radikális nyaki nyirokcsomólánc kiirtásra került sor. A beteg így sem vált teljesen tumormentessé, a 2. operáció után két évvel plazma calcitonin szintje emelkedik. A leány beteg kétoldali nyaki blokk-dissectiójára emelkedı plazma calcitonin szint miatt az elsı mőtét után egy évvel került sor, de ı sem vált tumormentessé. Plazma calcitonin szintje a 2. mőtét után két évvel újra jelentıs mértékben emelkedett. Phaeochromocytoma irányába végzett szőrıvizsgálatok mindkét betegünknél ismételten negatívak. 11

12 A nem autoimmun primer hyperthyreosisban szenvedı beteg molekuláris genetikai vizsgálati eredménye A csecsemıkora óta nem autoimmun primer hyperthyreos miatt gondozott beteg vér- és pajzsmirigyszövet mintájából igazoltuk a TSHR gén aktiváló mutációját. Kimutattuk, hogy a 10-es exonban heterozigóta formában az pozícióban adenin citozin báziscsere (ATC-CTC) történt, ami fehérje szinten a 630. kodonnak megfelelıen izoleucin helyett leucin (I630L) cserével jár. Elvégeztük a család genetikai vizsgálatát is, amelynek során igazoltuk, hogy a szülık egyike sem hordozza ezt a mutációt, tehát a betegben a mutáció de novo jelentkezett. KÖVETKEZTETÉSEK 1. Megállapítottam, hogy hazai Turner-szindrómás betegek körében hagyományos cytogenetikai analízissel végzett karyotípus meghatározás 130-ból három esetben, azaz 2,3%-ban mutatott ki teljes vagy részleges Y- kromoszómafragmentumot. 2. Kimutattam, hogy a Semmelweis Egyetem II. sz. Gyermekklinika és a Szegedi Lombikbébi Alapítvány Molekuláris Genetikai Laboratóriumának kooperációjában kidolgozott aspecifikus DNS-kötı fluoreszcens festéket alkalmazó real-time PCR alapú módszer a hagyományos PCR-hoz hasonló specificitású, de annál egyszerőbb, gyorsabb és költséghatékonyabb eljárás. Az új módszer alkalmas a FISH és a hagyományos PCR-t követı agaróz gélelektroforézissel történı detektálás kiváltására. 3. Megállapítottam, hogy a vizsgált Turner-szindrómás betegek körében az Y-kromoszómaanyag elıfordulási aránya 2,3%-ról 6,9%-ra emelkedett, ha 12

13 molekuláris genetikai módszert is alkalmaztunk a rejtett Y-kromoszóma DNS szekvencia kimutatására. 4. Kimutattam, hogy az Y-kromoszómaanyagot hordozó TS betegek között egy esetben (1/9=11%) fordult elı gonadoblastoma. 5. Az eltávolított gonadokból három beteg esetében sikerült gonadalis DNS-t nyerni. Kimutattam, hogy az egyik beteg gonadjának minden sejtjében elıfordult Y-kromoszómaanyag, a másik beteg gonadjában 30%-os, a harmadik beteg gonadjában 10%-os volt az Y-kromoszóma DNS szekvencia elıfordulási gyakorisága. A perifériás vérminták Y-kromoszóma mozaicizmus arányával összevetve megállapítottam, hogy a három vizsgált gonadminta közül két esetben a gonadok kisebb arányban tartalmaztak Y-kromoszómafragmentumot, míg egy esetben nagyobb arányban fordul elı Y-kromoszómaanyag a gonadsejtekben, mint a perifériás lymphocyta-tenyészetben. 6. A RET gén V804M mutációját hordozó MEN2A szindrómás család kórtörténetének elemzésével bemutattam a gyermekendokrinológus munkáját a familiáris MTC kialakulásának megelızésében. Rámutattam arra, hogy ha tudomásunkra jut egy gyermek családjában pajzsmirigy neoplasia elıfordulása, mielıbb tisztázni kell a hisztológiai diagnózist, és amennyiben MTC-re derül fény, genetikai tanácsadást követıen okvetlenül indokolt a családtagok mielıbbi RET protoonkogén mutációanalízise. A bemutatott családban a genetikai szőrıvizsgálat a legfiatalabb korosztályban (negyedik generáció) két leánynál igazolta a mutáns gén hordozását, esetükben megtörtént a profilaktikus thyreoidectomia, ezáltal jelentıs mértékben javulhatnak az életkilátásaik, valamint a mutációt nem hordozó hét gyermek mentesül a további orvosi vizsgálatok alól. 7. A Semmelweis Egyetem II. sz. Gyermekklinikán felismert és gondozott két nem vérrokon MEN2B szindrómás beteg kórtörténetének elemzésével felhívtam a figyelmet a betegségre jellemzı specifikus tünetekre, valamint a korai 13

14 diagnózis fontosságára. Marfanoid alkat, vaskos ajkak és szemhéjak, nyelven észlelhetı nyálkahártya neuromák, illetve gasztrointesztinális panaszok esetén gondolni kell ennek a ritka szindrómának a lehetıségére. A késın felállított diagnózis nagymértékben csökkenti betegeink életkilátásait. 8. Kimutattam, hogy csecsemıkorban kialakult nem autoimmun primer hyperthyreosisban szenvedı betegünknél a TSHR gén de novo csírasejtes mutációja (I630L) sporadikus megjelenéső betegséget okozott. A beteg szülei a mutációt nem hordozták, de a betegség autoszomális domináns módon történı öröklıdése miatt, a jövı generáció érdekében, a család számára genetikai tanácsadás szükséges. 9. A TSH receptor gén mutációhoz társuló örökletes primer hyperthyreosis szakirodalomban közölt klinikai jellemzıinek és kórlefolyásának elemzése alapján megállapítottam, hogy a kórkép a megjelenési életkort, a súlyosságot, illetve a diagnózis felállítási idejét illetıen is heterogén, a sporadikus és familiaris esetek közötti különbség azonban kismértékő. A 14 sporadikus esetben már csecsemıkorban felállították a hyperthyreosis diagnózisát, ezzel szemben a familiaris esetek többségében (28 probandus közül 18-nál) a betegség klinikai tünetei egyéves kor után jelentek meg. A sporadikus formákban a klinikai tünetek megjelenése után nyolc betegnél azonnal, hat esetben pedig legkésıbb nyolc hónappal a tünetek jelentkezése után hormonális vizsgálatokkal is bizonyították a hyperthyreosis fennállását. A familiaris formák probandusait vizsgálva azt találtam, hogy nyolc betegnél több mint két év telt el a klinikai tünetek megjelenési ideje és a hyperthyreosis diagnózisának megállapítása között. Feltételezhetı, hogy ezeknél a betegeknél enyhébb formában jelentkezett a kórkép. A betegség kezelését illetıen megállapítottam, hogy a hyperthyreosis a thyreosztatikus kezelésre egy idı után refrakterré válik, a részleges thyreoidectomia után is gyakori a relapszus, ezért a minél korábbi totalis thyreoidectomia a helyes eljárás, és a mőtétet követıen megfontolandó a radioaktív jódkezelés alkalmazása. 14

15 SAJÁT PUBLIKÁCIÓK JEGYZÉKE A disszertációhoz kapcsolódó közlemények: Sallai Á, Ugocsai P, Halász Z, Hosszú É, Ságodi L, Erhardt É, Kozári A, Niederland T, Szabó J, Sólyom J, Dobos M, Fekete Gy. (2006) Y-kromoszóma DNS-szekvenciáinak szőrése Turner-szindrómában. Gyermekgyógyászat, 57: Sallai Á, Hosszú É, Gergics P, Rácz K, Fekete Gy. (2008) Orolabial signs are importent clues for diagnosis of the rare endocrine syndrome MEN 2B. Presentation of two unrelated cases. Eur J Pediatr, 167: IF: 1,416 (A Magyar Endokrinológiai és Anyagcsere Társaság Pajzsmirigy Szekció Henning Díja 2008, a legjobb 2007-ben megjelent pajzsmiriggyel foglalkozó hazai közlemény) Sallai Á, Igaz P, Patócs A, Gergics P, Rácz K, Fekete Gy. (2008) Profilaktikus thyreoidectomia gyermekkorban. Gyermekgyógyászat, 59: Sallai Á, Hosszú É, Gergics P, Rácz K, Fekete Gy. (2009) Ajak- és nyelvelváltozások egy ritka endokrin szindróma fontos jelei. (Kivonatos ismertetés) LAM, 19: 112. Sallai Á, Sólyom J, Dobos M, Szabó J, Halász Z, Ságodi L, Niederland T Kozári A, Bertalan R, Ugocsai P, Fekete Gy: Y-chromosome Markers in Turner Syndrome Screening of 130 Patients. J Endocrinol Invest, 2009, Jul 21. [Epub ahead of print] IF: 1,888 (2008) Bertalan R, Sallai Á, Sólyom J, Lotz G, Szabó I, Kovács B, Szabó É, Patócs A, Rácz K: Hyperthyroidism caused by a germline activating mutation of the thyrotropin receptor gene: difficulties in diagnosis and treatment. Thyroid elfogadva dec. 10-én (kettıs elsı szerzıség) IF: 3,000 (2008) A disszertációhoz kapcsolódó absztraktok: Sallai Á, Ugocsai P, Hosszú É, Halász Z, Luczay A, Gál V, Ságodi L, Szőts PT, Szabó J, Sólyom J, Dobos M, Fekete Gy. (2004) Screening of Hidden Y 15

16 chromosome Sequences in Hungarian Patients with Turner Syndrome. Slov Pediatr, 11: 105. Sallai Á, Ugocsai P, Halász Z, Hosszú Éva, Ságodi L, Erhardt É, Kozári A, Niederland T, Szabó J, Sólyom J, Dobos M, Fekete Gy. (2005) 111 Turnerszindrómás beteg szőrése az Y-kromoszóma DNS-szekvenciáira. Gyermekgyógyászat, 56(S1): 125. Sallai Á, Ugocsai P, Halász Z, Hosszú Éva, Ságodi L, Erhardt É, Kozári A, Niederland T, Szabó J, Dobos M, Sólyom J, Fekete Gy. (2006) 124 Turnerszindrómás beteg szőrése Y kromoszóma DNS szekvenciáira. Magy Belorv Arch, 59(S1): 64. Sallai Á, Ugocsai P, Halász Z, Hosszú É, Luczay A, Ságodi L, Niederland T, Erhardt É, Kozári A, Szabó J, Dobos M, Sólyom J, Fekete Gy. (2006) Screening of Y-specific sequences in 124 Hungarian patients with Turner syndrome. Horm Res, 65(S4): Sallai Á, Tulassay Zs, Rácz K, Fekete Gy. (2006) MEN-2B - a fenotípus fontossága, tévútra vezetı tünetek. Gyermekgyógyászat, 57(S1): 71. Sallai Á, Hosszú É, Gergics P, Tulassay Zs, Rácz K. (2007) Two simultaneous cases of a rare syndrome. Endocrine Abstracts, 14: P156. Sallai Á, Tulassay Zs, Gergics P, Rácz K, Fekete Gy. (2007) Importance of phenotype a case of a multiple endocrin neoplasia type 2B undiagnosed for many years. Horm Res, 68(S1): 241. Sallai Á, Patócs A, Gergics P, Rácz K, Fekete Gy. (2008) Preventív thyreoidectomia gyermekkorban A RET protoonkogén V804M kodon mutációja miatt. Magy Belorv Arch, 61: 260. Sallai Á, Luczay A, Gergics P, Rácz K, Fekete Gy. (2008) Prophylactic thyroidectomy in children with the V804M mutation of proto-oncogene RET. Horm Res, 70(S1): Bertalan R, Sallai Á, Sólyom J, Lotz G, Szabó É, Patócs A, Rácz K. (2009) Hyperthyroidism caused by a novel activating germline mutation of the thyrotropin receptor gene, case report and assessment of the literature. Horm Res, 72(S3):

17 Egyéb publikációk jegyzéke Könyvfejezet: Halász Z, Hosszú É, Sallai Á. (2000) Elégtelen hormontermelés, hormonpótló kezelés. In: Fekete Gy. (szerk), Tabularium paediatriae. Melania Kft, Budapest, Cikk: Kálmánchey R, Sallai Á, Rudas G. (1992) Gyermekkori dancing eyes syndroma occult neuroblastomában. Orvosi Hetilap, 133: Hosszú É, Sallai Á. (1997) Human parvovírus B19 fertõzés krónikus arthritises gyermekben. Orvosi Hetilap, 138: Klujber V, Sallai Á, Kálmánchey R, Szõnyi L, Hosszú É. (1997) Késõi kezdetû I. típusú tyrosinaemia. Orvosi Hetilap, 138: Sólyom J, Sallai Á, Kontor E, Schafer J, Pápai J, Almássy Zs, Gyõrvári B, Dobos M, Fekete Gy. (1997) Részleges gonad dysgenesis: új betegek ismertetése és a korábbi esetek áttekintése. Gyermekgyógyászat, 48: Sallai Á, Hargitai G, Pásti K, Sólyom J. (2000) Congenitalis adrenalis hyperplasia miatt kezelt betegek serdülése. Gyermekgyógyászat, 51: Sallai Á. (2001) Gyermekkori obesitas. Hippocrates, 5: Schreiber D, Barta Cs, Halász Z, Sallai Á, Rácz K, Ságodi L, Fekete Gy, Hiort O, Sólyom J. (2003) Mutational analysis of Hungarian patients with androgen insensitivity syndrome. J Pediatr Endocrinol Metab, 16: IF: 0,947 Sallai Á, Mónus M, Urbán R, Sólyom J. (2003) Az agyi maszkulinizáció vizsgálata congenitalis adrenalis hyperplasiás lányoknál. Gyermekgyógyászat, 54: Constantin T, Ponyi A, Bense T, Sallai Á, Gergely L, Fekete Gy, Dankó K. (2004) A juvenilis dermatomyositis klinikai sokszínősége esetismertetés és irodalmi összefoglaló. Gyermekgyógyászat, 55: Constantin T, Ponyi A, Balázs Gy, Sallai Á, Dankó K, Fekete Gy, Karádi Z. (2004) Az MRvizsgálatok szerepe és helye a juvenilis dermatomyositis diagnosztikájában. Magy Immunol/Hun Immunol, 3: Gál V, Niederland T, Sallai Á, Flach E, Gellén B. (2006) Turner-szindróma és serdülés. Gyermekgyógyászat, 57:

18 Constantin T, Ponyi A, Orbán I, Molnár K, Dérfalvi B, Dicsı F, Kálovics T, Müller J, Garami M, Sallai Á, Balogh Zs, Szalai Zs, Fekete Gy, Dankó K. (2006) National registry of patients with juvenile idiopathic inflammatory myopathies in Hungary - clinical characteristics and disease course of 44 patients with juvenile dermatomyositis. Autoimmunity, 39: IF: 2,033 Halász Z, Tıke J, Patócs A, Bertalan R, Tömböl Zs, Sallai Á, Hosszú É, Muzsnai Á, Kovács L, Sólyom J, Fekete Gy, Rácz K. (2006) High prevalence of PROP1 gene mutations in Hungarian patients with childhood-onset combined anterior pituitary hormone deficiency. Endocrine, 30: IF: 1,805 Constantin T, Ponyi A, Kálovics T, Orbán I, Molnár K, Dérfalvy B, Dicsı F, Sallai Á, Garami M, Balogh Zs, Szalai Zs, Fekete Gy, Dankó K. (2007) Juvenilis és felnıtt kori dermatomyositisben szenvedı betegek kórlefolyásának jellegzetességei, illetve a kezelés és a késıbbi kórlefolyás kapcsolatának vizsgálata. Orvosi Hetilap, 148: Constantin T, Ponyi A, Kálovics T, Orbán I, Molnár K, Dérfalvy B, Dicsı F, Sallai Á, Karádi Z, Garami M, Balogh Zs, Szalay Zs, Fekete Gy, Dankó K. (2007) A juvenilis idiopathias inflammatorikus myopathiában (IIM) szenvedı betegek klinikai jellemzıi (panaszok és tünetek, kórlefolyás) Juvenilis IIM-ben szenvedı betegek magyarországi regiszterének adatai alapján. Gyermekgyógyászat, 58: Sallai Á. (2007) Turner-szindrómás betegek gyermek- és ifjúkori ellátása, átadás a felnıtt gondozásba. Családorvosi Fórum, 2: Szamosi A, Czinner A, Szamosi T, Sallai Á, Hatunic M, Berla Z, Tomsits E, Almássy Zs, Nolan JJ. (2008) Effect of diet and physical exercise treatment on insulin resistance syndrome of schoolchildren. J Am Coll Nutr, 27: IF: 2,162 Idézhetı absztrakt: Sallai Á. (1997) Partial Gonadal Dysgenesis. Endocrine Regulations, 31: 240. Sallai Á, Hargitai G, Pásti K, Sólyom J. (2000) Congenitalis adrenalis hyperplasia miatt kezelt betegek serdülése. Orvosi Hetilap, 141(S1): Sallai Á, Hargitai G, Sólyom J. (2001) Puberty in Hungarian Patients Treated for Congenital Adrenal Hyperplasia. Slov Pediatr, 8: 59. Sólyom J, Sallai Á, Halász Z, Hosszú É, Hajmássy Zs, Dobos M, Fekete Gy. (2001) Gonadal Dysgenesis - Case Presentation and Preliminary Report on the Database of a Paediatric Endocrine Unit in Hungary. Slov Pediatr, 8: 58. Sallai Á, Halász Z, Hosszú É, Hajmássy Zs, Dobos M, Sólyom J, Fekete Gy. (2002) Gonad dysgenesis. Gyermekgyógyászat, 53(S1):

19 Constantin T, Ponyi A, Garami M, Sallai Á, Dankó K. (2002) Juvenilis dermatomyositis. Allergológia és Klinikai Immunológia (AKI), 2: 46. Sallai Á, Mónus M, Urbán R, Sólyom J. (2003) Az agyi maszkulinizáció vizsgálata congenitalis adrenalis hyperplasiás lányoknál. Gyermekgyógyászat, 54(S1): 51. Constantin T, Karádi Z, Balázs Gy, Sallai Á, Ponyi A, Fekete Gy. (2003) Modern képalkotó vizsgálatok szerepe és helye a juvenilis idiopathias inflammatoricus myopathiák diagnosztikájában. Gyermekgyógyászat, 54(S1): 101. Luczay A, Sallai Á, Halász Z, Hajmássy Zs, Pápay J, Dobos M, Sólyom J, Fekete Gy. (2003) Elégtelen maszkulinizáció fiúmagzatban. Gyermekgyógyászat, 54(S1): 91. Sallai Á, Mónus M, Urbán R, Sólyom J. (2003) Female Patients with Congenital Adrenal Hyperplasia have Prenatal Masculinization of the Brain. Slov Pediatr, 10: 184. Constantin T, Ponyi A, Karádi Z, Balázs Gy, Sallai Á, Dankó K, Fekete Gy. (2003) Az MRI vizsgálat szerepe és helye a juvenilis dermatomyositis diagnosztikájában. Magyar Reumatológia, 44: 172. Luczay A, Török D, Ferenczi A, Majnik J, Sallai Á, Gács Zs, Sólyom J, Fekete Gy. (2004) A glukokortikoid-receptor érzékenységét növelı polimorfizmus, mint a CAH fenotípusát befolyásoló egyik lehetséges tényezı (esetbemutatás). Gyermekgyógyászat, 55(S2): 61. Luczay A, Török D, Ferenczi A, Majnik J, Battelino T, Sallai Á, Gács Zs, Sólyom J, Fekete Gy. (2004) The N365S Polymorphism of the Glucocorticoid Receptor: Potential Contribution to Phenotype of CAH Case Report. Slov Pediatr, 11: 92. Halász Z, Majnik J, Tıke J, Tömböl Zs, Hosszú É, Muzsnai Á, Sallai Á, Juhász É, Kozári A, Bertalan R, Tóth M, Sólyom J, Rácz K. (2005) Combined pituitary hormone deficiency. Mutation analysis of PROP1 gene and clinical characteristics. Horm Res, 64(S1): 224. Luczay A, Török D, Ferenczi A, Battelino T, Majnik J, Sallai Á, Gács Zs, Sólyom J. (2005) The N363S polymorphism of the glucocorticoid receptor modifies the phenotype of congenital adrenal hyperplasia. A pilot study. Horm Res, 64(S1): 336. Goschler Á, Németh Á, Sallai Á, Kárpáti S, Dunai Á, Fekete Gy. (2005) Bırtünetek nélkül jelentkezı Stevens-Johnson-szindróma 10 éves gyermekben. Gyermekgyógyászat, 56(S1): 66. Sallai Á, Tıke J, Bertalan R, Tömböl Zs, Halász Z, Sólyom J. (2005) Clinical and Hormonal Phenotype and PROP1 Genotype in a Short Girl Case Report. DMEV, (S2): 8-9. Luczay A, Török D, Ferenczi A, Halász Z, Hosszú É, Sallai Á, Sólyom J, Fekete Gy. (2005) The N363S Polymorphism of the Glucocorticoid Receptor in Obese Children. DMEV, (S2): 16. Constantin T, Ponyi A, Danko K, Muller J, Sallai A, Kalovics T, Karadi Z, Fekete G. (2005) Diagnostic value of MRI on the detection of myositis relapses in a patient with juvenile dermatomyositis - a case report with long-term follow-up. Ann Rheum Dis, 64(S3): 512. IF: 3,916 Mónus M, Sallai Á, Urbán R, Balassa T, Sólyom J. (2006) Lánynak születni, nıvé válni. Magy Belorv Arch, 59(S1): 55. Halász Z, Tıke J, Patócs A, Bertalan R, Tömböl Zs, Sallai Á, Hosszú É, Muzsnai Á, Kovács L, Sólyom J, Fekete Gy, Rácz K. (2007) Genetic analysis of PROP1 gene in patients with childhood-onset combined pituitary hormone deficiency (CPHD). Endocrine Abstracts, 14: P

20 KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS Ezúton szeretném köszönetemet és hálámat kifejezni Schuler Dezsı professzor úrnak, aki fiatal orvos koromban ismeretlenül a klinikájára vett és számomra bizalmat szavazott, gyermekorvossá válásomban irányt mutatott, igényességével, tudásával egy életen át példaképemmé lett. Nagyon köszönöm Fekete György professzor úrnak, hogy 1994 óta klinikaigazgatóként segítette a munkámat, lehetıvé tette, hogy endokrinológiából is szakvizsgát szerezzek, támogatta, hogy nemzetközi kongresszusokon részt vehessek, valamint ösztönzött a Ph.D. tudományos fokozat megszerzésére. Köszönettel tartozom Sólyom János professzor úrnak, aki bevezetett a gyermekendokrinológia rejtelmeibe, logikus gondolkodásra nevelt, megszervezte, hogy két alkalommal néhány héten át tapasztalatot győjtsek az ulmi gyermekklinika szteroid laboratóriumában, illetve betekinthessek a német gyermekendokrin betegellátásba. Külön köszönet illeti témavezetımet, Rácz Károly professzor urat, aki számtalan elfoglaltsága mellett 2007 óta bátorította, irányította és sok türelemmel segítette tudományos munkámat. Hálásan köszönöm a II. sz. Belgyógyászati Klinika Molekuláris Endokrinológiai Laboratóriumában dolgozó kollégáknak, elsısorban Dr. Patócs Attilának az önzetlen szakmai segítséget. Dr. Bertalan Ritát a TSHR gén mutáció vizsgálatáért illeti köszönet. Köszönöm a hazai gyermekendokrin centrumokban dolgozó Kollégáimnak, hogy Turner-szindrómás betegeiket bevonták a vizsgálatomba. Ezen betegek molekuláris genetikai vizsgálatában nyújtott metodikai segítségért Dr. Ugocsai Pétert illeti köszönet. Köszönettel tartozom a II. sz. Gyermekgyógyászati Klinikán dolgozó Kollégáimnak és Barátaimnak, elsısorban az endokrin és a genetikai munkacsoport régi és jelenlegi tagjainak az együtt végzett munka öröméért és sikeréért, valamint Betegeimnek a segítıkészségükért. Külön is köszönöm Dr. Halász Zitának, Dr. Hosszú Évának, Dr. Luczay Andreának és Dr. Németh Krisztinának a szakmai támogatását. Végül, de nem utolsó sorban, megköszönöm családomnak, édesanyámnak, férjemnek és gyermekeimnek, hogy szeretettel és megértéssel segítik munkámat, és biztos hátteret nyújtanak szakmai elképzeléseim megvalósításához. 20