Doktori értekezés. Nagy Katalin. Témavezető: prof. Kopper László Konzulens: Dr. Mihalik Rudolf és Dr. Peták István

Átírás

1 A proteaszóma-ubikvitin rendszer szerepe kemoterápiás szerek és TRAIL által indukált apoptózis szabályozásában promyelocitas leukemia és vastagbélrák sejtekben Doktori értekezés Nagy Katalin Témavezető: prof. Kopper László Konzulens: Dr. Mihalik Rudolf és Dr. Peták István Semmelweis Egyetem I. sz. Patológiai és Kísérleti Rákkutató Intézet Budapest, 2006

2 Tartalomjegyzék Összefoglaló 4 Abstract 6 Rövidítések jegyzéke 8 1.Bevezető A proteaszóma-ubikvitin rendszer A proteaszóma-ubikvitin rendszer szerepe a sejtben A proteaszóma-ubikvitin rendszer szerepe az apoptózis szabályozásában Az ubikvitináció folyamata Az ubikvitinálásban szerepet játszó enzimrendszer A 26S proteáz komplex Proteaszómagátló vegyületek Proteaszómagátló-szerek és kemoterápiás szerek kombinált alkalmazásának lehetőségei Proteaszómagátló-szerek és TRAIL kombinált alkalmazásának lehetőségei vastagbélrákok esetében A dolgozat célkitűzése Proteaszómagátlás hatásának vizsgálata a mikrotubulusgátló nokodazol-indukált apoptózisra promyelocitas leukemia sejtekben Proteaszómagátlás hatásának vizsgálata a halálligand, TRAIL-indukált apoptózisra vastagbélráksejtekben Anyagok és módszerek Alkalmazott anyagok, vegyszerek Sejt- és szövettenyésztés, a kezelések menete Apoptotikus DNS-fragmentáció vizsgálata áramlási citometriával (FACS, Becton- Dickinson) Kaszpáz- és proteaszómaaktivitás mérése Mitokondriummembrán depolarizációjának vizsgálata áramlási citometriával Western-blot analízis Hsp70 Western-blot Pro-és antiapoptotikus fehérjék kimutatása Western-blottal Mitokondriális proapoptotikus fehérjék citoplazmatikus felszabadulásának vizsgálata Smac/Diablo fehérje expressziójának gátlása RNS interferencia (RNAi) módszerrel Smac/Diablo mrns-t célzó shrns konstrukciók létrehozása RKO sejtek tranziens transzfektálása Nucleofector módszerrel Statisztikai analízis, az adatok elemzése 36 2

3 7. Eredmények A mikrotubulusgátló nokodazol által kiváltott apoptózis befolyásolása proteaszómagátló-szerekkel A nokodazol kezelés indukálta sejtciklusgátlás és az ezt követő apoptózis vizsgálat A proteaszómagátlók és kaszpázgátló-szer okozta apoptózisgátlás A kaszpáz-3 aktivitás vizsgálata nokodazol indukálta apoptózisban és a proteaszómagátlók hatása az aktivitásra Az Hsp72 fehérje szintjének vizsgálata nokodazollal és MG132-vel kezelt sejteken A halálligand TRAIL hatásának fokozása proteaszómagátló-szerek segítségével TRAIL-rezisztens vastagbélráksejtvonalon Különböző proteaszómagátló-szerek érzékenyítő hatása vastagbélráksejtekben TRAIL által indukált apoptózisban Antiapoptotikus fehérjék mennyiségének vizsgálata epoxomicin/trail kezelést követően A kaszpázok szerepének vizsgálata a kombinált kezelés következtében kialakult DNSfragmentáció folyamatában A kaszpáz-3 aktivációjának vizsgálata aktivitás-esszében és Western-blot technikával A mitokondriális membrándepolarizáció és a proapoptotikus mitokondriális faktorok felszabadulásának vizsgálata kombinált epoxomicin/trail-lel kezelt sejtekben Az eredmények összefoglalása és értékelésük A nokodazollal és etopoziddal végzett kísérletek rövid összefoglalása és az eredmények értékelése A TRAIL-lel és a proteaszómagátló-szerekkel RKO sejteken végzett kísérletek rövid összefoglalása és az eredmények értékelése Összefoglalás 61 Köszönetnyilvánítás 63 Saját közlemények: 64 Irodalomjegyzék 66 3

4 Összefoglaló Az utóbbi évek legsikeresebb kemoterápiás szerei közé tartoznak a mikrotubulusrendszer gátlószerei (pl. taxol), amelyeket többek között emlő- és petefészekrák kezelésében is alkalmaznak. A kemoterápiás szerek új típusát jelentik a proteaszóma-ubikvitin rendszer működését gátló szerek és a klinikai tesztelés alatt álló citokin, a TRAIL (TNF-α-Realted Apoptosis Inducing Ligand), melynek hatékony tumorölő hatását már sokféle daganatban kimutatták. A bortezomib (PS-341) az első olyan proteaszómagátló, amelynek klinikai akalmazását az FDA (Food and Drug Administration, USA) engedélyezte. Kevés adat áll rendelkezésünkre a proteaszómagátlók és a kemoterápiás szerek, illetve a TRAIL kombinált alkalmazásáról. A proteaszómagátló- és kemoterápiás szerek, illetve TRAIL hatásának szinergizmusát már kimutatták, de a szinergizmus hátterében álló molekuláris és biokémiai folyamatok még nem tisztázottak. A hagyományos terápiával szemben rezisztens tumorok gyógyításában ezek a kombinált kezelések azonban hatékony új eszközök lehetnek. Kísérleteinkben HL60 humán promyelocitas leukemia sejtekben vizsgáltuk a nokodazol, illetve az etopozid és különböző proteaszómagátló-szerek, valamint kaszpázgátló-szerek hatását. Kimutattuk, hogy a nokodazol kaszpáz-függő apoptózist indukál a HL60 sejtekben. Subcitotoxikus koncentrációkban az MG-132, illetve a klaszto-β-lakton proteaszómagátló-szerek a nokodazol indukálta kaszpáz-3-aktivációt nem gátolták, de az apoptotikus DNS-fragmentációt igen. Ezzel szemben az MG-132 párhuzamosan csökkentette a topoizomerázgátló etopozid indukálta apoptotikus DNSfragmentáció és a kaszpáz-3-aktivitás mértékét is. Vizsgálatainkban kimutattuk azt is, hogy a Hsp70 fehérje szintje megemelkedik az MG132-vel és az MG132/nokodazollal kezelt mintákban. Eredményeink alapján elmondható, hogy a proteaszómagátló-szerek alkalmazása a nokodazol indukálta apoptózist a kaszpáz-3 aktiválódása után gátolja, feltehetően az indukálható Hsp70 szint emelkedésével. Ezek az eredmények felhívják a figyelmet arra, hogy a mikrotubulusgátló- és proteaszómagátló-szerek kombinált alkalmazása kemoterápiás kezelésként körültekintést igényel az egyes szerek egymást kioltó hatása miatt. További kísérleteinkben proteaszómagátló-szerek érzékenyítő hatását vizsgáltuk TRAIL-indukált apoptózisban TRAIL-rezisztens RKO vastagbélráksejtekben. 4

5 Kimutattuk, hogy a különböző proteaszómagátlók (epoxomicin, bortezomib/ps-341 és MG-132) alkalmazásával a TRAIL-rezisztens vastagbélráksejtek jelentős mértékben érzékenyíthetőek TRAIL-lel szemben. DNS-fragmentációt, mitokondriális membrándepolarizációt és kaszpáz-3 aktivációt kizárólag a kombinált (epoxomicin és TRAIL) kezelésen átesett mintákban tudtunk kimutatni. A DNS-fragmentáció gátolható volt az általános kaszpázgátlóval (Z-VAD-fmk) és a kaszpáz-8 inhibitorral (Z-IETDfmk) is. A TRAIL kezelés önmagában csak a kaszpáz-3 részleges aktiválódását indukálta (p20 fragment), míg a kombinált kezelést követően a mintákban teljes kaszpáz-3 aktivációt tudtunk kimutatni (p17 fragment). Ugyanebben az időpontban a kombinált kezelés jelentős mitokondriummembrán-depolarizációt és a citokróm-c, a HtrA2/OMI és a Smac/Diablo felszabadulását indukálta. Az epoxomicin önmagában csak a citokróm-c és a HtrA2/OMI felszabadulását eredményezte, de ezzel párhuzamosan sem szignifikáns membrándepolarizáció, sem Smac/Diablo kiáramlás nem volt kimutatható. A TRAIL-kezelés önmagában nem okozott jelentős változást egyik mitokondriális proapoptotikus fehérje kiáramlásában sem. Az AIF fehérje felszabadulása semmilyen kezelés eredményeképpen nem volt kimutatható. Eredményeink alapján elmondható, hogy a TRAIL és az epoxomicin által indukált apoptózisban a teljes kaszpázaktiváció megvalósulásához és az ennek következtében bekövetkező DNS-fragmentációhoz feltehetően hozzájárul a Smac/Diablo fokozott felszabadulása a citoplazmába. A Smac/Diablo szerepét sirns technikával is alátámasztottuk. Kimutattuk, hogy azokban a sejtekben, amelyekben gátoltuk a Smac/Diablo termelődését a kombinált kezelés indukálta apoptózis szignifikáns mértékben csökkent. Ezek az eredmények hozzájárulnak ahhoz, hogy további in vivo vizsgálatokkal megalapozhassuk a proteaszómagátlók és a TRAIL kombinált alkalmazását szolid daganatokban, többek között vastagbélrákokban is. 5

6 Abstract Drugs which interfere with microtubules, such as taxol, are among the most successful chemotherapeutic agents of recent years, and they are used in the treatment of many solid tumors including breast and ovarian cancer. TRAIL, a tumor specific cytokine in phase I. clinical trial, represents the new type of chemotherapeutic drugs, simirarly to proteasome inhibitors which interact with the proteasome-ubiquitin pathway. PS-341/Bortezomib was the first proteasome inhibitor approved by the Food and Drug Administration for clinical use but only against myeloma. The effects of the combination treatment of proteasome inhibitors with other drugs against various tumors and the molecular and biochemical mechanisms of the synergism are barely explored, while it can offer a new effective opportunity to treat resistant tumors. In our study human promyelocytic leukemia cell line, HL-60 was exposed to nocodazole or etoposide in combination with proteasome or caspase inhibitors. Nocodazole, a microtubule inhibitor, induced caspase-dependent apoptosis in the HL-60 cell line. At subcytotoxic concentrations, proteasome inhibitors - including MG-132 or clasto-β-lactone - decreased nocodazole-induced apoptotic DNA fragmentation without affecting the induction of caspase-3 activity. In contrast, MG-132 decreased both DNA fragmentation and caspase activation induced by etoposide, a topoisomerase-ii inhibitor. In parallel, MG-132 upregulated Hsp70 protein expression both in the presence or absence of nocodazole. We showed that proteasome inhibitors decreased antimicrotubule drug-induced apoptotic DNA fragmentation downstream of caspase-3 activation, possibly due to increased Hsp70 expression. Results indicate that combination treatment with proteasome inhibitors and the more conventional drugs in leukemia requires careful evaluation of their interferences at the level of apoptosis signalling. Next we focused on the sensitization effect of proteasome inhibitors to TRAIL in TRAIL-resistant colon carcinoma cells. Combination of various proteasome inhibitors (epoxomycin, bortezomib/ps-341 and MG-132) and TRAIL induced rapid apoptosis in TRAIL-resistant colon carcinoma cell lines. DNA fragmentation, mitochondrial membrane depolarization and increased caspase-3-like enzyme activity were induced only by the combined treatment (epoxomycin and TRAIL). DNA fragmentation was 6

7 inhibited completely by the general caspase inhibitor Z-VAD-FMK and partially by the caspase-8 inhibitor IETD-FMK. Further, treatment with TRAIL alone induced partial activation of caspase-3 (p20 fragment), while the combination treatment led to the full proteolytic activation of caspase-3 (p17 fragment). At the same time point (5 hr), the combination treatment induced marked membrane depolarization and the release of cytochrome-c, HtrA2/OMI and SMAC/Diablo from the mitochondria. Epoxomycin alone induced the release of cytochrome-c and HtrA2/OMI, in the absence of significant mitochondrial membrane depolarization or release of SMAC/Diablo, while TRAIL treatment alone did not cause significant release of any of these mitochondrial proapoptotic proteins. AIF was not released by any of these treatments. Our results provide a model where enhanced release of Smac/Diablo has an important role in full caspase activation and subsequent DNA fragmentation induced by the combination of TRAIL and epoxomicin. We used sirna technique to confirm this action and we found that apoptotic DNA fragmentation induced by the combination treatment was significantly inhibited in Smac/Diablo knock out cells. These results further underline that TRAIL and a proteasome inhibitor is a promising combination against colon carcinomas. 7

8 Rövidítések jegyzéke Ac-DEVD-AMC : acetil-asp-glu-val-asp-7-amino-4- metilcoumarin, kaszpáz-3 szubsztrát AIF: apoptosis inducing factor ANT: adenosin nucleotid translocator Apaf1: apoptotic protease activating factor 1 CAD: caspase-activated DNase CBL: clasto-lactacistine-beta-lactone Cyp-D: ciklofillin D DAB: 3,3 -Diaminobenzidine DcR: decoy receptor, csalireceptor DiOC6: 3, 3'-Dihexyloxacarbocyanine, iodide DISC: death inducing signal complex DMSO: dimethyl-sulfoxide DTT: ditriothreitol Eto: etopozid FADD: Fas -associated via death domain FBS: fötális borjú szérum FDA: Food and Drug Administration, Egyesült Államok Gly: glicin IAP: inhibitor of apoptosis, apoptózis gátló fehérjecsalád ICAD: inhibitor of caspase activated DNase Lys: lizin NAC: N-acetil-cisztein, antioxidáns vegyület Noc: nokodazol PBS: phosphate-buffered-saline, foszfát puffer PMSF: phenyl-methyl-sulfoxide ROS: reactive oxygen species, reaktív oxigéngyökök SDS: sodium-dodecil-sulfate 8

9 Suc-LLVY-AMC: TNF: TRAIL: XIAP: Succinil-Lys-Lys-Val-Tyr- amino-4-metilcoumarin, proteaszóma szubsztrátja tumor-necrosis-factor TNF-related-apoptosis-inducing-ligand X-linked inhibitor of apoptosis protein 9

10 1.Bevezető A sejten belüli fehérjék szintjének szabályozását termelődésük és lebontásuk egyensúlya befolyásolja. Emlős sejtekben a különböző fehérjék lebontása többféle módon valósulhat meg. Az extracelluláris térből a sejtbe jutó fehérjék és egyes intracelluláris fehérjék lebontása a lizoszómában történik. Extralizoszómális útvonalon a proteaszóma-ubikvitin rendszer segítségével a sejt saját fehérjéinek szabályozott lebontása zajlik. A sejt saját fehérjéink jelentős része szubsztrátja a proteaszómaubikvitin rendszernek, amely rendkívül fontos szerepet tölt be az intracelluláris folyamatok szabályozásában (Lin és mtsai, 1998; Michael és mtsai, 2003; Reed és mtsai, 2006). A proteaszóma gátlása különböző specifikus gátlószerek alkalmazásával felfüggeszti ezeknek a szabályozó fehérjéknek a lebontását, és így pl. a proapoptotikus hatású fehérjék stabilizációját előidézve új terápiás lehetőséget kínál a malignus folyamatok kezelésére. 10

11 2. A proteaszóma-ubikvitin rendszer 2.1. A proteaszóma-ubikvitin rendszer szerepe a sejtben A proteaszóma központi komponens a sejt fehérjéinek lebontásában. A legkülönbözőbb szubsztrátok degradációjával számos sejtfunkció szabályozásába bekapcsolódik. Szerepe rendkívül sokrétű; sok esetben már részletesen ismert. Az alábbiakban röviden összefoglalom ezeket a területeket. 1. Sejtciklus-szabályozás. A legtöbb sejtciklust szabályozó fehérje (ciklinek, ciklinfüggő kinázok, gátlóik, stb.) lebontása is a proteaszóma rendszeren keresztül valósul meg (Gutierrez és mtsai, 2006 review). 2. Immunválasz szabályozása. Az MHCI. típusú antigének előállítása a nagyméretű mikrobiális fehérjékből a proteaszóma közreműködésével történik. Emellett a gyulladásos és egyéb immunológiai folyamatok szabályozásában is fontos szerepet játszik az NF-κB aktiválódásának regulációján keresztül (Strehl és mtsai, 2005 review). 3. Fehérjetekeredés (folding). A proteaszóma számos hősokk fehérjével, illetve chaperonnal lép kölcsönhatásba, fontos szerepet töltve be a hibásan tekeredett fehérjék eltávolításában (Esser és mtsai, 2004 review). 4. Endoplazmatikus retikulum (ER) függő fehérjebontás. Az ER-hoz kapcsolódó proteaszómáknak fontos szerepe van az ER-ban termelődő nem megfelelő konformációjú fehérjék eltávolításában (Ye, 2005 review) A proteaszóma-ubikvitin rendszer szerepe az apoptózis szabályozásában Az értekezés a proteaszómagátlók különböző kemoterápiás szerek által indukált apoptózisra kifejtett hatásával foglalkozik, ezért a proteaszóma-ubikvitin rendszer apotózisban betöltött szabályozó szerepét részletesebben ismertetem. Egyre bővül azoknak az anti- és proapoptotikus fehérjéknek a száma, amelyekről kimutatták, hogy 11

12 lebontásukat ez a rendszer végzi. Ezek közül a fehérjék közül kiemelek néhányat, melyek a dolgozat kísérletes részében gyakran említésre kerülnek.. - Az NF-κB egy fontos, a sejtek túlélését biztosító transzkripciós faktor, bár bizonyos esetekben az apoptózis elindítója is lehet. Működésének szabályozása proteaszómális úton valósul meg, hiszen a megfelelő stimulusok hatására (pl. növekedési faktorok, TRAIL) aktiválódó IKK kináz enzim foszforilálja az NF-κB-hez kötődő gátlófehérjét, az IκB-t. A foszforiláció eredménye az IκB ubikvitinálódása és degradációja a proteaszómán keresztül, melynek eredményeképp az NF-κB aktívvá válik és a sejtmagba jutva fejti ki transzkripciót szabályozó hatását (Kroll és mtsai; 1997; Schmitz és mtsai, 2004 review). - A Bcl-2 fehérjecsalád tagjainak nem csak a lebontása kötődik proteaszómális szabályozáshoz, hanem a termelődése is, hiszen legtöbbjük expresszióját az NF-κB befolyásolja (Chang és mtsai, 1998; Chadebech és mtsai, 1999; Breitschopf, 2000; McFarlane, 2002; Ma és mtsai, 2006) - Az apoptózist gátló fehérjékről (IAPs) az utóbbi évek kutatásainak eredményeként derült ki, hogy ún. RING doménnel, így ubikvitin-ligáz aktivitással rendelkeznek és autoubikvitinációra is képesek. Az IAP fehérjék mai ismereteink szerint elsősorban a saját maguk és a kaszpázok ubikvitinálásában vesznek részt, lebontásukat a proteaszóma végzi (Suzuki és mtsai, 2001; Ni, 2005 review). - A p53 központi szerepe az apoptózis szabályozásában elvitathatatlan. A p53 degradációját az Mdm2 fehérje szabályozza, mely elősegíti a p53 ubikvitinációját. Az Mdm2 fehérjét is a proteaszóma bontja le, így a szabályozás több lépcsőben valósul meg (Honda és mtsai, 1997). Az előbbiekben felsoroltak alapján érthető, hogy a proteaszóma szerepe az apoptózis szabályozásában érdekes és jelentős lehet. Ez a felsorolás arra is rávilágít, hogy a proteaszóma-ubikvitin rendszer szabályozó szerepe a mitokondriális (belső) és halálreceptor (külső) útvonalat egyaránt érinti. 12

13 2.3. Az ubikvitináció folyamata A fehérjék lebontása a proteaszóma-ubikvitin rendszeren keresztül két fő lépésre osztható. Elsőként a célfehérjéhez több lépésben egy poliubikvitin lánc kötődik, majd az így megjelölt fehérje az ún. 26 S proteáz komplexben (vagy a lizoszómában) degradálódik. Az ubikvitináció folyamatát ábrázolja sematikusan az 1. ábra (Hershko and Ciechanover, 1998 és Nandi és mtsai, 2004). Az ubikvitin molekula evolúciósan konzervált 76 aminosavból álló fehérje. A folyamat során az ubikvitin molekula C- terminális glicin aminosava (Gly) aktiválódik az ubikvitin-aktiváló enzim közreműködésével (E1), ez a lépés ATP-t igényel. 1. ábra. Az ubikvitináció folyamata. A folyamat során az ubikvitin molekula C-terminális Gly-je aktiválódik az ubikvitin-aktiváló enzim közreműködésével (E1), ez a lépés ATP-t igényel. Ezt követően az ún. ubikvitin-konjugáló enzim (E2, UBC) aktiválódik és az ubikvitin molekulát E1-ről a következő enzimre, az ubikvitin-protein ligázra (E3) viszi át. A folyamat eredményeképp izopeptid kötés jön létre az ubikvitin molekula C-terminális Gly-je és a fehérje egy Lys aminosava között. Az ubikvitinlánccal jelölt fehérje lebontása a 26S proteázkomplexben valósul meg, melynek eredményeképp 4-aminosavas peptid darabok jönnek létre. 13

14 Ezt követően az ún. ubikvitin-konjugáló enzim (E2) az ubikvitin molekulát az E1-ről a következő enzimre, az ubikvitin-protein ligázra (E3) viszi át. A folyamat eredményeképp izopeptid kötés jön létre az ubikvitin molekula C-terminális Gly-je és a fehérje egy lizin (Lys) aminosava között. Azokban a fehérjékben, amelyek nem tartalmaznak Lys-t, a jelölődés az N-terminális aminosavon történhet meg. A bekötődött ubikvitin molekulához hasonlóan újabb és újabb ubikvitin molekulák kötődnek létrehozva a poliubikvitin láncot. A folyamat kezdeti lépései még nem teljesen tisztázottak, így pl. az sem, hogy pontosan mi az a jel, amely az adott fehérjét lebontásra ítéli. Egyes esetekben olyan primer, de rejtett szekvenciák találhatóak meg, melyek állandóan jelen vannak az adott fehérjén, de mégsem vezetnek folyamatos lebontáshoz, mert csak a fehérje alegységeinek szétválásakor kerülnek a felszínre. Más esetekben különböző fehérjékkel (molekuláris chaperonok, virális onkoproteinek) történő asszociáció jelöli ki az adott szubsztrátot (Bercovich és mtsai, 1997 és Sherman és mtsai, 1996). Megfigyelték a fehérjék - egyes jelutak működésének eredményeképpen bekövetkező - poszttranszlációs módosításainak (oxidáció, foszforiláció) szerepét is. Ilyen foszforilációs motívum az ún. PEST szekvencia (Pro-Glu-Ser-Thr) (Rogers és mtsai, 1986), mely a rövid életidejű fehérjékben gyakori (pl. G1 ciklinek és transzkripcióaktivátorok), de bizonyos fehérjék esetén a foszforiláció védő hatású is lehet. Egyáltalán nem mindegy, hogy a poliubikvitin lánc kialakulásakor melyik Lys aminosavhoz kötődik a következő ubikvitin molekula. Az ubikvitin Lys48 illetve a Lys29 aminosaván történő láncépülés elsősorban proteaszómális lebontásra ítéli a fehérjét, míg más Lys aminosavakon (pl. 63) történő láncépítés a DNS repair mechanizmusát, illetve különböző transzkripcis faktorokat aktiválhat (Tenno és mtsai, 2004). A fehérjék jelölődése nem csak poliubikvitin lánc kialakításával történhet meg, bizonyos esetekben csak egyetlen ubikvitin molekula kötődik a fehérjéhez. A monoubikvitináció szerepe azonban más: bizonyos receptorfehérjék esetében endocitózisukat indíthatja el, vagy a hisztonok monoubikvitinációja működésük szabályozásában játszik fontos szerepet (Mosesson és mtsai, 2006 review és Osley és mtsai, 2006). 14

15 2.4. Az ubikvitinálásban szerepet játszó enzimrendszer Az ubikvitinálásban három féle enzim vesz részt (Hershko és Ciechanover, 1998 review és Nandi és mtsai, 2006): I. Ubikvitin-aktiváló enzimet (E1) kódoló gének száma néhány darab. Az enzim feladata a szubsztrát aktivált Gly-jével egy nagy energiájú tiolészter intermedier kialakítása. Ebben a folyamatban az enzim egy belső Cys-je vesz részt. II. Az ubikvitin-konjugáló enzimekből (E2) több található a sejtben. Feladatuk egyrészt nagy energiájú tiolészter intermedier kialakítása, másrészt az ubikvitinnek az E3 enzimre való átadása. Egy E2 enzim több E3 megkötésére is képes. III. Az ubikvitin-protein ligázok (E3) feladata, hogy az ubikvitint a tiolészter kötésből a szubsztráttal kialakítandó izopeptid kötésbe vigyék át. Ezek az enzimek felelősek a rendszer specifitásáért, mivel az egyes E3 enzimek csak egy adott szerkezeti motívummal rendelkező szubsztrátcsoportot ismernek fel. E3 enzimeket kódoló génekből több száz található a sejtekben. Az E3 enzimeket több családba sorolják közös szerkezeti motívumaiknak megfelelően (Koegl és mtsai, 1999). Az ubikvitin felszabadítása különböző vegyületekből fontos lépés, mivel gyakran történik hibás jelölődés, illetve az ubikvitin molekula legtöbbször kötötten fordul elő poliubikvitin prekurzorként vagy glutationhoz kötődve (Nijman és mtsai, 2005). Az ubikvitint újrahasznosító enzimek közös neve: tiol-proteázok (Ciechanover, 1998) A 26S proteáz komplex Az ubikvitinnel jelölt fehérjék lebontása a 26 S proteázkomplexben megy végbe. Emlőssejtekben a komplex elsősorban a citoplazmában található, nagy mennyiségben kötődve az endoplazmatikus retikulum felszínéhez, a plazmamembránhoz, különböző 15

16 citoszkeletális elemekhez, de a sejtmagban is megtalálható. A komplex mennyiségének megoszlása az egyes sejtalkotók között sejttípustól és a sejt fiziológiai állapotától függően változik. Feltételezik, hogy vannak proteolitikus központok a sejtben, bár a proteázkomplexek a sejt egészében megtalálhatóak. Ilyen proteolitikus hely a centroszóma, illetve a perinukleáris tér (Wigley és mtsai, 1999). A 26S komplex egy 20S katalitikus magkomplexből (macropain, szűkebben ezt nevezik proteaszómának) és általában az ehhez kapcsolódó regulátor alegységekből (elsősorban 19S regulátor sapka) épül fel (Hershko és Ciechanover, 1998 review és Nandi és mtsai, 2006). Az 1. táblázatban foglaltam össze a proteaszómához kapcsolódó regulátor elemeket (Chu-Ping és mtsai, 1994; Glickman és mtsai, 1999; Gomes és mtsai, 2006; Sharon és mtsai, 2006; Tanaka és mtsai, 1998; Ustrell és mtsai, 2002, 2005). Az ubikvitin-proteaszóma rendszer működését az aktivátor és a gátló elemeken kívül a sejtben megtalálható ubikvitin-szerű fehérjék is befolyásolják, melyek pl. kompetitíven gátolják a célfehérjék jelölődését és lebontását, de szerepük sok esetben még nem tisztázott. Az ismert ubikvitin-szerű fehérjéket a 2. táblázatban foglaltam össze. 1. táblázat. Proteaszómaaktivátorok 16

17 2. táblázat. Az ubikvitin-szerű fehérjék felsorolása. A proteaszóma felépítésére jellemző a hordó alakú szerkezet, mely 2 α és 2 β gyűrűből áll, ezeket további 7-7 alegység alkotja α1-7, illetve β1-7 elrendeződésben (Tanahashi és mtsai, 1993 és Nandi és mtsai, 2006 review). A konstitutívan aktív centrumokat hordozó β1, β2 és β5 alegységek emlősökben mikrobiális fertőzés, illetve IFNγ stimulus hatására kicserélődnek β1i, β2i és β5i alegységekre, létrehozva az ún. immunproteaszómát, melynek az immunválasz kialakításában és az antigének processzálásában van jelentős szerepe (Akiyama és mtsai, 1994). A proteaszóma szerkezete szimmetrikus felépítésű, a gyűrűk α-β-β-α sorrendben helyezkednek el (2.A. ábra). Az azonos α alegységek az α gyűrűkben szomszédosan helyezkednek el. Az α alegységek katalitikusan inaktívak, inkább stabilizáló szerepűek, a regulátor elemek kötésében vesznek részt és megkönnyítik a szubsztrátok bejutását az aktív üregbe. Az α alegységek sokkal konzerváltabbak, mint a β alegységek. A β gyűrűkhöz kapcsolódik a proteaszóma háromféle enzimaktivitása: a tripszinszerű (bázikus aminosavak után hasít), a kimotripszinszerű (aromás aminosavak után hasít) és a kaszpázszerű hidrolitikus aktivitás. Eukariótákban a kaszpáz-(β1), tripszin- (β2) és kimotripszinszerű (β5) aktivitást hordozó alegységek proformában termelődnek, majd enzimatikus hasítás következtében aktiválódnak (Akopian és mtsai, és Heinemeyer és mtsai, 1997). Mivel minden proteaszómában 2 β gyűrű található, az aktív centrumokból 6 áll rendelkezésre. Az aktív centrumok elhelyezkedését a gyűrűn mutatja az 2. B.ábra. 17

18 Az aktív centrumokat hordozó alegységek között allosztérikus szabályozás jön létre, a kimotripszinszerű aktivitás szubsztrátjai aktiválják az azonos gyűrűn lévő kaszpázszerű aktivitást, és a másik gyűrűn lévő kimotripszinszerű aktivitást (Kisselev és mtsai, 1999). 2. ábra. A 26S proteázkomplex felépítése. A. ábra: A proteaszóma hordó alakú szerkezete 2 α és 2 β gyűrűből áll, melyeket 7-7 alegység alkot α1-7, illetve β1-7 elrendeződésében. A proteaszómához két oldalról kapcsolódó több alegységes regulátor elemek, a 19S sapkák felépítésében ATPáz és nem ATPáz alegységek vesznek részt. B.ábra:Az aktív centrumok elhelyezkedése a β alegységekből felépülő gyűrűn. A kaszpázszerű és a tripszinszerű aktivitást hordozó β1 és β2 alegység egymás mellett helyezkednek el, míg a kimotripszinszerű aktivitással rendelkező β5 alegység ezekkel átellenben található. IFNγ hatására ezek a konstitutív elemek kicserélődnek indukált alegységekre, létrehozva az immunproteaszómát. 18

19 2.6. Proteaszómagátló vegyületek 3. ábra. A PS341, az epoxomicin, a klaszto-beta-lakton és az MG132 proteaszómagátló vegyületek szerkezeti képlete A különböző gátlószerek fontos segítséget nyújtottak a proteaszóma működésének, szerkezetének részletesebb megismerésében (Groll és mtsai, 2004, review). A korábban használt gátlószerek között megtalálhatóak reverzibilis és irreverzibilis hatásúak, melyek stabilitása és specifitása is eltérő. A kisszámú természetes eredetű vegyület mellett egyre több mesterségesen előállított gátlószer jelenik meg (Fischer és mtsai, 1995; Fenteany és mtsai, 1998; Meng és mtsai, 1999; Tanashi és mtsai, 1999; Abu- Farha és mtsai, 2005; Nandi és mtsai, 2006 review). A legtöbb gátlószer a proteaszóma 19

20 kimotripszin-szerű aktivitását gátolva éri el a kívánt hatást. A leghatékonyabb és legszelektívebb proteaszóma-gátlószerek a peptid-epoxi-ketonok (pl. epoxomicin), melyek irreverzibilis módon alacsony koncentrációban képesek a proteaszómaaktivitást specifikusan gátolni, így rendkívül toxikusak is. Az értekezés kísérletes részében alkalmazott proteaszómagátlók szerkezeti képletét ábrázolja a 3. ábra. Mivel a proteaszóma központi szerpet tölt be a sejt biokémiai folyamataiban, gátlása minden sejttípusban apoptózist indukál időtartamtól és koncentrációtól függően, azonban a tumorsejtek jóval érzékenyebben reagálnak rá, mint a normál sejtek. Ezt az előnyt kihasználva a proteaszómagátlók hatékony kemoterápiás szerek lehetnek. Mivel a proteaszómagátlók és kemoterápiás szerek egyaránt hatékonyan indukálnak apoptózist, kombinációjuk még hatékonyabb hatású lehet olyan esetekben, amelyekben az egyes szerek alkalmazása nem éri el a kívánt hatást (Cusack és mtsai, 2001; Mitsiades és mtsai, 2003; Denlinger és mtsai, 2004). Bizonyos esetekben azonban antagonista hatást mutattak ki a kemoterápiás szerek és a proteaszómagátlók között, ezt figyelték meg pl. a széles körben elterjedt etopozid esetében is. A proteaszómagátló-szerek megjelenése új tumorellenes terápia lehetőségét nyitotta meg. Az első klinikumban is használatos proteaszómagátló-szer a peptid-boronátok közé tartozó bortezomib (PS341) (Kane és mtsai, 2003). A bortezomib számos előnye a korábban kipróbált szerekhez képest, hogy nagymértékben specifikus és reverzibilis gátlásra képes, így a citotoxikus hatásai csökkenthetők (Richardson és mtsai, 2005, review). Számos vizsgálat támasztja alá a bortezomib tumorellenes hatását főleg hematológiai daganatokban (Orlowski és mtsai, 2006, review) és bizonyos szolid tumorok kezelésében (Ludwig és mtsai, 2005, review). A bortezomib kedvező és bizonyított tumorellenes hatásának következtében az első olyan proteaszómagátlószerré vált, melyet a különböző betegcsoportokon történt vizsgálatok után elsőként regisztrált az FDA (Food and Drug Administration, USA) (Kane és mtsai, 2003) a myeloma és a köpenysejtes lymphoma kemoterápiás kezelésére. A bortezomib alkalmazásának lehetőségei szolid tumorok kezelésében még kevéssé vizsgált terület. Az ezzel kapcsolatos közlemények száma rohamosan növekszik, ugyanakkor keveset tudunk a bortezomib, vagy egyéb proteaszómagátló-szerek más kemoterápiás szerekkel, vagy tumorellenes citokinekkel történő együttes alkalmazásának hatékonyságáról. 20

21 3. Proteaszómagátló-szerek és kemoterápiás szerek kombinált alkalmazásának lehetőségei Az utóbbi évek legsikeresebb kemoterápiás szerei közé tartoznak a mikrotubulusrendszer gátlószerei (pl. taxol) (Jordan és Wilson, 2004), amelyeket számos szolid tumor, többek között emlő- és petefészekrák kezelésében sikeresen alkalmaznak (Wildiers és Paridaens, 2004; Kita és mtsai, 2004). A legtöbb kemoterápiában alkalmazott szer a p53 aktiválásán keresztül fejti ki sejtpusztító hatását. A proteaszómagátlók alkalmazása a p53 stabilizálódásához vezet, mivel a p53 lebontása az Mdm2 fehérje közreműködésével proteaszómális úton valósul meg. Ez nagymértékben elősegítheti a kemoterápiás szerek apoptózist indukáló hatását (Williams és McConkey, 2003).A proteaszómagátlók alkalmazása más útvonalak aktiválásával, vagy gátlásával is segítheti a kemoterápia hatékonyságát. Az egyik ilyen útvonal - mely a proteaszóma-kutatás egyik legfeltártabb és legtöbbet emlegetett útvonala - az NF-κB aktivációja. Az NF-κB fontos túlélési faktor, melynek túlműködése a hematológiai eredetű malignitásokban gyakran fordul elő. A proteaszóma aktiválja az NF-kB funkcióját (lásd előző fejezet). Az NF-kB számos anti-apoptotikus fehérje expresszióját fokozza (pl. apoptózis inhibitor fehérjék: IAP, XIAP, Bcl-2 család fehérjéi) (Wang és mtsai, 1998). Az NF-κB útvonal gátlása miatt a proteaszómagátlók alkalmazása a különböző hematológiai malignitásokban, többek között myeloma multiplex és leukemiák kezelésében terápiás lehetőséget nyújtanak(montagut és mtsai, 2006; Cavo, 2006; Vink és mtsai, 2006). A fentiek alapján elmondható, hogy a kemoterápiás szerek és a proteaszómagátlók együttes alkalmazása hatékonyabb kezelést tehet lehetővé, azonban a kombinált kezelések hatásmechanizmusáról és hatékonyságáról leukémiákban nagyon kevés adat áll a rendelkezésünkre. Mindezek indokolttá teszik olyan vizsgálatok elvégzését, melyek ezeknek a folyamatoknak a feltárására irányulnak. 21

22 4. Proteaszómagátló-szerek és TRAIL kombinált alkalmazásának lehetőségei vastagbélrákok esetében Világviszonylatban a vastagbélrákok a malignus daganatok okozta halálozás második-harmadik helyén állnak (Midgley and Kerr, 1999). A kezelés lehetőségeit jelentősen csökkenti a vastagbéltumorok primer, illetve szerzett rezisztenciája a kemoterápiás kezelésekkel szemben, ezért nagy jelentőséget kapnak azok az új terápiás módszerek, amelyek hatékonyan, egyénre szabott módon harcolnak a vastagbéldaganatok ellen. Korábban kimutatták számos tumorsejtvonalon, illetve xenografton többek között vastagbéltumorokban is -, hogy a TRAIL citokin egyedüli, vagy kemoterápiás szerekkel együtt történt alkalmazása jelentős daganatellenes hatással bír (Gliniak és Lee, 1999; Kelley és mtsai, 2001; Naka és mtsai, 2002). A TRAIL, más néven Apo2L a TNF-családba tartozó II. típusú membránfehérje, melynek szolubilis és membránkötött formája is képes apoptózist indukálni különböző transzformált sejtekben, azonban nagy előnye, hogy az immunrendszer egyes sejttípusait leszámítva, a normál sejtek nem érzékenyek rá (Marsters és mtsai, 1996 és Wiley és mtsai, 1995). A TRAIL citokinnek eddig 5 különböző receptorát azonosították (Held és Schulze-Osthoff, 2001 és Shankar és Srivastava, 2004). A TRAIL a TRAIL-R1 (DR4) és a TRAIL-R2 (DR5) receptorokhoz kötődik és létrehozva a DISC-komplexet (Death Inducing Signaling Complex) apoptózist indukál (Bodmer és mtsai, 2000; Kischkel és mtsai, 2000 és Sprick és mtsai, 2000). A DISC-ben a trimerizált receptor intracelluláris részéhez a FADD adapter fehérjén keresztül kaszpáz-8 kötődik, majd autoaktiváció révén aktív kaszpáz-8 jön létre. I. típusú sejtekben a kaszpáz-8 aktivációja közvetlenül az effektor kaszpáz-3 aktivációját eredményezi (külső, vagy halálreceptor útvonal) (Scaffidi és mtsai, 1998), míg II. típusú sejtekben a TRAIL a mitokondriális útvonalat is aktiválja. Utóbbiban fontos szerepet tölt be a Bid fehérje kaszpáz-8 általi hasítása, majd a hasított forma transzlokációja a mitokondriumba. A Bid a Bax fehérjével komplexet képezve elősegíti a mitokondriális proapoptotikus faktorok, köztük a citokróm-c felszabadulását (Walczak és mtsai, 2000). A citokróm-c az Apaf1 fehérjével együtt részt vesz a kaszpáz-9 aktiválásában, amely képes a kaszpáz-3 aktivációját előidézni (Ashkenazi és 22

23 mtsai, 1998; Held és Schulze-Osthoff, 2001; Leblanc és Ashkenazi, 2003 és Shankar és Srivastava, 2004). A funkcionális intracelluláris doménnel rendelkező receptorok mellett ismert még 2 ún. csalireceptor (DcR1/2), melyek hiányzó doménjeik miatt nem képesek apoptotikus jelet közvetítetni a sejt felé, overexpressziójuk azonban védelmet biztosít a TRAIL által indukált apoptózissal szemben. Ismert továbbá a TRAIL szolubilis receptora, az osteoprotegerin, melynek szerepe a csontfejlődést szabályozó hatásán kívül nem tisztázott (Aubin és mtsai, 2000, review). Különböző vizsgálatok kimutatták azt is, hogy a halálligandot megkötő és a sejtek felé ezután apoptotikus jelet közvetítő TRAIL-R1 és TRAIL-R2 receptorok expressziója igen magas vastagbéltumorokban (Alderson és mtsai, 2003; Pukac és mtsai, 2003; Halpern és mtsai, 2004; Johnson és mtsai, 2004; Halpern és mtsai, 2004 és Roach és mtsai, 2004), így a TRAIL receptorok aktiválása mint tumorellenes terápia több lehetőséget kínál. Humán rekombináns TRAIL ( aminosav) alkalmazása állatkísérletekben jelentős sikereket hozott, a legkülönbözőbb humán tumorokban (köztük vastagbéltumorokban) növekedésgátlás, illetve citotoxicitás volt megfigyelhető (Gliniak és Li, 1999, Naka és mtsai, 2005). Másfajta lehetőséget kínál a humán agonista monoklonális ellenenyagok alkalmazása, melyeknek különböző variációi szintén klinikai vizsgálatok alatt állnak (Lee és mtsai, 2004). Utóbbiak előnye a rekombináns TRAIL-terápiával szemben, hogy specifikusan a TRAIL-R1 illetve TRAIL-R2-höz kötnek, kizárva ezzel a csalireceptorok gátló hatását. A vastagbéltumorok tehát jó terápiás célpontjai a TRAIL kezelésnek (Van Geelen és mtsai, 2004; Finnberg és mtsai, 2006), azonban vannak olyan vastagbéltumorok, amelyek rezisztensek a TRAIL kezeléssel szemben, ezekben az esetekben olyan kombinált kezelést kell találnunk, amely helyreállítja a tumor TRAIL-lel szembeni érzékenységét. A rezisztencia kialakulása több szinten valósulhat meg. A receptorok szintjén a DR4/DR5 receptorok glikozilációja, a receptorok nem megfelelő eloszlása a sejtfelszínen, a csalireceptorok túlzott termelése, a receptorgének promotereinek metilációja és a receptorok génjeit hordozó kromoszómaszakasz deléciója mind TRAILlel szembeni érzéketlenséghez vezet (Horak és mtsai, 2005; Sanlioglu és mtsai, 2005; Riccioni és mtsai, 2005). TRAIL-rezisztencia alakulhat ki abban az esetben is, ha a receptorok aktiválódását nem követi megfelelő kaszpáz-8 vagy -10 aktiválódás. Ennek hátterében a kódoló gének deléciója, mutáns kaszpáz-8 fehérjék expressziója, illetve a 23

24 promoterek metilációja állhat. Megfelelő minőségű kaszpáz-8 termelése esetén is megfigyelhető rezisztencia. Ez egyrészt a CARP fehérjék közreműködésével a kaszpáz- 8-nak a proteaszóma által megvalósított lebontása miatt alakul ki, másrészt a kaszpáz-8 és -10 enzimet gátló c-flip fehérje DISC-be történő bekötődése válthatja ki (McDonald és mtsa, 2004; Kim és mtsa, 2001, review). A mitokondrium szintjén a Bax mutációja állhat az elmaradt apoptózis mögött II. típusú sejtekben (LeBlanc és mtsai, 2002). Végül az IAP fehérjék túltermelése - amit elsősorban a survivin és a XIAP esetén figyeltek meg - szintén TRAIL-lel szembeni rezisztenciát eredményez, mivel ezek a fehérjék a kaszpázaktivációt gátolják (Kawasaki és mtsai, 1998; Lin és mtsai, 2003; Yang és mtsai, 2003). A fenti, az apoptotikus folyamatok zavarát jelentő lehetőségek közül vastagbéltumorokban a TRAIL receptorok glikozilációját, mutáns kaszpáz-8 fehérje termelődését, a CARP enzimek túltermelődését, a c-flip jelentőségét és a survivin, illetve XIAP fehérje overexpresszióját mutatták ki mint a TRAIL-lel szemben kialalkult rezisztencia okait (Endo és mtsai, 2004; Van Geelen és mtsai, 2004; review; Hernandez és mtsai, 2001; Burns és mtsai, 2001). A proteaszómagátló-szerek TRAIL-lel való együttes alkalmazását vastagbéltumorokban számos eddigi megfigyelés indokolja. Egyre nő azoknak a közleményeknek a száma, amelyek a két szer együttes alkalmazásának hatékony tumorellenes hatásáról számolnak be különböző malignus elváltozásokban (Barille- Nion és mtsai, 2003, review, Van Geelen és mtsai, 2005, review; Sayers és mtsai, 2006, review). A fentiekben már említett TRAIL elleni rezisztencia hátterében álló IAPsurvivin fehérjeszint emelkedés, mely a vastagbéltumorok 64%-ban kimutatható (Lin és mtsai, 2003), gátolható proteaszómagátló-szer adásával, amely a survivin/xiap expressziójának csökkenését az NF-κB aktivációjának gátlásával éri el. Bár a jelenlegi ismereteink szerint a DR4 és DR5 túltermelése általában már nem növeli a sejtek TRAIL-lel szembeni érzékenységét, a proteaszóma gátlása fokozza ezeknek a receptoroknak az expresszióját a sejtfelszínen, így megemelhető az apoptotikus jeleket továbbító receptorok aránya a csali receptorokkal szemben (Lee és mtsai, 2004). A proteaszóma gátlásakor a kaszpáz-8 enzimek CARP-mediálta lebontása is szünetelhet. A felsorolt példák tehát alátámasztják olyan vizsgálatok jelentőségét, amelyek 24

25 TRAIL-rezisztens vastagbéltumorokban a TRAIL és proteaszómagátlók kombinált alkalmazási lehetőségeit és ezek hatásmechanizmusát vizsgálják. 25

26 5. Célkitűzés Munkám célkitűzése az volt, hogy megismerjem a proteaszómagátló-szerek hatását két daganatellenes kezelés, a mitokondriális útvonalat aktiváló mikrotubulus-gátlás és a halálreceptor aktiváció által kiváltott sejthalálban. Ezek a preklinikai molekuláris farmakológiai információk segíthetnek a kombinációs terápiák tervezésében, a gyógyszerhatékonyságot előrejelző diagnosztikus eljárások és új hatékonyabb terápiák kifejlesztésében Proteaszómagátlás hatásának vizsgálata a mikrotubulusgátló nokodazol-indukált apoptózisra promyelocitas leukemia sejtekben. Mivel a belső, mitokondriális útvonalon ható kemoterápiás szerek esetében több esetben is leírták a proteszómagátlók antagonista hatását, egy széleskörben elterjedt kemoterápiás kezelés, a mikrotubulusgátlás esetében vizsgáltam a proteaszómagátlók lehetséges szinergista, vagy antagonista hatását. A vizsgálatokat párhuzamosan elvégeztem etopozid indukálta apoptózisban is. Az etopozid esetében részletesebben ismert a proteaszómagátlás antagonista szerepe, így a két rendszert összehasonlítva vontam le a következtetéseket. Ebben a kísérletsorozatban HL60 promyelocitas leukemiasejteket kezeltem a mikrotubulusgátló nokodazollal MG132, illetve Klaszto-beta-lakton (CBL) proteaszómagátló-szerekkel együtt. Vizsgáltam az egyes szerek együttes hatásának hátterében álló molekuláris mechanizmusokat. 26

27 5.2. Proteaszómagátlás hatásának vizsgálata a halálligand, TRAILindukált apoptózisra vastagbélráksejtekben. Mivel a mitokondriális útvonalat aktiváló nokodazol-kezelés esetében is a proteaszómagátlók antagonista hatását figyeltem meg, ezért vizsgáltam a külső, halálreceptor útvonalat aktiváló TRAIL esetében a proteaszómagátlók lehetséges szinergista, vagy antagonista hatását. Kísérleteimben TRAIL-rezisztens RKO vastagbélráksejteket különböző proteaszómagátló-szerekkel érzékenyítettem a TRAIL apoptózist indukáló hatásával szemben. Vizsgáltam az érzékenyítés hátterében álló molekuláris mechanizmusokat, ezeken belül is elsősorban a mitokondrium szintjén zajló folyamatokat. 27

28 6. Anyagok és módszerek 6.1. Alkalmazott anyagok, vegyszerek Kísérleteinkben az alábbiakban felsorolt vegyszereket használtuk: a Z-VAD-FMK-t (Z-Val-Ala-Asp (OMe)-FMK az Enzyme System Products-tól; a nocodazolt (Noc), etopozidot (Eto), MG132-t (MG), klaszto-β-lakton-t (CBL), Ac-DEVD-AMC-t (Acetil- Asp-Glu-Val-Asp-7-amino-4-metilkumarin), Suc-LLVY-AMC-t (Sukcinil-Lys-Lys- Val-Tyr- amino-4-metilkumarin) a Sigma-Aldrich Kft-től vásároltuk. A felsorolt vegyszerek mindegyikéből dimetil-szulfoxidot (DMSO, Sigma-Aldrich) használva készítettük el a törzsoldatot, amelyet -20ºC-on tároltunk, majd a kezeléseknél tenyésztőmédiumban a megfelelő végkoncentrációra higítottunk, úgy, hogy a DMSO mértéke nem haladta meg a 0.1%-ot. További vegyszerek: az etídium-bromidot a Calbiochem-től, a Triton-X 100-at a Serva-tól, a D(+) glükózt a Reanal-tól, a fötális borjú szérumot (FBS) a Sigma- Aldrichtól szereztük be. A Western-blot-hoz használt anyagok közül az egér monoklonális anti-human Hsp70 ellenanyagot a Transduction Laboratories-től, a tormaperoxidáz-konjugált (HRPO) kecske anti-egér IgG ellenanyagot a Southern Biotechnology-tól, a Vectastain ABC Kit-et a Vector Laboratories-tól, a 3,3 -diaminobenzidin-t (DAB) a Dako-tól rendeltük meg. Az itt fel nem sorolt egyéb vegyszerek mindegyike a Sigma-Aldrich cég, az általunk használt műanyagáruk mindegyike pedig a Sarstedt terméke volt Sejt- és szövettenyésztés, a kezelések menete A HL-60 promyelocitas leukemia és az RKO vastagbélráksejtvonalakat az ATCC sejtbankból szereztük be; fenntartásuk L-gutamint tartalmazó RPMI-1640 (Sigma) tápfolyadékban történt, amelyet 10% FBS-sel egészítettünk ki. A tenyészeteket 37ºC-os, 28

29 5% CO 2 -ot tartalmazó inkubátorba helyeztük. A kísérletekhez használt tenyészetek mindegyike exponenciális növekedési fázisban volt. A HL-60 sejteket a kísérletek megkezdése előtt 2 órával 2 x 10 5 sejt/ml sűrűségben raktuk ki 24-lyukú tálcára. A kezelések során a sejteket 200 nm nocodazollal (NOC) 12 óráig előinkubáltuk (éjszaka), majd ezt követően további 8 órát inkubáltuk a sejteket a következő proteázgátlók jelenlétében: 3 μm MG-132 vagy 10 µm klaszto-β-lakton (CBL) vagy 100 μm Z-VAD-FMK. Ezzel párhuzamosan 30 perces előinkubálást követően a fent említett proteázgátlókkal 6 óráig kezeltük a HL-60 sejteket 10 µm etopoziddal. Az RKO sejteket 24 órával a kezelések megkezdése előtt raktuk ki, hogy a tenyészetben lévő sejtek letapadjanak a műanyag felülethez és exponenciális növekedési fázisba kerüljenek. A kinetikai vizsgálatok során a proteaszómagátlókkal [1 μm epoxomicin (EPO, Boston Biochemicals), vagy 3 μm MG-132 (Calbiochem) vagy 3 μm PS341/bortezomib (Millennieum Inc. Ajándéka)] történt fél órás előinkubálást követően a sejteket további 13 órán át kezeltük 60 ng/ml TRAIL-lel. Kontollként DMSO kezelést alkalmaztunk. Ezzel párhuzamosan a kaszpázagátlószerek adásakor a sejteket előkezeltük 50 µm Z-VAD-FMK-val vagy 10 µm Z-IETD-FMK-val, ezt követően 30 percig inkubáltuk a tenyészetet a proteaszómagátló epoxomicinnel, majd TRAIL kezelésnek vetettük alá. Mind a HL-60, mind az RKO sejtek esetén a kezelések eredményeképpen jelentkező apoptotikus DNS-fragmentációt áramlási citométerrel vizsgáltuk. A kezelések menetét egyszerűsítve ábrázoltam: 29

30 6.3. Apoptotikus DNS-fragmentáció vizsgálata áramlási citometriával (FACS, Becton-Dickinson) A kezeléseket követően a sejteket összegyűjtöttük, RKO sejtek esetén az úszó és letapadt sejteket egyaránt, majd centrifugálással (200g, 3min) eltávolítva a tápfolyadékot -20ºC-os, 70%-os etanolban fixáltuk a mintákat (így tárolhatóak -20ºC-on a vizsgálat kivitelezéséig). Az apoptózis során keletkező DNS darabok a fixálást követően eltávolíthatóak a sejtekből egy alkalikus extrakciós puffer segítségével (200 mm dinátrium-foszfát, a ph mm citromsavval beállítva). A puffer kioldja a sejtekből a kisméretű nem fixált DNS darabokat, így az apoptózison átesett sejtek DNS tartalma alacsonyabb lesz (Mihalik és mtsai, 1996). Az alkalikus pufferhez 100 µg/ml végkoncentrációban RNázt is adunk az RNS lebontására, amely a későbbiekben zavarná a mérést. A megfelelő mértékű extrakcióhoz a mintákat 20 percig inkubáltuk szobahőmérsékleten az extrakciós pufferben, majd 10 μg/ml végkoncentrációban etídium-bromiddal egészítettük ki az oldatot, amely 15 perc inkubáció után bekötődve a sejtek DNS-éhez megjelöli azokat (Mihalik és mtsai, 1996). Az extrakciót és festést követően a mintákat áramlási citométerrel vizsgáltuk, amelynek segítségével elkülöníthető és mennyiségileg mérhető a csökkent DNS tartalmú apoptotikus sejtek (subg 1 ) aránya. A nocodazollal kezelt sejtek esetében az ábrákon közölt adatok a 12 órás előinkubálást követő 8 óra alatt történt változásokat mutatják Kaszpáz- és proteaszómaaktivitás mérése A kaszpázaktivitás méréséhez a kezelések leállítása után a sejteket összegyűjtöttük, majd PBS-sel történő mosást követően 100 µl kaszpázaktivitás pufferben vettük fel őket (CAP: 50 mm TRIS-HCl, 100 mm NaCl, 5 mm EDTA, 1 mm EGTA, 0.2 % CHAPS; ph 7.3). A puffert a mérés előtt kiegészítettük 10 mm ditiotreitol-lal (DTT). A proteaszómaaktivitás mérésekor a sejteket 5mM EGTA-t tartalmazó PBS-ben reszuszpendáltuk (az EGTA a Mg 2+ ionokat elvonva a kalpain aktivitását gátolja, 30

31 azonban a proteaszómaaktivitást nem). A kaszpázaktivitás kimutatásához Ac-DEVD- AMC (25µM végkoncentráció) mesterséges fluorogén szubsztrátot adunk a mintákhoz (100 µl CAP pufferben, amely a a sejtek lízisét elősegítő 1% Triton-X 100-at tartalmazott). A proteaszómaaktivitás kimutatásához Suc-LLVY-AMC (25 µm végkoncentráció) mesterséges fluorogén szubsztrátot adtunk, amely a gyártó és a szakirodalom szerint is a proteaszóma kimotripszinszerű aktivitásásnak szubsztrátja. A szubsztrátot 100 µl 5 mm EGTA-t és 1% Triton-X 100-at tartalmazó PBS-ben adtuk a mintákhoz. Az enzimatikus aktivitás következtében a szubsztrátokból felszabaduló AMC (aminokumarin) fluoreszcenciáját 380nm gerjesztési és 460nm emissziós hullámhosszon mértük 20 percig 5 percenként Fluoroskan Ascent tálcaleolvasó műszerrel (Thermo). Az aktivitási görbék ezek mellett a feltételek mellett a lineáris tartományban voltak Mitokondriummembrán depolarizációjának vizsgálata áramlási citometriával A nem fixált sejtekhez a kezeléseket követően 10 nm DiOC 6 festéket adtunk, majd 15 percig inkubáltuk a mintákat 37ºC-on, 5% CO 2 tartalom mellett. A mérés elve, hogy a pozitív töltésű festék felhalmozódik az ép mitokondriumokban, míg az apoptózison átesett sejtek mitokondriumának membránja integritását elvesztve kevesebb festéket képes a mitokondriumokban tartani. A sejteket párhuzamosan propídium-jodiddal is jelöltük, amely csak a károsodott plazmamembránú sejtekbe jut be (nekrotikus), azokban festi a DNS-tartalmat. Az egyes sejtekben a fluoreszcencia intenzitást áramlási citométerrel mértük. Az értékelésnél apoptotikus sejteknek az ép plazmamembránnal rendelkező sejteket tekintettük (propídium-jodid negatív sejtek), ezekben vizsgáltuk a DiOC 6 felhalmozódásának változását az ép sejtekhez (propídium-jodid negatív és DiOC 6 negatív sejtek) képest. 31

32 6.6. Western-blot analízis Hsp70 Western-blot A HL-60 sejtek vizsgálatakor 10 6 sejtet kezeltünk a fentiekben leírtak szerint. A kezeléseket követően a sejteket PBS-sel mostuk kétszer, hogy az üledékről a tápfolyadékot eltávolítsuk, majd a sejteket 40 µl jéghideg desztillált vízben vettük fel, majd 10 µl 6x lízis puffert adtunk hozzá (300 mm TRIS-HCl ph 6.8, 12% SDS, 0.6% brómfenolkék, 60% glicerol, 600 mm DTT frissen hozzáadva az oldathoz). A mintákat 3 percig forraltuk, majd a fehérjetartalmat Bradford-módszerrel határoztuk meg. Az elektroforézis során 12.5% akrilamid gélt használtunk, amelyre 20 µg fehérjét vittünk fel minden egyes mintából. Az általunk használt monoklonális ellenanyag (Transduction Laboratories) mind a konstitutívan, mind az indukálhatóan termelődő Hsp70 formát képes kimutatni. Az előhíváshoz Vesctastain ABC Kit-et (Vector Laboratories) és DAB-ot használtunk kromogén szubsztrátként Pro-és antiapoptotikus fehérjék kimutatása Western-blottal Az 70% konfluens 75 cm 2 felületű flaskában tenyésztett RKO sejteket (kb. 2x10 7 sejt) 30 percig előinkubáltuk epoxomicinnel, majd 3, illetve 5 órát kezeltük TRAIL-lel. A sejteket tripszin-edta oldattal felszedtük a flaskáról, megmostuk PBS-sel, majd 250 µl lízis pufferben felvettük [3 mm TRIS, 150 mm NaCl, 1% TRITON-X 100, 10% glicerol, 1 mm PMSF és proteázgátló koktél (Sigma)]. Minden mintát 3 percig forraltunk, a fehérjetartalmat Bradford-módszerrel határoztuk meg. 10 illetve 20 µg fehérjét vittünk fel 4-20% grádiens akrilamidgélre (Bio-Rad). Az általunk használt anti-humán ellenanyagok a következők voltak: anti-kaszpáz-3, -8, anti-xiap (MBL); anti-bcl-2, -X L (Transduction Laboratories); anti-survivin (RD Systems); anti-aktin (Sigma-Aldrich). Az előhíváshoz Vectastain ABC Kit-et és ECL Plus kemilumineszcens szubsztrátot (Amersham) használtunk. 32

33 Mitokondriális proapoptotikus fehérjék citoplazmatikus felszabadulásának vizsgálata A kísérletekhez 75 cm 2 méretű tenyésztőflaskában növesztettük az RKO sejteket addig, amíg a 70-80% konfluenciát elérték, majd a sejteket epoxomicinnel és TRAIL-lel kezeltük a fent leírtak szerint. A kezelések végén a sejteket tripszin-edta hozzáadásával eltávolítottuk a flaska felszínéről, majd 2 ismételt PBS-sel történő mosást követően a sejtüledékből szétválasztottuk a mitokondriális és a citoplazmatikus frakciót ApoAlert Cell Fractionation Kit (Clontech) segítségével a gyártó leírását követve. Az így előállított frakciókat Western -blot analízisnek vetettük alá. A vizsgálatokhoz 10 μg fehérjét használtunk. Az általunk használt anti-humán ellenanyagok a következőek voltak: poliklonális anti-citokróm-c (a kit tartalmazta, Clontech), poliklonális anti- Smac/Diablo (MBL), monoklonális anti-aif (SantaCruz) és poliklonális anti- Omi/HtrA2 ellenanyag (Dr. ES Alnemri bocsátotta a rendelkezésünkre, Philadelphia, USA) Smac/Diablo fehérje expressziójának gátlása RNS interferencia (RNAi) módszerrel Smac/Diablo mrns-t célzó shrns konstrukciók létrehozása A Smac/Diablo fehérje expressziójának gátlását mrns szinten gátoltuk az ún. sirna (silencing RNA/ small interfering RNA/RNA interference) technikával, melynek lényege, hogy a target mrns szekvencia részleteit kódoló hairpin szerkezetű kis shrns molekulákat a sejtbe juttatva azokat egy fehérjekomplex, a RISC mintaként használva megtalálja a megfelelő mrns molekulát és azt hasítja. A hasított mrns instabillá és egyéb RNáz enzimek célpontjává válik. Az mrns molekula szekvenciaspecifikusan történő lebontását indukálva gátolható az mrnsről történő transzláció (Chang és mtsai, 2006, review; Snove és mtsai, 2006, review; Montgomery, 2004, review). 33

34 Az shrns szekvenciákat a Smac/Diablo mrns szekvencia alapján (Smac mrna variant 3) terveztük meg az exon-exon határokat is figyelembe véve. Az shrns oligokat a Promega U6 sistrike-hmgfp rendszerének megfelelően terveztük. A vektor linearizált formában van jelen, ragadós végeket tartalmaz, ezek segítségével történik a cél mrns szekvencia alapján megtervezett shrns oligo vektorba ligálása. Az oligokat DNS formában szintetizáltatjuk HPLC tisztítással kiegészítve (IDT-BioScience), ezeket a ligálás előtt anelálljuk. A vektorban az shrns inszertet megelőzően található az U6 promoter, mely az RNS polimeráz III promotere. A polimeráz az inszertről dupla szálú RNS molekulákat készít, ezt az teszi lehetővé, hogy a dupla szálú RNS-nek megfelelő szekvenciát kinyújtva tervezzük meg, az összehajtódást a tervezett loop szekvencia teszi lehetővé az átíródás után. A szekvenciák beépülésekor a szekvencia végén található bázissorrend a vektorban található bázissorrenddel kiegészülve egy PstI. (Sigma-Aldrich) hasítóhelyet hoz létre (egy másik hasítóhely is található a vektorban). A vektorokat a mellékelt protokoll szerint megemésztve az inszertet is tartalmazó vektorokból kihasad egy 1100 bp méretű szakasz, a vektor pedig 5000 bp méretnél lesz látható agaróz gélelektroforézis után 1% gélben. Amennyiben az inszert nincs jelen, a vektor csak felnyílik a második PstI. hasítóhelynél és nem látjuk az inszertnek megfelelő csíkot. Kísérleteinkben 2 shrns szekvenciát terveztünk és klónoztunk a sistrike vektorba, ezeket a konstrukciókat Smac1-GFP és Smac2-GFP néven jelöltük. A tervezett shrnsek szekvenciája az alábbi volt: Smac1 shrns: 5'-ACCGCGGTGTTTCTCAGAATTGATTCAAGAGATCAATTCTGAGAAACACCGCTTTTTC -3' Smac1shRNS komplementer: 5'-TGCAGAAAAAGCGGTGTTTCTCAGAATTGATCTCTTGAATCAATTCTGAGAAACACCG -3' Smac2 shrns: 5'-ACCGCACCCTGTTTAACATTTCATTCAAGAGATGAAATGTTAAACAGGGTGCTTTTTC -3' Smac2 shrns komplementer: 5'-TGCAGAAAAAGCACCCTGTTTAACATTTCATCTCTTGAATGAAATGTTAAACAGGGTG -3' 34

35 RKO sejtek tranziens transzfektálása Nucleofector módszerrel A sejtek transzfektálásakor 3 módszert használtunk, eredményességüket az U6 sistrike vektorról expresszálódó hmgfp fluorescens fehérje termelődésével ellenőriztük fluorescens mikroszkóp és áramlási citometria segítségével. A kísérletek során többszöri próbálkozás után sem a CaPO 4 transzfekció, sem a lipofectamin transzfekció nem bizonyult hatékonynak. További próbálkozások egy új, elterjedőben lévő transzfektálási módszer segítségével történtek. A Nucleofector módszer (Amaxa) elektroporáción alapszik, mely speciális, különböző sejttípusokra optimalizált pufferekben történik. A módszer során a transzfekció optimális körülményeit és a hatékonyságot a cég által előállított p max -GFP vektor párhuzamos transzfektálásával ellenőriztük, mely optimális esetben 80-90%-ban jut be a sejtekbe. Kísérleteinkben minden transzfekcióhoz 10 6 RKO sejtet használtunk. Az általunk optimalizált kondíciókkal a kontroll p max -GFP vektorral 55%-ban, a Smac 1 és Smac 2 psistrike vektorral kb %-ban tudtuk transzfektálni a sejteket. Az optimalizált protokoll szerint az RKO sejteket Nucleofection V oldattal és T020 programmal transzfektáltuk. A transzfektálást követően a sejteket 48 óráig növesztettük tenyésztőmédiumban. A transzfekció hatékonyságát a transzfektálást követő 24. órában fluoreszcens mikroszkóppal, a 48. órát követően áramlási citometriával ellenőriztük. A sejteket tripszinnel eltávolítottuk a tenyésztőedényről, centrifugálással (200g, 3 min) eltávolítottuk a tripszin és médium maradékát, melyek zavarnák a mérést, majd a sejteket 1 ml PBS-ben vettük fel. Ezt követően a mintákhoz 10 μg/ml végkoncentrációban propídium-jodidot adtunk, melyet csak a membránkárosodott (pusztult) sejtek vesznek fel. A mérés során a hmgfp fluoreszcenciáját az FL-1 csatornán (zöld) detektáltuk, ezzel párhuzamosan az FL-3 (piros) csatornán detektáltuk a propidium-jodiddal festődött sejtek fluoreszcenciáját. A mérések során kapuzással állapítottuk meg, hogy milyen mértékű volt a transzfekció hatékonysága. A közel 50%- os hatékonyságot elegendőnek ítéltük meg ahhoz, hogy a transzfektált sejtek elválasztása (szorterezése) nélkül is vizsgálni tudjuk a későbbiekben az shrns konstrukciók biológiai hatását. A sejteket a kísérletek során a fentiekben leírtaknak 35

36 megfelelően epoxomicinnel, PS341-el és TRAIL-lel kezeltük és apoptózisvizsgálatnak vetettük alá Statisztikai analízis, az adatok elemzése Minden kísérletet háromszor ismételtünk meg egymástól függetlenül. Az ábrázolt adatok a kapott eredmények átlagát és a standard devianciát (szórás) ábrázolják. A statisztikai analízist párosított Student-féle T-próbával végeztük, a különbséget akkor tekintettük szignifikánsnak, ha a p<

37 7. Eredmények 7.1. A mikrotubulusgátló nokodazol által kiváltott apoptózis befolyásolása proteaszómagátló-szerekkel A nokodazol kezelés indukálta sejtciklusgátlás és az ezt követő apoptózis vizsgálat 4. A. ábra. HL60 sejtekben a nokodazol kezelés G2/M sejtciklusgátlást indukál 12 órás kezelést követően. 20 órás kezelés apoptózist indukál a sejtek 38-40%-ában. A: DNS hisztogramok a kontroll, 12 órás és 20 órás kezelésekről. A kontroll mintán látható legmagasabb csúcs a G1 fázisban lévő sejteket, a kisebbik csúcs a G2 fázisban lévő sejteket mutatja. A 12 órás kezelésnél a sejtek a G2 fázisban felhalmozódnak, míg 20 órás kezelésnél csökkent DNS tartalmú apoptotikus sejtek (subg1 sejtek ) is megjelennek. B: A nokodazol kezelés indukálta apoptotikus DNS-fragmentáció kinetikai vizsgálata. A DNS-fragmentáció (subg1 sejtek) 12 órás kezelést követően emelkedik meredeken. Az ábrázolt adatok 3 független kísérlet átlagait mutatják. 37

38 A HL60 sejteket 200 nm nokodazollal 20 óráig kezeltük a korábban közölt adatoknak megfelelően (Matsuhisa, 2001). Az apoptózis mértékét a nukleoszómális DNS-fragmentáció áramlási citometriás (FACS) vizsgálatával állapítottuk meg (subg1=apoptotikus sejtek). Kimutattuk, hogy 12 órás nokodazol kezelést követően a sejtek nagy része felhalmozódik a G2/M fázisban (4. A. ábra). Az apoptózis mértékének kinetikai vizsgálata azt mutatta, hogy a 12 órás kezelést követő sejtciklus gátlás után a sejtek 38%-a apoptózissal elpusztul (20 óra); a sejtpusztulás mértéke a 12. órát követően emelkedik jelentősen (4. B. ábra) A proteaszómagátlók és kaszpázgátló-szer okozta apoptózisgátlás 5 A. ábra. A proteaszómagátlók hatása a DNS-fragmentáció mértékére nokodazol és etopozid indukálta apoptózisban. A: 12 órás nokodazollal való előkezelést követően a sejteket további 8 órát kezeltük a jelölt proteázgátlószerekkel. B. ábra. A sejteket 30 percig előkezetük a jelölt proteázgátlószerekkel, majd 6 órán át kezeltük etopoziddal. (Noc-nokodazol;Eto-etopozid; CBL-klaszto-beta-lakton; MG-MG132; VAD-Z- VAD.fmk). Az ábrázolt adatok 3 egymástól független kísérlet eredményeinek átlagát jelentik. A sejteket 200nM nokodazollal 12 óráig kezeltük, majd további 8 órát inkubáltuk 100 µm Z-VAD-fmk (Z-VAD) vagy különböző proteaszómagátlók jelenlétében (MG132 3µM; CBL 10µM). Az apoptotikus DNS-fragmentációt ábrázoltuk az 5.A. ábrán. A 20 órás nokodazol kezelés 24% apoptózist eredményezett, amelyet az általános 38

39 kaszpázgátló-szer, a Z-VAD teljes mértékben (1%, p=0.007) gátolt. Az Mg132 szignifikáns mértékben (7.75%, p=0.033), a CBL pedig jelentős mértékben, de nem szignifikánsan gátolta a nokodazol indukálta apoptotikus DNS-fragmentációt (16%, p=106). Az alkalmazott koncentrációkban és időtartamban a proteázgátlószerek nem voltak toxikus hatásúak a sejtekre. A kísérleteket párhuzamosan elvégeztük etopozid indukálta apoptózisban is, ahol azt tapasztaltuk, hogy 10µM etopozid a HL60 sejtekben 6 órás kezelést követően 57% apoptózist indukált, amely Z-VAD-val teljes mértékben (2%, p=0.002), proteaszómagátlókkal szignifikáns mértékben (MG132 16%, p=0.004; CBL 19%, p=0.004) gátolható volt A kaszpáz-3 aktivitás vizsgálata nokodazol indukálta apoptózisban és a proteaszómagátlók hatása az aktivitásra 6. ábra. A proteaszómagátló-szerek hatása a kaszpáz-3 (DEVDáz) enzimaktivitásra nokodazol és etopozid indukálta apoptózisban. A: Kaszpáz-3 aktivitás nokodazollal 12 óráig előkezelt, majd a jelölt proteázgátlószerekkel további 8 óráig kezelt sejtlizátumokban. B: Kaszpáz-3 aktivitás a jelölt proteázgátlókkal 30 percig előkezelt, majd etopoziddal további 6 óráig kezelt sejtlizátumokban. (Nocnokodazol;Eto-etopozid; CBL-klaszto-beta-lakton; MG-MG132; VAD-Z-VAD.fmk). Az ábrázolt adatok 3 egymástól független kísérlet eredményeinek átlagát jelentik. 39

40 Ebben a kísérletsorozatban a kaszpáz-3 szerepét vizsgáltuk. A kísérletek első menetében ex vivo enzimaktivitás esszében megvizsgáltuk, hogy a különböző proteázgátlók mennyire specifikusak, illetve hogy az egyes gátlószerek egymás célenzimét képesek-e aspecifikusan gátolni. Azt tapasztaltuk, hogy a kaszpázgátló Z- VAD specifikusan gátolta a kaszpáz-3 aktivitását, a proteaszómagátlók pedig a proteaszóma aktivitását anélkül, hogy a kaszpáz-3 aktivitását befolyásolták volna (nem ábrázolt adatok). Ezt követően kaszpáz-3 aktivitást mértünk nokodazollal kezelt sejtekben Z-VAD és proteaszómagátlók (MG132, CBL) jelenlétében, illetve ezek nélkül (6. A. ábra). Azt tapasztaltuk, hogy a nokodazol indukálta kaszpáz-3 aktivitást a Z-VAD teljes mértékben gátolta (gátlás mértéke=97%, p=0.009), azonban sem az MG132 (p=0.604), sem a CBL (p=0.603) nem gátolta az enzimaktivitást. (Az MG132 szignifikáns, a CBL jelentős mértékben, de nem szignifikánsan gátolta az apoptotikus DNS-fragmentációt!) Az etopozid által kiváltott kaszpáz-3 aktivitást mindhárom proteázgátlószer gátolta: a Z-VAD teljes mértékben (gátlás mértéke:97%, p=0.001), az MG132 53%-ban (p=0.008), a CBL pedig 52%-ban (p=0.004) gátolt (6. B. ábra) Az Hsp72 fehérje szintjének vizsgálata nokodazollal és MG132-vel kezelt sejteken 7. ábra. A proteaszómaaktivitás gátlása az indukálható Hsp72 fehérje mennyiségét megnöveli a proteaszómagátlókkal kezelt sejtlizátumokban. (cont-kontroll; Noc-nokodazol 20h; MG-MG132 8h; Noc+MG- nokodazol 20h+ MG132 8h) 40

41 Kísérleteinkben vizsgáltuk a Hsp70 fehérje szerepét nokodazol-indukált apoptózisban. A kísérleteinkben használt monoklonális ellenanyag a Hsp70 konstitutív (Hsp73) és indukálható (Hsp72) formáját is képes kimutatni. Eredményeink azt mutatják, hogy a Hsp73 fehérje mennyiségét sem a nokodazol, sem az MG132 nem befolyásolta a kontrollhoz képest, azonban az MG132 a nokodazollal kezelt és nokodazollal nem kezelt sejtekben a Hsp72 szintjét megemelte (7. ábra.) A halálligand TRAIL hatásának fokozása proteaszómagátlószerek segítségével TRAIL-rezisztens vastagbélráksejtvonalon Különböző proteaszómagátló-szerek érzékenyítő hatása vastagbélráksejtekben TRAIL által indukált apoptózisban A kísérleteinkben használt RKO vastagbélráksejteket különböző proteaszómagátlószerekkel előkezeltük 30 percig a következő koncentrációkban: 3μM MG132, 1μM epoxomicin, 1μM PS341. Az előinkubálást követően a sejteket 60ng/ml koncentrációban kezeltük TRAIL liganddal további 13 óráig. A mintákat különböző időpontokban fixáltuk, majd áramlási citometriával meghatároztuk a fragmentált DNS tartalmú sejtek (apoptotikus) százalékát (8. ábra) Önmagában egyik szer sem vezetett apoptózishoz a 10. óráig, a 3 proteaszómagátló közül azonban az epoxomicin jelentős mértékű apoptózist indukált (37%+/-4%) 13 órás kezelés után. A kombinált kezelésekben az epoxomicin/trail kezelés már 6 óra elteltével 40%+/-3% apoptózist eredményezett, amelynek mértéke tovább emelkedett 83%-ig a 10. óráig. Ehhez hasonlóan a PS341/TRAIL kezelés6 óránál 41%+/-5% apoptózist indukált, ami 13 óra után érte el a maximumát, 82%-ot. 41

42 8. ábra. Különböző proteaszómagátló-szerek érzékenyítő hatása TRAIL indukálta apoptózisban RKO sejteken. A sejteket 30 percig előkezeltük epoxomicinnel (Epo 1μM), PS341-vel (3μM), illetve MG132-vel (3μM), majd 60ng/ml koncentrációban TRAIL liganddal növekvő ideig. Az apoptózist (SubG1 populáció) áramlási citometriával propidium-jodid festést követően határoztuk meg. Az MG132/TRAIL kezelés által kiváltott apoptózis jóval lassabban és fokozatosabban emelkedett, 13 órás kezelést követően még csak 63%+/-5% mértékű volt. Eredményeink alapján elmondható, hogy a TRAIL-rezisztens RKO sejtek 10 órás kezelést követően még nem érzékenyek egyik proteaszómagátló-szerrel szemben sem, azonban rendkívül jelentős mértékben érzékenyíthetőek a TRAIL apoptotikus hatásával szemben. Hasonló adatokat kaptunk HT29 vastagbélráksejtek esetén is (nem ábrázolt adat). A továbbiakban a megfigyelt jelenség molekuláris hátterét vizsgáltuk epoxomicin/trail kombinált kezelést alkalmazva. 42

43 Antiapoptotikus fehérjék mennyiségének vizsgálata epoxomicin/trail kezelést követően Kísérleteinkben azt kívántuk vizsgálni, hogy az RKO sejtekben TRAIL-lel szemben kialakult rezisztencia hátterében milyen antiapoptotikus fehérjék (NF- κb által szabályozott) állhatnak és ezek mennyisége hogyan változik a kombinált kezelés következtében kialakuló apoptózis során. Vizsgálatainkban a kontroll, TRAIL-lel, epoxomicinnel és kettős kezelt mintákban hasonlítottuk össze a Bcl2, BclX, survivin és XIAP mennyiségét 3, 5 és 9 órás inkubáció elteltével (9. ábra). A fehérjék mennyiségében 3 és 5 óra elteltével nem láttunk jelentős változást sem a TRAIL-lel, sem az epoxomicinnel inkubált mintákban. 9 órás kezelést követően azonban jelentős változás volt kimutatható a XIAP fehérje mennyiségében és minőségében egyaránt. 9. ábra. NF-κB által szabályozott antiapoptotikus fehérjék szintjének vizsgálata Western-blottal epoxomicinnel (1μM) és TRAIL-lel (60ng/ml) kezelt sejteken. A kezelés időtartama 3, 5, illetve 9 órás volt. Jól látható a XIAP fehérje mennyiségének csökkenése, mely a fehérje hasítódásának eredménye (9. ábra). Szintén csökkenés figyelhető meg a kombinált kezelést követő 9. órában a BclX fehérje mennyiségében. 43

44 A kaszpázok szerepének vizsgálata a kombinált kezelés következtében kialakult DNS-fragmentáció folyamatában 10. ábra. Az epoxomicin/trail kombinált kezelés indukálta apoptózis kaszpáz-3 és kaszpáz-8 függő módon valósul meg. Az RKO sejteket általános kaszpázgátló-szer (A. ábra) és kaszpáz-8 gátlószer (B. ábra) jelenlétében kezeltük 1 μm epoxomicinnel, illetve 60ng/ml TRAIL-lel. Az apoptózis mértékét a mintákban a csökkent DNS tartalmú sejtek százalékaként határoztuk meg. 44

45 Kísérletünkben két kaszpázgátló-szert alkalmaztunk: a Z-VAD.fmk (50 μm) egy általános hatású kaszpázgátlószer, míg a Z-IETD.fmk alacsony koncentrációban (10 μm) specifikusan gátolja a kaszpáz-8 enzimet. A kezelések során epoxomicinnel és/vagy kaszpázgátló-szerekkel történő 30 perces előinkubációt, majd TRAIL kezelést alkalmaztunk. Az apoptotikus DNS-fragmentáció mértékét áramlási citometriával vizsgáltuk. A 10 órás kombinált epoxomicin/trail kezelés indukálta apoptózis 78% mértékű volt, melyet a Z-VAD.fmk teljes mértékben (p<0.0001), a Z- IETD.fmk jelentős és szignifikáns mértékben gátolt (p<0.01). Eredményeinket mutatja a 10. ábra A kaszpáz-3 aktivációjának vizsgálata aktivitás-esszében és Western-blot technikával 11. ábra. A kaszpáz-3 enzim aktivációjának kialakulása epoxomicin/trail kombinációval kezelt mintákban. A. ábra. A kaszpáz-3 aktivitását mesterséges fluoreszcens szubsztrát felhasználásával vizsgáltuk 5 órás epoxomicin (1μM) és 60ng/ml TRAIL kezelést követően. B. ábra. Az aktivitásméréssel párhuzamosan a kaszpáz-3 proteolítikus aktivációját Western-blottal követtük. 45

46 Kísérleteinkben vizsgáltuk a kaszpáz-3 aktivációját TRAIL, epoxomicin és kombinált kezelésen átesett sejtlizátumokban aktivitás-esszé, illetve Western-blot Korábban már kimutatták, hogy a proteaszómagátló-szerek a kaszpáz-3 aktivációját a belső apoptotikus útvonalon indítják el. Szintén ismert tény, hogy a TRAIL képes a receptorain keresztül a kaszpáz-8 és ezen keresztül a kaszpáz-3 aktiválására a külső útvonalon. Az RKO sejtekben a TRAIL kezelés azonban nem vezet apoptózishoz. Kísérleteinkben vizsgáltuk a kaszpáz-3 aktivációját TRAIL, epoxomicin és kombinált kezelésen átesett sejtlizátumokban aktivitás-esszé, illetve western-blot segítségével. A kezelés időtartama 5 óra volt. Szignifikáns kaszpáz-3 aktivitást (DEVDáz) kizárólag az epoxomicin/trail-lel kezelt mintákban tudtunk kimutatni. (11. A. ábra). A DEVD-AMC szubsztrát elsődlegesen a kaszpáz-3 szubsztrátja, azonban nem zárható ki aspecifikus hatás, ezért aktivációját Western-blot segítségével is ellenőriztük. Az általunk használt ellenanyag mind az inaktív prokaszpáz-3-at, mind pedig annak hasított formáit kimutatja. A kontroll és epoxomicinnel kezelt mintákban kizárólag a proenzimet tudtuk kimutatni. A TRAIL-lel kezelt mintákban megjelent a p20 fragment, ami a kaszpáz-3 részleges aktivációjának felel meg. A teljesen aktív forma, a p17 fragment csak a kombinált kezelés hatására jelent meg. (11. B. ábra) A mitokondriális membrándepolarizáció és a proapoptotikus mitokondriális faktorok felszabadulásának vizsgálata kombinált epoxomicin/trail-lel kezelt sejtekben Már korábban mind a proteaszómagátló-szerek által, mind a TRAIL által indukált apoptózisban leírták a membrándepolarizációt, illetve a proapoptotikus faktorok felszabadulását a mitokondriumból. Mivel a membrándepolarizáció a kaszpáz-3 aktivációt és a DNS-fragmentációt megelőző esemény, kísérletünkben olyan korai időpontot választottunk ennek vizsgálatára, amelynél a sejteknek csak egy részében 46

47 figyelhető meg DNS-fragmentáció (5 óra). A kezelések menete a fent leírtakkal C C C C ábra. A mitokondrium membránpotenciál és a mitokondriális proapoptotikus faktorok felszabadulásának vizsgálata. A. ábra. A mitokondrium membránjának depolarizációját áramlási citometriával mértük DiOC 6 festést követően. Az RKO sejteket 5 óráig inkubáltuk 1μM epoxomicin, illetve 60ng/ml TRAIL jelenlétében. B. ábra. A mitokondrium mebránpotenciál mérésével párhuzamosan a kezelt sejtekből elválasztottuk a citoplazmatikus frakciót (C) a mitokondriumot tartalmazó frakciótól (M), majd vizsgáltuk a különböző proapoptotikus mitokondriális fehérjék jelenlétét a citoplazmában. Western-blot módszerrel. A kapott eredményeket (citoplazmatikus frakció) denzitometráltuk és a kapott értékeket a β- aktin esetében kapott értékekkel leosztottuk. C. ábra. Teljes sejtlizátumban vizsgáltuk a Smac/Diablo fehérje összmennyiségét Western-blot technikával. (Az egyenletes fehérjeterhelés vizsgálatára kontrollként β-aktin Western-blotot használtunk ugyanazon a membránon.) 47

48 megegyező volt. Mindkét szer önmagában kis mértékben idézett elő membrándepolarizációt (epoxomicin: 12%+/-3%, TRAIL: 11%+/-2%), míg a kombinált kezelés esetén jelentős emelkedés volt megfigyelhető (44%+/-3%). (12. A. ábra). A továbbiakban azt vizsgáltuk, hogy a membrándepolarizációt követi-e a mitokondriumban található proapoptotikus fehérjék felszabadulása a citoplazmába. Ebben a kísérletben a kezeléseket ugyanúgy hajtottuk végre, mint a fentiekben. A kezelés ideje 5 óra volt. Az inkubációs idő leteltével a mintákból mitokondriális és citoplazmatikus frakciót izoláltunk és vizsgáltuk a mitokondriális proapoptotikus faktorok megjelenését a citoplazmatikus frakcióban. Az általunk vizsgált fehérjék a következőek voltak: Smac/Diablo, HtrA2/Omi, citokróm-c és AIF. Az 5 órás kezelést követően az epoxomicinnel és a TRAIL-lel önállóan kezelt mintákban a citoplazmában megjelent a citokróm-c és a HtrA2/Omi és nem volt kimutatható a Smac/Diablo. A kombinált kezelés eredményeképp a citoplazmában jelentős mértékben megemelkedett az HtrA2/Omi mennyisége összehasonlítva a kontroll és az önállóan kezelt mintákkal. A citokróm-c esetében a kettős kezelés hatására kismértékű változást figyeltünk meg a kontroll és az önállóan kezelt mintákhoz képest. Érdekes változást figyeltünk meg azonban a Smac/Diablo fehérje esetén: a kontroll mintához hasonlítva sem a TRAIL, sem az epoxomicin önmagában nem indukálta a Smac/Diablo kiáramlását, míg a kettős kezelés hatására a fehérje szintje megemelkedett a citoplazmában. (12. B. ábra) Ugyanolyan körülmények között kezelt sejtekből készült teljes sejtlizátumokon is vizsgáltuk a Smac/Diablo mennyiségét azért, hogy kizárjuk, hogy a Smac/Diablo szintjének citoplazmatikus emelkedése nem a gátolt proteaszómális lebontásának következménye. Az önállóan kezelt mintákat és a kombinált kezelésen átesett mintákat összehasonlítva nem találtunk változást a fehérje mennyiségében (12. C. ábra). Az egyenletes mintafelvitel kontrolljakánt β-aktint használtunk. Eredményeink alapján megállapítottuk, hogy kizárólag a kombinált kezelés eredményeképpen figyelhető meg RKO sejtekben a Smac/Diablo kiáramlása a citoplazmába. 48

49 Smac/Diablo expressziójának gátlása RNS interferencia módszerrel és a Smac/Diablo knock out sejtek viselkedésének vizsgálata kombinált kezelést követően Kimutattuk, hogy a kontroll mintához hasonlítva sem a TRAIL, sem az epoxomicin önmagában nem indukálta a Smac/Diablo kiáramlását, míg a kettős kezelés hatására a fehérje szintje megemelkedett a citoplazmában. Ez alapján feltételezhető, hogy RKO sejtekben a Smac/Diablo jelentős szerepet tölt be az epoxomicin/trail kombinált kezelés okozta apoptózisban. A Smac/Diablo fehérje expressziójának gátlásával alá kívánjuk támasztani az előző kísérleteink eredményeit. Létrehoztunk két vektorkonstrukciót, amelyek két különböző szekvenciát céloznak a Smac/Diablo mrns molekulán belül. Az inszert szekvenciák jelenlétét PstI. enzimatikus hasítással ellenőriztük (13. A. ábra). A megfelelő vektorkonstrukciók előállítása után azokat az RKO sejtekbe transzfektáltuk Nucleofector módszerrel. A transzfekció hatékonyságát áramlási citométerrel ellenőriztük. A kapott eredményeket mutatja a 13. B. ábra. A hatékonyan transzfektált mintákat további apoptózis vizsgálatoknak vetettük alá. Kontrollként üres sistrike-hmgfp vektorral transzfektált sejteket használtunk. A sejteket 3 μm PS341 és 1 μm epoxomicin proteaszómagátlóval előkezeltük 30 percig, majd további 6 óráig 100 ng/ml TRAIL-lel kezeltük. A mintákban az indukált apoptózis mértékét áramlási citometriával vizsgáltuk. Az eredményeket mutatja a 13. C. ábra. A 13. B. ábrán látható, hogy a Smac/Diablo szekvenciákat tartalmazó vektorok hatékonyabban juttathatóak a sejtekbe, mint az üres vektor (18%). A két konstrukció közül a Smac2-hMGFP vektor a sejtek 51%-ba, a Smac1-hMGFP vektor a sejtek 44%- ba jut be. A transzfektálást háromszor ismételtük és mindhárom esetben hasonló eredményeket kaptunk. Kimutattuk, hogy a kontrollhoz hasonlítva (üres vektorral transzfektált sejtek) a Smac-2 célszekvencia az epoxomicin és TRAIL, illetve a PS341 és TRAIL kombináció által indukált apoptózist is gátolta. A Smac-1 célszekvencia az epoxomicin és TRAIL kombináció okozta apoptózist nem, azonban a PS341 és TRAIL kombinált kezelés indukálta apoptózist hatékonyan gátolta. Ezek az eredmények arra utalnak, hogy a két célszekvencia közül a Smac-2 hatékonyabban gátolja a Smac/Diablo mrns-t. 49

50 13. ábra. Smac/Diablo mrns csensesített sejtek reakciója proteaszómagátló és TRAIL kombinált kezelésre. A. A Smac1 és Smac2 target szekvencia jelenlétének ellenőrzése sistrike-hmgfp vektorban PstI. enzimatikus hasítással. A vektor mérete 5500 bp, a kihasított inszert mérete 1100 bp. B. sistrike vektorkonstrukciókkal transzfektált sejtek arányának vizsgálata áramlási citométerrel. (PI propídium jodid festés a viabilitás ellenőrzésére, GFP zöld fluoreszcencia, hmgf, 1 -pusztult, nem transzfektálódott sejtek aránya, 2-pusztult, transzfektálódott sejtek aránya, 3 - élő, nem transzfektálódott sejtek aránya, 4 - élő, transzfektálódott sejtek aránya). C. Smac/Diablo fehérje expressziógátlás hatása a kombinált proteaszómagátló és TRAIL indukálta apoptózira (E-epoxomicin, 1 μm, PS-PS341 3μM). 50

51 Ezek az eredmények alátámasztják a Smac/Diablo fontos szerepét a proteaszómagátló és TRAIL kezelés indukálta apoptózisban. Mivel a gátlás azonban részleges volt, ezért Real-Time PCR-rel és/vagy Western-blottal meg kell vizsgálnunk, hogy az általunk használt konstrukciók milyen mértékben gátolták a Smac/Diablo mrns expresszióját. Vizsgálnunk kell a transzfektált sejtek biológiai válaszát szorterezést követően is. Ebben az esetben a kapott eredményeket nem torzítja, hogy a kísérletben a nem transzfektálódott sejtek apoptózisát. 51

52 8. Az eredmények összefoglalása és értékelésük 8.1. A nokodazollal és etopoziddal végzett kísérletek rövid összefoglalása és az eredmények értékelése órás nokodazol kezelést követően a sejtek nagy része felhalmozódik a G2/M fázisban. 2. A 12 órás kezelést követő sejtciklus gátlás után a sejtek 38%-a apoptózissal elpusztul. 3. A nokodazol kezelés indukálta apoptózist az általános kaszpázgátló-szer teljes mértékben gátolta. 4. Az Mg132 szignifikáns mértékben, a CBL pedig kis mértékben gátolta a nokodazol indukálta apoptotikus DNS-fragmentációt. 5. A kaszpáz-3 aktivitást nokodazol indukálta apoptózisban a proteaszómagátlók alkalmazása nem befolyásolta. 6. Az MG132 kezelés fokozta a sejtekben az indukálható Hsp72 fehérje mennyiségét. Ebben a kísérletsorozatban két különböző hatású szer apoptotikus szabályozását, a kaszpázok és a proteaszóma szerepét hasonlítottuk össze (Nagy és mtsai, 2005). Mindkét szer a belső (mitokondriális) útvonalat aktiválva indukál apoptózist a sejtekben. A proteaszómagátlókról is kimutatták, hogy a kezelési időtől és koncentrációtól függően a legkülönbözőbb sejtekben képesek apoptózist indukálni, szintén aktiválva a mitokondriális proapoptotikus folyamatokat (Johnson és mtsai, 2003; Nikrad és mtsai, 2005). Mivel ezek a szerek hasonló hatásmechanizmus révén indukálnak apoptózist, kombinációjuk még hatékonyabb hatású lehet olyan esetekben, amelyekben az egyes szerek alkalmazása nem éri el a kívánt hatást. A kemoterápiás szerek és proteaszómagátlók szinergista hatását több esetben figyelték meg (Cusack és mtsai, 2001; Mitsiades és mtsai, 2003; Denlinger és mtsai, 2004), azonban bizonyos 52

53 esetekben antagonista hatást mutattak ki (Canfield és mtai, 2006). A proteaszómagátlók antagonista hatását figyelték meg a sok esetben használt kemoterápiás szer, az etopozid esetén is Hickman és munkatársai 1992-ben. Az etopozid a topoizomeráz II enzim gátlószere, mely a kettős DNS szál kitekerésében és átmeneti hasításában játszik szerepet. Az etopozid reverzibilis módon megakadályozza az enzim működését és a DNS szálak helyreállítását. A gátolt, működésképtelenné vált topoizomeráz enzim lebontását és eltávolítását a proteaszóma rendszer végzi, így a DNS törések láthatóvá válnak a sejt számára, beindítva az apoptotikus folyamatot (Mao és mtsai, 2001). Elmondható tehát, hogy az etopozid indukálta apoptózisban a proteaszóma megfelelő működése elengedhetetlen az apoptózis elindulásához, hiszen gátlásával a gátolt topoizomeráz a DNS szálon marad, elfedve az apoptózist kiváltó jelet. Vizsgálatainkban, mint ahogyan azt vártuk az etopozid apoptózist indukált HL60 sejtekben, melyet kaszpáz aktiválódás kísért. A kaszpázaktiváció és az annak következtében kialakuló apoptotikus DNS-fragmentáció egyaránt gátolható volt Z- VAD.fmk általános kaszpázgátlóval és proteaszómagátlóval is. Ezek az eredmények alátámasztják a proteaszóma korai hatását az etopozid indukálta apoptózisban. A párhuzamosan nokodazollal folytatott kísérleteinkben kimutattuk, hogy HL60 sejtekben a mikrotubulusgátló nokodazol indukálta apoptózist az MG132 és a klasto-βlakton proteaszómagátlók jelentős mértékben gátolták. A nokodazollal kezelt sejtek az apoptotikus sejtelhalást megelőzően a sejtciklus G2/M fázisaiban felhalmozódtak; ezt a jelenséget már korábban megfigyelték a taxol esetében (Mao és mtsai, 2001). A proteaszómagátlókkal történő kezelés hatására a sejtek G1 fázisban halmozódnak fel, melynek hátterében feltehetően a különböző ciklin-függő kináz gátlók (p27, p21) stabilizációja állhat (Almond és Cohen, 2002; Chen és Lin, 2004; Bogner és mtsai, 2003). Ahhoz, hogy elkerüljük a mikrotubulus gátlók és a proteaszómagátlók okozta eltérő hatás miatt bekövetkező interferenciákat, a sejteket 12 óráig előkezeltük nokodazollal, amely elegendőnek bizonyult arra, hogy a G2/M felhalmozódás megtörténjen. Az a megfigyelés, hogy a nokodazol indukálta apoptózist általános kaszpázgátló Z-VAD.fmk-val gátolni tudtuk, alátámasztja a kaszpázok aktív részvételét. A kaszpáz-3 aktivitás felelős az ICAD gátlófehérje hasításáért, ez a hasítás teszi lehetővé a CAD DNáz enzim aktiválódását, amely a nukleoszómális DNS-fragmentációt idézi elő (Wolf 53

54 és mtsai, 1999). A CAD aktiválódása az apoptózis felé való elköteleződést jelenti, amelyet az angol nyelvű szakirodalom point of no return -nek nevez (Green és Amarante-Mendes, 1998). A kísérleteinkben azt az érdekes jelenséget tapasztaltuk, hogy bár a nokodazol indukálta kaszpázaktivációt és DNS-fragmentációt szignifikáns mértékben gátolni tudtuk általános kaszpázgátló Z-VAD.fmk-val, a proteaszómagátlók nem voltak hatással a kaszpázaktivitásra, holott az apoptotikus DNS-fragmentációt gátolták. Ez arra utal, hogy a kaszpáz-3 aktiválódása után a nokodazol indukálta apoptózisban még van legalább egy szabályozási pont, amelyet a proteaszómagátlók befolyásolnak. A proteaszóma gátlása az apoptotikus útvonalakat több módon is befolyásolhatja (Almond és Cohen, 2002, review). Az eddig vizsgált útvonalak esetében a proteaszóma szabályozó hatása a kaszpáz-3 aktiválódást megelőzve lép a folyamatba. Ezek közül a mechanizmusok közül a legjobban ismert folyamat a proteaszóma NF-kB aktivációt befolyásoló hatása, ugyanis az NF-kB aktiválódásához elengedhetetlen az IkB gátló fehérje proteaszómális lebontása (Palombella és mtsai, 1994; Wang és mtsai, 1998; Mayo és Baldwin, 2000; Micheau és mtsai, 2001; Heckman és mtsai, 2002). Számos anti-apoptotikus fehérje degradációját a proteaszóma végzi, így ebben az esetben a proteaszómális út gátlása anti-apoptotikus hatású lehet (Siegmund és mtsai, 2001; Harwood és mtsai, 2000). A nokodazollal végzett kísérleteink újszerűsége abban mutatkozik meg, hogy kimutattuk, hogy a proteaszóma gátlása a kaszpáz-3 aktivációt követően gátolta az apoptotikus DNS-fragmentációt. Jaattela és munkatársai 1998-ban kimutatták, hogy TNF-α indukálta apoptózisban a Hsp70 overexpressziója az apoptózist a meglévő kaszpáz-3 aktivitástól függetlenül gátolta. További eredményekből ismert az is, hogy a proteaszómagátlás a sejtekben jelentős mértékben emeli az indukálható Hsp72 fehérje szintjét (Kim és mtsai, 1999; Grossin és mtsai, 2004; Awasthi és mtsai, 2005). Megvizsgáltuk, hogy az MG132 apoptózist gátló hatásának hátterében is a Hsp70 valamelyik formájának expressziója áll-e. Kimutattuk, hogy az MG132 jelenléte megemelte a Hsp72 szintjét (MG132 illetve MG132/nokodazollal kezelt sejtekben). A Hsp70 aktív kaszpáz-3 utáni gátló hatását több útvonalon keresztül is kifejtheti. Első feltételezésünk szerint a Hsp70 az AIF gátlásával, vagy az Endonukleáz-G (Endo- G) gátlásával akadályozza meg a nukleoszómális DNS-fragmentációt. Korábban már 54

55 kimutatták, hogy az AIF és az Endo-G mitokondriális pro-apoptotikus faktorok a mitokondriumból felszabadulva a sejtmagban kaszpáz-aktivációtól függetlenül indukálhatnak apoptotikus DNS-fragmentációt (Van Loo és mtsai, 2001; Cande és mtsai, 2002). Megfigyelték azt is, hogy a hősokk fehérjék közül a Hsp70 fehérje gátolja az AIF sejtmagbeli transzportját, megakadályozva ezzel a DNS-fragmentációt kiváltó hatását (Gurbuxani és mtsai, 2003; Lui és mtsai, 2007). A Hsp70 gátló hatását az endonukleáz-g esetében is kimutatták, bár ez a fehérje elsősorban apoptotikus RNáz aktivitással rendelkezik és inkább másodlagos szerepű a DNáz aktivitása (Kalinowska és mtsai, 2005). Ennél a hipotézisnél azt feltételezzük, hogy a kaszpáz-3 aktiváció mellett a nokodazol-indukált AIF felszabadulás is az egyik kiváltó oka a DNSfragmentációnak. Mivel a proteaszómagátlók teljes mértékben nem tudták gátolni az apoptotikus DNS-fragmentációt, azt gondoljuk, hogy a gátolható komponens az AIF által indukált, a nem gátolható komponens pedig a kaszpáz-3 által indukált DNSfragmentáció volt. Ebben az esetben nem teljesen helyénvaló az az állítás, hogy a proteaszómagátlók hatására indukálódó Hsp70 a kaszpáz-3 után gátol, inkább azt állíthatjuk, hogy attól függetlenül a nokodazol hatására párhuzamosan aktiválódó, de a DNS-fragmentációban fontos szerepet betöltő úton (AIF). Ezt a következtetést azonban cáfolja, hogy a kaszpázgátló teljes mértékben gátolta az apoptózist, míg az AIF kaszpáz-független úton indukál DNS-fragmentációt. Sokkal megalapozottabbnak gondoljuk azonban azt az elképzelést, amely szerint a Hsp70 gátló hatása a CAD endonukleáz szintjénél érvényesül. Kimutatták, hogy bizonyos hiszton fehérjék (H1) a CAD-dal direkt kölcsönhatásba lépve fokozzák az enzim nukleáz aktivitását (Liu és mtsai, 1999; Widlak és mtsai, 2000 és 2005). Kimutatták azt is, hogy a hisztonok acetilációja gátolja ezeknek a fehérjéknek a nukleoszómák közötti kölcsönhatásokat szabályozó szerepét, hiperacetilációjuk apoptózist indukálhat (Hansen, 2006, review). Huang és munkatársai 2002-ben kimutatták, hogy a hősokk fehérjéket gátló geldanamicin gátolta a H4 hiszton hiperacetilációját és a hiperacetiláció indukálta apoptózist. Ezzel párhuzamosan kimutatták, hogy a geldanamicin a hősokk fehérjék közül a Hsp70 szintjét emelte meg. Ezek az eredmények azt az elképzelésünket támasztják alá, hogy a proteaszómagátlók által indukált Hsp70 a nokodazol esetében a hisztonok működését és a kromatin szerkezetének változását befolyásolva gátolhatja a CAD endonukleáz aktivitását és a 55

56 DNS-fragmentációt. Ebben az esetben természetesen nem csak a hisztonok acetilációja, hanem foszforilációja, metilációja Sumo-ilációja és ubikvitinációja is lehet a Hsp70 fehérje célpontja. Összefoglalva ezeket az eredményeket, kimutattuk, illetve az etopozid esetében megerősítettük, hogy a két kemoterápiás szer hatását a proteaszómagátlók jelentős mértékben csökkentették leukémia sejtekben. Eredményeink felhívják a figyelmet arra, hogy a jövőben alkalmazott kombinált kemoterápiás kezelések, amelyekben mikrotubulusgátló-szert (pl. taxol) és proteaszómagátló-szert együtt kívánunk alkalmazni, körültekintést igényel az egyes szerek egymást kioltó hatása miatt A TRAIL-lel és a proteaszómagátló-szerekkel RKO sejteken végzett kísérletek rövid összefoglalása és az eredmények értékelése 7. Csak a kombinált kezelés igazán hatékony indukátora a sejtelhalásnak (TRAILrezisztensek az RKO sejtek). 8. A kombinált epoxomicin/trail kezelés következtében kialakult DNSfragmentációt a Z-VAD.fmk teljes mértékben, a Z-IETD.fmk szignifikáns mértékben gátolta. 9. A Bcl2, BclX, survivin és XIAP mennyiségében 3, 5 órás inkubáció elteltével nem láttunk jelentős változást órás kezelést követően kimutatható a XIAP fehérje csökkenése, mely a fehérje hasítódásának eredménye. 11. A TRAIL kezelés a kaszpáz-3 részleges aktivációját eredményezi. 12. A teljes kaszpáz-3 aktiváció a TRAIL/epoxomicin kombinált kezelésen átesett mintákban megy végbe. 13. A kombinált kezelés a mitokondriális membrán depolarizációját okozza. 14. A TRAIL-lel és epoxomicinnel kezelt mintákban megfigyelhető a citokróm-c és HtrA2/Omi felszabadulása a citoszólba, mely kombinált kezelésen átesett mintákban fokozódik. 56

57 15. A Smac/Diablo megnövekedett felszabadulása csak a kombinált kezelés hatására figyelhető meg. 16. Az AIF felszabadulását egyik kezelés hatására sem tudtuk kimutatni. 17. A Smac/Diablo fehérje elleni shrns-t termelő vektorkonstrukciók a kombinált kezelés okozta apoptotikus DNS-fragmentációt jelentősen gátolják. 14. Ábra. Az epoxomicin/trail kombinált kezelés indukálta apoptózis molekuláris hátterének modellje. Az RKO sejtekben a kaszpáz-3 aktiváció csak részlegesen megy végbe, feltehetően azért, mert a teljes aktivációt a XIAP fehérje gátolja. Az epoxomicin hatására a mitokondriumból kiszabaduló citokróm-c és Omi/HtrA2 fehérje nem képes leküzdeni a XIAP gátló hatását, így ebben az esetben sincs kaszpáz-3 aktiváció és apoptotikus DNS-fragmentáció. A kombinált epoxomicin és TRAIL kezelés következtében azonban a mitokondriumból felszabadul a Smac/Diablo fehérje, mely a XIAP allosztérikus gátlásával lehetővé teszi a kaszpáz-3 teljes aktivációját és az ezt követő apoptózist. A Smac/Diablo felszabadulását több fehérje is szabályozhatja. Az epoxomicin hatására stabilizálódó Bik és Bak fehérje együttműködve a TRAIL által aktivált Bid fehérjével lehetővé teheti a mitokondrium membránjának olyan változását, amely nagy hatékonysággal engedi ki a Smac/Diablo fehérjét. A TRAIL a kaszpáz-3 aktiválását és az apoptózist a kaszpáz-8 aktiválásán keresztül indítja el. Ez kétféle módon valósulhat meg: a kaszpáz-8 közvetlenül hasítja a kaszpáz- 3-at, vagy a Bid fehérje hasításával elősegíti a citokróm-c kiáramlását a mitokondriumból, mely a kaszpáz-9 aktivációjához vezet (Gross és mtsai, 1999). Az RKO sejtekben a TRAIL kezelés azonban nem vezet apoptózishoz. Ebben a 57