Molekuláris pathologia alkalmazása a mindennapi pathologiai diagnosztikában. Hogyan?

Átírás

1 Molekuláris pathologia alkalmazása a mindennapi pathologiai diagnosztikában Tóth Erika, Csernák Erzsébet, Gallai Mónika Mit? Országos Onkológiai Intézet Hogyan? Miért?

2 The field of molecular diagnostics is growing, adapting, changing constantly, and beginning to permeate virtually every area of medicine. (MB Rita Molecular diagnostics Hematology 2003)

3 Molekuláris biológiai alapfogalmak 1. DNS szerkezete Tm= 4(G:C) + 2(A:T)

4 Molekuláris biológiai alapfogalmak 2. DNS replikáció

5 Molekuláris biológiai alapfogalmak 3. Fehérje szintézis Centralis dogma

6 Molekuláris biológiai alapfogalmak 4. Fehérje szintézis Kód táblázat

7 Szekvenálás

8 Mit Molekuláris célpontok a diagnosztikában I. Fehérjék II. DNS, RNS 1.Génátrendeződések, transzlokációk fiziológiás pathologiás 2.Mutációk (SNP-szinonim, non-szinonim; non-sens; missens) 3.Kromoszóma régió többlet, inzerció, amplifikáció 4.Kromoszóma régió vesztés, deléció III. Kórokozók (fehérje, RNS, DNS alapján)

9 Mit Fehérjék Sejtfelszíni Intracytoplasmaticus Nuclearis Hogyan Immunhisztokémia Miért Daganatok sejteredete Differenciáltság Prognózis Terápiás célpont

10 Mit Génátrendeződések, transzlokációk - fiziológiás (IgH, TCR): poliklonális, monoklonális -patológiás: jelen van, nincs jelen Qualitatív Quantitatív Chimera gének protoonkogének bcr-abl t(9;22) c-myc t(8;14) ALK t(2;5) bcl-2 t(18;14)

11 Hogyan Génátrendeződés, transzlokációk PCR hagyományos valós idejű Kariotipizálás (1000kb-tól) Cytogenetika Interfázis cytogenetika, FISH (1-100kb-ig) CISH fúziós szignál FISH split szignál FISH

12 IgH génátrendeződés VH D JH C FR1 CDR1 FR2 IgH gén somaticus CDR2 FR3 hypermutatio FR4 CDR CDR1 CDR2 CDR3 Intraclonalis divergencia

13 IgH génátrendeződés (FR3A/LJH) folliculáris lymphomákban Hagyományos PCR módszert követő agaróz gélelektroforézis 100bp

14 Kapilláris elektroforézis

15 IgH génátrendeződés, RT-PCR, poliklonális FL CD10

16 IgH génátrendeződés, RT-PCR, monoklonális FL

17 Molekuláris vizsgálat indikációi lymphomákban: Diagnosztikus (neoplasticus/reaktív-igh, TCR) Klasszifikáció (specifikus transzlokáció kimutatása- BCL2, BCL1, c-myc, ALK) Prognózis (IGH szomatikus hypermutáció-cll, transzformációra való hajlam-api2/malt1, IGH/BCL10) Beteg követés (IGH, BCL2)

18 IgH és TCR génátrendeződés vizsgálatának buktatói Álpozitivitás: Kontamináció Pseudoklonalitás (kis minta) Helicobacter gastritis Hepatitis C fertőzés Sjögren syndroma Rheumatoid arthritis tumor reaktív immunválasz Álnegativitás preanalítikai tényezők (degradáció, fixálás) egyetlen V-régió konszenzus primer használata nagyszámú reaktív sejt a mintában részleges IgH átrendeződés szomatikus hypermutáció IgH gén deletio (1/10 lymphoma)

19 Hogyan FISH módszerek Fusion-Signal FISH LNA-FISH e-fish Split-Signal FISH COBRA-FISH ACM-FISH cat-fish Comet-FISH PNA-FISH arm-fish CB-FISH DBD-FISH CO-FISH D-FISH cryo-fish Fiber-FISH CARD-FISH COMBO-FISH Halo-FISH COD-FISH M-FISH

20 Hogyan FISH módszerek, fúziós próba Töréspont A gén B gén Fúziós próba hátránya: - alternatív partnerhez való fúziót nem mutatja ki - magas álpozitivitás (5-10%) a véletlen ko-lokalizáció miatt

21 Burkitt lymphoma, c-myc-igh t(8;14) reciprok transzlokáció Fúziós szignál próba

22 FISH módszerek, split (hasadó) próba Töréspont A gén Split próba előnye: - detekció független a partner géntől - nincs ko-lokalizációs hiba - könnyű értékelni

23 Burkitt lymphoma, c-myc transzlokáció Split szignál próba

24 Dako DuoCISH Automated Dual Color CISH Visualization AP HRP AP HRP Hybridisatio Texas Red és FITC jelölésű próbákkal (Hagyományos FISH) Inkubáció CISH antitest keverékkel Hátrány: kék és lila jel elkülönítése nehéz Előny: mindenütt elérhető, ahol van jó immunhisztokémia érdekelt asszisztens és pathologus technikai háttér Inkubáció piros majd kék chromogen szubsztrát oldattal

25 Miért Köpenysejtes lymphoma Cyclin D1-IgH transzlokáció t(11;14) IgH Split próba Dako DuoCISH Automated Dual Color CISH Visualization Cyclin D1

26 DLBCL GC fenotípussal, atípusos Burkitt-szerű megjelenéssel CD10 Ki-67 c-myc split próba, transzlokáció nincs

27 Real-time PCR módszer Bcl-2 (14;18) transzlokáció kimutatása Exon1 Exon 2 Exon 3 IgH Bcl-2 exon 3 primer primer Fluorescein- Probe Amplicon LC Red - Próba Translocation specific probe anchor próba detector Olvadáspont analízis: Hőmérsékletet fokozatosan 0.1 ºC-kal emeljük az amplifikációs ciklus végén

28 PCR reakció szenzitivitásának meghatározása DOHH2 sejtvonal hígítási sorral

29 Olvadáspont analízis valós idejű PCR reakció után

30 Miért Minimális reziduális betegség kimutatása Gyógyszerek tumorellenes hatásának mérése Csontvelői infiltráció kimutatása Betegkövetés Relapsus korai kiszűrése Normál egyénekben detektált transzlokációk: t(14;18) BCL-2-IGH Follicularis lymphoma t(9;22) BCR-ABL1 Ph+ ALL, CML t(2;5) NPM1-ALK ALCL

31 Mit RNS alapú vizsgálatok Fúziós gének kimutatása lágyrész daganatokban Hogyan RT PCR mrns cdns PCR Amplifikáció

32 Fúziós partner Fli1 (11q24) % Erg (21q22) Tumor típus PNET / Ewing sarcoma Askin tumor 5-10 % EWS 22q12 TLS 16q11 WT1 (11q13) >80 % ATF1 (12q13) % CHN (16p11) 75 % CHOP (12q13) 5+95 % DSRCT Világossejtes sarcoma Extrasceletalis myxoid chondosarcoma Myxoid / kereksejtes liposarcoma

33 Specifikus molekuláris eltérésekre, transzlokációkra jellemző fehérje expressziók FLI1- EWS/FLI1 PNET/ Ewing sc ALK- ALCL, inflammatoricus myofibroblastos tumor Cyclin D1- IGH/BCL1 köpenysejtes lymphoma CD10, BCL6- germinalis centrum eredetű DLBCL MUM1, FOXP1, BCL2- nem germinalis centrum eredetű DLBCL ZAP70- SHM negatív CLL BCL10- IGH/BCL10, API2/MALT1 gyomor MALT lymphoma

34 Mit Kromoszóma régió többlet gains N-myc amplifikáció.neuroblastoma EGFR amplifikáció.. tüdőrák, vastagbél ca HER-2 amplifikáció..emlőrák Cyclin D1 amplifikáció fej-nyaki laphámrákok

35 Hogyan FISH módszer, centromerikus próba

36 Adenoid cysticus ca 2 kópia EGFR

37 Valós idejű PCR Abszolút quantifikáció 1-, 13- és 25-szörös N-myc amplifikációt tartalamzó IMR 32 neuroblastoma sejtvonal segítségével copies

38 N-myc status Túlélési valószínűség P= Nem amplifikált Amplifikált Túlélés (hónapok)

39 N-myc amplifikáció és szövettani megjelenés közötti öszefüggés 30 kópia MYCN Differenciálatlan tumor Magas MKI Prominens nucleolusok

40 Mit Kromoszóma régió vesztés, silencing EGFR deletio.tűdőrák 3p, 5q,18q allélvesztés.fej.nyaki laphámrák P16 metiláció (silencing) fej-nyaki laphámrákok MMR metiláció vastagbélrák, nem herediter

41 Mit Mutációk K-ras. Vastagbélrák B-raf..vastagbélrák, melanoma, pajzsmirigy EGFR.tüdőrák P53.fej-nyaki laphámrákok, Li-Fraumeni syndroma BRCA1/BRCA2..emlőrák APC.FAP, Turcot syndr (CNS tumor+colon ca) MMR HNPCC C-kit.GIST PDGFR.GIST

42 BRAF: 7q34 protoonkogén, serin-threonin kináz mutáció: 89%, exon 15(V600E): szubsztrát-kötő helyet védi 11%, exon 11 (G loop): ATP-kötődés mediálása Membrane RAS P RAF P P Cytosol MEK P P A mitogén-aktiválta-protein-kináz (MAPK) kaszkád egyik génje. Specifikus mutációi önmagukban is génaktivációt idéznek elő. Növekedési faktor-szignál nélkül is sejtproliferációt indukál. Differenciációt gátolja. V600E V600E B-RAF is approximately 480 fold more active than wt B-RAF ACA GTG AAA wt ACA GAG AAA mut Nucleus Nuclear substrates Val Glu ERK P P enhanced signal and cellular responses

43 DNS minta Mutáció kimutatása Real-time PCR-t követő olvadáspont analízissel Az amplifikációs ciklus befejeztével 0.1 fokonként emeljük a hőmérsékletet a sensor próba leolvadásáig

44 A BRAF V600E mutáció kimutatásának jelentősége Diagnosztikai BRAF negatív Spitz naevus (van Dijk, 2005) Világossejtes sarcoma Endometrium komplex hyperplasia HNPCC Follicularis pajzsmirigy ca Low grade serosus ovarium ca BRAF pozitív Spitzoid melanoma Melanoma Endometrium carcinoma Sporadikus MSI-H rák Papilláris ca follicularis var. High grade serosus ovárium ca Prognosztikai A BRAF+ vastagbélrák kórlefolyása kedvezőtlen Terápiás Nexavar

45 Mutáns BRAF solaris melanomában Vad típusú BRAF vulva melanomában

46 A KRAS (vagy BRAF) mutáció gátolja a cetuximab EGFR gátló hatását EGFR Anti- EGFR mab EGFR-től független szignálút aktiváció G12D G12V G13D G13C KRAS V600E P P RAF P MEKP P ERK P P Aktivált állapot gyakoriság 54 % gyakoriság 11 % Blokkolt anti-egfr hatás

47 Primer tumor Máj áttét 42 éves ffi. - Jobb colonfél ca. + cseplesz áttét. - Anti-EGFR kezelés után rebiopsia. G12V KRAS Wt kontroll - Májáttétek a fenti kezelés alatt. - Non-responder, 2 éven belül meghalt EGFR IH

48 Mit Kórokozók EBV.lymphomák, nasopharyngealis carcinoma HPV cervix és fej-nyaki laphámrákok HIV.AIDS Mycobactérium tuberculosis Hogyan ISH PCR

49 Angioimmunoblastos T-sejtes lymphoma, EBV Miért CD21 EBER-EBV encoded RNA ISH CD4 CD10 CD20

50 Recurralo juvenilis laryngealis papillomatosis HPV 6-11 Recurralo juvenilis laryngealis papillomatosis HPV 6-11

51 Előnyök, hátrányok FISH PCR alapú módszer Anyag minősége Friss, paraffinos Friss, paraffinos Időigény 2 nap 2-4 nap Szubmikroszkópos eltérések kimutatása igen igen Numerikus eltérések igen nem Heterogén töréspont igen Kisebb találati arány Több partner gén a transzlokációban igen nem Pontmutációk nem igen Érzékenység % tumorsejt 5-10% 0,001-1%

52 Futó vizsgálatok listája FISH/CISH IGH/BCL-2 dual fusion, IGH split, MALT1 split, C-MYC split, bcl-6 split N-myc dual color EGFR dual color IgH, TCR génátrendeződés EBV kimutatás (whole genom) Mutációk: BRAF KRAS EGFR C-kit Microsatellita instabilitás HPV tipizálás

53 Molekuláris pathologia Információ, amihez a hagyományos pathologiai feldolgozás során nem jutunk hozzá Sok lehetőséget rejt magában.de csak a puzzle egy darabja A többi adattal együtt kell értékelni az adott összefüggéseket (klinikum, morfológia, immunhisztokémia) figyelembe véve Pozitív eredmény.nem mindig neoplasticus Negatív eredmény.nem mindig nem neoplasticus Racionálisabb, biológiai alapú diagnózis, célzott terápiák