Dr. Fekete Jenõ A folyadékkromatográfia újabb fejlesztési irányai HILIC

Átírás

1 Dr. Fekete Jenõ A folyadékkromatográfia újabb fejlesztési irányai HILIC 2009

2 LaChrom Ultra UHPLC Sebesség és hatékonyság a kromatorgráfiában ÚJ! Merck Kft. Magyarország 1113 Budapest, Bocskai út Telefon: kemia@merck.hu Fax: szerviz@merck.hu

3 Dr. Fekete Jenõ A folyadékkromatográfia újabb fejlesztési irányai HILIC 2009

4 Dr. Fekete Jenõ Lektor: Ritz Ferenc ISBN Felelõs kiadó: Merck Kft. Felelõs vezetõ: Dr. Meisel Tibor Terjedelem: 11 ( A5) ív

5 Köszönetnyilvánítás Ezúttal szeretnék köszönetet mondani, azért a sok segítségért, amelyet a BME Szervetlen és Analitikai Tanszék HPLC csoport tagjai nyújtottak a könyv elkészítésében. Köszönöm láh Erzsébetnek, Mészáros Ágnesnek, Kiss Kornéliának és Berki Róbertnek a könyv alapos és mindenre kiterjedi átnézését és javítását. Külön köszönetet mondok Ritz Ferencnek az ábrák elkészítéséért és a könyv szerkesztésért. A tisztelt olvasótól elnézést kérünk, hogy az irodalomból vett példáknál a vegyületek angol nevét használtuk.

6 Tisztelt kromatográfus Kollégák! Nagy örömmel lépünk Önök elé ezzel az új kiadvánnyal, amely egy sorozat második kötete. A sorozat elsõ kiadványát 2008-ban vehették kezükbe az lvasók, melybõl a gyors folyadékkromatográfia alapjaiba, legújabb fejlesztési irányaiba kaphattak betekintést. Örömmel nyugtáztuk, hogy ez a kiadvány hiánypótlónak bizonyult, hisz az utánnyomást is megérte és mind a mai napig igen nagy iránta az érdeklõdés. Jelen kiadványunkat az az igény hívta életre, melyet a folyadékkromatográfia egy új ágának, a hidrofil kölcsönhatásokon alapuló elválasztásnak (HILIC) a térnyerése támasztott. A Merck ezen a téren is lépést tart a tudomány fejlõdésével, hiszen az új módszer alkalmazói számára széles skálán kínálja legújabb állófázisait. Bizonyára Önök közül már sokan megismerkedtek ezzel az elválasztási módszerrel, sõt biztosan alkalmazzák is mindennapi munkájukban. Biztosak vagyunk abban is, hogy számos kolléga mostanában fog ismereteket gyûjteni róla. Bízunk benne, hogy mindannyiuknak hasznos eszközt jelent ez a könyv. A kiadvány létrejöttéért ismét Dr. Fekete Jenõ tanár úrnak tartozunk köszönettel, aki összefoglalta a HILIC technika alapjait és segít elhelyezni azt a többi elválasztástechnikai módszer között. Kívánunk minden kedves lvasónknak a kötet tanulmányozása során hasznos idõtöltést, remélve, hogy hozzájárulunk ismereteinek gyarapodásához és mindennapi munkájának megkönnyítéséhez! Üdvözlettel, A Merck Kft. csapata

7 Dr. Fekete Jenő: A folyadékkromatográfia újabb fejlesztési irányai HILIC Tartalomjegyzék 1. Bevezetés 7 2. A HILIC helye a hagyományos folyadékkromatográfiás módszerek között A hidrofil kölcsönhatású kromatográfiában alkalmazott állófázisok és jellemzésük Folyadékkromatográfiás vegyületek osztályba sorolása a HILIC használatakor Szilikagél, mint HILIC állófázis Szilikagél használata HILIC állófázisként Polárisan módosított szilikagélek, mint HILIC állófázisok Ioncserélők, mint HILIC állófázisok Zwitter-ion tartalmú HILIC állófázisok Egyéb állófázis típusok a HILIC-ban Mozgófázisok a HILIC gyakorlatában A ph kontroll és a vegyületek szerkezete közti összefüggés Puffer választás a HILIC ban A ph mérés lehetőségei és gyakorlata a folyadékkromatográfiában A visszatartást megszabó tényezők és törvényszerűségek a HILIC-ban Szerves oldószer tartalom hatása a visszatartásra Grádienselúció a HILIC-ban Általános grádienselúció a HILIC-ban A grádienselúció és problémája a HILIC-ban A grádienselúciós folyadékkromatográf tesztje 79 Tárgymutató 84 5

8 6 Dr. Fekete Jenő: A folyadékkromatográfia újabb fejlesztési irányai - HILIC

9 Dr. Fekete Jenő: A folyadékkromatográfia újabb fejlesztési irányai HILIC 1. Bevezetés Amikor Cvet elvégezte híres kísérletét, és felöntötte a petroléterrel kivont növényi extraktumot a porított kálcium-karbonáttal megtöltött üvegcsövére, nem gondolhatta, hogy bevonul a tudománytörténelembe és ezzel egyúttal a világtörténelembe is. Mózes, amikor a bibliai történetek szerint az ihatatlan vízből ihatót állított elő, szintén nem gondolhatta, hogy több mint kétezer évvel ezután, mint az ókor első kromatográfiás szakemberének nevezik. A kromatográfiát nagyon sok misztérium és fátyolköd lengi körül. Pedig ennek az alkalmazott tudománynak az alapjai sokkal jobban ott vannak a mindennapi életünkben, mint azt gondolnánk. Alkalmazott tudomány csak úgy lehet, hogy alapjai szilárd természeti törvényeken nyugszanak. A mindennapi életből hadd ragadjak csak ki egy példát. Amikor a kellemetlen szagokat okozó vegyületeket el akarjuk távolítani a levegőből, akkor egy olyan anyagot alkalmazunk, amely azt megköti. Létezik hát egy áramló fázis, amely szállít egy anyagot, és van egy fázis, mely helyhez kötött. A kérdéses komponens azonban jobban szereti, szakszóval élve, affinitása nagyobb az állófázishoz, ezért azon adszorbeálódik, majd a folytonos áramban egy idő után deszorbeálódik. Miután ezek a folyamatok sokszor egymásután megismétlődnek a komponensek áthaladnak a töltetágyon. A modern megfogalmazás szerint a kromatográfiás módszerek olyan, kvázi-egyensúlyon alapuló elválasztási módszerek, amelyeknél találunk egy állófázist, amely az esetek többségében helyhez kötött, és egy mozgófázist, amelybe a komponenseket tartalmazó mintát bejuttatjuk. Az egyes komponensek megoszlása az álló- és a mozgófázis között eltérő, ezért eltérő sebességgel haladnak, a szorpciós és deszorpciós sebességük különböző. Ez az eltérő vándorlási sebesség (migrációs sebesség) különbség az oka az egyes komponensek elkülönülésének. Könnyű belátni, hogy bármely hatás, amely megváltoztatja ezt a vándorlási sebességet, az egyúttal a komponensek elválasztását is befolyásolja. A folyadékkromatográfiában ebből a szempontból a változtatást mindkét fázisban elvégezhetjük. A folyadék-szilárd megoszlásban, ha a folyadékban bármilyen összetétel változtatást végzünk, az megváltoztatja a szilárd határfelület tulajdonságát is. Folyadékkromatográfiás szempontból ez annyit jelent, hogy nagyon sok lehetőség áll rendelkezésünkre az elválasztás befolyásolására. A klasszikusnak tekinthető normál-, fordított fázisú, ioncserés és méretkizárásos módszerek mellett a nagy polaritású és ionos vegyületeket elválasztására így fejlődött ki egy új elválasztási módszer. Ezt a módszert cukrok elválasztására már régóta alkalmazták, ezt általánossá téve a nagy polaritású és ionos vegyületekre jött létre az az új módszer, amelyet hidrofil kölcsönhatási kromatográfiának (hydrophilic interaction chromatography) vagy hidrofil kölcsönhatási folyadék kromatográfiának (hydrophilic interaction liquid chromatography) és az ebből képzett mozaik vagy betűszó után HILIC-nek nevezünk. Ennél a módszernél az elválasztást sok esetben több, egymás mellett lejátszódó folyamat szabja meg. Ez a módszerfejlesztésnél jól kihasználható a megfelelő elválasztás elérésére. További jellemzője ennek a módszernek, hogy a klasszikus módok is kiválthatók vele. Ez különösen fontos szempont, akkor, amikor a tömegspektrométer (MS) előtérbe került a detektálási módszereknél. A HILIC olyan módszer, amely kompatibilis a tömegspektrométerrel (MS). Ugyanez vonatkozik az elpárologtatás utáni fényszóráson alapuló detektor alkalmazásakor (evaporative light scattering detector, ELSD), vagy korona kisülést felhasználó aeroszol detektornál (corona charged aerosol detektor, CAD). Az MS, az ELSD és a CAD kompatibilitás egyben mutatja, hogy ezzel a módszerrel nemcsak az elemezhető vegyületek számát, hanem a detektálási módok használhatóságát is kiterjesztettük. Végül, de nem utolsósorban, mivel a nagy polaritású és ionos vegyületeknél, ahol szilárd additívet kellett a mozgófázisba tenni, a fent említett detektálási módok nem voltak használhatók, ezek a módszerek a HILIC-val kiválthatók, és ezek a detektorok is használhatók. A rövid bevezetővel arra szerettük volna felhívni a figyelmet, hogy a HILIC jelentős szerepet tölt be a hagyományos folyadékkromatográfiás módszerek között is. 7

10 Dr. Fekete Jenő: A folyadékkromatográfia újabb fejlesztési irányai - HILIC 2. A HILIC helye a hagyományos folyadékkromatográfiás módszerek között. A folyadékkromatográfiás módszereket a mozgó- és az állófázis jellege szerint csoportokba sorolhatjuk. A csoportba sorolás azért is célszerű, mert meg tudjuk adni azokat a vegyületcsoportokat, amelyek elemezését az adott módszer lehetővé teszi. Vagy megadhatjuk azt is, hogy az adott mozgó-, és állófázis milyen vegyületcsoportok elemzését nem teszi lehetővé. Az álló- és mozgófázis jellege szerinti beosztást adunk meg az 2.1. táblázatban. A 2.1. táblázatban megadott besorolást nevezzük a hagyományos folyadékkromatográfiás besorolásnak. Állófázis Mozgófázis Elnevezés aolárisabb apolárisabb apolárisabb ionos apoláris, nagy pórus átmérőjű poláris, nagy pórus átmérőjű apolárisabb polárisabb polárisabb + hidrofób ion puffer, vagy ion tartalmú víz és szerves oldószer szerves oldószer puffer normálfázisú folyadékkromatográfia (NP-HPLC, NPLC) fordítottfázisú folyadékkromatográfia (RP-HPLC, RPLC fordítottfázisú ionpár- folyadékkromatográfia (RP-IP-HPLC, RPIPLC) ioncserés nagyhatékonyságú kromatográfia (IEC, IE-PLC) nem vizes méretkizárásos kromatográfia (SEC), régebbi nevén gél permeációs kromatográfia (GPC) vizes méretkizárásos kromatográfia,(sec), régebbi nevén gélszűrés C-4, C-6 RP só (1-4 mol/l) HIC hidrofób kölcsönhatási LC 2.1. táblázat A hagyományos folyadékromatográfiás módszerek besorolása az álló- és a mozgófázis fázisviszonya alapján. A fázisviszonyok, és a fázisok felületi tulajdonságainak ismerete egyben megszabja a folyadékkromatográfiásan vizsgálható vegyületeket. Alaptétel, hogy csak azok a vegyületek határozhatók meg, melyek a mozgófázisban, a detektálás megszabta koncentrációban, kémiai átalakulás nélkül oldhatók. Ahhoz, hogy a vegyületek vándorlási sebessége között különbség legyen, az kell, hogy az állófázis felületén eltérő időt töltsenek. Ehhez a komponens és az állófázis között kölcsönhatásnak kell kialakulnia. Ha a komponens és az állófázis jellege nagyban eltér, akkor nem alakulhat ki olyan kapcsolat, hogy a visszatartás nagyobb legyen, mint a holtidő kétszerese. Ez a minimális visszatartás, ami azért szükséges, hogy a két komponens együtt eluálódásából eredő interferenciát minimalizáljuk. Ezeket a szempontokat figyelembevéve, a 2.2. táblázatban összegeztük az egyes módszerekkel meghatározható vegyületek jellegét. 8

11 Dr. Fekete Jenő: A folyadékkromatográfia újabb fejlesztési irányai HILIC Módszer Vegyület jellege Kizáró ok NP-HPLC RP-HPLC RP-IP-HPLC IE-HPLC nem vizes SEC közepesen poláris apoloráris ionos ionos apoláris polimer ionos jelleg, nincs poláris csoport a vegyületben, nagy polaritású anyagok ionos jelleg kis apoláris résszel, nagy polaritás nem ionos vagy nem ionizálható nem ionos vagy nem ionizálható poláris polimer ionos vagy ionizálható csoporttal vizes SEC biopolimerek apoláris polimerek HIC biopolimerek kis molekula 2.2. táblázat Az egyes folyadékkromatográfiás módszerek alkalmazhatósága a vegyületek jellege szerint. A 2.2 táblázatban megadtuk, hogy az egyes folyadékkromatográfiás módszerek milyen jellegű vegyületcsoportoknál használhatók, és milyen kizáró okok vannak, amelyek megakadályozzák a vizsgálatot. A 2.2 táblázatban megadott folyadékkromatográfiás módszereket a könnyebb átláthatóság érdekében bontsuk két csoportba. A folyadékkromatográfiásan kis molekulatömegűeknek azokat tekintjük, melyek molekulatömege a 2-4 ezret nem haladja meg. Ezeket a vegyületeket azokkal a porózus és monolit töltetű kolonnákkal vizsgálhatjuk, melyek pórusátmérője 6-15 nm (NP-HPLC, RP-HPLC, RP-IP-HPLC, IE-HPLC). A második csoportba az efölötti molekulatömegűek tartoznak, amelyek vagy méretkizárásos folyadékkromatográfiával vagy nagy pórusátmérőjű töltetekkel határozhatók meg. Ha folyadékkromatográfiásan kis molekulatömegű anyagokat vesszük szemügyre és megnézzük, hogy az egyes módszereknél milyennek kell a vegyületek jellegének lenni, és milyen kizáró okok teszik lehetetlenné használatukat, akkor azt a következtetést vonhatjuk le, hogy a nagy polaritású vegyületek a megadott módszerek egyikével sem vizsgálhatók. A szerves vegyületek folyadékkromatográfiás meghatározásánál ezt a hiányzó szeletet tölti be a hidrofil kölcsönhatású folyadékkromatográfia (HILIC). A HILIC-nél, csakúgy, mint a NP-HPLC-nál vagy a RP-HPLC-nál, a fázisviszonyokat kell értelmezni. Ismételten hangsúlyozzuk a meghatározandó komponensek oldhatóságát a mozgófásban, és kölcsönhatásukat az állófázissal. A nagy polaritású vegyületek csak valamilyen poláris jellegű oldószerben oldódnak, kölcsönhatásuk csak akkor lesz számottevő az állófázissal, ha az polárisabb jellegű a mozgófázisnál. Az általánosan használt fogalmak szerint két eltérő módon poláris jellegű fázissal van dolgunk, ahol az állófázis polárisabb, mint a mozgófázis. A polárisabb állófázissal a vegyületek nagyobb kölcsönhatást alakítanak ki, mint a mozgófázissal, így véges visszatartásuk lesz. A mozgófázis oldaláról megfogalmazva, ahogy annak polaritása csökken, úgy abban a nagyon poláris komponensek vagy ionos anyagok oldhatósága is csökken, és az állófázis felületére szorulnak. Az eltérő vándorlási sebesség az egyes nagyon poláris vagy ionos vegyületek között azért jön létre, mert oldhatóságuk a mozgófázisban csökken, és ezzel párhuzamosan az állófázissal való kölcsönhatásuk nő. Ha a fázis viszonyok alapján a 2.1. táblázatban megadott módszerek közé helyezzük be a HILIC-t, akkor az IE-HPLC után tehetjük (2.3. táblázat). 9

12 Dr. Fekete Jenő: A folyadékkromatográfia újabb fejlesztési irányai - HILIC Állófázis Mozgófázis Elnevezés polárisabb apolárisabb apolárisabb Ionos polárisabb apoláris, nagy pórus átmérőjű poláris, nagy pórus átmérőjű apolárisabb polárisabb polárisabb + hidrofób ion puffer vagy ion tartalmú víz és szerves oldószer kevésbé poláris szerves oldószer puffer normálfázisú folyadékkromatográfia (NP-HPLC, NPLC) fordítottfázisú folyadékkromatográfia (RP-HPLC,RPLC fordítottfázisú ionpár- folyadékkromatográfia (RP-IP-HPLC, RPIPLC) ioncserés nagyhatékonyságú kromatográfia (IEC, IE-PLC) hidrofil kölcsönhatási kromatográfia (HILIC) nem vizes méretkizárásos kromatográfia, (SEC), régebbi nevén gél permeációs kromatográfia (GPC) vizes méretkizárásos kromatográfia (SEC), régebbi nevén gélszűrés C-4,C-6 RP Só (1-4 mol/l) HIC hidrofób kölcsönhatási LC 2.3. táblázat A HILIC besorolása a hagyományos folyadékromatográfiás módszerek közé az álló- és a mozgófázis fázisviszonya alapján Ha az NP-HPLC és a HILIC fázis viszonyait összevetjük, akkor könnyen érthetővé válik, hogy miért nem fázis polaritásokról, hanem polaritás viszonyokról beszélünk. Mind a HILIC-nál, mind a NP-HPLC-nál poláris jellegű az állófázis, és a mozgófázis ennél kevésbé poláris; csakhogy a HILIC-nál ez poláris jellegű oldószerelegyet jelent, míg a NP-HPLC-nél a mozgófázis fő komponense apoláris jellegű. 10

13 Dr. Fekete Jenő: A folyadékkromatográfia újabb fejlesztési irányai HILIC Módszer Vegyület jellege Kizáró ok NP-HPLC RP-HPLC RP-IP-HPLC IE-HPLC HILIC nem vizes SEC közepesen poláris apoloráris ionos ionos nagy polaritású, ionos apoláris polimer ionos jelleg, nincs poláris csoport a vegyületben, nagy polaritású anyagok ionos jelleg kis apoláris résszel, nagy polaritás nem ionos vagy nem ionizálható nem ionos vagy nem ionizálható apoláris, és ionos állapotba nem hozható poláris polimer ionos vagy ionizálható csoporttal vizes SEC biopolimerek apoláris polimerek HIC biopolimerek kis molekula 2.4. táblázat Az egyes folyadékkromatográfiás módszerek alkalmazhatósága a vegyületek jellege szerint, és a HILIC helye ebben a besorolásban. A HILIC alapvetően a nagy polaritású és ionos anyagok elválasztási módszere. A protonfunkciós csoportot nem tartalmazó molekulák meghatározására, amelyek nagy polaritásúak, ez az egyetlen technika, amellyel az elválasztásuk megoldható. Ionos vagy ionos formába hozható vegyületeknél a HILIC mellett használható még a fordított fázisú ionpár kromatográfia és az ioncserés kromatográfia is. Az ionpár kromatográfiában az alkalmazott ionpárképző só formában van. Így a bevezetőben már leírtak szerint nem kompatibilis a tömegspektrometriás (MS), az elpárologtatás utáni fényszóráson alapuló (ELSD) és a korona kisüléses aeroszol (CAD) detektor használatakor A hidrofil kölcsönhatású kromatográfiában alkalmazott állófázisok és jellemzésük Az állófázis a folyadékkromatográfiában elsődlegesen megszabja a komponensek visszatartását. Emiatt elsőnek megnézzük, hogy milyen anyagok használhatók erre a célra. Minden szorbensnek, melyeket HILIC állófázisnak használunk, eleget kell tennie az általános elvárásoknak. Ezek a következők: mechanikai stabilitás kis szemcseátmérő és kis szemcseátmérő eloszlás mikropórus mentesség a felületen nem lehetnek (nagyon eltérő mennyiségben) nagyban eltérő kölcsönhatási erősségű szorpciós helyek A HILIC-ban használható poláris felületeknek, ennek megfelelően, a következő lehetőségeink vannak: szilikagél aluminium-oxid zirkónium-oxid titán-dioxid poláris módosított szilikagélek-(amino-, nitril-, diol stb.) 11

14 Dr. Fekete Jenő: A folyadékkromatográfia újabb fejlesztési irányai - HILIC anioncserélők kationcserélők zwitter-iont tartalmazó állófázisok Amennyiben a fenti listát áttekintjük, akkor azt a következtetést vonhatjuk le, hogy az apoláris felületű állófázisokat kivéve, szinte az összes nagyhatékonyságú folyadékkromatográfiában alkalmazott állófázis használható a HILIC-nál Folyadékkromatográfiás vegyületek osztályba sorolása a HILIC használatakor A folyadékkromatográfiás elválasztás tervezésének első lépése az állófázis fizikai paramétereinek kiválasztása. A fizikai paraméterek alatt több, a töltetre jellemző adatot értünk. A töltet szemcseátmérője alapvetően megszabja a zónaszélesedést és ezzel az elméleti tányérszámot. Ezt a hatást részletesen tárgyaltuk a Dr. Fekete Jenő, A folyadékkromatográfia elmélete és gyakorlata, Edisonhose, 2006 és Dr. Fekete Jenő A folyadékkromatográfia fejlesztési irányai, Merck, című könyvekben. Itt csak a lényeges elemeket és azoknak a folyadékkromatográfiás készülékek kiválasztására gyakorolt hatását foglaljuk össze röviden. A szemcseátmérő megszabja a töltetre jellemző H min és u min értékeket. Ezek az adatok teszik lehetővé, hogy az eltérő szemcseátmérőjű tölteteket összevessük. A gyakorlatban soha nem dolgozunk ezen paraméterek alkalmazásával. Az ok nagyon egyszerű, mivel a folyadékkromatográfiában a zónaszélesedést a diffúziós folyamatok kontollálják és a diffúzió alapjellege, hogy lassú. A diffúzió kontollált folyamatoknál az idő faktor alapvető (lásd Fick I és Fick II. törvény) a mért H min kis u min értéknél van. Ez gyakorlatban az elemzési idő jelentős mértékű növekedését eredményezné. Ezért a gyakorlati életben ettől a ponttól jobbra, nagyobb lineáris áramlási sebességeknél dolgozunk, ahol az anyagátadási ellenállás növeli a H értéket. Ezt is a diffúziós folyamatok szabják meg, amely közül a porózus szemcsén belüli diffúziós úthossz adja a legnagyobb járulékot. Ez viszont szorosan összefügg az állófázis szemcseátmérőjével. A szemcseátmérő megválasztása megszabja a kromatográfiás elválasztás hatékonyságát, ezért alapvető jelentőségű. Az előbbiek csak akkor igazak, ha a szemcseátmérő eloszlása egy szűk intervallumba esik. A másik, állófázisra jellemző tényező, a töltet pórusátmérője. Ezt a molekula mérete szabja meg. A ma alkalmazott folyadékkromatográfiás töltetek döntő többsége porózus szerkezetű. Ez igaz a HILIC tölteteknél is. Bármilyen típusú HILIC állófázist használunk is a visszatartás biztosításához a töltet fajlagos felülete alapvető. A porózus szerkezet adja a nagy fajlagos felületet és ezen keresztül a nagy visszatartást. A fajlagos felület és a visszatartás fordított arányban vannak. A pórusátmérő csökkentése a fajlagos felület növekedését eredményezi. Ahhoz, hogy a fentiek igazak legyenek, a vegyületeknek be kell diffundálni a pórusokba. A pórusátmérő csökkentésének határt szab a molekula mérete. A pórusdiffúzió a stagnáló, a mozgófázis összetételével megegyező összetételű folyadékelegyben történik. Ebből a szempontból a diffúzió sebessége megegyezik a szemcsék közötti térben mérttel, mindaddig, amíg a pórusfal nem gátolja azt. Ez annyit jelent, hogy a pórusnak olyan átmérőjűnek kell lenni, hogy a molekulák szabadon diffundálhassanak abban. Bármely hatás ugyanis, amely a diffúzió sebességét csökkenti a pórusokban, az a zóna kiszélesedését eredményezi. Ahogy azt már hangsúlyoztuk, a fajlagos felület és a pórusátmérő között fordított arányosság áll fenn, és a nagy fajlagos felület azért szükséges, hogy nagy legyen a töltet visszatartása. Egy kromatográfiás kolonnában a visszatartást az össz. fajlagos felület szabja meg. Ezt a tételt úgy kell módosítanunk, hogy a vegyületek számára hozzáférhető felület. Ezzel későbbiekben foglalkozunk. 12

15 Dr. Fekete Jenő: A folyadékkromatográfia újabb fejlesztési irányai HILIC A nagy visszatartáshoz, tehát kis pórusátmérőjű töltet kell. Nézzünk meg egy közelítő elméleti modellt, hogy a pórusátmérő csökkentésének mik a határai. Egyik oldalról a pórusátmérő csökken- tésnek határt szab, hogy a vizsgált molekula nem tud a pórusba bediffundálni. Ezt nevezzük kizárási molekulatömegnek. A ábrán látható, hogy kb. egy es molekulatömegű makromolekula átmérője megegyezik a pórusátmérővel, így abból kizáródik ábra A porózus töltet és a molekulatömeg (molekula átmérő) viszonya. A porózus töltetek nagy részénél a kiindulási szilikagél átlagos pórusátmérője 10 nm. A biopolimerek vizes oldatban feltekeredett állapotban vannak. A 10 nm-es pórusból általában kizáródnak. A molekulatömeg csökkenésével a molekulák egyre több pórusba tudnak behatolni, így kölcsönhatásba lépni a pórus felülettel. Ez termodinamikailag alapvető a visszatartáshoz (k), azonban a diffúziójuk ekkor a pórusban gátolt (kinetikai oldal), ami nagy zónaszelesedést okoz. Ahhoz, hogy kis zónadiffúzió legyen, a másik oldalról figyelembe kell vennünk, hogy a vegyület a póru- aránynak kb. 10-nek kell lenni. Ezt a helyzetet adtuk meg a sokban stagnáló folyadékban viszonylag szabadon diffundáljon, a pórusátmérő/molekulaátmérő ábrán ábra A porózus töltet pórusátmérőjének és a molekulaméretének viszonya a szabad diffúzió (pórus által nem gátolt) szemszögéből. Ha a pórusátmérő és a molekula átmérő viszonya 1:10-hez, a molekula a pórusban stagnáló folyadékban szabadon diffundál. Ekkor a molekulatömeg kb közé esik. A HILIC gyakorlatában ez attól függ, hogy az állófázis milyen jellegű. Ez alatt azt értjük, hogy módosított vagy módosítatlan. A tölte- előtt tek jellemzésénél, amikor a gyártó cégek megadják a pórus átmérőt, akkor azok a módosítás értendők. Ez a módosított töltetekre egy irányszám, mert a pontos érték a töltet pórusátmérőjének, szilikagél alapú állófázisnál a módosítószer méretétől is jelentősen függ. Minél nagyobb az átlagos pórusátmérő, annál nagyobb molekulatömegű anyagok diffundálnak be a pórusokba. 30 nm-es átlagos pórusátmérőjű töltetekbe a es molekulatömegű anyagok is gátlás nélkül tudnak bediffundálni. Ezeket a töltetekett WP (wide pore) jelzéssel látják el, ez megmutatja a felhasználónak, hogy nagy molekulatömegű anyagok elválasztására alkalmas töltetről van szó. 13

16 Dr. Fekete Jenő: A folyadékkromatográfia újabb fejlesztési irányai - HILIC Összegezve az előzőket: a HILIC-nél használt töltetek nagy részénél a pórusátmérő 6-20 nm között változik, így az es molekulatömegig a vegyületek vizsgálhatók. Az ebbe a molekulatömeg tartományba eső vegyületeket nevezzük folyadékkromatográfiásan kis molekulatömegű anyagoknak. Ezeknél a tölteteknél a két vagy három helyiértékű szám előtt, amely pórusátmérőt adja meg Angströmben, nincs külön jelzés. amennyiben a töltetek nem folyadékkromatográfiásan kis molekulatömegű anyagok elválasztására alkalmasak, akkor WP (Wide Pore), Bio mozaikszó szerepel a pórusátmérő előtt. 14

17 Dr. Fekete Jenő: A folyadékkromatográfia újabb fejlesztési irányai HILIC 3. Szilikagél, mint HILIC állófázis A szilikagél, mint állófázis jól ismert a NP-HPLC-ban. A felülete poláris, ez alapvető, mind a NP-HPLC, mind a HILIC technikánál. Ahhoz, hogy megértsük a két módszer közti különbséget, meg kell ismernünk a szilikagél felületi fizikai-kémiai tulajdonságait. A szilikagél alapváz Si 4 tetraéderekből áll (3.1. ábra). A szilikagél felszíne H (szilanol) csoportokkal borított. Mérések szerint a szilanol-csoport sűrűség 8-9 μmol/m 2. H Si H Si H Si határfelület szilárd fázis 3.1. ábra Szilikagél alapváz A két szilicium atomot oxigén köti össze, az így kialakult sziloxán kötés apoláris. A polaritást a szilanol csoportok okozzák. A hagyományos NP-HPLC-nál az alkalmazott mozgófázisokban a szilanolcsoportok nem disszociált molekuláris formában vannak. A HILIC mozgófázisok mindig tartalmaznak kis mennyiségű vizet, ami lehetővé teszi a szilanolcsoportok disszociációját. A szilanolcsoportok molekuláris formáját a mozgófázis ph-ja szabja meg. Kis ph értékeken ion visszaszorított formában vannak, nagy ph értékeken ionizált formában. Ekkor kationcserélőként viselkednek. Nézzük meg, hogy a HILIC módszernél használt szilikagél milyen tulajdonságokkal rendelkezik. Elsőnek a hagyományos folyadékkromatográfiában használt szilikagél tulajdonságait tekintjük át. A mai besorolás szerint hagyományos folyadékkromatográfiának tekintjük azt, amikor a készülékek maximális nyomása bar (6000 PSI) és a kolonnán kívüli zónaszélesítő hatásokat a mm hosszú és 4,6 mm belső átmérőjű kolonnákra tervezték. A hagyományos HPLC-ban használt szilikagél formáját, szerkezetét a következő tulajdonságok jellemzik: átlagos szemcseátmérő, d p, 3-10 μm között szemcseméret eloszlása: ±20% alak, geometria (gömbszabályos [reguláris], szabálytalan [irreguláris]) pórusátmérő, 6-20 nm között fajlagos felület, m 2 /g között fajlagos pórus térfogat, 0,5 1,0 cm 3 /g között A szilikagél nagy mechanikai stabilitása miatt az elsőszámú állófázis az NP-HPLC-ban és a HILIC-ban. A szűk szemcseméret-eloszlási intervallum egyrészt azért fontos, mert: a kisebb szemcsék az oszlopot érő nyomásterhelés hatására beékelődnek a nagyobb szemcsék közötti járatokba ( beton effektus ), így jelentősen növelik a nyomásesést, és a kolonna úgy fog viselkedni, mintha csupa kisebb átmérőjű szemcsével lenne megtöltve; másrészt jelentősen nő a zónaszélesedés, ha nő a szemcseátmérő eloszlás. 15

18 Dr. Fekete Jenő: A folyadékkromatográfia újabb fejlesztési irányai - HILIC A töltetet alkotó szemcsék alakja és geometriája a fenti két összefüggés miatt érdemel figyelmet. Összehasonlítva a szabályos és szabálytalan alakú részecskék mechanikai paramétereit, azt tapasztaljuk, hogy a szabályos szemcsék sokkal jobban ellenállnak a nyomásterhelésnek, kevésbé porlódnak apróbb darabokká, és térkitöltésük is sokkal egyenletesebb, mint a szabálytalan alakú szemcséké ( ábra) ábra Szabályos alakú szemcsék 3.3 ábra Szabálytalan alakú szemcsék Áramlási csatorna szűkülés 3.4. ábra A szabálytalan alakú szemcsék porlódásának mechanizmusa A kromatográfiás oszlopon az áramlás csak a szemcsék közöttt történik, ha az áramlási keresztzegzugos metszet csökken, akkor a nyomásesés nő a kolonnán. A porozitás a szilikagél igen fontos tulajdonsága. A szilikagél gömb belül csatornákat, járatoka rejt, ezáltal fajlagos felülete, és így adszorpciós kapacitása igen nagy. Az egyes gyártmányok esetében megadott átlagos pórusátmérő tág pórustartomány legjellemzőbb pórusméretét jelzi. Például egy Si 60 jelzésű szilikagél átlagos pórusátmérője 60 Å, de Å-os járatokatt is tartalmaz. A pórusméret csökkenésével növekszik a fajlagos felület, de jelentős mértékben csökken az ún. kizárási molekulatömeg. Az 3.1. táblázat tartalmazza példaképpen a Lichrosorb ill. a Lichrospher töltetek fizikai jellemzőit. A folyadékkromatográfiás gyakorlatban a pórusátmérő mértékegysége e az Ängström (Å) 1Å = 0,1 nm A kizárási molekulatömeg azt jelenti, hogy a molekula átmérője nagyobb, mint a pórusátmérő és a komponens nem tud bediffundálni. 16

19 Dr. Fekete Jenő: A folyadékkromatográfia újabb fejlesztési irányai HILIC LiChrosorb Fajlagos felület (m 2 /g) Fajlagos pórustérfogat (ml/g) Kizárási molekulatömeg (Dalton) Si ,6 4,000 Si ,7 20,000 Si ,0 40,000 LiChrospher Si ,000 Si , DIL 350 1, táblázat Különböző pórusméretű szilikagélek adatai A szilikagél állófázisok felületi tulajdonságai: A szilikagél felületén három eltérő tulajdonságú szilanol csoportot találunk: H H Si Si 3.5. ábra Szabad szilanol csoportok Si H Si H 3.6. ábra H-hidas kötésű szilanol csoportok A szabad szilanol csoportok egymástól 0,5 nm-nél nagyobb távolságra vannak. Ha ennél kisebb a távolság, akkor H-hidak alakulnak ki az egyes szilanol csoportok között, melyek nagyban csökkentik az állófázis aktivitását. A szilikagél felületén kialakulhatnak ún. szilándiolok, amelyek már nem tudnak H-hidas kölcsönhatásba lépni (3.7. ábra). H H Si 3.7. ábra Szilándiol 17

20 Dr. Fekete Jenő: A folyadékkromatográfia újabb fejlesztési irányai - HILIC Tehát az előzőekből is látszik, hogy a szilikagél felülete energetikailag heterogén, nem mutat egységes adszorpciós tulajdonságokat kromatográfiás szempontból. H H H H Si Si 3.8. ábra A szilikagél kölcsönhatása vízzel A fizikailag szorbeálódott víznek a HILIC elválasztásnál nagy jelentősége van. Ez adja azt a határfelületi réteget, amelybe a vizsgálandó komponensek beoldódnak. A leegyszerűsített kromatográfiás kép alapján, minél nagyobb a vegyületek vízoldékonysága, annál több időt töltenek ebben a határfelületi rétegben. A határfelületi rétegben a tartózkodási idő megegyezik a vegyületek nettó retenciós idejével. Az egyes vegyületek nettó retenciós ideje közti különbség a kromatográfiás rendszer szelektivitását adja meg. T n = t r -t m [3.1.] α = t n2/ t n1 [3.2.] ahol: t n a nettó retenciós idő, a t r a bruttó retenciós idő és t m a holtidő. Neue (2.1. Estimation of the extent of the water-rich layer associated with the silica surface in hydrophilic interaction chromatography David V. McCalleya,*, Uwe D. Neue Journal of Chromatography A, 1192 (2008) ) és munkatársai kimérték, hogy a szilikagél pórusainak 4-13 %-a vízzel feltöltött a % acetonitril-víz mozgófázis használatakor. Hasonló eredményt kaptak a teljesen porózus Atlantis szilikagélre és a héjszerű töltetre (Halo). A mérésekre benzolt használtak, és feltételezték, hogy a benzol nem lép kölcsönhatásba a nagy víztartalmú határfelületi réteggel. A felületi inhomogenitást még csak fokozza a fémszennyezők jelenléte a szilikagélben. Fémionok beépülése a szilikagél szerkezetbe erős kölcsönhatási energiával rendelkező ioncserélő és komplexképző centrumok létrejöttét jelenti, illetve még polarizáltabbá teszi az Si H-kötéseket. A fémionokkal és a polarizáltabb szilanol csoportokkal a molekula kölcsönhatások energiája jóval nagyobb, mint a nem fémion környezetben lévő szilanol csoportoké, amely a kromatográfiás csúcs kiszélesedéséhez, torzulásához vezethet. A modern szilikagél állófázisok már csak néhány ppm fémszennyezést tartalmaznak. Ezeket nevezzük nagy tisztaságú vagy harmadik generációs szilikagélnek. (Silica B) A fentebb ismertetetteken kívül a szilikagél felületén lehetnek a gyártásból visszamaradt savas, vagy bázikus karakterű szennyezések. Ezek a tényezők együttesen szabják meg az állófázis kromatográfiás tulajdonságait, nevezetesen a visszatartást, a zónaszélesedést, a szelektivitást, vagyis az elválasztást. A fém-ion tartalom változása viszont megváltoztatja a felületen a szilanol csoportok molekuláris állapotát, ami befolyásolhatja a vízréteg vastagságát. Egyéb, a retenciót befolyásoló hatás itt nem várható. 18

21 Dr. Fekete Jenő: A folyadékkromatográfia újabb fejlesztési irányai HILIC 3.9. ábra A HILIC-nál használt szilikagél felületének változása a ph függvényében. A 3.8. ábra azt mutatja, hogy a szilikagél erős kölcsönhatásbaa lép a vízzel. Eddigi ismereteink szerint, több molekuláris rétegben adszorbeálódik, létrehoz egy megosztó fázist. A két fázis közti folyadék-folyadék megoszlás mellett a szilanolcsoport molekuláris formájától függően felléphet egy másik kölcsönhatás is, amely a visszatartást, a szelektivitást és a csúcsalakot is befolyásolja. Ez a kölcsönhatás az ioncserés kölcsönhatás. Ez a kölcsönhatási forma a RP-HPLC módszerben tiltott. Kérdés, hogy a HILIC módszernél vajon ki lehet-e használni az elválasztás szelektivitásának növelésére vagy ez itt is tiltott. A HILIC-nál is alaptétel, hogy olyan erős kölcsönhatás az ionozált szilanolcsoport és a protonált amin között nem jöhet létre, amely irreverzibilis adszorbciót vagy aszimmetrikus csúcsokat eredményez. A viszonyok viszont nagymértékben különböznek a RP-HPLC-hoz képest. A HILIC-nél a vízrétegbe történő megoszlás és az erős ioncserés (ionos) kölcsönhatás a két fő retenciót megszabó tényező. A 3.9. ábrán a ph függvényébenn adtuk meg a szilanolcsoport molekuláris állapotát. A kis ph értékeknél a szilanolcsoportok ionizációja visszaszorított. Ekkor csak H-hidas kötés jöhet létre a pozitív töltésű aminokkal, ez egy gyenge kölcsönhatás, amelynek a kromatográfiás eredménye szimmetrikus kromatográfiás csúcs. A másik véglet a nagy ph-n a szilanolcsoport teljes egészében ionos formában lenne, de ez a HILIC körülmények közöttt nem lehetséges, mert a szilikagél feloldódna. A közbenső ph értékeken a két molekuláris forma aránya a ph függvénye. Amennyiben a két forma aránya összemérhető, akkor ezeknek a ph értékeknek használata is lehetséges. McCallay, aki bázisos csoportot tartalmazó vegyületek elválasztását, mind RP-HPLC, mind HILIC módszerben tanulmányozta, a kolonna túlterhelésével ellenőrizte, hogy fellépnek-e olyan erős kölcsönhatások, melyek inkompatibilitást eredményeznek. (Interneten elérhető: Journal of Chromatography A, (2007) Is hydrophilic interactionn chromatography with silica columns a viable alternative to reversed- McCallay azt találta, hogy a kolonna terhelése a savas közegű HILIC elválasztásnál tízszerese a RP-HPLC-nél tapasztaltaknak. Ez annyit jelent, hogy a HILIC megfelelőbb elválasztási módszere az ionizálható bázisos csoportot tartalmazó vegyületeknek, mint a RP-HPLC. Különböző Silica B phase liquid chromatography for the analysis of ionisable compounds? David V. McCalley) kolonnák azonos retenciós sorrendet adtak. A visszatartás mértéke is megegyezett a közel azonos fajlagos felületű szilikagéleknél. A határfelületi szilanolcsoportok molekuláris formája kérdéses. A Silica B alapú szilikagéleknél a szilanolcsoportok átlagos pka értéke 5-7. Köztudott, hogy nagy szerves oldószer tartalmú köze- el. gekben a gyenge savak pka értéke megváltozik. Általában a nagyobb értékek felé tolódik A HILIC visszatartást megalapozó elmélet szerint a határfelületen egy vízréteg jön létre. Ez azt okozhatja, hogy a szilanolcsoportok pka értéke nem változik. Azok az értékekk lesznek mérvadók, melyeket a vizes közegben mértek ki. A ph<3 savasságú közegekben a szilanolcsoportok prototonált formában vannak. Ez a ph érték a vizes közegben mérve értendő. A kis ph értékeknél való működés nem okoz stabilitási problémákat. A szilikagéll polisav, amely savas közegben nem oldódik. A különböző cégek által forgalmazott, és a HILIC elválasztá- protonálódhatnak, és a pozitív töltésű csoportok anioncserélőként viselkednek. Egyes szerzők sokra ajánlott szilikagéleknél ez az alsó ph érték 1-2. Az egyes ph érték alattt a szilanolcsoportok szerint a szilanolcsoport izoelektromos pontja a 2-3 ph körül van. Valószínűleg az újabb erős kölcsönhatás elkerülése miatt ajánlják, hogy a szilikagéleket 1-2 ph érték felett használjuk. 19

22 Dr. Fekete Jenő: A folyadékkromatográfia újabb fejlesztési irányai - HILIC A felső használati ph tekintetében az egyes szilikagélek esetén még nagyobb az eltérés. A legalacsonyabb 5, míg a legnagyobb 8-8,5. Az eltérő felső ph értéket részben magyarázhatja az eltérő szilanolcsoport aktivítás, részben az előállítás módja. A szól-gél technológiával előállított szilikagélek, általában kisebb fajlagos felületűek és vastagabb pórusfalúak. Így a ph stabilitásuk nagyobb. Kérdés, hogy akkor mi a különbség a NP-HPLC elválasztások kra, és a HILIC módszerre forga- mivel lomba hozott kromatográfiás kolonnák között. A kérdésre adandó válasz nagyon egyszerű, a két szilikagél, amelyet két különböző cég hoz forgalomba, a pórus paramétereiben különbözik ugyan, de felületi tulajdonságaiban nem, egyszerre lehet NP-HPLC-ban és HILIC-ben használni. Mindenkiben joggal merül fel a kérdés, akkor mit is ajánlanak NP-HPLC alkalmazásra és mit a HILIC-re? A válasz nagyon egyszerű; a szilikagél azonos, értve ez alatt az oszloptöltetet, csak az oldószer, amelyben tárolják különböző! A NP-HPLC-ban használt szilikagél kolonnát apoláris oldószerben tárolják. A HILIC célra használt szilikagél kolonna oldószere acetonitril vagy acetonitril-víz elegye. A protonfunkciós vegyületek elválasztásakor a HILIC-nél is elkerülhetetlen a ph kontroll. Kis ph értékeken a szilikagél, ahogy az előzőekben kifejtettük, lévén polisav, stabil, nagy ph értékeken viszont az alapszilikagél oldódik. Az oldódás változását a 3.9 ábrán adtuk meg. A szilikagél oldhatósága 7-es ph felett jelentősen nő, amire ügyelnünk kell, hogy a nagy szerves oldószer tartalmú mozgófázisokban a hidrogén-ion aktivitása jelentősen nő. Ha a szilikagél felületén egységesen vízborítottság van, akkor ezt a ph eltolódást nem kell figyelembe venni. Ha egyes felületi részeket acetonitril-víz borít, akkor itt ph eltolódás lesz, amely a szilikagél hosszú- idejű stabilitását jelentősen befolyásolhatja. Ez akár 2-3 egységgel is növelheti az aktuális hidrogén- ion aktivitást. Ez a hatás mindenképpen a felső ph érték csökkentését kívánná meg. A másik hatás, hogy a kioldódó szilikát termékek ionosok, amelyek oldhatósága a nagy acetonitril tartalmú mozgófázisba szer kisebb, mint vízben, ez kinetikailag gátolja a gyors oldódást. Mindenesetre a ph>7 alkalmazásakor a kolonna élettartama jelentősen csökkenhet. A Silica A és a Silica B kolonna közül, a kisebb szilanol aktivitású Silica B kolonna választása az előnyösebb. A viszonyokat a ábrán adtuk meg ábra A szilikagél oldhatósága a ph függvényében 20

23 Dr. Fekete Jenő: A folyadékkromatográfia újabb fejlesztési irányai HILIC Ismételten hangsúlyozzuk, gyártók által forgalmazott HILIC szilikagél abban különbözik a normálfázisú folyadékkromatográfiában alkalmazottól, hogy acetonitrilben hozzák forgalomba. A zirkónium- és a titán-dioxidot ma még nem, vagy ritkán alkalmazzák, de elvi akadálya nincs, hogy alkalmazzuk, mint HILIC állófázist. Néhány a HILIC gyakorlatban használt szilikagélt az alábbiakban adunk meg: Betasil (Thermo Scientific, Waltham, MA, USA) [30], Hypersil (Thermo Scientific) [31], Inertsil (GL Science, Tokyo, Japan) [32], Kromasil (EKA Chemicals, G oteborg, Sweden) [33], Supelcosil LC-Si(Sigma Aldrich, St. Louis, M, USA) [34], Alltima (Alltech, Nicholasville, KY, USA) [35], Spheri5 Silica (Alltech) [36], and Supersphere Si (Trentec, Gerlingen, Germany) [37]. Atlantis (Waters) [38 46]. Waters for HILIC mode ultrahigh-performance liquid chromatography (UPLC) [47,48]. Luna HILIC (Phenomenex) Ascentis silica ((Supelco, Bellefonte, PA, USA) Szilikagél használata HILIC állófázisként A rövid felsorolásból is látható, hogy mind a Silica A, mind a Silica B osztályból is használtak szilikagéleket poláris vegyületek elválasztására. Egyben ez annyit jelent, hogy bármely normálfázisú folyadékkromatográfiában használt állófázis használható a HILIC technikában. A folyadékkromatográfiásan kis molekulatömegű anyagok elválasztására a 10 nm (100 Å),a folyadékkromatográfiásan nagy molekulatömegű anyagok elválasztására a 30 nm(300 Å) pórusátmérőjű szilikagéleket használjuk. A táblázatban a LiCHrosorb sorozatra adtuk meg a pórusátmérőket és a kizárási tömegeket. Ez a szilikagél a Silica A osztályba tartozik és a Merck cég terméke. A továbbiakban ugyanennek a cégnek a Silica B kategóriába tartozó termékeit adjuk meg a specifikációjukkal együtt ( táblázat) Töltet megnevezése Fajlagos felület (m 2 /g) Fajlagos pórustérfogat (ml/g) Kizárási molekulatömeg (Dalton) LiChrospher Si LiChrospher Si LiChrospher 100 DIL LiChrosorb Si LiChrosorb Si LiChrosorb Si táblázat A Merck cég által forgalmazott Silica B kategóriába tartozó termékek, amelyek a HILIC-ban állófázisként használhatók. A szilikagélek felülete energetikailag heterogén. A felületi szilanolcsoportok pka értékét több tényező együttesen határozza meg. A HILIC-ban a szilanolcsoportok molekuláris állapota meghatározza a kölcsönhatásukat a vizsgált vegyületekkel. Bármilyen változás a molekuláris formájukban megváltoztatja a kölcsönhatási lehetőségeket, ez viszont a visszatartást befolyásolja. A szakirodalom ezt a jelenséget úgy interpretálja, hogy a szilikagélek használatakor az egyensúly beállása lassú. Nézzük meg, hogy ez a meglehetősen summás kijelentés mikor igaz és hogyan lehet ezt az időt csökkenteni. Ezt a jelenséget Snyder a fordított fázisú folyadékkromatográfiában behatóan tanulmányozta. Az ott szerzett tapasztalatokat ültetjük át a HILIC-nál alkalmazott körülményekre. 21

24 Dr. Fekete Jenő: A folyadékkromatográfia újabb fejlesztési irányai - HILIC A lassú egyensúly beállás oka jelenleg nem ismert. Snyder feltételezte, hogy a szilanolcsoportok molekuláris formáinak változása (egyensúly beállása) a ph változtatásával gyors (3.1.3.): SiH = Si - +H + [3.1.3.] Emellett a protolitikus folyamat mellett lejátszódik egy másik is, amelynek eredete nem ismert (3.1.4): XH=X - +H + [3.1.4.] Ez a folyamat kinetikailag gátolt. Az eddigi ismereteink szerint az anion protonfelvétele lassú folyamat. Itt kimondottan kinetikai gátlásról van szó. Az egyensúly beállását nem segíti, hogy nagyobb térfogatáramlási sebességgel több mozgófázist áramoltatunk át a kromatográfiás kolonnán. Egyedüli paraméter az idő. Snyder azt találta, hogy az általa vizsgált 19 Silica B alapú kolonnából ez az egyensúly-beállási probléma 8 kolonnánál lépett fel. Ezeket a vizsgálatokat fordított fázisú kolonnákkal végezte. Ha ezek az egyensúly-beállási problémák a kémiailag módosított szilikagéleknél felléptek, akkor a módosítatlan szilikagéleknél is fel kell, hogy lépjenek. Feltételezések szerint a proton felvételi sebesség a lassú folyamat, ezért a hatás a 2-3 ph körüli értékeknél erősebben érzékelhető. Mindaddig, amíg a XH/X - arány nem lesz állandó, addig a visszatartás is változhat. A továbbiakban meg kell néznünk, hogy milyen típusú vegyületek azok, amelyek a XH/X - arány változására érzékenyen reagálnak. Folyadékkromatográfiásan a vizsgálandó vegyületeket négy csoportba sorolhatjuk: 1. Kromatográfiásan semlegesek; a és b csoport. 2. Savas csoportot tartalmazók 3. Bázisos csoportot tartalmazók 4. Ionos csoportot tartalmazók. A négy csoport közül az 1a osztályba soroltak kivételével az összes csoportba tartozó vegyület meghatározható HILIC-val, ha a vegyületek lgp értéke kisebb mint -0,5 vagy -1. Most sorba vesszük az egyes osztályokat és megnézzük, hogy hol reagálnak jelentősen a XH/X - arány megváltozására. 1. A kromatográfiásan 1.b osztályba azok a vegyület tartoznak, amelyek poláris csoportot tartalmaznak. A poláris csoportok molekuláris állapotát a ph változtatása nem változtatja meg. Például a HILIC-val meghatározható vegyületek közül ilyenek a polihidroxi vegyületek. Nézzük meg a cukrokat, amelyek a legrégibb HILIC vegyületek. A cukrok beoldódnak a határfelületi vízrétegbe, és H-hidas kölcsönhatást alakítanak ki a vízzel körülvett szilanolcsoporttal. Ez a H-hidas kölcsönhatás gyenge, mert a víz is erős H-hidat képez a szilanolcsoporttal. Ennek eredménye, hogy az ebbe az osztályba tartozó vegyületek csak kis mértékben reagálnak az XH/X - arány megváltozására. Tehát az ebbe a csoportba tartozó vegyületeknél az egyensúly beállás lassúságából eredő probléma csak kis mértékű. 2. A kromatográfiásan 2. osztályba sorolt vegyületeknél (savas csoportot tartalmazó vegyületek) a molekuláris formák arányát állandó értéken kell tartani. A vegyületek oldaláról nézve szükséges a ph kontroll. A ph megváltoztatja a XH/X - arányt. A HILIC-nál is érvényes, hogyha lehet, akkor az elválasztást az ion-visszaszorított formában végezzük. Egyes szakirodalmak ezt nevezik a savas csoportot tartalmazó vegyület semleges formájának. Ekkor a pka-2=ph értékeknél kisebbeken dolgozunk. Az anionos ismeretlen felületi elem ekkor protonálódik. A és a egyenlettel jellemzett egyensúlyok baloldalra tolódnak el. A egyenletben megadott szilanolcsoport protonálódása gyors, ezért ami az egyensúly beállását megszabja, az az ismeretlen anion protonálódása (3.1.4.). A savas csoport, mind az ion visszaszorított szilanollal, mind az ismeretlen anion protonált formájával H-hidas kölcsönhatást tud kialakítani. Ennek erőssége nagyobb, mint az alkoholos hidroxiddal kialakított-é. Továbbra is igaz, hogy ezt a kölcsönhatást gyengíti, hogy a víz molekulák is kialakítanak H-hidakat a két protonált csoporttal. A protonálódás befejeződése után a retenció állandó lesz. A lassú egyensúly beállás miatti retencióváltozás a savas csoportot tartalmazó 22

25 Dr. Fekete Jenő: A folyadékkromatográfia újabb fejlesztési irányai HILIC vegyületeknél már nagyobb lehet, mint a kromatográfiásan semlegeseknél (1.b). Ha a vegyületek poláris jellegének növelése miatt a savas csoportot ionos formába akarjuk hozni, akkor célszerű a pka+2=ph feletti tartományban dolgozni. Ennek határt szabhat a szilikagél oldhatósága. Ha a savas csoport pka értéke öt, akkor ez hetes ph-t jelent. Ezen a ph értékén a egyenlettel megadott folyamat a jobb oldali irányba tolódik el. A szilanolcsoportok ionizálódnak, ezért a felületi töltéssűrűség jelentősen megnövekszik. Ehhez képest az ismeretlen eredetű protonfunkciós hely deprotonálódásából eredő töltés növekedés csak kisebb mértékben járul hozzá. Az, hogy a negatív töltések száma a szilikagél felületén idővel növekszik, csak kis mértékben csökkenti az ionos formában lévő savas csoportot tartalmazó vegyület retencióját. Általánosan elmondható, hogy 6-os ph felett a savas csoportot tartalmazó vegyületek elválasztásánál nincs egyensúly beállási hatás. 3. A kromatográfiásan 3. osztályba sorolt vegyületeknél (bázisos csoportot tartalmazó vegyületek) a molekuláris formák arányát állandó értéken kell tartani. A vegyületek oldaláról nézve szükséges a ph kontroll. A ph megváltoztatja a XH/X - arányt. A HILIC módszernél a bázisos csoportot tartalmazó vegyületeket általában kis ph értékeken határozzuk meg. Lehetőleg a pka-2=ph értékeknél kisebbeken, mert ekkor a vegyületek teljes mértékben ionos formában vannak. A protonálódott aminok (pozitív töltés) visszatartása függ attól, hogy a határfelületi fázisban a negatív töltést hordozó helyek száma mennyi. A egyenlet szerint a szilanolcsoportok gyakorlatilag protonálódtak. Az XH csoportok pka értékei nem ismertek, csak annyi, hogy protonálódásuk lassú. Az X - csoportok számának csökkenésével a protonált aminnal való erős kölcsönhatás lehetősége csökken, ami visszatartás csökkenést eredményez. Aminok HILIC-val történő mérésekor, kis ph értékeken, számolhatunk egyensúlybeállási problémákkal. Ha lehetőségünk van bázisos csoportot tartalmazó vegyületek elválasztására, ph>6 savasságú közegben, ahol a bázis ion-visszaszorított formában van, akkor nem lép fel erős kölcsönhatás a szabad bázis és a felületen lévő aniononos hely között. Az anionos helyek számát a szilanolcsoportok ionizációja szabja meg, ezért nem lép fel az egyensúly beállási probléma. 4. A kromatográfiásan 4. osztályba sorolt vegyületek egy része állandó töltéssel rendelkezik. Ha kis ph értéken dolgozunk, akkor mind az anionoknál, mind a kationoknál az állófázis felületén található negatív töltés befolyásolja a visszatartást. Például a kvaterner ammóniumsóknál az erős ioncserés kölcsönhatás szabja meg a visszatartást. Változik a negatív töltésű helyek száma a felületen, változik a visszatartás. Az eredmény csökkenő retenció. Az anionoknál az azonos töltések közötti elektrosztatikus taszítás miatt változik a visszatartás. Minél kevesebb a felületen a negatív töltés, annál nagyobb lesz a retenció. A kationok vagy anionok elválasztásakor, amikor kis ph értékeken dolgozunk, egyensúly beállási problémával találkozhatunk. ph>6 (lúgos) közegben, ahol a negatív töltést döntően a szilanolcsoportok ionizációja eredményezi, a lassú proton felvétel nem okoz egyensúly-beállási problémát. Az egyensúly beállás lassúsága kis ph értékeken nemcsak a szilikagélnél, hanem az összes szilikagél alapú HILIC állófázisnál problémát okozhat. Először röviden összefoglaljuk a fő jellemzőit az egyensúly beállás lassúságának, majd javaslatot teszünk, hogy a gyakorlati életben hogyan lehet hatását csökkenteni vagy teljes mértékben megszüntetni. Jellemzők: kis ph tartományban lép fel független a kolonnán a mozgófázis térfogatától, csak az időtől függ savas csoportot tartalmazó vegyületeknél retenciónövekedést okoz bázisos csoportot tartalmazóknál retenció csökkenést eredményez anionoknál retenciónövekedést okoz kationoknál retenció csökkenést okoz hőmérséklet növelésével az egyensúly beállási idő jelentősen csökken. 23

26 Dr. Fekete Jenő: A folyadékkromatográfia újabb fejlesztési irányai - HILIC A lassú egyensúly beállás acetonitrilben még jobban jelentkezik, mert gyakorlatilag nincs proton, amely a folyamathoz szükséges. A különböző kolonnagyártó cégek ezért ajánlják, hogy pár százalék vizet vagy puffert tegyünk az acetonitrilbe. A nagy szerves oldószer tartalmú mozgó- be. Ahogy a lassú egyensúly beállás jellemzőit felsoroltuk, a két legfontosabb tényező, hogy kis fázisokba csak szerves pufferkomponenseket tehetünk, mert különben kristály kiválás következik ph értékeken következik be (savas közegben), és időfolyamat. Ahhoz, hogy egyes esetekben akár órákig várjunk az egyensúly beállásra, szükséges, hogy a szilikagél vagy szilikagél alapú HILIC kolonnákat pufferben tároljuk. Még szerves pufferek használatak kor is ügyelnünk kell arra, hogy ne legyen túl nagy a koncentrációja, hogy a só kiválást elkerüljük! 3.2. Polárisan módosítottt szilikagélek, mint HILIC állófázisok A polárisan módosított szilikagélek közül a szénhidrát analitikai alkalmazások miatt kiemelt szerepe van az aminofázisnak, a többi is alkalmazható különböző elválasztási célokra. A polárisan módosított szilikagélek általános felépítésétt a ábrán adjuk meg ábra Poláris csoportott tartalmazó szilánnal kémiailag módosított szilikagél A propil csoporthoz kapcsolódó aminocsoport poláris, és savas ph-n protonfelvétel után anioncserélő (ionos) jellegű. A propilcsoportot távtartónak neveztük el, mert a poláris csoport közvetlenül nem kapcsolódhat a szilicium-atomhoz, mert nem lesz stabil. A propilcsoport távolságot tart a szilicium és az aminocsoport között. A szilicium-atomhoz kapcsolódó két metil-csoport sztérikuss gátlást jelent, hogy az újabb reaktív szilán a szomszédoss szilanolcsoportokkal reagáljon. A sztérikus gátlás miatt kb. a szilanolcsoportok fele reagál. 8 μmol/m 2 átlagos szilanol koncentrá- szilikagél felületén. Ha a szilikagél fajlagos felülete 300 m 2 /g, akkor ez 0,9-1,2 mmol/g borítottságot jelent. cióval számolva 3-4 μmol/m 2 propilamino csoport koncentráció lesz a módosítás után a A felületen több fajta kölcsönható csoport található. Reagálatlan szilanol, aminocsoport és a propil, metilcsoportok. A 3.1. fejezetben bemutattuk, hogy a szilanolcsoportok a mozgófázis ph-tól függően vagy ionvisszaszorított, vagy ionizált formában vannak. Az aminocsoport molekuláris formája, és ezzel kölcsönható képessége is ph függő. gyantaa fázis CH 3 N + H + H proton amino ábra Az aminocsoport protonálódása H + N CH H 3 H amino csoport Az aminocsoport savas ph-n protonálódik és anioncserélővé alakul. Propilaminnal modellezve a folyamatot, az aminocsoport pka értéke A fázis felső használati ph-ja 7. Tehát ph kontrollt használva az aminocsoport anioncserélőként működik 24

27 Dr. Fekete Jenő: A folyadékkromatográfia újabb fejlesztési irányai HILIC Ioncserélő kapacitás meq/g + N H CH 3 H + N H CH 3 H CH 3 I. II. N III H N CH 3 H ábra Az aminofázis molekuláris állapota a ph függvényében. A kolonnát 7-es ph alatt lehet használni, ezért ph kontroll használva a 3-7 tartományban anioncserélőként is működik A protonált aminocsoport H-hidas kötést alakít ki azokkal a vegyületekkel, amelyek aktív hidrogén-atomot tartalmaznak. Ugyancsak H-hidas kötést alakít ki a disszociójában visszaszorított szilanolcsoport. Az ionizált szilanol viszont kationcserélő helyként viselkedik. A propil- és metilcsoportok apoláris (hidrofób) kölcsönhatást tudnak kialakítani a vizsgált vegyületekkel. A poláris szilanolcsoportok, a protonált aminocsoportok is hidratálódnak, és az állófázis határfelületén vízréteg alakul ki. A visszatartást és a szelektivitást több tényező együttesen szabja meg a vegyületek szerkezetétől függően: k=k v +k ic +k H +k d [3.2.1.] pk b ahol: k v, k ic, k H, k d a vízréteg, az ioncsere, a H-hidas kötés és a diszperziós kölcsönhatás járuléka a visszatartáshoz. A primér amino csoportot tartalmazó aminofázisoknál problémát jelenthet a Schiff-bázis képződés. Az irodalomban, ezt azonban eddig senkinek sem sikerült bizonyítani. Az irodalomban sok aminofázist használtak HILIC elválasztásra. Közülük adunk meg néhányat: Bondapak AX (Waters), Bondapak carbohidrate (Waters), Spherisorb NH2 (Waters),YMC-Pack NH2 (Waters), Luna Amino (Phenomenex) Hypersil APS2 (Thermo Science) [61,62], Zorbax NH2 (Agilent, Santa Clara,CA, USA) [63], aphera NH2 (ASTEC, Whippany, NJ, USA)[64], Alltima Amino (Alltech) [65], PALPAK TypeN (TakaraBio,tsu, Japan) [66], and Micropellicular [67]. YMC PackPolyamine II (YMC) A következő táblázatban ( táblázat) a Merck termék adatait adjuk meg: Állófázis jellemző Propilamino módosított szilikagél Alak: gömbszimmetrikus Szemcseátmérő: 5; 10 μm Pórusátmérő: 100 Å (10 nm) Pórustérfogat 1,25 ml/g Fajlagos felület: 350 m 2 /g Széntartalom: 4,6 % C Felületi borítottság: 4,1 μmol/m 2 Hatékonyság N/m ; N/m ph tartomány: ph 2-7,5 Tárolási oldószer: n-heptán ph táblázat A Merck aminofázis és jellemző paraméterei 25

28 Dr. Fekete Jenő: A folyadékkromatográfia újabb fejlesztési irányai - HILIC A táblázatban a Merck cég n-heptánbann szállítja a kolonnát, a HILIC-ban viszont acetonitril víz elegyet kell használnunk. Ehhez oldószercserét kelll végrehajtanunk. Ennek kivitele egyszerű. A kolonnát először diklórmetánnall mossuk. A kolonna mosáshoz kb szeres kolonna- aceto- térfogatú diklórmetánt használunk. Majd diklórmetános mosás után ugyanolyan térfogatú nitrillel mossuk ismét a kolonnát és ezután használhatjuk a HILIC-nál használatos oldószereket. Ezt az oldószercserét kell mindenn olyan esetben végrehajtani, amikor n-heptánban vagy n-hexánban szállítják a kolonnát. Ez az oldószercsere mutatja meg azt, hogy a hagyományosan a normálfázisú folyadékkromatográfiához szállított kolonnákat hogyan kell a HILIC -módba átvinni. Az aminocsoport helyett lehet nitrilcsoport is ábra Nitrilcsoportot artalmazó állófázis, ami HILIC töltetként használható. A nitril csoportban töltés szétválás történik; a nitrogén-atom részlegesen negatív, míg a szénatom részlegesen pozitív lesz. A csoport dipól-dipól kölcsönhatást tud kialakítani. Ennél a módosításnál is maradnak a felületen reagálatlan szilanol csoportok. A HILIC-nél feltételezett vízburok kialakításában a nem reagált szilanolcsoportok, és a nitrilcsoportok is szerepet játsza- is nak. A felületi vízrétegbe történő beoldódás (abszorpció) mellett a dipól-dipól kölcsönhatás befolyásolja a vegyületek visszatartását ábra Diolcsoportot tartalmazó állófázis, ami HILIC töltetként használható. A hidroxilcsoportok gyenge H-hidas kölcsönhatástt alakítanak ki a vizsgált vegyülettel. A határ- veszi körül. A táblázatban a Merck által forgalmazott, γ-propiolinit trillel módosított szilikagél alapú felületen létrejövő vízburok kialakításához úgy járulnak hozzá, hogy a diolcsoportot hidrátburok termék adatait adjuk meg. 26

29 Dr. Fekete Jenő: A folyadékkromatográfia újabb fejlesztési irányai HILIC Töltet jellemzője: Alak: Szemcseátmérő: Pórusátmérő: Fajlagos pórustérfogat: Szilikagél γ-propiolinitrillel módosítva gömbszimmetrikus 5; 10 μm 100 Å (10 nm) 1,25 ml/g Fajlagos felület: 350 m 2 /g Széntartalom: 6,6 % C Felületi borítottság: 3,52 μmol/m 2 Hatékonyság: ph tartomány ph 2-7,5 Tárolási oldószer: N/m ; N/m n-heptán táblázat Merck által forgalmazott γ-propiolinitrillel módosított szilikagél. A HILIC -módra történő oldószer váltás megegyezik az aminó módosított szilikagélnél leírtakkal. A táblázatban a Merck által forgalmazott, diol módosított szilikagél alapú termék adatait adjuk meg. Töltet jellemzője: Alak: Szemcseátmérő: Pórusátmérő: Fajlagos pórustérfogat: Diol módosítású szilikagél gömbszimmetrikus 5; 10 μm 100 Å (10 nm) 1,25 ml/g Fajlagos felület: 350 m 2 /g Széntartalom: 8,0 % C Felületi borítottság: 3,87 μmol/m 2 Hatékonyság: ph tartomány: ph 2-7,5 Tárolási oldószer: N/m ; N/m n-heptán táblázat Merck által forgalmazott, diol módosított szilikagél alapú termék adatai. Elvileg bármely módosítás, amely poláris jelleget ad a felületnek HILIC töltetként használható Ioncserélők, mint HILIC állófázisok. A HILIC-ben használhatunk ioncserélőket is állófázisként. Az ioncserélőket töltésük alapján két osztályba soroljuk: Erős anioncserélők, jellemzőjük, hogy az állófázis felületén rögzített pozitív töltésű csoportok vannak az elválasztás körülményei között 27

30 Dr. Fekete Jenő: A folyadékkromatográfia újabb fejlesztési irányai - HILIC Kationcserélők, jellemzőjük, hogy az állófázis felületén rögzített negatív töltések találhatók az elválasztás körülményei között gyantaa fázis vagy alapfázis + N - H ellenion Az ioncserélőket töltésük ph-függése alapján ismét két csoportba sorolhatjuk: Erős anioncserélők azok, amelyek ioncserélő kapacitása független a mozgófázis (eluens) ph értékétől. Ilyenek a kvaterner-ammóniumm vegyületek ( ábra). ioncserélő ábra Erős anioncserélő gyanta (állófázis) szerkezete Az ioncserélők döntő többsége szerves polimer alapú. Ezeket az alapfázisokat az angol szakirodalom "resine"-nek, egyszerűen gyantának nevezik. Innenn ered a gyanta fázis elnevezés. Készülhetnek szervetlen oxid alapon is az esetek többségében szilikagél alapon. Attól függően, hogy polimer vagy szervetlen (szilikagél) alapon készültek az anioncserélők más lesz az alkal- A szerves polimer alap valóban az 1-14 ph tartománybann használható, károsodáss nélkül. A problémát viszont az okozza, hogy a HILIC módszernél használt folyadékkromatográfiás rendszer ugyan mazható ph tartomány. Alkalmazási ph tartomány szerves polimer alapú anioncserélőnél: 1-12 (13) Egyes irodalmak ezt a ph tartománytt az 1-14 közé teszik. Az előzőekben 1-12-re szűkítettük. rozsdamentes acélból készül, de a kis és a nagy ph értékeken megnő a korrózió veszélye. Ez az oka a ph tartomány korlátozásának. Alkalmazási ph tartomány szilikagéll alapú anioncserélőnél: 3-7 Kis ph értékeknél jelentősen nő az ioncserélő csoportot tartalmazó rész hidrolízis sebessége. A nagy ph értékeken viszont előtérbe kerül az alapszilikagél oldhatóságának növekedése. Az erős kationcserélők felületén szerves szulfonsav csoportok vannak. A csoportok vizes közegben nagymértékben disszociálnak. Így a felület negatív töltéssel rendelkezik. A szerves szulfonsav disszociációja függ a közeg szerves oldósezr tartalmától. Ha elfogadjuk a HILIC alaptételét, hogy a határfelületen egy vízréteg alakul ki, akkor a szerves szulfonsav disszociációs viszonyainál is a határfelületi vízréteggel kell számolnunk. A szerves polimer alapú erős kationcserélő szerkezetét a ábrán mutatjuk be ábra Szerves polimer alapú erős kationcserélő, mint HILIC állófázis. 28

31 Dr. Fekete Jenő: A folyadékkromatográfia újabb fejlesztési irányai HILIC A HILIC mérési körülményei között a szerves polimer alapú erős ioncserélő ionizált formá- A ban fordul elő. Az ionos részt hidrátburok veszi körül, ez biztosítja a határfelületi vízréteget. vízbe történő beoldódás mellettt a kationcsere is hozzájárulhat a visszatartáshoz. A szerves polimeralapú erős ioncserélők mellett használhatók még a szervetlen alapúak is. Ezek közül a szilikagél alapúak, amelyeket a leggyakrabban használunk. reaktív szilanol csoportok CH 3 Si H CH 3 Si Si Si + H Cl Si Si H CH 3 CH 3 szilikagél része szilárd reaktív szilán CH 3 cc. H 2 S 4 Si Si S 3 - H + Si H CH ábra Szilkagél alapú erős kationcserélő felülete, amelyet HILIC állófázisként használhatunk. Az ioncserélő csoportot tartalmazó rész borítottsága kisebb, mint a oktadecil csoportot tartalmzó szilánnal történt módosításnál, több lesz a reagálatlan szilanolcsoport. A reágalatlan szilanolcsoportok is hozzájárulnak a határfelületi vízréteg kialakulásához. Kölcsönhatási szempontból a szilanol- formában van és H-hidas kölcsönhatást alakít ki, ph 7 körüli savasságú közegben nagy részük csoportok molekuláris állapota a mozgófázis ph-tól függ. A ph 3 körül nagy részük nem disszociált ionizált formában kationcseréree alkalmas Zwitter-ion tartalmú HILIC állófázisok. Az előző két fejezetben (3.2 és fejezet), láttuk, hogy mind az anion, mind a kationfelületen cserélők használhatók állófázisként a hidrofil kölcsönhatási kromatográfiában (HILIC). A lévő pozitív és negatív töltések hidratációja azt eredményezi, hogy a határfelületen vízréteg alakuljon ki, amely a HILIC módszer egyik jellemzője. A pozitív töltés okozta anioncsere és a negatív töltés eredményezte kationcsere önmagában is lehetőség, hogy az ionos vegyületeknél megfelelő mértékű visszatartás jöjjön létre. Az ionos kölcsönhatáshoz a vizsgálandó vegyületnek is ionos formában kell lennie ábra Zwitter-iont tartalmazó HILIC állófázis 29

32 Dr. Fekete Jenő: A folyadékkromatográfia újabb fejlesztési irányai - HILIC A ábrán adtuk meg a ZIC-HILIC állófázist. A hordozó vagy alap itt is kétféle lehet. Vagy szilikagélen, vagy szerves polimeren immobilizálják a szulfo-bétain típusú kettős iont. Az alap vagy hordozó megszabja a ph tűrését az állófázisnak. A szilikagél alapnál az általános határ 3-7, ez a gyári specifikáció szerint 3-8 közötti ph tartományt jelenti. A gyártó ugyan nem adja meg, hogy milyen kötésen keresztül történik a zwitterion kapcsolása a felülethez, valószínűleg ez Si--Si kötésen keresztül történik, ahogy a ábrán megadtuk. CH 3 CH 3 Si Si (CH 2 )n CH 2 N (CH 2 2) 3 S 3 CH 3 CH ábra A zwitterion kapcsolódása a szilikagél felületéhez. A kettősion a polárisabb mozgófázis felé orientálódik, mert a végcsoport egy szerves szulfonsav, amely az alkalmazott ph értékeken ionos formában van. Az alkalmazott szilikagél jellegét nem adják meg, de ismerve a mai trendeket, ez egy Silica B kategóriába tartozó fázis, amelynek összes fémion tartalma kisebb, mint 10 ppm. Az állófázis határfelületén tehát immobilizát kettősion és nem reagált szilanolcsoportok találhatók. A szilanolcsoportok molekuláris állapota, mint azt a 3.1. fejezetben, a ábrán bemutattuk, a ph függvényében változik. Ezen a ph-n a zwitterionos állófázis határfelületen kialakult ph-t értjük. A szilikagél felületén, ennél az állófázisnál, az immobilizált ligand és a szilanolcsoport is poláris, így a felületen kialakul a vízréteg. Ennek a vízrétegnek a ph-ja dönti el a szilanolcsoportok molekuláris formáját. Silica B csoportba sorolt szilikagéleknél a szilanolcsoportok pka értéke 7 körül van. 5-ös ph alatt a szilanol- H-hidas kölcsönhatást tudnak kialakítani. Kvaterner-ammónium ionok nem tudnak H-hidas kölcsön- csoportok döntően protonált (ionvisszaszorított) formában vannak. Ezek a szilanolcsoportok hatásban résztvenni, tehát a szilanolcsoport és a láncban lévő szilanolcsoport kölcsönhatását kizárhatjuk. A lánc végén lévő szulfonsav csoport, ha hidrogén formában van, azaz ellenionja hidrogén, H-hidas kölcsönhatást tud a szilanolcsoportokkal kialakítani. ph>5 savasságú közegekben a szilanolcsoportok egy része ionizált molekuláris formában van. A negatív töltésű szilanolcsoport és a pozitív töltésű kvaterner-ammóniun ion erős elektroviszont a sztatikuss kölcsönhatást tud kialakítani. Az ionizált, negatív töltésű szulfonsav csoport víztartalmú mozgófázis felé orientálódik. A módosításnál, a szilícium-atomot és a kvaterner- felülét ammonium iont egy hosszabb alkillánc köti össze. Ez az alkillánc védi az alap szilikagél ( ábra), ez lehet az oka, hogy a forgalmazók a felső alkalmazási ph-t nyolcra növelték ábra A ZIC-HILIion közötti elektrosztatikus kölcsönhatás van, ennek eredményeképp az alkillánc védi a felületet. felülete ph>5 savasságú közegben. Az ionizált szilanol és a kvaterner-ammónium 30

33 Dr. Fekete Jenő: A folyadékkromatográfia újabb fejlesztési irányai HILIC Az alkillánc hosszát nem adták meg a forgalmazók, de 20 nm pórusátmérőből arra lehet következtetni, hogy 3-nál nagyobb. Figyelembe véve, hogy a gyakorlatban milyen zwitterionos felületaktív anyagot használnak, akkor ez valószínűleg dodecilcsoport. A betain 12 elnevezésű felületaktív anyag ugyanis N-dodecil-N,N-dimetil-aminó-propánszulfonsav. A gyári specifikáció elég szűkmarkú. Ezt a táblázatban adjuk meg. Kolonna típusa: Átlagos szemcseátmérő: Átlagos pórusátmérő: Maximálisan alkalmazható nyomás: ZIC-HILIC 5 μm 200 Å Alkalmazható ph tartomány: 3-8 Maximális hőmérséklet: 70 C 40 Mpa (400 bar) Fajlagos felület: 140 m 2 /g Nem alkalmazható oldószerek: táblázat A ZIC-HILIC specifikációja a gyártó alapján. THF, DMS, DKM, ha PEEK a kolonnaház A táblázatban megadott 20 nm-es (200 Å) átlagos pórusátmérő a módosítás előtti szilikagélre vonatkozik. Az, hogy ez milyen mértékben csökken a módosítás után, az a felületi borítottság függvénye, erre vonatkozó adatokat eddig nem adtak meg. Nem adták meg a módosítás utáni fajlagos felületet sem. A 20 nm viszont elég, hogy ne csak a folyadékkromatográfiásan kis vegyületeket vizsgáljuk ezzel a kolonnával. A táblázat utolsó sorában megadtuk azokat az oldószereket, amelyek a kolonna szerkezeti anyagát duzzasztják. Az állófázist ugyanis poliéter-éterketon (PEEK) műanyag kolonnában is forgalomba hozzák. Tilos tehát minden olyan oldószer használata, amely ezt a műanyagot oldja, vagy duzzasztja. A szerves polimer alapú állófázist ZIC-pHILIC névvel hozzák forgalomba. A kis p jelzi a felhasználó számára, hogy itt szerves polimer hordozóról van szó. A szerves polimer alap ph tűrő, ami korlátozza az alkalmazott ph értéket, az a polimer-zwitterion kapcsolat. ZIC -HILIC ZIC -philic ph taromány: 3-8 ph taromány: 2-10 Nyomás: 400 bar Nyomás: 200 bar Hőmérséklet: 70 C Hőmérséklet: 60 C Pórusátmérő: 200 A(20nm) Fajlagos felület: 140 m 2 /g Pórusátmérő: 200 A(20nm) Fajlagos felület: N/A táblázat A ZIC-HILIC és a ZIC-pHILIC kolonna jellemzői Ha a táblázatban megadott paramétereket összevetjük, akkor jól láthatók az alkalmazási körülmények közti különbségek. Az első a használható ph tartomány. A polimer alapúnál 2-10 közötti érték (ZIC-pHILIC). A ph<2 alatt és ph>10 az alap polimer és a zwitterion közötti kötés hidrolízisének sebessége jelentősen megnő. A polimer alapból eredően a felső alkalmazható nyomás 200 barra (20 Mpa) csökken. A felső alkalmazható hőmérséklet ugyancsak 10 C-kal kisebb. 31

34 Dr. Fekete Jenő: A folyadékkromatográfia újabb fejlesztési irányai - HILIC Nincs adat a pórus átmérőről és a fajlagos felületről. A szerves polimer alap nagy valószínűséggel sztirol-divinilbenzol koopolimer. A szerves polimereknél csak akkor lehetséges a 200 baros nyomás használata, ha a térhálósági fok nagy. Ezeknél a nagy térhálóságú polimereknél a mikropórusok előfordulási valószínűsége nagy. A mikropórusok minden esetben kiszélesítik a kromatográfiás csúcsokat, ami az elméleti tányérszám csökkenését okozza. A táblázatban a szilikagél alapú ZIC-HILIC kolonnák dimenzióit adtuk meg. A rendelkezésre álló kolonna méretek széles skálát mutatnak. Az analitikai mérettől a mikroméreten keresztül a kapilláris kolonnáig terjed. Katalógusszám P/N Hossz mm Átmérő mm Szemcseátmérő μm Pórusátmérő Å (5 pcs) (5 pcs) táblázat A ZIC-HILIC kolonnák választéka, amely az analitikai mérettől a mikroméreten keresztül a kapilláris kolonnáig terjed. 32

35 Dr. Fekete Jenő: A folyadékkromatográfia újabb fejlesztési irányai HILIC A ZIC-HILIC kolonnák választéka az anlitikai folyadékromatográfiás elválasztásra alkalmastól indul és a nano-folyadékkromatográfiásnál ér véget. Kérdés, hogy adott folyadékkromatográfiás készülékhez milyen méretű kolonnát válasszunk. Természetes, hogy a kisebb dimenziójú kolonnáknál a mozgófázis fogyasztás csökken. Az azonos hatékonyság eléréséhez, ha a töltet minden egyéb paramétere a két kolonnában megegyezik, akkor az átmérők arányának négyzetével változik a felhasznált mozgófázis térfogata. (d c1 /d c2 ) 2 F 1 =F 2 [3.4.1.] ahol: d c1 és d c2 a két kolonna átmérő, F 1 és F 2 az 1. és 2. kolonnán mért térfogat-áramlási sebesség. Ha 4,6 mm-es belsőátmérőjű kolonna helyett 2,1 mm-est használunk, akkor a felhasznált oldószer mennyiség a kisebb átmérőjűnél az első kolonnához képest csak 21 %. Az oldószer megtakarítás kb. ötszörös. A táblázatban megadott 50 mm hosszúságú kolonnák közül az első, a 2,1 mm belsőátmérőjű használatakor nagy mennyiségű oldószert spórolunk meg. A kisebb retenciós térfogat nagyobb csúcsmaximumbeli koncentrációt jelent, ami növeli az érzékenységet. Ha kromatográfiás rendszer csúcsszélesítő hatása nem teszi tönkre, amit a kolonna tud. Az ötször kisebb retenciós térfogat azt is eredményezi, hogy a csúcsszélesség, térfogategységben kifejezve, is ötször kisebb lesz. Vegyük a 50 mm hosszú 2,1 mm belső átmérőjű kolonnát. A van Deemter összefüggés alapján a H min 10μm, akkor az elérhető maximális elméleti tányérszám: 2000, a holttérfogat (V M ) 105 μl, felhasználva a összefüggést, k=5-nél a retenciós térfogat (V R ) 630 μl V R = V M (1+k) [3.4.2.] Ekkor a σ 2 = 4 μl 2 és a maximálisan a kolonnán kívül megengedett zónaszélesedés ennek 10 %-a lehet, azaz 0,4 μl 2. 2 σ E Összetevői 2 σ A 2 σ ö 2 σ Dcell 2 σ Dt P A K D σ = σ + σ + σ + σ 2 E 2 A 2 ö 2 Dcell 2 Dt detektor elektronika okozta zónaszélesedés detektorcella okozta zónaszélesedés összekötő vezetékek okozta zónaszélesedés adagoló okozta zónaszélesedés ábra A kolonnán kívüli zónaszélesítő hatások a ZIC-HILIC kolonna használatakor. 33

36 Dr. Fekete Jenő: A folyadékkromatográfia újabb fejlesztési irányai - HILIC Kolonnahossz (mm) Átmérő (mm) V m (ml) σ (μl 2 ) σ 2 folyadék- kromatográf 50 2,1 0,10 0,4 gyors 50 4,6 0,50 1,9 gyors 100 2,1 0,2 0.8 gyors 100 4,6 1,00 3,,84 gyors 150 2,1 0,3 1,2 gyors 150 4,6 1,5 5,7 gyors, HPLC? 250 2,1 0,5 2,0 gyors 250 4,6 2,5 9,5 HPLC táblázat 5μm szemcseátmérőjű ZIC-HILIC a megengedett kolonnán kívüli zónaszélesítés és alkalmazható folyadékkromatográfiás készülék (k=5). A gyors folyadékkromatográf a kis kolonnán kívüli térfogatú készülékeket jelenti, HPLC a hagyományos 400 bar nyomásra tervezettet, ahol detektor cella térfogata 5-10 μl között van. A táblázat adataiból látható, hogy az 5 μm szemcseátmérőjű ZIC-HILIC oszlopnál a hagyományos HPLC csak a 250 x 4,6 mm-es kolonnánál alkalmazható minden kétséget kizáróan. A 150 x 4,6 mm-es kolonnát csak akkor, ha 1-5 μl térfogatú mintákat adagolunk. A maximálisan adagolható térfogatot úgy döntjük el, hogy a különböző térfogatú adagolásokhoz kiszámoljuk az elméleti tányérszámot (N) és az adagolási térfogat függvényében ábrázoljuk ( ábra). A maximálisan adagolható mintatérfogat (V injm max) az, amikor az N értéke már 10 %-kal csökken ábra A maximálisan adagolható mintatérfogat a ZIC-HILIC kolonna használatakor. A maximálisan adagolható mintatérfogat (V injmax ) az, amikor az N értéke már 10 %-kal csökken. A táblázatban a szerves polimer alapú ZIC-pHILIC kolonnákat adtuk meg. Itt kisebb a választék. Ebből a táblázatból hiányzik két oszlop; a becsült holttérfogat és a kolonnán kívüli maximálisan megengedett zónaszélesedés. Az utóbbival kezdve. Köztudott, hogy a szervess polimer alapú töltetek pórusszerkezete miatt szélesebb kromatográfiás csúcsokat kapunk összevetve a megegyező szemcseátérőjű szilikagélekhez viszonyítva. Az a tétel, hogy a H mn kb kétszerese vagy háromszorosa a szemcseátmérőnek, a jó pórusszerkezetű szilikagélre igaz. A szerves polimer alapú töltetek pórusszerkezete gyártmányfüggő, ezért a szilikagél alapú kolonnáknál használt becslés itt nem használható. Az átlagos pórusátmérőt a gyártó megadta ugyan, de póruseloszlás, alak és jelleg is ismeretlenek, így a holttérfogatot sem lehet ugyanazzal az összefüggéssel becsülni, mint amelyet a szilikagéll alapú ZIC-HILIC-nél használtunk. 34

37 Dr. Fekete Jenő: A folyadékkromatográfia újabb fejlesztési irányai HILIC Katalógusszám P/N Hossz mmm Átmérő mm Szemcseátmérő μm Pórusátmérő Å táblázat A ZIC-pHILIC kolonnák választéka, amely az analitikai mérettől a mikroátmérőjű kolonnáig terjed. A ZIC-HILIC sorozatban ismeretes egy új tag is, ekkor a szilikagél felületéhez olyan kettős iont (zwitter-iontcsoport. immobilizáltak, amikor a külső ion lesz a kvaterner-ion és a belső egy foszforkolin ábra A ZIC-cHILICC kolonna szerkezeti felépítése. Az alap szilikagél. A szilikagél felületén kettős ionokat immobilizálni az állófázis előállítóknál ma már rutinfeladat. Ezekből a módosításokból mutatunk be néhányat. CH CH 3 N CH 3 S 3 HEMA-DMAES CH CH 3 N S 3 S300-ECH-DMA-PS CH 3 CH 3 N S 3 S300-TC-DMA-PS CH 3 CH 3 CH 3 N CH 3 S 3 S300-MAA-SPE PolyDAEMA + (Si 2 )-grafted silica 35

38 Dr. Fekete Jenő: A folyadékkromatográfia újabb fejlesztési irányai - HILIC NH NH N H 2 His-Si 2 Si Si H Si Si C N H 2 Lys-Si 2 NH 2 H 2 N NH 2 NH Arg-HEMA NH CH 2 CH 3 N CH 3 S 3 ZIC-HILIC (SeQuant, Merck) P P N N n-1 KS-polyMPC H Si N N S 3 H Cl SilmPS H Si S N N S 3 H SilmBs CF 3 S 3 36

39 Dr. Fekete Jenő: A folyadékkromatográfia újabb fejlesztési irányai HILIC NH NH NH NH NH PolyCAT A (PolyLC, USA) NH N H 3 NH NH Si Si NH Si Si NH P CH 3 N CH 3 CH 3 IAM.PC.DD (Regis Tech) Si Si NH táblázat Kettős-ion immobilizálás a szilikagél felületén. Ugyancsak kettős-ion (zwitter-ion) szerkezetet mutat az belisc N kolonna. Az N megjelölés a normál fázisra utal. A fázis szerkezetét a ábrán mutatjuk be. Hidrofil lánc ábra belisc N kolonna határfelülete. A pozitív és negatív töltéseket hidrofil lánc köti össze. A pozitív és negatív töltéseket hidrofil lánc köti össze, így a fázis poláris jellegű. HILIC módban, mind a töltés körüli részeket, mind a hidrofil láncot hidrát búrok veszi körül. Így teljesül az feltétel, hogy az állófázis felületén vízréteg van, ami polárisabb a mozgófázisnál. A ZIC-HILIC-hez képest fordított töltéshelyzet az ionos vegyületeknél eltérő visszatartást és szelektivítást eredményez. 37

40 Dr. Fekete Jenő: A folyadékkromatográfia újabb fejlesztési irányai - HILIC 3.5. Egyéb állófázis típusok a HILIC-ban Alpert, aki a HILIC módszert illetve a vizes fázisú normálfázisú kromatográfiás módszer nevét adta annak, az aminopropil-szilánt poliszukcin-imiddel módosította, ezzel egy új típusú HILIC állófázis sorozatnak adta meg az alapját. Az így kialakított állófázis felületén szulfonsav csoportok találhatók. A kémiai kötéstt savamid csoportok biztosítják, amelyek polárisak. A határfelületi fázisban az anioncserélő csoportok és a savamid csoportok is hidrátburokkal vannak körülvéve. A visszatartást két fő hatás szabja meg: a vízrétegbe való beoldódás és az ionos kölcsönhatás. A ciklodextrint tartalmazó szilikagélek is felhasználhatók HILIC állófázisként. Építőegységei α-kötésben lévő glükózok ( ábra). Különböző tagszámú ciklikus vegyületet kialakítva. Három típust alkalmaznak, α-cd, β-cd, γ-cd ( ábra), sorrendben hat, hét illetve nyolc glükóz egységből épülnek fel. A cikolodextrinek belső része apoláris jellegű. A belső részre kerülnek a C--C kötések, amelyek elektrondonorok ugyan, de ezt kötés-típust tartalmazó vegyületek polaritása kicsi, a külső részen vannak a CH 2 H csoportok, amelyek erős H-hidas kölcsönhatást alakítanak a vízzel. A nagy acetonitril artalmú mozgófázisoknál adott, hogy a felületi fázisban vízréteg alakuljon ki ábra γ-ciklodextrin szerkezete, az üreg belső része apoláris, míg a külső részén az alkoholos hidroxil csoportok erős H-hidas kölcsönhatást alakítanak ki a vízzel 38

41 Dr. Fekete Jenő: A folyadékkromatográfia újabb fejlesztési irányai HILIC ábra A 6, 7 és 8 glükóz egységből felépülő ciklodextrinekk jellemző méretei. Cilodextrinek α-cd β-cd γ-cd Belső átmérő [nm] Külső átmérő [nm] 0,57 1,37 0,78 1,53 0,95 1, táblázat Ciklodextrinek adatai Magasság [nm] 0,78 0,78 0,78 A kettős-iont tartalmazó állófázisoknál bemutattuk, hogy a szilikagél vagy szervess polimer felületén sokionos anyag immobilizálható, ugyanez elmondható, bármely nem ionos, de poláris csoportra. Ezeket a poláris csoportot tartalmazó állófázisokat, amelyek apoláris karaktere elhanya- hogy golható, mind használhatjuk HILIC állófázisként. Az egyes állófázis típusoknál bemutattuk, több kölcsönhatás szabja meg a visszatartást és ezzel a szelektivitást is. Ezt azért emeljük ki ismét, mert az állófázis előállításáná bekövetkező bármely változás a kolonnáról-kolonnára történő reprodukálhatóságot megváltoztatja. Hosszú távú használat során azokra a kolonnagyártókra kell támaszkodni, akik a sarzsról-sarzsra történő reprodukálhatóságott biztosítanii tudják. Ez különös fontos a HILIC alkalmazásának mai fázisában, amikor kevés adat áll rendelkezésre a kolonna stabilitásról és a reprodukálhatóságról. 39

42 Dr. Fekete Jenő: A folyadékkromatográfia újabb fejlesztési irányai - HILIC 4. Mozgófázisok a HILIC gyakorlatában A HILIC-ban használt mozgófázisoknak is eleget kell tenni azoknak az általános feltételeknek, amelyeket akár a normál, akár a fordított fázisú folyadékkromatográfiában megköveteltünk. Ezeket most felsorolásszerűen adjuk meg. kis viszkozitás nagy tisztaság szilárdanyag mentesség gázmentesség UV detektálásnál kis UV cut-off kis mértékű kipárolgás kis toxicitás gazdaságosság Az általánosan megadott követelmények mellé jön az a HILIC megszabta követelmény, hogy kevésbé kell polárisnak lenni, mint az állófázis felületén kialakult vízrétegnek. A nemzetközi irodalomban ezt úgy adják meg, hogy apolárisabbnak kell lennie, mint az állófázis. Figyelembe véve a vízzel elegyedő, kis viszkozitású oldószereket, amelyeket önmagukban szintén polárisnak tekintünk, javasoljuk a valóságot jobban megközelítő, kevésbé poláris kifejezés használatát. A HILIC módszernél a mozgófázisnak kis mennyiségű vizet minden esetben kell tartalmaznia, mivel általánosan elfogadott, hogy az állófázis felületén kialakult vízréteg és a kevésbé poláris mozgófázis közötti eltérő megoszlás eredményezi a komponensek eltérő vándorlási sebességét. A HILIC a poláris, ionos és könnyen ionizálható vegyületek meghatározási módszere. Minél ionosabb vagy polárisabb a vizsgált molekula, annál kevésbé tartózkodik a kevésbé poláris mozgófázisban. Ha növeljük a mozgófázis víztartalmát, akkor a vegyületek többet tartózkodnak abban, és így a visszatartásuk csökken (4.1.) k=n s /n m [4.1.] ahol: az n s és n m az álló-és a mozgófázisban az anyagmennyiség mólokban kifejezve. Ennek fényében a víz lesz a legerősebb mozgófázis összetevő, mert növelésével a visszatartás csökken. Ehhez a vízhez kell a vízzel elegyedő, lehetőleg kis viszkozitású szerves oldószert adni. Amennyiben a víz mennyiségét jelentősen növeljük, gyakorlatilag a kolonnára adagolt vegyületek csak a mozgófázisban tartózkodnak. Ennek eredménye, hogy a holtidőhöz közeli idővel eluálódnak a kolonnáról. Ez egyben azt is jelenti, hogy csak egy adott értékig csökkenthetjük a víztartalmat. A vegyület szerkezetétől és az állófázis milyenségétől függően ez a víztartalom nem lehet nagyobb, mint %. A HILIC-nál az erősebbik oldószer koncentrációja a mozgófázisban korlátozott tf.% felett a poláris és/vagy ionos vegyületek a holtidőnél eluálódnak. Víztartalom oldaláról nézve a mozgófázis víztartalma 2-40 tf% között változhat. Nézzük, hogy milyen szerves oldószereket használhatunk és hogyan viszonyul a mozgófázis erőssége a vízhez. A vízhez polaritásban a metanol áll a legközelebb. Ezért a poláris és ionos vegyületek kölcsönhatása a víz után ebben a legerősebb. Így az eluenserősségi sorban a víz után a metanol következik. Az etanol is erős H-hidas kölcsönhatást tud a vegyületekkel kialakítani. Sok vegyületnél az eluenserősségi sorrendben a metanolt követi. Problémát okoz, hogy az etanol-víz elegynek nagy a viszkozitása. Az etanol viszkozitása 1,2 cp, 25 C-on. Használata ezért elenyésző. 40

43 Dr. Fekete Jenő: A folyadékkromatográfia újabb fejlesztési irányai HILIC Az eluenserősségi sorban a következő oldószer az acetonitril. Az acetonitril több szempontból is nagyon előnyös mozgófázis összetevő. A 4.1. ábrán adtuk meg azoknak a biner elegyeknek a viszkozitás változását a szerves oldószertartalom függvényében, amelyeket a HILIC gyakorlatában alkalmazunk. A HILIC-nál a 60 tf. % feletti koncentrációra kell koncentrálnunk tf.% között az acetonitril-víz elegy viszkozitása harmada a metol-víz elegyének. Ez két szempontból is előnyös a kis viszkozitás szűkebb kromatográfiás csúcsokat eredményez, másrészt a Darcy törvény értelmében a nyomásesés kisebb (4.2.) φηlu Δ p = [4.2.] 2 d p ahol: Δp d p t M η L nyomásesés a kolonnán átlagos szemcseátmérő holtidő mozgófázis viszkozitása kolonna hossza 4.1. ábra Viszkozitás változás a szerves oldószer-víz összetétel függvényében 41

44 Dr. Fekete Jenő: A folyadékkromatográfia újabb fejlesztési irányai - HILIC ldószer UV cut-off [nm] Refraktív index (20 C) Viszkozitás [cp] Forrpont [ C] Polaritás [P ] Acetonitril 190 1,3441 0,38 81,6 5,8 Dioxán 215 1,4224 1,37 101,3 4,8 Etanol 210 1,3614 1,20 78,0 n.a. 2-Propanol 205 1,3772 2,40 82,3 3,9 Metanol 205 1,3284 0,55 64,7 5,1 Tetrahidrofurán 212 1,4072 0,55 66,0 4,0 Víz 190 1,3330 1,00 100,0 10,2 4.1.táblázat A HILIC-ban alkalmazott mozgófázisok és tulajdonságai Műveleti szempontból ez annyit is jelent, hogy a kis viszkozitás kis áramlási ellenállást jelent (4.3), ezért a térfogatáramlási sebesség növelhető. Kérdés, hogy ez mennyire rontja le a kinetikai hatékonyságot. Δpd φ = ηl 2 ptm 2 [4.3.] A 4.2. ábrán mutatjuk be hogyan befolyásolja a viszkozitás változása a kinetikai hatékonyságot ábra Az elválasztás hatékonyságának függése a mozgófázis viszkozitásától. A 4.2. elvi ábrán látható, hogy a megnövelt térfogatáramlási sebesség, amellyel arányosan nő a mozgófázis lineáris sebessége is, a kis viszkozitású mozgófázisnál csak kis mértékű hatékonyság vesztéssel jár. A 4.2. ábrán a ΔH jelenti a kinetikai hatékonyság veszteséget a legnagyobb hatékonysághoz képest (H min ). Acetonitil-víz elegy használatakor a térfogatáramlási sebességet 3-6 ml/perc értékre lehet növelni, ezzel arányosan az elemzési idő csökken. A jó minőségű acetonitril UV cut-off értéke a 4.1. táblázat szerint 190 nm. Ez azért fontos, mert minél kisebb a detektálási hullámhossz, annál több vegyületet lehet az általánosan elterjedt UV detektorral mérni. Az eluenserősségi sorban a következő oldószer a terahidrofurán (THF). Viszkozitása a metanolvíz és az acetonitri-víz közé esik. A nem stabilizált THF UV cut-off értéke 212 nm. Csak akkor 42

45 Dr. Fekete Jenő: A folyadékkromatográfia újabb fejlesztési irányai HILIC alkalmazhatjuk, ha a vegyületeket e fölötti hullámhosszon tudjuk detektálni. A THF a polimerek nagy részét duzzasztja, így hosszú távú használatkor a PEEK-t is; ha a HILIC kolonnáknak ez a szerkezeti anyaga, akkor használata nem ajánlatos. Az etanol és az izopropanol viszkozitása nagy, tehát sem nyomásesési, sem zónaszélesedési oldalról nézve nem kedvező a használata. Néhány irodalom ajánljaa még az aceton használatát. Az aceton kis viszkozitású ugyan de az UV cut-off-ja 250 nm fölött van. Ezt az UV detektáláskor figyelembe kell venni. Végezetül megadjuk a különböző binér-elegyek H-u görbéit (4.3.ábra.) 4.3. ábra Különböző binér-elegyek H-u görbéi a lineáris áramlási sebesség függvényében. Az acetonitril-víz elegy adja a legkisebb H értékeket, használatakor legnagyobb az elválasztáss hatékonysága. Használata a HILIC-ban ajánlatos. A különböző oldószerek elúciós erőssége a következőképpen változik. szer a víz, ezt követi a metanol, majd az acetonitril végül a tetrahidrofurán. A legerősebb oldó- víz>metanol>acetonitril>tetrahidrofurán. A szelektivitást a HILIC-ban több tényező együttesen szabja meg. Attól függően, hogy milyen állófázist használunk és az hány fajta és erősségű kölcsönhatásra képes a vegyülettel, ez lesz a döntő faktor. Egy adott állófázisnál a szelektivitás általában fordítottan változik az eluenserősséggel. Ennek megfelelően a szelektivitási sorrend: víz<metanol<acetonitril<tetrahidrofurán. 43

46 Dr. Fekete Jenő: A folyadékkromatográfia újabb fejlesztési irányai - HILIC 5. A ph kontroll és a vegyületek szerkezete közti összefüggés A HILIC-nál, ugyanúgy, mint a RP-HPLC módszernél a ph kontrollra több szempontból is szükséges lehet. Az első szempont, hogy a vegyületek molekuláris formája vagy azok aránya az elválasztás körülményei között állandó legyen. Ha ez a feltétel nem teljesül, akkor a másodlagos egyensúlyok miatt a kromatográfiás csúcs kiszélesedik, és a visszatartás is változhat. Ha az állófázis felületén savas vagy bázisos csoportok vannak, azokra is érvényes, hogy a molekuláris formájuk nem változhat, mert az kölcsönhatás változást okoz, ami csúcsszélesedés és visszatartás változást okozhat. A molekuláris formák állandóságának tétele, mind az állófázisra, mind a mozgófázisban feloldott vegyületekre igaz. A ph kontroll szükségességének megítélése előtt a szerves vegyületeket kromatográfiás szempontból csoportokba kell sorolni. Hangsúlyozzuk, hogy a szerves vegyületek osztályba sorolása kizárólag a folyadékkromatográfiás szempontok alapján történik. A HILIC-nál is első eldöntendő kérdés, hogy kell ph kontroll vagy a vegyületek oldaláról nézve ez nem szükséges. Ennek a csoportosításnak a vezérlő elve tehát, hogy a mozgófázis ph-jának változtatásával megváltozik-e a vegyületek molekuláris formája. Mindazon esetekben, amikor ez bekövetkezik, akkor ph kontroll kell, hogy biztosítani tudjuk a molekuláris formák állandóságát és ezzel összhangban a visszatartást és a zónaszélesedést. Ebben a megközelítésben a mozgófázis oldaláról vizsgáljuk, azokat a követelményeket, amelyekkel az elválasztás fő paramétereit állandó értéken tudjuk tartani. Az utóbbi évek kutatásai nyilvánvalóvá tették, hogy a szilikagél alapú állófázisoknál a szilanol csoportok molekuláris formáit is állandó értéken kell tartani, ahhoz, hogy a visszatartás, a zónaszélesedés és a csúcs szimmetria ne változzon. Lehetséges olyan eset is, hogy a vegyület molekuláris állapota ph független, de a szilikagél alapú állófázis megköveteli a ph kontrollt. HILIC szempontból a vegyületek négy csoportra oszthatók: 1. kromatográfiás szempontból semleges vegyületek 2. savas jellegű funkciós csoportot tartalmazó vegyületek 3. bázikus funkciós csoportot tartalmazó vegyületek 4. ionos vegyületek Az 1. osztályba tartoznak azok a nagy polaritású vegyületek, amelyek kis apoláris rész (hidrofób) rész mellett olyan poláris csoportokat tartalmaznak, amelyek a kromatográfiás körülmények között használt ph-n nem változtatják a molekuláris formájukat. Az alkalmazott ph tartományokat az 5.1. táblázatban adtuk meg. Állófázis típus ph tartomány Szilikagél 2-7 Szilikagél alapúak 3-7 (8) Szerves polimer alapúak táblázat Különböző HILIC állófázisok és alkalmazási ph tartománya. Ezeken a ph értékeken belül kell dolgoznunk ahhoz, hogy az állófázis élettartama megfelelő legyen. 44

47 Dr. Fekete Jenő: A folyadékkromatográfia újabb fejlesztési irányai HILIC Ebbe a csoportba tartoznak a poliol vegyületek, például a szaharidok és poliszaharidok. Ezeknél a vegyületeknél nem kell ph kontrollt használni, ha az állófázis vagy a mátrix komponensek nem követelik meg. A savas funkciós csoportot tartalmazó vegyületek a ph-tól függően két molekuláris állapotban lehetnek jelen, s ezeknek a mozgófázisban való oldhatósága eltérő. Ebből következik, hogy ha ph-kontroll nélkül próbálnánk mérni, és a körülmények valami miatt megváltoznak, akkor a molekuláris formák aránya is változni fog, ami pedig a visszatartási tényező definíciójának megfelelően (k=n s /n m, az n s a mólok száma az állófázison és a n m a mólok száma a mozgófázisban) a retenció megváltozását eredményezi. A fentiekből egyértelműen kitűnik, hogy a ph-kontroll célja biztosítani a mozgófázisban a molekuláris formák arányának állandóságát, illetve, hogy kizárólag az egyik vagy másik forma legyen jelen. HILIC-nál a nagyobb polritású vegyületek visszatartása a nagyobb. A savas csoportot tartalmazó vegyületeknél fontos a ph kontroll, azért is, hogy a minimális visszatartást elérjük (k>1). Az 5.1. ábrán adtuk meg a savas csoportot tartalmazó vegyületekre az ionizáltsági diagramot. Ha vegyület ionizációja (disszociációja) elhanyagolható, akkor az ionizáltsági fok 0, ha az ion visszaszorított forma arány elhanygolható, akkor I=1, ha pka= ph, akkor I=0,5. A pka értékhez képesti 2 ph egységgel való eltolás annyit jelent, hogy a molekuláris formák aránya 100/1, ami az egyik molekuláris forma dominanciáját jelenti. ionizáltság I 1 I = 1 ionizált sav 0, nem disszociált sav I = ábra Ionizáltság változása a ph függvényében savas csoportot tartalmazó vegyületeknél A ph-ionizáltsági fok savas vegyületek esetében, a) ion visszaszorított forma, b) teljesen ionizált, c) mind két forma jelen van a mozgófázisban Az ábrán három tartományt különböztethetünk meg: 1. A ph=pk a 2 értéknél savasabb tartományban a vegyület ion visszaszorított formában van jelen, ezt a formát a szakirodalom semleges formának is nevezi. Pontosabb, ha a savas csoportot tartalmazó vegyület semleges formájáról beszélünk. A vegyületek apoláris jellege nagy mértékben megnő. Az esetek többségében a HILIC körülmények között a holtidő körül eluálódnak. Ezt a tarományt el kell kerülni a hatékony elválasztás érdekében. pk a ph 45

48 Dr. Fekete Jenő: A folyadékkromatográfia újabb fejlesztési irányai - HILIC 2. A ph=pk a +2 értéknél lúgosabb tartományban a molekula ionos formában van.a savas csoportot tartalmazó vegyületeknél ez jelenti legpolárisabb molekuláris formát és a legnagyobb visszatartást. Efölött a ph érték felett a ph megváltozása nem jár a vegyület visszatartásának változásával.stabil, robusztus a rendszer, HILIC szempontjából ez jelenti a jó működést, ha a szilikagél alapú állófázisok megengedik ennek a ph-nak a használatát.. 3. A ph= pk a ±2 tartományban a molekula mindkét formája jelen van, a visszatartás (retenció) attól függ, hogy milyen a két forma aránya. Itt több kölcsönhatás típus játszik szerepet az elválasztásban, s mivel ez zónaszélesítő hatású, a csúcs általában széles. Emellett a módszer nem robosztus, hiszen kis ph változás esetén a két molekulaforma arányának megváltozása miatt jelentős retencióváltozás következhet be. A megfelelő ph és a puffer kiválasztásához a vegyületek pka értékét ismerni kell. Ezt vagy a szakirodalomból keressük ki, vagy megmérjük, vagy intelligens programok segítségével a vegyületek szerkezeti képletéből előre jelezzük (prediktáljuk). A továbbiakban egy kereskedelmi forgalomban lévő program csomagra hivatkozunk, amellyel ezek az értékek meghatározhatók. A program kombinálja a lgp és pka értékeket, hogy előre jelezze, hogyan változik meg a szerves vegyület megoszlása az oktanol és a víz közöt (5.2. ábra). Ezt a modult lgd-nek nevezik. A lgk érték szoros korrelációt mutat a lgd értékkel a ph függvényében. lgd ionvisszaszorított forma pk a ionos forma ph 5.2. ábra A lgd-ph összefüggés a Pallas intelligens szoftverrel előre jelezve. A lgd-t nevezhetjük a lgp ph függő formájának. A lgp vagy lgk ow az n-oktanol és víz közötti megoszlást adja meg. HILIC-nál víz és egy kevésbé poláris mozgófázis közti megoszlás van. Az n- oktanol-víz és a HILIC-nhál tapasztalt fázisviszonyok inverzei egymásnak. Minél nagyobb a lgp, annál kisebb a vegyületek visszatartása a HILIC-ban. Saját tapasztalat, hogy általában, ha lgp<-1, akkor kapunk a nagy szerves oldószer tartalmú mozgófázisoknál megfelelő visszatartást (k>1). A szakirodalomban, az erre témára vonatkozó, kevés számú közleményben ez az érték -0,5. Az elválasztások tervezésénél a lgp helyett a lgd használata előnyösebb, a későbbiekben ezt fogjuk használni. A lgd megadja, hogy adott ionerősség és puffer koncentráció mellett hogyan függ az adott vegyület megoszlása az apoláris oktanol és a poláris víz között. Tekintettel arra, hogy a HILIC és az oktanol-víz hasonló megoszlási rendszert jelent, de inverzei egymásnak, ezt figyelembe véve, használhatjuk a Collender-típusú megközelítést: lgk=-algd+b [5.1] ahol: a és b rendszer állandók 46

49 Dr. Fekete Jenő: A folyadékkromatográfia újabb fejlesztési irányai HILIC Ez egyben annyit jelent, hogy a vízre vonatkozó lgd értékek megfelelő korrekcióval átvihetők a HILIC elválasztásra. Ezt a korrekciót tartalmazza a a és b együttható. A 3. csoportba vagy osztályba sorolt vegyületek azok, amelyek bázisos csoportot tartalmaznak. Az ionizációs viszonyokat az 5.2. ábrán adtuk meg. ionizáltság 1 protonált bázis I 0, pk a szabad bázis 5.3. ábra Ionizáltság változása a ph függvényében bázikus csoportot tartalmazó vegyületeknél ph. A ph=pk a 2 értéknél savasabb tartományban a molekula ionos formában van jelen (a.), ez jelenti a poláris molekuláris formát, amely a mozgófázisban kevésbé jól oldódik, ennek megfelelően visszatartása a szabad bázishoz képest nagy mértékű. A kölcsönhatási lehetőségek száma kicsi, nincs több egyensúly egymás mellett, ezért kis zónaszélesség és szimmetrikus csúcs várható. A ph=pk a +2 értéknél lúgosabb tartományban ion visszaszorított formában (szabad bázis). Ez jelenti az apolárisabb molekuláris formát, amely kölcsönhatása az állófázissal kisebb, mint a protonált formáé. A nagy szerves oldószer tartalmú mozgófázisoknál a bázisos csoportot tartalmazó vegyület a holtidő körül eluálódik. A ph= pk a ±2 tartományban (c. tartomány) a molekula mindkét formája jelen van, több egyensúly lehetséges, ennek megfelelően széles csúcs és egyes esetekben aszimmetria várható. A szilikagél alapú állófázisoknál ebben a ph tartományban a szilanol csoportok egy része is ionizált molekuláris formában van. A negatív töltésű szilanol anion erős kölcsönhatásba lép a pozitív töltésű, protonált bázikus csoporttal. Az ioncserére alkalmas helyek száma korlátozott, ezért ezeken a helyeken hamar túltelítés következik be, amely eredménye széles aszimmetrikus kromatográfiás csúcs.. A lgd-ph és a lgk-ph között ugyanaz a Collendar-típusú összefüggés érvényes (5.4. ábra), amelyet a savas csoportot tartalmazó vegyületeknél már bemutattunk (5.2. ábra). Az 5.4. ábrán bemutatott ph-lgd görbe a Pallas intelligens programmal előre jelezhető. A lgd adatok korrekciókkal felhasználhatók az elválasztás tervezésére. 47

50 Dr. Fekete Jenő: A folyadékkromatográfia újabb fejlesztési irányai - HILIC lgd ionvisszaszorított forma pk a ionos forma 5.4. ábra lgd-ph összefüggés bázikus csoportot tartalmazó vegyületeknél. ph Ma az alkalmazott mérési módszerekkel szemben alapvető követelmény, hogy robosztus legyen a módszer. Ebből következik, hogy amennyiben ez lehetséges, mind a savas, mind pedig a bázikus funkciós csoportot tartalmazó vegyületek esetében az ionizált formának megfelelő ph-t kell beállítani. A 4. csoportba sorolt vegyületek a HILIC állófázisok által megengedett ph tartományban nem változik meg a molekuláris formájuk. Ha ph kontroll kell, akkor az az állófázis miatt szükséges Puffer választás a HILIC ban A HILIC-ban is a puffereknek eleget kell tenni az általános követelményeknek. Ezek közül a legfontosabb, hogy a nagy szerves oldószer tartalmú mozgófázisból ne váljanak ki. Idegen kifejezéssel kompatibiliseknek kell lenniük a mozgófázissal. Mielőtt ezt a részt tovább tárgyalnánk, nézzük meg, hogy a folyadékkromatográfiás gyakorlatban mit nevezünk puffereknek. A pufferoldatok ph-ja jól definiált, sav illetve bázis hozzáadásakor kevéssé változik. A pufferoldatok gyenge savból (vagy bázisból) és a gyenge sav (bázis) erős bázissal (savval) alkotott sójából álló rendszerek. Folyadékkromatográfiás gyakorlatban alkalmazunk olyan anyagokat is, amelyek a fenti definíciónak nem felelnek meg viszont ph változás tompító hatásúak. Ha a ph tompító hatást tesszük meg a puffer definiciónak, akkor ezek az anyagok is a puffer kategóriába kerülnek. A ph változást tompító oldatok egyik fő jellemzőjük a pufferkapacitás. A pufferkapacitás (ß) a pufferoldatok tompítóhatását jellemzi, definíciószerűen valamely erős bázisnak (b) vagy erős savnak (a) az a mennyisége [mol/dm 3 ], amely a pufferoldat ph-ját egy-egységgel változtatja meg: β HA = 2, 3 c c sav sav c + c ahol: β HA puffer-kapacitás C sav puffer gyenge sav komponense alkalmazott gyenge sav bázissal képzett sója C só só só [5.1.1] Mielőtt a ph tompító hatású anyagokkal (pufferek) szemben támasztott általános követelményeket vizsgálnánk, néhány, a kiválasztásuknál fontos gyakorlati szempontot vizsgálunk meg. 48

51 Dr. Fekete Jenő: A folyadékkromatográfia újabb fejlesztési irányai HILIC Először is puffer használata savas vagy bázikus csoportot tartalmazó vegyületeknél szükséges. Az ionos vegyületek bevitele a mozgófázisba az esetek többségében csökkenti az állófázis stabilitását. a puffer tartalmú mozgófázisnak szilárd anyagtól mentesnek kell lennie. Mindig szűrni kell a puffer oldatot, HPLC-nél kb. 0,5μm-es,az UPLC-nél 0,22 μm-es pórusátmérőjű membránszűrővel. A következő kritérium a detektálással függ össze. A puffer komponenseknek is van fényelnyelése, amennyiben ez túl nagy az adott hullámhosszon, akkor lehetetlenné teszi a mérést. A fény áteresztést a tiszta puffer komponensekre adjuk meg, a gyakorlatban 0,2 mol/l feletti koncentrációban nem használjuk azokat, így a megadott értékeknél kisebb hullámhosszon is mérhetünk. Alap kritérium puffer fényelnyelésével kapcsolatban, hogy a puffer tartalmú mozgófázis UV cut-off hullámhossza kisebb legyen, mint a mérésnél alkalmazott hullámhossz. puffer tisztasági követelménye. Kromatográfiás minőségű, tiszta puffer még nem kapható, így mindig az elérhető legtisztább anyagot kell alkalmazni. Nem megfelelően tiszta puffert tartalmazó mozgófázis in-situ módosíthatja az állófázis felületét, illetve gradiens elúciónál szellemcsúcsokat eredményezhet. A HILIC alkalmazásánál kritikus a puffer kompatibilitása a mozgófázissal. A nagy acetonitril és metanol tartalmú mozgófázisoknál a szerves alapú pufferek használata ajánlatos. Ezeknél is figyelembe kell venni az oldhatóságot, sok esetben 25 mmol/dm 3 feletti pufferkoncentrációk esetén megnő a szilárd anyag kiválás veszélye. A használható legnagyobb puffer koncentrációt a mozgófázis szerves oldószer tartalma szabja meg. Figyelembe véve, hogy ennél a módszernél 70 tf.% feletti szerves oldószer tartalmat használunk, minél jobban közelítünk a vízmentes mozgófázishoz, annál kisebb a megengedett puffer koncentráció. Kivételként említjük meg, hogy tf.% szerves oldószer tartalomnál az irodalomban 200 mmol/dm 3 koncentrációt is alkalmaztak. A nagy szerves oldószer tartalom miatt a puffer típus megválasztása kritikus. A szervetlen pufferek, így a foszfát pufferek a nagy szerves oldószer tartalmú mozgófázisokban nem oldódnak. Más szavakkal inkompatibilisek a mozgófázissal. A pufferek közül csak a szerves komponens tartalmúak jöhetnek szóba, ezek ammónium-acetát/ecetsav ammónium-formát/ hangyasav ammónium-citrátok/citomsavak tris/tris HCl trietilamin-foszfát A HILIC módszernél a legtöbbet használt oldószer az acetonitril. A fenti pufferek oldhatósága is korlátozott ebben sz oldószerben. Az eddigi gyakorlat szerint 25 mmol/l feletti alkalmazásukkor a só kiválás veszélye megnő. A vegyületek többsége, amelyeket ebben a kategóriában találunk nem tartalmaz UV-fényt elnyelő csoportot. Detektálásukhoz vagy tömegspektrométert, vagy ELSD vagy koronakisülésen alapuló aeroszol detektort kell használni, ekkor az ammónium-só formában lévő vegyületek használhatók pufferként, mert nagyobb hőmérsékleten elpárologtathatók (illékony pufferek). Tompító hatású anyagokként, azaz a folyadékkromatográfiás gyakorlatban pufferként használatosak a következő anyagok: hangyasav ecetsav trifluorecetsav 49

52 Dr. Fekete Jenő: A folyadékkromatográfia újabb fejlesztési irányai - HILIC A HILIC-ban az egyik leggyakrabban alkalmazott tompító hatású anyag (puffer) az ammónium- tarto- acetát. Az ammónium-acetát két ph tartományban használható (5.1. ábra). A 3,5-5,5 közti mányban és 8,5-10,5 köztiben. Ahogy az ábrából látható, hogy 3,5 ph alatt, az 5,5-8,,5 között kicsi a pufferkapacitása. Az ábrán bemutatott adatok vizes közegre vonatkoznak ábra A pufferkapacitás ph és koncentrációfüggése ammónium-acetát puffer alkalmazásakor A HILIC-ban nagy szerves oldószertartalomnál dolgozunk. Ez a tompítóhatású anyagoknál (puffereknél) a pka érték eltolódását eredményezi. Az ábrán ezt az eltolódást adtuk meg ábra Az ammónium-acetát pk a értékének változása a metanolban a vízhez viszonyítva Az ábrából jól látható, hogy a változás mértéke már olyan nagy, hogy sok esetben nem férünk be a pk a értékénekk eltolódásával korrigált ±1-es tartományba. A maximális puffer- 1-3 kapacitás a puffer komponensének pka±1 környezetében van. A vízben mért pk a értéket egységgel korrigálnii kell. Elméletileg még meg nem oldott kérdés, hogy a HILIC-nál a határfelületi vízrétegben hogyan alakulnak a ph viszonyok. Feltehetőleg ebben a vizes rétegben az ionos anyagok, így a tompítóhatású anyagok (pufferek) feldúsulnak. Ennek eredményeképp a puffer- anyagok (pufferek) kiválasztásánál. kapacitásuk nő. Ebben az esetben a vízre vonatkozó pka értékekett használhatjuk a tompítóhatású 50

53 Dr. Fekete Jenő: A folyadékkromatográfia újabb fejlesztési irányai HILIC A puffer készítése és a ph mérés mikéntje a HILIC módszerek reprodukálásánál és adaptálásánál is alapvető. Továbbiakban ezt tárgyaljuk. Elsőnek a puffer készítés lehetséges módjait vizsgáljuk. Savas vagy bázikus csoportot tartalmazó vegyületeknél elérkeztünk az egyik központi kérdéshez: milyen ph értéken dolgozzunk. Vagy meddig kell csökkenteni a ph értéket ahhoz, hogy az protonált formáját kapjuk meg a bázisoknak. Vagy a savas csoportot tartalmazó vegyületeknél meddig növelhetjük a ph-t, hogy a savaniont kapjuk meg anélkül, hogy a kolonnát tönkretennénk. A szervesvizes rendszerekben a hidrogén-ion aktivitást több tényező együttesen szabja meg, a ph, mint fogalom egy műveleti paraméter, amely mérésének megvannak az egyértelmű szabályai. A protonálódást, a deprotonálódást, és a kolonna tönkremenetelt viszont az oldatok hidrogén-ion aktivitása szabja meg. Megállapíthatjuk, hogyha csak a puffer ph-ját mérjük, akkor a nem vizes oldatban a hidrogén-ion aktivitás nem adható meg. Így a vizes pufferoldatokra megadott kolonna stabilitás értéke nem számolható ki csak a puffer ph ismeretében. A mozgófázisban mért, de vízre kalibrált ph mérésnél már a hidrogén-ion aktivitások a megadottak alapján számolhatók, amennyiben az elektródoknál a diffúziós potenciál elhanyagolható. A ph skála értelmezésénél mindig a használt mozgófázis összetételéből, és az azt alkotó szerves oldószerből kell kiindulnunk. A ph skálát a mozgófázist alkotó oldószerelegy nagy mennyiségű alkotója határozza meg. Viszonyítási alapnak a vizet vesszük: 25 ºC-on a víz önprotonálódási állandójának negatív logaritmusa 14. Azaz a ph skálát 0 és 14 között értelmezzük, metanolnál ez az érték 16,77 a ph skála ennek megfelelően 0 és 16,77 között értelmezendő, acetonitril-víz esetén a pk a érték 34,40, tetrahidrofurán-víznél 34,70. A pufferek kiválasztásánál és a vegyületek ionizáltsági állapotának megítélésénél a pka központi szerepet tölt be. A vízre kimért pk a értékek különösen a nagy szerves oldószer tartalomnál változnak meg jelentősen. Sajnálatos módon az irodalomban még nem jelentek meg adatok arról, hogy a vízre megadott 1-8 ph közötti stabilitás hogyan vihető át a szerves oldószer tartalmú mozgófázisban mért ph stabilitásra. Spekulatív módon azonban következtethetünk ezekre az adatokra. Például 70 tf.% acetonitril víz elegynél a ph skála kitolódása 3,14, így a fordított fázisú s töltet felső ph ( s ph ) határa 11 körül van. Ismételten fel kell hívni a figyelmet, hogy ez nem az alkalmazott puffer ph-ja! Mindezekből látszik, hogy a viszonylag egyszerű ph megadási és mérési módszer adja a használható kolonna ph tartományáról a legkevesebb információt. A kolonna gyártók megadják a felső alkalmazási ph értéket. Nem adják meg viszont, hogy vizes vagy a szervesvizes közegre vonatkozik-e. A HILIC gyakorlatában használt nagy szerves oldószer tartalomnál a hidrogén-ion aktivitás és a vizes közegben mért ph értékek között jelentős eltérés van. Ezért, ha a megadott felső használati ph értéknél dolgozunk, kérdéses a kolonna élettartama! Gyakorlati szempontból is elérkeztünk egy lényeges szemponthoz; hogyan lehetséges úgy puffer oldatokat készítenünk, hogy azok reprodukálhatóak legyenek. Ez a kérdés ismételten visszavezethető arra, hogy az oldatban mért hidrogén-ion aktivitás még vizes oldatban sem törvényszerűen egyezik meg a mért ph értékkel, továbbá az ion koncentráció is befolyásolja. Következmény, hogy az eltérően készített és a ph mérő által azonos értéket adó oldatok hidrogén-ion aktivitása eltérő, és a módszer reprodukálásánál eltérő eredményt kapunk. Ezek után nézzük meg, hogy hányféleképpen készíthetjük el a puffert. 1. Az ajánlott módszer, hogy az elsődleges és/vagy másodlagos pufferekből tömeg szerint összemérjük az oldatokat, és a nemzetközileg elfogadott értéket használjuk. Ez egyértelmű, mindenhol reprodukálható. Amennyiben táblázatban az adott összetételt és a hozzá tartozó ph értéket nem találjuk meg, akkor a tiszta komponensekből törzsoldatot készítünk, ezek ph-ja adott és a megadott arányokban összemérjük, és mérjük a ph értéket. A tömegmérés az egyik legpontosabb analitikai mérésünk. 2. Az analitikai-kémiai számításoknál megismert közelítő képlet alapján számítást végzünk: ph=pk a +log C só /C sav 51

54 Dr. Fekete Jenő: A folyadékkromatográfia újabb fejlesztési irányai - HILIC a képlet alapján kiszámoljuk, hogy 0,01 mól/l savhoz mennyi bázist kell adni, hogy 4-es legyen a ph értéke. Készítsünk ecetsav-ammóniumacetát puffert. pk a =4,76, ekkor bemérünk 0,01 mol ecetsavat egy 1000 ml-es normállombikba, majd a számítás alapján hozzáadunk 0,015 mol ammónium-hidroxidot, és 1 l-re egészítjük ki. A ph csak körülbelül lesz 4-es értékű, mert a bázisnál nem vettük figyelembe az aktivitásfüggést ( lásd Debey-Hückel elmélet vagy Bates-Guenheim közelítés). A hidrogén-ion aktivitás függ a disszociációs állandótól, az egyéb ionoktól, és a mozgó fázisban mért valódi hidrogénion aktivitás, az önprotonálódási állandótól módszer: bemérjük az ecetsavat és ammónium-hidroxiddal-dal 4-es ph értékig titráljuk. Ismételten a hidrogén-ion aktivitás meghatározatlansága okoz bizonytalanságot a retenció reprodukálásában módszer: a fenti műveletet a mozgófázisban hajtjuk végre. A mozgófázishoz hozzámérjük az ecetsavat, és NH 4 H oldattal titrálva állítjuk be a ph értéket. Ekkor a vízre vonatkoztatott értékhez képest megkapjuk a vízre kalibrált, de a mozgó fázisban mért ph értéket, amely eltér a vízre vonatkoztatottól és a szerves oldószerre vonatkoztatottól is. A puffer készítésnél, tehát az első módszer ajánlott, módszer átvételnél viszont ellenőrizni kell, hogy hogyan készítették. Mivel a HILIC használatakor is a helyes ph megválasztásának döntő szerepe van, továbbá a módszereket csak azonos ph mérési megoldás mellett lehet reprodukálni bemutatjuk a módszereket és rámutatunk azok különbségeire A ph mérés lehetőségei és gyakorlata a folyadékkromatográfiában A pufferek ph-ját az elsődleges és/vagy másodlagos pufferekhez viszonyítva egyértelműen, és reprodukálhatóan lehet mérni. Kérdéses viszont, hogy mit értünk a mozgófázis ph-ján és hogyan mérjük. Három lehetőség kínálkozik: 1. Mérjük a puffer ph-t és ehhez adjuk a szerves oldószert 2. Kalibráljuk az üvegelektródot az elsődleges és/vagy másodlagos pufferekre, és utána a kész mozgófázisban mérjük a ph-t 3. A kalibrációnál az elsődleges és/vagy másodlagos puffereket a mozgófázisba mérjük be, és a mérést is a mozgófázisban végezzük el. Az első esetben a ph alsó és felső indexében is w kell, hogy szerepeljen, a második esetben, az alsó indexben w, a felsőben s, a harmadik esetben mind az alsó, mind a felső indexben s -nek kell szerepelni. A három mérési módszer három eltérő eredményt (számot) ad. Kérdés, hogy milyen folyadékkromatográfiás szempontból lehet érdekes a valódi hidrogén-ion aktivitás. Az első lényeges kérdés, hogy a gyártó cégek által megadott ph tartomány a fordított fázisú töltetekre milyen módon mért értékre értendő. A másik lényeges kérdés kapcsolódik a proton funkciós vegyületek elválasztásához (a savas vagy bázikus csoportot tartalmazókra). Az ilyen típusú elválasztásoknál a ph alapvető paraméter, mert a vegyületek pk a értékéhez képest kell beállítani. Ahhoz, hogy a hidrogénion aktivitás hatását megértsük, vissza kell mennünk az ionaktivitás általános elméletéhez, nevezetesen a Debey-Hückel közelitéshez és a Bates-Guggenheim konvencióhoz. Az előbbi a termodinamikailag nem mérhető egyedi hidrogén-ion aktivitás becslését teszi lehetővé, az utóbbi ezt kiterjeszti más oldószerekre is. Az összefüggés a követező: logγ H 0 1/2 A I = 1+ a B I 1/2 [5.2.1.] ahol γ H az egyedi hidrogén-ion aktivitás, I az ionerősség, A és B konstansok, amelyek az oldószertől és a hőmérséklettől függenek, az a o a szolvatált ionméret. 52

55 Dr. Fekete Jenő: A folyadékkromatográfia újabb fejlesztési irányai HILIC Az eredeti Bates-Guggenheim konvenció szerint az oldószer víz, és a standard állapotot is erre vonatkoztatjuk, úgyhogy a hidrogén-ion koncentrációt végtelen kicsinek vesszük, akkor az a o B értéke 1,5. Ha a fenti adatokat átvisszük más oldószerekre is, akkor az előbbi megközelítés szerint az alábbi összefüggést kapjuk. s ( a s 0 w ερ 1/2 B) = 1,5[ ] s w [5.2.2.] ε ρ ahol a felső index s az adott oldószert, míg w a vizet jelenti, ε az adott oldószer és víz permittivitását, a ρ pedig a sűrűséget. Amennyiben a ph-t értelmezni akarjuk a fordított fázisú mozgófázisoknál, akkor a standard állapot nem lehet más, mint az adott oldószer, és ebben a hidrogén-ion koncentrációt végtelen kicsinek vesszük. Ez egy újabb hidrogén-ion skálát jelent. A vízre vonatkozó ph skálát szokás abszolút ph skálának nevezni. A két ph skála megkülönböztetésére a IUPAC (Robinson és Stoke alapján), amennyiben a ph-t az abszolút értékhez akarjuk hasonlítani, vagy kifejezni vele, akkor a ph alsó indexében w szerepel, és a felső indexben s. Ha az adott közeg (oldószer) a viszonyítási alap, akkor az alsó és a felső indexben is s szerepel: s w s s 0 ph = ph log( γ ) [5.2.3.] s w H amennyiben a vízre definiáljuk a standard állapotot, akkor a két skála megegyezik. Ezeket a meggondolásokat kell alkalmaznunk az összes sav-bázis egyensúlyra is, ahol a ph-nak szerepe van. Ennek megfelelően a savi disszociációs állandó negatív logaritmusára is (pk a ): s w pk a s s 0 = pk log( γ ) [5.2.4.] s a w H Ebben az összefüggésben a hidrogénion standard állapotát vizes közegre adjuk meg, ha a koncentrációja tart a nullához; másképpen fogalmazva, ha végtelen híg oldatról van szó, akkor értéke tart a nullához. Nem szabad elfelednünk, hogy értéke függ az oldatban található egyéb ionoktól is. Folyadékkromatográfiás körülmények között viszont a viszonyítási alap az adott mozgófázis. Ez okozza a hidrogénion aktivitása közti eltérést! Ha a három módszerrel ugyanazt az értéket olvassuk le a ph mérőről, tudnunk kell, hogy az három nagyon eltérő hidrogén-ion aktivitást jelent. Ha vegyületek oldaláról nézzük az ionos és a nem ionos molekuláris formák aránya nagy mértékben változik. Ez pedig a visszatartás változásával jár a HILIC-ban. Reprodukálni csak akkor lehet egy módszert, ha ph mérés ugyanazon módszerrel történik, mint, amelyet a módszer kidolgozásánál alkalmaztak. 53

56 Dr. Fekete Jenő: A folyadékkromatográfia újabb fejlesztési irányai - HILIC 6. A visszatartástt megszabó tényezők és törvényszerű- ségek a HILIC-ban A folyadékkromatográfiás gyakorlatban, ahol a vegyületek többféle molekuláris formában lehetnek jelen a mozgófázisban, biztosítani kell, hogy az elválasztás során az arányuk állandó legyen. Így van ez a HILIC-nál is. A módszer kidolgozásnál, vagy az átvett módszer megítélésénél első feladat, annak eldöntése, hogy kell-e alkalmaznunk ph kontrollt. Ennek megítéléséhez ismernünk kell a vegyületek pka értékeit. Azt kell mondanunk, hogy a pka ismerete nélkül nem lehet a módszer- fejlesztésnek nekikezdeni. Ezt az anyagi állandót vagy valaki már megmérte és közzé tette az irodaléteznek lomban, vagy nekünk kell különböző módszerek alkalmazásával megmérni, vagy ma már olyan szakértői programok, amelyekkel a vegyületszerkezetek alapján előre tudjuk jelezni (prediktálni) azokat. A pka ismeretében és az állófázis ph tűrését figyelembe véve dönthetünk arról, hogy kell-e ph kontroll. Szilikagél vagy szilikagél alapú HILIC állófázisokat 2-8 vagy 3-7-es ph tartományban használhatjuk. Savas csoportott tartalmazó vegyületeknél a pka-2 ph értékekk alatt a vegyületek disszociációja elhanyagolható. Ha az állófázis felső használati ph-a 8, akkor azok a savas csoportot tartalmazó vegyületek, melyek pka értéke 10, az ilyen közegben már ion visszaszorított formában vannak. Ezeknél a savas csoportot tartalmazó vegyületeknél nem kell ph kontroll. Ha az állófázis felső használati ph-közegben már ion visszaszorított formában vannak. Bázisos csoportot tartalmazó vegyü- 7, akkor azok a savass csoportot tartalmazó vegyületek, melyek pka értéke 9, az ilyen leteknél, ugyanezt a metódust követve csak most az állófázisok alsó ph tűrési határait kell figye- dolgozunk, az ionizációs viszonyok úgy változnak meg, hogy savak pka értékei a vízhez képest lembe vennünk, ez az érék 0 vagy 1. A HILIC nál, ahol nagy szerves oldószer tartalmú közegekben nőnek, a bázisos csoportot tartalmazóké viszont csökkenek. A vízre vonatkozó értékek tehát nagy biztonságot nyújtanak a ph kontroll megítélésére. Ezt mutatjuk be a 6.1. és ábrákon ábra Savas csoportott tartalmazó vegyületek elválasztásaa savas pufferrel. Az 1. görbe a vizes közegben adja meg a vizsgálandó vegyületre a molekuláris formák arányát, a 3. nagy szervess oldószer artamú közegben. A 2. és 4. görbék a puffer ionizációs viszonyait adják meg vízben és nagy szerves oldószer tartamú közegben. A 6.1. ábrán az I=0,5 ionizáltsági állapot jelenti a pka értéket. Egyértelműen látható, hogy a vegyület pka értéke is, és például a HILIC-ban sokat használt ammónium-actát/ecetsav pka értéke is a nagyobbb ph értékekk felé tolódott el. Ez abból a szempontból is fontos, mert fellép a kompenzációs effektus és az azonos eltolódás miatt megmarad a rendszer pufferkapacitása, mert benne maradunk a pufferre megadottt pka±1 tartományban. Az elválasztás tervezésénél a vízre vonatkozó adatokkal számolhatunk. Ennek feltétele, hogy savass csoportot tartalmazó vegyületeknél savat artalmazó tompító hatású (puffert) anyagot használjunk. 54

57 Dr. Fekete Jenő: A folyadékkromatográfia újabb fejlesztési irányai HILIC Bázisos csoportot artalmazó vegyületeknél (6.2. ábra) is hasonló viszonyokat kapunk, ha puffer bázist artalmaz. A pka értékek eltolódása, csökkenése azonos irányba mutat, és ismét fellép a kompenzációs effektus s spk HA = a w sw pk + HA b s A jelöléseknél az s jelenti a nagy szerves oldószer tartalmú mozgófázist, w a vizet. [6.1.] 6.2. ábra A puffer bázikus összetevőjének és a szerves vegyület bázisos csoportjának pk a érték eltolódása a mozgófázis szerves oldószer tartalmának változtatásával. Jelölések: 1. puffer vizes közegben, 2. bázikus csoportot tartalmazó vegyület vízben, 3. puffer 60 v/v% szerves oldószerben, 4. bázikus csoportot tartalmazó vegyület 60 v/v% szerves oldószerben A HILIC gyakorlatában kevés a bázisos csoportot tartalmazó puffer. Sok esetben a formiát vagy acetát puffereket kell használnunk. Ebben az esetben a bázisos csoport pka értéke a kisebb ph felé tolódik el, míg a puffer pka ja a nagyobbak felé (6.3.ábra). A két ellentétes irányú válto- megfe- zás azt eredményezi, hogy a kicsúszunk, abból a ph tartományból, ahol a pufferkapacitás lelő. Ilyenkor empirikus megközelítést használunk ábra A szaggatott vonallal jelölt görbék a vízre megadott ionizációs viszonyokat tartalmazzák, a folytonos a szerves vegyületek hozzáadása után kialakultakat. A jobb oldalon a savas puffer (formiát vagy acetát) változása, míg a baloldalon a bázisos vegyületé látható. 55

58 Dr. Fekete Jenő: A folyadékkromatográfia újabb fejlesztési irányai - HILIC A 6.1. összefüggést felhasználva, a puffer vízben mért pka értékét ismerjük, akkor úgy kell a puffer ph-t vízre számítani, hogy az 1-2 egységgel kisebb legyen, mint bázisos csoport vízre számított pka értéke. Ebben az esetben a maximális pufferkapacitást biztosító ph tartományban maradunk. A molekuláris formák ismerete a HILIC elválasztásnál alapvető. Ennek oka nagyon egyszerű, mert csak nagy polaritású anyagok elválasztása oldható meg ezzel a módszerrel. Az ionogén vegyületek (savas vagy bázisos csoportot vagy csoportokat tartalmazók) molekuláris formái a ph függvénye. Az ionos forma nagy polaritású, míg az ion-visszaszorított forma sokkal apolárisabb. Az ionos forma ilyenkor HILIC-val, míg az ion visszaszorított forma a RP-HPLC módszerrel határozható meg. Bázisos csoportot tartalmazó vegyületek vízoldhatósága nagyban növelhető, ha olyan mozgófázis ph-án dolgozunk, ahol protonált formában fordulnak elő. A 6.6. ábrán a dextrometorfán, diphenydramin és a pszeudóefedrin lgd-ph görbéjét adtuk meg. A 6.5. ábrán megadott lgd-ph görbék alapján megállapítható, hogy a ph, mint retenciót és szelektivitást befolyásoló paraméternek alapvető szerepe van a HILIC módszer alkalmazásánál is. Ez előre vetíti, hogy a HILIC alkalmas nagyobb molekulatömegű és ionizálható csoportot tartalmazó anyagok elválasztására is, ha mérési körülmények között a vegyület ionos molekuláris formába hozható. Az ionos molekuláris formában a szerves vegyületek oldhatósága nagyságrendekkel megnő a vízben az ion visszaszorítotthoz képest (semleges molekuláris forma). Ezt mutatjuk be olyan vegyületeknél, melyek nagyobb molekulatömegűek, és apoláris hidrofób részt is tartalmaznak (6.4 ábra) ábra. Nagyobb molekulatömegű anyagok, amelyek jelentős apoláris (hidrofób) részt tartalmaznak, ezek is jól oldhatók ionos molekuláris állapotban. Ezeknek a vegyületeknek az elválasztása többféleképpen megoldható. A 6.5. ábrán látható lgd-ph függvények alapján a vegyületek nagy ph értéken viszonylag apoláris jellegűek. Ez jellemzi a vegyületek szabad bázis formáját vagy az ion visszaszorított molekuláris formát. A RP-HPLC módszer alkalmazható, ha a lgd vagy lgp értéke nullánál nagyobb. Nagy ph értékeken ez a megadott vegyületekre igaz, mert mindhárom vegyületre 2-es értékű körül van a lgd. Ezzel teljesül, hogy az RP-HPLC módszerrel a vegyületek meghatározhatók. A következő kérdés, hogy vajon megfelelően nagy-e a lgd k közötti különbség, hogy a vegyületeket el tudjuk választani. Ehhez a két legközelebb eső lgd-t kell megnéznünk (kritikus pár), ha ezek között a különbség (ΔlgD) nagyobb, mint 0,1-0,2 akkor nagy valószínűséggel elválaszthatók A 6.5. ábrából megállapítható, hogy a kritikus párra lgd értékek között nagyobb a különbség, mint 0,1, ezért ezek a vegyületek egy jól borított utószilanizált C-18-as tölteten elválaszthatók nagy ph értéken. A megadott vegyületek lgd értéki több nagyságrenddel csökkennek (lásd 6.5. ábra) kis ph értékeken, ezzel az ionos molekuláris formában a vegyületek a víz oldhatósága jelentősen megnő. Ezzel párhuzamosan sószerű vegyületek szerves oldószerekben való oldhatósága jelentősen csökken. HILIC módszer alkalmazásakor, ha 56

59 Dr. Fekete Jenő: A folyadékkromatográfia újabb fejlesztési irányai HILIC ezeket a vegyületeket kolonnára adagoljuk, akkor a koncentrációjuk a poláris állófázis felületén kialakult vízrétegben nagyobb, mint a mozgófázis oldószerében. Ezzel teljesül az a feltétel, hogy legkevésbé poláris vegyületre is nagyobb lesz a visszatartás, mint 1. A HILIC módszernél többféle állófázist is használhatunk az elválasztásukra. Nézzük meg, ha egy szilikagél alapú diol fázist alkalmazunk, akkor milyen fő kölcsönhatások szabják meg a visszatartást. Vizsgálatunk most az állófázis hatásra terjed ki. Ennél az állófázisnál a poláris jellege miatt kialakul az víz réteg, amelybe az ionos molekuláris formában lévő komponensek kedvezményezetten beoldódnak. Ezt nevezzük HILIC hatásnak. A szilikagél alapú diol-fázisnál a propil-csoportok apolárisak, ezért a molekulák apoláris része és az állófázis közötti apoláris (hidrofób) kölcsönhatás elkerülhetetlen. Feltételezzük, hogy a két kölcsönhatás egymástól függetlenül lép fel ekkor a visszatartás a két hatás összege lesz: k=k hilic +k hidrofób [6.2.] ahol: k hilic és a k hidrofób a két kölcsönhatás megszabta visszatartási rész 6.5. ábra A dextrometorfán, diphenydramin és a pszeudóefedrin megoszlása az apoláris n-oktán és a víz között. A ph<5 mozgófázisban mind három vegyület egyetlen molekuláris formában található. A protonált forma vízoldhatósága nagy. A 6.5. ábrán a dextrometorfán, diphenydramin és a pszeudóefedrin megoszlását adtuk meg az apoláris n-oktán és a víz között. A HILIC módszernél alkalmazott nagy szerves oldószer tartalomnál a pka érték attól függően lesz nagyobb vagy kisebb, hogy milyen típusú puffert alkalmazunk. Az irodalmi példában egy keverék puffert használtak, amely ammónium-acetátot, trietilamint tartalmazott és a ph-t foszforsavval állították be 5,2-re. A vegyületek retenciós sorrendje megegyezett a n-oktanol-vízben mérttel, elsőként a pszeudóefedrin, másodikként a diphenydramin végül a dextrometorfán eluálódott. Az alklamazott kolonna egy Silica A típusú Supelcosil kolonna volt. Ez a kolonna típus nagyobb mennyiségű fémiont tartalmaz, amely növeli a szilanolcsoportok savasságát. 5,2-es ph értéknél a szilanolcsoportok egy része ionizált formában van. A vegyületek pka értéke 9 felett van, így gyakorlatilag ionos formában vannak jelen a mozgófázisban. A protonált amin csoport és a negatív töltésű ionizált szilanolcsoportok között ioncserés kölcsönhatás alakul ki. A visszatartás mértéke az ionizált szilanolcsoportoktól függ, ez viszont a szilikagél fémion tartalmától. Ez egyben jelzés arra nézve is, hogy csak az azonos állapotú, gyakorlati szempontból azonos fémion tartalmú kolonna az, amely azonos visszatartást és szelektivitást ad. Az ioncserét a mozgófázis ionkoncentrációja nagyban befolyásolja, tehát ilyen esetekben nemcsak a ph-t, de puffer koncentrációt is azonos értéken kell tartani. Mivel mindhárom vegyület gyakorlatilag ionizált formában van és egy hidrogéniont vesz fel (egy pozitív töltés), ezért az ionkölcsönhatás az állófázissal közel azonos, a vegyületek apoláris része (hidrofób rész) eltérő ezért a szerves oldószerekben az oldhatósága megnő. 57

60 Dr. Fekete Jenő: A folyadékkromatográfia újabb fejlesztési irányai - HILIC A fenti, irodalomból vett példával azt kívántuk bizonyítani, hogy a lgd-ph függvény ismerete is alapvető, hogy megítéljük, hogy egy-egyy vegyületcsoport HILIC módszerrel meghatározható-e. Továbbá, hogy milyen ph értékeken lesz stabil a rendszer. A lgp vagy ionogén anyagoknál a lgd-ph függvény ismerete lehetővé teszi a retenciós sorrend és elválasztás nehézségének megítélését is. A két adatsor ismerete fontos, mert a nagy vízoldhatóság alapvető a HILIC alkalmazásakor. A nagy vízoldhatóságú anyagok sok funkciós csoportot tartal- muta- maznak és a vegyületek apoláris váza elhanyagolható.. Néhány konkrét példát a 6.6. ábrán tunk be ábra glicin (G), diglicin (DG), triglicin (TG), N-(1-deoxi-D-glükóz-1-il)-glicin (GG), N-(1-deoxi-D-glükóz-1-il) )-di-glicin ( GDG), N-(1-deoxi-D-glükóz-1-il)-tri-glicin (GTG) A 6.4. ábrán glicin és abból levezethető származékok láthatók. A vegyületek lgp értéke minden esetben -1-nél kisebb, ami mutatja a jó vízoldhatóságukat. A vízoldhatóság tovább növelhető, ha méréskor alkalmazott puffer ph-ján az aminocsoport protonálódik vagy a savas csoport ionizálódik. A glicin sorozat lgp értékeit a táblázatban adtuk meg. A retenciós sorrend követi a lgp értékeket. A legkisebb visszatartása a glicinnek (lg=-2,75) volt, míg a legnagyobb N-(deoxy-D-glukóz-1-il)- diglicinnek (lgp=-3,93). Vegyület neve: G DG GG TG GDG GTG lgp -2,75-2,95-3,22-3,33-3,44-3, táblázat A glicin sorozat lgp értékei Ahogy előzőleg hangsúlyoztuk a vízoldhatóság tovább növelhető, ha méréskor alkalmazott puffer ph-ján az aminocsoport protonálódik vagy a savas csoport ionizálódik. A ph függvényében a megadott vegyületek ionizációs viszonyait a 6.5. ábrán adtuk meg. A lgd csökkenésével a visszafunkciós tartás nőni fog. Ezzel a ph is egy döntő paraméter lesz, amennyiben a vegyület proton csoportot tartalmaz. 58

61 Dr. Fekete Jenő: A folyadékkromatográfia újabb fejlesztési irányai HILIC A fordított fázisú folyadékkromatográfiás módszernél a lgp-t és az lgd-t közvetlen függvénykapcsolatba hoztuk a lgk val. Megtehetjük ezt a HILIC-nél is. Az RP-HPLC módszernél alkalmazott lgp-lgk összefüggés ekkor a következőképp módosul: lgk=-algp+b [6.3.] Ismételten felhívjuk a figyelmet arra, hogy ezt a közelítést csak a nagy szerves oldószer tartalmú mozgófázisoknál lehet használni, ahol teljesül a k>1 feltétel ábra A nagy polaritású, proton funkciós vegyületek megoszlása n-oktanol-víz között. A lgd-ph diagram segíti a ph optimálást is. Ismételten hangsúlyozzuk, hogy ezek az adatok vízre vonatkoznak. Felhasználva 6.3. összefüggést és annak analógiájára: lgk=-algd+b [6.4.] és a már bemutatott 5.7 összefüggést: s w pk a = s s pk a log( s w és ennek alapján a 6.1.-ben megadottat: s s HA w sw HA γ s 0 H pk = a pk + b, ) Ezek alapján a bázisos csoportot tartalmazó vegyületeknél 1-2 egységgel kisebbre vesszük a vízre megadott értékeket. A transzformált értékek segítenek a kritikus ph elkerüléeésre is. Kritikusnak nevezzük, azokat a ph-kat, ahol a két vegyület lgd értéke megegyezik, mert ott a visszatartásuk is nagy valószínűséggel azonos. A lgd értékek különbsége segít annak megítélésében, hogy mely vegyületek lesznek a kritikus párok. Minél kisebb a lgd-ben a különbség, annál nagyobb a valószínűsége, hogy a két vegyület retenciós ideje közel esik. Ez a megközelítés az elválasztást a mozgófázis oldaláról nézi. Az állófázis szerepe a folyadékkromatográfiás elválasztásban döntő. A mozgófázisban meglévő kis különbségeket nagyban felerősítheti az állófázis-komponens kölcsönhatás. Ez különösen igaz a HILIC módszernél, ahol egyszerre több kölcsönhatás szabja meg a visszatartást. A mozgófázisbeli ioizációs viszonyok segítenek abban, hogy kevesebb számú lépéssel oldjunk meg egy-egy feladatot. Nézzük meg azt a vegyületsort, amelyeket a 6.8. ábrán adtunk meg. 59

62 Dr. Fekete Jenő: A folyadékkromatográfia újabb fejlesztési irányai - HILIC 6.8.ábra HILIC-val meghatározott vegyületek szerkezeti képlete. A vegyületek között kromatográfiásan semleges, savas- és bázisos csoportot tartalmazók is vannak. A 6.8. ábrán megadott vegyületek kromatográfiás szempontból nagyon eltérő tulajdonságúak. Az általunk alkalmazott folyadékkromatográfiás beosztás szerint találunk köztük folyadékkromato- gráfiásan semleges vegyületeket, például acetamid, formamid, savas csoportot tartalmazó vegyü- hogy milyen ph-n kezdjük az elválasztásokat, és hogyan folytassuk a kísérleteket, ha több vegyület leteket, oxálsav, oxamiksav és bázisos csoportot tartalmazókat, 1-aminó-benzpirén. Anélkül, hogy ismernénk a felsorolt vegyületek lgd-ph viselkedését nehez lenne eldönteni, együtt eluálódik. A 6.9. ábrán adtuk meg azt, hogy a ph függvényében hogyan változnak meg az n-oktanol-víz közötti megoszlások. A lgd közötti különbségek értékeléséve látjuk, hogy mely vegyületpárok lesznek kritikusak. A sok metszéspont egyben jelzi, hogy egyik ph értékről áttérve a másikra hogyan változhatnak meg a kritikus vegyületpárok. Mindezek figyelembevételével az elválasztás tervezése a mérnöki elvárásoknak megfelelően történhet, amely jelentősen csökkenti a módszer kidolgozásra fordított időt ábra A 6.8. ábrán megadott vegyületek és az aminó-benzpiridint tartalmazó vegyületek ionizációs viszonyait megadó lgd-ph függvény. 60

63 Dr. Fekete Jenő: A folyadékkromatográfia újabb fejlesztési irányai HILIC 7. Szerves oldószer tartalom hatása a visszatartásra Az 5. és 6. fejezetben részletesen tárgyaltuk a ph szerepét a HILIC módszerrel meghatározható vegyületek elválasztásánál. Az ionogén anyagoknak olyan molekuláris formába kell lenniük, hogy oldhatóságuk a mozgófázisban a legkisebb legyen. Továbbá, a kromatográfiásan semleges (nem ionogén) vegyületeknél a lgp értékeknek - 0,5 vagy -1 alatt kell lenniük, hogy a minimális visszatartás értékét (k>1) biztosítani tudjuk. Ha a megadott minimális visszatartás értékét (k>1) biztosítani tudjuk, akkor a következő lépés, hogy a szerves oldószer tartalmat változtatva a legrövidebb idő alatt a legnagyobb elválasztást elérjük. A lehetséges oldószerek, amelyeket a HILIC gyakorlatában használhatunk, azok a következők: víz>metanol>acetonitril>tetrahidrofurán. A sorrend az elúciós erősségi sorrendet adja meg. Minél nagyobb a víztartalom, annál nagyobb az elúciós erősség és annál kisebb a vegyületek visszatartása. Megfordítva a tételt, ahogy csökken a mozgófázisok víztartalma, úgy csökken a mozgófázis poláris jellege; ezzel a poláris, ionogén és ionos vegyületek oldhatósága is csökken a mozgófázisban, és ezzel együtt nő a visszatartásuk. A legkisebb elúciós erősségű a legkevésbé poláris tetrahidrofurán (THF) lesz, a legerősebb a víz, a víznél kisebb elúciós erősséget mutat a metanol (MeH), ennél is kisebbet az acetonitril (ACN). Ennek egyszerű a magyarázata, a megadott sorrendben növekednek a nagy polaritású anyagok és a szerves vagy szervetlen ionok oldhatósága, így k=n s /n m [7.1.] ahol k a visszatartási tényező (retenciós faktor), n s az állófázisban a kolonnára adagolt mólok száma, az n m ugyanez a mozgófázisban. Első közelítésben, amennyiben növekszik a vegyületek oldhatósága mozgófázisban az a 7.1. kifejezés szerint visszatartás csökkenést eredményez. A megoszlási hányados oldaláról közelítve a visszatartást: K=C s / C m [7.2.] ahol K megoszlási hányados, a C s és a C m az álló és a mozgófázisban a kolonnára adagolt minta koncentrációja. Amennyiben az előzőekben megadott sorrend szerint változtatjuk az oldószereket, akkor a THF-től a vízig nő a nagy polaritású anyagok és a szerves és szervetlen ionok koncentrációja a mozgófázisban (n m ). Végül: t r = t m (1+n s /n m ) [7.3.] ahol t m a holtidő. A retenciós idő csökkenését jól mutatja a 7.3. kifejezés. Az eluenserősségi sorrend megfordulása még egy nagyon jelentős változást eredményez a fordított fázisú folyadékkromatográfiás (RP-HPLC, RPLC) módszerhez képest. A fordított fázisú folyadékkromatográfiás (RP-HPLC, RPLC) módszernél növelve a mozgófázis szerves oldószer tartalmát a visszatartás a 7.4. egyenlet szerint csökken: lgk=a-bϕ [7.4.] ahol ϕ a szerves oldószer koncentrációja a mozgófázisban, A állandó, B az egyenes meredeksége a 7.1. ábrán 61

64 Dr. Fekete Jenő: A folyadékkromatográfia újabb fejlesztési irányai - HILIC 7.1. ábra A visszatartási tényező változása a szerves oldószer koncentrációjának függvényében a fordított fázisú folyadékkromatográfiás (RP-HPLC, RPLC) módszernél. A nagy polaritású vegyületeknél, ahol poláris állófázist alkalmazunk, akkor a visszatartás változása ellentétes lesz. A különböző nagy polaritású vegyületeknél ez a változás, általában tf.% szerves oldószer tartalom fölött, szintén linearizálható (7.5): lgk= A +B ϕ [7.5.] A 7.5. kifejezésben a B iránytangense pozitív lesz (7.2. ábra) ábra A visszatartási tényező változása a szerves oldószer koncentrációjának függvényében, ha nagy polaritású anyagokat szerves vagy szervetlen ionokat határozunk meg poláris állófázison. Mivel a 7.2. ábrán bemutatott változás ellentétes a fordított fázisú folyadékkromatográfiás (RP-HPLC, RPLC) módszerhez képest és az állófázis oldaláról nézve a visszatartás valamilyen poláris kölcsönhatás eredményeképp jön létre, ezt a módszert Hidrophil Interaction Chromatography vagy ma köztudatban csak, mint HILIC terjedt el. A kromatográfiás módszer névadásában a poláris kölcsönhatás megjelölése egyértelmű, a folyadékkromatográfia megjelölése, viszont magyarázatot igényel. A megnevezés takarja az összes folyadékfázisú elválasztást. A HILIC-nál az elválasztáss mechanizmusára utal, ahol a fő retenciót megszabó folyamatot visszavezetik a folyadék-folyadék megoszlásra. Általánosan elfogadott, hogy a poláris állófázis felületén a víz kedvezményezetten szorbeálódik. Ebbe a szorpcióss rétegbe oldódnak be a komponensek és ekkor egy folyadék-folyadék megoszlás jön létre a két fázis között. Ezt adtuk meg a 7.3. ábrán. 62

65 Dr. Fekete Jenő: A folyadékkromatográfia újabb fejlesztési irányai HILIC 7.3. ábra A visszatartás egyik lehetséges változata a HILIC folyadékkromatográfiás módszernél. A komponens megoszlik a szorbeált vízréteg és a mozgófázis között. A másik megközelítést a normálfázisú folyadékkromatográfia (NP-HPLC) oldaláról tehetjük. Az állófázisok, amelyekben a HILIC módszernél használunk, polárisak. Az NP-HPLC-nél és a visszatartást megszabó tényezőket figyelembee véve, a NP-HPLC-ben csökken a retenció, ha a poláris modifikátor koncentrációját növeljük az alkalmazott oldószerelegyben. HILIC-nál is, ha a víztartalmat növeljük és a HILIC módszernél azonos jellegű állófázist alkalmazunk. Mozgófázis oldaláról, a mozgófázisban, csökken a visszatartás. AN-H 2 vagy MeH-H 2 elegyben a víz jelenti a polárisabb oldószert. A fent leírtak alapján vontak analógiát a HILIC és az NP-HPLC között. Elnevezték vizes fázisú normálfázisú folyadékkromatográfiának. Ma ennek csak történelmi jelentősége van, mert a HILIC elnevezés az elterjedt. A HILIC olyan folyadékkromatográfiás módszer, ahol poláris állófázist és vizet (pufferelt) és azzal elegyedő szerves oldószereket használunk mozgófázisként. Jelentős visszatartást csak a nagy szerves oldószer tartalmú mozgófázisoknál kapunk, ahol a poláris anyagok oldhatóságaa jelentős mértékben csökken. A szerves vegyületek oldhatóság csökkenése a nagy szerves oldószer tartalomnál válik jelentőssé (7.4. ábra) 7.4. ábra A visszatartás változása a mozgófázis szerves oldószer tartalmának változtatásával. A vegyületek poláris jellegével a visszatartás nő. Polaritási sorrend: 3>2>1. A 7.4. ábrán látható, hogy jelentős változás tf.% felett várható. Minél nagyobb a vegyületek polaritása, annál kisebb koncentrációban kell alkalmazni a szervess oldószert. A szerves oldószerben a vegyületek oldhatóságot az oktanol-víz megoszlásból becsülhetjük, ahogy ezt az elválasztási példákon már bemutattuk. Amennyiben a megoszlási hányadost a HILIC-nél a mozgófázis és az állófázis felületén kialakult víz közti megoszlás szabja meg, akkor a retenciós sorrend ellentétes lesz a lgp értékekkel. Amennyiben a retenciós sorrend ettől eltér, akkor más kölcsönhatások is szerepet játszanak a visszatartásban. 63

66 Dr. Fekete Jenő: A folyadékkromatográfia újabb fejlesztési irányai - HILIC Amennyiben kihasználjuk az analógiát a normálfázisú folyadékkromtográfiával, akkor az elválasztások tervezésénél felhasználhatjuk a 7.6.összefüggést lgk= A-Slgϕ [7.6.] ahol: A mozgófázis víztartalma, ahol nincs visszatartás, S az egységnyi víz koncentrációra jutó visszatartás változás, ϕ a mozgófázis víztartalma. Grafikusan ábrázolva a 7.6. kifejezést a 7.5. ábrát kapjuk ábra A visszatartás változása a mozgófázis víztartalmának függvényében a HILIC módszer alkalmazásakor. Minél nagyobb a vízoldhatósága a vegyületnek, annál kisebbb az egyenes meredeksége. 64

67 Dr. Fekete Jenő: A folyadékkromatográfia újabb fejlesztési irányai HILIC 8. Grádienselúció a HILIC-ban A kromatográfiás elválasztás tervezésekor, a ph kontroll eldöntése után, annak megítélése, hogy az adott feladatot izokratikusan (állandó mozgófázis összetétel) megoldható-e vagy grádienselúciót kell alkalmazni. Egy elválasztás akkor oldható meg izokratikusan, ha a legkevésbé visszatartott komponensre k>1 és legnagyobb retenciójura teljesül, hogy a k<10. Ennél a megítélésnél a kritikus pár a két szélső retenciójú komponens. HILIC-nál, tehát legkevésbé poláris és a legpolárisabb komponenst kell szemügyre vennünk. Ha ezek között túl nagy a polaritás különbség, akkor izokratikusan egy lépésben a feladat, a megadott feltételek mellett, nem oldható meg. Mielőtt a grádienselúció részletes tárgyalásába belemennénk, hangsúlyozzuk, hogy maga a fogalom egy gyűjtőfogalom. Általános értelemben minden olyan esetben grádienselúcióról beszélünk, mikor a kromatográfiás rendszerben úgy változtatjuk meg a paramétereket, hogy a vegyületek retenciója csökken. Ha például HILIC-ban a mozgófázis víztartalmát növeljük, akkor annak az elúciós erőssége nő és ezért a vegyületek retenciója csökken. A retenció csökkenését az oldószer összetételének megváltoztatásával értük el, ezért oldószergrádiensről beszélünk. A kettősionokat tartalmazó (zwitterionos) állófázisoknál az ionogén anyag retenciója csökkenthető a pufferkoncentráció növelésével, ez a sógrádiens. Az elválasztásnál növelhetjük a hőmérsékletet, ami növeli a mozgófázis felé a komponensek megoszlását, ekkor hőmérsékletgrádiensről beszélünk. Vagy ionogén anyagoknál a ph változtatásával lehet csökkenteni a visszatartást, ekkor ph grádiensről beszélünk. A gyakorlati életben az oldószergrádienst használjuk az esetek döntő többségében, ezért a továbbiakban ezzel foglalkozunk részletesen. Az oldószergrádiensnél mindig az elválasztás szempontjából erősebb oldószer koncentrációját kell növelni az időben. A HILIC-nál ez a víz, amelynek a koncentrációját növelni kell, s ekkor csökken a retenció. A szerves oldószer víztartalmát megszabja az, hogy 40 tf.% felett az összes poláris komponens a holtidő körül eluálódik. Ez adja a felső határát a mozgófázis víztartalmának növelésében. A HILIC elválasztásnál alapvető, hogy a határfelületi fázisban vízréteg alakuljon ki, ehhez értelemszerűen a mozgófázisnak vizet kell tartalmaznia. A gádineselúció nem indítható szerves oldószerből, mint a leggyengébbik oldószertől, hanem 2-4 tf% vizet kell tartalmaznia. Nézzük meg, hogy hogyan dönthető el, hogy mikor kell grádienselúciót alkalmaznunk. Ennek egyik eldöntési lehetősége az általános grádienselúció alkalmazása. Az általános grádienselúció a fordított fázisú folyadékkromatográfiában vált ismerté. Ez annyit jelent, hogy az adott elválasztási módszernél a grádienselúciót az alkalmazgató leggyengébb mozgófázis összetételtől indítjuk és azt a legerősebbig folytatjuk. A kapott kromatogram alapján döntünk arról, hogy a feladat izokratikusan megoldható-e vagy grádienselúciót kell használni. Az általános elvet vetítsük ki a HILIC gyakorlatára és elsőnek a hagyományos HPLC-nál adjuk meg, hogyan hajtható végre az általános grádienselúció Általános grádienselúció a HILIC-ban A 8. fejezetben megadottak szerint elsőnek a két mozgófázis összetételt kell kiválasztanunk. A gyengébbik oldószert a továbbiakban A -val a legerősebbet B -vel jelöljük. A mozgófázis összetétel határ, amelyben mozoghatunk: A 97/3 tf.% acetonitril/víz B 60/40 tf.% acetonitril/víz 65

68 Dr. Fekete Jenő: A folyadékkromatográfia újabb fejlesztési irányai - HILIC A hagyományos HPLC rendszernél a 2,5 μm-nél nagyobb szemcseátmérőjű töltettel megtöltött kolonnákat használhatjuk. A kolonnák minimális hosszúsága függvénye a szemcseátmérőnek, általában a 3 μm-es vagy ennél kisebb szemcseátmérőjűeknél a maximális hossz 15 cm, a nagyobb szemcseátmérővel töltötteknél 10 cm. Ahhoz, hogy a kolonnán kívüli zónaszélesítő hatások ne haladják meg a 10 %-ot, a kolonnaátmérő 3mm vagy ennél nagyobb. Ekkor lesz a folyadékkromatográfiás rendszer kolonnán kívüli zónaszélesítő hatása 10 %-nál kisebb. Ahhoz, hogy az elválasztás sebessége megfelelő legyen 0,5 vagy 1 ml/min térfogatáramlási sebesség használata ajánlatos. Mivel minden folyadékkromatográfiás rendszernek van késletetési ideje, ezt a grádiensprofil beállítássánál figyelembe kell vennünk. Erről a fejezet további részében foglal-kozunk részletesen. Ezzel a késleltetési idővel kell növelnünk a grádiensidőt a B oldószernél, ahhoz a kolonna végén valóban az általunk beállított oldószer legyen a mérési ciklus végén. A következő lépés a grádiensprofil kiválasztása. A készülékek különböző grádiensprofil alkalmazását teszik lehetővé ugyan, de a gyakorlatban a lineáris profil használata elterjedt, mert ennek elméleti háttere ismert valamilyen mélységben. A HILIC-nál használjunk lineáris grádiensprofilt az általános grádienselúció végrehajtásakor. A lineáris grádiens arra is jó, hogy az izokratikus módszer használatakor a körülményeket (mozgófázis összetételt) előrejelezzük. Nézzük meg, hogy a HILIC módszernél, hogyan alkalmazhatjuk a fordított fázisú folyadékkromatográfiában jól bevált lineáris grádienst. Az angol elnevezése ennek a módszernek linear solvent strength gradient elution (LLS). A 6. és 7. fejezetben tárgyaltuk a HILIC-ban az oldószerek szerepét az elválasztásban. Megállapítást nyert, hogy a RP-HPLC-ban használt összefüggések a mozgófázis erősségi sorrend figyelembe vételével használhatók a HILIC gyakorlatában is. Ahhoz, hogy az olvasónak a kereszthivatkozásokhoz ne kelljen visszalapozni és az általános grádiens, mint módszer könnyen érthetővé váljon a módszer kiválasztása szempontjából, a fő megállapításokat megismételjük. Kezdjük a mozgófázis (eluenserősséggel) erősséggel. A RP-HPLC módszernél az oldószererősségi sorrend: H 2 <MeH<AN<EtH<IPrH<THF A HILIC-nál megtartva a fenti oldószer sorrendet, csak a relációs jelet kell megfordítanunk: H 2 >MeH>AN>EtH>IPrH>THF Azt, hogy hogyan befolyásolják a különböző oldószerek a visszatartást, mindig arra az oldószerre adjuk meg, amely csökkenti a visszatartást, tehát a nagyobb oldószererőségűre. Ezt a konvenciót használva, a RP-HPLC módszernél: lgk=a-bφ [8.1.1.] ahol az A és B állandók, amely az alkalmazott kolonnától és a vizsgált vegyületektől függ, a φ a szerves oldószer térfogat százaléka a mozgófázisban. Megjegyezzük, hogy a B-t sok közleményben S -sel jelölik, és oldószererősségi paraméternek nevezik. Sajnos az RP-HPLC-ban ennek értéke nemcsak a szerves oldószer minőségétől, hanem az alkalmazott állófázis borítottságától is függ. Ez az egyszerű összefüggés 10 tf.% szerves oldószer tartalomtól 90 tf.% szerves oldószer tartalomig, az esetek többségében jól írja le az oldószererősség hatását a visszatartásra a RP-HPLC módszernél. A HILIC-nál a legerősebb oldószer a víz lesz, és mivel a mozgófázisnak minden esetben kell vizet tartalmaznia, az összefüggéseket a víztartalomra kell vonatkoztatni. Továbbá, ahogy többször már hangsúlyoztuk, hogy egy adott víz koncentráció felett az összes komponens a holtidő körül fog eluálódni. Ez szűkíti az alkalmazható víztartalmát a mozgófázisnak. 40 tf% víz koncentráció alatt a komponensek visszatartása exponenciális függvény szerint változik a víztartalommal. Formailag ugyanazok az összefüggések használhatók, mind a RP-HPLC módszernél, csak a φ most a mozgófázis víztartalmát jelenti. Ennek alapján a 3tf.% víztartalomtól a 40 tf.% víztartalomig felírható, hogy lgk=a-bφ víz [8.1.2.] 66

69 Dr. Fekete Jenő: A folyadékkromatográfia újabb fejlesztési irányai HILIC Mind a RP-HPLC-nál, mind a HILIC-nál formailag ugyanazok az összefüggések használhatók a mozgófázis erősség és a visszatartás közti összefüggés leírására. Ez az alapja, hogy a fordított fázisú kromatográfiában a lineáris grádienselúcióra jól kidolgozott összefüggéseket használjuk a HILIC-nál is. Ezeket az összefüggéseket az elmélet iránt érdeklődők számára a könyv mellékletekében adjuk meg. Most a gyakorlati szempontból tárgyaljuk, hogy milyen következtetéseket tudunk a lineáris grádienelúció használatakor kapott kromatogramokból. A ábrán három különböző lehetőséget mutatunk be. A ábrán az elválasztások megítélésénél alapvető három paramétert is megadtunk. Az első holtidő (t m ), a második a kétszeres holtidő, amikor a visszatartási faktor (retenciós faktor) értéke 1 és a harmadik a tizenegyszeres holtidő, amikor a visszatartási faktor (retenciós faktor) értéke 10. Ez a három faktor, mint sarokkövek lehetővé teszik, hogy döntéseket hozzunk a HILIC módszer használatáról ábra Az általános grádienselúció alkalmazása a HILIC-nál a módszerfejlesztés segítésére. Az A ábrán a legkevésbé poláris komponensek visszatartása kisebb, mint egy, az állófázis nem megfelelő, B ábra: erősebb A mozgófázissal kell indítani a grádienst, vagy gyorsabban növelni a B koncentrációját, C ábra: optimált grádiens. A A ábrán megadottt kromatogramnál az 1., a 2. és a harmadik komponens k< 1 vissza- a tartási tényezőnél (retenciós faktornál) eluálódnak. A grádienselúciós módszer használatakor kromatográfiás csúcsok keskenyebbek (zónadiszperziójuk kisebb), mint az izokratikusnál, de véges szélességűek. A közeli tulajdonságú vegyületeknél, amelyek ebben a visszatartási tartományban eluálódnak, nagy lesz az együttt eluálódás (interferencia ) veszélye. Ez annyit jelent, hogy az adott körülmények közöttt a HILIC nem alkalmazható. Kérdés az, hogy egyértelműen kijelenhetjük-e, hogy ebben az esetben a HILIC-t az adott vegyületcsoportra nem alkalmazhatjuk, mert egyik alapvető feltételünk, hogy k>1 nem teljesült. A válasz az, hogy nem! Minden folyadékkromatográfiás, például az RP-HPLC-ban az állófázis felületi tulajdonságának alapvető szerepe van. Ezért kelll a módszerfejlesztést az állófázis kiválasztásával kezdeni. Ez az elv még inkább igaz a HILIC-nál. A 3. fejezetben bemutattuk, hogy nagyon eltérő felületi tulajdonságú állófázisok használhatók a HILIC-nál. Elméleti megalapozottságaa a HILIC-nak a határfelületen kialakult vízréteg, mind elsődleges poláris kölcsönhatási hely adja, ezt viszont jelentősen módosítják az állófázis nyújtotta egyéb kölcsönhatási lehetőségek. Ezeket, mivel a fő hatás mellett befolyásolják a visszatartást sok esetben csak,mint másodlagos kölcsönhatásoknak nevezzük. Az elnevezés nem 67

70 Dr. Fekete Jenő: A folyadékkromatográfia újabb fejlesztési irányai - HILIC teljesen fedi ezeknek a kölcsönhatásoknakk a szerepét a visszatartásban. Az ionos vegyületeknél sok esetben ezek a másodlagos kölcsönhatások adják a visszatartás döntő részét. k= =k HILIC +k másod dlagos [8.1.3] A A ábrán megadott helyzetnél, támaszkodva a vegyületek szerkezetére, ki kell válasz- Ez tanunk azt az állófázis típust, amelyet használva a k> >1 feltétel nagy valószínűséggel teljesül. egyben bizonyíték is arra, hogy a HILIC-nél is, akár izokratikus elválasztást, akár grádienselúcióst használunk, első lépés a módszerfejlesztésnél a vegyületek szerkezetének ismeretében a kompatibilis állófázis kiválasztása. A kompatibilitás első feltételee ugyanis, a sokat említett k>1 feltétel a legkevésbé visszatartott komponensre. HILIC-nál ez a legkevésbé poláris vegyületet jelenti. A B ábrán a legkevésbé visszatartott komponens visszatartása sokkal nagyobb, mint a minimálisként megadott k>1. Ekkor két lehetséges megoldás közül választhatunk, vagy növeljük az A oldószer víztartalmát, erősebb mozgófázisról indítjuk a grádienst, vagy a grádiens sebességét növeljük. Ami annyit jelent, hogy egységnyi idő alattt nagyobb mértékben változtatjuk a víztar- komponens visszatartása nagyobb, mint 1, a legnagyobbé viszont kisebb, mint tíz. Természetesen ez nem jelenti az optimált elválasztási körülményeket, hanem azt, hogy benne vagyunk az ú.n. talmú B mozgófázist. A C ábrán a HILIC-ban optimált elválasztást adtuk meg. A legkevésbé visszatartott kromatográfiás céltáblában. A kromatográfiás céltábla nem más, minthogy az összes komponens visszatartása beleesik 1<k<10 értékbe. Az általános grádienselúció a HILIC-náalapján az is eldönthető, hogy kell-e grádienselúciót használnunk. A ábrán az izokratikus módszerre megadott módon számolva a k értékét és az a legjobban visszatartott komponensre kisebb, mint 2-3, akkor grádienselúció nem szükséges. Az elválasztás megoldható izokratikus módszerrel is. fontos információkat ad, hogy hogyan folytassuk az elválasztást. Az eredmények k= =(t R -t m )/t m [8.1.4.] ahol a t R és a t m jelenti a bruttó retenciós időt és a holtidőt ábra Az általános grádienselúcióval végrehajtott elválasztásnál a legkevésbé visszatartott komponens k -ja nagyobb, mint 1, a legjobban visszatartotté kisebb, mint 2, ekkor nagy valószínűséggel az elválasztás izokratikus módon megoldható. 68

71 Dr. Fekete Jenő: A folyadékkromatográfia újabb fejlesztési irányai HILIC Általánosan elmondható, hogyha a kromatogramm bármely részén a legkevésbé visszatartott és a legjobban visszatartott komponens visszatartása között a különbség kisebb, mint 2-3 egység (Δk<2-3), akkor a vegyületek elválasztására elegendő az izokratikus elválasztás. A ábrán ilyen helyzetet adtunk meg. Ezen a kromatogramon látható, hogy a legjobban visszatartott komponens és a legkevésbé visszatartott komponens közötti különbség kisebb, mint ábra Általános grádienselúció alkalmazása annak eldöntésére, hogy adott mintánál izokratikus vagy grádienselúciót kell-e használni. Mivel a legjobban visszatartott komponens és a legkevésbéé vissza- Kérdés, hogy vajon ebből az általános grádienselúciós mérésből megadható-e az izokratikus módszernél alkalmazandó mozgófázis összetétel. A válaszhoz meg kell vizsgálnunk, hogy a különböző vegyületek visszatartása hogyan függ a mozgófázis összetételtől. Itt jön elő az oldószergrádiens előnye, amikor lineárisan változtatjuk a B komponenst a mozgófázisban. A lineáris oldószergrádiens és az izokratikus elválasztás közti analógiát Snyder és munkatársai kimutatták. Az izokratikus körülmények közöttt végrehajtott elválasztások törvényszerűségei jobban feltártak, mint a grádiens- elúcióé, ezért a további eszmefuttatásokban ezeket használjuk fel. Az elválasztások tervezésénél osztályokba soroltuk a vegyületeket HILIC elválasztáss szempontjai szerint. Az azonos osztályba tartozó vegyületek a kromatográfiás körülmények változtatására hasonlóan reagálnak. Ezeket az tartott közötti visszatartás különbség kisebb, mint 2-3, ekkor izokratikus módszer alkalmazható. irodalom hasonló, vagy kromatográfiásan rokon vegyületeknek nevezi. Ez számunkra azért fontos, mert a víztartalom függvényében a retencióváltozásuk hasonló jellegű, ez egyben azt is jelenti, ha megváltoztatjuk az induló ( A ) oldószer összetételét, akkor nincs retenciós sorrendváltozás. Ezt a helyzetet a ábrán mutatjuk be ábra A kromatográfiásan egy osztályba sorolt vegyületek visszatartás változás a víztartalom függvényében. A vegyületek visszatartásának csökkenése hasonló, ezért az egyenesek nem metszik egymást, nincs reteciós sorrendváltozás. 69

72 Dr. Fekete Jenő: A folyadékkromatográfia újabb fejlesztési irányai - HILIC A HILIC-nál is általános elvként használhatjuk fel, hogy a kromatográfiásan egy osztályba sorolt vegyületek visszatartás változása a víztartalom függvényében. hasonló, ezért az egyenesek nem metszik egymást, nincs retenciós sorrend változás. Ez annyit jelent, hogy az általános grádienselúciónál kapott sorrend megegyezik majd az izokratikus elválasztásnál. A másik lehetőség, hogy a minta különböző kromatográfiás osztályba sorolt vegyületeket tartalamaz. Ezek a vegyületek csakúgy, mint a RP-HPLC módszernél eltérően reagálnak a víztartalom megváltoztatására. Ezt mutatjuk be a ábrán ábra Folyadékkromatográfiásan eltérő módon viselkedő komponensek, kromatográfiásan nem rokon vegyületek, az izokratikus módszerre történő módszer átvitelnél, attól függően, hogy milyen mozgófázis összetételt használunk, retenciós sorrend változást kapunk. A ábrán bemutatott vegyületek eltérő módon reagálnak a víztartalom változtatására. Ez annyit jelent, hogy folyadékkromatográfiásan eltérő módon viselkedő komponensek. A szak- módszerre történő módszer átvitelnél, attól függően, hogy milyen mozgófázis összetételt használunk, retencióssorrend változást kapunk. A ábrán megadtuk a k= 1 és k=10 határokat, amelyeken belül bármely mozgófázis összetétel választható az izokratikus elválasztásnál. Az I., a II. és a III: irodalom ekkor kromatográfiásan nem rokon vegyületekről beszél. Ilyen esetekben az izokratikus helyzetben a retenciós sorrendek lényegesen eltérnek. A módszerfejlesztés során, amikor azt próbáljuk elérni, hogy a lehető legkisebb elemzési idő mellett az elvárt kritériumokat teljesítsük, változtatni kell a mozgófázis összetételét. Ekkor viszont mozgófázis összetételtőll függően más retenciós sorrendet kapunk és minden változtatás után ellenőriznünk kell azt. A következő lépés, hogy az általános grádienselúciónál kapott eredményeket átvigyük az izokratikus elválasztásra. Továbbiakban egy becslést adunk meg erről. Szeretnénk hangsúlyozni, hogy a HILIC módszer összetettsége miatt nem lehetséges egyetlen lépéssel az általános grádienselúciós mérésből megadni az izokratikus elválasztás mozgófázis összetételét. Ami a módszer átvitelnél fontos, hogy a kromatográfiás céltáblába betaláljunk. Ahogy az előzőekben kiemeltük már ez a 1 k 10 feltételt jelenti. A szakirodalomban néha ezt a határt k=20-ig terjesztik ki. A kiterjesztés a módszerfejlesztésnél nagyobbb szabadságot jelent ugyan, de megnöveli az elemzési időt és izokratikus elválasztásnáll a kromatográfiás csúcsmaximum csökken, ami jelentősen megnöveli a kimutatási határt, vagy más szóval csökkenti a módszer érzékenységét. A gyakorlati feladatokat megoldó folyadékkromatográfiás szakember számára ezért a k=10-et jelentő visszatartási felsőhatárt kell alapul vennünk. A módszer átvitel másik alapelve, hogy úgymond felülről közelítjük meg a problémát. Kromatográfiás szaknyelvet lefordítva ez annyit jelent, hogy a módszer átvitelnél a legjobban visszatartott komponenst tekintjük a kritikusnak. Az első izokratikus mérésnél az a célunk, hogy ennek a komponensnek a visszatartása ne legyen nagyobb, mint 10 (felső határ az elválasztásnál). 70

73 Dr. Fekete Jenő: A folyadékkromatográfia újabb fejlesztési irányai HILIC A HILIC-ban kevés adat áll rendelkezésre, hogy a víztartalom változtatására milyen mértékben csökken a retenció, és milyen módon változik a szelektivitás, ezért csak ajánlást tudunk tenni a víztartalom változtatására. Abból indulunk ki, hogy a rendelkezésünkre álló víztartalom változtatási lehetőség kb. 40 tf.% %. Ezt a tartományt kell vizsgálnunk, amikor az általános grádienselúció alapján a kezdő mozgófázis összetétellel elvégeztük az első kísérletet. Többféle lehetőséget kaphatunk, ezeket elemezzük ki a következőkben. A ábrán a szabályosan viselkedő kromatográfiásan rokon, reguláris) kromatogramját adtuk meg. Az 1. és a 2. komponensre nem teljesül a visszatartásra vonatkozó minimális kitétel. A visszatartási tényezőjük (retenciós faktoruk) kisebb, mint 1. Első feladat, hogy a két komponens visszatartása meghaladja a minimálisan elvárt értéket. Ehhez a mozgófázis elúciós erősségét csökkenteni kell. A HILIC-nál az eluenserősség szempontjából a víz, tehát ennek térfogatszázalékát kell csökkenteni ábra Az általános grádienselúció alapján elvégzett első izokratikus mérés eredménye. A kritikus feltétel teljesült, a legnagyobb mértékben visszatartott komponens visszatartási tényezője kisebb, mint 10. A legkevésbé visszatartott komponensé viszont nem érte el a minimum feltételekben megszabottat. Kérdés, tehát ha az általános grádienselúció alapján elvégzett első izokratikus mérés eredménye azt mutatja, hogy a kritikus feltétel teljesült, ez annyit jelent, hogy a legnagyobb mértékben vissza- viszont nem érte el a minimumm feltételekben megszabottat, akkor hogyan folytassuk a módszer- fejlesztést. A módszerfejlesztésnél mindig elsődleges a minimális feltételek teljesítése. Ez pedig a tartott komponens visszatartási tényezője kisebb, mint 10. A legkevésbé visszatartott komponensé visszatartási kritériumok teljesítését jelenti, majd ezt követi a kritikus párok elválasztásának megoldása. Esetünkben a legkevésbé visszatartott komponens retencióját kell növelni, hogy a visszatartása meghaladja a holtidő kétszeresét (k 1). Ennek elérésére a mozgófázis víztartalmát kell csökkenteni. Mivel a víztartalom változtatásában a lehetőségünk csak 40 tf.%-ot ölel fel, a víztartalom csökkentését 5 tf.% %-nál nagyobb mértékben nem ajánlatos elvégezni. Tételezzük fel, hogy az elő izokratikus mérésünket 10/90 tf.% víz-acetonitril mozgófázis összetételnél végeztük, akkor a következő mérést 15 tf.% víztartalomnál fogjuk elvégezni. Ha a ábrán az első komponens visszatartása eléri, vagy meghaladja k 1 értéket, akkor következik a szelektivitás optimálása, amikor a kritikus párra el kell érnünk az R s 1,5 vagy R s 2-3 értéket. A két érték két különböző elválasztási helyzetre vonatkozik. Ha a komponensek a mintában közel azonos mennyiségben vannak és érzékenységük az adott detektálási módszerree közel azonos, akkor az R s 1,5 kritériumot alkalmazhatjuk, mert ez jelenti az alapvonali elválasztást. Ha a kritikus pár koncentrációja, azonos detektálási érzékenységnél többb nagyságrendben eltér, akkor ahhoz, hogy a nagyobbik komponens interferenciája ne hamisítsa meg a megengedett hibahatáron túl a kisebbikét az R s 2-3 kritériumot kell alkalmaznunk. A szelektivitás optimálás a könyv ennél a részénél nem képezi azt. A másik szélső esetet a ábrán mutatjuk be. 71

74 Dr. Fekete Jenő: A folyadékkromatográfia újabb fejlesztési irányai - HILIC ábra Az általános grádienselúció alapján választott izokratikus elválasztási módszer. A legnagyobb mértékben visszatartott komponensre a k> >10, akkor kiléptünk a minimális elvárásnak megfelelő feltételekből. Ahhoz, hogy az 5. és a 6. komponens visszatartása kisebb legyen, mint 10, a mozgófázis víztartalmát növelni kell. A ábrán azt mutatjuk be, amikor az általános grádienselúció alapján választott izokratikus elválasztási módszernél a legnagyobb mértékben visszatartott komponensre a k>10. Ebben az esetben kiléptünk a minimális elvárásnak megfelelő feltételekből. Ahhoz, hogy az 5. és a 6. komponens visszatartása kisebb legyen, mint 10, a mozgófázis víztartalmát növelni kell. A ábrán megadottnak megfelelően az izokratikus elválasztásnál 15 tf.% víztartalmú acetonitrilt használtunk. Addig kell ezután a mozgófázis víztartalmát növelni, míg a 6. komponensre is teljesül a k 10 és igaz lesz, hogy az 1. komponensre is teljesül a k 1 és a kritikus párnál az elválasztás R s =1,5 vagy 2-3, a komponensek jelnagyságától függően. Addig kell a mozgófázis összetételét változtatni, amíg a ábrán megadott kromatogramnak megfelelő elválasztási képet nem kapjuk ábra Az általános grádienselúcióból kiinduló elválasztás optimálás és az izokratikus elválasztási körülmények megadása. A legnagyobb mértékben visszatartott komponensree igaz, hogy k 10, a legkisebb reteciójura, hogy k 1 és minden egyes komponensre e igaz, hogy R s 1,5 vagy

75 Dr. Fekete Jenő: A folyadékkromatográfia újabb fejlesztési irányai HILIC A ábrán adtuk meg az általános grádienselúcióból kiinduló elválasztás optimálását. Az elválasztási körülményeit addig kell módosítani, míg a legnagyobb mértékben visszatartott komponensre igaz, hogy k 10, a legkisebb retenciójúra, hogy k 1 és minden egyes komponensre igaz, hogy R s 1,5 vagy 2-3. Ha az előzőkben megadott kritériumokat nem tudjuk a mozgófázis összetételének változtatásával, akkor állófázist kell váltanunk. Az általános grádienselúciónak megvannak az előnyei, ha az állófázis az adott elválasztásra megfelelő. Ismét visszajutottunk a folyadékkromatográfia alapproblémájához. Nevezetesen, hogy hogyan válasszunk állófázist. Az általános alapelvek egyértelműek, egyrészt a visszatartásra vonatkoznak (lásd az előzőeket), másrészt a csúcsszimmetriára, A csúcsok aszimmetria faktora, vagy tailing faktorának egy adott értéken belül kell lennie. A csúcsok aszimmetria faktorra, vagy tailing faktorára elfogadott értékek sajnálatos módon a különböző folyadékkromatográfiás módszereket előíró szervezeteknél nem azonos. Fogadjuk el, hogy az aszimmetria faktor értéke (A s ) 0,8 és 1,8 között változhat. Ha bármelyik ezek közül nem teljesül, akkor az adott állófázis (kolonna) nem használható. Ezek kritériumok, azonban az állófázis kiválasztásánál a szükséges, de nem elégséges kritériumot jelentik. Ami minden esetben problematikus az a szelektivitás eldöntése. Ha csak a poláris határfelületi fázis és a kevésbé poláris mozgófázis közti megoszlás szabná meg a megoszlást és ennek megfelelően a szelektivitást, akkor a lgp értékek a szelektivitás előre jelzésére megfelelő alapot adnának. A fő visszatartást adó folyadék-folyadék megoszlás mellett az egyéb kölcsönhatások (másodlagos kölcsönhatások) nagymértékben befolyásolják az egyes vegyületek visszatartását és ezzel a szelektivitást. Ezt előrejelezni, a jelenlegi ismereteink szerint, nehéz. Az általános grádienselúció alkalmazásakor problémát jelent, hogy milyen ph-át használjunk. Ahogy az 5. fejezetben bemutattuk a ph megválasztás csakúgy, mint a fordított fázisú folyadékkromatográfiában alapvető a módszer kidolgozásánál. Ahhoz, hogy a ph megválasztásnál helyes döntést hozzunk ismernünk kell a vegyületek pka értékeit. Ezeknek három forrása lehet. ismert vegyületekről van szó, amelyeknek a pka értékeit már kimérték, irodalmi adatok titrálásos, spektrofotometriás módszerrel kimérjük intelligens programok segítségével, a vegyületek szerkezetének ismeretében előre jelezzük (prediktáljuk) Az általános grádienselúciónál is alapszabály, hogy a vegyületek olyan poláris formában legyenek, hogy azok visszatartása legalább kétszerese legyen a holtidőnek (k=1). Mivel ez ionofor vegyületek (savak és bázisok) a ph függvényében változtatják a molekuláris formáikat szükséges a molekuáris formák ismerete a mozgófázis kémhatását változtatjuk erre szolgálnak a már ismertetett lgd-ph függvények. Amit a HILIC szempontjából, leegyszerűsítve, ph függő lgp -nak tekintünk. Mivel a HILIC körülményei között a mozgófázisban és az állófázis határfelületi rétegében (vízrétegben) eltérő a vegyületek pka értékei, arra kell törekedni, hogy azzal, hogy a nagy szerves oldószer tartalmú közegben és a vízben is ugyanazok legyenek a molekuláris formák arányai. Az általános grádienselúció elvégzése elött is szükséges a vegyületek lgd-ph görbéinek ismerete, hogy a HILIC-nál használt ph-t eldöntsük. Egyben alkalmas lesz arra is, hogy a kiválasztott ph értéken, becslést végezzünk arra nézve, hogy kell-e grádienselúciót alkalmaznunk az elválasztás során. Kiemeljük azt, hogy ez egy kiindulópont, amelyet majd az első mérés alapján módosítanunk kell. A módosítást szükségszerűvé teheti, hogy a minta milyen jellegű komponenseket tartalmaz. Emlékeztetőül, hogy a vegyületek ugyanabba a kromatográfiás osztályba tartoznak (kromatográfiásan hasonló, kromatográfiásan rokon, reguláris vegyületek), vagy különböző osztályba (kromatográfiásan nem hasonló, kromatográfiásan nem rokon, irreguláris vegyületek). A ábrán különböző savakra adtuk meg a lgd-ph függvényeket. Az ábrából egyértelműen következik, hogy a HILIC elválasztás csak nagy ph értékeken oldható meg. 73

76 Dr. Fekete Jenő: A folyadékkromatográfia újabb fejlesztési irányai - HILIC ábra Különböző szénatomszámú savak lgd-ph függvényei. Azt, hogy egy intelligens program a lgd-ph számolásnál milyen adatokat ad meg, a n-hexánsav példáján mutatjuk be ( ábra). A megoszlási adatok mellett megadja az ionizált és ion vissza- modell szorítottt forma lgp értékeit és a vegyület pk a értékeit. A megoszlási adatok számolására több létezik, ezért a különböző számolási módszer eredményeit is feltünteti, majd tapasztalati faktorok segítségével ezeket átlagolja ábra A n-hexánsav lgd-ph adatai és megjelenítése a Pallas intelligens program segítségével. 74

77 Dr. Fekete Jenő: A folyadékkromatográfia újabb fejlesztési irányai HILIC 8.2. A grádienselúció és problémája a HILIC-ban. Az általános grádienselúció valóban egy jó eszköz arra nézve, hogy az összes vegyületet lássuk a kromatogramon. Ha nagy vegyületek közötti visszatartás különbsége az, akkor jelzés arra nézve, hogy grádienselúciót kell használni. A nagy retenciós idő különbség ugyanis azt jelenti, hogy a komponensek elúciója nagyon eltérő oldószer összetételnél következik be. Mivel a vegyületek visszatartását a fő folyadék-folyadék megoszlás mellett több másodlagos kölcsönhatás szabja meg, ezek hatását- a jelenlegi ismereteink mellett-nehéz előre jelezni. A mozgófázisban a viselkedésüket viszont lehetséges. Létezik tehát egy számítógéppel végrehajtható előtervezés, amely irányt mutathat az elválasztási lehetőségre. Nevezetesen, hogy az elválasztás megoldható-e izokratikusan vagy sem. Ezután áttekintjük, hogy milyen szabályszerűségeket kell betartani a grádienselúciónál. A ábrán az irodalomban leközölt elválasztás vegyületeit adtuk meg. Ha vegyületek szerkezetét nézzük, akkor a polaritásban nagy különbségeket vélünk felfedezni. A mérnöki és a tudományos gyakorlatban, azonban szeretünk mindent, amit lehet, számokkal kifejezni. Ezt a lehetőséget már bemutattuk, hogy a lgd-ph függvény erre nézve nagy segítséget ad. A ábrán adtuk meg ezeknek a vegyületeknek a lgd-ph függvényét. A ábrából kiolvasható, higyha HILIC-át akarunk alkalmazni, akkor ez csak a kis ph értékeken lehet. Itt lesz a lgd értéke olyan, hogy az ionos formában lévő vegyületek az acetonitril-puiffer mozgófásból a poláris jellegű állófázis felületére kényszerülnek. Ha kettes vagy hármas savasságú mozgófázisban dolgozunk, akkor látható, hogy a lgd értékek között nagy lesz a különbség. Ez a különbség a legkevésbé poláris és a legpolárisabb vegyület között értendő. A szemcsés és porózus tölteteknél, ha ez a különbség meghaladja a kettes értéket, akkor szükséges a grádienselúció. Az előzőekben taglalt példában ez a helyzet. Ahhoz, hogy egyetlen lépésben az elválasztást el tudjuk végezni grádienselúciót kell alkalmaznunk. ldószergrádiensnél meg kell adnunk, hogy mi legyen az induló és mi legyen a befejező erős mozgófázis összetétele. Foglalkozzunk először az induló mozgófázis összetétellel. A leggyengébb oldószert a szerves oldószerek jelentik a vízhez viszonyítva. Az olodószerek tárgyalásánál kifejtettük, hogy az acetonitril jelenti a számunkra kedvezőt. A HIILIC gyakorlatában akkor a leggyengébb oldószert is az acetonitil jelenti. Kérdés, tehát, hogy akkor a grádienselúciót a HILIC-ban acetonitrtilből indítsuk? Ennek eldöntéséhez szükséges, hogy a HILIC elválasztási mechanizmusát és a grádienselúciós követelményeket áttekintsük és összeegyeztessük. 75

78 Dr. Fekete Jenő: A folyadékkromatográfia újabb fejlesztési irányai - HILIC ábra A szakirodalomból vett elválasztási példa, amikor nagyon eltérő polarításúvegyületek elválasztását oldották meg grádienselúcióval a HILIC-ban ábra A szakirodalomból vett elválasztási példa, amikor nagyon eltérő polarításúvegyületek elválasztását oldották meg grádienselúcióval a HILIC-ban. 76

79 Dr. Fekete Jenő: A folyadékkromatográfia újabb fejlesztési irányai HILIC A grádienselúciós technika alkalmazásának az eldöntése a lgd-ph görbe alapján ábra A visszatartás egyik lehetséges változata a HILIC folyadékkromatográfiás módszernél. A komponens megoszlik a szorbeált vízréteg és a mozgófázis között. A HILIC-nál a tudomány mai álláspontja szerint az elválasztáss egyik sarkalatos alapjaa a határ- megoszlás, ahogy ezt a ábrán bemutattuk. Szükséges tehát, hogy a mozgófázisban víz le- felületi fázisban adszorbeálódott víz és az annál kevésbé poláris mozgófázis közötti komponens gyen, mert különben ez a határfelületi réteg nem tud kialakulni. Kérdés, tehát, hogy mekkora legyen a víztartalom a mozgófázisban. Ehhez a grádienselúció elméletéhez kell visszamennünk. A ábrán a gyakorlati élet- a ben alkalmazott grádienselúciós folyamatot adtuk meg. A grádienselúciónál többször ismételjük folyamatot. Alapvető, hogy minden ismétlésnél ugyanabból a helyzetből induljunk, hogy minden lépésnél ugyanolyann visszatartást, retenciótt kapjunk. B% I II t G 0 III IV 1 2 t ábra Gradiens elúciós technika alkalmazása. Az I. a mérés előtti szakasz, II. az erősebb mozgó fázis összetevő növelése, III. visszaállási szakasz az A mozgó fázisra, IV. beállási idő az új mérés előtt. tg = gradiensidő A gradienselúciónál felmerül az a kérdés, vajon a két gradiens mérés között teljes egyenméréseket. A ábrán adtuk meg a gradienselúció jellemző szakaszokat a mérés indításától. Az első szakasz súlynak kell lennie, vagy minden esetben ugyanarról a helyzetbőll elegendő indítani a a mérési ciklus indítása előtti szakasz. Ekkor a két fázis között az egyensúlyy valószínűleg beáll. A II. szakaszon növeljük a mozgófázis elúciós erősségét, ez HILIC-nál a víztartalom növelését jelenti, a III. szakaszon visszaállunk az eredeti összetételre, míg a negyedik szakasz az újabb ciklus előtti várakozó szakasz. A ábrán az első ciklust a nulladik mérésnek kell megadni, mert ekkor kell ellenőrizni a mozgófázis tisztaságát. A HILIC-nál a IV. szakaszon kell kialakulni a határfelületi vízrétegnek. Amennyiben ennek kialakulásaa bizonytalan, akkor a visszatartás (retenció) is bizonymekkora talanná válik. A határfelületi réteg kialakulásának bizonytalanságaa összefügg azzal, hogy a mozgófázis víztartalma. Minél kisebb a mozgófázis víztartalma, annál hosszabb időt vesz igénybe a határfelületen az egyensúlyhoz közeli állapot elérése. Ha nulladik lépéstől, amelyet a mozgófázis tisztaságának ellenőrzésére használunk, eltekintünk, akkor automata mintaadagoló használatakor, amikor egy méréssorozaton belül vagyunk, nem szükséges az álló- és a mozgófázis közötti teljes egyensúly beállása. A feltétel, hogy mindig, a nulladik lépéstől eltekintve, ugyanolyan helyzetből indítsuk a grádienselúciót. Sajnos a hagyományos folyadékkromatográfiás rendszereknél 77

80 Dr. Fekete Jenő: A folyadékkromatográfia újabb fejlesztési irányai - HILIC a késleltetési térfogat (dwell volume) nagyon eltérő is lehet. Ennek következtében ezt a HILIC módszerek átvételénél is figyelembe kell venni. A ábrán adtuk meg, hogy az eltérő késletetési térfogatú készülékekben hogyan alakulnak a mozgófázis összetételi viszonyai. Ha a legkisebb késletetési térfogatú készülékre kidolgozott módszert át akarjuk vinni más folyadékkromatográfiás készülékre, akkor figyelembe kell vennünk az eltérő késletetési térfogatot, amely döntően a folyadékkromatográfiás készülékek eltérő keverési térfogatából ered. B% 100 t g t [perc] ábra A mozgófázis összetétel változása eltérő késleltetési idejű folyadékkromatográfiás készülékek használatakor. Ha a legkisebb késleltetési térfogatú készüléknek megfelelően állítjuk a grádiensidőt, akkor a többi készüléknél előbb ér véget a folyamat, mielőtt elérnénk a végső mozgófázis összetételt A késleltetési idő arányosan eltolja retenciós időket, mert kolonna elejét ezzel az idővel később éri el a mozgófázis. Ez a térfogat értelemszerűen nem okoz zónaszélesedést, de az elválasztásnál alapvető, hogy az elemzés leállítása előtt a kívánt erősségű oldószert elérjük (B). Az elemzési időt tehát ezzel az idővel meg kell hosszabbítani. Izokratikus méréseknél is az adagolt minta térfogata és az adagolót a kolonnával összekötő vezeték térfogata megnöveli a retenciót. A jól optimált rendszernél ez a térfogat elhanyagolható a kolonna térfogatához képest ábra Az elméleti grádiens lefutás (szaggatott vonal) és a gyakorlatban kapott (folytonos vonal). A grádienselúciónál mindig figyelembe kell venni a késleltetési térfogatot. A 8.6. ábrán megadtuk az elméleti grádiens lefutást (szaggatott vonal) és a gyakorlatban kapottat (folytonos vonal). A HILIC módszerek átvételénél ezt figyelembe kell vennünk ezt. Továbbá, mivel a határfelületi vízréteg az elválasztásnál alapvető szerepet játszik, a grádienst nem indíthatjuk acetonitrilből. A gyengébbik oldószernek a grádienselúciónál mindig kell vizet tartalmaznia. Kérdése, hogy milyen koncentrációban. Elméletileg, annál jobb, minél nagyobb a koncentrációja, gyakorlatban viszont 78

81 Dr. Fekete Jenő: A folyadékkromatográfia újabb fejlesztési irányai HILIC problémát jelenthet, hogy a legkevésbé visszatartott komponens (legkevésbé poláris) visszatartása nem lesz megfelelő és a kolonna elején nem történik meg a koncentrálása. Ennek eredménye az lesz, hogy ennek a komponensnek a csúcsszélesedése nagyobb lesz, mint a többié. Az erős B oldószertartályba nem vizet teszünk, hanem % szerves oldószer tartamú vizet vagy puffert. Az előzőekben már megállapítást nyert, hogy ez alatt a szerves oldószertartalom alatt a vegyületek visszatartása elhanyagolható. A ábrán megadott grádinselúciós rendszernél, tehát az A tartályba 95/5 térfogatarányú acetonitril (vagy egyéb vízzel elegyedő szerves oldószer)- víz (puffer), míg a B tartályba tf. % acetonitril (vagy egyéb vízzel elegyedő szerves oldószer)- víz (puffer kerül). A K I KL D A, B oldószerek I injektor B gradienskésés oka: t D =t kev +t ö +t inj t D dwell time, késleltetési idő t kev keverő kiürülési ideje t ö összekötő vezetéken történő áthaladás ideje t inj injektorban töltött idő ábra Az A tartályba 95/5 térfogatarányú acetonitril (vagy egyéb vízzel elegyedő szerves oldószer)- víz(puffer), míg a B tartályba tf. % acetonitril (vagy egyéb vízzel elegyedő szerves oldószer)- víz (puffer kerül). Amennyiben puffert kell használnunk az ionogén anyagok elválasztásánál, akkor a sókiválás az oldószernél lesz kritikus, mert csökkentve az acetonitril (szerves oldószer) tartalmat a pufferek oldhatósága nő a mozgófázisban. Ha az acetonitrilt (szerves oldószert) összekevertük a pufferrel és fél-egy óra múlva sincs kristály kiválás, akkor a sóproblémát elkerültük. Automata mintaadagoló használatakor egy mintasorozat mérésekor nem kell a teljes egyensúly beállását kivárnunk. Ez sokszor feleslegesen megnövelné az elemzési időt. Ha az első mérést, amelyet 0 -nak nevezünk el, arra használjuk, hogy az oldószer tisztaságot ellenőrizzük, akkor a IV. szakaszon az a fontos, hogy annak befejeztével az A mozgófázis áramoljon a kolonnán. A szabályos egymás utáni adagolásokkor, minden esetben ugyanolyan távol vagyunk a teljes egyensúlytól, így minden egyes adagolás után ugyanazokat a visszatartásokat kapjuk. Ha mérést valamilyen okból megállítjuk, akkor az új sorozatot ismét a 0 megjelöléssel kell indítanunk A grádienselúciós folyadékkromatográf tesztje A grádienselúciós rendszerek megbízhatóságát több paraméter is befolyásolja. Az előző fejezetben (8.2.) kiemeltük a késleltetési térfogat szerepét(dwell volume), emellett a folyadékkeverés jósága, a szelepek megbízható működésével összefüggő paraméterek mind-mind befolyásolják a grádiens ismételhetőségét és reprodukálhatóságát. Fel szeretnénk hívni a figyelmet, hogy sok esetben a grádiens ismételhetőségét és reprodukálhatóságát felcserélve használják. Minden olyan esetben, amikor ugyanazon a készüléken végezzük el a kísérleteket, annak bizonyítására, hogy ha ugyanazt a grádinsprofilt alkalmazzuk, akkor a retenciós idők szórása a megadott előíráson belül (specifikáción) marad, akkor ez a grádiens ismételhetőségét jelenti. Ha a kidolgozott grádienselúciós módszert átvisszük egy megegyező késleltetési térfogatú készülékre és a retenciós időkre; és a szórására ugyanazt kapjuk, mind az előző készülékre, akkor a reprodukálhatóságot ellenőriztük. 79

82 Dr. Fekete Jenő: A folyadékkromatográfia újabb fejlesztési irányai - HILIC A retenciós idők két grádienselúciós készüléken, azonos körülményeket alkalmazva, akkor egyeznek meg, ha a késletetési térfogataik és a folyadékkromatográfiás rendszer kolonnán kívüli térfogati megegyeznek. A ábrán adtuk meg a grádienselúciós rendszert. A késleltetési térfogat három részből tevődik össze; a keverő, a keverőt az adagolóval összekötő kapilláris, az adagoló össztérfogatából és az adagolót a kolonnával összekötő vezeték térfogatából. A hagyományos folyadékkromatográfiás rendszernél ezek közül a térfogatok közül a keverő térfogata a legnagyobb, ehhez képest a többi elhanyagolható. Elvileg a kolonna végét a detektorcellával összekötő vezeték és a detektor térfogatoknak is meg kellene egyeznie, azonban az ezek között lévő különbségek elhanyagolhatók. Első feladat, tehát a HILIC-ban használt grádienselúciós készüléknél a késleltetési térfogat ellenőrzése. Ehhez a folyadékkromatográfiás rendszerből a kolonnát kivesszük, és az adagolót a detektor bemenetelével egy fojtást jelentő kapillárissal kötjük össze. Ezzel küszöböljük ki, hogy a nagynyomású szivattyú pulzálásából eredő detektorzajt nagymértékben csökkentsük. Vagy a nagyobb térfogat-áramlási sebességet alkalmazzunk, hogy az összekötő vezetéken megfelelően nagy legyen a nyomásesés (1-5 ml/perc). A grádienselúciós körülményeket a táblázatban adtuk meg. A mozgófázis 97/3 tf.% acetonitril-víz B mozgófázis 97/3/0,5th.% acetonitril-víz-aceton Térfogatáramlási sebesség 1 ml/min Detektálási hullámhossz 254 nm Adagoló hurka teljes mértékben feltöltve A mozgófázissal táblázat A késleltetési térfogat meghatározásakor alkalmazott folyadékkromatográfiás körülmények. Az adagoló hurka teljes mértékű feltöltése különösen azoknál a HPLC készülékeknél fontos, ahol a változtatható térfogatú adagolás miatt nagy mintatartó hurkot építenek be. Nem szabad elfelejteni, hogy az adagoló hurok térfogata része a késleltetési térfogatnak (dwell volume). A grádienselúciós módszernél az egyik készülékről a másikra való módszer átvitelnél fontos, hogy a teljes koncentráció intervallumban azonos sebességgel növekedjen az erősebb oldószer ( B ) mennyisége az ( A )-ban. Ezt ellenőrizzük a grádiens lineritásának vizsgálatával. Ezt az ellenőrzést is kolonna használata nélkül végezzük el. A mérési körülményeket és módszert a táblázatban adtuk meg. A mozgófázis 97/3 tf.% acetonitril-víz B mozgófázis 57/43/0,5tf.% acetonitril-víz-aceton Térfogatáramlási sebesség 1 ml/min Detektálási hullámhossz 254 nm Adagoló hurka teljes mértékben feltöltve A mozgófázissal Grádiensidő:10 perc, ehhez hozzá kell adni a késleltetési időt táblázat A grádinselúciós rendszer linearitásának ellenőrzése a HILIC-nál. 10 perc és ehhez adva a grádienskésés idejét, ez alatt az idő alatt jutunk el az A oldószerről a B oldószerig. A viszonyokat a ábrán mutatjuk be. Ha felfutó szakasz egyenletes, akkor a grádiens lineáris, mert az egyenes szakaszra igaz, hog y az egységnyi idő alatt ugyanannyival nő a mozgófázisban a B koncentrációja (ΔB tf.%/δt=állandó). Ha a felfutó szakasz nem egyenletes, akkor ez jelzése annak, hogy a keverő nem működik jól. 80

83 Dr. Fekete Jenő: A folyadékkromatográfia újabb fejlesztési irányai HILIC ábra A grádinselúciós rendszer linearitásának ellenőrzése a HILIC-nál. Következőkben a gádienslépések ellenőrzését végezzük el. Ehhez a mérési körülményeket a táblázatban adtuk meg. A mozgófázis 97/3 tf.% acetonitril-víz B mozgófázis 57/43/0,5tf.% acetonitril-víz-aceton Térfogatáramlási sebesség 1 ml/min Detektálási hullámhossz 254 nm Adagoló hurka teljes mértékben feltöltve A mozgófázissal A B koncentrációját az A -ban 5 lépcsőzetesen növeljük és minden lépcső között 5 percet várunk, amíg eljutunk a B oldószerig (57/43/0,5tf.% acetonitril-víz-aceton) táblázat A grádienselúciós készülék grádienslépéseinek ellenőrzése a HILIC-ban, mérési körülmények. A lépcsők magasságának minden egyes változtatás után meg kell egyezni. Ekkor a B koncent- a rációjától független az oldószer változtatás sebessége. Ha ez nem teljesül, akkor a készüléket szerviznek verifikálni kell ábra A grádienselúcióss készülék grádienslépéseinek ellenőrzése a HILIC-nál. A jól működő grádienselúciós rendszernél h 1 = h 2 = h 3 = h 4 = h 5 = h 6 = h 7 = h 8. 81

84 Dr. Fekete Jenő: A folyadékkromatográfia újabb fejlesztési irányai - HILIC A ábra a jól működő grádienselúciós rendszernél h 1 = h 2 = h 3 = h 4 = h 5 = h 6 = h 7 = h 8, azaz egyenlő lépcsőmagasságokat kapunk. A hagyományos nagyhatékonyságú folyadékkromatográfiás rendszereknél (HPLC, 400 bar, 6000 PSI) a kisnyomású grádiens készülékeket alkalmaznak döntő mértékben. Itt a vezérelt szelepekkel érik el a megfelelő összetételű mozgófázist. A szelepek működését dőről-időre ellenőrizni kell. Ezt szolgálja a következő teszt, amelyet a HILIC-nál kell elvégeznünk. A kisnyomású grádiens- elúciós készüléket vagy binér (két szelep) vagy kvaterner (négy szelep) rendszerként használjuk. A szelepek működési jóságának ellenőrzését a táblázatban megadottak szerint végezzük el. A és B ág 97/3 tf.rész acetonitril/víz C és D ág Térfogatáramlási sbesség Detektálási hullámhossz 97/3/0,5 tf.rész acetonitril/víz/aceton 1 ml/min 254 nm Mérési lépések: /50 rész az A ágból, valamint a C ágból idő: 3 perc 100 rész a C ágból, idő 3 perc 50/50 rész az A ágból, valamint a C ágból idő: 3 perc A fentiek ismétlése: négyszer, majd az összes lehetséges kombinációra el kell végezni táblázat A kisnyomású grádienselúciós készülékeknéll a szelepek korrekt működésének ellenőrzésekor használt mérési körülmények és útmutató. Az egyes szelepek ellenőrzésekor a ábrán megadottaka at kapjuk ábra A kisnyomású grádienselúciós készülékeknél a szelepek korrekt működésének ellenőrzésekor kapott jelsorozat. Az egyes magasságokból számoljuk az átlagot, ezzel osztjuk az egy mérésnél kapott jelet, majd ezekből számoljuk a szórást, ha ez két százaléknál kisebb a szelepek működése megfelelő. A ábrán látható méréseket az összes szelep kombinációra elvégezzük és számoljuk a szórásokat. Ennél a műveletnél az egyes magasságokból számoljuk az átlagot, ezzel osztjuk az egy mérésnél kapottt jelet, majd ezekből számoljuk a szórást, ha ez két százaléknál kisebb a szelepek működése megfelelő. 82

85 Dr. Fekete Jenő: A folyadékkromatográfia újabb fejlesztési irányai HILIC A grádienselúció megbízhatóságát a rosszul működő szelepek nagyban befolyásolják. A nagynyomású szelepet ellenőrizni tudjuk, hogy jól zár-e. angolul ezt nevezik pressure bleed-down tesztnek. Elvégzése a következőképp történik. A nagynyomású szivattyú nyomás-behatárolóját 350 bar-ra állítjuk. A szivattyúról kijövő vezetéket lezárjuk, és megindítjuk a mozgófázis áramlását. A nyomáshatároló automatikusan leállítja a nagynyomású szivattyút, amikor a nyomás eléri a 350 bar-t. Ha tíz perc eltelte után a nyomáscsökkenés nem nagyobb, mint 15%, akkor a szelepek jól működnek. Ha ennél nagyobb, akkor a szelepet tisztítani vagy cserélni kell. Az egész grádienselúciós rendszer ellenőrzését teszi lehetővé a reprodukálhatóság ellenőrzése. A reprodukálhatóság itt annyit jelent, hogy a tesztet bármely időben megismételve ugyanazokat a szórásokat kapjuk. Az analitikai szakirodalomban ezt a tesztet inkább az ismételhetőség fogalomkörébe kellene sorolnunk. A szakirodalomban és a készülék gyártók körében a reprodukálhatóság néven vált ismertté, ezért mi is ezt a fogalmat használjuk. Tetszőleges vegyületsort kiválasztunk, azzal a feltétellel, hogy nagy legyen a vegyületek között a polaritás különbség. Kromatográfiásan semleges vegyületeknél, ez a két egység különbséget jelent a lgp-ben, úgyhogy a legkevésbé visszatartott komponensre teljesüljön, hogy a lgp kisebb legyen, mint -0.5 vagy -1. Hatszor elvégezve a grádienselúciós mérést, a mért adatokból számoljuk az átlagértéket és a szórást. Ugyancsak a görbe alatti területekből számoljuk az átlagot és a szórást. Mindkét esetben, ha a szórás egy százalék alatt van, akkor a grádienselúciós készülék jól működik. 83

86 Tárgymutató Dr. Fekete Jenő: A folyadékkromatográfia újabb fejlesztési irányai - HILIC Állófázisok erős anioncserélő...28 erős kationcserélő...28 HILIC aminofázis...30 HILIC szilikagél...15 HILIC Zwitter-ionos fázis...29 kizárási molekulatömeg...13 ZIC-cHILIC...35 ZIC-HILIC...31 ZIC-pHILIC...31 zwitterionos fázisok...35 Elúció erősségi sorrend...61 visszatartás-víztartalom...61 Gradienselúció általános gradienselúció...65 eredmény átvitele...70 gradiens ismételhetősége...80 gradiens lépcsők...77 gradiens linearitása...80 gradiensprofil kiválasztása...66 induló gradiens (A)...65 késleltetési térfogat (dwell volume)...78 lineáris erősségű gradiens...66 oldószer gradiens...65 szelepműködés ellenőrzése...82 végső összetétel (B)...66 HILIC besorolása... 9 egyensúly beállása...21 elúciós erősségi sorrend...43 eluens erősségi sorrend...40 fogalma... 7 használható állófázisok...11 kolonna tárolása

87 Dr. Fekete Jenő: A folyadékkromatográfia újabb fejlesztési irányai HILIC ph függés...19 ph kontroll...20 polimer alapú álófázis ph tartomány...31 szelektivitási sorrend...43 szilikagél állófázis ph tartomány...21 szilikagél, polárisan módosított ph tartomány...24 víztartalom a mozgófázisban...40 vizsgálható vegyületek...22 Zwitter-ion állófázis ph tartomány...31 HPLC elválasztás tervezése...12 ionizáció visszaszorítás...56 ionizáció, bázisos...47 ionizáció, ph függés...45 ionizáció, savas...45 vegyületek besorolása...22 HPLC kolonnák analitikai kolonnák anyaga, méretei...33 kolonnán kívüli zónaszélesedés...33 kritériumok a használatra...10 mikro és nano kolonnák...32 Kölcsönhatások H-hidas...17 hidrofób...25 HILIC kölcsönhatás... 7 ionos...19 lgd gradienselúció...59 kritikus párok...59 lgd-k...46 lgd-ph...46 lgp kritérium...73 retenciós sorred...58 Mozgófázisok erőssége

88 Dr. Fekete Jenő: A folyadékkromatográfia újabb fejlesztési irányai - HILIC használható pufferek...49 kompatibilitása PEEK-al...43 koncentrációja...78 oldószerek...41 retenció változása...62 szelektivitsa...43 vízhatás...61 ph fogalma a HILIC-ben...51 kiválasztása...52 látszólagos...51 mérése...52 optimálása...54 ph skála...53 pka bázisos...47 savas...45 vizes...50 Puffer...48 készítése...51 kompatibilitása...49 pufferkapacitás...48 szerves komponensekkel...49 tisztasági követelmények...49 RP-HPLC meghatározható vegyületek... 9 nem mérhető vegyületek... 9 oldószererősség...66 visszatartás függése a szerves oldószer tartalomtól...66 RP-IP-HPLC kiváltása HILIC-val...11 meghatározható vegyületek... 9 nem mérhető vegyületek... 9 Szilikagél anion protonfelvétele...22 felületi tulajdonságok

89 Dr. Fekete Jenő: A folyadékkromatográfia újabb fejlesztési irányai HILIC fémionok beépülése...18 határfelület kialakulása...18 ioncserés kölcsönhatás...19 Vegyületek bázisos...23 kis molekulatömegűek...13 meghatározási kritériumok...12 nagy molekulatömegűek...12 savas...22 semleges...22 Visszatartási faktor függése állófázistól...57 lgd-től...59 lgp-től...59 ph-tól...47 víztartalomtól... 63, 66 Víztartalom határfelületi réteg... 18, 77 induló...65 végső...66 Víztartalom ph állófázisban...23 mozgófázisban...53 Zwitterionos állófázisok kölcsönhatások...31 szerkezete...30 szerves polimer alapúak...31 szilikagél alapúak

90

91 Merck HPLC állófázisok Megnevezés LiChrosorb LiChrospher Superspher Purospher Purospher STAR Aluspher Chromolith ZIC -HILIC Töltetcsalád jellemzõi Porózus, irreguláris, szilikagél alapú töltet. Poláros és apoláros fázisok. 5, 7, 10 μm szemcseméret. Porózus, gömbszimmetrikus, szilikagél alapú töltet. Poláros és apoláros fázisok. 5, 10, 12 μm szemcseméret. Porózus, gömbszimmetrikus, szilikagél alapú töltet. Poláros és apoláros fázisok. 4 μm szemcseméret. Porózus, gömbszimmetrikus, nagytisztaságú (fémion-mentes) szilikagél alapú töltet. Poláros és apoláros fázisok. 5 μm szemcseméret. Porózus, gömbszimmetrikus, nagytisztaságú (fémion-mentes) szilikagél alapú töltet. Poláros és apoláros fázisok. 2, 3, 5 μm szemcseméret. Porózus, gömbszimmetrikus, alumínium-oxid alapú töltet. Apoláros fázisok. 5 μm szemcseméret Porózus, monolitikus, nagytisztaságú (fémion-mentes) szilikagél alapú töltet. Poláros és apoláros fázisok. Porózus, gömbszimmetrikus, szilikagél - vagy polimer alapú töltet. Ikerionos szerkezetû hidrofil állófázis. 3.5, 5 μm szemcseméret. Merck Kft. Magyarország 1113 Budapest, Bocskai út Telefon: kemia@merck.hu Fax: szerviz@merck.hu

92 Felelõs kiadó: Merck Kft. Magyarország 1113 Budapest, Bocskai út Telefon: Fax: Honlap: