Doktori (Ph.D.) Értekezés

Méret: px
Mutatás kezdődik a ... oldaltól:

Download "Doktori (Ph.D.) Értekezés"

Átírás

1 Doktori (Ph.D.) Értekezés AZ EXTRACELLULÁRIS MÁTRIX SZEREPE A HUMÁN OSTEOSARCOMA INVAZÍV NÖVEKEDÉSÉBEN ÉS CITOTOXIKUS GYÓGYSZEREKKEL SZEMBENI VÁLASZREAKCIÓJÁBAN Dr. Harisi Revekka Témavezeto: Prof. Dr. Jeney András D.Sc. Semmelweis Egyetem Általános Orvostudományi Kar I. sz. Patológiai és Kísérleti Rákkutató Intézet Semmelweis Egyetem Doktori Iskola Patológiai Orvostudományok Doktori Iskola Onkológiai Program Programvezeto: Prof. Dr. Kopper László D.Sc. Szigorlati Bizottság Elnök: Dr. Schaff Zsuzsa, egyetemi tanár, az orvostudomány doktora Tagok: Dr. Kralovánszky Judit, tudományos foosztályvezeto, kandidátus eerew Dr. Antal Imre, egyetemi adjunktus Ph.D. Hivatalos Bírálok Dr. Antal Imre, egyetemi adjunktus, Ph.D. Dr. Budai Barna Lajos, tudományos fomunkatárs, Ph.D. Budapest, 2005

2 Tartalomjegyzék 1 TARTALOMJEGYZÉK 1 TARTALOMJEGYZÉK BEVEZETÉS ÉS IRODALMI HÁTTÉR AZ OSTEOSARCOMA Epidemiológia Etiológia Citogenetika Lokalizáció Klinikai tünetek Laboratóriumi vizsgálatok Radiológiai vizsgálatok Szövettan Terjedés, áttétképzés Kezelés AZ EXTRACELLULÁRIS MÁTRIX (ECM) Az ECM szerkezete Az ECM átrendezodése Az ECM szerepe a szöveti muködés szabályozásában A tumoros ECM szerepe a daganatok progressziójában A proteoglikánok CÉLKITUZÉSEK ANYAGOK ÉS MÓDSZEREK ANYAGOK Szövettenyészeti anyagok és vegyszerek Antitestek és vektorok Daganatellenes gyógyszerek MÓDSZEREK OSCORT sejtvonal kialakítása Primer humán osteosarcoma HTB-2 és HTB-9 xenograftok kialakítása OSCORT szövettenyészeti sejtvonal kialakítása OSCORT sejtvonal humán eredetének igazolása ECM eloállítása és ECM biopolimerek izolálása ECM eloállítása EHS sarcomából (EHS-ECM) ECM biopolimerek izolálása ECM eloállítása OSCORT sejtekbol (OSCORT-ECM) Sejttenyésztési és citosztatikus kezelési módszerek Sejttenyésztés ECM-gél jelenlétében Sejttenyésztés ECM-gél biopolimerek jelenlétében Citosztatikumok hatásának vizsgálata Sejtek izolálása a háromdimenziós tenyészetbol A sejtproliferáció vizsgálata Az invazív növekedés vizsgálata in vitro Morfológiai vizsgálatok Citológiai vizsgálatok Sejtéletciklus vizsgálata

3 Tartalomjegyzék Immunhisztokémia és immuncitokémia Immunhisztokémia Immuncitokémia Biokémiai vizsgálatok Sejtmagizolálás, sejtmagi és citoplazmatikus fehérjék eloállítása Fehérjek azonosítása immunblot technikával Topoizomeráz aktivitások vizsgálata Metalloproteináz (zselatináz) aktivitás vizsgálata A doxorubicin DNS károsító hatásának vizsgálata DNS bontó aktivitás kimutatása Proteoglikánok vizsgálata Statisztikai analízis EREDMÉNYEK KLINIKAI HÁTTÉR HUMÁN OSTEOSARCOMA SEJTVONAL (OSCORT) JELLEMZÉSE HTB-2 és HTB-9 xenograftok jellemzése A xenograftok szövettani jellemzése A xenograftok immunhisztokémiai jellemzése OSCORT humán eredetének igazolása LDH izoenzimek kimutatása Citogenetikai vizsgálatok - Kariotípus analízis ECM HATÁSA AZ OSCORT SEJTEK NÖVEKEDÉSÉRE ÉS INVAZÍVITÁSÁRA ECM és biopolimerei hatása az OSCORT sejtek növekedésére ECM és biopolimerei hatása az OSCORT sejtciklusra ECM és biopolimerei hatása sejtciklushoz társult és tumor szuppresszor fehérjék expressziójára Topoizomeráz váltás ECM és biopolimerei hatására Nem specifikus DNS bontó aktivitás ECM hatására ECM biopolimerek hatása az OSCORT sejtek migrációjára ECM és biopolimerei hatása az OSCORT sejtek mátrix metalloproteináz aktivitására ECM és biopolimerei hatása az OSCORT sejtek ß1 integrin expressziójára ECM HATÁSA AZ OSCORT SEJTEK DOXORUBICINNEL SZEMBENI VÁLASZREAKCIÓJÁRA ECM hatása doxorubicinnel kezelt OSCORT sejtek növekedésére ECM hatása doxorubicinnel kezelt OSCORT sejtek repopulációjára ECM hatása doxorubicinnel kezelt OSCORT sejtek sejtciklus fázisaira ECM biopolimerek hatása az OSCORT sejtek doxorubicinnel szembeni válaszreakciójára ECM moduláló hatása a doxorubicin indukált DNS károsodásra ECM hatása doxorubicinnel kezelt OSCORT sejtek tumor szuppresszor fehérjék expressziójára ECM hatása doxorubicinnel kezelt OSCORT sejtek topoizomeráz fehérjék expressziójára és aktivitására Doxorubicin kezelés hatása OSCORT sejtek proliferációjára és migrációjára

4 Tartalomjegyzék 5.5 A PROTEOGLIKÁNOK LEHETSÉGES SZEREPE AZ OSTEOSARCOMA KEZELÉSÉBEN Proteoglikán expresszió az OSCORT sejtekben és az ECM-ben Doxorubicin és clodronat hatása az OSCORT sejtek növekedésére és proteoglikán termelésére Doxorubicin és clodronat kombinációs kezelés hatása az OSCORT sejtek növekedésére MEGBESZÉLÉS KÖVETKEZTETÉSEK, ÚJ MEGÁLLAPÍTÁSOK és KLINIKAI GYAKORLATI ALKALMAZÁSUK RÖVIDÍTÉSEK JEGYZÉKE KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS IRODALOMJEGYZÉK SAJÁT KÖZLEMÉNYEK ÖSSZEFOGLALÁS SUMMARY 143 4

5 Bevezetés 2 BEVEZETÉS ÉS IRODALMI HÁTTÉR 2.1 AZ OSTEOSARCOMA Az osteosarcoma a leggyakoribb primer csontdaganat. 1 A WHO-meghatározás alapján az osteosarcoma olyan malignus tumor, amelyre jellemzo a tumorsejtek direkt csontszövet-, illetve osteoidtermelése. Sokféle megjelenési formája van, és igen eltéro lehet a szövettani képe, alapveto azonban a tumorsejtek osteoidtermelo képessége, ennek alapján akkor is osteosarcomáról beszélünk, ha a tumor állományának nagy része porc- vagy kötoszövet Epidemiológia Az osteosarcoma gyakorisága évenként körülbelül 1.5/egymillió lakos, ami Magyarországon 15 új esetet jelent évente. 1 Az incidenciája kétszer gyakoribb a férfiaknál. Bármely életkorban elofordulhat, de a 60%-a az elso két évtizedben keletkezik. Az elofordulás csúcsa a 20. év a férfiaknál, a noknél a 17. év és a gyermekkori és fiatal felnottkori összes daganatos megbetegedés 8%-át képezi. Mindazonáltal 70 év körül ismételt kiugrás észlelheto, amely azonban lényegesen kisebb a serdülokorinál. 2 A 0-14 év közötti fiatal populációban a csonttumorok az összes malignus daganatoknak az 5%-át alkotják, ebbol az 52%-a az osteosarcoma, ezért az osteosarcoma a legfontosabb primer csonttumor gyerek és serdülokorban. 3 Elofordulása gyakoribb a fiúknál, fiú-leány arány 1.4:1. 2,4, Etiológia Az osteosarcoma eredete ismeretlen. Közismert azonban, hogy a retinoblastoma és a Li -Fraumeni szindróma gyakran társulnak osteosarcomával, ami a RB és TP53 szuppresszor gének deléciójának vagy mutációjának a szerepére utalnak az osteosarcoma kialakulásában. 6,7,8,9,10,11 A retinoblastomában a 13q14, a Li-Fraumeni szindrómában 17p13 kromoszóma rendellenességek mutathatók ki. Az MDM2 (2q13-14), a MYC (8q24) és a FOS (14q21) onkogének amplifikációját, valamint RNS és 5

6 Bevezetés protein expresszió fokozódását is összefüggésbe hozták az osteosarcomák kialakulásával. 12,13 Másodlagos osteosarcoma alakulhat ki irradiáció után, valamint Paget kór, fibrosus dysplasia, óriássejtes csonttumor, csontinfarktus és osteomyelitis talaján Citogenetika Osteosarcomák citogenetikai vizsgálatáról kevesebb, mint 50 esetben számoltak be az irodalomban, és az extrém módon komplex kariotípusok mellett semmilyen, a lymphomákhoz, illetve leukémiákhoz hasonló, jellemzo citogenetikai elváltozást nem találtak. 14 A közölt esetek többségében nagyfokú aneuploidiát és nagyszámú marker kromoszómát észleltek, az 1p, 1q, 3p, 3q, 6q, 7q, 8q, 9q, 11p, 12p, 14p, 17p, 19q és 12q kromoszóma karokon megfigyelt eltérések mellett. A 3, 4, 5, 10, 13, 15 és 22. kromoszómák hiányát, illetve izokromoszómákat, mint i(6p) és i(14q) írtak le legalább két analizált tumorban. Legalább 5 tumorban találtak az 1q11, 1q21, 1q42, 6q15-21, 7q11, 8q24, 9q34, 12p13 és 19q13 sávokban töréspontokat. 14 Az RB1 tumor szuppresszor gént hordozó 13q14 sáv, 15 illetve a teljes 13. kromoszóma hiányát írták le a vizsgált osteosarcoma esetek felében. 16 Osteosarcomákban viszonylag gyakori a TP53 tumor szuppresszor gént hordozó 17p13 locus 17 érintettsége. Amplifikációra utaló jelekrol, mint double minute-ok (DM), vagy homogénen festodo régiók, és/vagy esetlegesen az osteogen tumorokra jellemzonek tekintheto onkogéneket érinto átrendezodésekrol nem számoltak be. 14 Ugyanakkor parostealis osteosarcomában és néhány más csont és kötoszöveti daganatban egy számfeletti gyuru kromoszóma volt kimutatható Lokalizáció Az osteosarcoma a csontrendszeren, illetve adott csonton belül is jellegzetes predilekciós helyeken alakul ki. A legtöbb daganat a hosszú csöves csontok ízület közeli részein keletkezik (1. ábra). A csöves csontokon belül elsosorban a legaktívabb növekedés helyén, a metaphysisben alakul ki, és csak mintegy 10-15%-ában az epiphysisben, diaphysisben. A gyerek- és serdülokorban a leggyakrabban érintett csontok a femur (44%), a tibia (17%) és a humerus (15%). 4,5 A betegség nagyon ritkán a csontrendszeren kívül is elofordulhat, például a mellkasban vagy a hasüregben. 6

7 Bevezetés 1. ábra. Az osteosarcoma eloszlása Mirra nyomán. 19 A nem jelölt csontok az osteosarcomás esetek 4%-át jelentik. Az adatok a közép- és idoskorú osteosarcomás betegekre vonatkoznak. A gyerek- és serdülokorban kevesebb az axialis csontokban eloforduló esetek száma Klinikai tünetek Az osteosarcomának meglehetosen jellegtelen tünetei vannak. A kezdetben intermittáló fájdalom, késobb állandósul és fokozódik, terheléstol függetlenné válik, és éjjel intenzívebb. A fájdalom a környezo ízületek felé sugárzik ki, és azt jelzi, hogy az intraossealis tumor áttörte a corticalist és feszíti a periosteumot, majd a lágyrészekbe hatolva nyomja vagy infiltrálja a környezo képleteket. Elorehaladott állapotban a fájdalom csillapíthatatlanná válik. A duzzanat a tumor terjedését jelenti a környezo szövetek felé. Konzisztenciája a daganat tumor-csontképzo intenzitásától függ. A duzzanat felett a bor meleg tapintatú, különösen, ha a tumor terjedelmes és konzisztenciája puha. Elofordulhat hogy a bor a tumor fölött feszes és fénylo. A daganat felett gyakran látható tágult, subcutan vénás hálózat arra mutat, hogy a daganat a corticalist áttörve, a mélyebb vénák nyomásával pangást okoz. A mozgáskorlátozottság a fájdalom és a tumor növekedésének következménye. Ritkán számolnak be a betegek fogyásról, szintén nem gyakori a nagy destrukció miatt, elorehaladott stádiumban az érintett csont patológiás törése (1%). 20 7

8 Bevezetés Laboratóriumi vizsgálatok A laboratóriumi vizsgálatok gyorsult vörösvértest-süllyedést mutatnak, az esetek 50%- ában emelkedik a szérum alkalikus foszfatáz értéke is, a kórosan fokozott osteoblastaktivitás következtében. Ez a vizsgálat jó indikátora a kezelés hatásosságának és a metasztázisok jelentkezésének is: normál alkalikus foszfatáz érték a mutét után, a mutét jó eredményét mutatja, de ismételt emelkedése gyakran elobb figyelmeztet metasztázisképzodésre, mint a mellkas röntgen vizsgálata. 21 Osteosarcománál alkalikus foszfatáz a tumorszövetben is található. Ugyancsak gyakran emelkedett értékeket mutat a szérumelektroforézis alfa-2-globulin frakciója is Radiológiai vizsgálatok Az osteosarcoma röntgen megjelenése a daganatsejtek érettségi fokától függoen igen változatos: a sclerotizáló formától fokozatos átmenetet találunk egészen az osteolyticus formáig. Az elso röntgen tünet legtöbbször szabálytalan szerkezetu és a tumor infiltratív terjedése miatt elmosódott szélu intraossealis laesio a hosszú csöves csont metaphysisében. Az ép kóros határ elmosódott, molyrágásszeru. Ezután gyorsan bekövetkezik a corticalis destrukció. A destrukció helyén a tumorszövet a periosteumot elemeli a csontról, és ezen a helyen a periosteum trianguláris új csont képzésével reagál (Codman féle háromszög). 20 A corticalis és az elemelt periosteum között a corticalisra meroleges, sugaras spiculumok húzodnak. A tumor exraossealis terjedését a parostealis lágyrészárnyék többlet jelzi. Nagy segítséget nyújt mind a lágyrész-, mind az intramedullaris kiterjedés megítélésében a CT- és az MR-vizsgálat. 22 A daganat kiterjedésének megállapításán túl, a megfelelo mutéti beavatkozás megtervezéséhez elengedhetetlen az érintett régió CT- és / vagy MRI-vizsgálatának elvégzése. A távoli áttétek kizárása céljából csont izotóp, valamint mellkas röntgen, illetve mellkasi CTvizsgálatok elvégzése javasolt. A laboratóriumi vizsgálatok diagnosztikus értéke osteosarcománál korlátozott értéku. A végleges diagnózist a daganatból vett szövettani mintavétel igazolja. 8

9 Bevezetés Szövettan Feltételezik, hogy az osteosarcoma mesenchymalis ossejtbol származik, amely kötoszövetté, porc- és csontszövetté képes differenciálódni, és ezeket a szöveteket az osteosarcomában - ha különbözo mértékben is - gyakran meg lehet találni. A centrális (intramedulláris) (93%) és a csont felszínén növekvo (7%) osteosarcomát különböztetik meg. A centrális további altípusai: a klasszikus (87.5%) [osteoblastos (43.75%), chondroblastos (21.875%), fibroblastos (21.875%)], a teleangiectaticus (3%), az intraossealis jól differenciált (low grade) (1.2%), és a kissejtes osteosarcoma (1.3%). A klasszikus centrális osteosarcoma a leggyakoribb típus és így a legnagyobb jelentoségu. Sajnos minden centrális osteosarcoma agresszív, kivétel a jól differenciált. Az osteosarcomák közös jellemzoje, hogy osteoid mátrixot (daganatos csontot) termelnek. A tumoros osteoid kimutatása az osteosarcoma diagnózis feltétele, ennek alapján különítheto el a csontban szintén eloforduló, de ritkább egyéb daganatoktól. A daganatot alkotó stróma rendkívül polimorf, nagy bazofil sejtmagvú, osteoblastszeru tumorsejtekbol áll. Tumoros és osteoclast típusú óriássejtek egyaránt elofordulhatnak. Számos atípusos mitózis is látható, gyakoriak a bevérzések, nekrózisok. Az egyes osteosarcomák igen eltéro mennyiségu osteoidot tartalmaznak, ami általában tumorsejtek körül, az extracelluláris térben, laza hálószeru struktúrát alkotva rakódik le. Sajnos a meglehetosen eltéro szöveti szerkezetu osteosarcomák között csekély a prognosztikai különbség Terjedés, áttétképzés Az osteosarcoma progressziója során a környezo szövetek felé közvetlen terjed (pericapsularisan, direkt articularisan), valamint hematogén úton adhat áttétet. A leggyakrabban a pulmonális metasztázisok fordulnak elo. 24 A betegek 15-20%-ában szinkron tüdo áttétet lehet kimutatni már a diagnózis idejében, 25 20%-ában multiplex metasztázis alakul ki a betegség elorehaladása során. 26 Az osteosarcoma egyéb rosszindulatú daganatokhoz képest a nyirokcsomókba ritkábban ad áttétet. Metasztázis ritkán, de elofordulhat: a májban, a vesékben, az agyban, a lágyrészekben és a szívben. 4 9

10 Bevezetés Kezelés Az elmúlt évtizedekben lényeges változás következett be az osteosarcoma diagnózisában, kezelésében, valamint a túlélési eredményekben. A kezeletlen osteosarcoma a betegek 100%-ában egy éven belül halálhoz vezet. Az 1970-es években kizárólag sebészi kezelést (radikális amputációt) alkalmaztak. A sebészi beavatkozással 15-20%-os ötéves túlélést tudtak elérni a diagnózis idejében szinkron áttétekkel nem rendelkezo betegek eseteiben. A még nem metasztatikus osteosarcomában szenvedo betegek 80%-ában az amputációt követoen 6-9 hónapon belül jelentkeztek a tüdo áttétek. 27,28 Az 1970-es évek vége felé a kemoterápia hatásosságát sikerült bizonyítani ebben a daganatos betegségben is, és egyes esetekben végtagmegtartó mutéteket kíséreltek meg. A kemoterápia alkalmazása lényeges elorelépést jelentett az osteosarcomák kezelésében, alapvetoen megváltoztatta a kezelési stratégiát, és ezzel a túlélését jelentosen fokozta. Az 1980-as évek második felétol vezették be a preoperatív és postoperatív kombinált kemoterápiát, ami az ötéves túlélést 55-75%-ra emelte a szinkron áttéteket nem kimutatható betegcsoportban. 29,30 Az összehangoltabb kemoterápiás kezelések kidolgozása, a képalkotó eljárások fejlodése, a mutéti technikák fejlesztése, a multicentrikus osteosarcoma munkacsoportok létrejötte (ortopédsebész, radiológus, patológus, onkológus), az eredményeket tovább javította, és az 1990-es évek elejére a korai, alacsony malignitású stádiumokban 75-85%-os ötéves túlélést is sikerült elérni. 31,32,33,34,35,36 A kombinációs kemoterápia alkalmazásával, az idoben felismert esetek 80-85%-ában nyílik lehetoség végtagmegtartó mutétek elvégzésére, és egyre nagyobb számban kerül sor a távoli áttétek metasztazektomiájára is. Európában a legelterjedtebb, nemzetközileg elfogadott kezelési séma, az úgynevezett COSS (Cooperative Osteosarcoma Study) protokoll. 32,33,34,37,38 Az eredmények további javítása céljából a nemzetközi munkacsoportok két újabb kezelés bevezetését tervezik, az EURAMOS (European-American Multicentric Osteosarcoma Study) protokollt, amelyben a kombinált kemoterápiát immunterápiával egészítik ki és az Euro-B.O.S.S (European Bone Over 40. Sarcoma Study) protokollt. Utóbbi egy multicentrikus prospektív study, amelyben a nagy dózisú methotrexat nem szerepel, mivel a 40 év feletti osteosarcomás betegek nehezen viselik a methotrexat súlyos mellékhatásait. 39,40 10

11 Bevezetés A kemoterápiára jól válaszoló esetek ötéves túlélése 91-95% között mozog, a kemoterápiára kevésbé reagáló daganatoknál ez mindössze 50-60%. Utóbbi betegcsoportban szignifikánsan magasabb a relapszus ráta, 28,41,42 a betegek több mint 40%-ában a betegség progrediál és halálhoz vezet a pulmonális metasztázisok kialakulása miatt. 43,44 Az osteosarcoma adverz prognosztikai faktorai: a metasztázis jelenléte a diagnózis idejében, a 40 év feletti életkor, a férfi nem, a nem végtagi lokalizáció, a tumor nagy térfogata, az emelkedett szérum laktát dehidrogenáz, alkalikus foszfatáz és a rossz hisztológiai válasz a preoperatív kemoterápiára. 45,46 Az osteosarcomás betegek szérumából kimutatott bone sialoprotein (BSP) és c-erbb2 expresszió rossz prognózisra utalhat, mivel az esetleges mikrometasztázisokat jelentheti. A c-erbb2 esetleg az osteosarcoma egy kis csoportjában terápiás célpontot is képezhet. 47 Abban a betegcsoportban, amelyben a prognosztikai faktorok alapján rosszabb kimenetelre lehet számítani még jelentosebbé válik a hatékony kemoterápia szerepe és a hatékonyságát elorejelzo faktorok keresése. Az osteosarcomában alkalmazott kemoterápia prediktív faktorai egyike a szérum TNFα szint, mivel magas értéke gyenge kemoterápiás válasszal kapcsolódik. 48 Továbbá a reduced folate carrier (RCF) protein alacsony expressziója a diagnózis idején rossz válaszreakciót eredményezett osteosarcomás betegen végzett multicentrikus tanulmány a fibroblastos típusnál, ellentétben a chondroblastos típussal, jobb kemoterápiás választ igazolt. 50 A számos kutatás ellenére a kemoterápiára adott csökkent válasz továbbra is egy meg nem oldott probléma az osteosarcomás betegekben. A neoadjuváns kemoterápiára adott hisztológiai válasz a túlélo daganatsejtek mértékétol függoen, azaz a Huvos szerinti klasszifikáció, 51 jelenleg is a legmegbízhatobb prognosztikai faktornak tekíntheto a betegségmentes túlélés megitélését illetoen. 30,52,53 A Huvos szerinti klasszifikáció hátránya azonban, hogy több hét is eltelik mire értékelhetové válik a preoperatív kemoterápiás kezelésre adott válaszreakció. 54 Klinikai vizsgálatok igazolták, hogy a kemoterápiára rosszul reagáló betegek esetében alkalmazott agresszívebb kemoterápia nem járt sikkerel, csak az amugy sem elhanyagolható mellékhatásokat tovább növelte. 30 Azon betegek esetében akik rosszul reagálnak a kemoterápiára kiemelkedo jelentoségu, olyan új biológiai faktorok meghatározása, amelyek már a diagnózis idejében, 11

12 Bevezetés megbízható információkkal szolgáltatnak a kemoterápiás választ illetoen. Ebben a betegcsoportban vállik különösen fontossá a gyógyszerek hatékonyságát meghatározó celluláris és molekuláris események megismerése. A tumoros extracelluláris mátrix lehetséges célpontot jelenthet a daganat terápiában. A közelmúltban több kutató laboratóriumban többek között a mi laboratóriumunkban is beigazolódott, hogy az extracelluláris mátrix mikrokörnyezet jelentosen módosítani képes az egészséges és a malignus sejtek fenotipusát, 55,56 a tumorsejtek szaporodását, 57 invazív és metasztatikus képességét, 56 58, 59 válaszreakcióját. valamint daganatellenes szerekkel szembeni 2.2 AZ EXTRACELLULÁRIS MÁTRIX (ECM) Az ECM szerkezete Az extracelluláris mátrix (ECM) biopolimerekbol (fehérjék, proteoglikánok, glikoproteinek) felépített hálózat, mely részt vesz a szövetek szerkezetének felépitésében. A funkcionális követelményeknek megfeleloen az ECM szerkezete nagyon eltéro lehet. Strukturális fehérjék (kollagének, elasztin), adhezív fehérjék (fibronektin, tenascin, laminin), proteoglikánok és a glükózaminoglikánok tartoznak az ECM biopolimerek családjához (2. ábra). 2. ábra. Az extracelluláris mátrix felépítése. 12

13 Bevezetés Az ECM átrendezodése Az extracelluláris mátrixot a fibroblastok, a máj csillagsejtek, a chondroblastok, az osteoblastok és az endotél sejtek termelik. A mátrix megújulása szövetenként változhat, kötoszövetben viszonylag gyors, ellentétben a csontban nagyon lassú, amelyben a kollagén életideje 10 év is lehet. A mátrix szintézis fo stimulátora a transzformáló növekedési faktor ß1 (TGF β1). Emellett más növekedési faktorok, citokinek, transzformáló növekedési faktor α (TGFα), tumor nekrózis faktor α (TNFα), epidermális növekedési faktor (EGF), bázikus fibroblast növekedési faktor (bfgf), interleukin-1 (IL-1), vérlemezke eredetu növekedési faktor (PDGF) is részt vesznek a szintézis szabályozásában, részben a mátrix fehérjék szintézisének stimulálásával, részben az ezeket termelo sejtek számának növelésével. A mátrix lebontását a proteázok, elsosorban a metalloproteinázok (MMP) végzik, ez utóbbiak fo jellemzoje, hogy katalitikus aktivitásukhoz cink szükséges az enzim aktív centrumában. Zimogén formában szekretálódnak, proteázok, vagy szerves higany vegyületek aktiválják oket. Aktiválásuk során kb. 10 kda méretu peptid hasad le. cdna szinten homológiát írtak le a különbözo csoportok között, egy vagy több ECM komponenst hasítanak. A szöveti metalloproteináz inhibitor (TIMP) gátolja oket. 60, Az ECM szerepe a szöveti muködés szabályozásában Az ECM aktív részese a szöveti muködésnek. A parenhímasejtek és az oket körülvevo ECM és stróma ökoszisztémát alkotnak, mely elengedhetetlen a differenciált és szabályozott muködéshez. Az ECM illetve annak egyes komponensei nemcsak a szövet specifikus szerkezet kialakításáért felelosek és az intercelluláris kapcsolatok megteremtésében vesznek részt, hanem újabb megfigyelések szerint; közremuködnek a sejtek proliferációjában, 62 differenciációjában, 63,64 szövetspecifikus muködésében, 65 életképességének fenntartásában 66 valamint a biokémiai és a celluláris szerkezetet szabályozó jelátvitelben. 67,68 Az ECM proteinek befolyásolhatnak egyéb biológiai folyamatokat, mint a sejtek letapadása, szétterülése, sejtpolaritása és migrációja. 69,70 Bár még csak körvonalaiban jellemezheto az ECM hatásmehanizmusa: az eddigi vizsgálatok arra utalnak, hogy az integrin rendszeren keresztül az ECM több celluláris szabályozó 13

14 Bevezetés faktor expresszióját és muködését képes megváltoztatni, mint például a ciklin függo kinázokat és azok gátlóit valamint a tumor szupresszor proteineket. 71, A tumoros ECM szerepe a daganatok progressziójában Az ECM sejt interakció eltérése több kóros állapot, így a malignus transzformáció és progresszió jellemzoje. Megállapítást nyert, hogy az ECM sejt kölcsönhatás jelentosen módosul a malignus transzformációt követoen, melynek következtében megváltozik a differenciált szövetek háromdimenziós szerkezete. 73 Számos vizsgálati eredmény alapján megállapítható, hogy a tumorsejt egyfelol az ECM-ben raktározott növekedési faktorokat hasznosítja, másfelol a metasztatizáló növekedés igényének megfeleloen alakítja át az ECM-et tumoros extracelluláris mátrixszá. 74 Ennek ellenére, a megváltozott mennyiségu és összetételu tumoros ECM továbbra is felügyeli a sejt muködését. 75,76 A daganatsejtek úgynevezett "neostrómát" termelnek, vagy olyan mediátorokat szintetizálnak, melyek a stróma nem tumoros sejtjeit mátrixtermelésre serkentik. A daganatsejtek növekedésük és terjedésük során a már meglévo strómát lebontják. A daganatok strómája eltér a kiindulási szövetben található strómától. A proteoglikán és a fibronektin depozíció a tumoros strómában gyakori. 77 Struktúrfehérjék, mint a kollagének és elasztin, valamint adhezív és antiadhezív molekulák, mint a laminin, fibronektin, entaktin, tenascin és a proteoglikánok egyaránt kimutathatók a daganatos strómában. 78 A stróma sejtes elemei és a mátrixban található fehérjék egyaránt befolyásolhatják a daganat viselkedését. 79 Szinte minden mátrixfehérje képes a sejtek biológiai viselkedésének befolyásolására. 80 Az integrinek, mint az ECM mátrixfehérje receptorai kollagént, laminint, fibronektint képesek megkötni, amelyek hatására a sejtfelszíni receptorok citoplazmatikus domain-je foszforilálódik a citoszkeleton átrendezodésével, és egyes jelátviteli intracelluláris szignál útak aktiválódnak. 81,82,83 A daganatsejt-mátrix kölcsönhatás rendkívül fontos a daganatinvázió és áttétképzés során, 84 elsosorban a mátrix degradáló enzimeknek (MMP), azok gátlóinak (TIMP), adhéziós molekuláknak, motilitási faktoroknak van szerepük. 85,86 14

15 Bevezetés A proteoglikánok A proteoglikánok (PG) típusosan sejtfelszíni és extracelluláris mátrix (ECM) fehérjék. 87,88 Egy vázfehérjébol és savas karakteru cukorláncokból, a glükózaminoglikánokból (GAG) állnak. Bár a PG-ok és a GAG-ok súlyszerint csak kis százalékát teszik ki az extracelluláris mátrixnak (4-8%), mégis képesek modulálni a sejtek közti információcserét, interakcióba lépve számos ECM és sejtfelszíni komponenssel. 89,90 Aktív szerepet játszanak az intra- és/vagy extracelluláris eseményekben. Különbözo enzimeket, szignálokat képesek kötni, aktiválni vagy inaktiválni. Részt vesznek a növekedési faktorok aktiválásában, és azok lokalizációjának meghatározásában is. 91,92,93 A magba jutó cukorláncok révén a sejtproliferáció szabályozásában is fontosak, amit alátámaszt az a megfigyelés, hogy kulcsfontosságú magi enzimek aktivitását (pl. topoizomeráz) heparinnal gátolni lehet. 94,95,96 Fontosak az extracelluláris mátrix proliferációval járó folyamatokban, sejtvándorlással kísért folyamatokban (daganatok inváziója és metasztatizálása), ott, ahol a sejt mikrokörnyezetbeli változása miatt szabályozási zavarok lépnek fel (daganatok autoregulációja). 91,97 Gyakran fordul elo a proteoglikánok, ezek közül is elsosorban a kondroitinszulfát proteoglikánok, fokozott depozíciója a daganatos mátrixban. 98 Mennyiségük akár a normális szövetben mértnek szorosa is lehet. 99 A melanómában, hepatocelluláris carcinomában, veserákban a heparánszulfát proteoglikánok is felszaporodnak. 100? tumorsejtek termelhetnek olyan fehérjéket, melyeket az ép sejt nem szintetizál. A májrákokban megfigyelt heparánszulfát fokozódás elsosorban a perlekán cukorláncait reprezentálja, de az újabb vizsgálatok szerint az agrin a másik heparánszulfát cukorláncú proteoglikán, ami jellemzo a májtumorra. 99,101 Agrint más daganatban még nem detektáltak. Mindezek alapján látható, hogy a daganatos ECM egyik meghatározó komponense a perlekán, illetve az agrin. Az utóbbi évek számos olyan ismeretet halmoztak fel, amelyek alapján a proteoglikánoknak egyre nagyobb szerepet lehet tulajdonítani a daganat progressziójában. 15

16 Célkituzések 3 CÉLKITUZÉSEK Az osteosarcoma kezelésében elért jelentos eredmények ellenére, marad egy betegcsoport akinél nem, vagy kevésbé lehet terápiás választ elérni a jelenlegi kemoterápiás szerek alkalmazásával. A kezelési eredmények további fokozása olyan daganat elleni vegyületektol várható, amelyek újabb támadási pontra irányulnak. Munkám középpontjába a human osteosarcoma sejtek és az extracelluláris mátrix kölcsönhatását helyeztem, azzal a céllal, hogy megállapítsam az extracelluláris mátrix szerepét az osteosarcoma progressziójában és citoreduktív kezeléssel szembeni válaszreakcióban. Az extracelluláris mátrix hatását a humán osteosarcomára egy háromdimenziós extracelluláris mátrix modell és egy általunk kialakított humán osteosarcoma sejtvonal segítségével vizsgáltam. Részleteiben az alábbi kérdések, feladatok kerültek megfogalmazásra: 1. Kialakítani olyan vizsgálati modellt, amely alkalmas a humán osteosarcoma preklinikai tanulmányozására. 2. Meghatározni az extracelluláris mátrix szerepét a humán osteosarcoma progressziójában. 3. Jellemezni az extracelluláris mátrix szerepét az osteosarcoma sejtek szaporodását és invazív viselkedését szabályozó mechanizmusokban. 4. Megvizsgálni az extracelluláris mátrix szerepét a human osteosarcoma citosztatikumokkal szembeni viselkedésében és válaszreakciójában. 5. Kialakítani olyan in vitro modellt, amelyben a tumorsejtek az ECM-be vándorolnak és ezáltal alkalmassá vállik a citosztatikumok proliferációt és invázió gátló hatásának az összehasonlítására. 6. Megállapítani, az extracelluláris mátrix biopolimerek közül, melyiknek van a legnagyobb mértékben szerepe az osteosarcoma sejtek agresszív viselkedésében és citosztatikumokkal szembeni eltéro válaszreakciójában. 7. Megvizsgálni, hogy az ECM biopolimer szintézisének a gátlása hasznosítható-e az osteosarcoma kemoterápia hatékonyságának a növelésében. 16

17 Anyagok és Módszerek 4 ANYAGOK ÉS MÓDSZEREK 4.1 ANYAGOK Szövettenyészeti anyagok és vegyszerek A szövettenyészeti tápfolyadék (RPMI-1640), a tripszin-edta oldat (0.5 g/l tripszin, 0.2 g/l EDTA), a penicillin, a sztreptomicin, a kollagenáz IV, a DN-áz valamint a hialuronidáz I a Sigma (Irvine, Anglia) és a Gibco BRL (Eggenstein, Németország) termékei. A gentamicin a Sanofi-Aventis (Budapest, Magyarország) terméke. A foetalis marhaszérum protein a GMK (Gödöllo, Magyarország) terméke. A nagy tisztaságú vegyszerek a Sigma (St. Louis, MO, USA), a Merck (Darmstadt, Germany) és a Boerhinger Ingelheim (Heidelberg, Németország) termékei. A diszpáz a Boehringer Mannheim-tol (Mannheim, Germany) származott. Az acridinorange-etidium-bromid és a propidium-jodid a Sigma termékei. A 20 MBq [ 14 C]-glükózamin (CBS 109 D-a) a Nen TM Life Science Products, Inc (Boston, NY, USA) terméke. A topoizomeráz enzimek a Topogen-tol (Columbus, OH, USA) származtak Antitestek és vektorok Antitestek A monoklonális anti-egér osteokalcin Dr. D. Baylink, University Loma Linda, USA ajándéka. A monoklonális anti-egér osteopontin (LF-123 klón), a poliklonális anti-nyúl dekorin IgG (LF-113 klón) és a monoklonális anti-egér kollagén-i-c-peptid Dr. L.W. Fisher, NIH, Washington, USA ajándékai. A monoklonális egér anti-humán p53 (DO-7 klón), Rb (Rb1 klón), PCNA (PC-10 klón), Ki-67 (Ki-67 klón) ellenanyagok a DAKO (Glostrup, Dánia) termékei. A monoklonális egér anti-humán integrin ß1 ellenanyag (JB1a klón) a Chemicon (Temecula, USA), a monoklonális egér anti-humán p34 cdc2 ellenanyag (Bcdc2.1 klón) a Boehringer Mannheim GmbH (Mannheim, Germany), a monoklonális egér anti-humán ciklin B1 (7A9 klón), ciklin D1 (P2D11F11 klón) ellenanyagok a Novocastra Laboratories Ltd. (Newcastle Upontyne, UK) termékei. A poliklonális nyúl anti-humán topoizomeráz II alpha ugyancsak a Novocastra Laboratories Ltd. terméke. A poliklonális humán antiszérum anti-humán topoizomeráz I (scl-70, autoimmun IgG) a Topogen-tol (Columbus, Ohio, USA) származott. A 17

18 Anyagok és Módszerek monoklonális egér anti-humán agrin (7E12 klón) Dr. Kemény Éva 27 ajándéka, a monoklonális egér anti-humán perlekán (A7L6 klón) ellenanyag a Chemicon (Temecula, USA) terméke. Másodlagos reagensek: peroxidáz jelölt anti-nyúl IgG (DAKO) és biotinált antinyúl, anti-egér IgG (Vectastain Elite ABC Kit, Vector Laboratories, USA). Egyéb reagensek: a sztreptavidin fluoreszcein az Amersham (Buckinghamshire, UK) terméke. A peroxidázzal jelölt protein a Bio-RAD (Hercules, CA, USA), az ABC (Vectastain Elite ABC) Kit a Vector Laboratories (Burlingame, CA, USA) termékei. A biotinált tiramin törzsoldatot (7 mm biotinált tiramin törzsbol 1:125 hígításban, 0.033% H 2 O 2 hozzádadásával, 10 perc, 37ºC inkubálással) Merz és munkatársai 102 leírása alapján készítettük. Elohívásra használt reagensek: Az elohívást kemilumineszcens 103 luminol (3- aminophtalhidrazid) és p-kumársav reagensek (Sigma, St. Louis, MO, USA) segítségével, vagy 3,3 -diaminobenzidin tetrahidroklorid (DAB) (Sigma, St. Louis, MO, USA) segítségével végeztük. Vektor pbr322: Promega, Madison, USA Daganatellenes gyógyszerek A methotrexat és a cisplatin a Lachema (Brno, Csehország), a maphosphamid az ASTA Medica (Budapest, Magyarország), a doxorubicin a Pfizer Kft.-tol (Budapest, Magyarország) származtak. A clodronat a Roche Kft. (Budapest, Magyarország) ajándéka volt. A topotecan a Smithkline Beecham (King of Prussia, USA) ajándéka volt, az etopozid a Bristol Myers Squibb Oncology-tól (USA) származott. 18

19 Anyagok és Módszerek 4.2 MÓDSZEREK OSCORT sejtvonal kialakítása 3. ábra. OSCORT sejtvonal kialakításának sémája Primer humán osteosarcoma 1996-ban a Semmelweis Egyetem Ortopédiai Klinikán egy 17 éves fiúgyermek bal humerus proximális metaphysisében lévo elváltozás szövettani vizsgálata primer centrális osteosarcomát igazolt. Az osteosarcoma xenograft sejtvonal kialakítása és fenntartása, a beteg írásos beleegyezésével és a Semmelweis Egyetem Etikai Bizottságának szabályai alapján történt. Az állatkísérleteket a Semmelweis Egyetem az állatkísérletekre vonatkozó 100/1999 számú szabályzata szerint végeztük. Az I. sz. Patológiai és Kísérleti Rákkutató Intézetben végzett vizsgálatokat a Budapesti Àllatorvosi Központ (eng. Száma:25-20/2001) engedélyezte és ellenorizte. 19

20 Anyagok és Módszerek HTB-2 és HTB-9 xenograftok kialakítása A szövettani mintavétel során eltávolított tumoros szövet fragmentumait immunszuppresszált CBA/CA egerekbe ültettük subcutan, a gerincoszlop két oldalán. A CBA/CA hím egerek genetikai azonosságát rendszeres bortranszplantációs teszttel ellenoriztük. A mesterséges immunszuppressziót a négyhetes állatok thymectomiájával majd hét nap múlva Gy/perc dózisú egésztest besugárzásával értük el Pickard és munkatársai 104 módszere alapján. Az állatokat légkondicionált állatházban tartottuk, 25 C homérsékleten és 55%-os relatív páratartalomnál. A daganat megeredt, a tumor szövettanilag stabilizálódott, az 50. passzázst követoen is megtartotta eredeti szövettani szerkezetét. A kialakított xenograftot HTB-2 xenograftnak neveztük el (3. ábra). A HTB-9 xenograftot a preoperatív kemoterápiát követoen, a definitív mutét során eltávolított tumorból az elobb leírtak alapján alakítottuk ki OSCORT szövettenyészeti sejtvonal kialakítása Az eredeti szövettani szerkezetét megtartó HTB-2 xenograft 3. passzázsból, OSCORT jelzéssel szövettenyészeti sejtvonalat indítottunk. A HTB-2 xenograftból 2x2x2 cm-es tumort eltávolítva, további több 0.5x0.5x0.5 mm-es nekrózis mentes fragmentumokat nyertünk. A fragmentumokat enzimatikus módszerrel emésztettünk ( g kollagenáz IV, g DN-áz, g hialuronidáz I, 10 ml RPMI-1640 tápfolyadékban) 37 C-on, 30 percig enyhe mechanikus keverés mellett. A sejteket steril gézen megszurtük, az életképességüket tripánkék kizárási teszttel 105 meghatároztuk és Buerker kamrában megszámoltuk (91% ± 2.16). A primer tenyészetbol alakítottuk ki az OSCORT sejtvonalat, amelyet 37 o C-on, 5% CO 2 atmoszférában, RPMI-1640 médiumban tartottuk fenn, 10% foetal calf szérum (FCS), penicillin (100 unit/ml médium) és sztreptomicin (100 µg/ml médium) jelenlétében. Az OSCORT sejtek kontaminációját folyamatosan ellenoriztük, és az esetenként eloforduló mycoplasma fertozést sikeresen elimináltuk OSCORT sejtvonal humán eredetének igazolása A sejtvonal humán eredetét laktátdehidrogenáz (LDH) izoenzim identifikálásával és citogenetikai vizsgálatokkal igazoltuk. 20

21 Anyagok és Módszerek Az LDH izoenzim identifikálást Montes és munkatársai 106 módszere alapján végeztük. Röviden: Frissen eltávolított egér májat, humán szívet és májat, illetve tumorszövetet folyékony nitrogénben porítottunk. Az 0.1 gr szövethez 1 ml 0.9% NaCl mm EDTA oldatot adtunk és 15 másodperc ultrahangozást követoen 4 C-on 30 percig inkubáltuk. Az inkubálást, majd a 4 C-on, rpm-el való 20 perces centrifugálást követoen, a felülúszó 40 µl-éhez 60 µl 1.7%-os folyékony agarózt adtunk és 4 C-on, 30 ma-el 3 óráig futattuk. Az izoenzimek, a reagens puffer [5 mg tetrazolium bluechloride (Sigma T 4375), 5 mg KCN, 10 mg NAD, 0.25 mg phenazin methosulfate (Sigma P 9625), 0.25 M lítium-laktát, 6 ml PBS, ph:7.6] agaróz-gélre való rétegzést követoen váltak detektálhatóvá. Citogenetikai vizsgálatok: Dr. Major Jeno az alábbiak szerint vizsgálta az OSCORT sejtek kariotípusát. Az OSCORT tenyészetben a mitózisokat 2x10-7 M kolcemiddel Gibco BRL (Eggenstein, Németország) 2 óra hosszat kezeléssel leállította, a sejteket 0.02% EDTA segítségével a felszínrol leválasztotta, és a metafázisokat 30 perces M KCl hipotonizálást követoen háromszor fixálta jéghideg jégecet, metanol (4:1) eleggyel, majd jéghideg, nedves tárgylemezre cseppentette. A levegon szárított, háromnapos preparátumokat három óra hosszat, 60 C-on ASG sávozással festette (0.3 M NaCl, 0.03 M Na-citrát, és 2.5% Giemsa, ph:6.8) Comings nyomán. 107 A kromoszómákat 100 metafázisban megszámolta, illetve a szerkezeti elváltozásokat analizálta a CNN VisualMouse (MTA-SZTAKI) számítógépes képelemzo rendszer segítségével ECM eloállítása és ECM biopolimerek izolálása ECM eloállítása EHS sarcomából (EHS-ECM) Extracelluláris mátrix izolálási forrásként az ECM-ben gazdag egér Engelbreth Holm Swarm (EHS) sarcomát 108 használtuk Kramer és munkatársai módszerét követve (EHS- ECM), 109 azonban az állatok lathyrizálása nélkül, így ezzel az izolálási módszerrel kollagén IV-et kis mennyiségben tartalmazó extraktumot kaptunk. 110 Az EHS-ECM (ECM-gél) és a kereskedelmi matrigél (Becton Dickinson, Bedford, MA, USA) SDS 21

22 Anyagok és Módszerek PAGE és immunoblot analízissel történo összehasonlítása azonos mennyiségu laminint, fibronektint, entaktint és heparánszulfát proteoglikánt mutatott ki ECM biopolimerek izolálása A laminint, entaktint és kollagén IV-et az EHS-ECM-bol izoláltuk Kleinman és munkatársai, 110 valamint Bissell és munkatársai 111 leírása alapján. A heparánszulfát proteoglikánt (HSPG), proteoglikán izolálás módszerével állítottuk elo az EHS-ECMbol Lyon és Gallagher módszere szerint. 112 A fibronektin a Sigma-tól (St. Louis, MO, USA) vettük ECM eloállítása OSCORT sejtekbol (OSCORT-ECM) Az OSCORT sejtek által termelt extracelluláris mátrix izolálását (OSCORT-ECM) Fuks és munkatársai 113 módszere szerint végeztük. Röviden: 10 6 OSCORT sejtet tenyésztettünk T-25 sejttenyészto edényben (Sarstedt, Germany) 5 ml RPMI-1640 médiumban. 96 óra múlva, a médiumot eltávolítottuk és a sejteket 0.5% Triton X 100, 20 mm NH 4 OH (ph 7.4) PBS-ben lizáltuk 3 percig. A sejtmentes OSCORT-ECM-et négyszer mostuk PBS-el, majd 10 mm EDTA-val szolubilizáltuk Sejttenyésztési és citosztatikus kezelési módszerek Sejttenyésztés ECM-gél jelenlétében Az OSCORT sejteket 24 lyukú tenyésztoedényben (Greiner, Nürtingen, Germany) inkubáltuk 48 órán át (4. ábra). A sejtek (7x10 4 sejt/cm 2 ) 48 órás szérumos médiumban történo tenyésztése alatt letapadtak és egyszeri osztódásukkal a sejtszámuk megduplázódott (14x10 4 sejt/cm 2 ). Vizsgálatainkban ezt a sejtszámot tekintettük kiindulási sejtszámnak és a negyvennyolcadik óra végét kiindulási idopontnak (0. óra). Ezt követoen a médiumot eltávolítottuk és a sejtek felére 200 µl savós médiumot, másik felére 200 µl ECM-extraktumot rétegeztünk (10 mg/ml fehérje koncentráció savós RPMI-1640-ben). Fél órás inkubáció után a gélesedett (polimerizálódott) extraktumra és a médiumot tartalmazó tenyésztoedényekbe is, még 400 µl savós médiumot adagoltunk. A sejteket, amelyekre ECM-gélt rétegeztünk a továbbiakban ECM-gélen tenyésztett sejteknek, nevezzük. A sejteket, amelyeknek csak médiumot adtunk a továbbiakban 22

23 Anyagok és Módszerek plasztik felszínen vagy monolayerben tenyésztett sejteknek nevezzük. A 24, 48, 72, 96, 120, 144, 168 órás újabb inkubációk alatt sejtproliferációt, sejtviabilitást, tumor szuppresszor és sejtciklus asszociált fehérjék expresszióját, sejtéletciklus paramétereit, topoizomerázok aktivitását, DNS fragmentációt vizsgáltunk, valamint morfológiai megfigyeléseket végeztünk. 4. ábra. Sejttenyésztési és citosztatikus kezelési módszerek sémája Sejttenyésztés ECM-gél biopolimerek jelenlétében Az extracelluláris mátrixot alkotó biopolimerek (laminin, fibronektin, entaktin, kollagén IV, heparánszulfát proteoglikán) hatását külön is vizsgáltuk az OSCORT sejtek sejtbiológiai és biokémiai viselkedésére. A biopolimereket 10 µg/ml, 50 µg/ml és 100 µg/ml fehérje koncentrációban adagoltuk. Sejtproliferációs vizsgálatainkhoz a tumorsejteket 96 lyukú tenyésztoedényben (Greiner, Nürtingen, Germany) tenyésztettük. Az OSCORT sejtek (10 4 sejt / well) 48 órás szérumos médiumban történo tenyésztése után a sejtszám megduplázódott (2x10 4 sejt/well) (kiindulási sejtszám és idopont). A médium eltávolítása után a sejtekre 200 µl médiumot, illetve 200 µl ECM biopolimereket rétegeztünk. 72 órás újabb 23

24 Anyagok és Módszerek inkubációt követoen a proliferációt a szukcinát-dehidrogenáz teszt (MTT assay) 114,115,116,117,118 segítségével értékeltük. Az ECM (EHS-ECM, OSCORT-ECM) koncentrációfüggo hatásának vizsgálatához az ECM-gélt több koncentrációban is adagoltuk (10-, 50-, 100 µg/ml) a biopolimerekkel megegyezo módon. A fehérje expressziós és aktivitás, valamint a sejtéletciklus paraméterek vizsgálataihoz a sejteket 24 lyukú tenyésztoedényben tenyésztettük az ECM-géllel végzett kísérleteinkkel hasonló módon. Ebben az esetben az ECM biopolimerek, valamint az OSCORT-ECM fehérje koncentrációja 100 µg/ml volt Citosztatikumok hatásának vizsgálata Az OSCORT sejteket a 0. órában, az osteosarcoma kezelésében használt különbözo dózisú ( µg/ml) citosztatikumokkal kezeltük [methotrexat, cisplatin, maphosphamid (4-hydroxy-cyclophosphamid, amely a cyclophosphamid aktív metabolitja és amely, aktív in vitro), doxorubicin (DOX)] 4 illetve 24 órán át mind a 24 mind a 96 lyukú tenyésztoedényekben (4. ábra). A kezelést követoen a sejteket 2x mostuk savó mentes RPMI-1640 médiummal, majd ezt követoen rétegeztük az ECMgélt, illetve az ECM biopolimereket és inkubáltuk az elobb leírt módszer alapján. Az alkalmazott citosztatikumok (a sejtnövekedés 50%-os gátlásához szükséges) IC 50 értékekeit nem lineáris közelíto görbe felvételével határoztuk meg a Dose Effect Analysis software (Elsevier Biosoft, Cambridge, UK) segítségével Sejtek izolálása a háromdimenziós tenyészetbol Az ECM-gél jelenlétében tenyésztett sejtek egy része az ECM-gélbe migrált. Az inkubálási ido végén, az ECM-gélt a sejtekkel együtt óvatosan, mechanikusan, elkülönítettük az ECM-gélbe nem migrált sejtektol (monolayer). A sejteket az ECMgélbol 20 perces, szobahomérsékleten lévo 2.5 mg/ml diszpázzal való emésztéssel választottuk el. A diszpáz az ECM-gélt emészti szabaddá téve a sejteket. A diszpázt 53.7 µmol/l EDTA-val állítottuk le, majd háromszor mostuk a sejteket PBS-el. A gél fragmentumainak eltávolítását mikroszkóppal ellenoriztük. A monolayer, plasztikon maradt sejteket, valamint a kezdettol fogva plasztik felszínen tenyésztett sejteket tripszin-edta segítségével választottuk le a felszínrol. Morfológiai és biokémiai vizsgálatokat végeztünk a plasztik felszínen tenyésztett sejtek, valamint az ECM-gél 24

25 Anyagok és Módszerek jelenlétében tenyésztett sejtek (ECM-gélbe migrált + ECM-gélbe nem-migrált). Esetenként külön vizsgáltuk a migráló és a nem-migráló sejtpopulációkat A sejtproliferáció vizsgálata A sejtproliferációt több módszerrel tanulmányoztuk. A sejteket megszámoltuk Buerker kamrában vagy az MTT teszttel határoztuk meg a sejtpopuláció nagyságát. A sejtek életképességét tripánkék kizárási teszttel, 105 állapítottuk meg, továbbá az apoptotikus, nekrotikus sejtek mennyiségét fluoreszcens mikroszkópiával (Zeiss Axiolab, Jena, Germany), acridinorange etidium-bromid kombinált festés (1 µg/ml 1 µg/ml, 2 percig) után határoztuk meg. 119 Az OSCORT sejtek repopulációs kapacitásának a tanulmányozására a plasztik felszínen és ECM-gélen történo órás tenyésztés után a sejteket plasztik felszínre vittük (7x10 4 élo sejt/well) és óráig inkubáltuk Az invazív növekedés vizsgálata in vitro Az ECM biopolimerek hatását az OSCORT sejtek invazív növekedésére háromdimenziós módszer alapján vizsgáltuk. 59 AZ OSCORT sejteket 48 órán át tenyésztettük 50 µg/ml ECM biopolimerek jelenlétében. Az inkubálást követoen a sejtekre 0.75% agaróz-gélt rétegeztünk és a sejteket tovább inkubáltuk még 24 órán át. Az ECM biopolimer hatástól függo arányban az agaróz-gélbe migrált sejteket óvatosan, mechanikusan eltávolítottuk a monolayerben maradt, nem-migrált sejtektol. Mindkét sejtcsoportban, a tripszin-edta kezelést és PBS-el való mosást követoen, sejtszámolást végeztünk Buerker hemocitométerben Morfológiai vizsgálatok Citológiai vizsgálatok A sejteket 235 g-vel szobahomérsékleten centrifugáltuk 10 percig Haereus kilendülorotoros centrifugában. A sejtüledéket PBS-ben szuszpendáltuk fel [170 mm NaCl, 2 mm KCl, 1.8 mm KH 2 PO 4, 5.9 mm Na 2 (HPO 4 ) 2, ph:7.4], 10 6 sejt/ml PBS denzitásban. A mintákat 100 µl sejtszuszpenziónként (10 5 sejt) Shandon citospin segítségével

26 Anyagok és Módszerek rpm-el 5 percig tárgylemezre centrifugáltuk. A citospin keneteket vagy hematoxilineozinnal (HE) festettük, a standard festési és víztelenítési protokoll szerint, vagy immuncitokémiai vizsgálatokat végeztünk. Ezzel a módszerrel az elpusztult vagy szétesett sejteket is megfigyelhettük, teljes képet kapva a bekövetkezett morfológiai változásokról Sejtéletciklus vizsgálata Az OSCORT sejteket 235 g-vel szobahomérsékleten centrifugáltuk 10 percig Haereus kilendülo-rotoros centrifugában, majd PBS-ben szuszpendáltuk, 10 6 sejt/ml PBS denzitásban, újra 235 g-vel 10 percig szobahomérsékleten centrifugáltuk, majd C + T pufferben [0.1% citrát, 0.1% triton X-100, 0.05 mg/ml RN-áz, ph:7.3] vettük fel oket, az elozonek megfelelo denzitásban. Az áramlási citometriás méréseket, az elokészítést követoen 24 órán belül végeztük el. Az áramlási citometriás elemzés elott a sejteket 50 µg/ml koncenrációban propidiumjodiddal festettük 20 percig. Az adatok felvétele FACSScan flow citométer készülékkel történt (Becton Dickinson Immunocytometry Systems, San Jose, CA, USA), propidium-jodid fluoreszcencia jelt, valamint forward és side scatter paramétereket vettük fel. A sejtciklus elemzést Robinovitch-féle Multicycle (Phoenix Flow Systems Inc., San Diego, CA, USA) szoftverrel végeztük Immunhisztokémia és immuncitokémia Immunhisztokémia Az osteosarcoma molekuláris markereinek kimutatását Dr. Battmann A. Laboratoriumával (Institute of Pathology, Klinikum of Justus-Liebig-University, Giessen, Germany) eggyüttmuködve végeztük el. Immunhisztokémiára 5 µm vastag fagyasztott mintákat készítettünk kriosztáttal, majd metanolban (10 perc) és acetonban (10 másodperc) -20 ºC-on fixáltuk. A formalinban fixált, paraffinba ágyazott anyagok antigén feltárása a deparaffinálást követoen részben proteáz emésztéssel történt (0.01% tripszin a dekorin antitestnél, 10 perc 37ºC). A dekorinnál a proteáz emésztést megelozoen mikrohullámos antigén feltáró kezelés volt szükséges (0.01 M ph:4.0 citrát pufferben forraltuk a mintákat 3x5 percen keresztül). Ezt követoen az endogén 26

27 Anyagok és Módszerek peroxidázt 10% H 2 O 2 -t tartalmazó metanollal blokkoltuk. Az antitest aspecifikus kötodését 5% BSA inkubálással eloztük meg (60 perc, 37ºC). Az elsodleges antitesteket az alábbi hígításokban használtuk: monoklonális anti-egér osteokalcin 1:800, monoklonális anti-egér osteopontin 1:100, poliklonális anti-nyúl dekorin IgG 1:2000, monoklonális anti-egér kollagén-i-c-peptid 1:200. Másodlagos antitestként peroxidáz jelölt anti-nyúl IgG-t (DAKO) és biotinált anti-nyúl, anti egér IgG-t (Vectastain Elite ABC Kit, Vector Laboratories, USA) használtunk 1:200 hígításban, 30 percig 37ºC-on. Biotinált másodlagos antitestnél ezt ABC inkubálás (45 perc 37ºC-on) követte. Az immunreakció érzékenységét biotinált tiraminnal fokoztuk. Ismételt ABC reakció után az immunreakciót 0.05 mg/ml DAB kromogénnel hívtuk elo. A háttérfestés hematoxilinnel történt Immuncitokémia A citospin keneteket metanol-aceton módszerrel fixáltuk (15 perc metanol 20 C-on, 3 másodperc aceton), majd egy éjszakán át blokkoltuk 5% marha szérumalbumin PBS oldattal, amely 0.5% Triton X-100 és 20 mm NH 4 OH-t tartalmazott (ph:6.5). Másnap primer anti-p53 ellenanyaggal 1:200 hígításban, anti-topoizomeráz II esetén 1:200 hígításban reagáltattuk a keneteket 4 o C-on egy éjszakán át. A primer antitestek reakcióit a Vector biotinált univerzális másodlagos antitestével, majd sztreptavidin-fluoreszcein 1:200 hígításával mutattuk ki. A sztreptavidin-fluoreszcein oldat 2 µg/ml propidiumjodidot tartalmazott a sejtmagok kimutatása céljából. A FITC-propidium-jodid tartalmú oldattal történt elohívást mosási lépések követték, a vizsgálandó citospin mintákat citifluorral fedtük és BioRad MRC 1024 konfokális lézer scanning mikroszkóppal vizsgáltuk (Bio-Rad, Hercules, CA, USA), a piros és zöld fluoreszcens képeket és a fáziskontraszt képet is felvettük Biokémiai vizsgálatok Sejtmagizolálás, sejtmagi és citoplazmatikus fehérjék eloállítása A sejtmagi fehérjekivonatokat a szövettenyészeti sejtekbol Duguet és munkatársai 120 módszere szerint állítottuk elo, Sullivan és munkatársai 121 módosításával. Röviden: Potter homogenizátorban a sejteket hipotóniás oldatban homogenizáltunk, amit a sejtmagok 2000 g-vel, 10 percen át, 4ºC-os centrifugálása követett. A felülúszót 27

28 Anyagok és Módszerek citoplazma extraktként használtunk. A sejtmagi frakciót továbbiakban szacharóz grádiensen tisztítottuk, ezt követoen a 0.35 M NaCl-ban oldható magi fehérjéket a DNS-hiszton komplextol g-vel, 4ºC-on, 30 percig történt centrifugálással választottuk el Fehérjek azonosítása immunblot technikával Az OSCORT sejtekbol homogenátumokat készítettünk, amikbol Bradford módszerrel 122 fehérje meghatározást végeztünk. A minták 5 µg fehérjetartalmú teljes sejt eredetu aliquotjait, vagy 10 5 sejtszámra vonatkozó sejtmagi és citoplazma extraktumait Laemlioldattal 123 egészítettük ki, és 10%-os standard poliakrilamid gélen futtattuk meg a Bio Rad MINI Protean II akrilamid gélelektroforézis rendszer segítségével. 124 Proteoglikánok esetén 10 µg fehérje tartalmú EHS-ECM-bol izolált proteoglikánt, valamint 10 µg fehérje tartalmú OSCORT-ECM-et futtattunk meg 4-15% poliakrilamid tartalmú grádiens géleken. Az elektroforézis 35 percig 25 ma/gél áramerosséggel történt. A géleket elektroforézis után: Coomassie Brilliant Blue R250-el festettük, illetve proteoglikánok esetén Alciánkékkel és utána Coomassie-val festettük, vagy tovább blottoltuk. A poliakrilamid gélen elválasztott fehérjéket elektrotranszferrel nitrocellulóz membránra (Bio Rad, Hercules, CA, USA) vagy Millipore (Billerica, MA USA) PVDF membránra blottoltuk. A blottolás 330 ma rel 90 percig tartó elektrotranszferrel történt. Az antigén-antitest reakciót peroxidázzal jelölt másodlagos antitesttel, illetve a topoizomeráz I esetén peroxidáz jelölt protein A reagenssel kiviteleztük. A legtöbb esetben azonban a biotinált tiraminos erosítéses Vectastain Kit alapú módszert alkalmaztuk. 102 Az elohívást kemilumineszcens luminol és p-kumársav reagensek segítségével, vagy DAB kromogénnel végeztük. A kiértékelést Stratagene Eagle-Eye II videodenzitométer képanalizátorral (Stratagene, Gebouw, CA, USA) végeztük. Primer antitest reakciók Anti-humán p53, egér monoklonális: 1:1000, 18 órai reakció, elohívás: Vector ABC Kit, tiramin erosítés. Anti-humán Rb, egér monoklonális: 1:300, 18 órai reakció, elohívás: Vector ABC Kit, tiramin erosítés. 28

29 Anyagok és Módszerek Anti-humán PCNA, egér monoklonális: 1:500, 18 órai reakció, elohívás: Vector ABC Kit, tiramin erosítés. Anti-humán Ki-67, egér monoklonális: 1:500, 18 órai reakció, elohívás: Vector ABC Kit, tiramin erosítés. Anti-humán integrin ß1, egér monoklonális: 1:300, 18 órai reakció, elohívás: Vector ABC Kit, tiramin erosítés. Anti-humán p34 cdc2, egér monoklonális: 1:300, 18 órai reakció, elohívás: Vector ABC Kit, tiramin erosítés. Anti-humán ciklin B1, egér monoklonális: 1:300, 18 órai reakció, elohívás: Vector ABC Kit, tiramin erosítés. Anti-humán ciklin D1, egér monoklonális: 1:200, 18 órai reakció, elohívás: Vector ABC Kit, tiramin erosítés. Anti-humán topoizomeráz II alpha, nyúl poliklonális: 1:200, 18 órai reakció, elohívás: Vector ABC Kit, tiramin erosítés. Anti-humán topoizomeráz I, humán (scl-70, autoimmun IgG) poliklonális: 1:5000, 18 órai reakció, elohívás: 3000x hígított peroxidáz jelölt protein A-val. Anti-humán agrin, egér monoklonális: 1:500, 18 órai, elohívás: Vector ABC Kit, tiramin erosítés. Anti-humán perlekán, egér monoklonális: 1:500, 18 órai reakció, elohívás: Vector ABC Kit, tiramin erosítés. Tiramin erosítéses elohívás A primer antitest reakciók után a membránokat mostuk, majd amennyiben a primer ellenanyag nyúlban termelt poliklonális vagy egér monoklonális volt, a Vector univerzális biotinált antitestét alkalmaztuk 200x hígításban, 45 percig szobahomérsékleten. Mosás után az elore elkészített ABC reagenst raktuk a filterekre 30 percre az A és a B biopolimert 200x hígítva TBS-ben (20 mm TRIS HCl, 150 mm NaCl, ph:7.5). Az inkubálás után megoriztük az ABC reagenst. Ezután újabb mosás következett, majd 10 percre a tiramin reagenst raktuk a filterre szobahomérsékleten (8 µl biotinált tiramin törzs 900 µl TBS-ben µl 0.3%-os H 2 O 2 ). Újabb mosás után ismét 30 percre a megorzött ABC reagenst alkalmaztuk. Az elohívás: 0.05% DAB, 0.03% H 2 O 2 tartalmú 0.1 M (ph: 7.1) Tris HCl-ban történt. 29

30 Anyagok és Módszerek Topoizomeráz aktivitások vizsgálata 99 Relaxáció és dekatenáció 2.5x10 4 OSCORT sejtbol izoláltunk magi extraktumokat topoizomeráz I és II aktivitás meghatározáshoz. A topoizomeráz I enzim katalitikus aktivitását plazmid relaxációs módszerrel vizsgáltuk. 125,126 Röviden: A magi extraktumokat 500 ng szuperhélix pbr322 plazmiddal 37ºC-on 30 percig 20 µl standard ATP mentes relaxációs pufferben inkubáltuk [50 mm Tris HCl (ph:7.5), 150 mm KCl, 10 mm MgCl 2, 0.5 mm ditiotreitol, 0.5 mm EDTA, 0.03 mg/ml marha szérumalbumin], majd a reakcióhoz 1 mg/ml végkoncentrációjú proteináz K-t és 3% SDS-t adtunk, és 30 percig 50 ºC-on inkubáltuk. A reakciótermékeket 16 órán át 1%-os agaróz gélen 0.5x TBE pufferben [89 mm Tris-borat, 2 mm EDTA (ph:8.3)], 24 V-on elektroforetizáltuk. A topoizomeráz II aktivitást kinetoplaszt DNS dekatenációjának mértékével határoztuk meg, amihez a következö reakciópuffert [50 mm Tris HCl (ph:7.5), 85 mm KCl, 10 mm MgCl 2, 0.5 mm ditiotreitol, 0.5 mm EDTA, 0.03 mg/ml marha szérumalbumin, 1 mm ATP] használtuk, reakciószubsztrát-ként 200 ng kdns-t használtuk, illetve a reakciópuffer tartalmazott végkoncentrációban ATP-t is. 127 A reakciótermékeket 4 órán át 1%-os agaróz gélen 0.5x TBE pufferben, 35 V-al elektroforetizáltuk. Az elektroforézist követoen mindkét esetben a géleket 1 µg/ml etidium-bromiddal festettük és differenciáltuk vízben. A kiértékelést Stratagene Eagle-Eye II videodenzitométer képanalizátorral (Stratagene, Gebouw, CA, USA) végeztük. pbr322 végjelzése A Topo I és II hasítási komplexeinek kimutatására linearizált pbr322 plazmidon a 32 P datp végjelzést hajtottunk végre Klenow DNS polimeráz segítségével. Ehhez eloször Eco RI restrikciós endonukleázzal emésztettük a plazmidot. Az enzim által kialakult ragadós végeket Klenow DNS polimeráz segítségével töltöttük fel (Promega, Madison, WI, USA) a 32 P datp-t használva. 126 A polimeráz reakció 15 percig zajlott 30ºC-on, majd 10 perc 75ºC-on történt inkubálással állítottuk le. A be nem épült nukleotidokat Sephadex G50 (Pharmacia) oszlop segítségével, gélszuréssel választottuk el a beépültektol. Ezt BamH1 (Promega) restrikciós enzimmel történt emésztés követte, az 30

31 Anyagok és Módszerek egyik vég jelzésének eltávolítása céljából. A jelzés után a µl plazmid oldat aktivitása cpm/µl volt, és közvetlenül lehetett használni a cleavage reakciókhoz. Hasítási (Cleavage) reakciók 6000 cpm/reakció aktivitású végjelzett, emésztett plazmidot magi extraktummal inkubáltuk unkompetitív gátlók, topoizomeráz I vizsgálata esetén topotecan, topoizomeráz II esetén etopozid és ATP jelenlétében 15 percig, 37ºC-on. A reakciót követoen a mintákat 1 µg/µl proteináz K-val emésztettük 0.5 vegyes % SDS jelenlétében. A topoizomeráz I specifikus hasítás vizsgálata esetén futtatás elott a mintákat NaOH-dal denaturáltuk, majd 0.1% SDS-0.5x TBE futtatópufferben, 1% agaróz gélen, topoizomeráz II specifikus hasítás vizsgálata esetén szokványos 0.5x TBE futtatópufferben futattuk. A mintákat 2 V/cm feszültséggel órán át futtattuk, majd a gélt Shandon Speedvac-hoz kapcsolt gélszárítóval szárítottuk. A reakció során keletkezett DNS fragmenteket Kodak X-Omat (Rochester, NY, USA) röntgen film expozícióval mutattuk ki Metalloproteináz (zselatináz) aktivitás vizsgálata A metalloproteináz (zselatináz) izoenzimek kimutatását Heussen és munkatársa, 128 valamint Yamagata és munkatársai közleményei alapján, 129 zselatin zymogram módszer segítségével vizsgáltuk. Röviden: 10 5 OSCORT sejt szérum mentes médiumát koncentráltuk Centricon 31 filteren (Amicon, Millipore, Bedford, MA, USA) keresztül és 2-mercaptoetanolt nem tartalmazó Laemli-oldatban szuszpendáltuk. A 0.75 mm vastag, 0.1% SDS és 300 µg/ml zselatin tartalmú 10%-os poliakrilamid gélen való futtatást követoen, az SDS-t 2.5%-os Triton-X 100 oldattal távolítottuk el. Az enzimreakcióhoz a gélt 10 mm CaCl 2 -ot, 0.02% NaN 3 -t tartalmazó 50 mm-os Tris-HCl (ph:7.4) pufferben inkubáltuk 20 órán át 37 o C-on. A zselatinbontó aktivitás kimutatásához 0.2% Coomassie Brilliant Blue R250, 50% metanol, 10% ecetsav tartalmú oldatban festettük a géleket, ami egyben az enzimreakciót is leállította, majd a festést 20% metanolt és 10% ecetsavat tartalmazó oldattal differenciáltuk. A zselatint bontó enzimaktivitás áttetszo csíkként jelent meg a Coomassie R250-nel megfestett gél kék hátterében. A zselatináz zimográfia segítségével az MMP-2 (zselatináz A, 72 kda kollagenáz IV) és az MMP-9 (zselatináz B, 92 kda kollagenáz IV) aktivitásokat detektáltunk. A 31

32 Anyagok és Módszerek kiértékelést Stratagene Eagle-Eye II videodenzitométer képanalizátorral (Stratagene, Gebouw, CA, USA) végeztük A doxorubicin DNS károsító hatásának vizsgálata A doxorubicinnel való kezelést követo 4. és 72. órás tenyésztési ido letelte után DNS károsítást vizsgáltunk agaróz gélelektroforézis és egy-sejt agaróz gélelektroforézis (comet assay) technikákkal. Agaróz gélelektroforézis DNS fragmentek kimutatására A sejteket lecentrifugáltuk, majd 10 5 sejtenként 10 µl lízis pufferben (5 mm TRIS-HCl, 2 mm EDTA, 0.05% Triton X-100, ph:8.0) vettük fel és 30 percig jégen lizáltuk. A sejtlízist követoen g, 4 o C-on, 30 percig tartó centrifugálás után a fragment DNS-t tartalmazó felülúszót és a nem fragmentált, kromatint tartalmazó csapadékot különválasztottuk és a DNS tartalmat Hoechst festéssel fluoriméteren (DNA Quant. 2OOO fluorimeter, Hoefer) határoztuk meg. A DNS méréshez a csapadékot 1x TBE pufferben (TBE: 10.8 gr TRIS, 5.5 gr borsav, 2 mm EDTA, ph:8.0) vettük fel, majd 15 másodpercen keresztül ultrahangoztuk Braun ultrahang készülékkel. 130 A Hoechst-tel történo DNS meghatározáshoz 131 minta 20 µl-es aliquotját hozzáadtuk 2 ml Hoechst pufferhez (0.2 M NaCl, 1 mm TRIS-HCl, 1 mm EDTA, ph:7.4), amely 1 µl festék / 1ml puffer arányban tartalmazza a Hoechst festéket (Sigma, Németország), majd 15 másodpercen keresztül ultrahangoztuk Braun ultrahang készülékkel és a 15 perces sötétben való tartás után DNS tartalmat mértünk fluoriméterrel. A fragment DNS minták 25 µl-t, 1 mg/ml végkoncentrációjú proteináz K és 0.1 mg/ml végkoncentrációjú RN-áz-al emésztettük 1-1 órát 37 o C-on és ezt követoen 5 µl mintapuffert hozzáadva (0.25% bromfenolkék, 30% glicerin, 10x TBE) 1.5%-os TBE agaróz gélen, 1x TBE futtató pufferben 50 V árameroséggel futtattuk meg. A futtatás lejárta után a gélt 1 µg/ml etidium-bromiddal 15 percig festettük és Stratagene Eagle- Eye II videodenzitométer képanalizátorral (Stratagene, Gebouw, CA, USA) értékeltük. Egy-sejt agaróz gélelektroforézis (comet assay) Az OSCORT sejteket 65 µl 1%-os alacsony olvadáspontú (LMP) agarózban (ph:7.4) szuszpendálva 37 o C-on maratott-zsírtalanított felszínu üveg tárgylemezre pipettáztuk, 32

33 Anyagok és Módszerek amelyet elozoleg 1% normál olvadáspontú (NMP) agarózzal fedtünk. Az agarózt 10 percig 4 o C-on tartottuk, majd a tárgylemezeket még egy réteg LMP-vel fedtük le és ismét 4 o C-ra tettük, amíg az agaróz megdermedt. Ezután a tárgylemezeket 4 o C-os lizáló pufferbe (2.5 M NaCl, 100 mm Na 2 EDTA, 10 mm TRIS-HCl, 1% Na sarcosinatot, 1%- Triton X-100, ph:10) helyeztük 60 percre, eltávolítva ezzel a sejtfehérjéket. A lízist követoen a tárgylemezeket 30 percre horizontális elektroforézis tartályba helyeztük, amely 0.3 M NaOH, 1 mm Na 2 EDTA, ph: 2.7 puffert tartalmazott, majd 25 V, 300 ma feszültséggel futtattuk 20 percig, 15 o C-on. A futtatás befejezése után a tárgylemezeket háromszor 3 percig mostuk 4 o C-os neutralizáló pufferrel (0.4 M TRIS-HCl ph:7.5) majd a 25 µl 20 µg/ml etidium-bromiddal való festést követoen fedolemezzel lefedtük. Az etidium-bromiddal megjelölt nukleuszokat Zeiss fluoreszcens mikroszkóp segítségével vizsgáltuk, a mikroszkópos képek kvantitatív kiértékelését IMAN morfometriás software program (KFKI, 1997) segítségével végeztük. 132,133,134, DNS bontó aktivitás kimutatása A 72 órás plasztikon és ECM-gélen történt tenyésztés után a már leírt módon sejtmagi extraktumot izoláltunk, és DN-áz reakciót vizsgáltunk szubsztrát poliakrilamid gélelektroforézissel valamint agaróz gélelektroforézissel. Szubsztrát poliakrilamid gélelektroforézis A minták 2 µg fehérje tartalmú részeit, 10%-os 50 µg/ml calf thymust tartalmazó poliakrilamid gélen futtattuk meg, konstans feszültségen, 200 V-on, 30 percig. Az enzim aktivitás kimutatásához a futtatás befejezése után a gélt 2.5% Triton X-100 oldattal szobahomérsékleten mostuk, majd 20 órán keresztül inkubáltuk 37 o C-on a következo oldattal: 10 mm TRIS-HCl, ph:7.4, 10 mm NaCl, 1 mm CaCl 2, 3 mm Mg 2 Cl, 0.02% NaN 3. Az inkubálás befejezése után 1 µg/ml etidium-bromid festo oldattal 30 percig festettük a gélt és az enzimemésztést UV fényben vizsgáltuk. A doxorubicinnel, illetve cisplatinnal kezelt DNS-t tartalmazó 10%-os poliakrilamid elkészítéséhez, a calf thymus DNS-t elozetesen szobahomérsékleten, 2 órán keresztül 10 µg/ml doxorubicinnel illetve cisplatinnal kezeltük. 33

34 Anyagok és Módszerek Agaróz gélelektroforézis A sejtmagi extraktumban DN-áz reakciót vizsgáltunk 200 ng kdns felhasználásával, 37 o C -on, 30 perces inkubálással. 127 Az inkubálás után a reakciót 2 µg/µl proteináz K-1% SDS adásával állítottuk le, a reakciókeverékeket 1%-os agaróz gélen vizsgáltuk 2 V/cm töltéssurusséggel, 1x TBE pufferben Proteoglikánok vizsgálata A kezelési és jelzési idok letelte után külön gyujtöttük a médiumot és a sejteket a tenyésztoedénybol. Pogány és munkatársai módszere 136 alapján proteoglikán frakciót állítottunk elo mind a médiumból, mind a sejtekbol. Proteoglikán izolálás a médiumból 4ºC-on, 48 óráig jelölt (10 µci/na 2 [ 35 S]O 4 ) konfluens tenyészet médiumát dekantáltuk, PBS-el mostuk, majd 7 M urea puffert (10 mm Tris ph:7.4, 0.5% Triton X-100, 0.5 mm N-etilmaleimid, 0.5 mm PMSF, 0.001% tripszin inhibitor, 5% Gordox) adtunk hozzá. Ezt követoen ioncserét végeztünk 0.5 ml-es DEAE-cellulóz oszlopokon, ami urea pufferrel volt ekvilibrálva. A frakciók radioaktivitását megmértük, esetenként gélelektroforézissel (SDS-PAGE) ellenoriztük. A proteoglikán frakciót abszolút alkohollal kicsaptuk, lecentrifugáltuk (Eppendorf centrifuga, rpm, 4 o C, 10 perc), 70% alkohollal mostuk és újra centrifugáltuk. Speed Vac-ban történo beszárítás után a proteoglikánt 7.5%-os vagy 3-15%-os gradiens minigélen futattuk meg. A futtatást követoen Alcián kékkel majd Coomassie-val festettük a gélt. Differenciálás és szárítás után (Savant gél dryer, 60 o C, 1-2 óra) sötétségben fluorográfiát végeztünk -80 o C-on. Proteoglikán izolálás a sejtbol Inhibitorokat (0.5 mm N-etilmaleimid, 0.5 mm PMSF, 0,001%-os tripszin inhibitor, 5%-os Gordox) tartalmazó extraháló pufferrel (4 M guanidin-hcl, 50 mm Na-acetát, 0.5% Triton X-100) távolítottuk el a sejteket a tenyésztoedényrol és 1 éjszakán át rázattuk 4 o C-on. A DNS tartalmat Hoechst festéssel fluoriméteren (DNA Quant. 2OOO fluorimeter, Hoefer) határoztuk meg. A mintát centrifugáltuk rpm-el, 4 o C-on, 20 percig, majd a felülúszót dializáltuk az extraháló pufferból a 7 M urea pufferbe. Minden alkalommal megmértük a vezetoképességet és összehasonlítottuk az eredeti 7 M urea puffer vezetoképességével. Amint az eredeti oldat vezetoképessége megegyezett a 34

35 Anyagok és Módszerek végso oldat vezetoképességével ioncserét végeztünk a proteoglikán elválasztás céljából DEAE-cellulóz oszlopon. A további lépések azonosak voltak a fent említett lépésekkel. Proteoglikán szintézis vizsgálata A plasztikon tenyésztett sejtek doxorubicinnel és clodronattal való kezelés esetén a kezelést követo 24. órában a proteoglikán szintézis vizsgálatához wellenként 16 µci [ 14 C]-glükózamint (BS 109 D-a 14 C) adtunk metabolikus jelzés céljából 24 órán át. A proteoglikán frakciók [ 14 C]-re jellemzo ß aktivitását cpm-ben mértük, de dpm-ben is meghatároztuk a Triathler Multilabel Tester (Hidex, Turku, Finnország) scintillációs fotométeren. Fehérjéhez nem kötött glükózaminoglikán (GAG) izolálása A szabad GAG izolálására, a PG izolálás elso lépésében keletkezo homogenizálópufferes felülúszót használtuk, illetve a guanidin-hcl extrahálást követo TCA-val kicsapódó üledéket. A két frakciót összekeverve 0.5 N NaOH-val β-eliminálást végeztünk 4 órán keresztül, majd 1-2 órán át 10% TCA-val kicsapást. A felülúszót dializáltuk 3 napig csapvízben, illetve egy éjszaka desztillált vízben. A következo napon egy éjszakán keresztül 0.5% cetil-piridinium-klorid (CPC) és 0.02 M Na 2 SO 4 oldattal csaptuk ki a negatív töltésu poliszacharidokat. Másnap ezeket 2 M NaCl-96% etanol 100:15 arányú elegyével oldottuk fel, majd 1% K-acetátot és 1% ecetsavat tartalmazó alkoholos kicsapással tisztítottuk tovább a GAG-ot, egy éjszakán keresztül. Mindkét kicsapást 10000g, 4 o C-os, 30 perces centrifugálás követett, és mind a CPC, mind az acetátos kicsapás után az üledéket használtuk Statisztikai analízis Az ECM-biopolimerek valamint a kezelések hatásának szignifikanciáját Student-féle t- próbával végeztük, az értékek átlagát és a mérések standard hibáját adtuk meg. Statisztikailag akkor tekintettük szignifikánsnak a különbséget, ha a p kisebb volt, mint

36 Eredmények 5.1 KLINIKAI HÁTTÉR 5 EREDMÉNYEK Tumorbiológiai vizsgálataink klinikai hátterét a Semmelweis Egyetem Ortopédiai Klinikán kezelt 17 éves fiú alkotta. Klinikai vizsgálattal a bal humerus középso harmadában, anterolaterálisan, körülírt, a csonttal összefüggonek látszó, nem mobilis, tömött tapintatú, 3x5 cm-es kiemelkedést tapasztaltunk. Felette a bor elmozdítható, reakciómentes volt. A klinikai kép alapján az osteosarcoma alapos gyanúja merült fel, ezért incisionalis biopsziára került sor július. 24-én. A biopszia, primer, centrális, magas malignitású osteosarcoma fibroblastos formáját igazolta, 20% alatti tumoros porcállománnyal (5. ábra). Osteoid 5. ábra. A biopsziás anyag szövettani hematoxilin-eozin (HE) képe A metszetekben rendkívül polimorf, sejtdús primer malignus csonttumor látható. A sejtek többnyire megnyúlt citoplazmával és maggal rendelkezo fibroblastszeru sejtek, gócokban azonban a sejtek osteoblastokra emlékeztetnek, körülöttük halvány eozinofil anyag hálózatos lerakódása (osteoid) figyelheto meg. Nagyobb nagyítással vizsgálva rendkívül sok abnormis oszló alak, tumoros óriássejt látható. 100, 200x nagyítás. 36

37 Eredmények Betegünk a COSS (Cooperative Osteosarcoma Study) protokoll alapján 9 hetes neoadjuváns kemoterápiás kezelésben részesült (Semmelweis Egyetem II. sz. Gyermekklinika). A kemoterápiát követo végtagmegtartó mutét a humerus szegmentrezekcióból, ellenoldali autológ fibula transzplantációból és Wagner készülékkel való rögzítésbol állt. A mutétet követoen 14 hetes adjuváns kemoterápiás kezelés történt. A neoadjuváns, valamint az adjuváns kezelés nagy-dózisú methotrexat, cisplatin, ifosfamid és doxorubicin kombinált adásával történt a protokoll szerint. A definitív mutét során eltávolított tumor HE-os képén, a 12 vizsgált blokk túlnyomórészén, a vitális tumorsejtek 50% feletti arányát figyeltük meg (Huvos grade I), ami az osteosarcoma kemoterápia rezisztens formáját jelentette. A neoadjuváns kemoterápiát követo Rtg felvétel is alátámasztotta az osteosarcoma kemoterápia rezisztens formáját, mivel a tumoros osteoid mineralizációja a kemoterápia során, nem következett be, az elváltozás nem vált szklerotikussá, sot a kemoterápiás kezelés alatt a folyamat tovább progrediált (6. ábra). 6. ábra. A 17 éves fiúgyermek bal oldali humerus diaphysis Röntgen felvétele. a. A diagnózis idopontjában, a neoadjuváns kemoterápia elott. b. A neoadjuváns kemoterápiát követoen, a definitív mutét elott. A röntgen képen megfigyelheto, hogy a neoadjuváns kemoterápia alatt is bekövetkezett tumoros progresszió. 37

38 Eredmények Betegünkben a diagnózist követo 5. évben a bal oldali csípocsontban, valamint a bal oldali axilláris nyirokcsomóban metasztázis volt kimutatható, és egy évvel késobb a mellkas CT már multiplex tüdo áttéteteket is igazolt. Betegünket 23 éves korában, án veszítettük el. 5.2 HUMÁN OSTEOSARCOMA SEJTVONAL (OSCORT) JELLEMZÉSE A HTB-2 xenograftból kialakított osteosarcoma sejtvonal (OSCORT) kalcitriollal való stimulálása alkalikus foszfatáz és osteokalcin termelést eredményezett HTB-2 és HTB-9 xenograftok jellemzése A xenograftok szövettani jellemzése A biopsziás anyag fragmentumaiból kialakított HTB-2, valamint a definitív mutét során eltávolított daganatból kialakított HTB-9 xenograftok az osteosarcomára jellemzo tumoros osteoid termelo képességüket több átoltás (passzázs) után is megtartották. A HTB-2 xenograft 3. passzázsát követoen készített szövettani metszeteken, kis nagyítással vizsgálva (7.a,b ábra) megállapítottuk, hogy a sejtes összetétel gyakorlatilag megegyezik a biopsziás anyag szövettani metszetén látott sejtes összetétellel. Az egyes biopolimerek aránya mérsékelten változott, egyértelmuen dominál a tumoros csonttermelés (osteoid), osteoblastszeru sejtekkel melyek a tumorállomány 60-70%-át teszik ki. Nagy nagyítással (7.c ábra) változatlanul nagy malignitást tapasztaltunk, nagy atipusos mitózisokkal és sejtmag polimorfiával. Porc irányba történo differenciálódás itt sem volt látható. 38

39 Eredmények a. b. 39

40 Eredmények c. d. 7. ábra. A HTB-2 xenograft 6. passzázs szövettani képei a., b. HE festés, 100x nagyítás, c. HE festés, 200x nagyítás, d. Gömöri festés, amely jól mutatja a tumoros osteoidot. 40

41 Eredmények A xenograftok immunhisztokémiai jellemzése A HTB-2 és HTB-9 xenograftokban kimutathatóak voltak a csontra jellemzo, vagy a csontban található, nem-kollagén és kollagén csontproteinek. Osteopontint, osteokalcint, dekorint, valamint kollagén-i-c-peptidet detektáltunk mind a két xenograftban (8., 9. ábra). A neoadjuváns kemoterápiát követoen kialakított HTB-9 xenograftban, viszont szembetuno volt az osteopontin kisebb mennyisége, ellentétben a kollagén-i-cpeptiddel, amely expressziója kifejezettebb volt. 8. ábra. A HTB-2 xenograftban található csontproteinek a. Goldner festés, b. HE festés, c. Osteokalcin, d. Dekorin, e. Osteopontin, f. Kollagén-I-cpeptid. c-f: immunhisztokémiai képek, 400x nagyítás 41

42 Eredmények 9. ábra. A HTB-9 xenograftban található csontproteinek a. Goldner festés, b. HE festés, c. Osteokalcin, d. Dekorin, e. Osteopontin, f. Kollagén-I-cpeptid. c-f: immunhisztokémiai képek, 200x nagyítás 42

43 Eredmények OSCORT humán eredetének igazolása Az OSCORT humán eredetét laktát-dehidrogenáz (LDH) izoenzimek kimutatásával, valamint citogenetikai vizsgálatokkal igazoltuk LDH izoenzimek kimutatása Az LDH izoenzimek segítségével igazoltuk a HTB-2, a HTB-9 és az OSCORT humán eredetét, hiszen szemben az egérben található 2 izoenzimmel, a xenograftokban és az OSCORT sejtekben is kimutatható volt az emberre jellemzo mind a négy LDH izoenzim (10. ábra). 10. ábra. LDH izoenzim identifikálás a HTB-2, HTB-9 és az OSCORT sejtekben a humán eredet bizonyítására Citogenetikai vizsgálatok - Kariotípus analízis A citogenetikai elemzés igazolta, hogy az OSCORT sejtek humán férfi kariotípusúak. A ploiditás szintjére vizsgált 100 metafázis kromoszóma szám eloszlását az 1. táblázat mutatja be. A mitózisonkénti átlagos kromoszóma szám (±SD) 60.54±0.38 volt, a modális 62, a középérték pedig 61 volt. Mindössze egy diploid mitózist, egy másik hipoliploid sejtet (40 kromoszómával) észleltünk. Extrém poliploidiát (azaz mitózisonként több mint 92 kromoszómát) találtunk a metafázisok 5%-ban. A 20 mintából elvégzett kariotípus vizsgálatkor legalább két analizált metafázisban 43

44 Eredmények megtaláltuk a 2, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 13, 14, 16, 17, 19, 21, és a 22. kromoszómák hiányát, illetve az 1, 2, 3, 4, 5, 9, 12, 15, 16, és a 20. kromoszómák triplodiáját. A 13., és 17. kromoszómák teljes hiányát 4, illetve 3 metafázisban, míg mindketto egyideju hiányát csak 1 metafázisban észleltük. Egy, vagy két double minute volt jelen a metafázisok 8%-ban. Számos (4-12) ismeretlen eredetu marker kromoszóma volt jelen minden analizált metafázisban, de az átrendezodések részletes lokalizációja nem volt lehetséges. Legalább két mitózisban találtuk meg az 1p-, 2q-, 6q-, 10q-, illetve a 11q+, 13p+, és 14p+ jellegu átrendezodéseket. A 13. és 17. kromoszómák hiányát 23%-ban, illetve 17%-ban lehetett megfigyelni. 1. táblázat. A kromoszóma szám eloszlása 100 vizsgált OSCORT sejtben. 5.3 ECM HATÁSA AZ OSCORT SEJTEK NÖVEKEDÉSÉRE ÉS INVAZÍVITÁSÁRA ECM és biopolimerei hatása az OSCORT sejtek növekedésére Az OSCORT sejttenyészet növekedését és életképességét monolayer kultúrában (plasztik felszín), illetve az élo szervezetet jobban megközelíto EHS-ECM jelenlétében (ECM-gél) hasonlítottuk össze. Megállapítható, hogy az ECM-gél hatására fokozódik a sejtek szaporodása, a plasztik és az ECM-gél közötti sejtproliferáció különbség a 72. órától (p < 0.05) kezdve válik egyre kifejezettebbé, mivel a gélen tartott sejtek egyre jobban szaporodnak a plasztikhoz képest (11A. ábra). Az ECM-gél hatását az MTT teszt támasztotta alá (11B. ábra). Ugyanakkor a sejtpopulációk életképessége közel egyenlo volt, % között ingadozott. Az EHS-ECM a fehérje koncentrációval egyenes arányban növelte a sejtproliferációt (12. ábra). Szolúbilis EHS-ECM 50 µg/ml koncentrációnál a hatás szignifikánsnak 44

45 Eredmények bizonyult (p<0.001). Az OSCORT sejtek által termelt extracelluláris mátrix (OSCORT- ECM) az EHS-ECM-hez hasonlóan növelte a sejtproliferációt (12. ábra). Az extracelluláris mátrix biopolimerek között a fibronektin és a heparánszulfát proteoglikán (HSPG) koncentrációfüggoen minden esetben még az ECM-gélnél is jobban növelte a sejtproliferációt (p<0.001). Ellentétben, a kollagén IV már 10 µg/ml koncentrációban szignifikáns proliferáció gátlást eredményezett (p<0.001). A laminin és az EHS-ECM-ben kis mennyiségben található entaktin, nem befolyásolta a sejtnövekedést, az MTT teszttel mért értékek közel azonosak voltak a plasztik felszínen tartott sejtekhez viszonyítva (12. ábra). 11. ábra. Az ECM-gél hatása az OSCORT sejtek proliferációjára. Az OSCORT sejteket óráig tenyésztettük plasztik felszínen, vagy ECM-gélen. A sejtpopuláció növekedését a sejtek számának meghatározásával (11A. ábra), valamint MTT technikával (11B. ábra) vizsgáltuk. A feltüntetett átlag étékek többször elvégzett vizsgálatokból származnak, amelyek egyes adatainak eltérése 20% alatt volt. 45

46 Eredmények 12. ábra. Az extracelluláris mátrix és biopolimerei hatása az OSCORT sejtek proliferációjára. A plasztik felszínen tenyésztett sejtekhez szolúbilis EHS-ECM-et, OSCORT-ECM-et, vagy ECM biopolimereket adagoltunk 10-, 50-, 100 µg/ml koncentrációban. A sejteket 72 óráig inkubáltuk, majd MTT tesztet végeztünk a sejtpopuláció nagyságának meghatározása céljából. A plasztik felszínen tartott sejtek MTT értékét tekintettük 100%-nak (horizontális tengely), az SD érték 3.77% volt. Az ábrázolt eredmények 3 független vizsgálat átlagát tükrözik ECM és biopolimerei hatása az OSCORT sejtciklusra Következokben összehasonlítottuk a plasztik felszínen és az ECM-gélben szaporodó OSCORT sejt életciklusát a tenyészet 72. órájában. A plasztik felszínen tartott OSCORT sejtek 73.4%-a G 1 -, 9.4%-a S- és 16.7%-a G 2 -fázisban volt. Az ECM-gélen tartott sejtek között a G 1 -fázisban és a G 2 /M-fázisban levok aránya lecsökkent, ugyanakkor az S-fázisban levo sejtek aránya mintegy négyszeresére emelkedett, és az S- fázison belül a sejtek eloszlása egyenletes volt (2. táblázat). A 2. táblázaton az is látható hogy, az ECM biopolimerek közül a fibronektin és a HSPG hasonló hatással volt a sejtek cikluson belüli megoszlására, mint az ECM-gél. A HSPG a plasztikon mért értéknek, több mint négyszeresére növelte az S-fázisban lévo sejtek arányát, a fibronektin hatása ennél kisebb mértéku volt. A laminin nem volt hatással a sejtek cikluson belüli eloszlására, a plasztikon mért értékekhez hasonlókat 46

47 Eredmények tapasztaltunk. A kollagén IV viszont csökkentette a G 1 - és S-fázisban lévo sejtek arányát, és csaknem négyszeresére emelte a G 2 -ben lévo sejtek arányát. Az OSCORT sejtek által termelt ECM, az ECM-gélhez hasonlóan csökkentette a G 1 - és a G 2 /M-, és növelte az S-fázisban lévo sejtek arányát. Tenyésztési körülmények Az OSCORT sejtek százalékos megoszlása G 1 S G 2 /M Plasztik ± ± ± 1.40 EHS-ECM ± ± ± 1.20 Fibronektin ± ± ± 1.34 HSPG ± ± ± 1.51 Laminin ± ± ± 1.69 Kollagén IV ± ± ± 8.4 OSCORT-ECM ± ± ± táblázat. Az OSCORT sejtek sejtciklus fázisainak megoszlása ECM és biopolimerei jelenlétében. A sejteket 72 órán át tenyésztettük ECM, illetve 100 µg/ml ECM biopolimerek jelenlétében. Az értékek átlagát valamint a ± SD értéket adtuk meg. Az eredmények 3 független vizsgálat átlagát mutatják. : Szignifikánsan különbözik a plasztikon tartott sejtek értékéhez képest (p < 0.05, Student-féle t-próbával ECM és biopolimerei hatása sejtciklushoz társult és tumor szuppresszor fehérjék expressziójára Immunoblottal, a tenyésztés 72 órájában a Rb, p53, ciklin D1, PCNA, Ki-67, ciklin B1 és cdc2 expresszióját vizsgáltuk. Megállapítottuk, hogy a 105 kda-os Rb és az 53 kda-os p53 tumorszuppresszor fehérjék expressziója csökkent az ECM-gélen tartott sejtekben. Ugyanakkor az ECM fokozta az S-fázis belépését irányító ciklin D1 (13. ábra) és a sejtproliferáció aktivitását jelzo PCNA és Ki-67 (14. ábra) expresszióját. Az egyes ECM biopolimerek eltéroen befolyásolták a sejtéletciklust szabályozó fehérjéket (13. és 15. ábra). A sejtproliferáció aktivitását jelzo, azzal kapcsolatba hozható Ki-67 expresszió emelkedett EHS-ECM, és egyes biopolimerei jelenlétében (14B. ábra). Hasonlóképpen fokozódott a PCNA expressziója is (14A. ábra). A 47

48 Eredmények sejtéletciklus DNS-t szintetizáló fázisába (az S-fázis) történo belépésben fontos szerepet játszó ciklin D1, ECM és két biopolimere a fibronektin és a HSPG jelenlétében emelkedett a plasztik felszínen tenyesztett sejtekkel összehasonlítva (13. ábra). Ugyanakkor a mitózisba belépést szabalyozó ciklin B1 kisebb mennyiségben mutatható ki a sejtproliferaciót fokozó ECM, HSPG és fibronektin jelenlétében tenyésztett sejtekben (15. ábra). Az OSCORT-ECM jelenlétében tenyésztett sejtek a 36 kda-os ciklin D1 és még inkább a p36(ciklin D1)-p34(cdk4) komplex expresszióját fokozták, a plasztikon tartott sejtekhez viszonyítva (13. ábra). A 36 kda-os PCNA expressziót nagyobb mértékben, a 48 kda-os PCNA expresszióját kisebb mértékben fokozták. A Ki-67 expresszió is magasabb volt a plasztik sejtekhez viszonyítva (14. ábra). A ciklin B1 és a cdc2 expresszióját az OSCORT-ECM jelentosen csökkentette (15. ábra). 13. ábra. ECM és biopolimerei hatása a ciklin D1, valamint a p36(ciklin D1)-p34(cdk4) komplex fehérjék expressziójára. Az OSCORT sejteket 72 órán át tenyésztettük plasztik felszínen, valamint ECM-gél (EHS- ECM), 100 µg/ml ECM biopolimerek és OSCORT-ECM jelenlétében. A fehérje expressziót 10 5 OSCORT sejtmagi extraktumából immunoblottal mutattuk ki. Az ECM-gélen tartott sejtek valamint, fibronektin, HSPG, kollagén IV, OSCORT-ECM jelenlétében tenyésztett sejtek ciklin D1, valamint a p36(ciklin D1)-p34(cdk4) komplex fehérjék expressziója szignifikánsan különbözött a plasztikon tartott sejtek ciklin D1 és p36(ciklin D1)- p34(cdk4) komplex fehérjék expressziójához képest (p < 0.05, Student-féle t-próbával). Az immunoblotok eredményét a Stratagene Eagle-Eye II videodenzitométer képanalizátorral értékeltük (Stratagene, Gebouw, CA, USA). Az értékek átlagát valamint a ± SD értéket ábrázoltuk. Az eredmények 3 független vizsgálat átlagát mutatják. 48

49 Eredmények 48 kda 36 kda 350 kda 14. ábra. ECM és biopolimerei hatása a PCNA és a Ki-67 fehérjék expressziójára. Az OSCORT sejteket 72 órán át tenyésztettük plasztik felszínen valamint ECM-gél (EHS- ECM), 100 µg/ml ECM biopolimerek és OSCORT-ECM jelenlétében. A fehérje expressziót 10 5 OSCORT sejtmagi extraktumából immunoblottal mutattuk ki. A: PCNA fehérje expressziójának kimutatása: Az ECM-gélen tartott sejtek valamint, fibronektin, HSPG, OSCORT-ECM jelenlétében tenyésztett sejtek 36 kda-os PCNA fehérje expresszió szignifikánsan különbözött a plasztikon tartott sejtek PCNA expressziójához viszonyítva (p < 0.05, Student-féle t-próbával). Az ECM-gélen tartott sejtek valamint, fibronektin, HSPG, kollagén IV, OSCORT-ECM jelenlétében tenyésztett sejtek 48 kda-os PCNA fehérje expresszió szignifikánsan különbözött a plasztikon tartott sejtek PCNA expressziójához viszonyítva (p < 0.05, Student-féle t-próbával). B: Ki-67 fehérje expressziójának kimutatása: Az ECM-gélen tartott sejtek valamint, fibronektin, HSPG, kollagén IV, OSCORT-ECM jelenlétében tenyésztett sejtek Ki-67 fehérje expresszió szignifikánsan különbözött a plasztikon tartott sejtek Ki-67 expressziójához képest (p < 0.05, Student-féle t-próbával). Plasztikon (1), ECM-gélen (2), Fibronektin (3), HSPG (4), Laminin (5), Kollagén IV (6), OSCORT sejtek által termelt ECM (OSCORT-ECM) (7) jelenlétében tenyésztett sejtek. Az immunoblotok eredményét a Stratagene Eagle-Eye II videodenzitométer képanalizátorral értékeltük. Az értékek átlagát valamint a ± SD értéket ábrázoltuk. Az eredmények 3 független vizsgálat átlagát mutatják. 49

50 Eredmények 15. ábra. ECM és biopolimerei hatása a ciklin B1 és a cdc2 fehérjék expressziójára. Az OSCORT sejteket 72 órán át tenyésztettük plasztik felszínen valamint ECM-gél, 100 µg/ml ECM biopolimerek és OSCORT-ECM jelenlétében. A fehérje expressziót 10 5 OSCORT citoplazma extraktumából immunoblottal mutattuk ki. Az ECM-gélen tartott sejtek valamint, fibronektin, HSPG, OSCORT-ECM jelenlétében tenyésztett sejtek ciklin B1 és a cdc2 fehérjék expressziója szignifikánsan különbözött a plasztikon tartott sejtek ciklin B1 és a cdc2 fehérjék expressziójához viszonyítva (p < 0.05, Student-féle t-próbával). Az immunoblotok eredményét a Stratagene Eagle-Eye II videodenzitométer képanalizátorral értékeltük. Az értékek átlagát valamint a ± SD értéket ábrázoltuk. Az eredmények 3 független vizsgálat átlagát mutatják. 50

51 Eredmények Topoizomeráz váltás ECM és biopolimerei hatására Miután megállapítottuk, hogy az ECM jelenlétében az OSCORT sejtek szaporodása fokozódik, érdeklodésünk a DNS replikációban fontos szerepet játszó topoizomerázok mükodése irányába terelodött. Arra a kérdésre kívántunk válaszolni, hogy az ECM hatására fokozódó sejtproliferáció a topoizomeráz I vagy a II aktivitás változásával hozható kapcsolatba. A monolayer-plasztik felszínen tenyésztett sejtekben (nem-migráló kompartment) jelentosen magasabb topoizomeráz I expresszió és aktivitás volt kimutatható, mint az ECM-gélben szaporodó sejtekben ( ábra). Az ECM-gélben tartott sejtekben szignifikánsan kisebb expressziót mutattunk ki az immunoblottal (18. ábra). A pbr322 hasítási reakciók alig mutattak aktivitást (17. ábra), továbbá a jóval érzékenyebb pbr322 relaxációs reakciók is rendkívül kicsi topoizomeráz I aktivitást mutattak ki az ECM-gélen tartott sejtekben (19. ábra). Ezzel szemben az ECM-gélen tenyésztett sejtek esetében jelentos topoizomeráz II expressziót és aktivitást mutattunk ki, az immunoblot, a pbr322 hasítási reakció és a kinetoplaszt DNS dekatenációs vizsgálatok során ( ábra), míg a plasztik felszínen tartott sejtekben topoizomeráz II alig volt kimutatható ( ábra). A továbbiakban az a kérdés merült fel, hogy az ECM indukált topoizomeráz II dominancia egy meghatározott subpopuláció, a migráló sejtek tulajdonsága, vagy az ECM-sejt kapcsolat következménye. Választ keresve erre a kérdésre a monolayer és az ECM-gélen tartott sejteket a tenyésztés 72. órájában plasztik felszínre transzferáltuk és ott további 7 napot tenyésztettük. Az azt követo topoizomeráz I és II aktivitás meghatározása, újból a plasztik felszínen tenyésztett sejtek topoizomeráz állapotát mutatta, túlnyomórészt a topoizomeráz I aktivitás dominanciájával (16. ábra). Az OSCORT-ECM is az ECM-gélhez hasonló módon változtatta meg a topoizomerázok egymáshoz való viszonyát (20. ábra). Az ábrák alapján megfigyelheto, hogy az alacsony topoizomeráz I és a magas topoizomeráz II a legtöbb ECM biopolimer jelenlétében is mutatkozott (18., 19. ábra). Megemlítendo azonban, hogy a laminin jelenlétében nem csökkent a topoizomeráz I expressziója és aktivitása, a fibronektin jelenlétében pedig nem emelkedett a topoizomeráz II aktivitás és expresszió. A kollagén IV és a HSPG hatására emelkedett a legnagyobb mértékben a topoizomeráz II. 51

52 Eredmények 16. ábra. Az extracelluláris mátrix hatása a topoizomeráz I és topoizomeráz II aktivitásra. A. Topoizomeráz I aktivitás szuperhélix pbr322 plazmid DNS relaxációs módszerrel kimutatva 2.5x10 4 OSCORT sejtmagi extraktumából. B. Topoizomeráz II aktivitás kdns ATP függo dekatenációs módszerrel kimutatva 2.5x10 4 OSCORT sejtmagi extraktumából. 1: Negatív kontroll, 500 ng plazmid DNS sejtmagi extraktum nélkül. 2: Pozitív kontroll 500 ng plazmid DNS 2 unit topoizomeráz I vagy II-vel (TopoGen, Columbus, Ohio, USA). 3: Topoizomeráz I (A), II (B) aktivitások 72 órát monolayerben tenyésztett OSCORT sejtekben. 4: Topoizomeráz I (A), II (B) aktivitások 72 órát ECM-gél jelenlétében tenyészett sejtekbe. 5: Topoizomeráz I (A), II (B) aktivitások 7 napos monolayer OSCORT sejtekben, amiket plasztikra transzferáltunk a 72 órás monolayerben való tenyésztést követoen. 6: Topoizomeráz I (A), II (B) aktivitások 7 napos monolayer OSCORT sejtekben, amiket plasztikra transzferáltunk a 72 órás ECM-gélben való tenyésztést követoen. MW: molekulasúly. Az ábra tipikus gél képet reprezentál, a kísérletet háromszor ismételtük egymástól függetlenül. Az eredményeket a Stratagene Eagle-Eye II videodenzitométer képanalizátorral értékeltük. 52

53 Eredmények 17. ábra. Topoizomeráz I és II specifikus hasítási aktivitás extracelluláris mátrix jelenlétében. A/1 1.sáv: 5x10 5, 72 órát plasztikon tartott OSCORT sejtbol készült magi extraktummal. A/1 2.sáv: Az 1. reakcióhoz 100 µm topotecan (TpT) adva. A/2 1.sáv: 5x órát gélen tartott OSCORT sejtbol készült magi extraktummal. A/2 2.sáv: A 3. reakcióhoz 100 µm TpT adva. B/1 1.sáv: Cleavage aktivitás plasztikon tartott 5x10 5 sejtben, doxorubicin, nélkül. B/1 2.sáv: 5x10 5 plasztikon tartott sejt cleavage aktivitása a reakcióelegyhez adott 100 µm végkoncentrációjú doxorubicin mellett. B/2 1.sáv: Cleavage aktivitás gélen tartott 5x10 5 sejtben, doxorubicin, nélkül. B/2 2.sáv: 5x10 5 gélen tartott sejt cleavage aktivitása a reakcióelegyhez adott 100 µm végkoncentrációjú doxorubicin mellett. 18. ábra. A extracelluláris mátrix és biopolimereinek hatása a topoizomerázok expressziójára. Az OSCORT sejteket 72 órán át tenyésztettük ECM és 100 µg/ml ECM biopolimerek jelenlétében OSCORT sejt sejtmag extraktumból topoizomeráz I és II fehérje expressziót vizsgáltunk Az immunoblotokat kemilumineszcens reagensekkel hívtuk elo és az eredményeket a Stratagene Eagle-Eye II videodenzitométer képanalizátorral értékeltük. 1 (Plasztik): Plasztik felszínen tenyésztett sejtek. 2 (EHS-ECM): EHS-ECM-ben tenyésztett sejtek. 3 (FN): Fibronektin. 4 (HSPG): Heparánszulfát proteoglikán. 5 (LN): Laminin. 6 (K IV): Kollagén IV. Az ábra tipikus immunoblot képet reprezentál, a kísérletet háromszor ismételtük egymástól függetlenül. 53

54 Eredmények 19. ábra. A extracelluláris mátrix és biopolimereinek hatása a topoizomerázok aktivitására. Az OSCORT sejteket 72 órán át tenyésztettük ECM és 100 µg/ml ECM biopolimerek jelenlétében. A sejtmag extraktumból topoizomeráz I és II fehérje aktivitást vizsgáltunk. Topoizomeráz I aktivitást szuperhélix pbr322 plazmid DNS relaxációs módszerrel mutattuk ki 2.5x10 4 OSCORT sejtmagi extraktumából. R: Relaxált DNS. S: Szuperhélix DNS. NK: Negatív kontroll, 500 ng plazmid DNS sejtmagi extraktum nélkül. PK: Pozitív kontroll, 500 ng plazmid DNS 2 unit topoizomeráz I (TopoGen, Columbus, Ohio, USA). 1-6: 500 ng plazmid DNS különbözo tenyésztési körülmények alatt tenyésztett OSCORT sejtmag extraktummal. Topoizomeráz II aktivitást kdns ATP függo dekatenációs módszerrel mutattuk ki 2.5x10 4 OSCORT sejtmagi extraktumából. NW: Nagy molekulatömegu összefuzött gyurus kinetoplaszt DNS. Mc: Egyes gyurus kis kör alakú DNS (Minicircles). NK: Negatív kontroll, 500 ng plazmid DNS sejtmagi extraktum nélkül. PK: Pozitív kontroll 500 ng kdns 2 unit calf thymus topoizomeráz II-vel (TopoGen, Columbus, Ohio, USA). 1-6: 500 ng kdns különbözo tenyésztési körülmények alatt tenyésztett 2.5 x 10 4 OSCORT sejtmag extraktummal. 1 (Plasztik): Plasztik felszínen tenyésztett sejtek. 2 (EHS-ECM): EHS-ECM-ben tenyésztett sejtek. 3 (FN): Fibronektin. 4 (HSPG): Heparánszulfát proteoglikán. 5 (LN): Laminin, 6 (K IV): Kollagén IV. A táblázatban a relaxált plazmid DNS/dekatenált kdns-t adtuk meg az össz DNS/kDNS függvényében. Az ábra tipikus gél képet reprezentál, a kísérletet háromszor ismételtük egymástól függetlenül. Az eredményeket a Stratagene Eagle-Eye II videodenzitométer képanalizátorral értékeltük. 54

55 Eredmények 20. ábra. Az OSCORT-ECM hatása a topoizomeráz I és topoizomeráz II expressziójára és aktivitására. Az OSCORT sejteket 72 órán át tenyésztettük 100 µg/ml OSCORT-ECM jelenlétében. A sejtmag extraktumból topoizomeráz I és II fehérje expressziót és aktivitást vizsgáltunk. Topoizomeráz I aktivitás (A) szuperhélix pbr322 plazmid DNS relaxációs módszerrel kimutatva 2.5x10 4 OSCORT sejtmagi extraktumából. R: Relaxált DNS. S: Szuperhélix DNS. NK: Negatív kontroll, 500 ng plazmid DNS sejtmagi extraktum nélkül. PK: Pozitív kontroll, 500 ng plazmid DNS 2 unit topoizomeráz I. Topoizomeráz II aktivitás (B) kdns ATP függo dekatenációs módszerrel kimutatva 2.5x10 4 OSCORT sejtmagi extraktumából. NW: Nagy molekulatömegu összefuzött gyurus kinetoplaszt DNS. Mc: egyes gyurus kis kör alakú DNS (Minicircles). NK: Negatív kontroll, 500 ng plazmid DNS sejtmagi extraktum nélkül. PK: Pozitív kontroll 500 ng kdns 2 unit calf thymus topoizomeráz II-vel OSCORT sejt, sejtmag extraktumból topoizomeráz I (C) és II fehérje expressziót (D) vizsgáltunk. Pl: Plasztik felszínen tenyésztett sejtek. O: OSCORT-ECM jelenlétében tenyésztett sejtek. Az immunoblotokat kemilumineszcens reagensekkel hívtuk elo és az eredményeket a Stratagene Eagle-Eye II videodenzitométer képanalizátorral értékeltük Nem specifikus DNS bontó aktivitás ECM hatására A topoizomeráz I és II aktivitásainak változását értékelve felvetodött az a kérdés, hogy az ECM más DNS-t hasító fehérje muködését is befolyásolni képes-e. A kérdés eldöntésére összehasonlítottuk a plasztikon és az ECM-en tenyésztett sejtek nukleáz aktivitását. 72 órán át ECM-gélen tartott sejtek magi extraktumaiban 55 kda-tömegu DNS bontó fehérjét mutattunk ki (21. ábra). A DNS bontó aktivitás a plasztikon tartott sejtek magi 55

56 Eredmények extraktumaiban nem volt kimutatható. Az ECM-gélen tartott sejtek magi extraktumaiból származó DNS bontó aktivitás nem mutatott különbséget a nem kezelt illetve a 10 µg/ml doxorubicinnel vagy 10 µg/ml cisplatinnal kezelt calf thymus DNS-re (21. ábra). A plasztikon tartott sejtekbol extrahált fehérje DN-áz aktivitás azonban csak a kezelt DNS-re jelent meg (21. ábra). Annak bizonyítására, hogy az ECM-gélen tartott OSCORT sejtek magjaiban kimutatható DNS bontó aktivitás nem szennyezésként került az ECM-gélbol a sejtekbe, megvizsgáltuk a szolubilizált ECM-gélben is a DNS bontó aktivitást. A 22. ábrában látható, hogy az ECM-gélben nincs DNS bontó aktivitás, viszont az ECM-gélen tartott sejtekben van. Megfigyelheto, hogy a kimutatott DNS bontó aktivitású fehérje meglehetosen horezisztenciájú, mert 10 perc hokezelés után csak a kisebb 0.8 µg fehérjetartalmú extraktumban csökkent az aktivitás, míg a nagyobb 2.4 µg fehérjetartalmú extraktumban nem változott az aktivitás ábra. Nem specifikus DN-áz aktivitás kimutatása. A. 1-2: DN-áz aktivitás kimutatása OSCORT sejtmagból, calf thymus DNS tartalmú poliakrilamid gélen. 72 órát plasztikon tartott sejtben (1), 72 órát ECM-gélen tartott sejtben (2), 3-4: Doxorubicinnel kezelt DNS tartalmú poliakrilamid gélen. 72 órát plasztikon tartott sejtben (3), 72 órát ECM-gélen tartott sejtben (4), 5-6: Cisplatinnal kezelt DNS tartalmú poliakrilamid gélen. 72 órát plasztikon tartott sejtben (5), 72 órát ECM-gélen tartott sejtben (6). MW: Molekulatömeg-marker. B. DN-áz aktivitás OSCORT sejtmagból, agaróz gélen, 1 kb DNS standard használatával (1), 72 órát ECM-gélen (2), és 72 órát plasztikon tartott sejtben (3). 56

57 Eredmények 22. ábra. DN-áz aktivitás kimutatása ECM-gélen tartott OSCORT sejtek magi extraktumából. 1: Negatív kontroll, kdns, 2-5: 72 órát ECM-gélen tartott sejtek DN-áz aktivitása: 0.8µg fehérjetartalmú magi extraktumban (2), 2.4µg fehérjetartalmú magi extraktumban (3), 0.8µg fehérjetartalmú magi extraktumban, hokezelve (4), 2.4 µg fehérjetartalmú magi extraktumban, hokezelve (5), 6-9: ECM-gél + kdns: 0.8µg fehérjetartalmú ECM-gélben (6), 2.4 µg fehérjetartalmú ECM-gélben (7), 0.8µg fehérjetartalmú ECM-gélben, hokezelve (8), 2.4 µg fehérjetartalmú ECM-gélben, hokezelve (9) ECM biopolimerek hatása az OSCORT sejtek migrációjára Az ECM biopolimerek hatását az OSCORT sejtek migrációjára háromdimenziós tenyészetben vizsgáltuk. 59 A 3. táblázat alapján látható, hogy a HSPG és a fibronektin 31% illetve 20%-os proliferáció fokozódást, a kollagén IV ellentétben 20%-os redukciót eredményezett az OSCORT sejtpopulációban. Tovább vizsgálva az OSCORT sejtek megoszlását a monolayerben és az agaróz gélben, megfigyelheto hogy az OSCORT sejtek migrációs készsége az ECM biopolimerek hatására fokozódott. A migráció leginkább a HSPG hatására fokozódott, de a fibronektin hatása is igen jelentosnek bizonyult. ECM biopolimerek (50 µg/ml) Kontroll Fibronektin HSPG Laminin Kollagén IV Nem-migráló kompartment ± ± ± ± ± 2.23 Sejtszám (x10 4 ) Migráló kompartment 9.29 ± ± ± ± ± 1.83 Proliferáció változás az összsejt populációban (%) 100 ± ± ± ± ± Változás a migrációs kompartmentben (%) 100 ± ± ± ± ± táblázat. Az ECM biopolimerek hatása az OSCORT sejtek agaróz gélbe való migrációjára. Az értékek átlagát valamint a ± SD értéket adtuk meg. : Szignifikánsan különbözik a plasztikon tartott sejtek értékéhez képest (p < 0.05, Student-féle t-próbával). 57

58 Eredmények ECM és biopolimerei hatása az OSCORT sejtek mátrix metalloproteináz aktivitására Megvizsgáltuk, hogy az ECM migrációt fokozó hatása kapcsolatban áll-e az MMP aktivitás emelkedésével, továbbá adatot kívántunk szerezni arról, hogy melyik zselatináz aktivitása változik ECM jelenlétében. Az extracelluláris mátrix (EHS-ECM, OSCORT-ECM) indukálta a 92 kda MMP-9 (92 kda kollagenáz IV) és aktív formájának (82 kda kollagenáz IV) termelodését (23. ábra). Figyelemre méltó, hogy a 72 kda MMP-2 (72 kda kollagenáz IV) és aktív formája (62 kda) nem volt kimutatható az OSCORT sejtekben. Az ECM biopolimerek közül a fibronektin növelte a 92 kda MMP-9 (92 kda kollagenáz IV) expresszióját, de aktivációját (82 kda kollagenáz IV) már kevésbé eredményezte. Ellenben a HSPG és a kollagén IV indukálták mind a 92 kda, mind a 82 kda MMP-9 képzodését, a laminin azonban nem indukálta az MMP-9-t. 23. ábra. MMP-9 indukció ECM és biopolimerei hatására. Az OSCORT sejteket 72 óráig tenyésztettük EHS-ECM, OSCORT-ECM és ECM biopolimerek jelenlétében. A metalloproteináz aktivitást a sejtek kondicionált médiumából mutattuk ki. Plasztik: Plasztik felszínen tartott sejtek. EHS-ECM: EHS-ECM jelenlétében tenyésztett sejtek. Fibronektin (FN), Heparánszulfát proteoglikán (HSPG), Laminin (LN), Kollagén IV (K IV): az ECM biopolimereket 100 µg/ml koncentrációban adtuk a sejttenyészethez. OSCORT- ECM: OSCORT-ECM 100 µg/ml koncentrációban. A metalloproteináz aktivitást a Stratagene Eagle-Eye II videodenzitométer képanalizátorral értékeltük. A zselatint bontó enzimaktivitás áttetszo csíkként jelent meg a megfestett gél kék hátterében. Az ábra tipikus zymogrammot reprezentál, a kísérletet háromszor ismételtük egymástól függetlenül. 58

59 Eredmények ECM és biopolimerei hatása az OSCORT sejtek ß1 integrin expressziójára A ß1 integrin egy alapveto mediátora az extracelluláris proteinek által közvetített szignáloknak. A ß1 integrin kimutatása egy szoros ECM OSCORT kapcsolatra utalhat. Immunoblottal kimutattuk, hogy az OSCORT sejtvonal termeli a 130 kda-os ß1 integrint, amelynek fehérje expressziója fokozódott az EHS-ECM és az OSCORT-ECM jelenlétében (24. ábra). Az ECM biopolimerek is növelték a fehérje expressziót, legnagyobb mértékben a HSPG, legkevésbé a kollagén IV (24. ábra). 24. ábra. ß1 integrin expresszió ECM és biopolimerei hatására. Az OSCORT sejteket 72 óráig tenyésztettük EHS-ECM, OSCORT-ECM és ECM biopolimerek jelenlétében. A fehérje expressziót 10 5 OSCORT sejt citoplazma extraktumából mutattuk ki. Plasztik: Plasztik felszínen tartott sejtek. EHS-ECM: EHS-ECM jelenlétében tenyésztett sejtek. Fibronektin (FN), Heparánszulfát proteoglikán (HSPG), Laminin (LN), Kollagén IV (K IV): az ECM biopolimereket 100 µg/ml koncentrációban adtuk a sejttenyészethez. OSCORT- ECM: OSCORT-ECM 100 µg/ml koncentrációban. Az expressziót a Stratagene Eagle-Eye II videodenzitométer képanalizátorral értékeltük. Az ábra tipikus immunoblot képet reprezentál, a kísérletet háromszor ismételtük egymástól függetlenül. 5.4 ECM HATÁSA AZ OSCORT SEJTEK DOXORUBICINNEL SZEMBENI VÁLASZREAKCIÓJÁRA ECM hatása doxorubicinnel kezelt OSCORT sejtek növekedésére Irodalmi adatok és saját elozo vizsgálataink arra utaltak, hogy a sejtek citotoxikus hatóanyagokkal szembeni védekezo képességét az ECM növelni képes. 58,59 A cisplatinnal, methotrexattal, maphosphamiddal és doxorubicinnel történo kezelést 59

60 Eredmények követoen az ECM-gélen tenyésztett, növekedési szakaszban levo tumorsejtek proliferációja magasabb volt a plasztik felszínen növekedett kezelt sejtekhez viszonyítva. Az IC 50 szignifikánsan nagyobb volt mind a négy citosztatikum esetében, ha a sejteket az ECM-gélen tartottuk. Mivel a legkifejezettebb hatáskülönbség a plasztikon, illetve az ECM-gélen tenyésztett OSCORT sejtek között a doxorubicinnel való kezelés esetében figyeltük meg, további vizsgálatainkban a doxorubicin (DOX) hatástani sajátosságát jelemeztük ECM és biopolimerei jelenlétében. A 25. ábra mutatja, a doxorubicin beáramlását az OSCORT sejtekbe, amely 30 perc alatt a sejtpopuláció egészére terjed ki. A doxorubicin transzport ECM jelenlétében bekövetkezo zavarainak az elkerülésére a plasztik felületen kezeltük az OSCORT sejteket 4 órán át. Ezt követoen rétegeztük az ECM-gélt a monolayer tenyészetre. 25. ábra. Doxorubicin a plasztik felszínen kezelt OSCORT sejtekben. A doxorubicin a kezelést követo 5. percben még nem került a sejtbe. A 30. percben azonban a fluoreszcens mikroszkóppal jól látható a doxorubicin jelenléte szinte az összes OSCORT sejtben. 60

61 Eredmények Doxorubicin kezelés hatására nagyobb sejtszám csökkenést, valamint kisebb viabilitást lehetett megfigyelni, ha a sejttenyészetre ECM-gélt rétegeztünk, a plasztik felszínen növo OSCORT tenyészethez képest (26., 27. ábra). A hatáskülönbség annál kifejezettebb volt, minél magasabb a doxorubicin kezelés dózisa, valamint minél több ideig tartott az OSCORT sejt-ecm kapcsolat, azaz minél több ideig tenyésztettük az osteosarcoma sejteket az ECM-gélen. 26. ábra. Az ECM-gél hatása a doxorubicinnel kezelt OSCORT sejtek proliferációjára. A µg/ml doxorubicin kezelés hatását vizsgáltuk az OSCORT sejtek proliferációjára A sejtproliferációt sejtszámolással vizsgáltuk. 61

62 Eredmények 27. ábra. Az ECM-gél hatása a doxorubicinnel kezelt OSCORT sejtek életképességére. Az OSCORT sejtek életképességére tripánkék kizárási teszttel és sejtszámolással vizsgáltuk. A doxorubicin kezelésre létrejövo apoptotikus válasz kisebb volt az ECM-gélen tartott sejtek esetében. A 72. órában az ECM-gélen a 0.1 µg/ml doxorubicin hatására az apoptózis harmada volt a plasztik felszínen tenyésztett sejtekhez képest, 10 µg/ml doxorubicin hatására pedig kétszer gyakoribb volt az apoptotikus sejtek száma. A hatáskülönbség annál kifejezettebb volt minél több ideig maradtak a sejtek az ECMgéllel kapcsolatban (28. ábra). 62

63 Eredmények 28. ábra. Az ECM-gél hatása a doxorubicinnel kezelt OSCORT sejtek apoptózisára. A µg/ml doxorubicin kezelés hatását az OSCORT sejtek apoptózisára acridinorange etidium-bromid jelöléssel vizsgáltuk ECM hatása doxorubicinnel kezelt OSCORT sejtek repopulációjára A következoben arra a kérdésre kívántunk választ kapni, hogy az ECM-gélnek köszönheto fokozott proliferációs kapacitás, valamint doxorubicinnel szembeni védelem tartósnak mondható-e, vagy addig tart ameddig az ECM OSCORT kapcsolat? 63

64 Eredmények 7x10 4 plasztik felszínen kezelt (4 órán át), majd plasztik felszínen vagy ECM-gél jelenlétében tenyésztett élo sejtet a tenyésztés 72. órájában plasztik felszínre vittük át és további 120 órás tenyésztés alatt, megvizsgáltuk a sejtek repopulációs kapacitását. Az ECM-gélrol származó sejtek már kezdettol fogva jobban szaporodtak a plasztikról származó sejtekhez képest. A 120. órában az ECM-gélbol a plasztik felszínre átvitt 5 µg/ml és 10 µg/ml doxorubicinnel kezelt sejtek esetében ki tudtunk mutatni élo sejteket ellentétben a plasztikról származó sejtekkel. A kezelt sejtek esetében az ECM-gélnek egy korai és egy késoi védo hatását figyeltük meg (4. táblázat). T Élo sejtszám x 10 4 (Kontroll %-a) (h) Plasztik felszínrol, plasztik felszínre transzferált sejtek ECM-gélrol, Plasztik felszínre transzferált sejtek Kontroll Kontroll µg/ml Dox µg/ml Dox ±1.2 (100) 11.96±1.3 (67) 11.1±1.9 (62) 10.8±2.0 (60) 20.0 ±2.6 (100) 14.9±2.1 (74) 13.1±1.8 (65) 11.1±1.9 (55) ±2.2 (100) 10.4±1.5 (38) 7.3±2.2 (26) 7.4±2.3 (27) 33.4±2.5 (100) 25.0±1.8 (74) 20.3±2.6 (60) 20.9±2.0 (62) ±3.2 (100) 18.3±2.4 (32) 12.8±2.4 (23) 11.3±2.3 (20) 70.3±4.1 (100) 54.9±4.3 (78) 41.9±4.0 (60) 35.3±3.7 (50) ±5.3 (100) 31.7±2.2 (28) 10.3±3.3 (9) 3.4±0.8 (3) 137.3±4.9 (100) 102.3±4.6 (74) 87.8±4.5 (63) 61.1±4.1 (44) ±5.7 (100) 27.2±3.9 (15) 7.5±3.8 (4) 0.9±0.3 (0.5) 232.5±6.1 (100) 187.6±7.2 (80) 129.0±7.1 (55) 85.7±5.5 (37) 4. táblázat. A plasztik felszínen és ECM-gélen tenyésztett OSCORT sejtek repopulációs kapacitása. T: Tenyésztési ido. Az értékek átlagát valamint a ± SD értéket adtuk meg. Az eredmények 3 független vizsgálat átlagát mutatják. : Szignifikánsan különbözik a kontroll (nem kezelt) sejtek értékéhez képest (p < 0.05, Student-féle t-próbával). 64

65 Eredmények ECM hatása doxorubicinnel kezelt OSCORT sejtek sejtciklus fázisaira Áramlási citometria segítségével vizsgáltuk az ECM-gél hatását a doxorubicinnel kezelt OSCORT sejtek sejtciklus különbözo fázisaira (29. ábra).? doxorubicin kezelés növelte az S-fázisban és csökkentette a G 1 - és G 2 -fázisban lévo sejtek arányát. A plasztikon tartott sejtek egy része a 0.5 µg/ml doxorubicin kezelést követo 72. órában a kezelés hatására az S-fázisban halmozódott fel, a G 2 -fázisban levo sejtek száma lecsökkent a kontrollhoz képest. Az ECM-gélen tartott sejtek a doxorubicin kezelés hatására hasonlóan a plasztikon tartott kezelt sejtekhez, az S-fázisban felhalmazódtak, ugyanakkor az S-fázis elején, a DNS replikáció korai szakaszában megjelent egy másik felhalmazódás is. A G 2 -fázisban ugyanannyi sejt volt, mint a kezelt plasztik esetében, de az S-fázisban még több sejt tartózkodott, mint a csak ECM-gélen kezeletlen sejtek esetében. Plasztik ECM-gél Az OSCORT sejtek százalékos megoszlása G 1 S G 2 Kontroll 73.4 ± ± ± 1.4 DOX 0.5 µg/ml 55.0 ± ± ± 2.4 Kontroll 45.9 ± ± ± 1.2 DOX 0.5 µg/ml 40.6 ± ± ± ábra. Az extracelluláris mátrix hatása a doxorubicinnel kezelt OSCORT sejtek megoszlására az életsejtciklus fázisai között. 65

66 Eredmények A sejteket a 4 órás doxorubicinnel való kezelést követoen, 72 órán át tenyésztettük plasztikon vagy ECM-gél jelenlétében. FACS képek: (1) kontroll plasztik, (2) 0.5 µg/ml DOX kezelést követo 72. órában plasztikon tartott sejtek, (3) kontroll ECM-gél, (4) 0.5 µg/ml DOX kezelést követo 72. órában ECM-gélen tartott sejtek. Az értékek átlagát valamint a ± SD értéket adtuk meg. Az eredmények 3 független vizsgálat átlagát mutatják. : Amennyiben az érték szignifikánsan különbözik a kontroll (nem kezelt) sejtek értékéhez képest (p < 0.05, Student-féle t-próbával) ECM biopolimerek hatása az OSCORT sejtek doxorubicinnel szembeni válaszreakciójára A szolúbilis EHS-ECM és hasonlóan az OSCORT sejtek által termelt extracelluláris mátrix a koncentrációjukkal egyenes arányban csökkentették a doxorubicin citotoxikus hatását (30. ábra). Azzal a kérdésünkkel kapcsolatban, hogy az ECM biopolimerek között melyik teheto felelossé a doxorubicinnel szembeni védo hatásért, megállapítottuk hogy elsosorban a heparánszulfát proteoglikán és valamivel kisebb, de még így is jelentos mértékben a fibronektin nyújtott védelmet. A laminin és az entaktin nem befolyásolta a doxorubicin citoreduktív hatását, a sejtek hasonló mértékben proliferáltak mint a plasztik felszínen tenyésztett kezelt sejtek. A kollagén IV ezzel szemben egyenesen elosegítette a doxorubicin citotoxikus hatását, a sejtek proliferációjának szignifikáns csökkenését tapasztaltuk (30. ábra). 66

67 Eredmények 30. ábra. Az ECM és biopolimereinek hatása az OSCORT sejtek növekedésére az 5 µg/ml doxorubicin kezelést követo 72. órában. a. Az ECM biopolimerek fehérje koncentrációjának összefüggése az OSCORT sejtek növekedésével a plasztik felszínen tenyésztett sejtekhez, százalékához viszonyítva. b. Az ECM biopolimerek fehérje koncentrációjának összefüggése az OSCORT sejtek növekedésével a plasztik felszínen tenyésztett sejtekhez, százalékához viszonyítva, 5 µg/ml doxorubicinnel való kezelést követoen. A sejtproliferációt MTT teszt segítségével vizsgáltuk. A sejtproliferációs értékek átlagát valamint a ± SD értéket ábrázoltuk. Az eredmények 3 független vizsgálat átlagát mutatják. 67

68 Eredmények ECM moduláló hatása a doxorubicin indukált DNS károsodásra A doxorubicinnel végzett sejt károsítást követo 72. óra után Hoechst DNS méréssel, agaróz gélelektroforézissel és egy-sejt gél elektroforézissel (comet assay) összehasonlítottuk a doxorubicin okozta DNS károsítást a plasztik felszínen, illetve az ECM-gélen tartott OSCORT sejtekben (31., 32., 33. ábra). Az ECM-gélen tenyésztett sejtek DNS károsítását Hoechst festéssel és fluorométerrel vizsgálva megállapítható, hogy a plasztikon illetve az ECM-gélen tartott kontroll sejtek spontán DNS fragmentációja közel azonos volt, ezzel ellentétben a doxorubicinnel kezelt sejteknél már szignifikáns különbséget tapasztaltunk. A plasztik felszínen tartott tumorsejtek 0.5 µg/ml doxorubicinnel való kezelése a kontroll sejtekre jellemzo DNS fragmentáció 238%-át, az 5 µg/ml doxorubicin kezelés a 244%-át érte el. Ezzel ellentétben az ECM-gélen a DNS fragmentáció kisebb mértéku volt a kontrollhoz képest (p>0.05, Student-féle t-próbával) (31. ábra). 31. ábra. A doxorubicin okozta DNS fragmentáció kimutatása Hoechst-jelöléssel 4 és 72 órával a kezelést követoen plasztik felszínen és ECM-gélen tenyésztett OSCORT sejtek esetében. Az értékek átlagát valamint a ± SD értéket adtuk meg. Az eredmények 3 független vizsgálat átlagát ábrázolják. 68

69 Eredmények A fenti eredményeket a fragmentált DNS 1 µg-jának agaróz gélelektroforetikus futtatása is alátámasztja. A doxorubicin okozta DNS károsítás már közvetlenül a 4 órás kezelést követoen megjelent, de a kezelés után 72 órával kifejezettebb volt. Az ECMgélen tartott sejtekben a DNS károsodás szignifikánsan kisebb volt a plasztikon tartott sejtekhez viszonyítva. Kiemelendo, hogy a kisebb doxorubicin dózis esetében a 4 órás károsításhoz képest kisebb DNS fragmentációt tapasztaltunk az ECM-gélen tartott sejtek esetében, ami már a repair folyamat meglétét támasztja alá az ECM-gél hatására (32. ábra). 32. ábra. A doxorubicin okozta DNS fragmentáció kimutatása 1.5%-os agaróz gélelektroforézissel 4 és 72 órával a kezelést követoen plasztik felszínen és ECM-gélen tenyésztett OSCORT sejtek esetében. (1) 4 órás Dox kezelést követoen, (2) kontroll plasztik a tenyésztés 72. órájában, (3) 0.5 µg/ml DOX kezelést követo 72. órában a plasztikon tartott sejtek, (4) 5 µg/ml DOX kezelést követo 72. órában a plasztikon tartott sejtek, (5) kontroll ECM-gél a tenyésztés 72. órájában, (6) 0.5 µg/ml DOX kezelést követo 72. órában az ECM-gélen tartott sejtek, (7) 5 µg/ml DOX kezelést követo 72. órában az ECM-gélen tartott sejtek. Az egy-sejt gélelektroforézis (comet assay) a DNS károsodást egy-sejt szinten ábrázolja. A sejtek agaróz gélelektroforézisét követoen, a DNS-t etidium-bromiddal jelöltük és fluoreszcens mikroszkóppal vizualizáltuk. A kiértékelésnél a mért paraméterek között a fejet, amely a sejtmagot, és a csóvát, amely a fragmentált DNS-t jelenti, vettük figyelembe (33. ábra). A csóva hossza, amely a maximális átmérobol a fej átmérojének a kivonatával számítható ki, arányos a fragmentált DNS méretével, hiszen 69

70 Eredmények minél kisebb a fragmentáció annál messzebbre vándorol az elektroforézis során. A csóva százalék a csóva denzitásának a totál denzitásával való elosztását majd 100-al való szorzását jelenti és arányos a fragmentált DNS mennyiségével. A csóva denzitást a fej denzitásnak a totál denzitásból való kivonásával számíthatjuk ki. A csóva momentum a csóva százalék és a csóva hosszának a szorzásából majd 100-al való elosztásával mérheto ki és arányos a fragmentált DNS-nek mind a méretével, mind a mennyiségével azaz a DNS károsodás mértékével. A sejtek DNS fragmentáció nagysága, mennyisége és összességében vett mértéke között nem tapasztaltunk szignifikáns eltérést ha a sejteket plasztik felszínen vagy ECM-gélen tartottuk. Megfigyelhetjük, hogy ellentétben a plasztikon tenyésztett sejtekkel, az ECM-gélen tartott sejtek csóva hossza, csóva denzitása és csóva momentuma kisebb, mind a 0.5 µg/ml doxorubicin mind az 5 µg/ml doxorubicin kezelés esetében. Ez alapján az ECMgélen tenyésztett doxorubicinnel károsított sejtek DNS nagysága, mennyisége és összessége szignifikánsabb kisebb volt a plasztikon tartott sejtekhez viszonyítva. Az ECM-gélen szemmel láthatóan a kezelés hatására kevesebb és nagyobb méretu sejttörmelék volt, mint a plasztikon (33. ábra). A 33. ábra a doxorubicin okozta DNS fragmentáció kimutatását egy-sejt gélelektroforézissel (comet assay) ábrázolja, 72 órával a kezelést követoen plasztik felszínen és ECM-gélen tenyésztett OSCORT sejtek esetében. A. Az etidium-bromiddal megjelölt sejtmagokat Zeiss fluoreszcens mikroszkóp segítségével vizsgáltuk. Fluoreszcens mikroszkópos képek: (1) kontroll plasztik a tenyésztés 72. órájában, (2) 0.5 µg/ml DOX kezelést követo 72. órában a plasztikon tartott sejtek, (3) 5 µg/ml DOX kezelést követo 72. órában a plasztikon tartott sejtek, (4) kontroll ECM-gél a tenyésztés 72. órájában, (5) 0.5 µg/ml DOX kezelést követo 72. órában az ECM-gélen tartott sejtek, (6) 5 µg/ml DOX kezelést követo 72. órában az ECM-gélen tartott sejtek. B. A mikroszkópos képek kvantitatív kiértékelése IMAN morfometriás software program segítségével történt. Az értékek átlagát valamint a ± SD értéket ábrázoltuk. Az eredmények 3 független vizsgálat átlagát mutatják. 70

71 Eredmények A. B. 33. ábra. A doxorubicin okozta DNS fragmentáció kimutatása egy-sejt gélelektroforézissel (comet assay). 71

72 Eredmények ECM hatása doxorubicinnel kezelt OSCORT sejtek tumor szuppresszor fehérjék expressziójára Választ keresve arra a kérdésre, hogy az ECM-gél mennyiben módosítja a prb és a p53 expresszióját, megállapítottuk, hogy az ECM-gélen tartott sejtekben mind a prb mind a p53 expresszió mértéke kisebb volt a plasztik felszínen tartott sejtekhez képest (34., 35A. ábra). Doxorubicin kezelésre a plasztikon, valamint az ECM-gélen tenyésztett sejtekben dózisfüggo prb és p53 fehérje expresszió fokozódást tapasztaltunk. Az ECMgélen tenyésztett sejtekben azonban szignifikánsan alacsonyabb volt a prb és a p53 emelkedése is (p<0.05) (34., 35A. ábra). 34. ábra. Az extracelluláris mátrix hatása az OSCORT sejtek prb expressziójára a doxorubicin kezelést követo 72 órás tenyésztési idot követoen. Az OSCORT sejteket a 4 órás 0.5 µg/ml és 5 µg/ml doxorubicin kezelést követoen 72 óráig tenyésztettük plasztik felszínen, vagy ECM-gél jelenlétében. A fehérje expressziót 10 5 OSCORT sejtbol mutattuk ki. Az expressziót a Stratagene Eagle-Eye II videodenzitométer képanalizátorral értékeltük. Az ábra tipikus immunoblot képet reprezentál. Az értékek átlagát valamint a ± SD értéket ábrázoltuk. Az eredmények 3 független vizsgálat átlagát mutatják. 72

73 Eredmények (MW) molekulasúly, (1) kontroll plasztik a tenyésztés 72. órájában, (2) 0.5 µg/ml DOX kezelést követo 72. órában a plasztikon tartott sejtek, (3) 5 µg/ml DOX kezelést követo 72. órában a plasztikon tartott sejtek, (4) kontroll ECM-gél a tenyésztés 72. órájában, (5) 0.5 µg/ml DOX kezelést követo 72. órában az ECM-gélen tartott sejtek, (6) 5 µg/ml DOX kezelést követo 72. órában az ECM-gélen tartott sejtek. 35. ábra. Az extracelluláris mátrix hatása az OSCORT sejtek p53 expressziójára a doxorubicin kezelést követo 72. órában. Az OSCORT sejteket a 4 órás 0.5 µg/ml és 5 µg/ml doxorubicin kezelést követoen 72 óráig tenyésztettük plasztik felszínen, vagy ECM-gél jelenlétében. A fehérje expressziót 10 5 OSCORT teljes sejtbol (A), illetve 10 5 OSCORT sejtmagi extraktumából (B) mutattuk ki. Az expressziót a Stratagene Eagle-Eye II videodenzitométer képanalizátorral értékeltük. Az ábra tipikus immunoblot képet reprezentál. Az értékek átlagát valamint a ± SD értéket ábrázoltuk. Az eredmények 3 független vizsgálat átlagát mutatják. A: (MW) molekulasúly, (1) kontroll plasztik a tenyésztés 72. órájában, (2) 0.5 µg/ml DOX kezelést követo 72. órában a plasztikon tartott sejtek, (3) 5 µg/ml DOX kezelést követo 72. órában a plasztikon tartott sejtek, (4) kontroll 73

74 Eredmények ECM-gél a tenyésztés 72. órájában, (5) 0.5 µg/ml DOX kezelést követo 72. órában az ECMgélen tartott sejtek, (6) 5 µg/ml DOX kezelést követo 72. órában az ECM-gélen tartott sejtek. B: (MW) molekulasúly, (1) kontroll plasztik a tenyésztés 72. órájában, (2) kontroll ECM-gél a tenyésztés 72. órájában, (3) 5 µg/ml DOX kezelést követo 72. órában a plasztikon tartott sejtek, (4) 5 µg/ml DOX kezelést követo 72. órában az ECM-gélen tartott sejtek. A p53 immunoblot vizsgálat az ECM-gélen tenyésztett sejtek magjaiban az 5 µg/ml doxorubicin kezelésre szignifikánsan kisebb p53 expresszió fokozódást mutatott (35B. ábra). A p53 immuncitokémiai vizsgálatákor jól látható, hogy az ECM-gélen tartott sejtekben ritkábban fordul elo p53 pozitivitás a plasztik felszínen tartott sejtekhez képest. Emellett a p53 csökkent indukálhatósága figyelheto meg ECM jelenlétében (36. ábra). A konfokális lézer scanning mikroszkóp alátámasztja a ritkább p53 pozitivitást az ECM-gél hatására (37. ábra). Továbbá, a plasztikon tenyésztett sejtekben az 5 µg/ml doxorubicin kezelést követo 72 óra múlva, a p53 túlnyomó része a citosztatikum hatására a citoplazmából a sejtmagba került (37. ábra). Ellenben, az ECM-gél hatására jelentosen kevesebb sejtben volt kimutatható p53 pozitivitás a sejtmagban (37. ábra). 36. ábra. p53 fehérje immuncitokémiai kimutatása doxorubicinnel kezelt OSCORT sejtekben, amelyeket, a kezelést követoen plasztikon, illetve ECM-gélen tenyésztettük. Az OSCORT sejteket a 4 órás 0.5 µg/ml és 5 µg/ml doxorubicin kezelést követoen 72 óráig tenyésztettük plasztik felszínen, vagy ECM-gél jelenlétében. (a) kontroll plasztik a tenyésztés 72. órájában, (b) 0.5 µg/ml DOX kezelést követo 72. órában a plasztikon tartott sejtek, (c) 5 µg/ml DOX kezelést követo 72. órában a plasztikon tartott sejtek, (d) kontroll ECM-gél a tenyésztés 72. órájában, (e) 0.5 µg/ml DOX kezelést követo 72. órában az ECM-gélen tartott sejtek, (f) 5 µg/ml DOX kezelést követo 72. órában az ECM-gélen tartott sejtek. 200x nagyítással, fluoreszcens mikroszkóppal készült képek. 74

75 Eredmények 37. ábra. p53 fehérje immuncitokémiai kimutatása a doxorubicinnel kezelt OSCORT sejtekben, amelyeket, a kezelést követoen plasztikon, illetve ECM-gélen tenyésztettük. Az OSCORT sejteket a 4 órás 5 µg/ml doxorubicin kezelést követoen 72 óráig tenyésztettük plasztik felszínen, vagy ECM-gél jelenlétében. A1: Kontroll plasztik. Átnézeti kép, p53 pozitivitás (zöld, vizualizálva sztreptavidin-fluoreszceinnel) a nem osztódó sejtek citoplazmájában. A2: Kontroll plasztik. p53 az osztódó sejtben (sejt anafázisban), a kromatin állományon kívül, a citoplazmában. A3: Átnézeti kép, az 5 µg/ml doxorubicin kezelés hatására p53 megjelenése a sejtmagban (piros festodés propidium-jodiddal). A4: Az 5 µg/ml doxorubicin kezelés hatására p53 megjelenése a sejtmagban. B1: Kontroll ECM-gél. Átnézeti kép, amely mutatja, hogy a p53 pozitivitás ritkán fordul elo. B2: Átnézeti kép, az 5 µg/ml doxorubicin kezelés hatására p53 megjelenése a sejtmagban ritka, nekrobiózisban a p53 vezikulárisan látható. A1, A3, B1, B2: 400x nagyítással, A2, A4: 1000x nagyítással konfokális lézer scanning mikroszkóppal kész ült képek ECM hatása doxorubicinnel kezelt OSCORT sejtek topoizomeráz fehérjék expressziójára és aktivitására Ismert, hogy a topoizomeráz II a doxorubicin molekuláris célpontja, ezért a topoizomeráz II kimutatása a kezelést követoen a nem-migráló és a migráló kompartmentben fontos jelentoséggel bírt. Vizsgálatunk eredménye arra utal, hogy a doxorubicin mind a két sejtpopulációban gátolta a topoizomeráz II aktivitást (38. ábra). 75

76 Eredmények A dekatenációs aktivitási méréseinket az immuncitokémiai vizsgálataink is megerosíteni látszanak, a doxorubicin kezelés csökkentette a topoizomeráz II aktivitást (39. ábra). A továbbiakban az a kérdés merült fel, hogy módosulhat-e az ECM indukált topoizomeráz váltás a doxorubicin kezelést követoen. A monolayer-plasztik felszínen maradt sejtekben (nem-migráló kompartment) jelentos topoizomeráz I aktivitást mutattunk ki, ugyanakkor az ECM-gélbe vándorolt sejtekben (migráló kompartment) ez az aktivitást sokkal alacsonyabb volt. Figyelemre méltónak tartható, hogy a doxorubicin kezelés után ez a különbség nem volt megfigyelheto (40. ábra) ábra. Topoizomeráz II dekatenációs aktivitásának összehasonlítása doxorubicinnel kezelt OSCORT sejtek nem-migráló és migráló populációjában. Az OSCORT sejteket 48 órán át tenyésztettük plasztik felszínen. A 4 órás 5 µg/ml doxorubicinnel való kezelést követoen ECM-gélt rétegeztünk a monolayerre és tovább inkubáltuk 24 órán át. Az inkubációs ido letelte után a migráló és a nem-migráló sejtekben külön-külön vizsgáltuk a topoizomeráz II aktivitást. A topoizomeráz II aktivitást kdns ATP függo dekatenációs módszerrel mutattuk ki 2.5x10 4 OSCORT sejtmagi extraktumából. NW: Nagy molekulatömegu összefuzött gyurus kinetoplaszt DNS. Mc: Egyes gyurus, kis kör alakú DNS (Minicircles). NK: Negatív kontroll, 500 ng plazmid DNS sejtmagi extraktum nélkül. PK: Pozitív kontroll 500 ng kdns 2 unit calf thymus topoizomeráz II-vel (TopoGen, Columbus, Ohio, USA). 1-4: 500 ng kdns különbözo tenyésztési körülmények alatt tenyésztett 2.5x10 4 OSCORT sejtmag extraktummal. Nem-migráló: A plasztik felszínen maradt (nem-migráló) sejtek (kontroll). Migráló: Az ECM-gélbe migrált sejtek (kontroll). Nem-migráló DOX: 5 µg/ml doxorubicinnel való kezelést követoen a plasztik felszínen maradt (nem-migráló) sejtek. Migráló DOX: 5 µg/ml doxorubicinnel való kezelést követoen az ECM-gélbe migrált sejtek. Az aktivitást a Stratagene Eagle-Eye II videodenzitométer képanalizátorral értékeltük. 76

77 Eredmények 39. ábra. Topoizomeráz II fehérje immuncitokémiai kimutatásának összehasonlítása doxorubicinnel kezelt OSCORT sejtek nem-migráló és migráló populációjában. Az OSCORT sejteket 48 órán át tenyésztettük plasztik felszínen. A 4 órás 5 µg/ml doxorubicinnel való kezelést követoen ECM-gélt rétegeztünk a monolayerre és tovább inkubáltuk 24 órán át. Az inkubációs ido letelte után a migráló és a nem-migráló sejtekben külön-külön vizsgáltuk a topoizomeráz II jelenlétét. A topoizomeráz II zöldként vizualizálódott, a sejtmag pirosra festodött. 1, 2: Kontroll nem-migráló sejtek. A mitotikus sejtekben nagyon kicsi (1), vagy egyáltalán nincs (2) topoizomeráz II immunreakció. 3: 5 µg/ml doxorubicin kezelés hatására a nemmigráló sejtekben az immunreakció csökkent. 4, 5: Kontroll migráló-sejtek. A mitotikus sejtekben magas a topoizomeráz II immunreakció. 4: Égo csipkebokor. 5: Topoizomeráz II a kromoszóma felületén. 6: 5 µg/ml doxorubicin kezelés hatására a migráló sejtekben az immunreakció jelentosen csökkent. 1, 2, 3, 4, 6: 400x nagyítással, 5: 1000x nagyítással konfokális lézer scanning mikroszkóppal készült képek. 77

78 Eredmények 40. ábra. Topoizomeráz I fehérje relaxációs aktivitás kimutatásának összehasonlítása doxorubicinnel kezelt OSCORT sejtek nem-migráló és migráló populációjában. Az OSCORT sejteket 48 órán át tenyésztettük plasztik felszínen. A 4 órás 5 µg/ml doxorubicinnel való kezelést követoen ECM-gélt rétegeztünk a monolayerre és tovább inkubáltuk 24 órán át. Az inkubációs ido letelte után a migráló és a nem-migráló sejtekben külön-külön vizsgáltuk a topoizomeráz I aktivitást. A topoizomeráz I aktivitást szuperhélix pbr322 plazmid DNS relaxációs módszerrel mutattuk ki 2.5x10 4 OSCORT sejtmagi extraktumából. R: Relaxált DNS. S: Szuperhélix DNS. NK: Negatív kontroll, 500 ng plazmid DNS sejtmagi extraktum nélkül. PK: Pozitív kontroll, 500 ng plazmid DNS 2 unit topoizomeráz I (TopoGen, Columbus, Ohio, USA). 1-4: 500 ng plazmid DNS különbözo tenyésztési körülmények alatt tenyésztett 2.5x10 4 OSCORT sejtmag extraktummal. Nem-migráló: Kontroll a plasztik felszínen maradt (nem-migráló) sejtek. Migráló: Kontroll az ECM-gélbe migrált sejtek. Nemmigráló DOX: 5µg/ml doxorubicinnel való kezelést követoen a plasztik felszínen maradt (nemmigráló) sejtek. Migráló DOX: 5 µg/ml doxorubicinnel való kezelést követoen az ECM-gélbe migrált sejtek. Az aktivitást a Stratagene Eagle-Eye II videodenzitométer képanalizátorral értékeltük. 78

79 Eredmények Doxorubicin kezelés hatása OSCORT sejtek proliferációjára és migrációjára A plasztik felszínen tenyésztett OSCORT sejteket különbözo dózisú ( µg/ml) és különbözo ideig (4-24 óra) kezeltük doxorubicinnel. A kezelést követoen ECM-gélt rétegeztünk a sejtekre és tovább inkubáltuk 24 órát. A nem-migráló (plasztik felszínen maradt és növekedo sejtek) és a migráló (ECM-gélbe vándorolt és proliferáló sejtek) OSCORT sejteknek eltéro volt a válaszreakciója a doxorubicin kezelésre és összefüggésben volt a kezelési idotartammal (41 ábra). A 4 órás doxorubicinnel való kezelést követoen a kisebb dózisoknál (0.01, 0.05 és 0.25 µg/ml) az összsejtszámot (migráló és nem migráló sejtek) illetoen nem volt eltérés a kontroll értékekhez képest. Azonban a nagyobb dózisoknál (0.5 és 5.0 µg/ml) már csökkenést figyeltük meg. A nagyobb dózisú doxorubicin kezelést követoen a túlélo sejtek többsége, az ECM-gélbe vándorolt, ezért a migráló és a nem migráló sejtkompartment közötti arány megváltozott. Igy a kisebb dózisok esetében ( µg/ml) a migráció szelektív gátlása, míg a magasabb dózisok esetében a nem migráló sejtek számának a csökkenése jellemezte a doxorubicin hatását (41 ábra). A 24 órás doxorubicinnel való kezelést követoen már a kisebb dózisoknál (0.01, 0.05 és 0.25 µg/ml) is hatékony volt a kezelés, itt is dózisfüggo redukciót tapasztaltunk az összsejtszámot illetoen. A 24 órás doxorubicinnel való kezelést követoen a nagyobb dózinál (5.0 µg/ml) már nem volt túlélo sejt kimutatható. A 24 órás kis dózisú doxorubicin kezelés antimigrációs hatása még kifejezettebbnek bizonyult a 4 órás kezeléssel összehasonlítva (41 ábra). A 4 és a 24 órás kezelést követoen az ECM-gélbe vándorolt sejtek viabilitása 10%-al volt magasabb a plasztikon maradt sejtekhez viszonyítva. Vizsgálataink a doxorubicin proliferáció gátló hatásán kívül, egy dózisfüggo antimigrációs hatását is mutatták. 79

80 Eredmények 41. ábra. A 4 és a 24 órás doxorubicin hatása az OSCORT sejtek proliferációjára és migrációjára. Az összsejtek, a migráló és a nem-migráló sejtek növekedésének összehasonlítása µg/ml 4 órás, valamint 24 órás doxorubicin kezelést követoen. Az ábrázolt séma mutatja a kísérlet menetét: A sejteket plasztik felszínen tenyésztettük 24 vagy 48 órán át, majd kezeltük µg/ml dózisú doxorubicinnel 4 órán át, vagy 24 órán át. Ezt követoen a sejtekre ECMgélt rétegeztünk 24 órán át. A nem-migráló (plasztik felszínen maradt és növekedo sejtek) és a migráló (ECM-gélbe vándorolt és proliferáló sejtek) OSCORT sejtek válaszreakcióját együtt és külön-külön is értékeltük. 80

81 Eredmények Mivel kísérleteink során a proteoglikánok kiemelkedo szerepét tapasztaltuk az OSCORT sejtek biológiai viselkedésében és doxorubicinnel szembeni válaszreakciójában, további vizsgálatainkban a proteoglikánok szintézisét tanulmányoztuk. Továbbá megvizsgáltuk, hogy a proteoglikanok szintézisének gátlása hasznosítható-e a doxorubicin daganat elleni hatásában. 5.5 A PROTEOGLIKÁNOK LEHETSÉGES SZEREPE AZ OSTEOSARCOMA KEZELÉSÉBEN Proteoglikán expresszió az OSCORT sejtekben és az ECM-ben Megállapíthattuk, hogy az OSCORT sejtek a HSPG mellett dekorint is termelnek és mindkét proteoglikán, még nagyobb mértékben, a médiumban is kimutatható (42. ábra). A. B. C. 42. ábra. OSCORT sejtekbol izolált proteoglikán minták vizsgálata. A. Western blot reakció HSPG antitesttel. B. Western blot reakció dekorin antitesttel. C. Negatív kontroll. MW: Molekulasúly, M: Médiumból izolált PG, S: Sejtbol izolált PG. A továbbiakban összehasonlítottuk az ECM-gélben és az OSCORT sejtek által termelt extracelluláris mátrixban (OSCORT-ECM) lévo heparánszulfát proteoglikánt. Mind az ECM-gélben, mind az OSCORT-ECM-ben agrin volt kimutatható, ellenben csak az ECM-gélben találtunk perlekánt (43. ábra). 81

82 Eredmények 43. ábra. HSPG az ECM-gélben és az OSCORT-ECM-ben. A. Az ECM-gélbol és az OSCORT-ECM-bol proteoglikánt izoláltunk és 10 µg fehérjére vonatkoztatva megfuttattuk 10%-os akrilamid gélen. Ezt követoen nitrocellulóz membránra transzferáltuk és reagáltattuk anti-agrin antitesttel. 1.oszlop: OSCORT-ECM-bol izolált proteoglikán. 2.oszlop: ECM-gélbol izolált proteoglikán. B. Az ECM-gélbol és az OSCORT-ECM-bol proteoglikánt izoláltunk és 10 µg fehérjére vonatkoztatva dot blotra vittük fel. A reakció anti-perlekán antitesttel történt Doxorubicin és clodronat hatása az OSCORT sejtek növekedésére és proteoglikán termelésére A clodronat koncentrációtól függoen csökkentette az OSCORT sejtek növekedését, 50 µmol/l koncentráció felett a hatás szignifikánsnak bizonyult. Az 50 és az 500 µmol/l clodronat kezelés hatása között szignifikáns különbség nem volt megfigyelheto (p=0.386), ami arra utal, hogy a clodronat OSCORT-sejtekre gyakorolt növekedést csökkento hatása telítodési görbét ír le (44. ábra). 500 µmol/l clodronat a kontrollhoz képest annak 71.22%-ára csökkentette a sejtszámot, összehasonlításképpen 5 µg/ml doxorubicin (8.62 µmol/l) a kontrol 62.54%-ára csökkentette a sejtszámot. A clodronat OSCORT sejtekre gyakorolt sejtszám csökkento hatása figyelemre méltó, de a doxorubicinnel összehasonlítva sokkal jelentéktelenebb. 82

83 Eredmények 44. ábra. Clodronat hatása az OSCORT sejtek növekedésére. 80x10 4 OSCORT sejtet kezeltünk plasztik felszínen, 4 órán át µmol/l clodronattal. A kezelést követoen a sejteket tovább inkubáltuk még 48 órán át. A sejtproliferációt sejtszámolással vizsgáltuk. A sejtproliferációs értékek átlagát valamint a ± SD értéket ábrázoltuk. Az eredmények 3 független vizsgálat átlagát mutatják. A clodronat egy másik hatása azonban a sejtnövekedés gátlásnál nagyobb jelentoséggel bír. OSCORT sejtekben 14 C-izotóppal jelölt glükózaminnal bioszintetikus jelölést végeztünk 24 órán át. A glükózamin a proteoglikán molekulák glükózaminoglükán láncaiba épül be. 4 órán át tartó 500 µmol/l clodronat illetve 5 µg/ml doxorubicin kezelést követoen proteoglikánt izoláltunk az OSCORT sejtekbol és a sejtek által kondicionált médiumból. A radioaktivitás a beépült glükózamint jellemzi, ami a proteoglikán szintézis intenzitásával hozható összefüggésbe. A doxorubicin növelte a sejtszámra vonatkoztatott glükózamin eredetu radioaktivitás mértékét mind a sejtekbol, mind a médiumból izolált proteoglikánokban. A clodronat ezzel szemben csökkentette a radioaktivitást a kontrollhoz képest a médiumból és a sejtekbol izolált proteoglikánokban (45. ábra). A clodronat elsosorban a proteoglikánba épült radioaktivitást gátolta, azonban a médiumba jutott szabad GAG mennyisége is jelentosen kevesebb volt (46. ábra). 83

84 Eredmények 45. ábra. A doxorubicin és a clodronat hatása az OSCORT sejtek proteoglikán szintézisére. 2x10 4 OSCORT sejtet kezeltünk plasztik felszínen, 4 órán át 5 µg/ml doxorubicinnel, illetve 500 µmol/l clodronattal. A kezelést követoen a sejteket a 24. órában [ 14 C]-glükózaminnal jelöltük további 24 órán át. A tenyésztési ido letelte után a sejtekbol proteoglikánt izoláltunk. A proteoglikán frakciók aktivitását cpm-ben mértük. Az értékek átlagát valamint a ± SD értéket ábrázoltuk. Az eredmények 3 független vizsgálat átlagát mutatják. 46. ábra. A doxorubicin és a clodronat hatása az OSCORT sejtek GAG és proteoglikán szintézisére. 2x10 4 OSCORT sejtet kezeltünk plasztik felszínen, 4 órán át 5 µg/ml doxorubicinnel, illetve 500 µmol/l clodronattal. A kezelést követoen a sejteket a 24. órában [ 14 C]-glükózaminnal jelöltük további 24 órán át. A tenyésztési ido letelte után a sejtekbol szabad GAG-ot és proteoglikánt izoláltunk. A frakciók aktivitását külön-külön dpm-ben mértük. Az értékek átlagát valamint a ± SD értéket ábrázoltuk. Az eredmények 3 független vizsgálat átlagát mutatják. 84

85 Eredmények További kísérleteink a clodronat dózisfüggo proteoglikán szintézis gátlást igazolták. (47. ábra). 47. ábra. A clodronat hatása az OSCORT sejtek proteoglikán expressziójára. 2x10 4 OSCORT sejtet kezeltünk plasztik felszínen, 4 órán át, 5-, 50-, és 500 µmol/l clodronattal. A kezelést követoen a sejteket a 24. órában [ 14 C]-glükózaminnal jelöltük további 24 órán át. A tenyésztési ido letelte után a sejtekbol és a megfelelo médiumból proteoglikánt izoláltunk. Az ábra fluorográfiás képet reprezentál. 1. Kontroll sejt médiumából izolált proteoglikán, 2. 5 µmol/l clodronattal kezelt sejt médiumából izolált proteoglikán, µmol/l clodronattal kezelt sejt médiumából izolált proteoglikán, µmol/l clodronattal kezelt sejt médiumából izolált proteoglikán, 5. Kontroll sejtbol izolált proteoglikán, 6. 5 µmol/l clodronattal kezelt sejtbol izolált proteoglikán, µmol/l clodronattal kezelt sejtbol izolált proteoglikán, µmol/l clodronattal kezelt sejtbol izolált proteoglikán. Az eredményt a Stratagene Eagle-Eye II videodenzitométer képanalizátorral értékeltük. Megfigyelheto hogy mind a sejtekben, mind a médiumban egy dózisfüggo proteoglikán csökkenés következett be a clodronat kezelésre Doxorubicin és clodronat kombinációs kezelés hatása az OSCORT sejtek növekedésére Plasztik felszínen tenyésztett 14x10 4 sejt/cm 2 OSCORT sejtet 4 órán át kezeltünk 5 µg/ml doxorubicinnel. A kezelés után 4 órás inkubálási periódus következett, majd újabb 4 órás kezelés 50 µmol/l clodronattal. A kezelés végén ECM-gélt rétegeztünk az OSCORT sejtekre és további 72 órán át inkubáltuk. Ezzel párhuzamban 4 órás kezelést végeztünk monoterápiában csak doxorubicinnel vagy csak clodronattal. A tenyésztési ido lejárta után a sejtek proliferációját és viabilitását vizsgáltuk (48. ábra). 85

86 Eredmények Sejtszám A. Viabilitás B. 48. ábra. A doxorubicin és a clodronat kombinációs kezelés hatása az OSCORT sejtek növekedésére A kezelések hatását az OSCORT sejtek proliferációjára (A.) és életképességére (B.) tripánkék kizárási teszttel és sejtszámolással vizsgáltuk. Az értékek átlagát valamint a ± SD értéket adtuk meg. Az eredmények 3 független vizsgálat átlagát mutatják. 86

Tüdő adenocarcinomásbetegek agyi áttéteiben jelenlévő immunsejtek, valamint a PD-L1 és PD-1 fehérjék túlélésre gyakorolt hatása

Tüdő adenocarcinomásbetegek agyi áttéteiben jelenlévő immunsejtek, valamint a PD-L1 és PD-1 fehérjék túlélésre gyakorolt hatása Tüdő adenocarcinomásbetegek agyi áttéteiben jelenlévő immunsejtek, valamint a és PD-1 fehérjék túlélésre gyakorolt hatása Téglási Vanda, MoldvayJudit, Fábián Katalin, Csala Irén, PipekOrsolya, Bagó Attila,

Részletesebben

Lymphoma sejtvonalak és gyerekkori leukémia (ALL) sejtek mikro RNS (mir) profiljának vizsgálata

Lymphoma sejtvonalak és gyerekkori leukémia (ALL) sejtek mikro RNS (mir) profiljának vizsgálata Lymphoma sejtvonalak és gyerekkori leukémia (ALL) sejtek mikro RNS (mir) profiljának vizsgálata Dr. Nemes Karolina, Márk Ágnes, Dr. Hajdu Melinda, Csorba Gézáné, Dr. Kopper László, Dr. Csóka Monika, Dr.

Részletesebben

A keringı tumor markerek klinikai alkalmazásának aktuális kérdései és irányelvei

A keringı tumor markerek klinikai alkalmazásának aktuális kérdései és irányelvei A keringı tumor markerek klinikai alkalmazásának aktuális kérdései és irányelvei A TM vizsgálatok alapkérdései A vizsgálatok célja, információértéke? Az alkalmazás területei? Hogyan válasszuk ki az alkalmazott

Részletesebben

In Situ Hibridizáció a pathologiai diagnosztikában és ami mögötte van.

In Situ Hibridizáció a pathologiai diagnosztikában és ami mögötte van. In Situ Hibridizáció a pathologiai diagnosztikában és ami mögötte van. Kneif Józsefné PTE KK Pathologiai Intézet Budapest 2017. 05. 26 Kromoszóma rendellenesség kimutatás PCR technika: izolált nukleinsavak

Részletesebben

Norvég Finanszírozási Mechanizmus által támogatott projekt HU-0115/NA/2008-3/ÖP-9 ÚJ TERÁPIÁS CÉLPONTOK AZONOSÍTÁSA GENOMIKAI MÓDSZEREKKEL

Norvég Finanszírozási Mechanizmus által támogatott projekt HU-0115/NA/2008-3/ÖP-9 ÚJ TERÁPIÁS CÉLPONTOK AZONOSÍTÁSA GENOMIKAI MÓDSZEREKKEL Norvég Finanszírozási Mechanizmus által támogatott projekt HU-0115/NA/2008-3/ÖP-9 ÚJ TERÁPIÁS CÉLPONTOK AZONOSÍTÁSA GENOMIKAI MÓDSZEREKKEL KÖZÖS STRATÉGIA KIFEJLESZTÉSE MOLEKULÁRIS MÓDSZEREK ALKALMAZÁSÁVAL

Részletesebben

Az orvosi biotechnológiai mesterképzés megfeleltetése az Európai Unió új társadalmi kihívásainak a Pécsi Tudományegyetemen és a Debreceni Egyetemen

Az orvosi biotechnológiai mesterképzés megfeleltetése az Európai Unió új társadalmi kihívásainak a Pécsi Tudományegyetemen és a Debreceni Egyetemen Az orvosi biotechnológiai mesterképzés megfeleltetése az Európai Unió új társadalmi kihívásainak a Pécsi Tudományegyetemen és a Debreceni Egyetemen Azonosító szám: Az orvosi biotechnológiai mesterképzés

Részletesebben

Nemzeti Onkológiai Kutatás-Fejlesztési Konzorcium a daganatos halálozás csökkentésére 1/48/2001

Nemzeti Onkológiai Kutatás-Fejlesztési Konzorcium a daganatos halálozás csökkentésére 1/48/2001 Nemzeti Kutatási és Fejlesztési Program 1. Főirány: Életminőség javítása Nemzeti Onkológiai Kutatás-Fejlesztési Konzorcium a daganatos halálozás csökkentésére 1/48/2001 3. Részjelentés: 2003. November

Részletesebben

A tumor-markerek alkalmazásának irányelvei BOKOR KÁROLY klinikai biokémikus Dr. Romics László Egészségügyi Intézmény

A tumor-markerek alkalmazásának irányelvei BOKOR KÁROLY klinikai biokémikus Dr. Romics László Egészségügyi Intézmény A tumor-markerek alkalmazásának irányelvei BOKOR KÁROLY klinikai biokémikus Dr. Romics László Egészségügyi Intézmény 2016.10.17. 1 2016.10.17. 2 2016.10.17. 3 A TUMORMARKEREK TÖRTÉNETE I. ÉV FELFEDEZŐ

Részletesebben

MAGYOT évi Tudományos Szimpóziuma Május 5-6, Budapest

MAGYOT évi Tudományos Szimpóziuma Május 5-6, Budapest MAGYOT 2017. évi Tudományos Szimpóziuma Május 5-6, Budapest A petefészekrákok kezelésében nem régen került bevezetésre egy újabb fenntartó kezelés BRCA mutációt hordozó (szomatikus vagy germinális) magas

Részletesebben

Biológiai módszerek alkalmazása környezeti hatások okozta terhelések kimutatására

Biológiai módszerek alkalmazása környezeti hatások okozta terhelések kimutatására Szalma Katalin Biológiai módszerek alkalmazása környezeti hatások okozta terhelések kimutatására Témavezető: Dr. Turai István, OSSKI Budapest, 2010. október 4. Az ionizáló sugárzás sejt kölcsönhatása Antone

Részletesebben

Sarkadi Margit1, Mezősi Emese2, Bajnok László2, Schmidt Erzsébet1, Szabó Zsuzsanna1, Szekeres Sarolta1, Dérczy Katalin3, Molnár Krisztián3,

Sarkadi Margit1, Mezősi Emese2, Bajnok László2, Schmidt Erzsébet1, Szabó Zsuzsanna1, Szekeres Sarolta1, Dérczy Katalin3, Molnár Krisztián3, Sarkadi Margit1, Mezősi Emese2, Bajnok László2, Schmidt Erzsébet1, Szabó Zsuzsanna1, Szekeres Sarolta1, Dérczy Katalin3, Molnár Krisztián3, Rostás Tamás3, Ritter Zsombor4, Zámbó Katalin1 Pécsi Tudományegyetem

Részletesebben

Esetbemutatás. Dr. Iván Mária Uzsoki Kórház 2013.11.07.

Esetbemutatás. Dr. Iván Mária Uzsoki Kórház 2013.11.07. Esetbemutatás Dr. Iván Mária Uzsoki Kórház 2013.11.07. Esetbemutatás I. 26 éves férfi 6 héttel korábban bal oldali herében elváltozást észlelt,majd 3 héttel később haemoptoe miatt kereste fel orvosát antibiotikumos

Részletesebben

Immunológia I. 4. előadás. Kacskovics Imre

Immunológia I. 4. előadás. Kacskovics Imre Immunológia I. 4. előadás Kacskovics Imre (imre.kacskovics@ttk.elte.hu) 3.1. ábra A vérsejtek képződésének helyszínei az élet folyamán 3.2. ábra A hemopoetikus őssejt aszimmetrikus osztódása 3.3. ábra

Részletesebben

Katasztrófális antifoszfolipid szindróma

Katasztrófális antifoszfolipid szindróma Katasztrófális antifoszfolipid szindróma Gadó Klára Semmelweis Egyetem, I.sz. Belgyógyászati Klinika Antifoszfolipid szindróma Artériás és vénás thrombosis Habituális vetélés apl antitest jelenléte Mi

Részletesebben

Immunológia I. 2. előadás. Kacskovics Imre (imre.kacskovics@ttk.elte.hu)

Immunológia I. 2. előadás. Kacskovics Imre (imre.kacskovics@ttk.elte.hu) Immunológia I. 2. előadás Kacskovics Imre (imre.kacskovics@ttk.elte.hu) Az immunválasz kialakulása A veleszületett és az adaptív immunválasz összefonódása A veleszületett immunválasz mechanizmusai A veleszületett

Részletesebben

Diagnosztikai irányelvek Paget-kórban

Diagnosztikai irányelvek Paget-kórban Diagnosztikai irányelvek Paget-kórban Dr. Donáth Judit Országos Reumatológiai és Fizioterápiás Intézet, Budapest HALADÁS A REUMATOLÓGIA, IMMUNOLÓGIA ÉS OSTEOLÓGIA TERÜLETÉN 2012-2014 2015. ÁPRILIS 17.

Részletesebben

XIII./5. fejezet: Terápia

XIII./5. fejezet: Terápia XIII./5. fejezet: Terápia A betegek kezelésekor a sebészi kezelés, a kemoterápia (klasszikus citotoxikus és a biológiai terápia), a radioterápia és ezek együttes alkalmazása egyaránt szóba jön. A gégének

Részletesebben

Immunológia Alapjai. 13. előadás. Elsődleges T sejt érés és differenciálódás

Immunológia Alapjai. 13. előadás. Elsődleges T sejt érés és differenciálódás Immunológia Alapjai 13. előadás Elsődleges T sejt érés és differenciálódás A T és B sejt receptor eltérő szerkezetű A T sejt receptor komplex felépítése + DOMÉNES SZERKEZET αβ ΤcR SP(CD4+ vagy CD8+) γδ

Részletesebben

Dr. Máthéné Dr. Szigeti Zsuzsanna és munkatársai

Dr. Máthéné Dr. Szigeti Zsuzsanna és munkatársai Kar: TTK Tantárgy: CITOGENETIKA Kód: AOMBCGE3 ECTS Kredit: 3 A tantárgyat oktató intézet: TTK Mikrobiális Biotechnológiai és Sejtbiológiai Tanszék A tantárgy felvételére ajánlott félév: 3. Melyik félévben

Részletesebben

Az áramlási citométer és sejtszorter felépítése és működése, diagnosztikai alkalmazásai

Az áramlási citométer és sejtszorter felépítése és működése, diagnosztikai alkalmazásai Az áramlási citométer és sejtszorter felépítése és működése, diagnosztikai alkalmazásai Az áramlási citométer és sejtszorter felépítése és működése Kereskedelmi forgalomban kapható készülékek 1 Fogalmak

Részletesebben

ANTICANCER RESEARCH [Rákkutatás]

ANTICANCER RESEARCH [Rákkutatás] ANTICANCER RESEARCH [Rákkutatás] Nemzetközi rákkutatási és rákgyógyászati folyóirat Az MGN-3/Biobran rizskorpából kivont módosított arabinoxilán in vitro növeli a metasztatikus emlőráksejtek érzékenységét

Részletesebben

Célzott terápiás diagnosztika Semmelweis Egyetem I.sz. Pathologiai és Kísérleti Rákkutató Intézet, Budapest Tamási Anna, Dr.

Célzott terápiás diagnosztika Semmelweis Egyetem I.sz. Pathologiai és Kísérleti Rákkutató Intézet, Budapest Tamási Anna, Dr. Célzott terápiás diagnosztika Semmelweis Egyetem I.sz. Pathologiai és Kísérleti Rákkutató Intézet, Budapest Tamási Anna, Dr. Krenács Tibor KROMAT Dako szeminárium 2017. Napjainkban egyre nagyobb teret

Részletesebben

Hivatalos Bírálat Dr. Gődény Mária

Hivatalos Bírálat Dr. Gődény Mária Hivatalos Bírálat Dr. Gődény Mária:,,Multiparametrikus MR vizsgálat prognosztikai és prediktív faktorokat meghatározó szerepe fej-nyaki tumoroknál, valamint a kismedence főbb daganat csoportjaiban című

Részletesebben

A ROSSZ PROGNÓZISÚ GYERMEKKORI SZOLID TUMOROK VIZSGÁLATA. Dr. Győrffy Balázs

A ROSSZ PROGNÓZISÚ GYERMEKKORI SZOLID TUMOROK VIZSGÁLATA. Dr. Győrffy Balázs A ROSSZ PROGNÓZISÚ GYERMEKKORI SZOLID TUMOROK VIZSGÁLATA Dr. Győrffy Balázs ELŐADÁS ÁTTEKINTÉSE 1. Elmélet Gyermekkori tumorok Központi idegrendszer tumorai 2. Kutatás szakmai koncepciója 3. Együttműködés

Részletesebben

OPPONENSI VÉLEMÉNY. Dr. Kulka Janina MTA doktori értekezéséről

OPPONENSI VÉLEMÉNY. Dr. Kulka Janina MTA doktori értekezéséről 1 OPPONENSI VÉLEMÉNY Dr. Kulka Janina MTA doktori értekezéséről Az értekezés témaválasztása korszerű és megfelel a XXI. századi emlő onkológia elvárásainak. A patológusok szerepe az emlőrák kórismézésében

Részletesebben

BETEGTÁJÉKOZTATÓ RHEUMATOID ARTHRITISBEN SZENVEDŐ BETEGEK SZÁMÁRA I. RHEUMATOID ARTHRITIS. origamigroup. www.origami.co.hu

BETEGTÁJÉKOZTATÓ RHEUMATOID ARTHRITISBEN SZENVEDŐ BETEGEK SZÁMÁRA I. RHEUMATOID ARTHRITIS. origamigroup. www.origami.co.hu BETEGTÁJÉKOZTATÓ RHEUMATOID ARTHRITISBEN SZENVEDŐ BETEGEK SZÁMÁRA I. RHEUMATOID ARTHRITIS origamigroup www.origami.co.hu I. Rheumatoid arthritis Sokat hallunk napjainkban az immunrendszernek az egészség

Részletesebben

Hasi tumorok gyermekkorban

Hasi tumorok gyermekkorban Hasi tumorok gyermekkorban Dr. Bartyik Katalin SZTE ÁOK Gyermekgyógyászati Klinika és Gyermekegészségügyi Központ, Szeged A gyermekkori tumorok a halálozási oki tényezői közül a 2. helyen állnak a balesetek,

Részletesebben

A patológiai vizsgálatok metodikája. 1. Biopsziástechnikák 2. Speciális vizsgálatok

A patológiai vizsgálatok metodikája. 1. Biopsziástechnikák 2. Speciális vizsgálatok A patológiai vizsgálatok metodikája 1. Biopsziástechnikák 2. Speciális vizsgálatok Biopsziaindikációk Diffus/multifocalis eltérések Folyamat etiológiájának tisztázása Szisztémás kezeléshez szükséges paraméterek

Részletesebben

Nemzeti Onkológiai Kutatás-Fejlesztési Konzorcium a daganatos halálozás csökkentésére 1/48/2001. Zárójelentés: 2001. május 15.-2004. december 31.

Nemzeti Onkológiai Kutatás-Fejlesztési Konzorcium a daganatos halálozás csökkentésére 1/48/2001. Zárójelentés: 2001. május 15.-2004. december 31. Nemzeti Kutatási és Fejlesztési Program 1. Főirány: Életminőség javítása Nemzeti Onkológiai Kutatás-Fejlesztési Konzorcium a daganatos halálozás csökkentésére 1/48/2001 Zárójelentés: 2001. május 15.-2004.

Részletesebben

Bevacizumab kombinációval elért hosszútávú remissziók metasztatikus colorectális carcinomában

Bevacizumab kombinációval elért hosszútávú remissziók metasztatikus colorectális carcinomában Bevacizumab kombinációval elért hosszútávú remissziók metasztatikus colorectális carcinomában G E LE N C S É R V I K TÓ R I A, B O É R K ATA LI N SZ E N T MA RGIT KÓ RH Á Z, O N KO LÓ GIA MAGYOT, 2016.05.05

Részletesebben

eljárásokkal Doktori tézisek Szatmári Tünde Semmelweis Egyetem Klinikai Orvostudományok Doktori Iskola Sugárterápia Program

eljárásokkal Doktori tézisek Szatmári Tünde Semmelweis Egyetem Klinikai Orvostudományok Doktori Iskola Sugárterápia Program Agydaganatok sugárterápia iránti érzékenységének növelése génterápiás eljárásokkal Doktori tézisek Szatmári Tünde Semmelweis Egyetem Klinikai Orvostudományok Doktori Iskola Sugárterápia Program Doktori

Részletesebben

I./5. fejezet: Daganatok növekedése és terjedése

I./5. fejezet: Daganatok növekedése és terjedése I./5. fejezet: Daganatok növekedése és terjedése Tímár József A fejezet célja, hogy a hallgató megismerje a daganatok növekedésének és biológiai viselkedésének alapjait. A fejezet teljesítését követően

Részletesebben

METASZTÁZISKÉPZÉS. Láng Orsolya. Kemotaxis speciálkollégium 2005.

METASZTÁZISKÉPZÉS. Láng Orsolya. Kemotaxis speciálkollégium 2005. METASZTÁZISKÉPZÉS Láng Orsolya Kemotaxis speciálkollégium 2005. TUMOROK ÉS MIGRÁCIÓ PRIMER TUMOR METASZTÁZIS Angiogenezis Adhézió SEJT - SEJTCIKLUS Apoptózis Kemokinek Növekedési faktorok Szabályozó fehérjék

Részletesebben

Az Idegsebészeti Szövetbank jelentősége a neuro-onkológiai kutatásokban

Az Idegsebészeti Szövetbank jelentősége a neuro-onkológiai kutatásokban Az Idegsebészeti Szövetbank jelentősége a neuro-onkológiai kutatásokban Augusta - Idegsebészet Klekner Álmos 1, Bognár László 1,2 1 Debreceni Egyetem, OEC, Idegsebészeti Klinika, Debrecen 2 Országos Idegsebészeti

Részletesebben

MESENCHYMALIS TUMOROK

MESENCHYMALIS TUMOROK MESENCHYMALIS TUMOROK Dr. SZEKANECZ ÉVA M.D.,Ph.D. DE KK Onkológiai Intézet 2014. (Handout) BEVEZETÉS a malignus tumorok 0.5-1%-a bármely életkorban, de gyerekekben gyakoribb (7%) 4. lágyrész sarcomák

Részletesebben

(1) A T sejtek aktiválása (2) Az ön reaktív T sejtek toleranciája. α lánc. β lánc. V α. V β. C β. C α.

(1) A T sejtek aktiválása (2) Az ön reaktív T sejtek toleranciája. α lánc. β lánc. V α. V β. C β. C α. Immunbiológia II A T sejt receptor () heterodimer α lánc kötőhely β lánc 14. kromoszóma 7. kromoszóma 1 V α V β C α C β EXTRACELLULÁRIS TÉR SEJTMEMBRÁN CITOSZÓL αlánc: VJ régió β lánc: VDJ régió Nincs

Részletesebben

Szinoviális szarkómák patogenezisében szerepet játszó szignálutak jellemzése szöveti multiblokk technika alkalmazásával

Szinoviális szarkómák patogenezisében szerepet játszó szignálutak jellemzése szöveti multiblokk technika alkalmazásával Szinoviális szarkómák patogenezisében szerepet játszó szignálutak jellemzése szöveti multiblokk technika alkalmazásával Fónyad László 1, Moskovszky Linda 1, Szemlaky Zsuzsanna 1, Szendrői Miklós 2, Sápi

Részletesebben

Intelligens molekulákkal a rák ellen

Intelligens molekulákkal a rák ellen Intelligens molekulákkal a rák ellen Kotschy András Servier Kutatóintézet Rákkutatási kémiai osztály A rákos sejt Miben más Hogyan él túl Áttekintés Rákos sejtek célzott támadása sejtmérgekkel Fehérjék

Részletesebben

A klinikai citológia alapjai

A klinikai citológia alapjai A klinikai citológia alapjai Vajdovich Péter Szent István Egyetem Állatorvos-tudományi Kar Belgyógyászati Tanszék és Klinika Budapest A citológiai vizsgálatok célja elváltozások: normál, hiperplasztikus

Részletesebben

Általános daganattan II.

Általános daganattan II. Általános daganattan II. Benignus és malignus hámtumorok Semmelweis Egyetem II. Sz. Patológiai Intézet Neoplasia fogalma Kóros szövetszaporulat Genetikai és epigenetikai változásokon alapuló klonális proliferáció

Részletesebben

Részletes szakmai beszámoló Az erbb proteinek asszociációjának kvantitatív jellemzése című OTKA pályázatról (F049025)

Részletes szakmai beszámoló Az erbb proteinek asszociációjának kvantitatív jellemzése című OTKA pályázatról (F049025) Részletes szakmai beszámoló Az erbb proteinek asszociációjának kvantitatív jellemzése című OTKA pályázatról (F049025) A pályázat megvalósítása során célunk volt egyrészt a molekulák asszociációjának tanulmányozására

Részletesebben

DR. HAJNAL KLÁRA / DR. NAHM KRISZTINA KÖZPONTI RÖNTGEN DIAGNOSZTIKA Uzsoki utcai kórház. Emlő MR vizsgálatok korai eredményei kórházunkban

DR. HAJNAL KLÁRA / DR. NAHM KRISZTINA KÖZPONTI RÖNTGEN DIAGNOSZTIKA Uzsoki utcai kórház. Emlő MR vizsgálatok korai eredményei kórházunkban DR. HAJNAL KLÁRA / DR. NAHM KRISZTINA KÖZPONTI RÖNTGEN DIAGNOSZTIKA Uzsoki utcai kórház Emlő MR vizsgálatok korai eredményei kórházunkban 2015.01.01-2016.04.30 között kórházunkban végzett emlő MR vizsgálatok

Részletesebben

Immundiagnosztikai módszerek

Immundiagnosztikai módszerek Western blot/immunoblot Immundiagnosztikai módszerek Katona Éva 2015-03-24 Ag Enzim/Fluorochrome/ izotóp Másodlagos, jelzett At Primer At Western Blotting fehérje/ag preparálás (1) Fehérje tisztítás/extrahálás

Részletesebben

Gyermekkori daganatok. Mózes Petra

Gyermekkori daganatok. Mózes Petra Gyermekkori daganatok Mózes Petra 0-18 éves korcsoportban a daganatos megbetegedések miatti halál a balesetek után a második leggyakoribb halálok 240 280 új megbetegedés évente gyermekkori malignus megbetegedések

Részletesebben

ONKOLÓGIA Bödör Csaba I. sz. Patológiai és Kísérleti Rákkutató Intézet november 19., ÁOK, III.

ONKOLÓGIA Bödör Csaba I. sz. Patológiai és Kísérleti Rákkutató Intézet november 19., ÁOK, III. ONKOLÓGIA Bödör Csaba I. sz. Patológiai és Kísérleti Rákkutató Intézet 2018. november 19., ÁOK, III. bodor.csaba1@med.semmelweis-univ.hu ONKOLÓGIA Daganatok általános jellemzése, benignus és malignus daganatok

Részletesebben

Intraocularis tumorok

Intraocularis tumorok Intraocularis tumorok 25 évvel ezelőtt, ha egy szemben chorioidea melanomát találtunk, akkor a szemet enucleáltuk. Szemben lévő festékes daganat (melanoma chorioideae) Chorioidea melanoma miatt eltávolított,

Részletesebben

Kutatási beszámoló ( )

Kutatási beszámoló ( ) Kutatási beszámoló (2008-2012) A thrombocyták aktivációja alapvető jelentőségű a thrombotikus betegségek kialakulása szempontjából. A pályázat során ezen aktivációs folyamatok mechanizmusait vizsgáltuk.

Részletesebben

Receptorok és szignalizációs mechanizmusok

Receptorok és szignalizációs mechanizmusok Molekuláris sejtbiológia: Receptorok és szignalizációs mechanizmusok Dr. habil Kőhidai László Semmelweis Egyetem Genetikai, Sejt- és Immunbiológiai Intézet Sejtek szignalizációs kapcsolatai Sejtek szignalizációs

Részletesebben

Preeclampsia-asszociált extracelluláris vezikulák

Preeclampsia-asszociált extracelluláris vezikulák Preeclampsia-asszociált extracelluláris vezikulák hatása(i) a monocita sejt működésére Kovács Árpád Ferenc 1, Láng Orsolya 1, Kőhidai László 1, Rigó János 2, Turiák Lilla 3, Fekete Nóra 1, Buzás Edit 1,

Részletesebben

Gyógyszeres kezelések

Gyógyszeres kezelések Gyógyszeres kezelések Az osteogenesis imperfecta gyógyszeres kezelésében számos szert kipróbáltak az elmúlt évtizedekben, de átütő eredménnyel egyik se szolgált. A fluorid kezelés alkalmazása osteogenesis

Részletesebben

A tüdőcitológia jelentősége a tüdődaganatok neoadjuváns kezelésének tervezésében

A tüdőcitológia jelentősége a tüdődaganatok neoadjuváns kezelésének tervezésében A tüdőcitológia jelentősége a tüdődaganatok neoadjuváns kezelésének tervezésében Pápay Judit SE, I.sz.Patológiai és Kísérleti Rákkutató Intézet 70. Patológus Kongresszus Siófok 2011. szept. 29 - okt.1.

Részletesebben

Áramlási citometria 2011. / 4. Immunológiai és Biotechnológiai Intézet PTE KK

Áramlási citometria 2011. / 4. Immunológiai és Biotechnológiai Intézet PTE KK Áramlási citometria 2011. / 4 Immunológiai és Biotechnológiai Intézet PTE KK Az áramlási citometria elve Az áramlási citometria ( Flow cytometria ) sejtek gyors, multiparaméteres vizsgálatára alkalmas

Részletesebben

Új könnyűlánc diagnosztika. Dr. Németh Julianna Országos Gyógyintézeti Központ Immundiagnosztikai Osztály MLDT-MIT Továbbképzés 2006

Új könnyűlánc diagnosztika. Dr. Németh Julianna Országos Gyógyintézeti Központ Immundiagnosztikai Osztály MLDT-MIT Továbbképzés 2006 Új könnyűlánc diagnosztika Dr. Németh Julianna Országos Gyógyintézeti Központ Immundiagnosztikai Osztály MLDT-MIT Továbbképzés 2006 1845 Bence Jones Protein vizelet fehérje 1922 BJP I-II típus 1956 BJP

Részletesebben

Immunológia alapjai. 10. előadás. Komplement rendszer

Immunológia alapjai. 10. előadás. Komplement rendszer Immunológia alapjai 10. előadás Komplement rendszer A gyulladás molekuláris mediátorai: Miért fontos a komplement rendszer? A veleszületett (nem-specifikus) immunválasz része Azonnali válaszreakció A veleszületett

Részletesebben

A T sejt receptor (TCR) heterodimer

A T sejt receptor (TCR) heterodimer Immunbiológia - II A T sejt receptor (TCR) heterodimer 1 kötőhely lánc lánc 14. kromoszóma 7. kromoszóma V V C C EXTRACELLULÁRIS TÉR SEJTMEMBRÁN CITOSZÓL lánc: VJ régió lánc: VDJ régió Nincs szomatikus

Részletesebben

Az áramlási citometria gyakorlati alkalmazása az ondó rutin analízisben. Hajnal Ágnes, Dr Mikus Endre, Dr Venekeiné Losonczi Olga

Az áramlási citometria gyakorlati alkalmazása az ondó rutin analízisben. Hajnal Ágnes, Dr Mikus Endre, Dr Venekeiné Losonczi Olga Az áramlási citometria gyakorlati alkalmazása az ondó rutin analízisben Hajnal Ágnes, Dr Mikus Endre, Dr Venekeiné Losonczi Olga Labmagister Kft aktivitásai HumanCell SynLab Diagnosztika MensMentis LabMagister

Részletesebben

Az adaptív immunválasz kialakulása. Erdei Anna Immunológiai Tanszék ELTE

Az adaptív immunválasz kialakulása. Erdei Anna Immunológiai Tanszék ELTE Az adaptív immunválasz kialakulása Erdei Anna Immunológiai Tanszék ELTE NK sejt T Bev. 1. ábra Immunhomeosztázis A veleszületett immunrendszer elemei nélkül nem alakulhat ki az adaptív immunválasz A veleszületett

Részletesebben

Onkológiai betegek és az oszteoporózis

Onkológiai betegek és az oszteoporózis Onkológiai betegek és az oszteoporózis Dr. Nusser Nóra Zsigmondy Vilmos Harkányi Gyógyfürdőkórház (2011.) Oszteoporózis (OP) jelentősége Az első törésig tünetmentes! Az 50 év feletti nők 50%-ának, férfiak

Részletesebben

A harkányi gyógyvízzel végzett vizsgálataink eredményei psoriasisban között. Dr. Hortobágyi Judit

A harkányi gyógyvízzel végzett vizsgálataink eredményei psoriasisban között. Dr. Hortobágyi Judit A harkányi gyógyvízzel végzett vizsgálataink eredményei psoriasisban 2007-2011 között Dr. Hortobágyi Judit Pikkelysömörre gyakorolt hatása 2007-től 2009-ig 1. Lokális hatása 2. Szisztémás hatása 3. Állatkísérlet

Részletesebben

Semmelweis Egyetem Budapest Ortopédiai Klinika. Mozgásszervi tumorok differenciál diagnosztikája az alapvető röntgen és UH vizsgálattal.

Semmelweis Egyetem Budapest Ortopédiai Klinika. Mozgásszervi tumorok differenciál diagnosztikája az alapvető röntgen és UH vizsgálattal. Semmelweis Egyetem Budapest Ortopédiai Klinika Igazgató: Dr. Szendrői Miklós egyetemi tanár Mozgásszervi tumorok differenciál diagnosztikája az alapvető röntgen és UH vizsgálattal. K. Köllő Képalkotó diagnosztikánál

Részletesebben

A bőrmelanoma kezelésének módjai. Dr. Forgács Balázs Bőrgyógyászati Osztály

A bőrmelanoma kezelésének módjai. Dr. Forgács Balázs Bőrgyógyászati Osztály A bőrmelanoma kezelésének módjai Dr. Forgács Balázs Bőrgyógyászati Osztály Melanoma TNM (AJCC VIII.) A melanoma kezelés alapja (T:tumor, N:nyirokcsomó, M:metasztázis) T: Breslow érték a legközelebbi 0,1

Részletesebben

Az orvosi biotechnológiai mesterképzés megfeleltetése az Európai Unió új társadalmi kihívásainak a Pécsi Tudományegyetemen és a Debreceni Egyetemen

Az orvosi biotechnológiai mesterképzés megfeleltetése az Európai Unió új társadalmi kihívásainak a Pécsi Tudományegyetemen és a Debreceni Egyetemen Az orvosi biotechnológiai mesterképzés megfeleltetése az Európai Unió új társadalmi kihívásainak a Pécsi Tudományegyetemen és a Debreceni Egyetemen Azonosító szám: Az orvosi biotechnológiai mesterképzés

Részletesebben

Bevezetés. A fejezet felépítése

Bevezetés. A fejezet felépítése II./3.8. fejezet: Szervátültetés kérdése daganatos betegségek esetén Langer Róbert, Végső Gyula, Horkay Ferenc, Fehérvári Imre A fejezet célja, hogy a hallgatók megismerkedjenek a szervátültetés és a daganatos

Részletesebben

A GI daganatok onkológiai kezelésének alapelvei. dr Lohinszky Júlia SE II. sz Belgyógyászati Klinika

A GI daganatok onkológiai kezelésének alapelvei. dr Lohinszky Júlia SE II. sz Belgyógyászati Klinika A GI daganatok onkológiai kezelésének alapelvei dr Lohinszky Júlia SE II. sz Belgyógyászati Klinika Onkológiai ellátás Jelentősége Elvei Szemléletváltás szükségessége Klinikai onkológia Kemoterápia kit,

Részletesebben

A.) Biopsziás mintavétel lehetőségei és a biopsziás anyagok kezelésével kapcsolatos tudnivalók.

A.) Biopsziás mintavétel lehetőségei és a biopsziás anyagok kezelésével kapcsolatos tudnivalók. II./2.5. fejezet: Daganatok szövettani diagnosztikája Kulka Janina Ebben a fejezetben a daganatból történő szövettani mintavétel lehetőségeit és értékelését, illetve értékének korlátait, valamint a sebészeti

Részletesebben

Immunológia alapjai. Az immunválasz szupressziója Előadás. A szupresszióban részt vevő sejtes és molekuláris elemek

Immunológia alapjai. Az immunválasz szupressziója Előadás. A szupresszióban részt vevő sejtes és molekuláris elemek Immunológia alapjai 19 20. Előadás Az immunválasz szupressziója A szupresszióban részt vevő sejtes és molekuláris elemek Mi a szupresszió? Általános biológiai szabályzó funkció. Az immunszupresszió az

Részletesebben

A krónikus myeloid leukémia kezelésének finanszírozási protokollja (eljárásrend)

A krónikus myeloid leukémia kezelésének finanszírozási protokollja (eljárásrend) A krónikus myeloid leukémia kezelésének finanszírozási protokollja (eljárásrend) Országos Egészségbiztosítási Pénztár Elemzési, Orvosszakértői és Szakmai Ellenőrzési Főosztály Budapest, 2013. június 26.

Részletesebben

1. ábra: egészséges, normál szérumfehérje -frakciók (bal) ill.-komponensek (jobb) kapilláris elektroforézis képe

1. ábra: egészséges, normál szérumfehérje -frakciók (bal) ill.-komponensek (jobb) kapilláris elektroforézis képe Kapilláris elektroforézis lehetőségei a haematológiai-immunológiai laboratóriumi diagnosztikában Miklós Kata, Szabó Zsófia és Németh Julianna Országos Gyógyintézeti Központ (OGYK), Immundiagnosztikai Osztály

Részletesebben

II./3.3.2 fejezet:. A daganatok célzott kezelése

II./3.3.2 fejezet:. A daganatok célzott kezelése II./3.3.2 fejezet:. A daganatok célzott kezelése Kopper László A fejezet célja, hogy megismerje a hallgató a célzott terápiák lehetőségeit és a fejlesztés lényeges lépéseit. A fejezet teljesítését követően

Részletesebben

Tóth Erika Sebészeti és Molekuláris Patológia Osztály Országos Onkológiai Intézet. Frank Diagnosztika Szimpózium, DAKO workshop 2012.

Tóth Erika Sebészeti és Molekuláris Patológia Osztály Országos Onkológiai Intézet. Frank Diagnosztika Szimpózium, DAKO workshop 2012. Tóth Erika Sebészeti és Molekuláris Patológia Osztály Országos Onkológiai Intézet Frank Diagnosztika Szimpózium, DAKO workshop 2012.december 7 Follicularis hám eredetű daganatok Jól differenciált tumorok

Részletesebben

Fejezetek a klinikai onkológiából

Fejezetek a klinikai onkológiából Fejezetek a klinikai onkológiából Előadás jegyzet Szegedi Tudományegyetem Általános Orvosi Kar Onkoterápiás Klinika 2012. A patológiai, képalkotó és laboratóriumi diagnosztika jelentősége az onkológiában.

Részletesebben

Az Oxidatív stressz hatása a PIBF receptor alegységek összeszerelődésére.

Az Oxidatív stressz hatása a PIBF receptor alegységek összeszerelődésére. Újabban világossá vált, hogy a Progesterone-induced blocking factor (PIBF) amely a progesteron számos immunológiai hatását közvetíti, nem csupán a lymphocytákban és terhességgel asszociált szövetekben,

Részletesebben

Immunológia 4. A BCR diverzitás kialakulása

Immunológia 4. A BCR diverzitás kialakulása Immunológia 4. A BCR diverzitás kialakulása 2017. október 4. Bajtay Zsuzsa A klónszelekciós elmélet sarokpontjai: Monospecifictás: 1 sejt 1-féle specificitású receptor Az antigén receptorhoz kötődése aktiválja

Részletesebben

III./8.3. Lokálisan előrehaladott emlőrák. A fejezet felépítése

III./8.3. Lokálisan előrehaladott emlőrák. A fejezet felépítése III./8.3. Lokálisan előrehaladott emlőrák Kocsis Judit A fejezet célja, hogy megismerje a hallgató a helyileg előrehaladott emlődaganat fogalmát, diagnózisát és a terápiás lehetőségeket. A fejezet teljesítését

Részletesebben

Immunológiai módszerek a klinikai kutatásban

Immunológiai módszerek a klinikai kutatásban Immunológiai módszerek a klinikai kutatásban 7. előadás Immunizálás. Poliklonális és monoklonális ellenanyag előállítása, tisztítása, alkalmazása Az antigén (haptén + hordozó) sokféle specificitású ellenanyag

Részletesebben

EGYETEMI DOKTORI (Ph.D.) ÉRTEKEZÉS TÉZISEI

EGYETEMI DOKTORI (Ph.D.) ÉRTEKEZÉS TÉZISEI EGYETEMI DOKTORI (Ph.D.) ÉRTEKEZÉS TÉZISEI HUMÁN MALIGNUS MELANOMA PROGRESSZIÓJÁVAL TÁRSULÓ GENETIKAI ELTÉRÉSEK ANALÍZISE IN SITU HIBRIDIZÁCIÓS MÓDSZEREKKEL ÁDÁM ZSUZSANNA Témavezet : Dr. Balázs Margit

Részletesebben

Metasztatikus HER2+ emlőrák kezelése: pertuzumab-trasztuzumab és docetaxel kombinációval szerzett tapasztalataink esetismertetés kapcsán

Metasztatikus HER2+ emlőrák kezelése: pertuzumab-trasztuzumab és docetaxel kombinációval szerzett tapasztalataink esetismertetés kapcsán Metasztatikus HER2+ emlőrák kezelése: pertuzumab-trasztuzumab és docetaxel kombinációval szerzett tapasztalataink esetismertetés kapcsán Dr. Gelencsér Viktória, Dr. Boér Katalin Szent Margit Kórház, Onkológiai

Részletesebben

Sugárbiológiai ismeretek: LNT modell. Sztochasztikus hatások. Daganat epidemiológia. Dr. Sáfrány Géza OKK - OSSKI

Sugárbiológiai ismeretek: LNT modell. Sztochasztikus hatások. Daganat epidemiológia. Dr. Sáfrány Géza OKK - OSSKI Sugárbiológiai ismeretek: LNT modell. Sztochasztikus hatások. Daganat epidemiológia Dr. Sáfrány Géza OKK - OSSKI Az ionizáló sugárzás biológiai hatásai Determinisztikus hatás Sztochasztikus hatás Sugársérülések

Részletesebben

A PROTEIN KINÁZ C IZOENZIMEK SZEREPE HUMÁN HaCaT KERATINOCYTÁK SEJTM KÖDÉSEINEK SZABÁLYOZÁSÁBAN

A PROTEIN KINÁZ C IZOENZIMEK SZEREPE HUMÁN HaCaT KERATINOCYTÁK SEJTM KÖDÉSEINEK SZABÁLYOZÁSÁBAN EGYETEMI DOKTORI (Ph.D.) ÉRTEKEZÉS TÉZISEI A PROTEIN KINÁZ C IZOENZIMEK SZEREPE HUMÁN HaCaT KERATINOCYTÁK SEJTM KÖDÉSEINEK SZABÁLYOZÁSÁBAN Papp Helga DEBRECENI EGYETEM ORVOS-ÉS EGÉSZSÉGTUDOMÁNYI CENTRUM

Részletesebben

III./5. GIST. Bevezetés. A fejezet felépítése. A.) Panaszok. B.) Anamnézis. Pápai Zsuzsanna

III./5. GIST. Bevezetés. A fejezet felépítése. A.) Panaszok. B.) Anamnézis. Pápai Zsuzsanna III./5. GIST Pápai Zsuzsanna A fejezet célja: a GIST daganatok epidemiológiájának, tüneteinek, diagnosztikájának valamint, kezelési lehetőségeinek áttekintése egy beteg esetének bemutatásán keresztül.

Részletesebben

Az ABCG2 multidrog transzporter fehérje szerkezetének és működésének vizsgálata

Az ABCG2 multidrog transzporter fehérje szerkezetének és működésének vizsgálata Az ABCG2 multidrog transzporter fehérje szerkezetének és működésének Kutatási előzmények Az ABC transzporter membránfehérjék az ATP elhasítása (ATPáz aktivitás) révén nyerik az energiát az általuk végzett

Részletesebben

Emlőpatológia. II. Sz. Patológiai Intézet Semmelweis Egyetem

Emlőpatológia. II. Sz. Patológiai Intézet Semmelweis Egyetem Emlőpatológia II. Sz. Patológiai Intézet Semmelweis Egyetem Emlőpatológia áttekintés - Benignus léziók - Acut mastitis - Plasmasejtes mastitis / ductectasia - Zsírnekrózis - Fibrocisztás / proliferatív

Részletesebben

Dr. Nemes Nagy Zsuzsa Szakképzés Karl Landsteiner Karl Landsteiner:

Dr. Nemes Nagy Zsuzsa Szakképzés Karl Landsteiner Karl Landsteiner: Az AB0 vércsoport rendszer Dr. Nemes Nagy Zsuzsa Szakképzés 2011 Az AB0 rendszer felfedezése 1901. Karl Landsteiner Landsteiner szabály 1901 Karl Landsteiner: Munkatársai vérmintáit vizsgálva fedezte fel

Részletesebben

http://www.rimm.dote.hu Tumor immunológia

http://www.rimm.dote.hu Tumor immunológia http://www.rimm.dote.hu Tumor immunológia A tumorok és az immunrendszer kapcsolatai Tumorspecifikus és tumorasszociált antigének A tumor sejteket ölő sejtek és mechanizmusok Az immunológiai felügyelet

Részletesebben

PROGNOSZTIKAI FAKTOROK VIZSGÁLATA ÉS ÚJABB GYÓGYSZERES KEZELÉSI LEHETÕSÉGEK ROSSZINDULATÚ TÁMASZTÓSZÖVETI DAGANATOK ESETÉN. Ph. D.

PROGNOSZTIKAI FAKTOROK VIZSGÁLATA ÉS ÚJABB GYÓGYSZERES KEZELÉSI LEHETÕSÉGEK ROSSZINDULATÚ TÁMASZTÓSZÖVETI DAGANATOK ESETÉN. Ph. D. PROGNOSZTIKAI FAKTOROK VIZSGÁLATA ÉS ÚJABB GYÓGYSZERES KEZELÉSI LEHETÕSÉGEK ROSSZINDULATÚ TÁMASZTÓSZÖVETI DAGANATOK ESETÉN Ph. D. Értekezés Tézisei Dr. Pápai Zsuzsanna Témavezetõ: Dr. Kopper László egyetemi

Részletesebben

Emlőtumor agyi áttéteinek korszerű kezelése: a tumorválasz és extracraniális progresszió

Emlőtumor agyi áttéteinek korszerű kezelése: a tumorválasz és extracraniális progresszió Emlőtumor agyi áttéteinek korszerű kezelése: a tumorválasz és extracraniális progresszió összefüggései Szentmártoni Gy., Zergényi É., Torgyík L., Tóth A., Szita A., Dank M. SE Radiológiai és Onkoterápiás

Részletesebben

MULTIDROG REZISZTENCIA IN VIVO KIMUTATÁSA PETEFÉSZEK TUMOROKBAN MOLEKULÁRIS LEKÉPEZÉSSEL

MULTIDROG REZISZTENCIA IN VIVO KIMUTATÁSA PETEFÉSZEK TUMOROKBAN MOLEKULÁRIS LEKÉPEZÉSSEL MULTIDROG REZISZTENCIA IN VIVO KIMUTATÁSA PETEFÉSZEK TUMOROKBAN MOLEKULÁRIS LEKÉPEZÉSSEL Dr. Krasznai Zoárd Tibor Debreceni Egyetem OEC Szülészeti és Nőgyógyászati Klinika Debrecen, 2011. 10.17. Bevezetés

Részletesebben

Az ophthalmopathia autoimmun kórfolyamatára utaló tényezôk Bizonyított: A celluláris és humorális autoimmun folyamatok szerepe.

Az ophthalmopathia autoimmun kórfolyamatára utaló tényezôk Bizonyított: A celluláris és humorális autoimmun folyamatok szerepe. Az ophthalmopathia autoimmun kórfolyamatára utaló tényezôk Bizonyított: A celluláris és humorális autoimmun folyamatok szerepe. szemizom, retrobulbaris kötôszövet, könnymirigy elleni autoantitestek exophthalmogen

Részletesebben

mtorc1 and C2 komplexhez köthető aktivitás különbségek és ennek jelentősége humán lymphomákbanés leukémiákban

mtorc1 and C2 komplexhez köthető aktivitás különbségek és ennek jelentősége humán lymphomákbanés leukémiákban mtorc1 and C2 komplexhez köthető aktivitás különbségek és ennek jelentősége humán lymphomákbanés leukémiákban Sebestyén A, Márk Á, Nagy N, Hajdu M, Csóka M*, SticzT, Barna G, Nemes K*, Váradi Zs*, KopperL

Részletesebben

KERINGŐ EXTRACELLULÁRIS VEZIKULÁK ÁLTAL INDUKÁLT GÉNEXPRESSZIÓS MINTÁZAT VIZSGÁLATA TROPHOBLAST SEJTVONALBAN

KERINGŐ EXTRACELLULÁRIS VEZIKULÁK ÁLTAL INDUKÁLT GÉNEXPRESSZIÓS MINTÁZAT VIZSGÁLATA TROPHOBLAST SEJTVONALBAN 2016. 10. 14. KERINGŐ EXTRACELLULÁRIS VEZIKULÁK ÁLTAL INDUKÁLT GÉNEXPRESSZIÓS MINTÁZAT VIZSGÁLATA TROPHOBLAST SEJTVONALBAN Kovács Árpád Ferenc 1, Pap Erna 1, Fekete Nóra 1, Rigó János 2, Buzás Edit 1,

Részletesebben

Az Egészségügyi Minisztérium módszertani levele Immunhisztokémiai és immuncitokémiai módszerek alkalmazása a patológiában

Az Egészségügyi Minisztérium módszertani levele Immunhisztokémiai és immuncitokémiai módszerek alkalmazása a patológiában 1 Az Egészségügyi Minisztérium módszertani levele Immunhisztokémiai és immuncitokémiai módszerek alkalmazása a patológiában Készítette: Az Országos Pathologiai Intézet és a Pathologus Szakmai Kollégium

Részletesebben

Spondylitis ankylopoeticahoz társuló osteoporosis

Spondylitis ankylopoeticahoz társuló osteoporosis Spondylitis ankylopoeticahoz társuló osteoporosis Szántó Sándor DE OEC, Reumatológiai Tanszék 2013.11.05. Szeminárium Csontfelszivódás és csontképzés SPA-ban egészséges előrehaladott SPA Spondylitis ankylopoetica

Részletesebben

TRIPSZIN TISZTÍTÁSA AFFINITÁS KROMATOGRÁFIA SEGÍTSÉGÉVEL

TRIPSZIN TISZTÍTÁSA AFFINITÁS KROMATOGRÁFIA SEGÍTSÉGÉVEL TRIPSZIN TISZTÍTÁSA AFFINITÁS KROMATOGRÁFIA SEGÍTSÉGÉVEL Az egyes biomolekulák izolálása kulcsfontosságú a biológiai szerepük tisztázásához. Az affinitás kromatográfia egyszerűsége, reprodukálhatósága

Részletesebben

2.6.16. VIZSGÁLATOK IDEGEN KÓROKOZÓKRA HUMÁN ÉLŐVÍRUS-VAKCINÁKBAN

2.6.16. VIZSGÁLATOK IDEGEN KÓROKOZÓKRA HUMÁN ÉLŐVÍRUS-VAKCINÁKBAN 2.6.16. Vizsgálatok idegen kórokozókra Ph.Hg.VIII. - Ph.Eur.7.0 1 2.6.16. VIZSGÁLATOK IDEGEN KÓROKOZÓKRA HUMÁN ÉLŐVÍRUS-VAKCINÁKBAN 01/2011:20616 Azokhoz a vizsgálatokhoz, amelyekhez a vírust előzőleg

Részletesebben

Immunológia Világnapja

Immunológia Világnapja a Magyar Tudományos Akadémia Biológiai Osztály, Immunológiai Bizottsága és a Magyar Immunológiai Társaság Immunológia Világnapja - 2016 Tumorbiológia Dr. Tóvári József, Országos Onkológiai Intézet Mágikus

Részletesebben

A fejezet felépítése. A.) Általános nevezéktan

A fejezet felépítése. A.) Általános nevezéktan II./1.4. fejezet: Nevezéktan, stádiumbeosztás Torgyík László, Dank Magdolna A fejezet áttekintése során a hallgató megismerkedik az onkológiai kezelések során használatos kifejezések értemével és a TNM-osztályozás

Részletesebben

Antigén, Antigén prezentáció

Antigén, Antigén prezentáció Antigén, Antigén prezentáció Biológiai Intézet Immunológiai Tanszék Bajtay Zsuzsa ELTE, TTK Biológiai Intézet Immunológiai Tanszék ORFI Klinikai immunológia tanfolyam, 2019. február. 26 Bev. 2. ábra Az

Részletesebben

Hypophysis daganatok patológiája

Hypophysis daganatok patológiája Hypophysis daganatok patológiája Reiniger Lilla SEMMELWEIS EGYETEM I. PATOLÓGIAI ÉS KÍSÉRLETI RÁKKUTATÓ INTÉZET Klinikai Endokrinológia Fakultáció Budapest, 2017.10.11. reiniger.lilla@med.semmelweis-univ.hu

Részletesebben

Immunológia alapjai. 16. előadás. Komplement rendszer

Immunológia alapjai. 16. előadás. Komplement rendszer Immunológia alapjai 16. előadás Komplement rendszer A gyulladás molekuláris mediátorai: Plazma enzim mediátorok: - Kinin rendszer - Véralvadási rendszer Lipid mediátorok Kemoattraktánsok: - Chemokinek:

Részletesebben

Új lehetőségek a tumoros emlőanyagok patológiai feldolgozásában

Új lehetőségek a tumoros emlőanyagok patológiai feldolgozásában Új lehetőségek a tumoros emlőanyagok patológiai feldolgozásában Dr. Lippai Norbert Hetényi Géza Kórház, Szolnok Múlt és jelen Szakmai irányelvek a műtéti preparátumot az eltávolítás után azonnal (maximum

Részletesebben