cobas HIV-1 In vitro diagnosztikai célra Mennyiségi nukleinsavteszt cobas 4800 rendszeren való használatra 120 Tests P/N:

Átírás

1 Mennyiségi nukleinsavteszt cobas 4800 rendszeren való használatra In vitro diagnosztikai célra cobas HIV Tests P/N: cobas HBV/HCV/HIV-1 Control Kit 10 Sets P/N: cobas 4800 System Sample Preparation Kit 2 cobas 4800 System Wash Buffer Kit 240 Tests 960 Tests 240 Tests 960 Tests P/N: P/N: P/N: P/N: cobas 4800 System Specimen Diluent Tests P/N: cobas 4800 System Lysis Kit Tests 960 Tests P/N P/N

2 TARTALOMJEGYZÉK A felhasználás célja A teszt összegzése és ismertetése Háttér... 4 A HIV-1-tesztelés elméleti alapjai... 4 A vizsgálat háttere... 5 Az eljárás alapelvei... 5 Anyagok és reagensek Reagensek... 7 A reagensek tárolási és kezelési feltételei További szükséges anyagok Szükséges, de nem biztosított eszközök és szoftverek Óvintézkedések és kezelési követelmények Figyelmeztetések és óvintézkedések Helyes laboratóriumi gyakorlat Reagensek kezelése Szennyezdés Felhasználhatóság Hulladékkezelés Kiömlés és tisztítás Minták levétele, szállítása és tárolása Használati utasítás Mintavétel Minták szállítása, tárolása és stabilitása A teszt futtatása Eredmények Mintafeldolgozási térfogat Munkafolyamat Futtatási mennyiség Munkafolyamat Minségellenrzés és az eredmények érvényessége Kontrolljelzk Az eredmények értelmezése Az eljárással kapcsolatos korlátozások A nem klinikai teljesítmény értékelése A fontosabb teljesítményjellemzk Doc. Rev

3 WHO Nemzetközi standard Lineáris tartomány Pontosság laboratóriumon belül Csoport/altípus ellenrzése Specificitás Módszerkorreláció Teljes rendszerhiba Keresztszennyezdés További információk A teszt legfontosabb tulajdonságai Szimbólumok Gyártó és forgalmazók Védjegyek és szabadalmak Szerzi jog Hivatkozások Dokumentumverzió Doc. Rev

4 A felhasználás célja A cobas HIV-1 egy in vitro nukleinsav-amplifikációs teszt a humán immundeficiencia vírus 1. típusának (HIV-1) kimutatására HIV-1-fertzött egyének EDTA-s plazmájában. A teszt a klinikai megjelenéssel és a betegség progressziójának egyéb laboratóriumi markereivel együtt a HIV-1-fertzött betegek orvosi kezelésében nyújthat segítséget. A teszt a HIV-1-fertzés jelenlétének megersítésére használható ellenanyagra reaktív betegeknél, valamint a beteg prognózisának megállapítására a kiindulási HIV-1-szint mérésével. Ezen felül az antiretrovirális kezelés hatása a HIV-1 RNS-szint változásainak mérésével monitorozható. A teszt összegzése és ismertetése Háttér A HIV a szerzett immunhiányos tünetegyüttes (Acquired Immunodeficiency Syndrome AIDS)] kórokozója. A szerokonverziót követen a fertzött egyének általában klinikailag stabil, viszonylag tünetmentes fázisba kerülnek, ami évekig tarthat. A tünetmentes idszakot a fertzött egyén genetikájától és a fokozatosan kialakuló CD4 + T-limfocitahiánytól függen folytonos plazmavirémia jellemzi. Bár a fertzés tünetmentes fázisában a vírusszintek a perifériás vérben viszonylag alacsonyak, úgy tnik, hogy a vírus szaporodása és ürülése dinamikus folyamat, amelynek során a nagyfokú vírustermelés és a CD4 + sejtek által mutatott fertzés egyensúlyban van a nagyfokú vírusürüléssel, a fertzött sejtek pusztulásával és a CD4 + sejtek utánképzdésével, és így a HIV-fertzéssel él átlagos betegnél mind a plazmavirémia, mind a CD4 + sejtek mintegy 8 éven keresztül viszonylag stabil szinten maradnak. A plazmában megfigyelhet HIV-virémia mennyiségi mérései azt mutatták, hogy a magasabb vírusszintek a HIV-betegség gyorsabb progressziójával vannak összefüggésben. 1, 2 Ezen felül a klinikai kutatások majdnem két évtizede után megállapítható, hogy amikor antiretrovirális kezelés (ART) hatására a plazmában csökkennek a vírusszintek, jelentsen csökken a betegség progressziója, beleértve a haláleseteket, az AIDS kialakulását, az opportunista fertzéseket és a HIV-hez kapcsolódó morbiditás kockázatát. 3 A HIVvíruskoncentráció a HIV átvitelének kockázatával is összefügg, és randomizált, kontrollált klinikai vizsgálatok során megállapították, hogy a korán kezdett ART és a víruskoncentráció csökkentése 96%-kal csökkenti a HIV átvitelét. 4 A HIV-1-tesztelés elméleti alapjai Pillanatnyilag sok antiretrovirális gyógyszer áll rendelkezésre, amelyek a vírus proteázát, integrázát, burkát és reverz transzkrpitázát célozzák. Különböz kládokba tartozó vírusok genotípus-elemzései a HIV-1 polimeráz (pol) gén reverz transzkriptáz, integráz és proteáz régióiban természetesen elforduló és gyógyszer miatti nukleotidváltozásokat, polimorfizmusokat és másodlagos mutációkat mutattak. A rezisztencia vizsgálata fontos diagnosztikai eszközzé vált a HIV-1-fertzések kezelésében. Akkor végzik, amikor a beteg víruskoncentrációja szekvenálással kimutatható szint lesz. A víruskoncentráció monitorozásának legfontosabb szerepe, hogy bizonyítottan csökkenti a gyógyszer-rezisztencia kockázatát, és klinikailag a kezelésben részesül betegeknél elsként jelzi az aktív vírusszaporodást. 5,6 Ezért számos országos és nemzetközi irányelv ajánlja a HIV-1 víruskoncentráció mérését. 3,7-9 Doc. Rev

5 Az irányelvek jó néhány éven át azt tzték ki a kezelés fontos céljául, hogy a HIV-1 víruskoncentráció egy teszt kimutatási határa (pl. 50 kópia/ml) alá csökkenjen tl az Egyesült Államok HIV-kezelési irányelvei egyre inkább azt tartalmazták, hogy az ART kezelésben részesül betegeknél a legfeljebb 200 kópia/ml-es víruskoncentráció-eredmények nem feltétlenül jelentik a kezelés sikertelenségét. 3 Az európai irányelvekben továbbra is az 50 kópia/ml küszöbérték szerepel a kezelés sikertelenségének meghatározásánál. 7 Még nem végeztek szabályos klinikai vizsgálatot a használandó küszöbérték meghatározására. A víruskoncentrációt mér tesztek alsó határai közötti különbségek fontos eltérésekhez vezethetnek a víruskoncentrációeredmények klinikai értelmezésében a betegek kezelésre adott reakciói monitorozásakor 10,11, mivel a kezelés célja a víruskoncentráció olyan szintre csökkentése, amely mellett a legkevésbé valószín, hogy gyógyszerrezisztencia alakul ki. Az irányelvek a víruskoncentráció mérését a kezelésre adott reakciók monitorozása mellett annak meghatározására is ajánlják, hogy a > 500 sejt/mm 3 CD4+ sejtszámú (víruskoncentráció > kópia/ml) betegnél kell-e ART kezelést kezdeni, és annak biztosítására, hogy a gyógyszerrezisztencia-szekvenálás sikeres legyen a megfelel betegeknél (akik víruskoncentrációja > 1000 kópia/ml vagy az ART az optimálisnál gyengébb víruskoncentráció-reakciót eredményez). A víruskoncentráció mérését a szülést megelzen is ajánlott végrehajtani annak meghatározására, hogy szükség van-e császármetszésre az anya-gyermek HIV-fertzés elkerülésére (olyan várandós nknél, akiknek a víruskoncentrációja > 1000 kópia/ml). A vizsgálat háttere A cobas HIV-1 a cobas 4800 rendszeren végzett mennyiségi nukleinsavteszt. A cobas HIV-1 lehetvé teszi a HIV RNS kimutatását és mennyiségi meghatározását fertzött betegek EDTA-s plazmájában. A kimutatás és a mennyiségi meghatározás két próba használatával történik, amely nem különbözteti meg az M, N és O csoportokba tartozó altípusokat. A teszt a víruskoncentrációt egy HIV ellen ( Armored technológiával) nem felvértezett RNS mennyiségi standardhoz (RNA QS) képest méri, amelyet az egyes mintákhoz kell adni a minták feldolgozásakor. Az RNA QS bels kontrollként mködik a teljes mintaelkészítés és PCR-amplifikálás monitorozására. Ezen felül a teszt három küls kontrollt használ: egy magas titer pozitívot, egy alacsony titer pozitívot és egy negatívot. Az eljárás alapelvei A cobas HIV-1 teszt teljesen automatizált minta-elkészítésen (nukleinsav-extrahálás és tisztítás) alapul, amelyet PCR-amplifikálás és kimutatás követ. A cobas 4800 rendszer a cobas x 480 minta-elkészít készülékbl és a cobas z 480 valós idej PCR-analizátorból áll. Az automatizált adatkezelést a cobas 4800 szoftver végzi, amely az összes teszthez a következ eredmények egyikét rendeli: target not detected (nem kimutatható target), < LLoQ (alsó mennyiségi meghatározási határ), > ULoQ (fels mennyiségi meghatározási határ) vagy HIV RNA detected (HIV RNS kimutatható), egy érték a LLoQ ULoQ lineáris tartományban. Az eredményeket át lehet tekinteni közvetlenül a rendszer képernyjén, de exportálhatók vagy jelentésként nyomtathatók is. A rendszer a betegek mintáiból származó nukleinsavakat, küls kontrollokat és RNA QS molekulákat egyszerre extrahálja. Összegezve, a mintába proteináz és lízisreagens kerül, és ennek hatására a vírus nukleinsavai felszabadulnak. A felszabadult nukleinsavak a hozzáadott mágneses üvegpartikulumok szilikonfelületéhez kötnek. A kötetlen anyagokat és szennyezdéseket, például a denaturált fehérjéket, sejttörmeléket és lehetséges PCR-inhibitorokat az ezt követ mosóreagens-lépések eltávolítják, és egy eluáló puffer magasabb hmérsékleten eluálja a tisztított nukleinsavakat a mágneses üvegpartikulumokból. Doc. Rev

6 A teszt a mintában a célnukleinsavak szelektív amplifikálását a célvírusra specifikus forward és reverz primerekkel éri el, amelyeket a HIV nagy fokban konzervált régióiból választ. A HIV-1 gag gén és a HIV-1 LTR régió ketts targetjét a cobas HIV-1 teszt amplifikálja. Az RNA QS szelektív amplifikálását a teszt szekvenciaspecifikus forward és reverz primerekkel éri el, amelyeket úgy választ, hogy ne legyenek homológok a HIV genomjával. A teszt mind a reverz transzkripcióhoz, mind a PCR-amplifikáláshoz hstabil DNS-polimeráz enzimet használ. A target és RNA QS szekvenciákat egyszerre amplifikálja egy univerzális PCR-amplifikáló profillal, amely tartalmazza az elre meghatározott hmérséklet-lépcsket és a ciklusok számát. A Master Mix dezoxitimidin-trifoszfát (dttp) helyett dezoxiuridin-trifoszfátot (dutp) tartalmaz, amely beépül az újonnan szintetizált DNS-be (amplikon) A PCR els hevítési lépése során a PCR Master Mix reagensben lév AmpErase enzim az elz PCR-futtatásokból származó minden szennyez amplikont inaktivál. Az újonnan kialakuló amplikonokat viszont nem inaktiválja, mert az 55 C-ot meghaladó hmérséklet miatt az AmpErase enzim maga is inaktív lesz. A cobas HIV-1 Master Mix a HIV-1-targetszekvenciákra specifikus két kimutatási próbát tartalmaz, valamint egyet az RNA QS-hez. A próbákat fluoreszcens targetspecifikus jelzfestékek jelölik, ami lehetvé teszi a HIV-1-target és az RNA QS egyszerre történ kimutatását két különböz kimutatási csatornán. 15,16 Amikor az érintetlen próba fluoreszcens jelei nem kötdnek a targetszekvenciához, azokat egy blokkolófesték elnyomja. A PCR-amplifikálás minden egyes lépése során a próbák a specifikus, egyszálú DNS-templáthoz hibridizálnak. Ennek eredményeként a próbát a DNS-polimeráz 5' 3'-exonukleáz-aktivitása hasítja, így a jelzfesték és a blokkolófesték elválik, és fluoreszcens jel keletkezik. Minden PCR-ciklus során megn a hasított próbák mennyisége, és így növekszik a jelzfestékbl származó összesített jel is. A PCR-termékek valós idej kimutatása és megkülönböztetése a felszabadult, vírustargeteket és RNA QS-t reprezentáló jelzfestékek fluoreszcencenciájának mérésével megy végbe. Doc. Rev

7 Anyagok és reagensek Reagensek Minden felbontatlan reagenst és kontrollt A reagensek tárolási és kezelési feltételei táblázat ajánlásai szerint tároljon. Készlet Összetevk és reagensek Készletenkénti mennyiség Biztonsági jelzés és figyelmeztetés a MMX R1 N/A (cobas Master Mix reagens 1) Mangán-acetát, kálium-hidroxid, < 0,1% nátrium-azid 10 1,75 ml HIV-1 MMX R2 N/A (cobas HIV-1 Master Mix reagens 2) cobas HIV teszt (P/N: ) Tricin puffer, kálium-acetát, 18% dimetilszulfoxid, glicerin, < 0,1% Tween 20, EDTA, < 0,12% datp, dctp, dgtp, dutp-k, < 0,01% HIV-primerek, < 0,01% Quantitation Standard (mennyiségi standard) forward és reverz primerek, < 0,01% fluoreszcensen jelölt, a HIV-re és a mennyiségi standardra specifikus oligonukleotid-próbák, < 0,01% oligonukleotid aptamer, < 0,01% Z05D DNS-polimeráz (mikrobiális), < 0,01% AmpErase (uracil-n-glikoziláz) enzim (mikrobiális), < 0,1% nátrium-azid 10 0,5 ml RNA QS (cobas RNA mennyiségi standard) N/A Trisz puffer, < 0,05% EDTA, < 0,001% nem HIV-hez kapcsolódó Armored RNSkonstrukció primer és próbaspecifikus szekvenciarégiókkal (nem fertz RNS MS2 bakteriofágban), < 0,1% nátrium-azid 10 1,75 ml Doc. Rev

8 Készlet Összetevk és reagensek Készletenkénti mennyiség Biztonsági jelzés és figyelmeztetés a HBV/HCV/HIV-1 L(+)C (cobas HBV/HCV/HIV-1 alacsony pozitív kontroll) cobas HBV/HCV/HIV-1 Control Kit 10 készlet (P/N: ) < 0,001% szintetikus (Armored) HIV-1 M csoport RNS MS2 bakteriofág burokfehérjébe csomagolva, < 0,001% szintetikus (plazmid) HBV DNS Lambda bakteriofág burokfehérjébe csomagolva, < 0,001% szintetikus (Armored) HCV RNS MS2 bakteriofág burokfehérjébe csomagolva, normál humán plazma, engedélyezett vizsgálatok alapján nem reaktív HIV 1/2, HCV-, HBsAg-, valamint HBc-antitestre; a HIV-1 RNS, HIV-2 RNS, HCV RNS és HBV DNS nem mutatható ki PCR-eljárásokkal. 0,1% ProClin 300 tartósítószer HBV/HCV/HIV-1 H(+)C (cobas HBV/HCV/HIV-1 magas pozitív kontroll) < 0,001% szintetikus (Armored) HIV-1 M csoport RNS MS2 bakteriofág burokfehérjébe csomagolva, < 0,001% szintetikus (plazmid) HBV DNS Lambda bakteriofág burokfehérjébe csomagolva, < 0,001% szintetikus (Armored) HCV RNS MS2 bakteriofág burokfehérjébe csomagolva, normál humán plazma, engedélyezett vizsgálatok alapján nem reaktív HIV 1/2, HCV-, HBsAg-, valamint HBc-antitestre; a HIV-1 RNS, HIV-2 RNS, HCV RNS és HBV DNS nem mutatható ki PCR-eljárásokkal. 0,1% ProClin 300 tartósítószer 10 0,75 ml 10 0,75 ml Figyelem H317 Allergiás brreakciót válthat ki. P261 Kerülje a por/füst/gáz/köd/gzök/ permet belélegzését. P272 Szennyezett munkaruhát tilos kivinni a munkahely területérl. P280 Védkeszty használata kötelez. P333 + P313 Brirritáció vagy kiütések megjelenése esetén: orvosi ellátást kell kérni. P362 + P364 A szennyezett ruhát le kell vetni és az újbóli használat eltt ki kell mosni. P501 A tartalom/edény elhelyezése hulladékként: jóváhagyott hulladékkezelési üzemben keverék: 5-klór-2-metil-4- izotiazolin-3-on [EC ] és 2-metil- 2H-izotiazol-3-on [EC ] (3:1) ( ) C (cobas negatív kontroll 2) Normál humán plazma, engedélyezett tesztek alapján nem reaktív HIV 1/2, HCV-, HBsAg-, valamint HBc-antitestre; HIV-1 RNS, HIV-2 RNS, HCV RNS és HBV DNS PCReljárásokkal nem mutatható ki 0,1% ProClin 300 tartósítószer 10 0,75 ml Doc. Rev

9 Készlet Összetevk és reagensek Készletenkénti mennyiség Biztonsági jelzés és figyelmeztetés a cobas 4800 System Sample Preparation Kit teszt (P/N: ) MGP 2 (cobas 4800 MGP reagens 2) Mágneses üvegpartikulumok, trisz puffer, 0,1% metil-4-hidroxibenzoát, < 0,1% nátrium-azid EB 2 (cobas 4800 eluáló puffer 2) Trisz puffer, 0,2% metil-4-hidroxi-benzoát 10 8 ml ml N/A MGP 2 cobas 4800 System Sample Preparation Kit teszt (P/N: ) (cobas 4800 MGP reagens 2) Mágneses üvegpartikulumok, trisz puffer, 0,1% metil-4-hidroxibenzoát, < 0,1% nátrium-azid EB 2 (cobas 4800 eluáló puffer 2) Trisz puffer, 0,2% metil-4-hidroxi-benzoát ml ml cobas 4800 System Wash Buffer Kit 240 teszt (P/N: ) WB (cobas 4800 rendszer mosópuffer)nátrium-citrát-dihidrát, 0,05% N-metilizotiazolon-HCl ml N/A cobas 4800 System Wash Buffer Kit 960 teszt (P/N: ) WB (cobas 4800 rendszer mosópuffer)nátrium-citrát-dihidrát, 0,05% N-metilizotiazolon-HCl ml N/A cobas 4800 System Specimen Diluent teszt (P/N: ) SD 2 Trisz puffer, 0,1% metil-4-hidroxibenzoát, < 0,1% nátrium-azid 10 8 ml N/A Doc. Rev

10 Készlet Összetevk és reagensek Készletenkénti mennyiség Biztonsági jelzés és figyelmeztetés a Veszély P 2 (cobas 4800 proteáz 2) Trisz puffer, < 0,05% EDTA, kalcium-klorid, kalcium-acetát, 8% (m/v) proteináz 10 1,0 ml H302+H332 Lenyelve vagy belélegezve ártalmas. H315 Brirritáló hatású. H318 Súlyos szemkárosodást okoz. H334 Belélegezve allergiás és asztmás tüneteket, és nehéz légzést okozhat. H412 Ártalmas a vízi élvilágra, hosszan tartó károsodást okoz. cobas 4800 System Lysis Kit teszt (P/N: ) EUH032 Savval érintkezve nagyon mérgez gázok képzdnek. P261 Kerülje a por/füst/gáz/köd/gzök/ permet belélegzését. P280 Védkeszty/szemvéd/arcvéd használata kötelez. P284 Légzésvédelem használata kötelez. LYS 2 (cobas 4800 lízispuffer 2) 43% (m/v) guanidin-tiocianát, 5% (m/v) polidokanol, 2% (m/v) ditiotreitol, nátrium-citrát-dihidrát ml P305 + P351 + P338 + P310: SZEMBE KERÜLÉS ESETÉN: Több percig tartó óvatos öblítés vízzel. Adott esetben a kontaktlencsék eltávolítása, ha könnyen megoldható. Az öblítés folytatása. Azonnal forduljon TOXIKO- LÓGIAI KÖZPONTHOZ vagy orvoshoz. P342 + P311 Légzési problémák esetén: Forduljon TOXIKOLÓGIAI KÖZPONTHOZ vagy orvoshoz. P362 + P364 A szennyezett ruhát le kell vetni és az újbóli használat eltt ki kell mosni. Doc. Rev

11 Készlet Összetevk és reagensek Készletenkénti mennyiség Biztonsági jelzés és figyelmeztetés a cobas 4800 System Lysis Kit teszt (P/N: ) a P 2 (cobas 4800 proteáz 2) Trisz puffer, < 0,05% EDTA, kalcium-klorid, kalcium-acetát, 8% (m/v) proteináz LYS 2 (cobas 4800 lízispuffer 2) 43% (m/v) guanidin-tiocianát, 5% (m/v) polidokanol, 2% (m/v) ditiotreitol, nátrium-citrát-dihidrát A termék biztonsági címkéi megfelelnek az EU GHS elírásainak. 10 1,0 ml ml Veszély H302+H332 Lenyelve vagy belélegezve ártalmas. H315 Brirritáló hatású. H318 Súlyos szemkárosodást okoz. H334 Belélegezve allergiás és asztmás tüneteket, és nehéz légzést okozhat. H412 Ártalmas a vízi élvilágra, hosszan tartó károsodást okoz. EUH032 Savval érintkezve nagyon mérgez gázok képzdnek. P261 Kerülje a por/füst/gáz/köd/gzök/ permet belélegzését. P280 Védkeszty/szemvéd/arcvéd használata kötelez. P284 Légzésvédelem használata kötelez. P305 + P351 + P338 + P310: SZEMBE KERÜLÉS ESETÉN: Több percig tartó óvatos öblítés vízzel. Adott esetben a kontaktlencsék eltávolítása, ha könnyen megoldható. Az öblítés folytatása. Azonnal forduljon TOXIKO- LÓGIAI KÖZPONTHOZ vagy orvoshoz. P342 + P311 Légzési problémák esetén: Forduljon TOXIKOLÓGIAI KÖZPONTHOZ vagy orvoshoz. P362 + P364 A szennyezett ruhát le kell vetni és az újbóli használat eltt ki kell mosni. Doc. Rev

12 A reagensek tárolási és kezelési feltételei Reagens Tárolási hmérséklet Tárolási id cobas HIV C A jelölt lejárati dátumig stabil cobas HBV/HCV/HIV-1 Control Kit 2 8 C A jelölt lejárati dátumig stabil cobas 4800 System Sample Preparation Kit C A jelölt lejárati dátumig stabil cobas 4800 System Wash Buffer Kit C A jelölt lejárati dátumig stabil cobas 4800 System Specimen Diluent C A jelölt lejárati dátumig stabil cobas 4800 System Lysis Kit C A jelölt lejárati dátumig stabil Ne fagyassza le a reagenseket. További szükséges anyagok Anyagok cobas 4800 rendszer kivonási (mély lyukú) lemeze, 2,0 ml cobas 4800 rendszer AD (kislyukú) lemeze, 0,3 ml Zárófólia-felhelyez CORE hegyek, 1000 µl, 96-os állványban ml-es reagenstároló ml-es reagenstároló pozíciós hordozó pozíciós hordozó Szilárdhulladék-zacskó Hamilton STAR manyag csúsztató Egyszer használatos kesztyk, púdermentes Vortex kever (egycsöves) Centrifuga, kilendül fejes rotorral, minimum 1500 RCF P/N (kicsi) vagy (nagy) Bármely púdermentes egyszer használatos keszty elfogadható. Bármely vortexkever elfogadható. Bármely megfelel centrifuga elfogadható. A külön beszerezhet anyagokkal kapcsolatos további információkért forduljon a Roche helyi képviseljéhez. Doc. Rev

13 Szükséges, de nem biztosított eszközök és szoftverek Szükséges, de nem biztosított eszközök és szoftverek cobas 4800 rendszer cobas x 480 készülék cobas z 480 analizátor Vezérlegység cobas 4800 System Application Software (Core) ás vagy újabb verzió cobas 4800 rendszer cobas HIV-1 AP ás vagy újabb verziója A készülékeken használható elsdleges és másodlagos mintacsövekkel kapcsolatos további információkat a cobas 4800 rendszer kézikönyve 2.1-es vagy újabb szoftver, cobas HIV-1 a cobas 4800 rendszerrel való használattal (innentl röviden: cobas 4800 rendszer kézikönyve cobas HIV-1-hez ) cím kiadványban találja. Megjegyzés: A készülékekkel használható mintaállványok, hegyállványok, reagensállványok és lemezhordozók részletes megrendellistájáért forduljon a Roche helyi képviseljéhez. Óvintézkedések és kezelési követelmények Figyelmeztetések és óvintézkedések Mint minden teszteljárásnál, a helyes laboratóriumi gyakorlat alapvet a teszt megfelel kivitelezéséhez. A vizsgálat nagy analitikai érzékenysége miatt ügyeljen arra, hogy a reagensek, minták és amplifikálási keverékek szennyezdéstl mentesek maradjanak. Csak in vitro diagnosztikai célra. A cobas HIV-1 tesztet nem értékelték ki HIV-1 szrtesztként vérben vagy vérkészítményekben. Minden betegtl származó mintát fertzként, megfelel biztonságos laboratóriumi eljárásokat alkalmazva kell kezelni. Ilyeneket ír le a Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories és a CLSI Document M29-A4. 17,18 Ezt a vizsgálatot csak a fertz anyagok kezelésében és a cobas HIV-1 és cobas 4800 rendszer használatában jártas személy végezheti. Minden humán eredet anyagot potenciálisan fertznek kell tekinteni, és az általános óvintézkedések szerint kezelni. A cobas HBV/HCV/HIV-1 kontrollkészlet emberi vérbl származó plazmát tartalmaz. A forrásanyagot engedélyezett antitest-vizsgálattal tesztelték, és nem bizonyult reaktívnak HCV-, HIV-1/2, HBsAg- és HBc-antitest jelenlétére. A PCR-eljárásokkal történ tesztelés során HIV-1 RNS, HIV-2 RNS, HCV RNS vagy HBV DNS nem volt kimutatható. Egyetlen ismert vizsgálati módszer sem nyújthat teljes garanciát arra, hogy a humán vérkészítményekben nincs jelen fertz anyag. Ügyeljen rá, hogy a mágneses üvegpartikulumok ne kerüljenek mágneses mezk közelébe. Ne fagyassza a teljes vért és az elsdleges csövekben tárolt mintákat. Az optimális vizsgálati feltételek biztosítása érdekében csak a szállított vagy a megadott szükséges fogyóeszközöket alkalmazza. A biztonsági adatlapok (SDS) igény esetén hozzáférhetek a Roche helyi irodájában. Doc. Rev

14 cobas HIV-1 A vizsgálat helyes kivitelezésének biztosítása végett szigorúan tartsa be a megadott eljárásokat és irányelveket. A megadott eljárásoktól és irányelvektl való bármilyen eltérés befolyásolhatja a vizsgálat teljesítményét. Álpozitív eredmények fordulhatnak el, ha a minták átvitelét a mintakezelés és -feldolgozás során nem kontrollálják megfelelen. A cobas x 480 készülék, illetve cobas z 480 analizátor fertzési kockázatának csökkentésére vonatkozó további figyelmeztetéseket, óvintézkedéseket és eljárásokat a cobas 4800 rendszer kézikönyve cobas HIV-1-hez cím kiadványban találja. Ha felmerül a szennyezdés gyanúja, végezzen tisztítást és heti karbantartást a cobas 4800 rendszer kézikönyve cobas HIV-1-hez és a cobas 4800 rendszer kézikönyve szerint. Megjegyzés: A konkrét utasításokat a Minták levétele, szállítása és tárolása cím részben találja. Helyes laboratóriumi gyakorlat Ne pipettázzon szájjal. Ne egyen, igyon vagy dohányozzon a laboratórium területén. Alaposan mosson kezet a minták és a készlet reagenseinek kezelése és kesztylevétel után. Viseljen szemvédt, védruhát és egyszer használatos védkesztyt minden reagens kezelése közben. Ezen anyagok brrel, szemmel és nyálkahártyával való érintkezése kerülend. Ha mégis érintkezésbe kerülnek, azonnal öblítse le b vízzel. Ellenkez esetben égés jelentkezhet. A reagenseket kiömlés esetén szárazra törlés eltt hígítsa vízzel. Gondosan tisztítson meg, és desztillált vagy ioncserélt vízbl frissen készített 0,5%-os nátriumhipoklorit oldattal (1:10 arányban hígított háztartási fehérítszer) ferttlenítsen minden laboratóriumi munkafelületet. Ezután törölje át 70%-os etanollal a felületet. Reagensek kezelése A minták és kontrollok átvitelének elkerülése érdekében minden reagenst, kontrollt és mintát a helyes laboratóriumi gyakorlat szerint kezeljen. Felhasználás eltt szemrevételezzen minden reagensüveget és csövet, hogy nem tapasztal-e szivárgásra utaló jeleket. Szivárgás esetén azt az anyagot ne használja fel a vizsgálathoz. A cobas 4800 lízispuffer 2 guanidin-tiocianátot tartalmaz, ami potenciálisan veszélyes vegyület. Kerülje a reagensek brrel, szemmel vagy nyálkahártyával való érintkezését. Ha mégis elfordul érintkezés, azonnal mossa le b vízzel, mert ellenkez esetben égés történhet. A cobas HIV-1, cobas 4800 minta-elkészít készlet 2 és a cobas 4800 rendszer mintaoldószer 2 oldata tartósítószerként nátrium-azidot tartalmaz. Kerülje a reagensek brrel, szemmel vagy nyálkahártyával való érintkezését. Ha mégis elfordul érintkezés, azonnal mossa le b vízzel, mert ellenkez esetben égés történhet. Ha a reagensek kiömlenek, szárazra törlés eltt hígítsa ket vízzel. Ügyeljen rá, hogy a guanidin-tiocianát tartalmú cobas 4800 lízispuffer 2 ne lépjen érintkezésbe nátrium-hipoklorit-oldattal (fehérít). Az ilyen keverékbl ersen mérgez gáz fejldhet. Szennyezdés Viseljen kesztyt, és a minták, valamint a cobas HIV-1-reagensek kezelése között váltson kesztyt. A minták és kontrollok kezelése során ügyeljen a kesztyk szennyezésének elkerülésére. A minták és a készlet reagenseinek kezelése közben viseljen kesztyt, köpenyt és szemvédt. Kerülje a reagensek mikrobiális és ribonukleáz-szennyezését. Álpozitív eredmények fordulhatnak el, ha a mintakezelés során nem ügyel a minták átvitelének elkerülésére. Doc. Rev

15 Felhasználhatóság Ne használja a készleteket a lejárati id után. Ne öntse össze a reagenseket. Ne használjon egyszer használatos anyagokat a lejárati id után. Az egyszer használatos anyagokat csak egyszer szabad felhasználni. Ne használja újra azokat. Valamennyi felszerelést a gyártó utasításai szerint megfelelen karban kell tartani. Hulladékkezelés A cobas HIV-1, cobas 4800 minta-elkészít készlet 2 és a cobas 4800 rendszer mintaoldószer 2 oldata nátrium-azidot tartalmaz (lásd: Figyelmeztetések és óvintézkedések ). A nátrium-azid az ólom- és rézcsövekkel reakcióba lépve ersen robbanékony fém-azidokat képezhet. Amikor nátriumazid tartalmú oldatot önt ki a laboratóriumi mosogatóba, az azidlerakódás megakadályozása céljából nagy mennyiség hideg vízzel öblítse le a lefolyót. A fel nem használt reagensek és hulladék kezelésének összhangban kell lennie a megfelel országos, szövetségi, állami és helyi szabályozásokkal. Megjegyzés: A folyékony hulladék megfelel hulladékkezelésének leírását a megfelel cobas 4800 rendszer felhasználói kézikönyvében találja. Kiömlés és tisztítás A cobas 4800 lízispuffer 2 guanidin-tiocianátot tartalmaz. Ha guanidin-tiocianátot tartalmazó folyadék ömlik ki, megfelel laboratóriumi tisztítószerrel és vízzel tisztítsa fel. Ha potenciálisan fertz anyagot tartalmazó folyadék ömlik ki, ELSZÖR laboratóriumi tisztítószerrel és vízzel, majd 0,5%-os nátriumhipoklorit oldattal tisztítsa meg az érintett területet. Ha a cobas x 480 készülékre folyadék ömlik, a készüléket a megfelel cobas 4800 rendszer kézikönyvének utasításai alapján tisztítsa meg. Ne használjon nátrium-hipoklorit oldatot (fehérítszert) a cobas x 480 készülék vagy a cobas z 480 analizátor tisztításához. A cobas x 480 készüléket vagy a cobas z 480 analizátort a megfelel cobas 4800 rendszer kézikönyvének utasításai szerint tisztítsa meg. Doc. Rev

16 Minták levétele, szállítása és tárolása Megjegyzés: Valamennyi mintát fertz ágensek átvitelére alkalmasként kell kezelni. Mintavétel Az összes mintát az elírt hmérséklettartományban tárolja. A minták stabilitását a magasabb hmérséklet befolyásolja. Ha a másodlagos csövekben fagyasztott mintákat használ, tartsa ket szobahmérsékleten (15 30 C), amíg teljesen ki nem olvadnak, majd rövid ideg keverje (pl. 3 5 másodpercig vortexelje) és utána centrifugálja, hogy a minta teljes térfogata a cs aljára kerüljön. A vért molekulárdiagnosztikai tesztmódszerekhez való BD Vacutainer PPT plazma-elkészít csövekbe vagy EDTA véralvadásgátlót tartalmazó steril csövekbe vegye le. Megjegyzés: A felhasználó a szérum vagy plazma elkészítése során mindig kövesse a csövek gyártójának utasításait. Minták szállítása, tárolása és stabilitása A molekulárdiagnosztikai tesztmódszerekhez való BD Vacutainer PPT plazma-elkészít csövekbe vagy EDTA véralvadásgátlót tartalmazó steril csövekbe levett teljes vért 24 órán belül 2 C és 25 C között lehet tárolni és/vagy szállítani a plazma-elkészítés és az azt követ vizsgálat eltt. A plazmamintákat a másodlagos csövekben legfeljebb 24 órán át 2 C és 30 C között, legfeljebb 72 órán át 2 C és 8 C között vagy legfeljebb 6 héten át 18 C hmérsékleten lehet tárolni. Az elválasztott plazmaminták a másodlagos csövekben 18 C hmérsékleten történ tárolás esetén legfeljebb három fagyasztás olvasztás ciklusban maradnak stabilak fagyasztva. Ha a mintákat szállítani kell, a minták és kórokozó anyagok szállítására vonatkozó országos és/vagy nemzetközi elírásoknak megfelelen kell csomagolni és címkézni. Doc. Rev

17 Használati utasítás A teszt futtatása Mintafeldolgozási térfogat A cobas HIV-1 alapértelmezett mintafeldolgozási térfogata 400 µl. Kis térfogatú minták esetén választható a 200 µl-es mintafeldolgozási térfogat. Csak ebben az esetben a cobas 4800 rendszer mintaoldószer 2 oldatát további reagensként a rendszerbe kell tölteni. A felhasználót a szoftver varázslója erre felszólítja, ha a munkasorrend létrehozásakor a Diluted plasma (oldott plazma) lehetséget választotta. Munkafolyamat 1. ábra: A cobas HIV-1 munkafolyamata 1 A rendszer indítása 2 A készülék karbantartásának elvégzése 3 A tárolt minták és reagensek elvétele 4 A futtatás indítása 5 A paraméterkártyák olvasása 6 A minták betöltése 7 LIS esetén: a munkasorrend jóváhagyása LIS nélkül: a munkasorrend létrehozása 8 A fogyóeszközök (mély lyukú lemez, mikrolemez, hegyállványok) betöltése 9 A reagensek betöltése 10 A minta-elkészítési futtatás indítása 11 A mikrolemez eltávolítása és lezárása 12 A mikrolemez analizátorba helyezése 13 A minták, használt reagensek és mély lyukú lemez eltávolítása 14 Az eredmények áttekintése 15 LIS esetén: az eredmények LIS-be küldése 16 Az eszközök és anyagok kivétele az analizátorból Megjegyzés: A részletes használati utasításokat a cobas 4800 rendszer kézikönyve cobas HIV-1- hez cím kiadványban találja. Doc. Rev

18 Futtatási mennyiség A cobas HIV-1 teszt a cobas 4800 rendszer kézikönyve cobas HIV-1-hez cím kiadványban ismertetett minimálisan szükséges mintatérfogatokkal futtatható. A cobas 4800 rendszer támogatja a vegyes mintacsoportok futtatását. A generikus minta-elkészítési reagensek (cobas 4800 rendszer minta-elkészít készlet 2, cobas 4800 rendszer líziskészlet 2 és cobas 4800 rendszer mosófolyadék-készlet) kétféle méret készletben érhetk el. Mindkett 10 futtatásra alkalmas, egyszerre legfeljebb 24, illetve 96 mintával, amibe beletartoznak a futtatandó kontrollok és minták. A cobas HIV-1 egyféle méret készletben érhet el, és legfeljebb 120 (10 12) minta tesztelésére alkalmas (beleértve a kontrollokat és mintákat is). Minden mintacsoporthoz egy HBV/HCV/HIV-1 alacsony pozitív kontrollt, egy HBV/HCV/HIV-1 magas pozitív kontrollt és egy negatív kontrollt kell használni. Egy tesztfuttatásban legfeljebb 93 minta és 3 kontroll megengedett. A teszteljárást részletes ismertetését a cobas 4800 rendszer kézikönyve cobas HIV-1-hez tartalmazza. A(z) 1. ábra összefoglalja az eljárást. Megjegyzés: A reagensek optimális felhasználása érdekében a generikus minta-elkészítési reagenseket összesen 1 21 mintát tartalmazó futtatáshoz lehet használni (10 24-es tesztkészlet-méret) vagy összesen 1 93 mintához (10 96-os tesztkészlet-méret). A cobas 4800 rendszer mosófolyadék-készlet, a cobas 4800 rendszer minta-elkészít készlet 2 és a cobas 4800 rendszer líziskészlet 2 különböz méretei azonban nem kombinálhatók. Ha például a futtatás kezdetén a 96-tesztes mosópuffer reagensüvegét olvassa be, a többi minta-elkészítési reagenskészletbl is 96 teszthez való reagenseket használjon. Munkafolyamat A cobas HIV-1 teszt kivitelezése a cobas 4800 szoftver teljes munkafolyamatának használatával történik. Ez minta-elkészítési lépésbl áll a cobas x 480 készüléken, amit amplifikálási/kimutatási lépés követ a cobas z 480 analizátoron. A futtatás lehet csak HIV-1 vagy vegyes mintacsoport olyan tesztekkel, amelyek ugyanazt az automatizált mintaextrahálási eljárást és PCR-profilt igénylik az amplifikáláshoz és kimutatáshoz. A szoftver tesztkiválasztó lépésében megjelennek azok a tesztek, amelyek alkalmasak a cobas HIV-1 teszttel együtt történ futtatásra. A részleteket a cobas 4800 rendszer kézikönyve cobas HIV-1-hez cím kiadványban találja. 1. Végezze el a rendszer indítását és karbantartását a cobas 4800 rendszer kézikönyve cobas HIV-1- hez cím kiadvány A készülék karbantartása cím részében leírtak szerint. 2. Készítse ki az összes szükséges reagenst és fogyóeszközt. A HIV-1 MMX R2 és MMX R1 kivételével a cobas x 480 készülékbe történ betöltés eltt minden reagensnek szoba-hmérsékletnek kell lennie. A HIV-1 MMX R2 és MMX R1 reagenst a 2 8 C-os tárolásból közvetlenül is kiveheti, mert a folyamatban való felhasználásuk eltt a cobas x 480 készülékben töltött id alatt felveszik a szobahmérsékletet. Megjegyzés: Minden reagens és reagenstároló vonalkóddal van ellátva, és egyszeri használatra tervezve. A cobas 4800 szoftver nyomon követi a reagensek és reagenstárolók felhasználását, és nem fogadja el a korábban már használt reagenseket és reagenstárolókat. 3. Indítson új futtatást, és válassza a HIV-1 munkafolyamat-típust. Háromféleképpen hozhat létre munkasorrendet: A mintaszerkeszt használatával, mieltt a mintaállványt a cobas x 480 készülékbe helyezi ( Editor gomb a fmenü jobb oldalán). A munkasorrendeket szükség szerint mentheti, szerkesztheti és újratöltheti. Doc. Rev

19 A szoftvervarázsló új futtatáshoz történ használatával. Ebben az esetben a mintákat akkor tölti be a cobas x 480 készülékbe, amikor a varázsló erre felszólítja. A rendszer automatikusan beolvassa a minták vonalkódjait, és minden mintához meg kell határozni a kért eredményeket. Az intézmény LIS rendszerének használatával. A további részleteket a cobas 4800 rendszer kézikönyve cobas HIV-1-hez cím kiadványban találja. A kért eredmények kiválasztásakor jelölje be a HIV-1 lehetséget. 4. Töltse be a mintákat, és határozzon meg vagy válasszon egy munkasorrendet, illetve használja a LIS-t. A minimális mintatérfogat a cs típusától és méretétl függ. A további részleteket a cobas 4800 rendszer kézikönyve cobas HIV-1-hez cím kiadványban találja. 5. Kövesse a szoftvervarázsló utasításait, és töltse be a fogyóeszközöket. Ne töltsön be vagy távolítson el külön hegyeket részben használt hegyállványra vagy hegyállványról, mivel a szoftver nyomon követi a fennmaradó hegyek számát. Ha nincs elég hegy az adott futtatáshoz, a szoftver figyelmezteti a felhasználót. 6. Töltse be a minta-elkészítési reagenseket a vonalkóddal ellátott reagenstárolókba. A reagenstárolók két méretben állnak rendelkezésre: 200 ml és 50 ml. Kövesse a szoftvervarázslót a reagenstárolók megfelel méretének kiválasztásához. A reagenstároló vonalkódja a hordozó jobb oldala felé kell, hogy nézzen. Beolvas-beolvas-beönt-behelyez módszerrel töltse be a minta-elkészítési reagenseket: Olvassa be a reagensüveg vonalkódját. Olvassa be a reagenstároló vonalkódját. Öntse be a reagenst a tárolóba. Helyezze be a feltöltött reagenstárolót a reagenshordozó megfelel pozíciójába. Megjegyzés: A cobas 4800 rendszer bels órával méri a reagensek készülékben töltött idejét. A LYS 2 vagy WB reagens beolvasásától számítva 1 óra áll rendelkezésre a betöltési eljárás elvégzésére és a Start gomb megnyomására. A Workplace lapon visszaszámláló jelenik meg. A rendszer a bels idkorlát letelte után nem engedi a futtatás indítását. Megjegyzés: Az MGP pontos átvitelének érdekében közvetlenül a reagenstárolóba mérés eltt vortexelje vagy alaposan rázza fel az MGP-reagenscsövet. 7. Töltse be az amplifikálási/kimutatási reagenscsöveket (HIV-1 MMX R2, MMX R1 és RNA QS), a kontrollcsöveket [HBV/HCV/HIV-1 L(+)C, HBV/HCV/HIV-1 H(+)C és ( ) C] és a generikus reagenscsöveket (P2 és SD2, szükség szerint) közvetlenül a reagenshordozóba. A futtatás felesleges megszakítása és a szennyezdés megelzése érdekében pöccintse meg a reagenscsöveket, hogy ne képzdjenek buborékok vagy folyadékfilmek, és a pozitív kontrollok kezelése után váltson kesztyt. 8. A sikeres minta-elkészítési futtatás után mködképes lesz a Sample Preparation results (mintaelkészítés eredményei) és az Unload (eltávolítás) gomb. Ha kívánja, a Sample Preparation results gomb kiválasztásával áttekintheti az eredményeket, majd válassza ki az Unload gombot a lemezhordozók eltávolításához. Az eredmények áttekintése nélkül is eltávolíthatja a lemezhordozót, ha kiválasztja az Unload gombot. További információkat a cobas 4800 rendszer kézikönyve cobas HIV-1-hez cím kiadványban talál. 9. Kislyukú lemez lezárása és a lemez cobas z 480 analizátorba vitele, valamint az amplifikálási és kimutatási futtatás indítása során kövesse a cobas 4800 rendszer kézikönyve cobas HIV-1-hez cím kiadvány utasításait. Doc. Rev

20 Megjegyzés: A cobas 4800 rendszer bels órával méri az elkészített minták aktivált Master Mix reagenshez adása óta eltelt idt. Az amplifikálást és kimutatást minél hamarabb, de nem késbb mint 40 perccel a cobas x 480 készülék futásának befejezése után meg kell kezdeni. A Workplace lapon visszaszámláló jelenik meg. A rendszer a visszaszámláló lejárta után megszakítja a futtatást. 10. Miután egy amplifikálási és detektálási futás befejezdött, távolítsa el a kislyukú lemezt a cobas z 480 analizátorból. 11. Az eredmények áttekintése és elfogadása során kövesse a cobas 4800 rendszer kézikönyve cobas HIV-1-hez cím kiadvány utasításait. Eredmények A cobas 4800 rendszer automatikusan meghatározza a minták és kontrollok HIV-1 RNS koncentrációját. A HIV-1 RNS koncentráció mértékegysége a milliliterenkénti kópia (cp/ml) vagy a a milliliterenkénti nemzetközi egység (IU/ml). A cobas HIV-1 teszt váltószáma 0,6 cp/iu. Minségellenrzés és az eredmények érvényessége Minden feldolgozott mintacsoportba tartozik egy negatív kontroll ( ) C és két pozitív kontroll, egy alacsony pozitív kontroll HBV/HCV/HIV-1 L(+)C és egy magas pozitív kontroll HBV/HCV/HIV-1 H(+)C. A cobas 4800 szoftverben és/vagy jelentésben ellenrizze, hogy a csoport érvényes-e. A cobas 4800 automatikusan érvényteleníti az eredményeket a negatív és pozitív kontrollok helytelen jelzi alapján. Kontrolljelzk 1. táblázat: A negatív és pozitív kontrollok kontrolljelzi Negatív kontroll Jelz azonosítója Eredmény Magyarázat ( ) C R4803, R4804 (A kontrollcsoport sikertelen) Invalid Pozitív kontroll Jelz azonosítója Eredmény Magyarázat HBV/HCV/HIV-1 L(+)C HBV/HCV/HIV-1 H(+)C R4803, R4804 (A kontrollcsoport sikertelen) R4803, R4804 (A kontrollcsoport sikertelen) Invalid Invalid Érvénytelen eredmény, vagy a negatív kontroll számított titereredménye nem negatív. Érvénytelen eredmény vagy az alacsony pozitív kontroll számított titer eredménye nem esik a megadott tartományba. Érvénytelen eredmény vagy a magas pozitív kontroll számított titer eredménye nem esik a megadott tartományba. Ha a mintacsoport érvénytelen, ismételje meg az egész csoport (mind a minták, mind a kontrollok) tesztelését. Doc. Rev

21 Az eredmények értelmezése Megjegyzés: Minden vizsgálat és mintacsoport érvényességét a cobas 4800 szoftver határozza meg. Megjegyzés: Egy érvényes csoport érvényes és érvénytelen mintaeredményeket is tartalmazhat. A szoftver az érvényes csoporthoz a minták eredményeit a 2. táblázat szerint értelmezi. 2. táblázat: Az egyes céleredmények értelmezése a cobas HIV-1 Target Not Detected < Titer Min Titer Nincs kimutatott HIV RNS. Eredményjelentés és -értékelés Az eredmény a jelentésben HIV not detected (nincs kimutatható HIV). A számított titer a vizsgálat alsó mennyiségi meghatározási határa (LLoQ) alatt van. Az eredmény a jelentésben HIV detected, less than (Titer Min) (a kimutatott HIV titere nem éri el a minimális értéket). Titer min = 2,00E+01 cp/ml és 3,33E+01 IU/ml (400 µl) Titer min = 6,00E+01 cp/ml és 1,00E+02 IU/ml (200 µl) A számított titer a teszt lineáris tartományába esik: legalább Titer Min, és legfeljebb Titer Max. Az eredmény a jelentésben: (Titer) of HIV-1 detected (adott titer HIV-1 mutatható ki). A számított titer a vizsgálat fels mennyiségi meghatározási határa (ULoQ) fölött van. > Titer Max a Az eredmény a jelentésben HIV detected, greater than (Titer Max) (a kimutatott HIV titere meghaladja a maximális értéket). Titer max = 1,00E+07 cp/ml és 1,67E+07 IU/ml (400 µl és 200 µl) A minta eredménye > Titer Max olyan kimutatott HIV-1-pozitív titert jelent, ami meghaladja a fels mennyiségi meghatározási határt (ULoQ). Ha mennyiségi eredményre van szükség, hígítsa az eredeti mintát HIV-1-negatív EDTA-s plazmával, és tesztelje újra. Szorozza meg a mért eredményt a hígítási faktorral. Doc. Rev

22 Az eljárással kapcsolatos korlátozások 1. Acobas HIV tesztet csak a cobas HBV/HCV/HIV-1 kontrollkészlettel, cobas 4800 rendszer mintaelkészít készlet 2, cobas 4800 rendszer líziskészlet 2, cobas 4800 rendszer mosófolyadék-készlet és cobas 4800 rendszer mintaoldószer 2 oldatokkal együtt használva vizsgálták. 2. A megbízható eredmény a megfelel mintalevételen, szállításon, tároláson és feldolgozáson múlik. Kövesse a jelen használati útmutatóban és a megfelel cobas 4800 rendszer kézikönyve a cobas HIV-1-hez cím kiadványban leírt eljárásokat. 3. Ezt a tesztet csak EDTA-s plazmával való használatra validálták. Más típusú minták tesztelése pontatlan eredménnyel járhat. 4. A HIV-1 RNS mennyiségi meghatározása a mintában jelenlév víruspartikulumoktól függ, ezért befolyásolhatják a mintavételi módszerek, betegfaktorok (azaz kor, tünetek megléte) és/vagy a fertzés stádiuma. 5. Ritkán bár, de elfordulhat, hogy a cobas HIV-1 primerei és/vagy próbái által lefedett virális genom nagy fokban konzervált régióiban lév mutációk következtében a vírusmennyiség kevesebbnek adódik, vagy a vírus kimutatása sikertelen lesz. 6. A vizsgálat prediktív értéke a betegség elfordulási arányától függ az adott populációban. 7. Az AmpErase enzim hozzáadása a cobas HIV-1 Master Mixhez lehetvé teszi a targetnukleinsav szelektív amplifikálását, ugyanakkor a reagensek és amplifikálási keverékek szennyezdésének elkerüléséhez a helyes laboratóriumi gyakorlat és ezen használati utasításban meghatározott eljárások gondos betartása szükséges. 8. A terméket csak a PCR-technikák alkalmazására és a cobas 4800 rendszer használatára kiképzett dolgozók használhatják. 9. Csak a cobas x 480 készüléket és a cobas z 480 analizátort validálták a termékkel való használatra. A termékkel nem használható más minta-elkészít készülék vagy PCR rendszer. 10. A technológiák különbözsége miatt javasolt, hogy az egyik technológiáról a másikra való áttéréskor a felhasználók végezzenek korrelációs laboratóriumi vizsgálatokat, hogy a technológiák közötti különbség minsíthet legyen. A felhasználóknak a helyi specifikus irányelveket/eljárásokat kell követniük. 11. A keresztszennyezdés álpozitív eredményeket okozhat. A cobas HIV-1 tesztnél a minták közötti keresztszennyezdés arányát egy nem klinikai vizsgálatban 0,0%-osnak találták. Nem figyeltek meg futtatások közötti keresztszennyezdést. 12. A cobas HIV-1 tesztnek nem célja a HIV-1 vérben vagy vértermékekben való szrése. Doc. Rev

23 A nem klinikai teljesítmény értékelése A fontosabb teljesítményjellemzk Kimutatási határ (LoD) WHO Nemzetközi standard A cobas HIV-1 kimutatási határát az NIBSC-tl származó WHO HIV-1 RNS nemzetközi standard szerinti (WHO International Standard for HIV-1 RNA for Nucleic Acid Amplification Technology Assays 2. WHO nemzetközi standard), M csoport, B altípus sorozathígításának elemzésével állapították meg, amelyet HIV-negatív EDTA-s plazmában vizsgáltak 400 µl-es és 200 µl-es mintafeldolgozási térfogattal. Hat koncentrációszintbl és egy negatív kontrollból álló paneleket teszteltek a cobas HIV-1 reagensek három gyártási tételével, több futtatásban, napon, kezelvel és készüléken. A 3. táblázat és a 4. táblázat a két mintafeldolgozási térfogat EDTA-s plazmaeredményeit tartalmazza. A vizsgálat eredménye szerint a cobas HIV-1 a HIV-1 RNS-t 400 µl-es mintafeldolgozási térfogatnál 14,2 cp/ml (23,7 IU/ml) koncentrációban mutatta ki, 200 µl-es mintafeldolgozási térfogatnál pedig 43,9 cp/ml (73,4 IU/ml) koncentrációban 95%-os PROBIT találati aránnyal 3. táblázat : Kimutatási határ EDTA-s plazmában (400 µl) Bemeneti titer koncentrációja (HIV-1 RNS, cp/ml) Bemeneti titer koncentrációja (HIV-1 RNS, IU/ml) Érvényes ismétlések száma Pozitívok száma Találati arány 60,0 100, ,0% 30,0 50, ,0% 20,0 33, ,0% 10,0 16, ,1% 5,0 8, ,5% 2,0 3, ,1% 0,0 0, ,0% LoD PROBIT szerinti 95% találati arány mellett 14,2 cp/ml; 95% konfidenciaintervallum: 12,5 16,6 cp/ml 23,7 IU/ml; 95% konfidenciaintervallum: 20,8-27,7 IU/ml Doc. Rev

24 4. táblázat: Kimutatási határ EDTA-s plazmában (200 µl) Bemeneti titer koncentrációja (HIV-1 RNS, cp/ml) Bemeneti titer koncentrációja (HIV-1 RNS, IU/ml) Érvényes ismétlések száma Pozitívok száma Találati arány 100,0 166, ,0% 60,0 100, ,2% 30,0 50, ,4% 15,0 25, ,8% 7,0 11, ,0% 3,5 5, ,2% 0,0 0, ,0% LoD PROBIT szerinti 95% találati arány mellett 43,9 cp/ml; 95% konfidenciaintervallum: 37,7-52,7 cp/ml 73,4 IU/ml; 95% konfidenciaintervallum: 62,9-88,1 IU/ml Lineáris tartomány A cobas HIV-1 linearitását egy 12 tagú és egy 11 tagú panellal vizsgálták (400 µl-es, illetve 200 µl-es mintafeldolgozási térfogattal), ahol a predomináns HIV-1 (M csoport, B altípus) lefedte a teszt lineáris tartományát. A paneltagokat magas titer, HIV-1 RNS-re pozitív sejttenyészet felülúszó mintájából készítették. 400 µl-es mintafeldolgozási térfogatnál a cobas HIV-1 lineáris volt a 20,0 cp/ml 1,00E+07 cp/ml (33,3 IU/ml 1,67E+07 IU/ml) tartományban, és a maximális eltérés a jobban illeszked nemlineáris regressziótól kisebb volt, mint ± 0,07 log 10 (lásd: 2. ábra). A lineáris tartományban a teszt pontossága ± 0,18 log 10 értéken belül volt. 200 µl-es mintafeldolgozási térfogatnál a cobas HIV-1 lineáris volt a 60,0 cp/ml 1,00E+07 cp/ml (100,0 IU/ml 1,67E+07 IU/ml) tartományban, és a maximális eltérés a jobban illeszked nemlineáris regressziótól kisebb volt, mint ± 0,08 log 10 (lásd: 3. ábra). A lineáris tartományban a teszt pontossága ± 0,19 log 10 értéken belül volt. Doc. Rev

25 2. ábra: A lineáris tartomány meghatározása EDTA-s plazmában (400 µl) Megfigyelt logaritmikus titer [koncentrációegység] Megfigyelések Az adott tartományban Regressziós egyenes Az eltérés fels határa Az eltérés alsó határa Megadott logaritmikus titer [koncentrációegység] 3. ábra: A lineáris tartomány meghatározása EDTA-s plazmában (200 µl) Megfigyelt logaritmikus titer [koncentrációegység] Megfigyelések Az adott tartományban Regressziós egyenes Négyzetes modell Az eltérés fels határa Az eltérés alsó határa Megadott logaritmikus titer [koncentrációegység] Doc. Rev

26 Pontosság laboratóriumon belül A cobas HIV-1 pontosságát egy magas HIV-1-pozitív minta (M csoport, B altípus, tenyésztett vírus) sorozathígításainak elemzésével határozták meg HIV-negatív EDTA-s plazmában. Hét hígítási szintet (400 µles mintafeldolgozási térfogat) és öt hígítási szintet (200 µl-es mintafeldolgozási térfogat) vizsgáltak szintenként és mintafeldolgozási térfogatonként 16 párhuzamosban a cobas HIV-1 reagensek három gyártási tételével, három készüléken és négy kezelvel, 12 napon keresztül. Az eredményeket az 5. táblázat és a 6. táblázat tartalmazza. A cobas HIV-1 kiváló pontosságot mutatott három reagens-gyártásitételnél, amelyeket a 60,0 cp/ml 2,00E+07 cp/ml koncentrációtartományon vizsgáltak 400 µl-es mintafeldolgozási térfogatnál, és az 1,00E+04 cp/ml 2,00E+07 cp/ml tartományon 200 µl-es mintafeldolgozási térfogatnál. 5. táblázat: A cobas HIV-1 laboratóriumi pontosságán belül (EDTA-s plazmaminták 400 µl-es mintafeldolgozási térfogat)* Névleges koncentráció (cp/ml) Megadott koncentráció (cp/ml) EDTA-s plazma 1. tétel 2. tétel 3. tétel Minden gyártási tétel SD SD SD Poolozott SD Forrásanyag 2,0E+07 1,54E+07 Sejttenyészet 0,05 0,05 0,04 0,05 1,0E+06 7,70E+05 Sejttenyészet 0,05 0,05 0,05 0,05 1,0E+05 7,70E+04 Sejttenyészet 0,05 0,05 0,05 0,05 1,0E+04 7,70E+03 Sejttenyészet 0,04 0,06 0,07 0,06 1,0E+03 7,70E+02 Sejttenyészet 0,09 0,10 0,07 0,09 4,0E+02 3,08E+02 Sejttenyészet 0,08 0,10 0,09 0,09 6,0E+01 7,70E+01 Sejttenyészet 0,18 0,24 0,15 0,19 * A titeradatokat logaritmikusan normál eloszlásúnak tekintették, és log 10 transzformáció után elemezték. A szórás (standard deviation SD) oszlopok a logaritmikusan transzformált titerek összesítését tartalmazzák mind a három reagenstételre. 6. táblázat: A cobas HIV-1 laboratóriumi pontosságán belül (EDTA-s plazmaminták 200 µl-es mintafeldolgozási térfogat)* Névleges koncentráció (cp/ml) Megadott koncentráció (cp/ml) EDTA-s plazma 1. tétel 2. tétel 3. tétel Minden gyártási tétel SD SD SD Poolozott SD Forrásanyag 2,0E+07 1,54E+07 Tenyésztett vírus 0,04 0,04 0,04 0,04 1,0E+07 7,70E+06 Tenyésztett vírus 0,04 0,04 0,04 0,04 1,0E+06 7,70E+05 Tenyésztett vírus 0,03 0,04 0,05 0,04 1,0E+05 7,70E+04 Tenyésztett vírus 0,04 0,05 0,03 0,04 1,0E+04 7,70E+03 Tenyésztett vírus 0,05 0,04 0,04 0,04 * A titeradatokat logaritmikusan normál eloszlásúnak tekintették, és log 10 transzformáció után elemezték. A szórás (standard deviation SD) oszlopok a logaritmikusan transzformált titerek összesítését tartalmazzák mind a három reagenstételre. Doc. Rev

27 Csoport/altípus ellenrzése A cobas HIV-1 teljesítményét az M HIV-1 csoport altípusai és az O és N csoportok kimutatására a következkkel ellenrizték: Az M csoport altípusaihoz, valamint az O és N csoportokhoz tartozó kimutatási határ ellenrzése Az M csoport altípusaihoz, valamint és az O és N csoportokhoz tartozó linearitás ellenrzése A titermeghatározást a cobas HIV-1 teszttel végezték. Az M csoport altípusaihoz, valamint az O és N csoportokhoz tartozó kimutatási határ ellenrzése cobas HIV-1 Tenyésztett HIV-1 mintákat (M csoport, A, C, D, F, G, H, CRF01_AE, CRF02_AG), valamint HIV-1O-t és HIV-1N-t hígítottak EDTA-s plazmában a predomináns csoport, illetve altípus (HIV-1 M, B altípus) kimutatási határának megfelel koncentrációra a 95%-os találati arányú kimutatásihatár-elemzés szerint (20,0 cp/ml). A találati arány elemzését minden csoportra és altípusra 42 párhuzamosban végezték. Az eredmények alátámasztják, hogy a cobas HIV-1 teszt HIV-et mutatott ki a HIV-1M (A, C, D, F, G, H, CRF01_AE, CRF02_AG), HIV-1 O és HIV-1N csoportoknál 20 cp/ml koncentráció esetén, és a fels egyoldali 95%-os konfidenciaintervallum nagyobb volt a várt 95%-os találati aránynál. 7. táblázat: A HIV-1 M csoport altípusai és az O, illetve N csoportok kimutatási határának ellenrzése 400 µl EDTA-s plazmában Csoport Altípus Tesztelt koncentráció: 20,0 cp/ml Pozitív párhuzamosok száma Érvényes ismétlések száma Találati arány (%) (fels egyoldali 95%-os CI) M A ,86% (98,02%) C % (100%) D ,62% (99,88%) F ,86% (98,02%) G ,48% (96,68%) H ,62% (99,88%) CRF01_AE ,24% (99,15%) CRF02_AG ,62% (99,88%) O ,86% (98,02%) N ,62% (99,88%) Doc. Rev

28 Az M csoport altípusaihoz, valamint az O és N csoportokhoz tartozó lineáris tartomány ellenrzése A cobas HIV-1 altípusok linearitási vizsgálatában használt hígítási sorozat hét paneltagból áll, amelyek lefedik a lineáris tartományt. A paneltagokat a megfelel csoport/altípus magas titer, HIV-1 RNS-re pozitív sejttenyészet felülúszó mintáiból készítették. A cobas HIV-1 tesztelt lineáris tartománya az alsó mennyiségi meghatározási határtól (LLoQ, 20,0 cp/ml 400 µl-es mintafeldolgozási térfogatnál) a fels mennyiségi meghatározási határig (ULoQ, 1,0E+07 cp/ml) tartott, és legalább két orvosi döntési pontot tartalmazott. Szintenként tizenkét ismétlést teszteltek EDTA-s plazmában. A cobas HIV-1 lineáris tartományát az M csoport altípusaira, illetve az O és N csoportra vizsgálták. A lineáris regresszió és a jobban illeszked nemlineáris regresszió közötti maximális eltérés kisebb volt 0,12 log 10 -nél. Specificitás A cobas HIV-1 specificitását különböz donoroktól származó HIV-negatív EDTA-s plazmaminták elemzésével határozták meg. Hatszáztizennégy különböz EDTA-s plazmamintát teszteltek a cobas HIV-1 reagensek három gyártási tételével. Valamennyi minta negatív eredményt adott HIV-1 RNS-re. A tesztpanelban a cobas HIV-1 specificitása 100,0% volt [a 95%-os egyoldali konfidenciaintervallum (Clopper Pearson) alsó határa 99,5% volt]. Analitikai specificitás A cobas HIV-1 analitikai specificitását egy kórokozópanel (8. táblázat) hígításával vizsgálták HIV RNS-pozitív és HIV RNS-negatív EDTA-s plazmával. A kórokozókat negatív EDTA-s plazmához adták, és HIV RNS-sel, illetve nélküle tesztelték. A nem HIV kórokozók egyike sem zavarta a teszt teljesítményét. Minden HIV-1-target nélküli kórokozómintára negatív eredményt kaptak a cobas HIV-1 teszttel, és minden HIV-1-targetet tartalmazó kórokozómintára pozitív lett az eredmény. Ezen felül a potenciálisan keresztreagáló organizmusokat tartalmazó pozitív HIV-1-minták mindegyikének az átlagos log 10 titer értéke ± 0,32 log 10 eltérésen belül volt az adott pozitívre oltott minta átlagos log 10 titeréhez képest. 8. táblázat: Keresztreaktivitásra vizsgált kórokozók Vírusok Baktériumok Sarjadzógomba Adenovírus 5-ös típus 1-es és 2-es típusú herpes Propionibacterium acnes Candida albicans simplex vírus Cytomegalovírus Humán papillomavírus Staphylococcus aureus 1-es, 2-es, 3-as, 4-es típusú dengue vírus Influenzavírus A Epstein-Barr vírus Murray Valley encephalitis vírus FSME vírus (HYPR törzs) St. Louis encephalitis vírus Hepatitis A vírus Varicella-zoster vírus Hepatitis B vírus West Nile vírus Hepatitis C vírus Sárgalázvírus 1-es és 2-es típusú humán T-sejtes Zika vírus lymphotrop vírus 6-os típusú humán herpeszvírus Doc. Rev

29 Analitikai specificitás zavaró anyagok Magas triglicerid (27,9 29,0 g/l), konjugált bilirubin (0,18 0,22 g/l), nem konjugált bilirubin (0,19 0,2 g/l), albumin- (57,8 60,6 g/l), hemoglobin (1,8 2,3 g/l) és humán DNS (2 mg/l) tartalmú mintákat teszteltek HIV RNS jelenlétében, illetve hiányában. A vizsgált anyagok nem mutattak zavaró hatást a cobas HIV-1 teszt teljesítményével. Ezen felül a szisztémás lupus erythematosus (SLE) és rheumatoid arthritis (RA) autoimmun betegségek markerei, illetve az antinukleáris antitest (ANA) jelenlétét is vizsgálták. A 9. táblázatban felsorolt gyógyszervegyületeket is vizsgálták a Cmax háromszorosánál, HIV RNS jelenlétében, illetve hiányában. A vizsgálat minden potenciálisan zavaró anyagról kimutatta, hogy nincs hatással a teszt teljesítményére. A cobas HIV-1 teszttel minden HIV-target nélküli mintára negatív eredményt kaptak, és minden HIV-1- targetet tartalmazó mintára pozitív lett az eredmény. Ezen felül a potenciálisan zavaró anyagokat tartalmazó pozitív HIV-1-minták mindegyikének az átlagos log 10 titer értéke ± 0,20 log 10 eltérésen belül volt az adott pozitívre oltott minta átlagos log 10 titeréhez képest. 9. táblázat: A cobas HIV-1 teszt HIV RNS mennyiségi meghatározását esetlegesen zavaró gyógyszervegyületek vizsgálata Gyógyszerosztály Gyógyszer generikus neve Immunmodulátorok Peginterferon -2a Ribavirin HIV entry inhibitor Peginterferon -2b Maraviroc HIV-integráz inhibitorok Elvitegravir/kobicisztát Raltegravir Non-nukleozid HIV reverz transzkriptáz inhibitorok Efavirenz Etravirin Nevirapin Rilpivirin HIV-proteáz inhibitorok Atazanavir Nelfinavir Darunavir Fosamprenavir Lopinavir Ritonavir Saquinavir Tipranavir HCV-proteáz inhibitorok Boceprevir Telaprevir Reverz transzkriptáz vagy DNSpolimeráz inhibitorok Simeprevir Abacavir Aciclovir Ganciclovir Lamivudin Opportunista fertzések kezelésére szolgáló vegyületek Adefovir dipivoxil Cidofovir Emtricitabin Entecavir Foscarnet Azitromicin Klaritromicin Etambutol Flukonazol Isoniazid Sofosbuvir Telbivudin Tenofovir Valganciclovir Zidovudin Pyrazinamid Rifabutin Rifampicin Sulfamethoxazol Trimethoprim Doc. Rev

30 Módszerkorreláció A cobas HIV-1 teljesítményének értékelése a COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HIV-1 teszt 2.0-ás változatával összevetve A cobas HIV-1 tesztet és a COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HIV-1 teszt 2.0-ás változatát (TaqMan HIV-1 teszt, v2.0) HIV-1-fertzött betegek 243 EDTA-s plazmamintájának összehasonlításával végezték. A HIV-1 mintákat (M csoport, A D, F H, F/B, CRF01_AE, CRF02_AG, valamint HIV-1O) küls helyszínen, két-két párhuzamos mintával tesztelték. A Deming-regressziós analízist logaritmikusan transzformált titerekkel végezték. A Deming-regressziós analízis eredményeit a 4. ábra tartalmazza. Az ábrákon a * jel az egyéni meghatározást jelenti. A szín az altípust jelöli. 4. ábra: A cobas HIV-1 teszt és a TaqMan HIV-1 teszt 2.0-ás verziójának regressziós analízise EDTA-s plazmamintákban Szubtípus y = 1,06x + 0,05 R 2 = 0,98 Átlagos log10 titer, cobas HIV-1 Átlagos log10 titer, COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HIV-1 teszt, 2.0 verzió Teljes rendszerhiba A cobas HIV-1 teljes rendszerhiba-arányát a HIV-1 M csoportú és B altípusú targetjével oltott EDTA-s plazma 100 párhuzamosával határozták meg. Ezeket a mintákat körülbelül 3 kimutatási határ célkoncentrációnál vizsgálták. A vizsgálat eredményei szerint az összes párhuzamos érvényes és a HIV-1 targetre pozitív volt, vagyis a teljes rendszerhiba aránya 0,0% volt. A kétoldalú 95%-os pontos konfidenciaintervallum 0,0% volt az alsó határra, és 3,6% a fels határra [0%: 3,6%]. Keresztszennyezdés A cobas HIV-1 keresztszennyezdési arányát HIV-negatív EDTA-s plazmaminták 230 párhuzamosával és egy magas titer (1,9E+07 cp/ml) HIV-1-minta 235 párhuzamosával határozták meg. Összesen öt futtatást végeztek pozitív és negatív mintákkal, sakktáblaszer konfigurációban. A negatív minták mind a 230 párhuzamosa negatív volt, vagyis a keresztszennyezdési arány 0,0% volt egyoldali, fels, 1,3%-os 95%-os konfidenciaintervallummal. Doc. Rev

31 További információk A teszt legfontosabb tulajdonságai Minta típusa Minimálisan szükséges mintamennyiség Mintafeldolgozási térfogat 400 µl vagy 200 µl EDTA-s plazma További információkat a cobas 4800 rendszer kézikönyve cobas HIV-1- hez cím kiadványban talál. Analitikai érzékenység 14,2 cp/ml (400 µl) 43,9 cp/ml (200 µl) Lineáris tartomány 400 µl: 20,0 cp/ml 1,0E+07 cp/ml 200 µl: 60,0 cp/ml 1,0E+07 cp/ml Specificitás 100% (egyoldalú 95%-os konfidenciaintervallum: 99,5%) Kimutatott genotípusok HIV-1M (A D, F H, CRF01_AE, CRF02_AG), HIV-1O, HIV-1N Doc. Rev

32 Szimbólumok A következ szimbólumok használatosak a Roche PCR diagnosztikai termékek jelölésére. 10. táblázat: A Roche PCR diagnosztikai termékek címkéjén használt szimbólumok Segédszoftver In vitro diagnosztikai felhasználásra Meghatalmazott képvisel az Európai Közösségben Megadott tartomány alsó határa Vonalkód adatlap Gyártó Lotszám Sötétben tárolandó Biológiai veszély Tartalma <n> vizsgálathoz elegend Katalógusszám Tárolási hmérséklet Olvassa el a használati útmutatót Vizsgálatdefiníciós fájl A csomag tartalma Megadott tartomány fels határa Forgalmazó Lejárat dátuma Csak IVD teljesítmény értékelésre Globális kereskedelmi cikkszám Ez a termék eleget tesz az in vitro diagnosztikai orvostechnikai eszközökrl szóló 98/79 EK irányelv elírásainak. Felhasználói technikai segítségnyújtás az Egyesült Államokban Doc. Rev

33 Gyártó és forgalmazók 11. táblázat: Gyártó és forgalmazók Készült az Amerikai Egyesült Államokban Roche Diagnostics GmbH Sandhofer Strasse Mannheim, Germany Roche Diagnostics (Schweiz) AG Roche Diagnostics Industriestrasse 7 201, Boulevard Armand-Frappier 6343 Rotkreuz, Switzerland H7V 4A2 Laval, Québec, Canada (For Technical Assistance call: Roche Diagnostics GmbH Pour toute assistance technique, Sandhofer Strasse 116 appeler le: ) Mannheim, Germany Roche Diagnostics Roche Diagnostics, SL 2, Avenue du Vercors Avda. Generalitat, Meylan, France E Sant Cugat del Vallès Barcelona, Spain Distributore in Italia: Roche Diagnostics S.p.A. Roche Diagnostica Brasil Ltda. Viale G. B. Stucchi 110 Av. Engenheiro Billings, Monza, Milano, Italy Jaguaré, Building São Paulo, SP Brazil Distribuidor em Portugal: Roche Sistemas de Diagnósticos Lda. Estrada Nacional, Amadora, Portugal Védjegyek és szabadalmak Lásd: Szerzi jog 2016 Roche Molecular Systems, Inc. Doc. Rev