DNS MIKROSZATELLITEK VIZSGÁLATA LÓ ÉS SZARVASMARHA FAJTÁKBAN

Átírás

1 DOKTORI (PhD) ÉRTEKEZÉS TÉZISEI PANNON EGYETEM GEORGIKON MEZŐGAZDASÁGTUDOMÁNYI KAR Állattudományi és Állattenyésztéstani Tanszék Tanszékvezető Dr. Husvéth Ferenc egyetemi tanár, az MTA doktora Készült a Pannon Egyetem Állattenyésztési Tudományok Doktori Iskola, jogutód: Állat- és Agrárkörnyezet-tudományi Doktori Iskola állattenyésztés tudományok tudományág keretében Doktori Iskola volt vezetője Dr. Szabó Ferenc egyetemi tanár, az MTA doktora Doktori Iskola jelenlegi vezetője Dr. Anda Angéla egyetemi tanár, az MTA doktora Témavezető Dr. Husvéth Ferenc egyetemi tanár, az MTA doktora Társ-témavezető Dr. Fébel Hedvig tudományos tanácsadó Konzulens Bán Beáta vizsgáló mérnök DNS MIKROSZATELLITEK VIZSGÁLATA LÓ ÉS SZARVASMARHA FAJTÁKBAN Készítette Józsa Csilla KESZTHELY 2008

2 1. BEVEZETÉS ÉS CÉLKITŰZÉS A szelekció segítségével az ember a háziasítás kezdete óta beleszólt az általa tenyésztett populáció genetikai szerkezetébe. Ezen munka eredményeként alakult ki a ma élő tenyésztett fajok ismert tulajdonságainak változatossága. A hagyományos szelekciós módszerek mellett azonban folyamatosan megjelennek a molekuláris genetika által teremtett új eljárások (pl.: mikroszatellit analízis), lehetőségek, amelyek megbízhatóbb eredményeket nyújtanak mind a kutatók, mind a tenyésztők számára. A doktori munkám során a szarvasmarha és a ló fajok hazánkban tenyésztett néhány fajtájának genetikai jellemzőit vizsgáltam meg DNS mikroszatellitek segítségével. A vizsgálatokat a Mezőgazdasági Szakigazgatási Hivatal, Állattenyésztési Igazgatóság, Központi Állattenyésztési Laboratóriumában végeztem (MgSzH, Budapest). A felhasznált minták a rutinlaboratóriumba származásellenőrzés céljából (DNS mikroszatellit analízis) kötelezően között beküldött vérminták voltak, amelyeket a randomizálás elvén választottam ki mindkét faj (ló, szarvasmarha) esetében. A vizsgált egyedek vegyesen nő, illetve hím ivarúak voltak. A disszertáció tárgyát képező vizsgálatok főbb célkitűzései a következők voltak: A Magyarországon tenyésztett ló (angol telivér, amerikai ügető, lipicai, magyar hidegvérű), illetve szarvasmarha (magyar tarka, limousin, hereford, charolais, aberdeen angus) fajták genetikai változatosságának feltérképezése DNS mikroszatellit markerek segítségével. A mikroszatellit lókuszokon az allélok számának és frekvenciájának meghatározása, egyedi allélek keresése az előzőekben leírt ló, illetve szarvasmarha fajtákban. A hazánkban tenyésztett és az előzőekben felsorolt egyes ló és szarvasmarha fajták közötti genetikai távolság felmérése DNS mikroszatellit vizsgálatok segítségével. 2

3 A beltenyésztettség mértékének felderítése DNS mikroszatellit vizsgálatok alapján a kísérletekbe vont populációkban, illetve fajtákban. A DNS mikroszatellit markerek alkalmazhatóságának becslése a hazai állattenyésztés fejlesztése érdekében. 2. ANYAG ÉS MÓDSZER A lófajra kiterjedő vizsgálatok során a lipicai (n=630), az angol telivér (n=200), az amerikai ügető (n=198), valamint a magyar hidegvérű (n=58) fajta egyedeit teszteltem, amelyeket a véletlenszerűség elvén választottam ki. A populáció elemzések esetében az angol telivér fajta 2 állományának 2005-ben beküldött egyedeit, a dióspusztai (n=72) és a kerteskői (n=39) állományokat vizsgáltam. A húsmarha fajtákra vonatkozó kísérletek során öt fajta egyedeit teszteltem, név szerint a következőket: magyar tarka (n=252), limousin (n=127), hereford (n=144), charolais (n=254), aberdeen angus (n=337). A kísérletekbe vont egyedeket a véletlenszerűség elvén választottam ki. A magyar tarka fajtán belül elvégeztem még a Derecske Petőfi Mezőgazdasági Kft. (Derecske, n=40) és a Béke Agrárszövetkezet (Hajdúböszörmény, n=55) populációinak ig beküldött egyedeinek a DNS mikroszatellit vizsgálatát. Az ISAG (Inernational Society for Animal Genetics) által, a lovak származásellenőrzésében kötelező 9 mikroszatellit mellett még 8 mikroszatellitet (VHL20, HTG4, AHT4, HMS7, HTG6, AHT5, HMS6, ASB23, ASB2, HTG10, HTG7, HMS3, HMS2, ASB17, LEX3, HMS1, CA425), a szarvasmarha esetében pedig 11 mikroszatellitet (BM1824, BM2113, ETH10, ETH225, INRA23, SPS115, TGLA122, TGLA126, TGLA227, ETH3, TGLA53) tanulmányoztam. A vizsgálatok első szakaszában genomiális DNS-t izoláltam limfocitákból, majd a tiszta DNS kinyerése után felszaporítottam a templátot. Az amplifikálás elvégzéséhez az Applied Biosystems StockMarks ló és szarvasmarha faj számára kifejlesztett multiplex kitjeit alkalmaztam (Applied Biosystems, 2001). A multiplex formában sokszorozott fragmensek kapilláris 3

4 elektroforézissel történő elválasztását ABI PRISM TM 310 genetikai analizátor (Applied Biosystems, USA) segítségével végeztem. 3. EREDMÉNYEK A vizsgált 11 szarvasmarha, illetve a 17 ló mikroszatellit marker eredményeinek értékelése során a megfigyelt (n a ) és az effektív allélszámokban (n e ), a várt (H e ) és a megfigyelt (H o ) heterozigozitásban meglehetősen polimorf eredményeket tapasztaltam. A mikroszatellitek megjelenő alléljai és allélgyakoriság értékei szintén nagy változatosságot mutattak. A kísérletekben vizsgált húsmarha fajták közül a magyar tarka állomány (átlag n a =10,1818), a lófajták közül a lipicai fajta (átlag n a =10,6471) bizonyult a legváltozatosabbnak a megfigyelt allélok számában és gyakoriságában egyaránt. A vizsgált fajták esetében a legtöbb lókusz szignifikánsan nem tért el (P>0,05) a Hardy- Weinberg egyensúlytól, kivétel volt a lipicai ló-, illetve a charolais húsmarha fajta. A lipicai esetében 10 lókusznál tapasztaltam szignifikáns eltérést (P<0,001; P<0,01; P<0,05), míg a hazai charolais populációban a vizsgált 11 mikroszatellit közül 6 esetben kaptam különböző szintű szignifikáns eltéréseket (P<0,001; P<0,05). Egyik esetben sem tapasztaltam a vizsgálataim során azt, hogy maximális megfigyelt heterozigozitás értéket (H o =1) vettek volna fel a vizsgált fajták/populációk. Ez utóbbi arra utal, hogy az adott fajták/populációk megfelelő számú szülőgenerációtól származtak. A vizsgált 4 lófajta közül 3 (angol telivér, magyar hidegvérű, lipicai), illetve az összes vizsgált szarvasmarhafajta esetében az F IS értékek beltenyésztettséget mutattak (F IS >0). Az átlagos várt és a megfigyelt heterozigozitás értékeket tekintve mindegyik vizsgált ló és szarvasmarha fajtánál beltenyésztettségre utaló jeleket tapasztaltam, mivel az átlagos H e értékek mindegyik esetben meghaladták az átlagos H o értékeket (H e >H o ). Az allélgazdagságot tekintve a vizsgált fajták nagy változatosságot mutattak. Vizsgálataim során sikerült felmérni a tanulmányozott hazai tenyésztésű ló-, illetve szarvasmarha fajták genetikai hátterét. Lehetséges fajtaspecifikus allélek tekintetében élen járt a lipicai lófajta (pl. HMS7-P, HMS7-Q, HTG10-S). Ebből a szempontból még a limousin fajtát kell megemlíteni, mivel a TGLA122 mikroszatellit 177-es allélja 3,15%-os 4

5 gyakorisággal jelent meg, ugyanakkor a többi fajtában nem tudtam kimutatni az allélt. Eredményeim alapján a több faktorra és alrendszerre alapozott analitikai eljárások alkalmasnak mutatkoztak az egyedek és a fajták közötti különbségek, illetve a rokoni fok meghatározására. Segítségükkel a génáramlás, valamint a beltenyésztettség is figyelemmel kísérhető. Eredményeim bizonyítják azt, hogy a DNS mikroszatellit vizsgálatok szembetűnő különbségeket jeleznek mind a ló-, mind a szarvasmarha fajták között. E módszer segítségével egyértelműen eldönthető az egyed származása (a vizsgált szarvasmarha fajták esetében 97,85 és 99,46%-os, a vizsgált lófajták esetében 99,80 és 99,98%-os biztonsággal). A fajtákon belül végbemenő genetikai változások, és a különböző rokoni kapcsolatok is figyelemmel kísérhetőek. 4. KÖVETKEZTETÉSEK A Magyarországon tenyésztett ló, illetve szarvasmarha fajták DNS mikroszatellit markerekkel történő vizsgálata rámutatott arra, hogy a hazai állományok egésze genetikailag meglehetősen heterogén és jelentős genetikai erőforrásokkal rendelkezik. Kiemelten érvényes ez a lipicai fajtára, illetve szinte mindegyik vizsgált szarvasmarha fajtára. Mindezek mellett a tanulmányozott fajták a beltenyésztettség jeleit mutatják, amit több genetikai mérőszámmal is igazoltam. A hazánkban tenyésztett ló, illetve húsmarha fajták egymáshoz genetikailag közel állnak, a genetikai távolságot mutató adatok viszonylag alacsonyak. Ezt a megállapítást támasztják alá a fajtapárok F ST értékei, amelyek mértéke, ha 0,05-nél kevesebb, a differenciáltságot csekély mértékűnek ítélhetjük a fajták között, míg ha 0,25 feletti az F ST érték, igen nagy mértékű izolációra, fajon belüli fragmentálódásra következtethetünk. Saját eredményeimben egyik vizsgált ló, illetve szarvasmarhafajta esetében sem haladták meg az F ST értékek a 0,25-öt, sőt némelyikük a 0,05-nél is alacsonyabb volt. Mindezzel együtt a lófajták a 17, a szarvasmarha fajták a 11 DNS mikroszatellit marker segítségével jól elkülöníthetőek. A vizsgálatban szereplő hazai ló-, illetve szarvasmarha fajták teljes állománya lényegében nem tért el a Hardy-Weinberg egyensúlytól (kivétel a lipicai és a charolais fajták), 5

6 ami azt támasztja alá, hogy nincsenek beltenyésztettségre utaló jelek e fajtákban. Ennek ellenére több genetikai mérőszámmal igazolhatóak voltak beltenyésztettségre utaló jelek (várt és megfigyelt heterozigozitás egymáshoz viszonyítása; F IS értékek pozitivitása, illetve negativitása) a vizsgált húsmarha és lófajtákban. A hazánkban tenyészett ló és szarvasmarha fajták fenntartása szempontjából fontos lenne a beltenyésztett fajták vérfrissítése a saját fajtájukból származó (külföldi vagy hazai) egyedek tenyésztésbevonásával. A vérfrissítéshez mindenképpen elengedhetetlen a tenyésztésbe bekerülő egyedek előzetes molekuláris genetikai vizsgálata, örökíthető alléljainak ismerete, ezáltal biztosíthatjuk a fajták genetikai változatosságát. A vizsgálatok következő iránya a hazai nagyobb tenyészállományok felmérése lehetne a hazai tenyésztett ló, illetve szarvasmarha fajtákon belül, valamint az egyes apaállatok hatása a populáció genetikai hátterére. Mindezek alapján javaslom, hogy a molekuláris genetikai módszereket, s azok eredményeit tudatosan használják fel a tenyésztésben, mind ló, mind szarvasmarha fajták esetében. A hazánkban tenyésztett fajták genetikai változatosságát fenn kell tartani, ehhez a molekuláris genetikai vizsgálati módszerek kitűnő segítséget nyújtanak. Ahol azt a vizsgálati eredmények indokolják, esetleges külföldi tenyészállatok importálásával a genetikai változatosságot megalapozott biztosítani. A tenyésztésbe való bekerülés előtt javaslom az egyes egyedek molekuláris genetikai vizsgálatát annak érdekében, hogy csak a ténylegesen változatos, esetlegesen különleges allélekkel rendelkező egyedek frissítsék a hazai állományt, ezáltal javítva a fajták genetikai szerkezetét. A származásellenőrzés hatékonyságát tekintve megállapítható, hogy mind a ló, mind a szarvasmarha faj esetében megbízhatóan alkalmazható az általam használt 17 (ló), illetve 11 (szarvasmarha) mikroszatellit a hazai rutin származásellenőrzésben. 6

7 5. ÚJ TUDOMÁNYOS EREDMÉNYEK 1. Az általam vizsgált 17 DNS mikroszatellit marker alkalmasnak bizonyult a hazánkban tenyésztett lófajták pontos genetikai megkülönböztetésére. A vizsgált lókuszok magas genetikai változatosságot mutatnak. Néhány esetben kiemelkedően magas polimorfizmus jellemzi a mikroszatelliteket a hazai lófajtákban pl. VHL20, ASB2, CA425, ASB17, LEX3. A vizsgálatok során a 17 lókusz estében összesen 193 allélt sikerült detektálni. Kimutattam, hogy a lókuszonkénti allélszám 7 (HTG7) és 16 (ASB2, ASB23) között változik a lipicai, az angol telivér, az amerikai ügető és a magyar hidegvérű fajtákban. 2. Bizonyítottam, hogy a tanulmányozott szarvasmarha fajtákban a vizsgált 11 mikroszatellit elegendőnek bizonyul a hazai fajták közti különbségek feltárására. A vizsgált mikroszatellitek közül a TGLA lókuszok (122, 126, 227, 53), illetve az INRA23 és az SPS115 mikroszatellitek különösen változatos és magas allélszámmal rendelkeznek. A vizsgált húsmarha fajtákban a tesztelt 11 lókusz estében összesen 136 allél jelenlétét detektáltam. A lókuszonkénti allélszám változást 6 (BM1824) és 21 (TGLA122) között sikerült kimutatni. 3. A molekuláris genetikai vizsgálataimmal a hazánkban tenyésztett és tesztelt ló, illetve szarvasmarha fajták beltenyésztettségét igazoltam, amelyeket az F IS pozitív, illetve negatív értékeinek aránya, valamint az átlagos megfigyelt heterozigozitás értékek is alátámasztanak. Minden vizsgált fajta esetében az átlagos várt heterozigozitás érték meghaladja a megfigyelt heterozigozitást, ami ugyancsak beltenyésztettségre utaló jel. A lókuszok nagy részén a fajták nem térnek el a Hardy-Weinberg egyensúly alapján várható genotípus megoszlástól, kivételt tapasztaltam ugyanakkor e vonatkozásban a lipicai ló-, és a charolais húsmarha fajta esetében. 4. Eredményeim azt bizonyítják, hogy a vizsgált Magyarországon tenyésztett lófajták genetikailag közel állnak egymáshoz, a fajták közötti differenciáltság alacsony; (genetikai távolság: 0,2803-0,4869; F ST értékek: 0,0502-0,0717). Igazoltam, hogy genetikailag legközelebb a lipicai és a magyar hidegvérű, illetve az angol telivér és az amerikai ügető fajták állnak egymáshoz. 7

8 5. Bizonyítottam, hogy a Magyarországon tenyésztett, vizsgálataimba bevont szarvasmarha fajták genetikailag közel állnak egymáshoz, a fajták közötti differenciáltság alacsony. (genetikai távolság: 0,1052-0,4284; F ST értékek: 0,0212-0,0716). Genetikailag legközelebb a magyar tarka és a charolais fajták állnak, de nagyon kicsi a távolság a charolais és a limousin fajták között is. A charolais és a limousin fajták között kapott alacsony genetikai távolság bizonyítja, hogy minkét francia húsmarha fajta genetikailag hasonló állatpopulációra tekinthet vissza. A hazánkban tenyésztett aberdeen angus és hereford fajta között annak ellenére, hogy mindketten a brit húsmarha fajtacsoport tagjai, magasabb a genetikai távolság. 6. A TGLA122 mikroszatellit alléljei közül a limousin fajtában a 177-es, a charolais fajtában a 179-es, valamint a hereford fajtában a 185-ös allélok magas allélgyakorisággal jelennek meg, míg a többi fajtában nem tudtam detektálni azokat, ezért a viszonylag magas allélfrekvencia értékek miatt fajtaspecifikus alléleknek tekinthetőek. 7. A munkám során a tanulmányozott lófajtákban néhány egyedi allélt (angol telivér: AHT4-G, HTG6-R; amerikai ügető: HMS1-Q; magyar hidegvérű: ASB17-T, -K; lipicai: ASB23-Q, HTG10-S, CA425-P, HMS7-P, -Q,) sikerült kimutatni. Fajtaspecifikus allélekre utal a vizsgálataimban tapasztalt magas allélfrekvencia érték. 8. A származásellenőrzés hatékonyságát tekintve bizonyítottam, hogy a hazai rutin származásellenőrzésben alkalmazott mikroszatellitek (ló: 17 lókusz; szarvasmarha: 11 lókusz) megbízhatóan alkalmazhatóak az utód származásának ellenőrzésében. Megállapítottam, hogy az említett mikroszatellitek a vizsgált szarvasmarha fajták származásellenőrzésében 97,85 és 99,46%-os, a vizsgált lófajták esetében 99,80 és 99,98%-os értékek közötti hatékonysággal alkalmazhatóak. 8

9 6. PUBLIKÁCIÓK JEGYZÉKE Lektorált cikkek/közlemények: A. Szontagh, B. Bán, I. Bodó, E. G. Cothran, W. Hecker, Cs. Józsa, Á. Major (2005): Genetic diversity of the Akhal-Teke horse breed in Turkmenistan based on microsatellite analysis, Convervation genetics of endangered horse breeds, Wageningen Academic Publishers, Wageningen, Netherlands, S. Mihók, B. Bán, Cs. Józsa, I. Bodó (2005): Estimation of genetic distance between traditional horse breeds in Hungary, Convervation genetics of endangered horse breeds, Wageningen Academic Publishers, Wageningen, Netherlands, Józsa Cs., Husvéth F., Bán B., Takács E. (2006): A telivér és ügető fajták D- vércsoport és biokémiai polimorf rendszerek vizsgálata. Állattenyésztés és takarmányozás Cs. Józsa, F. Husvéth, B. Bán, E. Takács (2006): DNA microsatellite test of Thoroughbred and Trotter horses in Hungary. Állattenyésztés és takarmányozás Bán B., Bodó I., Józsa Cs., Mihók S. (2006): A Mezőhegyesen kitenyésztett lófajták vércsoport, biokémiai polimorfizmus és DNS mikroszatellit vizsgálata, összehasonlításuk a hucul és az angol telivér fajtákkal - könyvrészlet, Génmegőrzés, Hagyományos háziállatfajták genetikai és gazdasági értékének tudományos feltárása, , Debreceni Egyetem Agrárátudományi Centrum, Debrecen 9

10 Tudományos nemzetközi konferenciák: Beáta Bán, Alice Gyurmán, Csilla Józsa (2002): Thoroughbred and Trotter blood group and DNA allele frequency in Hungary (poster) D003, XXVIII. International Conference on Animal Genetics, ISAG, Germany, Göttingen Csilla Józsa, Ferenc Husvéth, Beáta Bán, Alice Gyurmán, Ferenc Szabó (2004): Microsatellite DNA polymorphism of four beef cattles in Hungary (poster) - E021, XXIX. International Conference on Animal Genetics, ISAG, Japan, Tokyo Cs. Józsa, B. Bán, S. Mihók, I. Bodó, F. Husvéth (2005): DNA microsatellite test of Hutsul horses in Hungary, Systems of identification in horses, Book of Abstracts of the 56th Annual Meeting of the European Association for Animal Production, H1-22 (poster), Uppsala, Sweden Csilla Józsa, Beáta Bán, Erzsébet Takács, Ferenc Szabó, Ferenc Husvéth (2006): Microsatellite DNA polymorphism of Lipizzan horses in Hungary (poster) A573, XXX. International Conference on Animal Genetics, ISAG, Brazília, Porto Seguro Tudományos nemzetközi előadások: S. Mihók, B. Bán, Cs. Józsa, E. Takács, I. Bodó (2004): Estimation of genetic distance between traditional horse breeds in Hungary, Free communications Horse Production, Book of Abstracts of the 55th Annual Meeting of the European Association for Animal Production, EAAP-Bled, Slovenia, H4-2. A. Szontagh, B. Bán, I. Bodó, E. G. Cothran, W. Hecker, Cs. Józsa (2004): Genetic diversity of the Akhal-Teke horse breed in Turkmenistan based on microsatellite analysis, Rare breeds: global genetic distance, Book of Abstracts of the 55th Annual Meeting of the European Association for Animal Production, EAAP-Bled, Slovenia, H

11 Tudományos hazai előadások: Józsa Cs., Bán B., Gyurmán A., Husvéth F., Németh K. (2003): A sportlovak származásellenőrzésének vizsgálata vér polimorfizmusok és DNS mikroszatellitek segítségével (előadás), Akadémiai Beszámolók, Genetika, MTA Állatorvos-Tudományi Bizottsága, Budapest Németh K., Balogh K., Ribiczeyné Sz. P., Mézes M., Gaál T., Husvéth F., Józsa Cs. (2003): Az E-vitamin- és a metionin-kiegészítés hatása a növendék baromfi antioxidáns rendszerére (előadás). Akadémiai Beszámolók. Élettan, Biokémia, Morfológia. MTA Állatorvos-Tudományi Bizottsága, Budapest Józsa Cs., Bán B., Gyurmán A., Mátrai R., Husvéth F. (2005): A lipicai fajta származásellenőrzésének vizsgálata genetikai markerek segítségével (előadás), MTA Állatorvos Tudományi Bizottsága, Akadémiai Beszámolók, Genetika, Budapest Józsa Cs., Bán B., Gyurmán A., Szabó F., Husvéth F. (2005): DNS mikroszatellit vizsgálatok húsmarha fajtákban (előadás), MTA Állatorvos Tudományi Bizottsága, Akadémiai Beszámolók, Genetika, Budapest Józsa Csilla, Bán Beáta, Péntek István, Husvéth Ferenc (2006): A lipicai fajta származásellenõrzésének vizsgálata DNS mikroszatellitek segítségével (előadás), Lótenyésztési Tudományos Napok, Debreceni Egyetem Agrártudományi Centrum, Debrecen Egyéb cikkek/közlemények: Jenny Cahill, Bokor Árpád, Józsa Csilla (2007): Lovak származás-ellenőrzése Új-Zélandon - Lovas Nemzet, XIII. évf., 3. szám, Józsa Csilla, Bán Beáta, Bokor Árpád (2007): Lovak származás-ellenőrzése Magyarországon - Lovas Nemzet, XIII. évf., 4. szám,