PhD Doktori Értekezés. Az adhezív töméstechnika alkalmazásának hatása a fogpulpa vérkeringésére. Szerző: dr. Iványi Iván

Átírás

1 PhD Doktori Értekezés Az adhezív töméstechnika alkalmazásának hatása a fogpulpa vérkeringésére Szerző: dr. Iványi Iván SEMMELWEIS EGYETEM DOKTORI ISKOLA FOGORVOSTUDOMÁNYI KUTATÁSOK Témavezető: Dr. Nyárasdy Ida Programvezető: Dr. Fazekas Árpád Szigorlati bizottság: Dr Boros Ildikó, Dr Gyenes Miklós, Dr Nagy Gábor Hivatalos bírálók: Dr Orosz Mihály, Dr Simon György Budapest, 2002

2 1 Bevezetés és irodalmi háttér A téma jelentősége Formai megjegyzések Helyesírás A doktori értekezésben alkalmazott rövidítések Az adhezív töméstechnika Fogorvosi iatrogenesis Az adhezív rendszerek fejlesztése- történeti kitekintés Az adhezív rendszerek biokompatibilitás-vizsgálata Az adhezív rendszerek biokompatibilitás-vizsgálatánál adódó problémák Adhezív rendszerek pulpális biokompatibilitása Kondicionálás biokompatibilitása Bondanyagok biokompatibilitása A bondanyagok által kiváltott pulpális reakciók élettani háttere A fogpulpa keringésének, keringési zavarainak vizsgáló módszerei Pulpális keringés morfológiája Hisztológiai módszerek Elektron mikroszkópia Scanning Elektron Mikroszkópia Biológiailag aktív anyagok kimutatása Funkcionális vizsgálatok Izotóp megoszlásos technikák Indikátor kimosásos technikák Jelölt mikrogyöngy elakadásának módszere Fényelnyelés-változást mérő módszerek Elektromos impedancia-változások mérése Isothermális mérések Egyéb jellemzők vizsgálata Anyagok lokális bejuttatásának lehetőségei Artéria carotis ágainak kanülálása

3 Diffúzió a dentinfalon keresztül Iontophoresis (facilitált diffúzió) Kísérleteinkben alkalmazott vizsgálóeljárások ismertetése Vitálmikroszkópos vizsgálat Lézer Doppler áramlásmérés Célkitűzések Módszerek A kísérletekben vizsgált anyagok A kísérleti állat Vizsgálatok vitálmikroszkópos modellen Kondicionálás hatásának vizsgálata Negyedik generációs bondrendszer hatásának vizsgálata kondicionálással és kondicionálás nélkül Aceton és nem aceton tartalmú bondanyag összehasonlító vizsgálata Bondanyag-összetevők pulpális hatásának vizsgálata A pulpális válaszreakció hatásmechanizmusának vizsgálata Vizsgálatok lézer Doppler áramlásmérővel Negyedik generációs bondanyag hatásának vizsgálata GC Fuji Bond LC bondanyag hatásának vizsgálata Vizsgálómódszerek összehasonlítása Statisztikai értékelés Eredmények Vizsgálatok vitálmikroszkópos modellen Kondicionálás hatása a pulpális keringésre Negyedik generációs bondrendszer hatása kondicionálással és kondicionálás nélkül Aceton és nem aceton tartalmú bondanyag összehasonlító vizsgálata Bondanyag-összetevők pulpális hatása A pulpális válaszreakció hatásmechanizmusának vizsgálata Vizsgálatok lézer Doppler áramlásmérővel Bondanyagok hatása (LD)

4 4.2.2 Fujibond LC hatása (LD) Megbeszélés Vizsgálatok vitálmikroszkópos modellen Kondicionálás hatása a pulpális keringésre Negyedik generációs bondrendszer hatása kondicionálással és kondicionálás nélkül Aceton és nem aceton tartalmú bondanyag összehasonlító vizsgálata Bondanyag-összetevők pulpális hatása A pulpális válaszreakció hatásmechanizmusának vizsgálata Vizsgálatok lézer Doppler áramlásmérővel Bondanyag hatása (LD) Fujibond LC hatása (LD) Vizsgáló-módszerek összehasonlítása Következtetések Az értekezés új eredményei Köszönetnyilvánítás Irodalom jegyzék Saját közlemények jegyzéke Az értekezés témájában megjelent elsőszerzős közlemények Nemzetközi folyóiratban megjelenő közlemények Nemzetközi folyóirathoz előkészületben lévő közlemények Hazai folyóiratban megjelent közlemények Idézhető előadáskivonatok Tudományos előadások A témával kapcsolatos, de az értekezésben nem szereplő közlemények A témához kapcsolódó idézhető előadáskivonatok Az értekezés témájához nem kapcsolódó közlemények Összefoglaló Abstract of dissertation Az értekezés témájában megjelent közlemények különlenyomatai

5 1 Bevezetés és irodalmi háttér 1.1 A téma jelentősége A mindennapi fogászati gyakorlatban egyre nagyobb szerepet kap az esztétikus tömőanyagok alkalmazása. A fogszínű kompozit tömőanyagok elterjedéséhez a kereskedelemben rendre megjelenő új anyagok, eljárások klinikai alkalmazhatóságának ellenőrzése társul. A fizikai tulajdonságok vizsgálata mellett az egyik legfontosabb kérdéskör az élő szervezetbe kerülő anyagok biológiai elfogadhatóságának vizsgálata. A fog keményszöveteivel közvetlenül érintkező fogászati anyagok hatással lehetnek a fogpulpára (hiszen a dentintubulusokon keresztül könnyen eljuthatnak a pulpaüregbe), a fogbél válaszreakciója azonban metodológiai okok miatt meglehetősen nehezen vizsgálható. Ebben a témában az irodalomban fellelhető vizsgálatok gyakran egymásnak ellentmondó eredményeket mutatnak. Az élő szövetek külső stimulusokra adott korai válasza a hemodinamika megváltozása, és csak ezt követi egyéb specifikus folyamatok kialakulása. A fogpulpa válaszreakcióiról fontos információkat ad a pulpaszövet keringésváltozásainak megfigyelése. A fogszínű tömőanyagok az adhezív töméstechnika alkalmazásával, bondanyagok segítségével (fizikai retencióval) rögzülnek a fog keményszöveteihez. Ez az eljárás napjainkra a mindennapi fogorvosi tevékenység alapvető része lett, egyre szélesebb körben alkalmazott, és valószínűleg ez a tendencia még folytatódik. Az esztétikus töméstechnika fejlődése számos változást eredményezett: új eljárások kerültek bevezetésre (dentin savazása, bondozása), és szemléletváltás jött létre az alábélelő anyagok alkalmazásával kapcsolatban is. Az adhezív eljárás segítségével annál erősebb retenció és tökéletesebb széli záródás érhető el, minél nagyobb felületen érintkezik a tömőanyag a dentinnel. Ezért a fogpulpa védelmét nem alábélelés alkalmazásával (hiszen az csökkentené az adhezív felszín nagyságát), hanem a homogén, jó széli 5

6 záródás biztosításával igyekszünk elérni. Máig nem egységes a kutatók állásfoglalása arról, hogy a mély kavitásokba helyezett adhezív anyagok toxikus tulajdonságai okozhatnak-e pulpális károsodást; szükséges e a nagyon mély, a pulpát 0,5-1 mm-re megközelítő kavitásban az alábélelés. Ennek a kérdésnek a tisztázásához jó kiegészítő adatokat nyerhetünk a pulpa mikrocirkulációjának vizsgálatával. Az esztétikus tömés készítése során az adhezív rendszerek összetevői közvetlen kapcsolatba kerülhetnek a pulpa szövetével a pulpát fedő dentinréteg tubulusain keresztül. A fotopolimerizációt követően ezen anyagok úgynevezett hibrid réteget és dentincsatornákba nyúló csapokat képeznek a dentin felszíni mintegy 10 µm-es rétegében, elzárva a további diffúzió útját. Így az esztétikus tömések pulpális toxicitását elsősorban az adhezív rendszerek összetevői határozzák meg, a bondanyagokra kerülő tömőanyagok toxikus hatása már csak gyengítetten jelentkezik a megkötött bondanyagok széli záródása miatt. A bondanyagok fotopolimerizáció előtti alkotóelemei különböző monomerek, kémiailag aktív molekulák, melyek citotoxicitása igen jelentős. A fotopolimerizáció során ezek a kisebb molekulák óriás makromolekulákká kapcsolódnak össze, megszilárdulnak, így nem mutatnak további jelentős diffúziót és toxicitást. Tehát a bondanyagok toxicitásának vizsgálatakor közvetlenül a felhelyezésüket követő pulpális reakciók megfigyelése a legjelentősebb. Célszerűnek látszik tehát az adhezív rendszer összetevőinek a pulpális keringésre kifejtett közvetlen akut hatását vizsgálni. A pulpális hatás létrejöttében az egyes adhezív alkotórészek jelentőségének kimutatása és a válaszreakciók során lejátszódó élettani folyamat megfigyelése hozzájárulhat az adhezív rendszerek biokompatibilitásának pontosabb megismeréséhez. 6

7 1.2 Formai megjegyzések Helyesírás A dolgozatban a Magyar Tudományos Akadémia érvényes helyesírási előírásait vettem figyelembe (1). A latin és görög eredetű orvosi szavaink írását az Akadémia állásfoglalásának megfelelően végeztem (2). Amennyiben a latinos és a magyaros írás is megengedett a magyaros írásmódot alkalmaztam A doktori értekezésben alkalmazott rövidítések ADA American Dental Association Bis-GMA biszfenol-a-glicidil-metakrilát CGRP Kalcitonin gén relációs peptid (calcitonin gene-related peptide) FDI Federation Dentaire Internationale HEMA 2-hidroxietil-metakrilát ISO International Organization for Standardization LD lézer Doppler áramlásmérő PB Prime and Bond 2.1 (DeTrey) SMP Scotchbond Multipurpose Adhesive System SP P-anyag (substance P) SPA P-anyag receptor antagonista TEGDMA trietilénglicol-dimetakrilát VM vitálmikroszkópos vizsgálat 7

8 1.3 Az adhezív töméstechnika Fogászati tömőanyagok ragasztása a fog keményszöveteihez biztosíthatja a tömőanyagok jó elhorgonyzását, tökéletesebb széli záródását, ezáltal csökkentheti a szekunder káriesz és a pulpális irritáció kialakulását. A tömőanyagok adhezív elhorgonyzása a kavitásalakítás megváltoztatásával a preparációs foganyagvesztést is csökkenti. A kavitás teljes felszínére kiterjedő kondicionálás (például 35-37%-os foszforsav) a fog preparálása után visszamaradó dentintörmeléket távolítja el, és a dentin legfelső rétegéből a kollagén rostok közül a szervetlen állományt kioldja. A szervetlen összetevők hiánya miatt támaszát vesztett kollagén hálózatot a következő lépésben alkalmazott primer készíti elő a bondozáshoz. Az ezt követően a dentinre kerülő bondanyagok így képesek a kollagén rostok közé penetrálni, majd fotopolimerizáció után megszilárdulva a rostokkal úgynevezett hibrid réteget alkotva rögzülni. A következőkben felhelyezett kompozit anyagok ezzel a réteggel már szilárd kötést hoznak létre. Az adhezíó kialakítása az évek során jelentős fejlődéseken ment keresztül. Bizonyos lépéseket összevontak, egy üvegbe került a primer, a bond és esetlegesen a kondicionáló anyag is: mégis az alapelvek nem változtak. 1.4 Fogorvosi iatrogenesis Napjainkban az orvostudományban alkalmazott anyagok gyors fejlődése és szerteágazó összetétele folytán egyre több gond jelentkezik a későn felfedezett káros mellékhatások következményeként. A fogászati iatrogenesisen a fogorvosi gyógyítás során létrejövő járulékos problémákat értjük. Ide tartoznak a szuvas fog ellátásakor alkalmazott anyagok pulpális toxicitásából adódó következmények is. Az egyre elterjedtebben alkalmazott kompozit bond és kondicionáló anyagok kémiailag és biológiailag aktív anyagok, így felvetődik a pulpális szövetekre gyakorolt toxikus hatásuk. 8

9 1.4.1 Az adhezív rendszerek fejlesztése- történeti kitekintés A tömőanyagok közvetlen kötődése a fog keményszöveteihez régóta célja a fogorvosi fejlesztéseknek. Az optimális dentin adhézió biztosítása azonban jelentős kihívás, a dentin nagyon alacsony felületi feszültsége és hidrofil tulajdonsága megnehezíti a hidrofób tömőanyagok mikroretenciós kötődésének létrejöttét. Az esztétikus tömőanyagok zománcadhézióját foszforsavas kezelés hatására már ben megfigyelték (3). A dentinadhézió sikeres alkalmazása azonban számos fejlesztés után vált csak lehetővé. A dentin hidrofób tulajdonságaiból adódó nehézségeket tovább bonyolítja, hogy a közvetlenül a dentinfelszínre kerülő bondanyagok jelentős veszélyt jelenthetnek a fogpulpa számára, hiszen jelentős sejtkárosító hatással rendelkeznek és a dentintubulusokon keresztül könnyen diffundálhatnak a pulpa szövetéhez. Ennek megfelelően a tömőanyagok biokompatibilitásának kérdésköre igen korán felvetődött (4, 5), de mind a mai napig nem zárult le megnyugtatóan. Az akrilát tömőanyagok dentinadhézióját (kezdeti sikertelenségek után) Nation figyelte meg egy promóter alkalmazását követően (6). Később 50% citromsav, metakrilát monomer, tartársav foszforészter, isocionát-monomer és glutáraldehid alkalmazásával értek el egyre jobb eredményeket. A fejlesztéseknek már ebben a szakaszában megfigyelték az anyagokhoz kapcsolódó jelentős pulpális toxicitást. A továbbiakban kifejlesztett foszforilált monomeres (módosított Bis-GMA, HEMA, TEGDMA) bondanyagok feltételezések szerint a dentin Ca ++ ionjaival létrejövő kelátképződéssel voltak hivatottak ionos kötéserőt biztosítani (7). 9

10 A kelátképző bondanyagokkal kapcsolatosan a savazást csak a zománcon végezték, hogy az úgynevezett smear layer a dentinen megmaradjon. A smear layer a forgóeszközzel preparált dentin felszínén visszamaradó réteg, mely dentintörmelékből és mikroorganizmusokból áll. Megtartását azért javasolták, mert a smear layer: Több Ca 2+ iont tartalmaz, mint a felszíni dentinréteg: így a feltételezett kelátképződés erősebb kötést eredményezhetett. Érdes, nagy felszíne jobb mechanikai elhorgonyzást jelenthet. A dentintubulusok normális folyadékáramlását 30%-kal csökkenti, így a szárazabb dentinfelszínen jobb kötés jöhet létre. A dentintubulusok lezárásával védi a pulpát a különböző irritációktól. Később kifejlesztették a total etching technikáját, ahol a kavitás teljes felszínére kiterjedő (a dentinen 15 másodperces) kondicionálás a smear layert eltávolítja, és a dentin legfelső 10 µm-nyi rétegében a szervetlen állományt kioldja. A támaszát vesztett kollagén háló összeesését, kollapszusát kiküszöbölendő vezették be a primer alkalmazását. A primerrel kezelt dentinre kerülő bondanyagok a kollagén rostok közé penetrálnak, s ott megszilárdulva rögzülnek (hibrid réteg). Ezt a mikromechanikai rögzülést erősíthetik a dentintubulusokba bejutó és megszilárduló bondanyagok polimercsapjai. A mikromechanikai rögzülésen kívül a kémiai kötéserők is szerepet játszhatnak az adhézióban, bár ennek jelentős szerepe mindmáig nem bizonyított. Feltételezett, hogy a foszfát, foszforilált észter vagy foszfo-biszkloro csoportok ionos kötésbe léphetnek a dentin Ca 2+ ionjaival. Az amino-, amido-, hidroxil-, karboxilcsoportok kollagén rostokkal kialakított kémiai kötése is lehetséges, de ezek rögzítő szerepe valószínűleg nem jelentős (7). A közelmúltban a szervetlen összetevőktől megfosztott kollagénháló rögzítő szerepét is megkérdőjelezték, és a rögzítő erőt a részben demineralizált dentinbe felszínesen (3µm) penetráló bondanyagnak tulajdonítják (8, 9). Látható, hogy a bondozás mechanikája, kémiája mind a mai napig nem tisztázott pontosan. 10

11 A hihetetlen sebességű fejlesztések eredményeként egyre újabb és újabb kompozit tömő- és bondanyagok jelennek meg a klinikai gyakorlatban. Mára már külön szakággá nőtte ki magát az adhezív fogászat. A rohamos fejlődés és az adhezív rendszerek tömeges kereskedelmi megjelenése az anyagok széleskörű tesztelését megnehezíti. Ez a magyarázata annak, hogy a modern tömőanyagok biokompatibilitása sokat vitatott kérdés. Noha a dentinhez való kötödés tökéletesítése érdekében számos vizsgálat fókuszált a bondozás mechanikájára, a pulpális biokompatibilitás kérdésköre sokáig háttérbe szorult (7). A pulpára gyakorolt izgató, toxikus hatás részben a bondanyagok kémiai összetételének függvénye. A bondrendszerek kémiai összetétele az évek során számos változáson ment keresztül, mégis a különféle bondanyagok összetétele hasonló. Bipólusú (egy hidrofób és egy hidrofil részből álló) molekulák biztosítják a hidrofil dentin és a hidrofób kompozit közötti kötést. Ezek rendszerint kettős kötésekkel rendelkező, valamilyen oldószerben (aceton, víz vagy alkohol) oldott monomerek, melyek fotoiniciátor hatására egymással kötésbe lépve, hosszú polimereket alkotnak. Tipikus képviselői a TEGDMA, HEMA és egyéb kémiai változatok. Ezeken kívül a bondanyagok kis százalékban tartalmaznak fotoiniciátort (a fotopolimerizáció beindítására), fotostabilizátort (a színtartóság érdekében), inhibitort (korai polimerizáció ellen). A TEGDMA hosszú flexibilis láncú, de kis molekulasúlyú bifunkcionális monomer. Jelenléte a polimerizált rezin flexibilitását növeli, keménységét csökkenti. Kisebb mérete miatt a bondanyag viszkozitását csökkenti. Jó diffúziós képessége és erős sejtkárosító hatása miatt jelentős szerepe lehet a pulpális reakciók kialakításában (10). A HEMA elsősorban a primerben alkalmazott monomer. Jó diffúziós képessége a bondanyagnak a kollagén rostok közé jutását segíti. A kollagén szálak megerősítésével (11) képes a keményszövet-támaszától megfosztott kollagén hálózatot a kollapszustól megvédeni, illetve újra feltámasztani (12). Így biztosítja az adhezív monomerek mély penetrációját a kondicionált dentinrétegbe. Jó diffúziós képessége miatt a pulpa 11

12 szövetében toxikus koncentrációt érhet el, így szerepe lehet az adhezív rendszerek alkalmazását követő pulpális reakciók létrejöttében (11). Számos egyéb monomer (például Bis-GMA) - a nagy molekulasúlyából adódóan lassan diffundál a dentintubulusokon keresztül, így a bondanyagok pulpális toxicitásában nem játszik jelentős szerepet (13) Az adhezív rendszerek biokompatibilitás-vizsgálata A kompozíciós tömőanyagok fejlődésével, fizikai tulajdonságainak tesztelésével párhuzamosan, a biokompatibilitás problematikájával foglalkozó közlemények is egyre nagyobb számban jelentek meg. Azt, hogy a kérdés még máig sem tisztázott, a biokompatibilitás tesztek egymásnak ellentmondó eredményei bizonyítják (10). Az adhezív töméstechnika során alkalmazott anyagok összetevőinek biokompatibiltás vizsgálata igen bonyolult folyamat, hiszen az adhezív eljárás legtöbbször összetett, több klinikai munkafázisból felépülő rendszer. Az adhéziós és fizikai tulajdonságok javítása céljából ezek az anyagok még napjainkban is folyamatos változtatásokon mennek keresztül. Tovább bonyolítja a vizsgálatokat, hogy a bondanyagok fizikai tulajdonságai áttételesen befolyásolhatják a biokompatibilitás-vizsgálat eredményeit. Például gyenge adhézió esetén a tömés és a fog között létrejövő rés hozzájárulhat a teszt során megfigyelhető pulpális irritációhoz. Több, a nemzetközi szakirodalomban megszabott és szabványosított in vitro és in vivo teszt ajánlott a tömőanyagok toxicitásának meghatározásához (10, 14, 15). Egy fogászati anyag biokompatibiltásának vizsgálata nem lehetséges egyetlen teszttel: in vitro és in vivo tesztek sorozata adhat csak teljes képet a vizsgált anyag biológiai tulajdonságairól. Strukturált biokompatibilitás-vizsgálat sorozat felépítésére először Autian tett ajánlást (16): a vizsgálati sor az egyszerűbb, olcsóbb tesztekkel kezdődve a bonyolultabb, specifikusabb tesztek felé tart. A később megalkotott nemzetközi szabvány (FDI, ISO 7405/1984) a Langeland által módosított vizsgálati sorozat ajánlását tartalmazza (17): 12

13 Iniciális tesztek (szisztémás toxicitás, mutagenitás, citotoxicitás) Másodlagos tesztek (implantáció, allergizálás, nyálkahártya irritáció) Felhasználási (usage) tesztek Az ajánlást mai formájában több apró változtatás után számos nemzeti (ADA/ANSI, BSI, DIN, AFNOR, MSZ) és nemzetközi (ISO, EN) szabvány rögzíti (15, 17). Ilyen például az ISO leírás, mely alkalmazható minden orvosi anyag biokompatibilitásvizsgálatához: a megfelelő tesztek kiválasztását (ISO ) és végrehajtását (ISO ) szabványosítja. A vizsgálandó anyag és összetevőinek sejtkárosító hatásáról nyújt információt a citotoxicitás vizsgálat, melynek leírását az ISO és az ISO-7405 dokumentum tartalmazza. A teszttel például a bondanyagok és összetevőik hatását különböző emberi és állati eredetű sejtkultúrákon vizsgálják. Az általában orális szövetekből származó sejteket kezelnek az adhezív rendszerek összetevőivel, majd valamilyen a sejt működésével kapcsolatos mutató (enzim aktivitás, DNS-RNS-fehérje képzés, morfológiai mutatók, vagy a sejt proliferáció redukció) változását mérik. Az anyag toxicitását rendszerint azzal a koncentrációval jellemzik, amely a vizsgált mutató 50%-os csökkenését eredményezi. Általános az ED 50 (=effective dose) koncentráció feltüntetése: az a koncentráció, amelynél a vizsgált sejteken 50%-os proliferációs csökkenés tapasztalható. A sokféle mutató alkalmazása és egyéb paraméterek változékonysága erősen befolyásolják a megfigyelt számszerű eredményeket, emiatt meglehetősen nehéz összehasonlítani a különböző munkacsoportok eredményeit. A citotoxicitás vizsgálatokon kívül számos eljárás hivatott a vizsgált anyag általános veszélyességének megítélésére. A genotoxicitás (mutagenitás, karcinogenitás) vizsgálata alapvető fontosságú. Több in vitro és in vivo tesztből épül fel (OECD és az ISO szabályozza). A mikrobiális teszt a baktériumokra kifejtett hatást vizsgálja. A nem specifikus lokális szöveti biokompatibilitást implantációs tesztekkel vizsgálják. A szisztémás toxicitással is több vizsgálat foglalkozik: a halálos dózis mérhető (LD 50, az a dózis, ahol a teszt állatok fele elpusztul) orális és inhalációs bevitelt követően. Mivel a 13

14 bondanyagok kis mennyiségben jutnak be szisztémásan a szervezet egészébe, a szisztémás toxicitás vizsgálatának a szerepe a bondanyagok biokompatibilitása szempontjából kicsi. Annál fontosabb, és egyre jobban előtérbe kerül az allergizáló és irritáló hatás vizsgálata (ISO , 1994). Számos vizsgálat bizonyítja az alkalmazott adhezív anyagok mind a mai napig meglévő erős irritáló és allergizáló hatását. A fogászati tömőanyagok biokompatibilitás-vizsgálatára az 1994-ben elfogadott ISO/DIS 7405 (a Dental Material standard EN1641 része) tesz külön ajánlást. Ez a dokumentum a pulpa/dentin felhasználási tesztek (usage tesztek) leírására fókuszál, hiszen ez az előző (ISO 10993) dokumentumban nem volt pontosan meghatározva. Ez a vizsgálati módszer a dentinre kerülő anyagok fogpulpára kifejtett lokális hatásait kutatja. Langeland és Klötzer (18, 19) által kifejlesztett eljárás során szövettani metszeteken vizsgálják a fogászati anyagok pulpális veszélyességét. Nemzetközileg ez a legelterjedtebben alkalmazott felhasználási teszt. A vizsgálandó anyagot standardizált körülmények között élő kísérleti állatok fogán kialakított V osztályú kavitásba helyezik, a klinikai alkalmazásnak megfelelően. Különböző idő eltelte után (3-7nap, 1 hónap, nap) a pulpa állapotát szövettani metszeteken vizsgálják. A megfigyelhető pulpareakció mértékét a cinkoxid eugenol (ZOE) cementtel tömött kontroll fogak pulpa állapotához hasonlítják. A szövettani elváltozásokat az intenzitásuk alapján osztályozzák és index-számmal jellemzik (0-4). A tömőanyagok pulpális biokompatibilitásának eldöntésére elsősorban ezt a tesztet alkalmazzák, pedig számos probléma ismert a vizsgálóeljárással kapcsolatosan (ld ). A biokompatibilitás-vizsgálatsor befejező lépése a klinikai tesztelés. Hosszú távú megfigyelés szükséges az esetlegesen addig fel nem fedett rizikó faktorok felismeréséhez és kiküszöböléséhez Az adhezív rendszerek biokompatibilitás-vizsgálatánál adódó problémák 14

15 A tömő és bondanyagok in vivo biokompatibilitás-vizsgálatánál elterjedten alkalmazott felhasználási pulpa tesztekkel kapcsolatban számos probléma merült fel (7). Ugyanazon anyagok vizsgálata során egymásnak teljesen ellentmondó eredmények születtek. Számos vizsgálatban (20, 21) nem találtak káros pulpális hatást egy bondanyag alkalmazását követően, de több vizsgálat ugyanezen anyag elfogadhatatlan biokompatibilitását dokumentálta (22, 23, 24). Az ellentétes eredmények okai a felhasználási tesztek korlátaiban keresendők (21, 25, 26). A legfontosabb probléma, hogy in vivo körülmények között az állatok fogába preparált kavitásban hetekig viselt töméseknél létrejövő pulpális reakciókat nemcsak a tömőanyag toxicitása okozhatja. Szerepet játszhat a tömőanyag és a fog közötti résképződés következményeképpen a pulpához diffundáló anyagok (baktériumok, bakteriális és más toxikus termékek) irritáló hatása (27). Ráadásul a bakteriális invázió tényezője nem független a tömőanyag, bondanyag fizikai tulajdonságaitól. Előfordulhat, hogy egy biológiailag inert tömőanyag rossz széli zárása miatt jelentős toxicitást mutat. A probléma felismerése óta a felhasználási tesztek során a bakteriális invázió mértékét is próbálják mérni, és a kiértékelésnél figyelembe venni (22). Sajnos azonban egyrészt a bakteriális invázió mértéke nehezen standardizálható, másrészt nehezen kimutatható és mérhető (festési problémák (21, 28)). További probléma, hogy a klinikumban és a felhasználási tesztekben a kavitásalakítás során a pulpa távolsága a dentinfelszíntől nem mérhető és így nem standardizálható (22). A pulpa alakja, mérete csak az utólagos hisztológiai metszeteken válik többékevésbé megfigyelhetővé és mérhetővé. Számos összefüggést mutattak ki a pulpális dentin vastagsága és a pulpareakció típusa, súlyossága között (29, 30). Tehát a pulpát fedő dentinréteg vastagsága a biokompatibilitás-vizsgálatokban jelentősen befolyásolhatja a kiváltott válaszreakció erősségét (21). A nemzetközileg alkalmazott tesztek során a kontroll csoportban cinkoxid eugenol cement töméseket alkalmaznak a vizsgálati csoporthoz hasonlóan kialakított üregben. Brännström kimutatta, hogy az eugenol összetevő jelenléte miatt ez a cement vakuólás 15

16 degenerációt okozhat a pulpális szövetben (31), és a közelmúltban a széli záródás biztonsága is megkérdőjeleződött (32). Ezért kontrolként történő alkalmazása nem biztosítja az irritációmentes pulpális szövet megfigyelését (25). Nem elhanyagolható faktor a szövettani metszetek értékelésének szubjektív volta. A szövettani károsodás mértékének megítélése jelentősen különbözhet az egyes szerzők szerint (10). Összességében tehát a teszt alkalmazása során több zavaró tényező együttes jelenléte okozhatja az irodalomban megfigyelt ellentétes eredményeket. Pozitív válaszreakció esetén nehéz eldönteni, hogy a reakciót a preparációs károsodás, esetlegesen kis ponton exponálódott pulpaszövet, bakteriális invázió, vagy valóban a töméshez alkalmazott valamelyik anyag toxicitása okozta (33). A kísérleteinkben alkalmazott vitálmikroszkópos vizsgálat, ugyan nem ad teljes képet a tömőanyag okozta változásokról, mégis megfelelően kiegészíti a nemzetközi vizsgálóeljárásokkal nyert adatokat az anyagok toxicitását illetően, hiszen az említett zavaró faktorok kevésbé befolyásolják a vizsgálatok eredményeit. A vizsgáló eljárások szabványosítása, és a megfelelő tesztek kijelölése jelentős előrelépés a különböző laborokban végzett biokompatibilitás-vizsgálatok eredményeinek összevethetőségéhez. A standard eljárások kialakításával azonban háttérbe szorulhatnak a különleges specifikus vizsgáló eljárások (mint például a vizsgálatainkban alkalmazott vitálmikroszkópia és lézer Doppler áramlásmérés), melyek adalék információival pontosabban megérthető a biokompatibilitás kérdésköre. A modern felfogás szerint a standard eljárások mellett nagy szükség van a nem standardizált egyedi vizsgálóeljárásokra is (15) Adhezív rendszerek pulpális biokompatibilitása Kondicionálás biokompatibilitása 16

17 A közelmúltban bevezetett total etching módszer alkalmazása során a zománc kondicionálása kiegészül a dentin kondicionálásával, így a kavitás teljes felszínére, a pulpális falra is kerül kondicionáló sav. A gyártók által előírt 15 ill. 20 másodperces kondicionálás a dentintubulusokat lezáró smear layer eltávolításával és a dentintubulusok átmérőjének növelésével a fokozza a pulpát fedő dentinréteg permeabilitását (34). Ezért a kondicionálást követően a pulpa védettsége a külső hatások ellen csökken. A savazás közvetlen önálló hatásának vizsgálata megnehezített, hiszen a felhasználási tesztekben a kavitást a megfigyelési időszak végéig le kell zárni valamilyen tömőanyaggal; így a rendszer együttes hatását lehet csak megfigyelni. Számos vizsgálat fókuszált mégis a pulpális fal kondicionálásának hatására, de az eredmények egymásnak ellentmondóak (25). A közlemények egy része a dentin savazás biztonságosságát (21, 35), míg más közlemények végzetes hatásait (24, 36) bizonyították. Stanley megállapította, hogy a sav koncentrációjának és a behatási idejének csökkenésével a pulpális szövettani reakciók mértéke is csökken (14). A kondicionáló anyagok kémiailag aktív savak, sejtkárosító hatásúak (37). A nemzetközileg alkalmazott vizsgáló eljárások eredményei megoszlanak a mély üregben történő savazás klinikai alkalmazhatóságát illetően. 17

18 Bondanyagok biokompatibilitása A bondanyagok toxicitását a kémiai alkotórészek veszélyessége határozza meg. A kémiai összetevőket számos sejtkultúra teszttel vizsgálták, és számos összetevőről (például: TEGDMA és HEMA) egyértelműen bizonyított erős sejtkárosító hatása (38). Kimutatott, hogy egyes kémiai összetevők kiváló diffúziós tulajdonságai (39) lehetővé teszik a monomerek dentin falon keresztüli pulpális diffúzióját (40), és ott a toxikus koncentráció elérését. Ennek ellenére nagyon kevés közlemény foglalkozik az egyes kémiai összetevők önálló pulpális hatásával (10). Valószínűleg metodológiai nehézségek miatt van ez így, hiszen az oldatban lévő kémiai anyagok kavitásban tartása az elterjedten alkalmazott krónikus felhasználási tesztekben nehezen kivitelezhető. Számos közlemény vizsgálja a bondanyagokból fotopolimerizációt követően kioldódó nem reagált monomerek lehetséges pulpális hatását (41). Ismert a kioldódó anyagok összetétele és mennyisége, és jelentős sejtkárosító hatása is (10). Bizonyított, hogy közvetlenül az anyag felhelyezését követő diffúzió a legjelentősebb (38), mégis kevés közlemény foglalkozik a bondanyagok kezdeti, közvetlenül az applikációt követő pulpális hatásával. A kereskedelemben kapható bondanyagok még nem polimerizált állapotukban sokkal magasabb koncentrációban tartalmaznak toxikus monomereket, mint a nemzetközi irodalomban széles körben vizsgált fotopolimerizációt követő krónikus monomer szivárgás koncentrációja. Gyakran a citotoxicitás vizsgálatok során is csak a már megkötött bondanyagok sejtkárosító hatását mérik, pedig a polimerizáció előtt - a monomer alkotórészek nagy koncentrációja miatt sokkal jelentősebb sejtkárosító hatással rendelkeznek (42). Számos, a fogorvoslásban alkalmazott bondanyagot vizsgáltak in vitro sejtkultúrákon. A bondanyagokat vékony detninréteggel elválasztva a sejtkultúrától a dentin jelentős (toxikus reakciót befolyásoló) szerepét bizonyították (43). Bondanyaggal átitatott szivacs bőralatti kötőszövetbe történő implantációja után súlyos gyulladásos reakciót figyeltek meg (44). 18

19 A kereskedelemben elérhető adhezív rendszerek (tömőanyaggal kombinált) alkalmazásának pulpális hatását temérdek szövettani felhasználási teszttel vizsgálták. Sajnos összehasonlításuk a vizsgált bond- és tömőanyagok, módszerek és egyéb faktorok (dentin mélység, bakteriális kontamináció) diverzitása miatt nagyon nehéz. Számos vizsgálat a bondanyagok kiváló biokompatibilitásáról tesz tanúbizonyságot (20), míg ezzel ellenkezőleg számos közlemény nem ajánlja pulpa közeli alkalmazásukat (23). Nem áll még megfelelő mennyiségű rendszerezett vizsgálati anyag a rendelkezésünkre, hogy a kérdés tisztázódjon (10). 1.5 A bondanyagok által kiváltott pulpális reakciók élettani háttere A pulpális szövet megfigyelésének metodikai problémái miatt a pulpális reakciók élettani háttere még korántsem tisztázott. A legtöbb közleményben a fogpulpa élettani működésére strukturális vizsgálatokkal vagy biológiailag aktív anyagok kimutatásával próbálnak következtetni. Kevés vizsgálat foglakozik a dinamikusan változó mikrocirkulációs reakciók megfigyelésével, mivel a pulpában az élettani jellemzők folyamatos vizsgálatára kevés metodika alkalmas. A fogpulpa gazdagon ellátott érző idegekkel (45). A szenzoros idegek alapvető feladata, hogy észleljék és továbbítsák a szöveteket érő stimulusokat. A mielinizált A rostok a dentint érő stimulusok észleléséért, az éles szúró fájdalom kiváltásáért felelősek. A polimodális C rostok nem csak a tompa fájdalmat keltő ingerületeket továbbítják a központi idegrendszer felé, hanem helyi bioaktív anyagok felszabadításával az azonnali válaszreakció elindításában is jelentős szerepük van. A szenzoros idegvégződésekből felszabaduló SP (P-anyag) és CGRP (kalcitonin gén relációs peptid) helyi vasodilatatiót, az érfal-permeabilitásának növekedését, azaz a neurogén gyulladás létrejöttét okozza (46). A neurogén összetevők jelentős szerepét a különböző szervek lokális vérkeringés-szabályozásában számos közlemény bizonyítja (47). A fogpulpában azonban metodológiai okokból még nem sikerült egyértelműen tisztázni a szenzoros 19

20 idegvégződések szerepét a pulpális keringésszabályozásban és a restauratív eljárásokra adott válaszreakciókban. 1.6 A fogpulpa keringésének, keringési zavarainak vizsgáló módszerei A fogpulpa felépítése, működése alkalmazkodott a keményszövetbe ágyazott helyzetéhez. Rigid dentinfallal körülzárt pozíciójából adódik keringésének egyedülálló patofiziológiája, és vizsgálati nehézségei is. Patológiás folyamatai vérkeringésváltozásokon alapulnak, ezért a pulpa hemodinamikájának vizsgálata alapvető a kóros reakciók megismeréséhez. A pulpa vérkeringésének megfigyelésére és megértésére számos módszer látott napvilágot, azonban metodológiai nehézségek miatt a pulpális mikrocirkuláció pontos dinamikája mindmáig nem ismert. A pulpális keringés fiziológiájának, patológiájának megismeréséhez nélkülözhetetlen strukturális, anatómiai felépítésének megismerése. Ezért röviden ennek vizsgálati lehetőségeit és eredményeit ismertetem, majd azt követően a keringés funkcionális, in vivo vizsgálómódszereit Pulpális keringés morfológiája A 18. században terjedt el az a nézet, hogy a fogpulpában nincsenek erek, hiszen azokat nem sikerült kanülálni ban Hopewell-Smith írta le pontosan a pulpa erek struktúráját és elhelyezkedését a fogbélben (48). Kramer extrahált emberi fogakon koronális üregen keresztül a pulpába tus-tintát szívott, és így vizsgálta az ereket. Ezzel a módszerrel figyelte meg az arteriovenózus anasztomózisok, subodontoblasticus kapillárishálózat pulpális jelenlétét (49). 20

21 Hisztológiai módszerek A pulpa egészének részletes hisztológiai vizsgálatát Provenza végezte el (50). Az ereket a szövettani képük szerint csoportosította. Valódi kapillárisnak az egyetlen endothelialis réteggel, metarteriolának pedig az izomréteggel rendelkező ereket nevezte. Hisztológiai módszerekkel a különböző arteriolák, kapillárisok, venulák meghatározott szerkezet szerinti elrendeződése figyelhető meg, és különleges struktúrák (U alakú hurok-arteriolák, és arteriovenózus, venovenózus anasztomózisok) is kimutathatóak. A pulpaszövet hisztológiai vizsgálata során a pulpa állapotáról az erek tágasságának megfigyelésével is kaphatunk információt. Szövettani feldolgozással a krónikus és akut gyulladás folyamatát és egyes fogászati anyagok pulpális hatását, biokompatibilitását vizsgálják Elektron mikroszkópia Han és Avery a kapillárisok és arteriolák ultrastruktúrájának vizsgálatát végezték el, mellyel kimutatták a transzkapilláris szállító pinocytoticus vesiculák és az erek közelében az idegvégződések jelenlétét (51) Scanning Elektron Mikroszkópia A vérerekbe juttatott korróziós latex vagy rezin öntvény felszínét vizsgálva az erek elhelyezkedéséről, lefutásáról nyerhető pontos információ. Krónikus és akut pulpális gyulladások során az erek morfológiájában beállt változásokat ezzel a módszerrel Kishi vizsgálta (52). Ezzel a módszerrel kitűnően vizsgálható a pulpális keringés struktúrája és a pulpaerek egyedülálló jellegzetességei (a kidomborodó U alakú hurok-arteriolák, és anasztomózisok). A pulpa érrendszerének felépítése három összetevőre különíthető el 21

22 (az odontoblastrétegtől a pulpa közepe felé haladva): terminális kapillárishálózat, a dentinfalra merőleges lefutású kapillárisok és a pulpa mélyebb területein található vastagabb arteriolák és venulák. A fő szállító erek köteget alkotva a pulpa centrális részében futnak Biológiailag aktív anyagok kimutatása A pulpaszövet élettani folyamatainak és szabályozó mechanizmusainak megértéséhez nyújt fontos információt az egyes receptorok ill. jelátvivő anyagok anyagcsereösszetevőinek kimutatása hisztokémiai módszerekkel. Számos fontos átvivőanyag jelenlétének kimutatásáról és lokalizációjáról szóló közlemény található meg az irodalomban. Hisztokémiai módszerrel Olgart és munkatársai bizonyították a fogpulpában a szenzoros idegvégződésekből felszabaduló P-anyag jelenlétét (53). A közelmúltban immuno-elektronmikroszkópos módszerrel a P-anyag pontos lokalizációját is felderítették (54) Funkcionális vizsgálatok Az élő szervezetekben elterjedt, a keringésről információt adó direkt funkcionális vizsgálómódszerek csak korlátozottan alkalmazhatók a fogbél területén (a pulpába lépő erek preparálása, elkülönítése, a vénás kiáramlás gyűjtése, mérése nem megoldott). Ennek ellenére a közelmúltban egyre több lehetőség nyílik a pulpális keringés dinamikájának megismerésére. A funkcionális vizsgálati módszerek segítségével a fiziológiás vagy patológiás állapotok keringési változásait figyelhetjük meg. Meg kell azonban említeni, hogy az ehhez szükséges bioaktív anyagok lokális alkalmazása a pulpa szövetén nehezen kivitelezhető. 22

23 Izotóp megoszlásos technikák A vénás keringésbe juttatott (izotóp) indikátoranyag különböző szervek közötti megoszlásából következtethetünk a szövet véráramlására. Minél nagyobb a keringése egy szövetnek, annál nagyobb a kimutatható indikátoranyag mennyisége a szövetben az első szívciklust követően. A módszer hátránya, hogy a keringésváltozások folyamatos, követéses megfigyelését nem teszi lehetővé. Rb 86 izotóp alkalmazásával először Steiner és Mueller állapította meg a pulpa átlagos vérkeringését (0,2 ml/min. g) patkányban (55) Indikátor kimosásos technikák A pulpába juttatott indikátoranyag pulpából való kimosódásának sebességéből következtethetünk a szövet véráramlására. Minél nagyobb a keringése egy szövetnek, és minél nagyobb az artériás ill. szöveti koncentráció különbség, annál gyorsabban csökken az indikátoranyag mennyisége a szövetben Xenon kimosásos technikák Olyan kísérleti állatokon alkalmazható, ahol a fogbél nagy tömegű. Az altatott állatoknál egy bolusban radioaktív xenont juttatnak a fogpulpába arteriális keringésen (artéria maxillárison) keresztül. (56). A xenon jó diffúziós képessége miatt a fogbél szövetébe lép az arteriális keringésből. Az ezt követő pulpából való kimosódás (a pulpális izotóp tartalom csökkenés) sebességéből a szövet keringésére következtethetünk. Így az állat szemfogának radioaktivitás változásának adataiból a pulpális keringés mértéke kiszámítható. A módszer előnye, hogy intakt fogon kvantitatív eredményt biztosít a pulpa keringéséről. 23

24 Jód kimosásos módszer Edwall és Olgart a radioaktív jód indikátort a fogon kialakított mély üregbe helyezte. A kavitásból az izotóp kiürülését mérve, következtettek a keringés mértékére (57). A pulpa indikátor kimosódásának mértéke az üregbe helyezett indikátor mennyisége mellett eltörpül, ezért a mérések szórás értéke igen magas. Az eredmények leginkább csak kvalitatívan értékelhetők. Hátrány ezenkívül az, hogy a keringés vizsgálata a mély kavitás alakítása miatt nem intakt fogbélen történik Hidrogén gáz deszaturációs módszer Tönder és Aukland 1974-ben határozták meg a pulpális keringés mértékét (15 ml/min 100g) belélegzett H 2 gáz pulpális kimosódása alapján (58). A módszer hátránya, hogy a fogbél-szövetbe implantált platina mérőelektróda maga is sérülést, vérömlenyt okozhat, és csak az elektróda körüli pár száz mikrométeres terület (azaz a teljes pulpa töredékének) keringéséről nyújt adatot Jelölt mikrogyöngy elakadásának módszere Szilárd szemcsék érpályában való elakadását először Pohlman (48) használta fel a vérkeringés vizsgálatára. Ma leginkább (radioaktivitással vagy festékkel) jelölt műanyag mikrogyöngyöket juttatnak a jobb pulpakamrába, melyek méretüknél fogva a kapilláris erekbe jutva ott elakadnak. Az így megakadt indikátor mennyisége arányos a szerv vagy szövet véráramlásával. Az állat leölése, a szövetek kipreparálása után mérhető az egyes területeken megakadt gyöngyök mennyisége, így kiszámítható a perctérfogathoz viszonyított keringés mértéke. A módszer előnye, hogy intakt fogon végezhető, egyszerre több információt is adhat: összevethető más szövetek keringésével, vagy regionális különbségek is vizsgálhatóak 24

25 (például: a koronális és az apikális területek összehasonlítása). Különböző méretű mikrogyöngyök (59) alkalmazásával (például: 9 µm nagyságú mikrogyöngyök a shuntereken átjutnak, de a kapillárisokban elakadnak, míg a 15µm-esek a shunterekben is elakadnak) a pulpális shuntkeringés mértéke is megbecsülhető (a pulpális keringés 33%-a!). Hátránya, hogy csak pillanatképet képes mérni az állat keringési viszonyairól, folyamatos megfigyelést nem tesz lehetővé Fényelnyelés-változást mérő módszerek A fényelnyelés változását mérő eljárások segítségével a pulpális keringésnek megfelelően változó fog opacitás mérhető noninvazívan. Ennek a módszernek használata nem terjedt el, hiszen a keringés mértékéről csak nagyon közvetetten nyújt információt. Spektrofotometriás módszer két hullámhosszon: Nissan és munkatársai a Millikan és Chance által leírt módszert tovább fejlesztve, nem csak az arteriola véráramlásának pulzációját és a vér oxigenizáció változását voltak képesek mérni, hanem a vérmennyiségről is nyertek adatot (60). Photopletysmográfia: Az Upthegrove által bevezetett pulpális véráramlás pulzálásának, és mennyiségi változásainak detektálására alkalmas módszert a közelmúltban fejlesztették tovább (61) Elektromos impedancia-változások mérése Az áramló vér sebességének és vezetőképességének összefüggését használja ki a Liebman és Cosenza által kifejlesztett módszer, ahol a dentinbe helyezett elektródák segítségével a pulpa elektromos ellenállását regisztrálták (62). Az ellenállás értékek változása alapján a pulpa volumetriás véráramlásáról nyertek adatokat (például: kutya fogbélben 0,06 ml/min). 25

26 Isothermális mérések A hőváltozások mérésével a vérkeringés noninvazívan, folyamatosan vizsgálható, de a dentin hőszigetelő hatása miatt a módszer érzékenysége kicsi, csak közvetett, pontatlan információt nyújt a pulpális keringésről. A módszer segítségével különböző ingerek alkalmazása mellett mérték a pulpális keringés változását (63) Egyéb jellemzők vizsgálata Kraintz és Conroy (64) határozták meg a pulpa szövetének vértartalmát. Jelölt albumin segítségével végzett méréseik szerint a kutya fogpulpája átlagosan 0,01 ml vért tartalmaz. A pulpa oxigén fogyasztását deleon és mtsai. vizsgálták (65), és a fogbél vérellátásával vetették össze. Az érfal permeabilitásának növekedése a gyulladásos reakciók egyik jelentős összetevője. Ennek vizsgálatára a vérplazma albuminjához kötődő festékanyagextravazációt mérik Evans-kék (vagy izotóppal jelölt albumin) módszer segítségével a pulpa szövetében (66). A pulpa szöveti nyomása szintén fontos információ a pulpális keringés pontos megismeréséhez. Már az 1960-as években végeztek nyomásméréseket a pulpában, de megbízható eredményeket a servo-null mikropipettás módszerrel Tönder és Naess (67) kaptak (a nyomásértékek arteriolában=43, kapillárisban=35, venulában=19 Hgmm). A pulpaszövet egy részében létrejött lokális gyulladás területén a nyomási értékekben átlagosan 10 Hgmm-rel magasabb értékeket találhatunk, mint a környező területeken, a gyulladás nem feltétlenül terjed szét az egész pulpa területén, hanem képes lokálisan kis területen megmaradni (68). 26

27 Az erekben mért nyomásértékek rámutatnak, hogy rezisztencia erek már a pulpán kívül is jelentős perfúziós nyomásesést okoznak, hiszen a 120Hgmm-es vérnyomásból már csak 43Hgmm nyomással érkezik a vér a pulpába. Ez feltételezi, hogy a pulpán kívül is szabályozódik a fogak vérkeringése (68) Anyagok lokális bejuttatásának lehetőségei A pulpális keringésváltozások patofiziológiai vizsgálatához, megértéséhez szükséges lehet biológiailag aktív anyagok bejuttatása a fogbél területére (például: agonisták, antagonisták). A szisztémás applikáció során létrejövő központi keringésváltozás befolyásolhatja, sőt eltakarhatja a pulpa erekben létrejövő véráramlás-változásokat. Ezért szükséges lehet az anyagok lokális bejuttatása a pulpa szövetébe, ami a pulpa keményszövetekbe ágyazott voltából adódóan jelentősen megnehezített Artéria carotis ágainak kanülálása A pulpába lépő erek kanülálása még nem megoldott, így az arteriálisan bejuttatott anyagok a környező szövetekbe is eljutnak. Így jön létre (vasodilatator anyagok intraarteriális applikációjánál) az un. stealing effektus : a környező szövetekben is kialakuló vasodilatatio a perfúziós nyomás csökkenését okozza (69), ezáltal a pulpában mért véráramlás-értékek csökkennek, a helyi vasodilatatio ellenére Diffúzió a dentinfalon keresztül Anyagok pulpális bejuttatása ozmotikus diffúzió segítségével csak elvékonyított dentinfalon keresztül lehetséges. A fog felszínén kialakított mély kavitás pulpális falára helyezett anyag lassan átáramlik a vékony dentinfalon és eljut a pulpába. A kavitás mélységének kialakításakor nincs lehetőség a megmaradó dentinréteg vastagságának standardizálására, ill. az esetleges preparációs károsodás kizárására. Jó 27

28 megoldást biztosít erre a később ismertetendő vitálmikroszkópos módszer, hiszen a megfelelő átláthatóság elérése érdekében közel azonos vastagságúra kell preparálni a pulpát fedő dentinfalat, és az esetleges preparációs károsodások is így jól megfigyelhetőek (70) Iontophoresis (facilitált diffúzió) Iontophoresis során a töltéssel rendelkező bejuttatandó anyagot elektromos áram segítségével szállítják a dentincsatornákon keresztül a pulpába. Szükséges a fogfelszínéről a zománcréteg eltávolítása, és az áram kizárólag pulpális vezetésének biztosítása. A kis áramerősség valószínűleg nem okoz jelentős keringésváltozást, de csak töltéssel rendelkező anyagok szállíthatóak így. Jelentős a veszélye, hogy az elektromos áram a szállítandó anyaggal nem pulpális irányba, hanem a jó vezetőképességgel rendelkező környező szövetek felé szállítódik (a mukogingivális szövetek hajlamosak az áram elvezetésére). További probléma, hogy nehezen meghatározható a bejuttatott anyag dózisa. Ma még nem ismerünk olyan módszert, melynek segítségével teljesen intakt fog belsejébe juttatható a vizsgálandó anyag, mégis az óvatos preparálással kivitelezett vitálmikroszkópos vizsgálat jó lehetőséget biztosít különböző anyagok lokális hatásának vizsgálatára. 28

29 1.6.4 Kísérleteinkben alkalmazott vizsgálóeljárások ismertetése Vitálmikroszkópos vizsgálat Az élő fogpulpa mikroszkópos megfigyelését először Taylor (71) írta le, aki kutya, majom, macska és patkány pulpáját tanulmányozva, ez utóbbit találta a legmegfelelőbb kísérleti objektumnak a pulpális keringés vizsgálatára. Kim és munkatársai (72), Pohto és Scheinin (73) a pulpális erek átmérőjén kívül egyéb hemodinamikai paramétereket is vizsgáltak vitálmikroszkópos módszerrel. Gyógyszerek és fogászati alábélelő, ill. tömőanyagok pulpális hatását vitálmikroszkópos modellen elsőként Gängler vizsgálta (74, 75). Nyárasdy esztétikus tömőanyagokat vizsgált a továbbfejlesztett modellen (76). A legtöbb funkcionális vizsgáló eljárás a pulpa egészének keringéséről nyújt összesített információt. A vitálmikroszkópia segítségével lehetővé válik a mikrocirkuláció közvetlen (az érrendszer felépítő-egységeire kiterjedő) regionális vizsgálata. Kísérleteinkben ezt a vizsgálóeljárást alkalmaztuk az adhezív rendszer anyagainak, összetevőinek és az élettani anyagok hatásának kimutatására. A metszőfogpulpa vitálmikroszkópos vizsgálata során a bal alsó állkapocsfél kipreparálása után a bal alsó metszőfog mesialis és distalis oldalát addig kell óvatosan csiszolni, amíg a mikroszkóp alatt a sértetlenül maradt dentinrétegen keresztül megfigyelhetővé nem válik a pulpális erekben a keringés. Az érátmérők, és a hozzájuk tartozó véráramlás-sebesség értékek alapján kiszámítható az adott éren időegység alatt átfolyó vér mennyisége. A vékony dentinréteg (20-50 µm) jó áteresztőképessége a vizsgálandó anyagok lokális applikációját is lehetővé teszi. 29

30 Lézer Doppler áramlásmérés A lézer Doppler áramlásmérés (LD) mikrocirkulációs keringés folyamatos noninvazív mérését teszi lehetővé (77, 78), ezáltal egyedülálló az eddig ismertetett vizsgálóeljárások között. A lézer Doppler áramlásmérő kifejlesztése áttörést jelentett a vizsgáló eljárások között, azonban a pulpális keringés vizsgálatához történő beállítása, rögzítése nagyon gondos munkát igényel, és az eredmények értékelése csak kellő óvatossággal végezhető. A lézer Doppler áramlásmérés a lézerfény frekvencia eltolódásán alapul, ami mozgó részecskékről történő visszaverődés során jön létre. A kis energiájú koherens lézerfény a szövet statikus struktúráin és az áramló vérsejteken egyaránt szóródik. A szövet statikus struktúráin szóródó fény nem mutat frekvencia-eltolódást. Az áramló vérsejteken szóródó fény frekvenciaspektruma azonban a Doppler-effektusnak megfelelően eltolódik. Üvegszálon keresztül a vizsgálandó területre jut a lézer fény, és visszaverődött fényt egy másik üvegszál vezeti a készülékbe. Az áramlásmérő műszer a visszaverődő fény frekvenciájának változásai alapján olyan kimeneti jelet állít elő, amely az adott szöveti térfogatban a vér sejtes elemeinek áramlását jellemzi. A mért értékek számszerűen nem utalnak áramlás értékekre, tehát a módszer csak relatív áramlásváltozások kimutatatására alkalmas. Mivel a lézerfej kis területről mér (1mm 2 ), a mért értéknek nagy a térbeli ingadozása (pozícionálási, immobilizálási problémák). 30

31 2 Célkitűzések Vizsgálatainkat azért végeztük, hogy az esztétikus fogorvoslásban alkalmazott adhezív rendszerek egyes összetevőinek a pulpális keringésre kifejtett hatásait megismerjük. Ezért célul tűztük ki: 1, Eltérő összetételű kondicionálók különböző idejű alkalmazásának pulpális hatásának megismerését. 2, Bondrendszer hatásának vizsgálatát és összehasonlítását kondicionált és nem kondicionált dentinfelszínen. 3, Két különböző összetételű bondanyag hatásának összehasonlítását. 4, Azon kémiai összetevők identifikálását, melyek a bondanyagok által kiváltott reakcióért felelősek. 5, A megfigyelt válaszreakciók élettani folyamatának megismerését, a szenzoros idegek részvételének vizsgálatát. 6, Két vizsgálóeljárást alkalmazva pontosabb kép kialakítását a pulpális változásokról, és a két eljárás eredményességének összehasonlítását. 31

32 3 Módszerek 3.1 A kísérletekben vizsgált anyagok Conditioner 36 (DeTrey, Dentsply, D Konstanz,) NRC Non-Rinse Conditioner (DeTrey, Dentsply) Scotchbond Multipurpose Adhesive System (3M Dental Products, St. Paul, MN , U.S.A) Prime & Bond 2.1 (DeTrey, Dentsply) 2-hidroxietil-metakrilát (HEMA, Sigma-Aldrich, H-1072 Budapest) trietilénglicol-dimetakrilát (TEGDMA, Sigma-Aldrich) N-acetil-L-triptofán 3,5-bis/trifluorometil/ benzil észter (L-732,138, Sigma- Aldrich) GC Fuji Bond LC (GC Corporation, Tokyo, Japan) 3.2 A kísérleti állat A vizsgálatokat Sprague Dawley hím patkányokon ( g, SE; n=184 ) altatásban végeztük. Az állatok tartása és kezelése megfelelt a nemzetközi (#A , Division of Assurances, Office of Laboratory Animal Welfare, Public Health Service, National Institutes of Health) követelményeknek és a Semmelweis Egyetem Tanácsának 53/2001- es határozatának. 32

33 3.3 Vizsgálatok vitálmikroszkópos modellen Nátrium pentobarbital (Nembutal; 35 mg/kg; 0,1 ml/100 g) intraperitoneális alkalmazásával altatott állatoknál tracheába helyezett kanül segítségével biztosítottuk a légjáratot a megfelelő légzéshez. A patkányok artéria femorálisába vékony polietilén kanült helyeztünk, amelyet elektromanométerhez csatlakoztattunk - a vérnyomás mérésére és regisztrálására. Az állat maghőmérsékletét folyamatosan mértük és stabilitását hőszabályozó segítségével (Thermocontroller, Skublics és társai, Magyarország) biztosítottuk. A mandibulafeleket összekötő ligamentumot átvágva a két alsó állkapocsfelet szétválasztottuk. A baloldalon a lágyrészeket a csont felszínéről leválasztottuk és a második moláris magasságáig feltoltuk (vérzés és a n. alveoláris inferior sérülésének elkerülése mellett). Az alsó metszőfog további preparálásához ill. mikroszkóp alatti rögzítéséhez a szabaddá tett állkapocsfelet poliészter-szalaggal ellátott körkörös matricafeszítő segítségével rögzítettük. A bal alsó metszőfog előkészítéséhez kb es fordulatszámú fúrógépet és a preparáció kezdetén karborundum csiszolóköveket, majd gyémánt fissurafúrót használtunk. A metszőfog mesialis és distalis oldalát, továbbá a fognyakat borító alveoláris csont egy részét a sagittalis síkkal párhuzamosan egy szintbe preparáltuk Krehan és mtsai módszere szerint az alveoláris nyúlványtól az incisalis élig (70). Az egész fog-előkészítési folyamat alatt a pulpát 37 C-os fiziológiás sóoldat alkalmazásával védtük a preparációs hőkárosodásoktól és óvtuk a kiszáradástól (79). Az alveoláris csont és a zománc eltávolítása után preparációs mikroszkóp (Nikon, 10 x vizuális nagyítás) alatt a csiszolást egészen addig folytattuk, ameddig a vitálmikroszkópos berendezés Nikon ( 10 x 10 es nagyítás) mikroszkópja alatt a sértetlenül maradt dentinrétegen keresztül láthatóvá és megfigyelhetővé nem vált a pulpális erekben a keringés. További preparálás növelné a preparációs károsodás lehetőségét, vastagabb dentinréteg pedig lehetetlenné tenné a keringés megfigyelését. Az állatot a mikroszkóp alá speciális tárgyasztalra helyeztük és a kapott képet videokamera (Sony CCD Iris) és képerősítő (500 x nagyítás; 1 mm a képernyőn - a valóságban 2 µm - nek felel meg) segítségével rögzítettük a későbbi mérésekhez. A preparált fogat a megfigyelés alatt 37 C-os konyhasó-oldat folyamatos csepegtetésével tartottuk nedvesen és állandó hőmérsékleten. 33

34 fűtő lámpa kamera metszőfog 37 C o fiziológiás sóoldat hőmérséklet szabályzó vérnyomás mérés 1. Ábra: A vitálmikroszkópos vizsgálat sematikus ábrája A vizsgálatot 60 perces várakozás, a steady state állapot kialakulása után kezdtük meg. A várakozási idő alatt felfedezett preparációs károsodás, pulpa expozíció ill. jelentős (kb. 33%-os) vérnyomásváltozás esetén az állatot kizártuk az értékelésből. A pulpakeringés megfigyelése után a kvantitatív méréshez kiválasztottunk egy olyan arteriolát, amely alkalmas volt belső átmérőjének képernyőn történő folyamatos mérésére. Egy perces videofelvételeken rögzítettük a kiindulási állapotot a kiválasztott és a későbbiekben megfigyelendő arterioláról. Ezt követően a kiválasztott terület objektív felöli dentin felszínére vagy fiziológiás sóoldatot (kontroll csoport), vagy a vizsgált anyagot (vizsgálati csoport) helyeztük fel. Az érlumen belső átmérőjének meghatározása a tesztanyag felhelyezését követően a 5., 15., 30., 60. percekben történt a kamerához csatlakoztatott monitoron mérve. Az érátmérő méréseket kezdetben a monitoron tolóméter segítségével végeztük, majd ezt tovább fejlesztve számítógépes rendszert állítottunk össze a szoftveres kiértékelésre. A mikroszkóphoz csatlakoztatott digitális kamera (Coolpix900) a felvételeket IBM 34

35 kompatibilis számítógépbe juttatja, ahol a Scion Corporation képelemző szoftver (Scion Image program) segítségével mérhetőek az érátmérő-változások. A kontroll csoportban álműtéttel 37 C -os fiziológiás sóoldatot alkalmaztunk, és a megfelelő mérési időpontokban ugyancsak elvégeztük a méréseket. Az értékeléshez a kiindulási adatokhoz viszonyított érátmérő-változások százalékos értékeit számítottuk ki az egyes csoportokon belül. Az érátmérő-növekedés százalékos értékét előjel nélkül, az érátmérő csökkenést pedig előjellel jeleztük. Statisztikai tesztek segítségével vizsgáltuk a csoportok azonos mérési időpontjaihoz tartozó értékek közötti eltéréseket (ANOVA, p<0,05). A megadott értékek: átlag ± S.E Kondicionálás hatásának vizsgálata Conditioner 36 (DeTrey, Dentsply, D Konstanz, 36 % ortofoszforsav) 15 másodperces behatási idővel (1. csoport) és NRC Non-Rinse Conditioner (itakon sav és malein sav) 20 másodperces behatási idővel (2. csoport) történő alkalmazásának hatását vizsgáltuk csoportonként Sprague-Dawley (350 ± 8 g) hím patkány metszőfogának vitálmikroszkópos modelljén. Az elnyújtott idejű savazás hatását Conditioner36 60 másodperces applikációjával mértük (3. csoport). Fiziológiás sóoldat alkalmazása a többi csoporttal megegyezően preparált fogon szolgált kontroll csoportként (4. csoport) Negyedik generációs bondrendszer hatásának vizsgálata kondicionálással és kondicionálás nélkül Negyedik generációs adhezív rendszer (Scotchbond Multipurpose Adhesive System, 3M Dental Products, St. Paul, MN , U.S.A) hatását vizsgáltuk három csoportban állaton (330 ± 9 g). A bondanyagot 15 másodperces kondicionálás után lege artis 35

36 (1.csoport) vagy kondicionálás nélkül (2. csoport) használtuk. A kontroll csoportban álműtéttel fiziológiás sóoldatot alkalmaztunk (3. csoport) Aceton és nem aceton tartalmú bondanyag összehasonlító vizsgálata Ötödik generációs selfpriming aceton alapú bond (Prime & Bond 2.1 Universal Light Curing Adhesive, DeTrey) (1. csoport) hatását hasonlítottuk a negyedik generációs nem aceton alapú adhezív rendszer (Scotchbond Multipurpose Adhesive System, 3M) (2. csoport) pulpális hatásához (n=10-10). A bondanyagokat 15 másodperces kondicionálás után az előírásnak megfelelően használtuk a kísérleti állatok (333 ± 9 g) metszőfogán. A kontroll csoportban (3. csoport) álműtéttel fiziológiás sóoldatot alkalmaztunk Bondanyag-összetevők pulpális hatásának vizsgálata A bondanyag-összetevő 2-hidroxietil-metakrilát (HEMA, Sigma) és trietilénglicoldimetakrilát (TEGDMA, Sigma) különböző koncentrációjú oldata által kiváltott akut pulpális keringésváltozásokat vizsgáltuk 40 (csoportonként 10) patkányon (348 ± 9 g). A forgalomban lévő bondanyagoknak megfelelő (HEMA [35%] - 1. csoport, TEGDMA [47%] - 2. csoport) és nagyobb koncentrációjú (TEGDMA [95%] - 3. csoport) oldat hatását figyeltük meg a három vizsgálati csoportban. A kémiai összetevőket 20 másodpercig helyeztük a dentinre, majd 37C o fiziológiás sóoldattal lemostuk. Fiziológiás sóoldat alkalmazása a többi csoporttal megegyezően preparált fogon szolgált kontroll csoportként (4. csoport). 36

37 3.3.5 A pulpális válaszreakció hatásmechanizmusának vizsgálata A korábban vizsgált bondanyag-összetevő 2-hidroxietil-metakrilát (HEMA, Sigma) 35% oldatának pulpális hatását vizsgáltuk P-anyag receptor antagonista (N-acetil-Ltriptofán 3,5-bis/trifluorometil/ benzil észter [L-732,138, Sigma] 20 µm) jelenlétében kísérleti állatok (351 ± 7 g) hat csoportján. A kiindulási érátmérő-értékek rögzítése után HEMA [35%] oldatát helyeztük 20 másodpercig a preparált fog felszínére, majd 37C o -os fiziológiás sóoldattal leöblítettük. Az első kísérletsorozatban (n=7-7) az érátmérő-változásokat az ezt követő 5., 15., 16., 20., 30., 45., 75. percekben rögzítettük. A 15. perc után, a fogra folyamatosan csepegtetett fiziológiás sóoldatot helyettesítettük a P-anyag receptor antagonista (SPA) oldatával. A kontroll csoportban a 15. percet követően is fiziológiás sóoldatot csepegtettünk a preparált fogfelszínre, de egyébként hasonlóan jártunk el, mint a vizsgálati csoportban. A második kísérletsorozatban (n=10-10) a fogra folyamatosan csepegtetett fiziológiás sóoldatot egy órával a HEMA applikációt megelőzően helyettesítettük SPA-val. Az érátmérő-változásokat a HEMA applikációt követő 5., 15., 30., 60. percekben rögzítettük. A kontroll csoportban a SPA alkalmazása helyett fiziológiás sóoldatot csepegtettünk a preparált fogfelszínre, de egyébként úgy jártunk el, mint a vizsgálati csoportban. A harmadik kísérletsorozatban (n=10-10) az érátmérő-változásokat bazális körülmények között, SPA oldat csepegtetését megelőzően majd az azt követő 5., 15., 30., 60. percekben mértük. A kontroll csoportban az egész kísérleti idő alatt fiziológiás sóoldatot csepegtettünk a preparált fogfelszínre. 37

38 3.4 Vizsgálatok lézer Doppler áramlásmérővel A két vizsgáló eljárás összevetése céljából a vitálmikroszkópos modellnek megfelelően állítottuk össze a kísérleti protokollt. A Nembutallal (nátrium pentobarbital) intraperitoneálisan altatott állatokon tracheába helyezett kanül segítségével biztosítottuk a megfelelő légzést. Az artéria femoralisba kötött kanült a vérnyomásmérőn keresztül számítógéphez csatlakoztattuk és mértük, regisztráltuk az állatok szisztémás vérnyomását. A rectalisan bevezetett termométerrel az állatok testhőmérsékletét a kísérlet egész ideje alatt rögzítettük és stabilitását szabályozott fűtéssel (Thermocontroller) biztosítottuk. Az állat alsó ill. felső metszőfogait fémrúdon erre a célra kialakított üregekben önkötő akrilát segítségével (Temdent, Weil Dental GmbH, Germany) rögzítettük. Ez a fémrúd biztosította egyúttal a lézer Doppler áramlásmérőhöz (Oxford Optronics, Experimetria, dióda lézer, 780 nm, 1.5mW, 10Hz -19kHz) csatlakoztatott száloptikás lézerfej elmozdulásmentes tartását is. A vizsgálandó anyagok felhelyezéséhez a fogak buccalis felszínén tesztüreget alakítottunk ki. Ehhez lassú fordulatszámmal működtetett fogászati fúrógépet és gyémánt fissurafúrót használtunk. Operációs mikroszkóp alatt a fogak buccalis felszínének középső harmadában standardizált méretű (körülbelül 1mm átmérőjű) V. osztályú kavitást preparáltunk. Az üreget addig mélyítettük, ameddig a kavitás pulpális falán sértetlenül maradt dentinrétegen keresztül a pulpaszövet megfigyelhetővé nem vált. A fog-előkészítési folyamat alatt a pulpát fiziológiás sóoldat alkalmazásával védtük a preparációs hőkárosodásoktól és a kiszáradástól. A kavitásnak megfelelő pulpális terület véráramlásának mérését a fog distalis felszínén rögzített lézer Doppler áramlásmérő (LD) szonda segítségével végeztük. A lézerfej megfelelő helyzetét mikromanipulátorral a distalis irányból a fog felszínre merőlegesen kerestük fel. Az így beállított és ellenőrzött pozíciót a lézerfejre húzott, és azon pontosan megszoruló fémcsőnek a fogakat tartó fémrúdhoz történő rögzítésével véglegesítettük. 38

39 lézerfej LD rögzítőrúd fej akrilát vezető fémcső fogpulpa vérnyomásmérő hőszabályzó 2. Ábra: A laser Doppler áramlásmérős vizsgálat sematikus ábrája Ennek a rögzítési módszernek köszönhetően szükség esetén a lézerfej az acél csőből eltávolítható, és a mérések folytatásakor az eredeti pozícióba pontosan visszahelyezhető. A preparált fogat a steady state állapot kialakulásáig (60 perces várakozás), majd a megfigyelés alatt 37 C o -os fiziológiás sóoldat folyamatos csepegtetésével tartottuk nedvesen és állandó hőmérsékleten. A lézer Doppler jeleket egy-egy percen keresztül számítógépes program segítségével (HAEMOSYS) regisztráltuk a tesztanyag felhelyezését megelőzően (0. perc), és azt követően az 1., 5., 15., 30., 60. percben. A vizsgálati csoporttal párhuzamosan a kontroll csoportnál álműtéttel 37 C o -os fiziológiás sóoldatot alkalmaztunk és a megfelelő mérési időpontokban ugyancsak elvégeztük a méréseket. A lézer Doppler áramlásmérővel egy percen keresztül mért értékek átlagát számoltuk ki, majd az így kapott értékeket a kiindulási (0. perces) értékek százalékában fejeztük ki. Ezeket a százalékos értékeket használtuk fel a további elemzésekhez (80). 39