AZ ETIL-LAKTÁT ENZIMKATALITIKUS SZINTÉZISE NEM-KONVENCIONÁLIS KÖZEGEKBEN

Átírás

1 Pannon Egyetem Vegyészmérnöki- és Anyagtudományok Doktori Iskola AZ ETIL-LAKTÁT ENZIMKATALITIKUS SZINTÉZISE NEM-KONVENCIONÁLIS KÖZEGEKBEN DOKTORI (PH.D.) ÉRTEKEZÉS Készítette: Major Brigitta okleveles vegyészmérnök Témavezet: Dr. Gubicza László egyetemi tanár Pannon Egyetem Biomérnöki, Membrántechnológiai és Energetikai Kutató Intézet 2013

2 AZ ETIL-LAKTÁT ENZIMKATALITIKUS SZINTÉZISE NEM- KONVENCIONÁLIS KÖZEGEKBEN Értekezés doktori (PhD) fokozat elnyerése érdekében Írta: Major Brigitta okleveles vegyészmérnök Készült a Pannon Egyetetem, Vegyészmérnöki Tudományok és Anyagtudományok Doktori Iskolája keretében Témavezet: Dr. Gubicza László Elfogadásra javaslom (igen / nem) (aláírás) A jelölt a doktori szigorlaton... % -ot ért el, Az értekezést bírálóként elfogadásra javaslom: Bíráló neve: igen /nem. (aláírás) Bíráló neve:......) igen /nem. (aláírás) A jelölt az értekezés nyilvános vitáján...% - ot ért el Veszprém. a Bíráló Bizottság elnöke A doktori (PhD) oklevél minsítése... Az EDT elnöke i

3 KIVONAT A disszertációban egy az élelmiszer- és a gyógyszeripar által felhasznált aromaanyag, az etil-laktát különböz, nem-konvencionális körülmények között történ szintézisét mutatom be. Az észter elállítását természetes alapanyagokból tejsavból és etanolból immobilizált Candida antarctica lipáz enzimmel valósítottam meg, hogy természetes minsítés terméket kapjak. A vizsgált nem-konvencionális közegek közül szerves oldószerekben kezdtem a kísérleteket. Meghatároztam a különböz körülmények hatását a reakcióra és az elérhet maximális hozamot (94 %). Ezeket az eredményeket összehasonlítási alapul véve kísérleteket végeztem foszfónium típusú ionos folyadékokban, és megállapítottam, hogy a vizsgált 7 közeg közül 2-ben ment végben enzimkatalizált reakció, míg 5 ionos folyadék maga is katalizálta a folyamatot. A különböz paraméterek hatását vizsgálva az elállításra azt találtam, hogy bár azonos hozamot értem el Cyphos 104 közegben (95 %), mint toluolban, mégis az ionos folyadék sok elnyös tulajdonsággal rendelkezett. Ilyen pozitívum pl. az elérhet nagyobb szubsztrátkoncentráció, a szükséges kisebb mennyiség enzim és a lipáz jobb újrafelhasználhatósága. Ezen kívül a felhasznált ionos folyadék család lehetséget ad a tejsav fermentlébl való kinyerésére és közegváltás nélkül az észterezés végrehajtására. Kísérleteket végeztem mikrohullámú hközlés, mint nem-konvencionális energiaforrás használata mellet több különböz ionos folyadék közegben, és megállapítottam, hogy a mikrohullámú sugárzás képes megnövelni az elérhet észter hozamot és lecsökkenteni a reakcióidt. Ismeretes, hogy a tejsav kb. 20 %-nál töményebb vizes oldatokban dimereket képez, ezeknek a molekuláknak az észterezési reakció körülményei között való viselkedése nem teljesen ismert. Ennek megértését segítették el a mikrohullámú sugárzás, illetve konvencionális hközlés és vízelvonás mellett végrehajtott kísérletek. Ezek a vizsgálatok rávilágítottak arra, hogy a mikrohullámú sugárzás meggyorsítja a laktilsav tejsavvá történ bomlását, ami magyarázza a megnövekedett észter hozamot és reakciósebességet. A vízelvonás pedig az észterezési reakcióknál általában tapasztaltakkal ellentétben csökkenti a hozamot, mivel a tejsav dimerizációját segíti el, ami fogyasztja az etil-laktát szintézis szubsztrátját. ii

4 ABSTRACT THE ENZYMATIC SYNTHESIS OF ETHYL LACTATE IN NON- CONVENTIONAL MEDIA In the dissertation synthesis of ethyl lactate, a flavour compound applied in the food and pharmaceutical industry is presented. The ester was manufactured under nonconventional conditions from natural raw materials: lactic acid and ethanol by immobilized lipase enzyme from Candida antarctica. Firstly organic solvents were used as a non-conventional media. Its effects on the reaction and the maximal yield (94 %) were determined. Then based on the results experiments were carried out in phosphonium type ionic liquids and it turned out that 2 of them were suitable for the enzymatic reaction. The synthesis was optimized in Cyphos 104 media and similar yield was achieved as in toluene (95 %), however the ionic liquid has more beneficial features like higher initial substrate concentration, lower amount of enzyme needed, recycling of the lipase. Moreover the ionic liquid family can be simultaneously applied for the direct recovery of lactic from the fermentation broth as well as the esterification reaction. Experiments were conducted to study the effect of microwave irradiation (as a non-conventional energy source) in various ionic liquids. It was found that higher ester yield and shorted reaction time were achieved by using microwave irradiation. It is known that lactic acid forms dimers in higher than 20 % concentration in aqueous solutions, and the behaviour of these molecules in the esterification reactions has not been thoroughly described. To study it measurements by microwave irradiation, conventional heating and water removal were carried out. The experiment results proved that microwave irradiation accelerate the hydrolysis of lactil lactate to lactic acid, which explains the higher ester yield and reaction rate. Water removal, however unlike the other esterification reactions decreased the yield, since it helps to form lactic acid dimers, consuming the substrate of the synthesis of ethyl lactate. iii

5 AUSZUG ENZYMKATALITISCHE SYNTHESE VON ETHYLLACTAT IN NICHTKONVENTIONELLEN MEDIEN In der Dissertation die Synthese von Ethyllactat, ein Aromastoff, das in der Lebensmittel- und Pharmaindustrie verwendet wird, ist vorgelegt. Das Ester wurde unter nichtkonventionellen Bedingungen aus natürlichen Ausgangsstoffen, aus Milchsäure und Ethanol mit Hilfe von immobilisierter Lipase aus dem Organismus Candida antarctica hergestellt. Zuerst wurden organische Lösungsmittel als nichtkonventionelle Reaktionsmedien verwendet. Ihre Wirkung auf die Reaktion und der maximale Umsatz (94 %) wurden bestimmt. Basierend auf den Ergebnissen die weitere Untersuchungen wurden in ionischen Flüssgkeiten von Phosphonium-Typ vorgenommen. Die Synthese wurde optimiert in Cyphos 104 Medium and ähnliche Umsätze wurden erreicht als in Toluol (95 %), aber die ionische Flüssigkeit hat viel günstigere Eigenschaften wie höhere Ausgangskonzentrationen, die erforderliche Enzymmenge ist kleiner, Recycling von Lipase-Enzyme. Ausserdem die verwendete Familie der ionischen Flüssigkeiten ermöglicht die unmittelbare Ausgewinnung der Milchsäure aus der Fermentationsbrühe und die Durchführung der Veresterung ohne Änderung des Reaktionsmediums. Um die Wirkung der Mikrowellenbestrahlung (als nichtkonventionelle Energiequelle) zu untersuchen, Versuche wurden in verschiedenen ionischen Flüssigkeiten durchgeführt. Hierbei zeigte sich, dass höherer Umsatz und kürzere Reaktionszeiten bei Verwendung der Mikrowellenbestrahlung konnten erreicht werden. Es ist bekannt, dass die Milchsäure in wässrigen Lösung höher als 20 % unter Abspaltung von zwei Wassermolekülen Dilactid bildet. Das Verhalten dieser Moleküle während der Veresterung ist noch weitgehend unbekannt. Um es zu verstehen, Versuche wurden bei konventionellen Heizung und Mikrowellenbestrahlung durchgefürt, weiterhin wurde die Wirkung der Wasserentfernung untersucht. Die Ergebnisse haben gezeigt, dass die Mikrowellenbestrahlung beschleunigte die Bildung von Milchsäure aus dem Dilactid. Es ist eine Erklärung für den erhöhten Umsatz und Reaktionsgeschwindigkeit. Die Wasserentfernung verringerte den Umsatz, weil sie die Bildung von Dimere aus der Milchsäure unterstüzt, wobei die freie Milchsäure, Substrat für die Ethyllactat Bildung verwendet wird. iv

6 JELÖLÉSJEGYZÉK Rövidítés Teljes név α Szeparációs faktor [Ac] - Acetát ion [bmim]pf 6 1-butil-3-metil-imidazólium-hexafluoro-foszfát [C 4 py][hso 4 ] N-butil-piridínium-hidrogén-szulfát [(C 4 ) 3 PC 1 ] [MeSO 4 ] Tributil-metil-foszfónium-metil-szulfát [C 4 py][hso 4 ] N-butil-piridinium-hidrogénszulfát [(C 6 ) 3 PC 14 ][FAP] Trihexil-tetradecil-foszfónium-trisz(pentafluoroetil)trifluorofoszfát [(C 6 ) 3 PC 14 ][Cl] Trihexil-tetradecil-foszfónium-klorid [(C 6 ) 3 PC 14 ][DCA], Trihexil-tetradecil-foszfónium-dicián-amid [(C 6 ) 3 PC 14 ][NTf 2 ], Trihexil-tetradecil-foszfóniumbisz((trifluorometil)szulfonil)-imid CAL-A Candida antarctica lipáz A CAL-B Candida antarctica lipáz B DC Cirkuláris dikroizmus készülék CE Kapilláris elektroforézis Cyphos 102 Trihexil-tetradecil-foszfónium-bromid Cyphos 104 Trihexil-tetradecil-foszfónium-bisz -(2,4,4-trimetil-pentil)- foszfinát Cyphos 105 Trihexil-tetradecil-foszfónium-dicián-amid Cyphos 106 Triizobutil-metil-foszfónium-tozilát Cyphos 109 Trihexil-tetradecil-foszfónium bisz-(trifluorometánszulfonil)-amid Cyphos 110 Trihexil-tetradecil-foszfónuim-hexafluoro-foszfát Cyphos 163 Tetrabutil-foszfónium-bromid Cyphos 166 Tetraoktil-foszfónium-bromid Cyphos 202 Trihexil-tetradecil-foszfónium-dodecilbenzol-szulfonát [DCA] - Dicián-amid ion dx/dx A pervaporáció hajtóereje Dielektromos veszteség - 1 -

7 t /2,n tg THF VACEM 42 VACEM 44 VACEM 47 VACEM 58 x A és x B y A és y B Dielektromos állandó [EMIM][NTf 2 ] 1-etil-3-metil-imidazólium-bisz((trifluorometil)szulfonil)- imid GC Gázkromatográf IL Ionos folyadék IPA 2-propanol J Fluxus Elektormos vezetképesség logp Adott oldószer víz és n-oktanol fázisok közötti megoszlási hányadosának tizes alapú logaritmusa MALDI-TOF MS Mátrixszal-segített lézer deszorpciós/ionizációs- repülési id tömegspektrométer [MEBu3P][NTf 2 ] 2-metoxi-etil(tri-n-butil)foszfónium- bisz(trifluorometánszulfonil)imid n Minta elemszáma NMR Nukleáris mágneses rezonancia PLU Propil-laurát egység RP-HPLC Fordított fázisú folyadékkromatográf s Korrigált tapasztalati szórás Az n-1 szabadsági fokhoz, bizonytalansághoz tartozó t eloszlás Dielektromos veszteségi tényez Tetrahidrofurán 1-(2-etoxi-etil)-3-metil-imidazolium-hexafluor-foszfát 1-{2-[2-(2-etoxi)-etoxi]-etil}-3-metil-imidazoliumhexafluor-foszfát 1-[2-{2-[2-(2-etoxi)-etoxi]-etoxi}-etil]-3-metil-imidazoliumhexafluor-foszfát 1-(2-metoxi-etil)-3-metil-imidazolium-hexafluor-foszfát Az A ás B komponensek koncentrációja a pervaporáció betáplálási áramában Az A és B komponensek koncentrációja a pervaporáció permeátumában - 2 -

8 TARTALOMJEGYZÉK 1 Bevezetés Irodalmi összefoglaló Tejsav Elfordulása és tulajdonságai Elállítás Kémiai szintézis Bioszintézis Tejsav észterek, etil-laktát Észterek elállítása Észterek felhasználása Etil-laktát tulajdonságai Candida antarctica lipáz B enzim Tulajdonságok Immobilizálás Enzimes reakciók nem-konvencionális közegei Szerves oldószer Ionos folyadék Foszfónium típusú (Cyphos ) ionos folyadékok Mikrohullámú sugárzás Mikrohullámú sugárzás definíciója Mikrohullámú hközlés alapelvei Mikrohullámú ftés és a konvencionális ftés összehasonlítása A mikrohullámú hközlés használata Mikrohullámú sugárzás kémiai reakciókra gyakorolt hatásai Mikrohullám hatása észterezési reakcióra Mikrohullám hatása az enzimekre és enzimes reakciókra Víztartalom szabályozás, pervaporáció Membrános mveletek alapegyenletei Pervaporációs membránok Hidrofil membránok Pervaporációval segített enzimes észterezési reakciók

9 3 Célkítzések Anyagok és analitikai módszerek Anyagok Alkalmazott enzim Vegyszerek Ionos folyadékok Membránok Analitikai módszerek Víztartalom meghatározás Sav-bázis titrálás Gázkromatográfiás elemzés Folyadékkromatográfiás elemzés Kísérleti módszerek, berendezések bemutatása a dolgozatban A mérések pontossága, reprodukálhatósága Kísérleti munka és eredmények Tejsav viselkedése h hatására Kísérleti módszer Eredmények és értékelésük Konvencionális hközléssel végrehajtott rázatott lombikos reakciók Kísérletek szerves oldószerben Kísérleti módszer Eredmények és értékelésük Kísérletek ionos folyadékban Kísérleti módszer Eredmények és értékelésük Enzim visszaforgatás vizsgálata Mikrohullámú hközléssel végrehajtott kísérletek Kísérleti berendezés Kísérleti módszer Eredmények és értékelésük Víztartalom szabályozás pervaporációval és zeolittal Kísérleti berendezések Kísérleti módszer Eredmények és értékelésük

10 6 Összefoglalás Irodalomjegyzék Tézisek Thesis Publikációk és proceedingek

11 1 Bevezetés Napjainkban egyre növekv igény tapasztalható az egészségre ártalmatlan zöld vegyszerek és oldószerek elállítására és használatára, zöld technológiák kidolgozására a környezet és a gazdaság kímélése céljából. Ez tulajdonképpen azt jelenti, hogy törekedni kell: az emberre és a környezetre ártalmatlan, megújuló forrásból származó alapanyagok használatára; a felhasználás után biológiai hatásra lebomló, ártalmatlan termékek elállítására; az energiafelhasználás minimalizálására, az energiakihasználtság növelésére; a hulladéktermelés elkerülésére; a segédanyagok, oldószerek használatának csökkentésére, a minél koncentráltabb, kisebb térfogatú elegyekben, katalizátorral történ szintézisekre; a vegyipari balesetek (robbanások, tüzek) lehetségének minimalizálására [Pereira 2011]. A tejsav jelentsége abból ered, hogy természetes forrásokból, biológiai úton (fermentációval), a kémiai szintézishez képest kisebb költséggel elállítható optikailag aktív formában is. Molekulaszerkezete hidroxil és karboxil csoporttal is rendelkezik reakciók sokaságára ad lehetséget, ezért felhasználható számos környezetre ártalmatlan, ipari jelentség termék szintézisében [Holten 1971]. Az észterezés a tejsav kinyerése, tisztítása és környezetbarát, nagy érték termékek elállítása szempontjából is fontos reakció. Ha az észterezést az ugyancsak természetes forrásból elállítható etanollal végezzük, egy a természetben is elforduló aromaanyagot, etil-laktátot kapunk, amelyet az élelmiszeriparon kívül a gyógyszeripar és az elektronikai ipar is felhasznál [Pereira 2011]. Ismeretes, hogy a természetes kiindulási anyagokból, enzimatikus átalakítással nyert aromaanyagok természetes minsítést kapnak, ami tovább növeli az elállított termék értékét. Az ionos folyadékok viszonylag új és még kevéssé megismert családja a foszfónium kationt tartalmazó vegyületek. Rájuk is igazak az ionos folyadékok kedvez tulajdonságai, úgymint az elhanyagolható gznyomás, a tervezhetség, a különleges - 6 -

12 oldószer-tulajdonságok, melyek lehetvé teszik enzimes reakciók lejátszatását bennük, és amik alapján zöld oldószernek tekintjük ket [Keskin 2007]. Az imidazólium és ammónium típusú ionos folyadékokhoz képest azonban számos további elnyös vonással is rendelkeznek. Ilyen sajátosság pl. a nagyobb kémiai [Martinis 2010] és hstabilitás [Bradaric 2003], az, hogy feltételezhetleg kedvezbb környezetet biztosítanak az enzimek számára [Abe 2008], illetve az a tapasztalat, hogy felhasználhatók a tejsav fermentlébl való kinyerésére [Marták 2007]. A mikrohullámú sugárzást, mely ionvezetés vagy dipólus polarizáció révén közvetlenül a reakcióelegynek adja át az energiát, egyenletes és a konvencionális hközlésnél hatékonyabb hátadási módszernek tartják. További elnye, hogy egyes esetekben megnöveli az enzimek szelektivitását, aktivitását és stabilitását [Carrillo- Munoz 1996], bár a lejátszódó folyamatok mechanizmusa legtöbbször nem ismert. A tejsav felhasználása kapcsán az egyik legnagyobb akadály, amitl a mai gyártástechnológiák szenvednek, a kis konverzió és a tisztaság, amik a termelést technológiai és ökológiai szempontból versenyképtelenné teszik. Ezért hatékony katalizátorok és elválasztási mveletek alapvet fontosságúak a tejsav-észterek versenyképes technológiáinak kifejlesztéséhez. Erre nyújthat lehetséget a tejsav foszfónium típusú ionos folyadékban történ enzimes észterezése, ha a tejsav kinyerését és az észterképzést sikerül ugyanazzal az ionos folyadékkal megvalósítani. A legkedvezbb technológia kidolgozásához az észterezési reakció jobb megértése is fontos tényez, mivel a tejsav hajlamos a felhasználás körülményei között dimereket képezni, illetve ezekbl visszaalakulni. Ez a mellékreakció a limitáló lépés mind a tejsav tisztításánál, mind az észterek elállításánál [Engin 2003]. Kutatómunkámnak ezért ketts célja volt: az etil-laktát enzimatikus elállításának vizsgálata különböz nem-konvencionális körülmények (szerves oldószer és ionos folyadék közeg, illetve mikrohullámú hközlés) alkalmazása mellett, illetve a lejátszatott észterezési reakció jobb megértése érdekében a tejsav dimerizációs, és dimerébl történ hidrolízisre való hajlamának vizsgálata

13 2 Irodalmi összefoglaló 2.1 Tejsav Elfordulása és tulajdonságai A 2-hidroxipropánsav, más néven tejsav, a természetben is megtalálható szerves sav. Felfedezése a svéd származású vegyész, Carl Wilhelm Scheele nevéhez fzdik, akinek 1780-ban sikerült izolálnia más szerves molekulákkal (pl.: citromsav, glicerin) együtt [Datta 2006]. Számos élelmiszer természetes összetevje. Megtalálható a legtöbb tejtermékben (joghurtban, íróban, túróban), mivel fermentációkor a tej cukortartalmából keletkezik. Hatására a fehérjék kicsapódnak, és kocsonyás álagúvá állnak össze, ezt nevezzük aludttejnek [Kajtár 1984]. A tejtermékeken kívül a tejsav megtalálható borban [Peres 2009], savanyú káposztában, kovászban és az állati és emberi izmokban is. Az emberi vérben nyugalmi állapotban 1-2 mmol/l, de ez az érték nagymérték fizikai igénybevétel esetén 20 mmol/l fölé is emelkedhet [Kajtár 1984]. Felépítését tekintve a tejsav a legegyszerbb asszimertikus szénatomot tartalmazó hidroxikarbonsav. Két optikailag aktív formája létezik, kémiai szintéziskor racém elegy képzdik. Izomereinek elnevezésére több különböz nevezéktan használható. Az egyik a glicerinaldehid szerkezetét alapul vev, a XIX. században, Emil Fischer által kidolgozott rendszer. Ez alapján a lineárisan polározott fény rezgési síkját jobbra forgató enantiomert L-nek, míg a balra forgatót D-nek nevezzük. A másik lehetség a Cahn, Ingold és Prelog által kidolgozott (C.I.P.) szabály használata. Ekkor az L enantiomer megfelelje az S, a D-é pedig az R [Markó 2001]. Mivel a szakirodalomban többségében az L, illetve D megjelölést használják, a dolgozatomban én is ezt a nevezéktant fogom követni. A 2-1. ábra mutatja a tejsav enantiomereinek szerkezetét. COOH COOH HO * C H H * C OH CH 3 CH 3 L(+)-tejsav D(-)-tejsav 2-1. ábra: Tejsav enantiomereinek szerkezeti képlete. A természetben töbségében a jobbraforgató L enantiomer fordul el. Ez a forma található meg az állati izmokban, továbbá ezt állítja el számos mikroorganizmus. Meg - 8 -

14 kell említeni azonban, hogy vannak D izomert [Németh 2011], illetve racém elegyet elállító törzsek is [Bartholomé 1979]. Fizikai és kémiai tulajdonságai alapján a tejsav színtelen, szagtalan ersen higroszkópos anyag. Vízben és vízzel elegyed oldószerekben korlátlanul, számos vízzel nem elegyed szerves oldószerben (hexán, toluol) nehezebben oldódik, míg benzolban és kloroformban oldhatatlan [Bartholomé 1979]. Néhány fizikai tulajdonságát a 2-1. táblázat tartalmazza táblázat: A tejsav fizikai tulajdonságai [Perry 1963]. Tulajdonság Számérték Moláris tömeg 90,08 g/mol Olvadáspont 16,8 C Forráspont 122 C (14 Hgmm-en) Relatív srség 1,1249 (15 C-on 4 C-os vízhez képest) Savasság (pk a ) 3,85 Forgatóképesség (α 25 D ) 2,53 (L-tejsav, 20 %-os vizes oldatban) A tejsavat különböz töménység vizes oldatok formájában forgalmazzák. Ennek oka, hogy vízelvonás hatására az egyik molekula karboxil csoportja egy másik molekula hidroxil csoportjával észter kötést alkot (víz kilépése mellett). Az oldatban ennek következtében dimerek, trimerek és egyéb oligomerek jelennek meg. Ezzel az egyensúlyi folyamattal 20 %-nál töményebb oldatokban már számolni kell [Vu 2005]. A keletkez oligomerek nemcsak a monomer tejsav tartalmat befolyásolják, hanem pl. a forgatóképességet is. Míg a 20 %-os vizes oldatban α 25 D = 2,53 addig 80 %-os oldatban már 5,1 [Bartholomé 1979] Elállítás A tejsav elállítására számos technológiát dolgoztak ki. Ezek között kémiai szintéziseket és fermentációs utakat is találunk. A két módszer közötti legnagyobb különbség, hogy a termék az els esetben optikailag inaktív, racém elegy, ezzel ellentétben, fermentáció használatakor a forgatóképességét az alkalmazott törzs határozza meg. Elállítható tehát L(+), D(-)-tejsav vagy racém elegy is, bár többnyire a jobbra forgató izomert részesítik elnyben, mivel a két legnagyobb felhasználó az élelmiszeripar (kizárólag) és a manyagipar (többségében) ezt igényli [Datta 2006]

15 Kémiai szintézis Szintetikus eljárások a hatvanas évek elejétl léteznek, és többnyire laktonitril (2- hidroxi-propánnitril) ers savakkal történ hidrolízisén alapszanak. Ezt a technológiát használta a Monsanto illetve a Sterling Chemicals. A laktonitrilt acetaldehidnek hidrogén-cianiddal való reagáltatásakor vagy az akrilnitril gyártásának melléktermékeként kapták [Datta 2006, Kajtár 1984]. Ezen kívül tejsav elállítása lehetséges acetaldehidnek szén-monoxiddal és vízzel történ reagáltatásával nikkel(ii)-jodid vagy kénsav katalizátor mellett, magas hmérsékleten és nyomáson [Bartholomé 1979]. Alternatív elállítási mód lehet a klórpropionsav hidrolízise, cukrok lúgokkal katalizált dehidratációja, propilénglikol oxidációja vagy propilén oxidálása salétromsavval [Mussatto 2008] Bioszintézis Ipari méretekben elször 1881-ben állítottak el tejsavat biológiai úton, és 1990 óta a nagy volumenben történ termelése szinte kizárólag szénhidrátok fermentációjával történik. Ennek egyik oka a már említett tény, hogy a kémiai szintézissel elállított termék racém elegy, amibl a gyakran elnyben részesített L-izomer kinyerése csak igen magas költségek árán lehetséges. A másik indok, hogy az olcsóbb, megújuló források használata célszerbb az amúgy is fogyatkozó petrolkémiai alapanyagoknál [Vu 2005]. A legnagyobb tejsavtermel vállalatok a hollandiai CCA Biochemical BV, - aminek vannak üzemei Európában, Brazíliában és az USA-ban az Archer Daniels Midland és a Natureworks LLC az USA-ban és a Musashino a Távol-Keleten [Datta 2006] Bioszintézis alapanyaga Szénhidrátforrásként számos különféle haszonnövény használható, pl.: kukorica, árpa, cukornád, cukorrépa [Joglekar 2006], cukorcirok [Hetényi 2010] vagy búza [Hetényi 2011a]. A legfbb különbség köztük a tisztaságukban, illetve az árukban van. Természetesen a legtisztább alapanyag a cukor lenne, de az nagyon költséges, így csak laboratóriumi méretekben használják. A melasz, a savó vagy más hulladékok jóval olcsóbb források, bár ezeknél figyelembe kell venni a szennyezanyagokat, mivel azok befolyásolhatják a feldolgozást. A fent felsorolt szénhidrátforrásokon kívül a fermentációt végz mikroorganizmusoknak fehérjékre, foszfát- és ammóniumsókra, illetve más egyéb tápanyagokra is szükségük van. Ezeket éleszt extraktum, szója

16 hidrolizátum stb. hozzáadásával biztosítják [Joglekar 2006], bár egyes alapanyagok, mint pl. a búza fehérjetartalma nitrogénforrásként is szolgál, ezzel csökkentve a szükséges éleszt mennyiségét [Hetényi 2008]. A fent említett, ipari méretekben alkalmazott alapanyagokon kívül kísérletek folynak egyéb növényi hulladékok hasznosítására tejsav fermentációban. Ilyen anyagok pl. a szilázs [Thang 2008], konyhai hulladékok [Zhao 2009a], rizshéj és Eucalyptus globulus (golyós eukaliptusz) fa [Vila 2008], Brassica juncea (barna mustár) levelek [Zhao 2008] vagy a sörgyártáskor keletkez cellulóz tartalmú pép [Mussatto 2008] A fermentációt végz mikroorganizmusok A használt mikroorganizmusokat több szempont szerint csoportosíthatjuk. Rendszertani szempontból vizsgálva elmondható, hogy tejsav elállítására általában gomba vagy baktériumtörzseket használnak. A termelt vegyületek tekintetében beszélhetünk: Homofermentatív törzsekrl: Kizárólag tejsavat termelnek. Heterofermentatív törzsekrl: A tejsav mellett pl.: etanolt és szén-dioxidot is termelnek. A fermentációt végz mikroorganizmusok csoportosíthatók a termelt tejsav forgatóképessége alapján is. Jobbra forgató tejsavat termelnek. Balra forgató tejsavat termelnek. Racém elegyet termelnek [Reddy 2008]. A 2-2. táblázat tartalmaz a teljesség igénye nélkül néhány tejsavtermel mikroorganizmust

17 2-2. táblázat: Tejsavtermel mikroorganizmusok. Mikroorganizmus Elállított Elállított tejsav Irodalom neve termék(ek) forgatóképessége Baktériumok Bacillus coagulans homofermentatív L(+) [Zhang 2008, Zhao 2008, Akao 2007] Lactobacillus. homofermentatív racém [Panesar 2007] acidophilus L. amylophilus homofermentatív L(+) [Reddy 2008] L. bulgaricus homofermentatív L(+) [Datta 2006, Bartholomé 1979] L. casei heterofermentatív L(+) [Panesar 2007] L. curvatus heterofermentatív D(-) [Panesar 2007] L. delbrueckii homofermentatív L(+) [Mussatto 2008] L. fermentum heterofermentatív L(+) [Panesar 2007] L. helveticus homofermentatív racém [Panesar 2007] L. leichmanii homofermentatív L(+) [Datta 2006] L. paracasei heterofermentatív L(+) [Panesar 2007] L. plantarum heterofermentatív racém [Charalampopoulos 2009] L. rhamnosus heterofermentatív L(+) [Panesar 2007] Lactococcus lactis homofermentatív L(+) [Panesar 2007] Leuconostoc sp. heterofermentatív D(-) [Panesar 2007] Streptococcus homofermentatív L(+) [Panesar 2007] thermophilus S. salivarius homofermentatív L(+) [Zhang 2008, Jiménez 2010] Gombák Rhizopus oryzae heterofermentatív L(+) [Lin 2007] Saccharomyces cerevisiae heterofermentatív L(+) [Gao 2009a, van Maris 2004]

18 Fermentáció és termékkinyerés Hagyományos módon napjainkban fleg szakaszos eljárásokkal hajtják végre a fermentációt. Ebbl az következik, hogy a tenyésztés elrehaladtával beavatkozás nélkül a termeld tejsav lecsökkenti a fermentlé ph-ját, ami negatívan befolyásolja a mikroorganizmusok termelékenységét. A szabályozás nélkül elérhet hozam általában csak a fele a szabályozás mellett tapasztaltaknak [Li 2004]. Ezért a ph-t valamely lúg, általában Ca(OH) 2 adagolásával állandó értéken tartják. Ennek következtében a keletkez tejsav egy része kálcium-laktáttá alakul át. Az ezt követ feldolgozás savas kezeléssel történik. Általában kénsavat adnak a rendszerhez, hogy visszanyerjék a tejsavat. A technológia nagy hátránya, hogy minden tonna termelt tejsav mellett keletkezik kb. 1 tonna CaSO 4 csapadék, ami a benne oldott szerves szennyezk miatt nehezen kezelhet, ezen kívül a több lépésbl álló kinyerés, tisztítás képezi a termék tejsav elállítási költségének felét [Yi 2008, Joglekar 2006]. Számos kísérlet folyik a fenti technológia fejlesztése érdekében. Az egyik kutatási irány olyan törzsek kifejlesztésével foglalkozik, amik alacsony ph-n is megfelel hatékonysággal termelnek [Gao 2009a]. Megoldást jelenthet egyéb lúgok pl.: nátrium-hidroxid, (v. karbonát), illetve ammónium-hidroxid [Hetényi 2011b] használata. Ezek szulfátja már nem képez oldhatatlan csapadékot, így egy megfelel technológiával visszaforgathatók. A harmadik kutatási irány egyéb a csapadékképzésen kívüli elválasztási módszerek kidolgozását tzte ki célul. Ha a fermentációt folyamatos üzemmódban mködtetjük, lehetség van a tejsav folyamatos elvételére a következ módokon: Reaktív extrakció: A tejsav hidofil tulajdonsága miatt rosszul extrahálható vízzel nem elegyed szerves oldószerekkel, de ha az extrahálószer reagál a tejsavval és komplexet képez vele, azzal átvihet a szerves fázisba. Az extrahálószer lehet valamely hosszú szénláncú, alifás amin, amit sok esetben valamilyen szerves oldószerben (pl.: trin-decilamin, cis-9-oktadekán-1-ol oldva alkalmaznak [Gao 2009b] vagy trialkilfoszfónium-oxid [Lin 2007]. A szerves fázisból a tejsav sztrippeléssel, sav, lúg vagy valamely ersebb, és illékony amin hozzáadásával nyerhet ki, amit az extrahálószer és az oldószer regenerálása és visszaforgatása követ. Ezen technológiának természetesen alapfeltétele, hogy se az oldószer, se az extrahálószer ne legyen toxikus a fermentációt végz mikroorganizmusokra [Joglekar 2006]. A membrános elválasztási mveletek az extraktív fermentáció számos hátrányát kiküszöbölik. Nem kell tartani a visszakeveredéstl, a mikroorganizmusok nincsenek

19 közvetlenül kitéve egyéb vegyszereknek, nincs szükség külön keverésre és viszonylag nagy hatékonyság érhet el. Többfajta membrános mvelet is szóba jöhet. Elektrodialízis, elektrodialízis bipoláris membránnal, illetve ezek bioreaktorral történ kombinálása (elektrokinetikus bioreaktor). Problémát jelent viszont a membránok rövid élettartama és magas ára [Li 2004]. Adszorpciós/kromatográfiás módszerek: Tejsav adszorpciója lehetséges számos ioncserél gyantával, úgymint Dowex MWA-1, Alamine 336, IRA-92 vagy Amberlite IRA-400. A legjobb eredményeket az utóbbival érték el metanol és 1 M kénsav eluens használata mellett. Kísérletek alapján a gyanta elnye az, hogy széles ph tartományban használható, továbbá az etanolos, kénsavas elúcióval egy lépésben az észterezés is végrehajtható. A technológia hátránya, hogy szükség van a fermentlé ph-jának szabályozására a szorpciós hatás növelése érdekében, továbbá a gyanta regenerálásához nagy mennyiség vegyszer szükséges [Joglekar 2006]. Ezen hátrányok kiküszöbölése sikerült osztrák és vietnámi kutatóknak [Thang 2008] semleges polimer gyanta (Amberlite XAD1600) alkalmazásával, mivel így eluensként vizet használhattak. Meg kell azonban említeni, hogy mindkét esetben szükség volt valamilyen egyéb tisztítási lépésre, mivel a termékben maradtak aminosav és egyéb szerves sav szennyezk. Észterezés: Ennek a technológiának nagy elnye, hogy nagy tisztaságú termék állítható el a nyers tejsav vagy tejsavsó alkohollal való reagáltatásával, rektifikálásával, majd az észter hidrolizálásával. Ezzel a módszerrel lehet legkönnyebben a különböz szerves savakat elválasztani. Az észterezés, illetve a hidrolizált tejsav kinyerése megoldható savkatalizátor és pervaporáció kombinálásával [Datta 1998], illetve ioncserél gyantával [Zhao 2009a, Sun 2006]. A technológia továbbfejleszthet azzal, hogy a desztillálás egy idben zajlik az észterezéssel és a hidrolízissel. Ekkor reaktív desztillációról beszélünk [Lin 2007]. Látható tehát, hogy a feldolgozás számos úton lehetséges, éppen ezért Joglekar és társai [Joglekar 2006] becslést készítettek néhány tejsav kinyerési technológia költségeire. Minden esetben az üzem kapacitását 1000 t/év-nek vették. A költségek számításának alapját az alapanyagköltségek és a közm költségei képezték indiai telephelyet feltételezve. A három technológia részleteit mutatja a 2-2. ábra

20 Extrahálószer(a), Folyamatos fermentáció oldószer Extrahálószer(b) MeOH I. technológia: Reaktív extrakció Vissza extrahálás Kinyerés Észterezés Hidrolízis Tejsav Mész MeOH H 2SO 4 II. technológia: Szakaszos fermentáció Szrés Ca-laktát csapadék képzése, szrés Calaktát Oldás, savas kezelés, szrés Tejsav metanolban észterezéshez NH 4 OH Sejttömeg CaSO 4 III. technológia: Szakaszos fermentáció Szrés NH 4- laktát Elektrodialízis NH 4- laktát Bipoláris elektrodialízis Tejsav észterezéshez Sejttömeg 2-2. ábra: Tejsav elállító technológiák [Joglekar 2006]. A költségbecslés adatait tartalmazza a 2-3. táblázat táblázat: Költségbecslés [Joglekar 2006]. Becsült költségek I. techn. II. techn. III. techn. Beruházási ktg. (millió $) 2,12 2,08 3,04 Vegyszerek, tartalék membránok ($/kg tejsav) 0,37 0,17 0,26 Közm ($/kg tejsav) 0,52 0,55 0,53 Mködési ktg. ($/kg tejsav) 0,12 0,12 0,13 Fix ktg. ($/kg tejsav) 0,58 0,56 0,82 Összes ktg. ($/kg tejsav) 1,59 1,40 1,74 A táblázat adatai alapján azt a következtetést vonhatjuk le, hogy a II. hagyományos, csapadékképzésen alapuló technológia a leggazdaságosabb, bár a szerzk nem részletezik, hogy a hulladékkezeléssel és -elhelyezéssel kapcsolatos költségekkel számoltak-e A tejsav felhasználása A világ tejsav termelése évrl évre n. A termelt volumen 2006-ban t/év [Datta 2006] és t/év [Joglekar 2006] közötti érték volt, és világviszonylatban

21 évenként %-os növekedést jósoltak. Ennek oka, hogy a hagyományos, ruhaipari brök cserzése, gyapjú festése, illetve élelmiszeripari - tartósító- és pácolószer, ph szabályzó, emulgeálószer felhasználás mellett a tejsav hasznosításának lehetségei egyre bvülnek. Dehidratálással akrilsav, polimerizációval politejsav, kondenzációval pentán-2,3-dion, hidrogénezéssel propilén-glikol állítható el belle, észterezhet, elállítható a kalcium- illetve nátriumsója. Ez is azt bizonyítja, hogy a tejsav kiváló platform vegyület, hiszen, belle egyszer kémiai átalakításokkal számos alapvegyület elállítható (több esetben megújuló forrásból). [Datta 2006]. 2.2 Tejsav észterek, etil-laktát A tejsav hidroxil és karboxil csoportja révén számos vegyülettel képes protonkatalizált egyensúlyi reakcióban észtert képezni. A reakció a karbonsavakra jellemz addíciós-eliminációs mechanizmus szerint játszódik le. Az észterezési reakció általános reakcióegyenletét a 2-3. ábra mutatja [Markó 2002]. O R C OH + R' OH H + R C O + H 2 O OR' 2-3. ábra: Észterezési reakció általános egyenlete Észterek elállítása Az észterezési reakció végbemeneteléhez mindenképpen szükség van valamilyen katalizátorra, mivel nélküle az egyensúly rendkívül lassan áll be. A hmérséklet emelésével a folyamat ugyan gyorsítható, de az egyensúlyi összetétel a hfokkal alig változik, mivel a reakció során nincs számottev entrópiaváltozás. Az egyensúly a tömeghatás törvénye szerint eltolható az észterképzés felé, ha az egyik reakciópartnert (rendszerint az alkoholt) feleslegben alkalmazzuk vagy a keletkez termékek egyikét folyamatosan eltávolítjuk a reakcióelegybl [Markó 2002]. Az észter hozam maximalizálása érdekében számos különböz megoldás született a fönt említett befolyásoló tényezk eltér kombinációinak alkalmazásával vagy újszer technológiák használatával. Az etil-laktát egyedi elállítási módjairól számolnak be Adams, illetve Pereira és munkatársai. Az általuk kidolgozott egyik technológia rektifikáló oszlopból, folyamatos kevert tankreaktorból és pervaporációs egységbl álló félfolyamatos eljárás [Adams

22 2008], a másik pedig egy szimulált mozgóágyas reaktor (12 ioncserél gyantával töltött oszlopból álló rendszer, melyek között a betáplálás és a termékelvétel helyét ciklikusan változtatták) használata az észter elállítására és elválasztására [Pereira 2011]. Asthana és társai koncentrált (88 tömeg %-os) tejsav és 40 % etanolfeleslegbl kiindulva ioncserél gyanta katalizátorral és reaktív desztillációjával értek el 95 %-os konverziót, némi laktát oligomer észter és sav melléktermékek keletkezése mellett. [Asthana 2005]. Ugyanakkor Gao és társai úgynevezett szuper-finom mágneses szilárd szupersav SO 2-4/ZrO 2 -Fe 3 O 4 katalizátort alkalmazva értek el 53 %-os hozamot [Gao 2007]. Az észterezési reakció hatékony katalizárotai lehetnek a lipázok is. Parida és társai Candida cylindracea (más néven Candida rugosa) enzimet használtak egyenes láncú 2- hidroxi savak (köztük tejsav) elsrend alkoholokkal történ észterezésére. A legjobb reakcióközegnek a toluolt találták, ahol az enzim aktivitása kb. 100-szorosa volt a tetrahidro-furánban vagy dioxánban tapasztaltaknak, továbbá 1-butanol esetén közel 100 % enantioszelektivitással ment végbe a reakció [Parida 1991]. From és munkatársai ezzel ellentétben Candida antarctica lipázt használták sikeresen tejsav alkoholokkal és karboxilsavakkal való észterezésére hexán közegben [From 1997]. Munkájukat kiegészíti Hasegawa és társainak eredménye, mely szerint etil-laktát enzimes elállítása (16 különböz lipázzal tesztelve) nagy hozammal lehetséges hidrofób éterekben és ketonokban is, mivel ezek az oldószerek a nagyobb hidrofóbicitásuk miatt kevésbé toxikusak az enzimekre. Méréseik során azonban a n-hexán és az oldószermentes közeg kevésbé bizonyult megfelelnek [Hasegawa 2008]. Roenne és társai ugyancsak több immobilizált lipáz enzimet úgy, mint Candida antarctica lipáz B (Novozym 435), Thermomyces lanuginosa lipáz (Novozym LT IM) és Rhisomucor miehei lipáz (Novozym RM IM) teszteltek tejsav egyenes láncú alkoholokkal (C 6 -C 18 ) való észterezésének katalizátoraként. Vizsgálták a reakció körülményeinek a hatását, tehát a használt enzim típusát, mennyiségét, reakció hmérsékletét, az alkohol : sav mólarányt, a szubsztrát koncentrációt. A hozam tovább növelése érdekében a keletkez vizet reakcióelegyhez adott megfelel mennyiség 4A zeolittal szabályozták. A legmagasabb észter hozamot a 2-4. táblázatban megadott reakciókörülmények között érték el [Roenne 2005]. Megjegyzend, hogy az alkalmazott 20 tömeg % enzim rendkívül magas érték, okára a cikk nem tér ki

23 2-4. táblázat: A legjobbnak ítélt reakciókörülmények. Számérték Tejsav 30 mm Alkohol 30 mm Novozym 435 enzim 20 tömeg % (a reaktánsokra vonatkoztatott) Zeolit 100 mg Oldószer: ciklohexán 10 ml Reakcióid 24 óra Reakcióhmérséklet 50 C Rázatás intenzitása 150 rpm A fermentáció termékeként a tejsavat gyakran ammónium-laktát formájában kapjuk meg, ezért több kutatócsoport is [Filachione 1952, Sun 2006] kísérletezett ammónium-laktátból kiinduló észter elállítással, hiszen így egy lépéssel rövidebb a folyamat, ami jelents költségmegtarkítást jelent. Az eredmények alapján azonban csak magasabb forráspontú alkoholokkal mint pl.: butanol ment végbe a reakció megfelel hozammal, mivel a reakcióhmérsékletet ezekben az esetekben 100 C fölé lehetett emelni, ami elsegíti az ammónia és a víz reakcióközegbl való eltávolítását. Alternatív megoldási lehetség az ammónia inert gázzal való eltávolítása, illetve szárítószer használata, bár Halpren eredményei alapján az elérhet konverzió nem túl jelents (45 % 96 óra után) [Halpern 2003]. Kasinathan és társai ugyancsak ammóniumlaktátból indultak ki, a tejsavat tributil-foszfáttal extrahálták, majd ezt követen hajtották végre az etanollal való észterezést savas ioncserél gyanta katalizátor jelenlétében. A 10 órás reakció eredményeként 78 %-os konverziót és 95 %-os (etillaktát) szelektivitást értek el, ami abból adódott, hogy az extrakció nélkül tapasztaltakhoz képest visszaszorultak a mellékreakciók [Kasinathan 2010]. Az egyensúly eltolásához a melléktermékként keletkez víz vagy a termék eltávolítására az egyik legkorszerbb módszer a pervaporáció alkalmazása. Delgado és társai savas ioncserél gyanta katalizátort és PERVAP 2201 típusú hidrofil pervaporációs membránt használva 90 %-os konverziót értek el tejsav etanollal való észterezésében. A szerzk megállapították továbbá, hogy 20 tömeg %-nál töményebb

24 tejsavban már oligomerek is jelen vannak, amik ugyancsak észterezdnek a reakció során [Delgado 2010]. A tejsav és etanol savas ioncserél gyanta katalizátorral való észterezésének és a megfelel észter hidrolízisének alaposabb megértése céljából Delgado és társai kinetikai méréseket is végeztek. Meghatározták a reakcióelegyben elforduló komponensek ioncserél gyantára való adszorbciós hajlamát és azt találták, hogy az adszorpciós konstansok a következ sorrendben csökkennek: víz > etanol > tejsav > etil-laktát. Meghatározták az észterezés és a hidrolízis aktiválási energiáját: 52,29 és 56,05 kj/mol [Delgado 2007] Észterek felhasználása A tejsav észterezésével kapott termékek többségének gyakorlati jelentsége is van. A tejsav sóinak hosszú szénláncú zsírsavakkal alkotott észtereit, mint pl. glicerollaktosztearátot elszeretettel használják az élelmiszeriparban, fleg pékárukban emulgeálószerként. A tejsav kis molekulatömeg alkoholokkal alkotott észterei, (pl.: etil-laktát, propil-laktát, butil-laktát) környezetbarát zöld oldószerek, mivel elhanyagolható a toxicitásuk, kicsi az illékonyságuk és biológiai hatásra lebomlanak [Aparicio 2009]. A tejsav észterek felhasználási területe nagymértékben növelhet, ha más természetes eredet oldószerekkel, mint pl. zsírsav-metil-észterekkel elegyítik ket. A tejsav, illetve tejsav észterek optikai aktivitását is ki lehet használni, pl. királis szintéziseknél, gyógyszerek és mezgazdasági vegyszerek elállítására. Erre példa az R-(+)-fenoxipropionsav és származékainak (gyomirtó szerek) elállítása [Datta 2006]. Az etil-laktátnak több felhasználási területe is van. Alkalmazzák a tinta összetevjeként, ízesítszerként, parfümökben, [Delgado 2010] bevonatként, továbbá kenanyagok és szilikonolaj eltávolítására. A nagy tisztaságú etil-laktát alkalmas elektronikai és precíziós készülékek tisztítására. Az FDA (Amerikai Élelmiszer és Gyógyszer Hatóság) jóváhagyta az etil-laktát használatát aroma és illatanyagok, valamint gyógyszerkészítmények oldószereként [ ]. Így érthet, hogy az élelmiszeripar mellett széles körben használja a gyógyszer- és kozmetikai ipar is, fleg kencsökben, krémekben elssorban oldószerként vagy vivanyagként, de az etil-laktát az aktív hatóanyag számos pattanás elleni készítményben is [Datta, 2006]. McConville és társai arról számoltak be, hogy

25 szilárd, orális gyógyszerkészítmények bevonásához is kiváló oldószer a nagy tisztaságú etil-laktát, kiváltva ezzel a hagyományosan használt szerves oldószereket, így csökkentve többek között az oldószer belégzésébl fakadó akut egészségkárosító hatásokat. Kutatásuk alapján az etil-laktát számos egyéb gyógyszergyári felhasználásra is alkalmas lehet. Alkalmazható tablettabevonat alkotóelemeként, használható granulálásnál, ízesítanyagként, illetve inhalálók hajtóanyagaként [McConville, 2009]. Ugyancsak az élelmiszeripar számára van nagy jelentsége, hogy az etil-laktát az acetonnal, etil-acetáttal, hexánnal és etanollal összehasonlítva hatékonyabb extrahálószernek bizonyult karotinoidok paradicsom hulladékokból történ kinyerésére [Strati 2011], illetve alkalmas -tokoferol olivaolajból való extrakciójára is [Vicente 2011]. A fenti felhasználási területeken kívül a rövid szénláncú alkoholokkal történ észterezés lehetséget nyújt a tejsav fermentlébl történ kinyerésére is, ezzel egybeolvasztva a tisztítás és az észter elállítás lépéseit, ahogy az már a fejezetben olvasható volt Etil-laktát tulajdonságai Az etil-laktát színtelen vagy enyhén sárgás szín, lágy krémes illatú folyadék. Molekulatömege 118,13 g/mol, -26 és 154 C között folyadék halmazállapotú, és srsége a vízével közel azonos (1,03 g/cm 3 ) [Bartolomé 1979]. Az etil-laktát iránti növekv érdekldés ellenére keveset tudunk az anyag fázisviselkedésérl, oldatának termodinamikai tulajdonságairól. A kevés, ezen a területen dolgozó kutatócsoport egyike Aparicio és társai, akik az etil-laktát vizes oldatának fázisviselkedését termodinamikai és spektroszkópiai szempontból vizsgálták, ezen kívül molekuláris dinamikai szimulációkat végeztek [Aparicio 2009, Aparicio 2008]. Ferreira és társai meghatározták az etil-laktát / poli-tejsav fázisdiagramját [Ferreira 2008], míg Tombokan és társai a szklareol ((1R,2R,8aS)-dekahidro-1-(3-hidroxi-3-metil-4- pentenil)-2,5,5,8a-tetrametil-2-naftol) / etil-laktát / szuperkritikus CO 2 terner elegy fázis tulajdonságait vizsgálták [Tombokan 2008]

26 2.3 Candida antarctica lipáz B enzim A lipázokat (E.C ), vagyis triglicerol hidrolázokat a hidroláz enzimek osztályába (E.C.3), ezen belül azok közé az enzimek közé soroljuk, amik hatásukat észter kötéseken (E.C.3.1), konkrétabban karboxil-észterek kötésein (E.C.3.1.1) fejtik ki [Hou 2009, Magnusson 2005] Tulajdonságok A Candida antarctica élesztgombát, ahogy azt a név is sejteti, eredetileg az Antarktiszon izolálták. A törzs két különböz (CAL-A és CAL-B) lipáz enzimet termel, amelyek egymástól eltér vonásokkal rendelkeznek (2-5. táblázat), így két jól elkülönül felhasználási területet alkotnak [Kirk 2002] táblázat: CAL-A és CAL-B tulajdonságai [Kirk 2002, Magnusson 2005, Martinelle 1995]. Tulajdonság CAL-A CAL-B Molekulatömeg (kda) Izoelektromos pont (pi) 7,5 6,0 Legmegfelelbb ph 7 7 Specifikus aktivitás (LU/mg) Hstabilitás 70 C-on [100] 15 [0] ph stabilitás Határfelületi aktiválódás 4 Van (de kicsi) Nincs Pozíció specifikusság trigliceridekkel szemben Sn-2 Sn-3 1 : Mérési körülmények: 1,5 ml, 0,2 M tributirin, 5 % gumiarábikum és 0,2 M CaCl 2, 25 C, 7,5- es ph. A szubsztrát oldatot emulgeálták és 1 percig ultrahangfürdben kezelték. A reakciót az enzim oldatnak a szubsztrát oldathoz adásával indították. 2 : Maradék aktivitás 70 C-on, 0,1 M tris pufferben (ph: 7,0) 20 percig, [illetve 120 percig] történ inkubálás után. 3 : A ph, amin 20 óra szobahmérsékleten történ inkubálás után a maradék aktivitás legalább 75 %. 4 : A triacilglicerol lipázok egy jellemz tulajdonsága a víz/lipid határfelületeken történ aktiválódásuk. Martinell és munkatársainak cikke alapján CAL-B esetén egyáltalán nem befolyásolta az új fázis megjelenése az enzim aktivitását, míg CAL-A esetén kismérték aktivitásnövekedés volt tapasztalható

27 Szerkezete alapján a CAL-B egy 317 aminosavból felépül globuláris fehérje, méretei kb.: 30 Å x 40 Å x 50 Å, aktív centruma körülbelül 10 Å x 4 Å széles és 12 Å mély [Idris 2012]. Képes hidrolizálni észtereket, tioésztereket, fehérjéket, epoxidokat, alkil-halogenideket, valamint hasítani hidroxil-nitrilek szénkötéseit [Magnusson 2005]. Nem-természetes nukleofilek lipáz-katalizált reakciója is végrehajtható vele, lehetvé téve az észterek aminolízisét [García 1994], perhidrolízisét [Hernandez 2011] vagy hidrazinolízisét [Yadav 2010]. Az ilyen reakciók elnyösek lehetnek olyan észterek átalakításánál, amikor a hagyományos kémiai katalízis nem mködik, vagy a mellékreakciók dominálnak [Faber 1997]. Mint általában a lipázoknak, a CAL-B-nek is nagy a stabilitása nem-vizes közegekben (pl.: szerves oldószerekben, ionos folyadékokban). Ez a tulajdonsága nagyon hasznossá teszi, mivel így az ellentétes irányú reakciók észterezés vagy átészterezés is lejátszathatók, szélesítve ezzel a felhasználás lehetségeit [Hollmanna 2009, van Rantwijk 2007] Immobilizálás Az egyes biokatalizátorok elterjedésének sok esetben a kulcsfontosságú momentuma az immobilizáció megvalósítása, mivel így biztosítható a drága enzim reakcióelegybl való könny, gyors eltávolítása és újra felhasználhatósága. A szilárd hordozóra történ kötés ezen kívül megakadályozza a termék enzimmel való elszennyezdését, és lehetvé teszi a szakaszos technológiák folyamatossá tételét. Ezen kívül az immobilizáció általában növeli az enzim stabilitását, a magas hmérséklettel és a szerves oldószerekkel szembeni trképességét [Kirk 2002, Idris 2012]. Ez CAL-B enzim esetén különösen nagy jelentség tény, mivel a stabilitása natív formában már 70 C-on elhanyagolható (2-5. táblázat). Immobilizálva viszont Chu és munkatársainak publikációja alapján már stabilnak és jól használhatónak bizonyult 65 C-on vizes közegben pálmazsírsav hidrolízisére [Chu 2003]. Az immobilizált enzimet körülvev mikrokörnyezet számos tényezje befolyásolja az enzim mködését. A legfbb tényezket és azok hatását tartalmazza a 2-6. táblázat

28 2-6. táblázat: Az immobilizálás enzimet befolyásoló tényezi és azok hatása [ReliZyme TM and SEPABEADS EC Enzyme carriers ]. Mátrix tulajdonságai Befolyásolt tulajdonság Hatás a katalitikus hatékonyságra A funkciós csoport típusa, Az aktív hely elérhetsége Enzim orientációja felület polaritása változik Porozitás Anyagátadás Reakciósebesség változik Távtartó molekula kötéstávolsága Anyagátadás, rendszer flexibilitása Stabilitás és aktív hely hozzáférhetsége változik Számos technológia használható lipázok immobilizálására. A leggyakoribbak a következ típusok: polimer alapú (pl. makropórusos akril gyanta) hordozón történ adszorpció; ionos kölcsönhatás útján való megkötés; funkciós csoport révén kovalens kötéssel rögzítés; keresztkötés; a sok esetben alginát alapú sziloxán mátrixba zárás; hidrofil, szervetlen hordozóra kötés [Kirk 2002]. A CAL-B leggyakrabban használt, kereskedelmi forgalomban kapható immobilizált preparátuma a Novozyme 435. Irodalmi adatok alapján a készítményben az enzim egy makropórusos, divinil-benzol keresztkötött polimer alapú metakril-észter gyantán van immobilizálva. Az enzimtartalom kb. 8,5-20 tömeg %, és a lipáz egy m széles rétegben helyezkedik el a gyanta felületi régiójában [Chen 2008, Nakaoki 2005]. A Novozyme 435 sikerét az is bizonyítja, hogy a ScienceDirect adatbázisa alapján 230 darab 2000 és 2011 között megjelent publikációban használták észterezési reakciók katalízisére. Ez, az ugyanebben az idszakban megjelent CAL-B enzimmel történ észterezést leíró publikációk (471 darab) majdnem 50 %-a, ami alátámasztja azt az Intézetünkben is tapasztalt tényt, hogy az immobilizált CAL-B kiváló választás észterezési reakciók katalízisére [Fráter 2007, Fehér 2009]

29 2.4 Enzimes reakciók nem-konvencionális közegei Az enzimek él szervezetekben végbemen kémiai reakciók katalizátorai, ami azt jelenti, hogy általában vizes oldatokban, semleges körüli ph-n, kis sótartalom mellett, enyhe hmérsékleten és atmoszférikus közeli nyomáson fejtik ki hatásukat [Magnusson 2005]. Minden ettl eltér körülményt nem-konvencionálisnak nevezünk. A szemléletesség kedvéért ez látható a 2-4. ábrán. 120 C 1000 bar Hmérséklet Nyomás 0 C ph: 12 ph Konvencionális biokatalízis 1 bar Víz Oldószer ph: 0 0 % 40 % Sótartalom sc CO ábra: Biokatalízis konvencionális és nem-konvencionális körülményei. (A zöld terület jelöli a nem-konvencionális biokatalízist.) Az 1980-as évek közepének fontos felismerése volt, hogy az enzimek nemcsak vizes oldatokban, hanem szerves oldószerekben is képesek kifejteni hatásukat [Gubicza 1990], így elkezddtek a kutatások, melyekben az egyik reaktáns feleslegét (oldószermentes közeg), vagy valamilyen szerves oldószert használnak az enzimes reakció közegeként. Az utóbbi évtizedekben nagy figyelem fordult újabb, nemkonvencionális közegek keresésére figyelembe véve toxikológiai és környezetvédelmi szempontokat. A kutatások eredményeként az oldószerek több új csoportja bizonyította elnyös tulajdonságait. Ilyen oldószerek pl. az ionos folyadékok [van Rantwijk 2007] és a szuperkritikus fluidumok [Cantone 2007]