Hollandia vízi környezetében

Átírás

1 VÍZGAZDÁLKODÁS ÉS SZENNYVIZEK Ösztrogénszennyeződés biológiai hatásai Hollandia vízi környezetében Tárgyszavak: szennyezés; biológiai behatás; hormon; hormonhatás; vizsgálat. Vegyszerek hatására észlelhető hormonbomlást élőlényekben igen eltérő mechanizmusok okozhatnak. Ezek természetes vagy szintetikus vegyületek (pl. xeno-ösztrogének), amelyek feminizáló hatást gyakorolnak, mivel a sejt ösztrogénreceptorához kötődnek. Ezek kölcsönhatása sokféle reakciót okoz, amely befolyásolhatja a szaporodást és fejlődést. Az ösztrogénvegyületek által okozott környezeti problémák elsősorban vízi környezetben fordulnak elő, ilyen pl. a hím halak feminizálódása. Ez arra indította a holland vízgazdálkodási és kommunális művek igazgatóságát, hogy széles körű országos vizsgálatot indítson a vízi környezetben előforduló ösztrogének hatásaira vonatkozólag ( ). A felmérés fő célja, hogy áttekintést nyújtson számos, gyanús xenoösztrogén anyag előfordulásáról és forrásairól a vízi környezetben, valamint megvizsgálja az ösztrogének mellékhatásait halakra, felszíni vízben. A felmérés egyedülálló módon kombinálta a kémiai és a hatásorientált kutatást. Különböző környezeti részlegekben mérték a xenoösztrogének koncentrációját és az ösztrogénaktivitást in vitro riportergénmeghatározásokkal. Vadon élő halakban specifikus biomarkerekkel vizsgálták az esetleges szaporodási zavarokat, mint pl. a vitellogenin (VTG) tojássárga-fehérje előfordulását hím halak vérében és a szaporítószervek kórszövettani állapotát. Az ösztrogén anyagok előfordulása és az osztrogén hatások összefüggését analizálták egy- és többváltozós statisztikai módszerekkel. Az ösztrogén hatás igazolására szennyvíztisztító telep (STP) elfolyójában a halakat az elfolyó és a közeli befogadó vízének tették ki. A helyszínen észlelt összefüggést tovább vizsgálták laboratóriumban in vitro és in vivo kísérletek során.

2 Vizsgálati terv, anyagok és módszerek Helyszíni vizsgálat A mintavételi helyeket úgy választották ki, hogy reprezentálják a holland vízi környezet keresztmetszetét (1. ábra). Több helyet úgy jelöltek ki, mint szennyezetlen referenciapontot (édes- és sósvízi helyek). A mintákat 1999 tavaszán, nyarán és őszén gyűjtötték. É Ems Dollad-öböl Északi-tenger Waddentenger IJssel-tó Északi-tengeri csatorna Rajna Németország Maas Kelet-Scheldt Rajna NyugatScheldt felszíni víz kommunális szennyvíz ipari szennyvíz fúrótorony esővíz sűrűn lakott területek 1. ábra Xeno-ösztrogének alapvonal-vizsgálatának mintavételi helyei

3 A minták különböző típusba sorolhatók: nyers szennyvíz, STPelfolyók és szuszpendált anyag, szarvasmarhatrágya, üledék, felszíni víz és ebben szuszpendált anyag, csapadék és halizomszövet. A szennyvízmintákat 3 hónapon át gyűjtött elegymintából vagy 24 órás, átfolyással arányos mintából vették. A szennyvíziszap-mintákat primer iszapból (előülepítő tartályból) és az utóülepítő fölös iszapjából állították össze. A felszínivízi-mintákat 0,45 µm-es, üvegszálas szűrőn mérték át extrakció előtt. A projekt új potenciális xeno-ösztrogének kiválasztott csoportjára korlátozódott, amelyek közvetlen feminizáló hatást okozhatnak (1. táblázat). A vizsgálat xeno-ösztrogének és ezek rövidítése 1. táblázat Kémiai csoport Természetes ösztrogén hormonok Szintetikus ösztrogén hormonok Alkil-fenol (etoxilát(ok) (AP/APE) Bisphenol-A Ftalátok Specifikus vegyület 17α-ösztradiol (17α-E2) 17α-ösztradiol (E2 vagy 17β-E2) Ösztron (E1) 17α-etinil-ösztradiol (EE2) Nonil-fenolok (NP) Nonil-fenol-etoxilátok (NPE vahy NPnEO) a Oktil-fenolnok (OP) Oktil-fenol-etoxilátok (OPE vagy OPnEO) a (BPA) Dimetil-ftalát (DMP) Dietil-ftalát (DEP) Di-n-butil-ftalát (DBP) Dipropil-ftalát (DPP) Butil-benzil-ftalát (BBP) Dimetil-propil-ftalát (DMPP) Diciklohexil-ftalát (DCHP) Di(2-etil-hexil)ftalát (DEHP) Di-n-oktil-ftalát (DOP) a n az etoxilátcsoportok száma A vízminták ösztrogénaktivitását az ER-CALUX (ösztrogénreceptorközvetített kémiailag aktivált luciferázgén expressziója) in vitro riportermódszerrel vizsgálták. Ezzel a módszerrel meghatározhatták számos egyéb vegyület in vitro ösztrogénhatását is.

4 A tengeröblök és parti vizek reprezentatív halaként az európai lepényhalat (Platichthys flesus), míg az édesvízi környezet esetében a dévérkeszeget (Abramis brama) választották a vizsgálat céljára. Tavasszal és ősszel (mindkét nembeli) halat gyűjtöttek az adott helyeken. Az ösztrogén hatások vizsgálatának fő paraméterei: hím halak vérének VTG-koncentrációja és oociták (primitív petesejtek) elfőrodulása hím halak hereszövetében (ovotestis). Az adatok általános korrelációjának vizsgálatára különböző statisztikai módszereket alkalmaztak (varianciaanalízis ANOVA, főkomponens-elemzés [PCA] és parciális legkisebb négyzetek regresszióelemzése [PLS]). Esettanulmányok A vizsgálatok helyszínei: az eindhoveni STP ( m 3 /nap átlagos vízhozam) amely egy kis folyóba áramlik és az Amsterdam Westpoort-i STP ( m 3 /nap), amely az északi-tengeri csatornába vezet. Mindkét STP befogad kommunális (75%) és ipari (25%) szennyvizet, amelyeket kombinált fizikai kémiai módszerekkel kezelnek, egyidejű nitrogén- és foszfáteltávolítással. Az Eindhoven STP-t lakosegyenértékű teljes kapacitással üzemeltették; az Amsterdam Wespoort-i STP jelenleg teljes kapacitásának ( lakosegyenérték) 60%-át használja. Mindkét STP-nél in situ mérték az elfolyó ösztrogenitását mobil, átfolyásos rendszerekkel. Szivárványos pisztrángot (Oncorhynchus mykiss) és pontyot (Cyprinus carpio) napig exponáltak különböző koncentrációjú elfolyókkal. A pontyot ezenkívül 21 napig ketrecben tartották a befogadó vizekben, az STP közelében. A kísérletekben alkalmazott elvi végpont a hím halakban mért VTG-termelés volt. A következő kísérleti módszereket használták: in vitro ER-CALUX-mérések, in vivo meghatározás transzgénikus zebrahalban (Danio rerio), parciális életciklus (PLC)-tesztek zebrahallal. A transzgénikus zebrahal stabil, ösztrogénreceptor-vezérelt luciferázgént tartalmaz, így a meghatározás áthidalja az in vitro ösztrogénindukció és a szervezetre gyakorolt ösztrogénhatások közötti szakadékot. A kifejlett halakat és ivadékaikat 25 napig, ill. 6 hétig exponálták 17βösztradiollal, friss STP-elfolyóval és szintetikus elfolyóval. A PLC-teszt elvi végpontja az ivadék szexuális differenciálódása és a nemek aránya volt.

5 Eredmények Xeno-ösztrogének előfordulása A kémiai elemzések eredményeit a 2 4. táblázatok mutatják. Természetes szteroid hormonokat találtak minden nyers szennyvízmintában, beleértve több kommunális STP-befolyót, egy kórház és egy szintetikus hormongyár szennyvizét. Leggyakrabban és legnagyobb koncentrációban ösztront (E1) és 17β-ösztradiolt (E2) mutattak ki. Az ösztron kivételével a hormonszintek jelentősen alacsonyabbak voltak biológiai tisztítás után és gyakran nem érték el a kimutatási határt (l.o.d.). Esővízben nem lehetett hormonokat kimutatni. Felszíni vizekben a minták fele tartalmazott ösztront (átlag 1,0 ng/l), míg a többi hormon általában az l.o.d. alatt volt. Belvízi árkok ösztronkoncentrációja magas volt, a nagyobb felszíni vizekhez képest. Intenzív szarvasmarha-tenyésztéssel foglalkozó területek közelében az árkok vize átlag 1,7 ng/l ösztront tartalmazott. A trágya hormonszintje ng/g-nak (ösztron), 17α-ösztradiol esetében ng/g-nek, ill ng/g-nek (17β-ösztradiol) adódott. A biszfenol-a (BPA) közel valamennyi nyers szennyvízmintában jelen volt. A BPA-eltávolítás aránya STP-k esetében helyenként jelentősen változott (átlag 91%). Az esővíz- és felszínivíz-minták felében volt jelen BPA, de csak kis koncentrációban. Viszonylag nagyfokú vízoldékonysága ( mg/l) mellett ez a vegyület megfigyelhető a legtöbb üledékben és szuszpendált anyagban, de szintén kis koncentrációban. Olyan helyeken, ahol a felszíni vízben sok BPA-t lehetett kimutatni, az anyagot halakban is megtalálták. Az alkil-fenol-etoxilát (APE) és az alkil-fenol (AP) koncentrációja nyers kommunális és iapri szennyvizekben változó, valószínűleg a rendszertelen kibocsátás folytán (µg/l tartományban). A biológiai STP-k hatékonyan eltávolították az Ap-t és az APE-t. Azonban az elfolyók szilárd maradékai még tartalmaztak jelentős mennyiségű nonil-fenolt (NP) és nonil-fenol-etoxilátot (NPE): Esővízben, felszíni vízben a szuszpendált anyag és üledék oktolfenol (OP)- és oktil-fenol-etoxilát (IPE)-koncentrációja általában az l.o.d. alatt volt, míg az NP és NPE főleg felszíni vizek szuszpendált anyagában volt jelen. Azonban két olaj/gáz fúróállvány közeli tengeri helyszínen nagy koncentrációjú NPE-t, OP-t és OPE-t találtak az oldott frakcióban (1-2 nagyságrenddel magasabbat, mint más helyeken).

6 2. táblázat A mért ösztrogénvegyületek koncentrációtartománya és középértéke különböző szennyvizekben Kibocsátási forrás Kommunális szennyvíz (ng/l) STP-elfolyó (ng/l) Koncentráció tartomány középérték tartomány középérték 17α-ösztradiol 17β-ösztradiol Ösztron 17α-etinil-ösztradiol Bisphenol-A Nonil-fenolok Nonil-fenol-etoxilátok Oktil-fenolnok Oktil-fenol-etoxilátok DMP DEP DBP DPP BBP DMPP DCHP DEHP DOP <0, <0,3 5, <240 1,9 E4 <820 1,25 E5 <270 1,3 E4 <1,1000 2,4 E ,4 E4 <380 5,1 E4 < ,900 1,5 E4 < <1,3 E4 1,0 E ,9 (11/12) 36,5 (12/12) 60,5 (12/12) 3,2 (4/12) 1410 (12/12) 3000 (9/12) 3,7 E! (9/12) 700 (9/12) 2,4 E4 (1/12) 1000 (12/12) 1,3 E4 (12/12) 3700 (11/12) 200 (8/12) 2200 (12/12) 5000 =12/12) 150 =(6/12) 3,2 E4 (12/12) 660 (12/12) Kibocsátási forrás Kommunális szennyvíz (ng/l) Koncentráció tartomány középérték 17α-ösztradiol 17β-ösztradiol Ösztron 17α-etinil-ösztradiol Bisphenol-A Nonil-fenolok Nonil-fenol-etoxilátok Oktil-fenolnok Oktil-fenol-etoxilátok DMP DEP DBP DPP BBP DMPP DCHP DEHP DOP <0,3 7,1 <0,8 54 <0,3 120 <0,3 3,9 < <440 3,9 E4 <260 2,3 E6 < <420 1,2 E4 < < <690 2,1 E4 <4 460 < <730 4,0 E5 <5 1,6 E ,5 E ,3 (3/10) 31 (3/10) 46 (7/9) 3,8 (2/9) 575 (8/11) 3,9 E4 (1/4) 2,4 E5 (3/4) 530 (1/4) 1,2 E4 (1/4) 320 (8/10) 4200 (5/10) 2200 (7/10) 170 (9/10) 480 (9/10) 2000 (7/10) 370 (8/10) 1,9 E4 (10/10) 150 (10/10) <0,4 <0,8 <0,3 11 <0,3 2,6 < < < < <650 <3 320 < < <1 22 < <1000 2,0 E < <2 19 (0/10) (0/10) 3,4 (6/10) 2,6 (1/10) 118 (7/10) 1500 (1/9) 2200 (1/9) 700 (2/9) (0/9) 170 (2/9) 840 (6/9) 300 (3/9) 15 (4/9) 70 (7/9) 700 (4/9) 15 (2/9) 1500 (7/9) 15 (4/) A középértéket az >l.o.d. (kimutatási határ) koncentrációjú mintákból számították ki. Zárójelben látható az l.o.d. feletti és az összes vizsgált minta száma.

7 3. táblázat A mért ösztrogénvegyületek koncentrációtartománya és középértéke eső- és felszíni vízben, üledékben Kibocsátási forrás Esővíz (ng/l) Felszíni víz(ng/l) Koncentráció tartomány középérték tartomány középérték 17α-ösztradiol 17β-ösztradiol Ösztron 17α-etinil-ösztradiol Bisphenol-A Oktil-fenolnok Oktil-fenol-etoxilátok Nonil-fenolok Nonil-fenol-etoxilátok DMP DEP DBP DPP BBP DMPP DCHP DEHP DOP <0,3 <1,5 <0,6 <0,3 <15 57 < <480 <410 < < < (0/5) 56 (2/5) 280 (1/6) (6) (6) 950 (2/6) 12 (3/3) 340 (3/3) 410 (3/3 160 (3/3) 420 (3/3) (0/3) 770 (3/3) 41 (3/3) <0,3 0,4 <0,8 1,0 <0,3 7,2 <0,3 0,4 <8,8 100 < < < < <4,5 190 < < <1,9 8 < <3 60 < <2 78 Kibocsátási forrás Szuszpendált anyag (ng/g szárazsúly) Üledék (ng/g szárazsúly) 0,4 (1/97) 1,0 (1/97) 1,0 (42/97) 0,4 (1/97) 45 (50/97) 300 (8/86) 1100 (2/86) 990 (9/86) 1500 (29/86) 17 (60/87) 430 (24/87) 250 (81/87) 6 (7/87) 77 (83/87) 380 (75/87) 8 (29/87) 320 (81/87) 15 (24/87) Koncentráció tartomány középérték tartomány középérték 17α-ösztradiol 17β-ösztradiol Ösztron 17α-etinil-ösztradiol Bisphenol-A Oktil-fenolnok Oktil-fenol-etoxilátok Nonil-fenolok Nonil-fenol-etoxilátok DMP DEP DBP DPP BBP DMPP DCHP DEHP DOP 5,6 56 <1 400 < < <5 2,2 E4 <1,3 1,6 E4 < < <0,53 1,3 E4 < < <ö2 1,9 E4 < (15/15) 15 (5/50) 800 (2/50) 170 (39/50) 310 (47/50) 224 (43/51) 37 (32/50) 98 (21/51) 1500 (29/51) 42 (32/51) 180 (24/51) 41 (24/51) 3400 (46/51) 90 (37/51) <1,1 43 <2 26 <34 < < , < <0, <5 60 < >2 11 < <2 55 3,2 (15/18) 8 (3/23) (0/23) 160 (21/23) 110 (19/23) 14 (20/21) 133 (15/16) 390 (3/21) 300 (12/21) 14 (12/21) 250 (3/21) 39 )4/21) 600 (19/21) 11 (13/21) A középértéket az >l.o.d. (kimutatási határ) koncentrációjú mintákból számították ki. Zárójelben látható az l.o.d. feletti és az összes vizsgált minta száma.

8 4. táblázat A mért ösztrogénvegyületek koncentrációtartománya és középértéke halak izomszövetében Kibocsátási forrás Dévérkeszeg-izom (ng/g nedves súly) Lepényhal-izom (ng/g nedves súly) Koncentráció tartomány középérték tartomány középérték Bisphenol-A Oktil-fenolnok Oktil-fenol-etoxilátok Nonil-fenolok Nonil-fenol-etoxilátok DMP DEP DBP DPP BBP DMPP DCHP DEHP DOP <0,18 1,4 <10 80 <10 < < <0,22 3, <0,35 7,7 <0,89 2,99 <0, <0, ,92 (2/3) 80 (1/17) (0/17) 135 (4/17) 120 (4/17) 1,9 (9/17) 111 (8/8) 44 88/17) 1,7 (17/17) 19 (10/17) 7,9 (16/17) 153 (8/8) 2,2 (8/17) 1,2 2,6 <10 10 <10 10 < ,14 5,4 6,7 91 <0,7 33 <0,08 2,7 <0,2 33 <0,2 7,0 <2,2 144 <0, ,3 (3/3) (0/20) 10 (1/20) 10 (2/20Ö) 15 (2/20) 0,45 (7/20) 34 (6/8) 7,8 (6/10) 0,86 (6/20) 6,9 (6/20) 4,6 (5/20) 64 (7/8) 1,93 (11/20) A középértéket az >l.o.d. (kimutatási határ) koncentrációjú mintákból számították ki. Zárójelben látható az l.o.d. feletti és az összes vizsgált minta száma. Az üledék és szuszpendált anyag NPE- és NP-szintje magasabb volt a Maasban ahol ez a folyó Belgiumból Hollandiába lép át, mint a Rajna-folyóban a német holland határnál. Azonban mivel a Maas viszonylag nagy torkolatba ömlik a koncentrációk jelentősen felhígulnak. Ezzel szemben a Rajnában mért koncentrációk növekednek a német határtól, ahol belép Hollandiába, ahonnan az Északi-tengerbe ömlik. Halakban NP-t és NPE-t észleltek 37 helyszín közül 8 esetben, míg OP-t és OPE-t csak egyszer mutattak ki halszövetben. Ftalátokat minden vizsgált anyagban találtak. Nyers kommunális szennyvízben legnagyobb mennyiségben DEP és DEPH fordult elő, amelyek viszonylag kis ösztrogénpotenciával rendelkező ftalátok. Nagyobb ösztrogénhatékonyságú egyéb anyagok (DMP, BBP) jóval kisebb koncentrációban észlelhetők. STP-k esetében a ftalátkoncentrációk DEHP kivételével rendszerint 1 µg/l alá csökkentek. Ftalátok minden felszínivíz-mintában jelen voltak, a belvizekben és az Északi-tengernél kisebb koncentrációban fordultak elő. Viszonylag nagyfokú ftalátszenynyeződést észleltek a Wadden-tengerben és az Északi-tengeri csatornában. Közel valamennyi mintában (felszíni víz, szuszpendált anyag és üledék) találtak DEHP-t, ami a széles körű termelésnek és felhasználás-

9 nak tulajdonítható. DEP, DMPP és DBP a felszíni vizekben, míg a DPP szuszpendált anyagban fordult elő nagy koncentrációban. Általában a ftalátok koncentrációja üledékben kisebb volt, mint szuszpendált anyagban. Figyelemre méltó, hogy a legtöbb ftalát esővízben hasonló koncentrációban található, mint a felszíni vizekben. Az élőlények ftalátkoncentrációja igen változó (4. táblázat). Nem azonosítottak olyan specifikus helyeket, ahol minden vizsgált xeno-ösztrogén szintje egyidejűleg magasabb volt. Ösztrögének hatásai In vitro ösztrogén hatást mutattak ki minden környezeti anyagban, legnagyobb koncentrációban nyers ipari szennyvízben (5. táblázat). Általában az ösztrogénaktivitás jelentősen csökkent a tisztítási eljárások során, bár az aktivitás szintje az elfolyóban még mindig meghaladta a felszíni víz átlagos aktivitási szintjét. Az intenzív állattartást folytató területek belvízárterén gyűjtött vízminták ösztrogén aktivitása szintén magas volt. Ezzel szemben igen kis aktivitást mértek melegházak környékén levő árkokból gyűjtött vízmintában. 5. táblázat Helyszíni vízminták extraktumainak ösztrogénaktivitása ER-CALUX módszerrel mérve Ösztradiol-ekvivalensek (pmol EEQ/1) Mintavételi hely n Tartomány (n>l.o.d.) Középérték Ipari szennyvíz: Elfolyó Befolyó Kommunális szennyvíz: Elfolyó Befolyó Felszíni víz Felszíni víz Belvízi árkok Esővíz ,2 9,5 (3) 5,8 560,4 (4 a ) <l.o.d. 2,2 (9) 2,4 275,1 (13) <l.o.d. 0,61 (85) 0,003 0,74 (11) 0,01 0,22 (3) 0, ,.3 27,4 0,07 0,.03 0,13 n = vizsgált minták száma. Középérték kiszámítása: a >l.o.d. értékű EEQ.-jú mintákra vonatkozólag. a Egy minta citotoxikus volt.

10 A halak VTG-szintje igen változó (2/b ábra). Legtöbb helyen az átlagos VTG-szint kisebb volt, mint 1000 ng/ml plazma, ami háttérszintnek tekinthető. A legnagyobb VTG-indukciót hím dévérkeszeg plazmájában mérték, amely az Eindhoven STP szomszédságában levő Dommel-folyóban él (max ng/ml) (2/a ábra). A hímek VTG-koncentrációja meghaladta az ugyanazon a helyen kifogott nőstényekben mért értéket. VTG-átlag+/- SE, ng/ml 1,0E+09 1,0E+08 1,0E+07 1,0E+06 1,0E+05 1,0E+04 1,0E+03 1,0E+02 1,0E+01 a) hím dévérkeszeg tavasz ősz * * * * * 1,0E referencia kis csatornák/ tavak nagy folyók nagy csatorna folyók x * * VTG-átlag+/- SE, ng/ml 1,0E+09 1,0E+08 1,0E+07 1,0E+06 1,0E+05 1,0E+04 1,0E+03 1,0E+02 b) hím lepényhal tavasz 1,0E+01 1,0E+00 x x x x x x * 1 referencia referencia nagy csatornák nyílt tenger/partmenti vizek öblök (félig sós) tó ősz * * 2. ábra VTG átlagkoncentrációja hím dévérkeszeg (a) és hím lepényhal (b) vérplazmájában különböző vízrendszerekben (számok az 1. ábrára utalnak). Csillaggal jelölve a referenciahelytől való szignifikáns eltérés. x = nincs adat

11 Egyedül a Dommel-folyóban találtak jelentős számban ovotestisszel rendelkező hím halakat. 14 vizsgált hal közül 6 esetben találtak oocitákat a here szövetében, tavasszal, míg ősszel 9 hím közül 3-nál észleltek hasonló helyzetet. Statisztikai elemzés A szennyeződések mintaelemzése arra utalt, hogy valamennyi felszínivíz-rendszer közül a Maas-vízgyűjtője mutatja a legnagyobb változatosságot, néhány helyen domináltak a ftalátok, máshol az NPE-k. A Dommel-folyóra jellemző a DEHP és NP-k előfordulása. Két északitengeri helyen alkil-fenol-etoxilátok fordultak elő. Általában három szenynyezőanyag-csoport különböztethető meg: alkil-fenol-etoxilátok, ftalátok és szteroid hormonok, valamint biszfenol-a. A szennyezésminták szezonális eltérései felszíni vízben és szuszpendált anyagban észlelhetők. Tavasszal alkil-fenol-etoxiltáok, míg nyáron inkább ftalátok mutathatók ki. Az őszi mintákra jellemző a kisebb szennyezéstartalom, valószínűleg a nagyobb áramlás következtében. Nem találtak szignifikáns statisztikai összefüggést a plazma VTGszintje és az ovotesztiszek előfordulása között. Azonban világos, hogy a legtöbb VTG-t tartalmazó helyeknél (Dommel-folyó) leggyakoribb az ovotesztisz előfordulása hím dévérkeszegekben. A halak belső szennyezettségi szintje bizonyos fokig összefügg a felszíni víz és a szuszpendált anyag szennyezettségével. A plazma VTG-szintje szignifikáns összefüggést mutatott az NPE-k és NP belső koncentrációjával dévérkeszegnél, míg lepényhal esetében a VTG főleg a ftalátokkal (BBP, DCHP) állt összefüggésben. Esettanulmányok A 100% Eindhoven STP-elfolyónak kitett szivárványos pisztráng vérében igen nagy VTG-koncentráció mérhető (3. ábra). 1:1 arányban (50%) hígított folyóvíz jelentősen csökkentette a VTG-indukciót. Az amsterdami STP-nél mérsékelt, de nem szignifikáns VTG-indukció figyelhető meg, 50 és 100%-os elfolyókoncentráció esetében. Valamennyi kísérleti ponty VTG-koncentrációja 500 ng/ml plazma alatt volt. Az eredmények szerint különbség van a fajok elfolyóban levő ösztrogének iránti érzékenységéhez képest.

12 1,0E+07 1,0E+06 Amsterdam Westpoot STP 1,0E+07 1,0E+06 Eindhoven STP * VTG, ng/ml 1,0E+05 1,0E+04 1,0E+03 1,0E+02 VTG, ng/ml 1,0E+05 1,0E+04 1,0E+03 1,0E+02 1,0E+01 1,0E+01 1,0E+00 t=0 (n=4) 0% (n=8) 25% (n=1) 50% (n=7) 100% (n=3) 1,0E+00 t=0 (n=9) 0% (n=12) 25% (n=11) 50% (n=12) 100% (n=9) elfolyó koncentrációja elfolyó koncentrációja 3. ábra Pisztráng átlagos plazma VTG-szintje holland STP-helyeknél végzett in situ kísérletekben 100 differenciálatlan hím nőstény 80 *** ** *** %-os arány * 20 0 expozíciókombináció szülők pozíciója holland standard víz E2 elfolyó szintetizált elfolyó holland standard víz E2 elfolyó szintetizált elfolyó ivadék pozíciója holland standard víz holland standard víz holland standard víz holland standard víz elfolyó E2 elfolyó szintetizált elfolyó 4. ábra Zebrahalivadékok nemi megoszlása különböző, kombinált expozíciók hatására Az ER-CALUX-módszerrel végzett meghatározások szerint ösztrogénaktivitás mutatható ki az Eindhoven STP-elfolyójában és a Dommel

13 vizében, az elfolyó kibocsátása közelében (6. táblázat). A transzgénikus zebrahallal végzett meghatározások hasonló nagyságrendű aktivitásokat mutattak. A szintetikus elfolyóban levő vegyületek (E1, BPA, AP-k, APE-k, DEHP) alig járultak hozzá a mért ösztrogénaktivitáshoz. A parciális életciklus (PLC)-teszt amikor kifejlett zebrahalat 17βösztradiol, szintetikus elfolyó vagy friss STP-elfolyó hatásának tettek ki nem mutatott szignifikáns hatást a lerakott ikrák száma tekintetében (4. ábra). 6. táblázat Kommunális szennyvíztisztító (WTP) elfolyójában mért ösztrogénkeverék ösztrogénhatása ER-CALUX (ERC) és transzgénikus zebrahal (FISH) módszerrel mérve 1. Ösztrogének + BPA Névleges koncent- ER-CALUX Transzgénikus zebrahal ráció szintetikus elfolyóban Elméleti Mért Elméleti Mért ng/l pm ERC- EEF ERC- EEQ EEQ-k FISH- EEF E ,1 1, EE2 2,8 9 1, BPA , ,1 < 0 FISH- EEQ EEQ-k EEQ-k összege (0,5) (110) 2. Alkil-fenolok NP , ,3 < 0 NP-4-E d 0,0 NA c NA OOP-8/9-E < d 0,0 NA NA EEQ-k összege 0,2 0,4 (0,0) 0 10 (2) 3. Ftalát DEHP < 0 0 (0,0) < 0 8 (2) Összes szintetikus elfolyó (1-3) Friss Eindhoven STP-elfolyó STP-t befogadó víz (Dommel) (0,5) (140) 12 (0,7) 189 (32) 9 (0,4) 237 (54) Az ösztradiol ekvivalensek (EEW, pmol/l) 3 5 független kísérlet átlagai (±SE) a Az elméleti EEQ-t úgy számították ki, hogy megszorozták a koncentrációt (pm) az ösztradiol ekvivalencia faktorral.

14 Megfigyelhető, hogy olyan nőstények domináltak, amelyeknek petéi 1 nm 17β-ösztradiolnak, szintetikus és STP-elfolyónak voltak kitéve. Így olyan populáció alakult ki, amely 15% hímhalból, 10% differenciálatlan halból és 75% nőstény zebrahalból állt. Feltehető, hogy a fiatal halak aktuális expozíciója döntő a nemek meghatározásában, nem pedig a szülők expozíciója. Értékelés Yeno-ösztrogének előfordulása és forrásai Közel valamennyi vizsgált anyag kis koncentrációban jelen van Hollandia vízi környezetében, míg néhány specifikus helyen nagyobb menynyiségben is előfordulhatnak. Még a referenciahelyek sem minősíthetők teljesen tisztának. Az OP, OPE-k és szteroid hormonok az ösztron kivételével csak néha mutathatók ki, igen kis koncentrációban. Általában a vegyületek szintje gyakran ugyanolyan nagyságrendű, mint a más országokban mért értékek. A koncentrációk jelentősen változnak a különböző helyeken és víztípusokban. Ezenkívül a mintavételi és elemzési módszerek eltérései gyakran gátolják a részletesebb összehasonlítást. In vitro ösztrogén aktivitást mutattak ki a vizsgált víztömegek valamennyi környezeti szakaszában. A nemzetközi vizsgálatokkal való öszszehasonlítás azt mutatja, hogy ezek a koncentrációk általában alacsonyabbak, néhány kivételtől (Dommel-elfolyó, Északi-tenger csatorna) eltekintve. A kommunális és ipari szennyvizek kibocsátása valószínűleg a xeno-ösztrogének vízi környezetbe való emissziójának fő útja. A kommunális szennyvizeket az STP-k biológiailag tisztítják, amely a vizsgált vegyületek több, mint 90%-át eltávolítja. Ez megegyezik más országok méréseivel és az in vitro ösztrogénaktivitás-eltávolítási hatékonyságával. Ennek ellenére a végső elfolyóban levő kis mennyiségű xeno-ösztrogén még mindig ösztrogén hatásokat vált ki halakban, különösen a biológiailag igen aktív szteroid hormonok. Ezenkívül heves esőzés során a nyers kommunális szennyvíz beömölhet a felszíni vízbe a csatornák túlfolyása útján, ami jelentősen hozzájárulhat az egész ösztrogénterheléshez. A szarvasmarhatrágya a környezeti ösztrogénszennyezés másik fontos forrása lehet, amit az állattenyésztéssel foglalkozó helyeken gyűjtött vízminták fokozott hormonszintje igazol.

15 Az esővíz is lehet xeno-ösztrogének különösen ftalátok forrása. A mért aktivitás meghaladta a felszíni vizek értékeit. A holland méréseket egy másik, újabb vizsgálat is alátámasztotta, amelynek során max. 2,3 pmol EEQ/l ösztrogénaktivitást észleltek. Ez azonban nem magyarázható teljes mértékben a ftalátkoncentrációval. Néhány partközeli tengeri olaj/gáz fúrótorony az NPE és NP valószínű forrásának tekinthető. Újabban megerősítették az itteni nagy koncentrációk jelenlétét. Nem világos, hogy ez a szennyeződés a fúrásnak és termelési tevékenységnek vagy pedig az adott területen található hajók kibocsátásainak tulajdonítható-e. Halakban észlelt hatások Megállapítható, hogy Hollandiában a tengerei halakra a xenoösztrogének nincsenek nagy hatással. Ez ellentétes az angliai eredményekkel, amelyek szerint az öblökben élő lepényhalakban nagy a plazma VTG-koncentrációja és ovotestis is kimutatható. Ez annak tulajdonítható, hogy a holland halak főleg a tengerparttól távol ívnak, nem pedig közeli öblökben, mint Angliában. A hal érzékeny fiatalkori szakaszaiban alig van kitéve a nemet megváltoztató anyagoknak az Északi-tenger tisztább, nyílt területein. A vizsgálat során legnagyobb VTG-szintet a Dommel-folyó halaiban találták, amelyeket az STP-elfolyó kibocsátásánál fogtak ki. Ez volt az egyedüli hely, ahol a halakban igen gyakori volt az ovotestis. Az eindhoveni STP kibocsátási aránya többé-kevésbé hasonló a dommelihez, ami jelentősen meghatározza a víz összetételét ebben a folyóban. Az Eindhoven-elfolyó nagyfokú ösztrogenitását megerősítette a szivárványos pisztránggal (in situ) és zebrahallal (laboratóriumban) végzett expozíció eredménye. Néhány megfigyelés arra utal, hogy a halakban észlelt ösztrogénhatások más, kisebb holland folyóban is előfordulnak. Helyileg a vízi környezet ösztrogenitása potenciális veszélyt jelent a halak számára. A nagyobb vizekben élő halakat jóval kevésbé érik ösztrogénhatások, mivel az ösztrogének gyorsabban felhígulnak ezeken a területeken. Ez érvényes a Rajnában és Maasban levő, legtöbb mintavételi helyre. Nemrég kimutatták, hogy az ovotestis-szel rendelkező halak szaporodási képessége csökkenhet, aminek káros hatása lehet a reprodukcióra és a populációk túlélésére. A helyszíni vizsgálatok ( ) Hollandia egyéb területein bizonyos eltéréseket mutattak: csökkent a hímek

16 nemi mirigyeinek súlya, korábban ment végbe a teljes kifejlődés és a nemek aránya a nőstények irányába eltolódott. Okozati összefüggés kimutatása A statisztikai elemzés szerint a hím halak plazmájának VTGkoncentrációja jól összefüggött néhány xeno-ösztrogén (főleg NP és ftalátok) szöveti koncentrációjával. Ez azonban nem jelenti azt, hogy az NP az (egyetlen) oka az észlelt ösztrogénhatásoknak. Egyik halfaj szennyezési szintje sem mutatott jó korrelációt a vizsgált környezeti szakaszok külső szennyezési szintjeivel. Ez részben azzal magyarázható, hogy az adott vegyületek a halakban gyorsan metabolizálódnak. Valószínű, hogy a halak szennyezési szintje sokkal több helyen történt xeno-ösztrogén-expozíciót reprezentálnak, nemcsak arra a helyre utalnak, ahol a halat kifogták és a kémiai elemzés céljára mintákat vettek. Az oksági összefüggés megközelítésének másik módja az esettanulmányok végzése két STP-helyen. Az eredmények szerint az STPelfolyó ösztrogén hatást gyakorolt a halakra. A laboratóriumi meghatározások arra utaltak, hogy a szintetikus ösztrogén (EE2) nagymértékben felelős a megfigyelt ösztrogenitásért a zebrahalban. A harmadik megközelítés a xeno-ösztrogének szintjének összehasonlítása a vízi környezetben az irodalomban található küszöbértékekkel. Megállapítható, hogy valószínűleg helyi hatást gyakorolnak a halakra az ösztrogén hormonok (természetes és szintetikus) és az AP-k/APE-k (szennyvízben és felszíni vízben). A BPA ösztrogén hatásai többékevésbé kizárhatók, míg a ftalátok aktuális ösztrogenitása halakra jórészt ismeretlen. Összefoglalva, oksági összefüggés szempontjából két csoport jelentős: a szteroid hormonok (EE2) és az Ap-k/APE-k (főleg az NP). Azonban még kétséges, hogy a két vegyülettípus közül melyik felelős elsősorban a halakban, jellemző helyeken előforduló ösztrogénhatásokért. A szteroid hormonok kimutatása környezeti anyagokban erősen korlátozott és pontos mérésük halszövetben igen nehéz, így alig állapítható meg ezeknek az anyagoknak a hatása felszíni vizekben élő halpopulációkra. Mivel az érzékenység, expozíciós rendszer és a vegyületek hozzáférhetősége fajonként változhat, ezért a két megközelítés eredményeit óvatosan kell összehasonlítani. A kísérleti adatok azonban azt mutatják, hogy az EE2 és más szteroidok a főbűnösök a kommunális szennyvízben és

17 valószínűleg a befogadó felszíni vizekben is. Ezenkívül még szerepet játszhatnak egyes ipari vegyületek is (NP, NPE-k). Ez egybevág az Európai COMPREHEND projekt eredményeivel. Összeállította: Dr. Pálfi Ágnes Vethaak, A. D.; Lahr, J. stb.: An integrated assessment of estrogenic contamination and biological effects int he aquatic environment of The Netherlands. = Chemosphere, 59. k. 4. sz p Onda, K.; Yankg, S.-Y.; Mlya, A.; Tanaka, T.: Study on endocrine disrupting chemicals in wastewater treatment plants. = Water Science Technology, 43. k p