Ritka, oldalláncban gyűrűs ekdiszteroidokat tartalmazó növények vizsgálata

Átírás

1 Szegedi Tudományegyetem Farmakognóziai Intézet Ritka, oldalláncban gyűrűs ekdiszteroidokat tartalmazó növények vizsgálata Ph.D. értekezés tézisei Ványolós Attila Témavezető: Prof. Dr. Báthori Mária Szeged 2012

2 Bevezetés Az ekdiszteroidok az ízeltlábúak szteránvázas hormonjai, de megtalálhatók más gerinctelen fajokban is. A rovarokban vedlést és fejlődést szabályozó szerepet töltenek be, számos biokémiai és élettani folyamatot befolyásolnak. Az első ekdiszteroidot Butenandt és Karlson izolálta 1954-ben selyemhernyóbábból. Több mint tíz évvel később fedezték fel az ízeltlábúak ekdsizteroidjaival szerkezetileg rokon vegyületeket, a fitoekdiszteroidokat. A növények több nagyságrenddel nagyobb mennyiségben szintetizálják az ekdiszteroidokat, mint a rovarok. Szerepük a növényekben nem teljesen tisztázott, de valószínűleg védelmi szerepet töltenek be a nem adaptálódott növényi rovarkártevőkkel szemben. A növényekből nyert nagy mennyiségű ekdiszteroid tette lehetővé farmakológiai vizsgálatukat, amelyek igazolták, hogy emlősökben számos élettani folyamatot jótékonyan befolyásolnak, és toxicitásuk igen alacsony. A farmakológiai hatások közül a legkiemelkedőbb a fehérjeszintézis fokozása, amelyhez nem társulnak a gerinces szteroidokra jellemző mellékhatások. A hatás mechanizmusa, ill. a metabolizmus folyamatai emlős, így humán szervezetben alig ismert. Anabolikus hatásuk mellett adaptogén, sebgyógyulást elősegítő, antidiabetikus és multidrogrezisztenciát csökkentő hatásuk érdemel említést. Az ekdiszteroidok rovarokban betöltött szerepük és alacsony emlős toxicitásuk miatt alkalmasak szelektív, környezetbarát inszekticidek kifejlesztésre: funkcionális analógjaikat, a bisz(acil)-hidrazinokat már használják növényvédelmi célokra. Az elmúlt évtizedek fitokémiai vizsgálatai eddig több mint 300 ekdiszteroidot azonosítottak. Szerkezetüket tekintve ciklopentano-perhidrofenantrén vázzal rendelkező vegyületek, a 17-es helyzetben β térállású alkil oldalláncot viselnek (1. ábra). 1

3 Az ekdiszteroidok jellegzetes szerkezeti elemei a B gyűrű 7-én-6-on kromofór csoportja, az A/B gyűrű cisz és a C/D gyűrű transz anellációja. A vázhoz kapcsolódó hidroxi csoportok száma általában ábra A leggyakoribb ekdiszteroid, a 20-hidroxiekdizon szerkezete Célkitűzés A Szegedi Tudományegyetem Farmakognóziai Intézetében több mint három évtizede folynak ekdiszteroidokkal kapcsolatos kutatások, amelyek magukban foglalják a növények szűrővizsgálatát, a biológiailag aktív komponensek azonosítását és gyakorlati alkalmazásaik vizsgálatát egyaránt. A kutatások során egy új, hatékony izolálási módszer került kidolgozásra az ekdiszteroidok kinyerésére. Ez a módszer különböző, optimalizált kromatográfiás módszerek kombinálásán alapszik. Az ekdiszteroidok szintézise nem gazdaságos, így nagyobb mennyiségben történő előállításukra egyetlen lehetőség, a növényekből történő izolálás kínálkozik. A disszertáció fő célkitűzései: Az Ajuga reptans var. reptans földfeletti rész, a Polypodium vulgare gyöktörzs és a Serratula wolffii gyökér ekdiszteroidprofiljának vizsgálata, és új ekdiszteroidok izolálása az említett fajokból Szokatlan szerkezetű, új ekdiszteroidok izolálása: - ritka sztigmasztánvázas ekdiszteroidok kinyerése - oldalláncban gyűrűt tartalmazó ekdiszteroidok felfedezése 2

4 Potenciálisan magas rovarhormon-aktivitással rendelkező új ekdiszteroidok izolálása Változatos szerkezetű ekdszteroidok izolálása multidrog-rezisztencia vizsgálatokhoz, amelyek hozzásegítenek a szerkezet-hatás összefüggések elemzéséhez, a hatásos komponensek azonosításához. Anyagok és módszerek Növényi nyersanyag Az A. reptans var. reptans (indás ínfű) földfeletti részét 2003 augusztusában Budapest környékén, a Növényvédelmi Kutatóintézet kísérleti telepén termesztett állományból, a P. vulgare (közönséges édesgyökerű páfrány) gyöktörzsét 2008 októberében Veszprém, Egerbakta és Kőszeg környékéről, míg a S. wolffii (pompás zsoltina) gyökerét 2003 augusztusában Herencsényben, termesztett állományból gyűjtöttük. A mintapéldányok a Növényvédelmi Kutatóintézet Ökotoxikológiai Tanszékén A0308-as számon (A. reptans var. reptans) és a Szegedi Tudományegyetem Farmakognóziai Intézetében P71-es (P. vulgare) és S94-es számon (S. wolffii) megtalálhatók. Reagensek és tesztanyagok Az analitikai tisztaságú oldószereket a Reanal (Budapest, Magyarország), a HPLC tisztaságúakat a Merck (Darmstadt, Németország) szállította. Az referencia ekdiszteroidok korábbi izolálási munkáinkból származnak. Az izolálás során alkalmazott módszerek A növényi nyersanyagból metanolos kivonatot készítettünk. A metanolos kivonat előtisztítása során frakcionált acetonos kicsapást, majd oldószeroldószer közti megosztást (vizes-metanolos oldat és n-hexán között), végül poliamid oszlopon szilárd fázisú extrakciót végeztünk. Az előtisztított kivonatból az ekdiszteroidokat különböző elválasztástechnikai műveletek kombinált alkalmazásával izoláltuk: klasszikus oszlopkromatográfia 3

5 (alumínium-oxid állófázison), vákuum oszlopkromatográfia (szilikagél állófázison), centrifugális rétegkromatográfia és végső tisztítási lépésként normál fázisú HPLC. Az elválasztás követésére rétegkromatográfiát használtunk. Szerkezetvizsgálat Az ismert ekdiszteroidok azonosítása fizikai és spektroszkópiai tulajdonságaik szakirodalmi adatokkal való összehasonlításán alapult. Az izolált ekdiszteroidok szerkezetét spektroszkópiai vizsgálatok (UV, NMR, MS) segítségével állapítottuk meg. A vegyületek szerkezetére vonatkozó alapvető információkat az NMR ( 13 C és 1 H) és tömegspektrumok elemzése során nyertünk. Az ekdiszteroidok szerkezetének meghatározása a vizsgálat során kapott spektrumok és a leggyakoribb ekdiszteroid, a 20- hidroxiekdizon megfelelő spektrumaival való összehasonlításával történt. Eredmények és értékelésük Ekdiszteroidok izolálása Különböző kromatográfiás módszerek kombinálásával 3 új és 2 ismert ekdiszteroidot izoláltunk az A. reptans var. reptans földfeletti részéből. A P. vulgare gyöktörzsének metanolos kivonatából 3 új és 11 ismert komponenst, míg a S. wolffii gyökeréből 2 új és 1 ismert ekdiszteroidot izoláltunk. Az izolált ekdiszteroidok szerkezetét a 2. és 3. ábra, ill. az 1. táblázat mutatja. Az új, természetes vegyületeket * jelöli. 4

6 R: 1 2* 3* 4 5* 2. ábra Az Ajuga reptans var. reptans földfeletti részéből izolált ekdiszteroidok: 24-dehidropreciaszteron (1), reptanszlakton A (2), reptanszlakton B (3), brevifloraszteron (4) és szendreiszteron (5). R: 19* 20 21* 3. ábra A Serratula wolffii gyökeréből izolált ekdiszteroidok: ponaszteron A-22- apiozid (19), 3-epi-22-dezoxi-20-hidroxiekdizon (20) és 3-epi-sidaszteron (21). 5

7 1. Táblázat. A Polypodium vulgare gyöktörzséből izolált ekdiszteroidok Ekdiszteroid R 1 R 2 R 3 R 4 R 5 pteroszteron (6) OH H βh OH rubroszteron (7) OH H βh OH 5-hidroxirubroszteron (8) OH H βoh OH 5-hidroxiekdizon (9)* OH H βoh OH 5-hidroxiposztszteron (10) OH H βoh OH posztszteron (11) OH H βh OH abutaszteron (12) OH H βh OH sidaszteron (13) OH H βh OH 5-hidroxisidaszteron (14) OH H βoh OH 6

8 20-deoxisidaszteron (15)* OH H βh OH polipodin B-2-glükozid (16)* Glu H βoh OH polipodoszaponin (17) H Rha- Glu αh H 26-metoxi-polipodoszaponin (18) H Rha- Glu αh H Az izolált ekdiszteroidok jelentősége Kivételes szerkezetű ekdiszteroidok Laktongyűrűt tartalmazó ekdiszteroidok Az Ajuga fajokból korábban izolált ekdiszteroidok sorát további ritka lakton típusú vegyületekkel gazdagítottuk. Az A. reptansból izolált ekdiszteroidok közül négy komponens (1-4) szerkezetében található laktongyűrű, amely a 26-os helyzetű karboxil csoport és a 22-es vagy 23-as hidroxi csoport között alakul ki. A 24-dehidropreciaszteron (1) hattagú, a reptanszlakton A és B (2-3), továbbá a brevifloraszteron (4) öttagú gyűrűt tartalmaz. A laktongyűrűs ekdiszteroidokat korábban az Ajuga fajok specifikus vegyületeinek tartották, de mára kiderült, hogy más növények, például a Cyathula, Leuzea és Silene nemzetség tagjai is bioszintetizálnak ilyen komponenseket. Az oldalláncban gyűrűs étert vagy félacetált tartalmazó ekdiszteroidok A gyűrűs éter csoportot tartalmazó ekdiszteroidok a gombák jellegzetes vegyületei, de a növényvilágban a Lamiaceae család képviselőiből (Ajuga macrosperma, A. nipponensis, Vitex canescens), Polypodium fajokból és a 7

9 Serratula wolffiiból is kimutattak ilyen szerkezetű ekdiszteroidokat. Az általunk izolált vegyületek közül a sidaszteron (13) és a sidaszteron származékainak oldallánca (14-15) a 22-es és a 25-ös helyzetű hidroxi csoporton keresztül alkot étergyűrűt A sidaszteron meglehetősen gyakran előfordul a növényekben, származékai viszont ritkák. A 20- deoxisidaszteron (15) új természetes vegyület, amelyet korábban szintézissel állítottak elő 20-hidroxiekdizonból. Az indás ínfűből izolált szendreiszteron (5), ill. az édesgyökerű páfrányból izolált polipodoszaponin (17) és annak metilszármazéka (18) gyűrűs acetál szerkezeti részt tartalmaz az oldalláncban. Ezek a vegyületek az A. nipponensisből ismert ajugacetálszteron A-hoz hasonló szerkezetű ekdiszteroidok. C-5 helyzetben hidroxileződött ekdiszteroidok Az édesgyökerű páfrány kivonatából izolált komponensek között számos olyan ekdiszteroid található, amely 5-ös helyzetű hidroxi csoportot tartalmaz. A hidroxilezett ekdiszteridok és alapvegyületeik együttes előfordulása a növényben igazolja azt a korábbi feltevést, miszerint a hidroxileződés végső lépése az ötös szénatomon zajlik le. Az általunk izolált hidroxilezett vegyületek közül a 9-es jelzésű új, természetes anyag, amely minor komponensként a páfrányban nagy mennyiségben előforduló ekdizon kísérő vegyülete. Epimer vegyületek A 3-epi-22-dezoxi-20-hidroxiekdizon (20) és a 3-epi-sidaszteron (21) a 3αhidroxi csoportot tartalmazó ekdiszteroidok csoportjába tartozik. Eddig 21 ilyen komponenst azonosítottak, ami a több mint 350 ismert ekdiszteroid töredékét képezi. Jelenlétük a növényekben szokatlannak számít, bioszintézisük főként a rovarokban megy végbe. A 3-epi-ekdiszteroidokkal szemben a 14-, 22- és 25-epi-származékok csak a növényekben találhatók meg. 8

10 Biológiailag aktív vegyületek kinyerése Kutatásaink igazolták, hogy mindhárom vizsgált növényfaj értékes forrása olyan szokatlan szerkezetű, ritka ekdiszteroidoknak, amelyek az oldalláncban öt- vagy hattagú gyűrűt képeznek. A gyűrűs szerkezet lehet lakton-, éter- vagy félacetál csoport. Ezek szerkezeti újdonságuk miatt fontosak szerepet töltenek be a szerkezet-hatás összefüggések vizsgálatánál. Néhány komponens biológiai aktivitását zöldborsó levéltetű [Acyrtosiphon pisum (Harris)] rovartesztrendszerben vizsgáltuk. A brevifloraszteron (4) kiemelkedő aktivitással rendelkezett (LC 50 = 3,65), míg a reptanszlakton B (3) (LC 50 = 78,81) és a szendreiszteron (5) (LC 50 = 95,14) alacsony aktivitásúnak bizonyult. A 4-es vegyület kiemelkedő aktivitása a komponens oldalláncának viszonylag alacsony polaritásával és könnyebb receptorkötődésével magyarázható, szemben a 3-as vegyülettel, amely több hidroxi csoportja révén polárisabb. Az 5-ös komponens csökkent aktivitása polaritásán kívül az oldalláncban levő gyűrűn elhelyezkedő nagyobb térigényű szubsztituenseknek (metoxi, etil), és így gyenge receptorkötődési affinitásának tulajdonítható. 9

11 Köszönetnyilvánítás Mindenekelőtt köszönetemet szeretném kifejezni Dr. Báthori Mária professzorasszonynak munkám folyamatos irányításáért, támogatásáért, és disszertációm elkészítéséhez nyújtott segítségéért. Köszönettel tartozom Dr. Máthé Imre professzor úrnak a Farmakognóziai Intézet korábbi, és Dr. Hohmann Judit professzorasszonynak, az intézet jelenlegi vezetőjének, hogy lehetőséget biztosítottak munkám elvégzéséhez. Külön köszönet illeti Dr. Szendrei Kálmán professzor urat értékes tanácsaiért, józan és pontos meglátásaiért. Köszönettel tartozom Dr. Cservenka Juditnak, Kóródi Blankának, Sulyok Józsefnek és Dr. Polgár Lászlónak a növénygyűjtésben nyújtott segítségéért. Köszönetemet fejezem ki társszerzőimnek: Dr. Tóth Gábornak, Dr. Simon Andrásnak és Dr. Béni Zoltánnak az NMR mérések elvégzéséért és kiértékeléséért, Dr. Kele Zoltánnak és Dr. Dékány Miklósnak a tömegspektrometriai vizsgálatokért, és Dr. Fekete Gábornak a rovarhormon-aktivitási vizsgálatokért. Hálával tartozom Hevérné Herke Ibolyának, akinek kiemelkedő laboratóriumi tapasztalata komoly segítségnek bizonyult izolálási munkám során. Köszönöm továbbá a laboratóriumban dolgozó munkatársaimnak, Dr. Hunyadi Attilának, Dr. Liktor-Busa Erikának, Dr. Tóth Noéminek, Dr. Dankó Balázsnak és Dr. Ana Martinsnak, segítségüket és támogatásukat. Köszönöm mindazoknak, akik időt és fáradságot nem kímélve átolvasták disszertációmat gépelési és szerkesztési hibák után kutatva. A Farmakognóziai Intézet minden munkatársának köszönöm a munkámhoz nyújtott segítséget és a kiegyensúlyozott, jó munkahelyi légkört. Köszönöm a Richter Gedeon Centenáriumi Alapítvány nagylelkű anyagi támogatását. Végül, de nem utolsósorban köszönöm családom szerető támogatását. 10

12 Az értekezés alapjául szolgáló közlemények I. Ványolós A, Báthori M New perspectives in the analysis of ecdysteroids: a promising group of biologically active compounds. Curr. Pharm. Anal. 4: If: II. Ványolós A, Simon A, Tóth G, Polgár L, Kele Z, Ilku A, Mátyus P, Báthori M C-29 ecdysteroids from Ajuga reptans var. reptans. J. Nat. Prod. 72: If: III. Simon A, Ványolós A, Béni Z, Dékány M, Tóth G, Báthori M Ecdysteroids from Polypodium vulgare L. Steroids 76: If: IV. Ványolós A, Béni Z, Dékány M, Simon A, Báthori M Novel ecdysteroids from Serratula wolffii. ScientificWorldJournal (közlés alatt). If: Előadások az értekezés témájában Ványolós A, Simon A, Béni Z, Dékány M, Báthori M. Az édesgyökerű páfrány (Polypodium vulgare L.) ekdiszteroidprofiljának vizsgálata. MGYT Gyógynövény Szimpózium, május 5-7., Szeged. Ványolós A, Simon A, Tóth G, Báthori M. Ajuga reptans var. reptans: egy új ekdiszteroidforrás a növényvilágból. MTA Szteroidkémiai Munkabizottság Előadóülése, Szeged, november 27. Ványolós A. Sztigmasztánvázas ekdiszteroidok új képviselői az indás ínfűből. Magyar Tudomány Ünnepe, MTA SZAB Gyógyszerészeti Szakbizottság és Műszaki Szakbizottság, Szeged, november

13 Ványolós A, Simon A, Ilku A, Báthori M. Ritka, sztigmasztánvázas ekdiszteroidok új képviselői az Ajuga reptans var. reptansból. Lippay János Ormos Imre Vas Károly Tudományos Ülésszak, Budapest, október Ványolós A. Ritka C-29 ekdiszteroidok új képviselői az Ajuga reptans var. reptansból. IX. Clauder Ottó Emlékverseny, Budapest, április