Tejsav enzimatikus észterezése ionos folyadékokban és szuperkritikus szén-dioxidban

Átírás

1 PANNON EGYETEM VEGYÉSZMÉRNÖKI- ÉS ANYAGTUDOMÁNYOK DOKTORI ISKOLA Tejsav enzimatikus észterezése ionos folyadékokban és szuperkritikus szén-dioxidban DOKTORI (Ph.D.) ÉRTEKEZÉS TÉZISEI KÉSZÍTETTE: Németh Gergely OKLEVELES KÖRNYEZETMÉRNÖK TÉMAVEZETŐ: Dr. Gubicza László EGYETEMI TANÁR PANNON EGYETEM BIOMÉRNÖKI, MEMBRÁNTECHNOLÓGIAI ÉS ENERGETIKAI KUTATÓ INTÉZET 2013.

2

3 ELŐZMÉNYEK, CÉLKITŰZÉSEK A vegyipari folyamatok átalakítása és a hulladékprobléma megoldása érdekében a megújítható/megújuló nyersanyagok felhasználása egyre elterjedtebb. Ilyen széles körben alkalmazott alapanyagok a tejsav és észterei, melyeket az élelmiszeripar konzerválószerként, aromaanyagként, emulgeálószerként alkalmaz, továbbá a gyógyszeripar és kozmetikai ipar is felhasználja, valamint a biológiailag lebomló polimerek előállítása során is alapanyagként szolgál. Doktori témámban vizsgált reakció a kémiai szintézissel előállított racém tejsav etanollal történő enantioszelektív észterezése, melyhez kétféle lipáz enzimet (Candida antarctica lipáz B, Candida rugosa) alkalmaztam különféle oldószerekben és reakciókörülmények között. A felhasznált oldószerek (ionos folyadékok, szuperkritikus CO 2 ) olyan környezetbarát vegyületek, melyeknek az a jellemzőjük, hogy összetételük vagy a reakciókörülmények változtatásával befolyásolhatók az oldószertulajdonságaik. Az említett reakció enantioszelektivitásának vizsgálata teljesen új kutatási terület, melyről még csak minimális irodalmi adat áll rendelkezésre. Célom az volt, hogy meghatározzam azokat az optimális reakciókörülményeket, melyek mellett az észterhozam és az enantiomertisztaság is maximális értéket mutat, ezzel egy olyan technológiához alapokat nyújtani, mellyel megfelelő (L)- és (D)-tejsav arányú elegyet előállítva biológiailag lebontható műanyag alapanyagához jutunk. A számos reakcióparaméter közül a hőmérséklet, a szubsztrátfelesleg és a kezdeti víztartalom hatásait vizsgáltam különböző konvencionális és nem konvencionális oldószerekben.

4 KÍSÉRLETI MÓDSZEREK Rázatott lombikos kísérletek során vizsgáltam különböző konvencionális közegekben és ionos folyadékokban olyan paraméterek hatását, melyek nagyban befolyásolják a lipázok működését. A paraméterek hatását a későbbiekben nagynyomású reaktorban követtem nyomon, ahol szuperkritikus szén-dioxidban és szuperkritikus szén-dioxid/ionos folyadék rendszerben zajlott a reakció. A reakció során képződött vizet zeolit hozzáadásával rázatott lombikos kivitelben, valamint pervaporációs berendezéssel távolítottam el. A legkedvezőbb paraméterkombináció mellett mért enantiomerfelesleg értékét az (L) > (D)-észterből visszakapott tejsav újbóli reakcióba vitelével növeltem. TÉZISPONTOK A Ph.D. kutatómunkám során elért új tudományos eredményeket az alábbi 7 tézispontban fogalmaztam meg: 1. Enantioszelektivitás és hozam szempontjából vizsgáltam a tejsav enzimes észterezését különböző közegekben. A szakirodalomban fellelhető eredmények között az enzimes tejsavészterezés enantioszelektivitásának vizsgálata teljesen új terület, melynek vizsgálatáról nem állnak rendelkezésre adatok. Megállapítottam, hogy n-hexánban és oldószermentes (etanolfelesleg) közegben a tejsav etil-észter enzimes (Candida antarctica lipáz B) előállítása során kismértékű enantioszelektivitás mérhető. n-hexán esetében monomer tejsavra vonatkoztatva a legnagyobb hozam 55%, az enantiomerfelesleg 20%, oldószermentes közegben pedig 81% illetve 22% volt, mindkét esetben 24 óra reakcióidő után.

5 A továbbiakban 10 Cyphos-típusú ionos folyadékot vizsgáltam enzim nélküli tejsav észterezéses reakcióban, és megállapítottam, hogy közülük 5 rendelkezik elegendően alacsony katalitikus aktivitással ahhoz, hogy felhasználhatók legyenek enzimes reakciók oldószereként. A kisebb katalitikus aktivitással rendelkező ionos folyadékok a 30 C-on mért hozammal: Cyphos 103: 9% Cyphos 104: 13% Cyphos 105: 6% Cyphos 109: 34% Cyphos 110: 26% Oldószermentes közegben: 2% Mérésekkel igazoltam, hogy az öt ionos folyadék közül a Cyphos 104 trihexiltetradecil-foszfónium-bisz (2,4,4-trimetilpentil) foszfinát a legalkalmasabb közeg tejsav és etanol enantioszelektív reakcióinak kivitelezéséhez. A kísérlettervezés kiértékelése során megállapítottam, hogy a három paraméter mért intervallumaiban a legnagyobb hozam és enantioszelektivitás 30 C-on, 11-es alk/ts arány és 8 m/m%-os kezdeti víztartalom mellett érhető el y=56%, e.e.=22%-os értékekben, 50%-os hozamnál az e.e.=23%. (1. publikáció) 2. Méréseim igazolták, hogy a Candida antarctica lipáz B nagyobb aktivitást és enantioszelektivitást mutat a vizsgált körülmények között, mint a Candida rugosa. 4 reakcióparaméter (hőmérséklet, kezdeti víztartalom, alk/ts arány, IL/alk mennyisége) változtatása mellett hasonlítottam össze a két enzimet. CALB-bal szinte valamennyi paraméterkombináció mellett nagyobb hozamot értem el, enantioszelektivitás esetében pedig egyértelműen CALB esetében mértem nagyobb e.e. értékeket 24 óra reakcióidő után. (4. publikáció)

6 3. A szuperkritikus CO 2 -ban és scco 2 /IL rendszerben folytatott mérések eredményeiből megállapítottam, hogy a tejsav etanollal történő észterezése 100% feletti hozamot is elérhet, miközben az enantioszelektivitás kicsi marad. A hőmérséklet értékét 35, 50 és 75 C-on, a nyomást pedig 100, 200, 300 bar-on vizsgálva megállapítottam, hogy a scco 2 mellé Cyphos 104-es ionos folyadékot adagolva pozitív hatást figyelhető meg a vizsgált észterezésre. Ionos folyadék nélkül csak magas hőmérsékleten mérhető 100% feletti hozam ( %), az enantiomerfelesleg értékei pedig ezzel ellenkező módon, alacsony hőmérsékleten mutattak 21-27% közötti értékeket nagyobb nyomás mellett 1 óra reakcióidő után. Ionos folyadékos közegben már 30 C-on is mértem 120%-os hozamot, ennek ellenére az enantiomerfelesleg értékei nem mutattak növekvő tendenciát az ionos folyadék nélküli rendszerhez képest. Az ionos folyadékban és scco 2 -ban végzett kísérletek eredményeit összehasonlítva megállapítottam, hogy Cyphos 104-es ionos folyadék közegében és CALB enzim használatával érhető el a legnagyobb hozam és enantiomerfelesleg. (2. publikáció) 4. A hőmérséklet, az alk/ts arány, a kezdeti víztartalom és a Cyphos 104 IL/alk arány optimális értékeit meghatározva megállapítottam a reakció maximális hozamát és enantioszelektivitását CALB enzim használata mellett. Kimutattam, hogy az optimális értékeket az enzim működéséből adódóan a következő intervallumokon kívül nem indokolt mérni: C, 3-19-es alk/ts arány, 2,5-16 m/m% kezdeti víztartalom, 0-2 IL/alk arány. Meghatároztam, hogy az adott mérések során a legjobb eredmények 30 C-on, 11-es alk/ts arány, 4 m/m%-os kezdeti víztartalom és 1-es IL/alk arány mellett érhetők el (y=77%, e.e. 1h =38%, e.e.(y=50%)=30%). (4. publikáció) 5. Bebizonyítottam, hogy a vízeltávolítás a hozamon kívül az enzim enantioszelektivitását is csökkentette a tejsav enantioszelektív észterezésekor. A vizsgálatok során a képződött vizet zeolittal (4Å) és pervaporációval (PERVAP 2201) távolítottam el a reakcióelegyből. Zeolit alkalmazásakor a referenciaeleggyel összehasonlítva [y=92%, e.e.(y=50%)=30%] 86% és 80%-os hozamot illetve 24% és 25%-os e.e. értékeket (y=50%-nál) értem el 48 órás reakcióidő után. Pervaporáció esetében 5 óra reakcióidő elteltével a hozam 22%-os volt, mely megegyezik a referenciaelegynél mért értékkel, az e.e. érték pedig 26% volt (referenciaelegy e.e.=34%). (3. publikáció)

7 6. Elméleti számításokkal és mérésekkel bizonyítottam, hogy az egyszeri reakció során kapott enantiomerfelesleg értéke nagymértékben növelhető a termékből visszanyert szubsztrát újbóli reakcióba vitelével. A meghatározott optimális paraméter értékek mellett a megváltozott enantiomer arányú termékből visszanyerhető kiindulási anyag (tejsav) újbóli reakciójával tovább növeltem az enantiomerfelesleg értéket. Három módszer közül 24 órás reakciók ill. 50%-os és 30%-os hozam utáni visszaforgatás az 50%-os hozam utáni módszerrel értem el a legjobb eredményeket. Ebben az esetben a legkisebb a visszaforgatások száma, ezáltal a várható költségek (4x, e.e.=79%). (4. publikáció) 7. Meghatároztam az enzim dezaktiváció mértékét Cyphos 104-es ionos folyadékban, és igazoltam az ionos folyadék enzimstabilizáló hatását. A hatás abban mutatkozott, hogy ötszöri újrafelhasználás után is nagyobb aktivitást mértem, mint ionos folyadék nélkül. Ionos folyadék közegében a kezdeti 77%-os hozam 5 újrahasználat után 20%-ra csökkent. Az ionos folyadék nélküli reakcióban a hozam 50%-ról 9%-ra csökkent az ötödik visszaforgatás után. (4. publikáció) KAPCSOLÓDÓ PUBLIKÁCIÓK A DOLGOZAT ALAPJÁUL SZOLGÁLÓ PUBLIKÁCIÓK 1. Findrik, Z., Németh, G., Gubicza, L., Bélafi-Bakó, K., Vasić-Rački, Đ.: Evaluation of factors influencing the enantioselective enzymatic esterification of lactic acid in ionic liquid, Bioprocess and Biosystems Engineering 35 (2012) IF=1, Knez, Ž., Kavčič, S., Gubicza, L., Bélafi-Bakó, K., Németh, G., Primožič, M., Habulin, M.: Lipase-catalyzed esterification of lactic acid in supercritical carbon dioxide, Journal of Supercritical Fluids 66 (2012) IF=2, Findrik, Z., Németh, G., Vasić-Rački, Đ., Bélafi-Bakó, K., Csanádi, Zs., Gubicza, L.: Pervaporation-aided enzymatic esterifications in non-conventional media, Process Biochemistry 47 (2012) IF=2, Németh, G., Bélafi-Bakó, K., Nemestóthy, N., Gubicza, L.: Asymmetric lactic acid esterification with biocatalysts in ionic liquid, Hungarian Journal of Industrial Chemistry, 39 (2012)

8 HASONLÓ TÉMÁBAN MEGJELENT PUBLIKÁCIÓK Major, B., Németh, G., Bélafi-Bakó, K.,: Unique role of water content in enzymatic synthesis of ethyl lactate using ionic liquid as solvent, Chemical Papers 64 (2010) Németh, G.: Zöld oldószer, lebomló műanyag, Élet és Tudomány 40 (2011) EGYÉB PUBLIKÁCIÓK Németh, G., Reich, K., Fazekas, B., Pitás, V., Kárpáti, Á., A rothasztott szennyvíziszap nehézfém-tartalmának csökkentési lehetősége, Hírcsatorna 3 (2009) Pitás, V., Németh, G., Reich, K., Fazekas, B., Biofilm hordozó hatása biofilmes/hibrid reaktorok működésére, Műszaki Információ. Környezetvédelem, 6 (2009) ANGOL NYELVŰ ELŐADÁSOK ÉS POSZTEREK Gubicza, L., Bélafi-Bakó, K., Csanádi, Zs., Németh, G.: Microwave assisted enzymatic esterification of lactic acid in phosphonium type ionic liquids, EUCHEM 2010, Conference on Molten Salts and Ionic Liquids, Bamberg, Németország, március , pp. 149., poszter Nemestóthy, N., Németh, G., Csanádi, Zs., Gubicza, L.: Continuous enzymatic esterification in pervaporation-aided system using ionic liquids as solvent, International Scientific Conference on Pervaporation, Vapor Permeation and Mambrane Distillation, Torun, Lengyelország, április , pp. 86., poszter Németh, G., Nemestóthy, N., Findrik, Z., Gubicza, L.: Enantioselecive enzymatic esterification of lactic acid in ionic liquids, 37th International Conference of Slovak Society of Chemical Engineering, Tatranské Matliare, Szlovákia, május , pp , előadás Németh, G., Csanádi, Zs., Findrik, Z., Gubicza, L.: Investigation of the enantioselectivity of different lipase enzymes during the esterification of lactic acid in ionic liquid cosolvent, Applied biocatalysis, 6 th meeting of students and university professors, Zágráb, Horvátország, június 9., pp. 9., előadás Németh, G., Csanádi, Zs., Bélafi-Bakó, K., Gubicza, L.: Effect of ionic liquids' properties on the enantioselective esterification of lactic acid, 8 th European Symposium on Biochemical Engineering Sciences, szeptember 5-8., Bologna, Olaszország, pp. 193., poszter Németh, G., Kavčič, S., Nemestóthy, N., Habulin, M., Knez, Z., Gubicza, L.: Asymmetric esterification of low carbon atom number carboxylic acids in ionic liquid as a co-solvent, Slovenski kemijski dnevi 2010, szeptember , Maribor, Szlovénia, pp. 132., előadás Németh, G., Bélafi-Bakó, K., Gubicza, L.: Enzymatic enantioselective esterification of lactic acid with low carbon chain alcohols in ionic liquids, 7 th International Conference on

9 Renewable Resources and Biorefineries, június 8-10., Bruges, Belgium, pp. 13., poszter Németh, G., Habulin, M., Knez, Ž., Primožič, M., Gubicza, L.: Comparison of the enzymatic production of lactic acid ethyl ester in ionic liquid and supercritical CO 2, 2 nd Conference on Applied Biocatalysis and 7th Meeting of Students and University Professors from Maribor and Zagreb, Maribor, Szlovénia, november 7-8., pp. 49., előadás Németh, G., Findrik, Z., Vasić-Rački, D., Bélafi-Bakó, K., Gubicza, L.: Effect of ionic liquids on the enantioselectivity of Candida antarctica lipase B during lactic acid esterification, 9 th International Conference on Protein Stabilization, május 2-4., Lisszabon, Portugália, pp. 43., poszter MAGYAR NYELVŰ ELŐADÁSOK Gubicza, L., Németh, G., Csanádi, Zs., Bélafi-Bakó, K., Vrasalovic Presecki, A., Nemestóthy, N.: Enzimkatalitikus észterezés ionos folyadékokban, Veszprém, Műszaki Kémiai Napok, április , pp Németh, G., Bányai, T., Nemestóthy, N., Findrik, Z., Gubicza, L.: Tejsav enantioszelektív észterezése Cyphos 104 ionos folyadékban, Műszaki Kémiai Napok, Veszprém, április , pp Németh, G., Bányai, T., Nemestóthy, N., Findrik, Z., Gubicza, L.: Tejsav enantioszelektív észterezése Cyphos 104 ionos folyadékban, Műszaki Kémiai Napok, Veszprém, április , pp Gubicza, L., Németh, G., Csanádi, Zs., Bélafiné Bakó, K., Vrasalovic Presecki, A., Nemestóthy, N.: Enzimkatalitikus észterezés ionos folyadékokban, Műszaki Kémiai Napok, Veszprém, április , pp