Infravörös spektroszkópia. Semmelweis Egyetem Gyógyszerészi Kémiai Intézet

Átírás

1 Infravörös spektroszkópia Kökösi József Semmelweis Egyetem Gyógyszerészi Kémiai Intézet

2 Infravörös Spektroszkópia A molekula funkciós csoportjaiban zajló rezgési és rotációs változások információinak elemzése A molekulákban funkciós csoportok jelenlétét, jellegét, kölcsönhatásait jellemezhetjük az IR spektrumok alapján.

3 IR spektroszkópia rövid történeti áttekintése 1800 Herschel (napfény prizma hőmérők) 1845 ifj. Herschel (alkoholos koromréteg) Infravörös emulziók, bolométer 1908 Coblentz Első spektrumkatalógus 1927 Czerny Rotációs szinképek felfedezése 1950 Regisztráló spektrofotométerek Szerkezetkutatási módszer 1980 után FT-IR, Laser-FT-IR

4 Optikai Spektroszkópia Fotonok belépése Fotonok kilépése Kis energiájú fotonok Nem destruktiv Lineáris kölcsönhatás (absorption) vagy nem-linearis (Raman, harmonic generation) Fotonok kilépése

5 IR spektroszkópia abszorpciós és experimentális spektrális optikai analitikai módszer Anyag és fény kölcsönhatása szerkezeti információk Jelhozzárendelés statisztikailag valószínüsített értékhatárok alapján

6

7 Az elektromágneses spektrum jellemzői

8 Spektrális technikák és információs tartalmak Moleculáris szabad mozgás (gátolt rotációk) Molekuláris vibrációk Elektron Abszorpció Külső vegyértékelektronszintek (atomok) Belső elektronhéj szintek (atomok) Microhullám, THz Infravörös, Raman, EELS UV abszorpció UV photoemisszió Electron vesztés Látható Fluoreszcencia Luminescencia Röntgensugár fotoemisszió (XPS, ESCA) Auger Electron (AES)

9 Elektromágneses sugárzás közös egységei Infravörös tartomány: hullámhossz :1 mm- 700 nm Frekvencia : Hz

10

11

12 Elektronspinek gerjesztett elektron állapotokban Alapállapot két elektron egy orbitálon ellenkező spinnel Singlet állapot Egy elektron magasabb energiájú orbitálon egy elektron alacsonyabb energiájú orbitálon ellenkező spinekkel Triplet állapot Az elektronok mindkét orbitálon azonos spinekkel

13 Nem-radiativ folyamatok tulajdonságai S 2 -S 1 belsö konverzió gyors és spin megengedett S 1 -T 1 belső rendszerek közötti kereszt átlépés spin tiltott S 1 -S 0, T 1 -S 0 Vibrációs relaxáció gyors, az energia hö formában eloszlik.

14 Infravörös spektroszkópia: Vibrációs átmenetek Alapállapot Minden rezgési módra jellemzö V=0 V=1 alap hullámsáv V=0 - V=2,3 felhang sávok

15 Felhangsávok Erös, intenzív sávok mutatnak felhangsávokat A bázis csúcs általában háromszor intenzivebb Felhang Bázis csúcs

16 Kvantummechanika: A frekvencia ( ) függ a vibrációs szintek közti energiakülönbségtől E = h = hc/ (cm -1 ) Csak a naturalis frekvencia abszorbeálódik (9 x s -1 ) frekvenciájú foton abszorbeálódik szelectíven

17 Analitikai Infravörös Spektroszkópia A leghasználhatóbb infravörös régió mm ( cm-1) (~10 kcal/mol=~40 kj/mol). Vibrációs energiaállapotok közötti átmenetek Vegyérték (stretching) rezgések Deformációs (bending) rezgések

18 CH 2 csoport vegyérték rezgései Szimmetrikus Antiszimmetrikus

19 CH 2 csoport deformációs rezgései síkban síkon kívül

20

21 Standard IR spektrumok Két fontos parametere :A jel frekvenciája, A jel intenzitása, I Milyen molekulaszerkezeti sajátságoktól függ a and I értéke?

22 IR: Korpuszkulum modell A kétatomos molecula atomjait mint pont tömegeket hajlékony rugók kötik össze. Mint elsö megközelités használható a Hooke Törvény F = -kx F = erö,az egyensúlyi pozíció eléréséhez szükséges k = karakterisztikus vegyérték konstans x = elmozdulás az egyensúlyi pozícióból

23 Rezgések, potenciális energia és elmozdulás

24 IR kötési frekvencia két atom között Milyen tényezők befolyásolják,, értékét? Hooke Törvény 1 2 k m r m r m 1 m 2 m 1 m 2 = frekvencia k = kötéserösség (kötés merevsége) m r = redukált tömeg

25 A kötésrend korreláció a vegyérték rezgési frekvenciákkal és a kötési energiákkal Kötéserő* Kötésrend C-C cm -1 C=C cm -1 C C cm -1 * kj/mol Azonos redukált tömeg

26 Szubsztituált cianidok IR sávjai _ X C C=N = (cm -1 ) _

27 Az abszorpciós jelek intenzitása Az abszorpció intensitása attól függ, hogy milyen hatásfokkal képes frekvenciájú electromágneses hullám energiáját transferálni rezgésben lévő atomra. Nagyobb változás a dipólmomentumban a vibráció során, a foton abszorpciójának nagyobb intenzitását indukálja.

28 Molekuláris rezgések száma N szabad atom: 3N független mozgás = 3N szabadsági fok Molekula: N kötött atom 3 transláció 3 rotáció 3N = 3N - 6 a vibrációs szabadságfok szám

29 Acetonitril 3 x 6-6 = 12 a vibrációs szabadságfokok száma Maximum 12 vibrációs abszopció az IR spektrumban 5 kötés = 5 vegyértékrezgés 12-5 = 7 deformációs rezgés

30 Folyamatos hullámú Infravörös Spektrofotométer -A spectrofotométer átfogja az egész frekvencia tartományt -A mintát egyidejüleg egy frekvencián vizsgálja -A teljes frekvenciatartomány átvizsgálása után generálja a frekvencia-intenzitás jelgörbét.

31

32 FourierTranszformációs Spektrofotométerek -A minta egyidejüleg kölcsönhat az egész frekvenciatartománnyal -- -A szignál csillapodását követi idöben, FID (Free Induction Decay) szignálként veszi fel, és Fourier tranform eljárással alakitja a szignál-idő görbét a hagyományos szignál-frekvencia görbévé.

33 Keskeny éles sávok Jel / zaj arány nő Nagyszámú scan Rövid felvételi idő: CW-IR 5-7 perc FT-IR 1-3 sec

34 Interferogram IR Spektrum

35

36 IR Gas Sample Cell

37 IR folyadékfilm minta készítése

38

39 IR Folyadékminta Cellák

40 KBr pasztilla sajtolása

41 KBr pasztilla készítő felszerelés

42 Infravörös tartományban használatos anyagok mérési tartománya NaCl 625 KBr 385 CsBr 250 CsCl 200 ZnS 357 TiCl 250 AgBr 286 BaF2 759 CaF SiO2 2500

43 IR készülék kalibrálása

44

45 Infravörös spektroszkópia Elönyök Hátrányok 1.Gyors, olcsó, egyszerü technika 2. Minden halmazállapotban használható (gáz, folyadék, szilárd) 3. Kis anyagmennyiség 4. Sokrétű Információ 5. Kvalitativ és kvantitativ célokra 6. Biológai kölcsönhatásokra 1. Frekvencia függő Érzékenység 2. Pontosság 3. Reprodukálhatóság 4. Információ szeparálás 5. Mintaelökészítés 6. Felvételi körülmények

46 Funkciós csoport koncepció a szerves kémiában Karakterisztikus kötési és csoportfrekvenciák IR spektroszkópia a funkciós csoportokat azonosítja!

47 Infravörös spektrumok kiértékelési stratégiája Kvalitativ analizis, szerkezetfelderítés 1. Hagyományosan az intenziv és közepes abszorpciós jelek asszignációja korrelációs táblázatok rezgési intervallumainak alkalmazásával Csatolt adatbázisok alapján számitógépes értékelés %-os valószinüségi sorrend 2. Spektrumok kiértékelése balról jobbra halad (vegyértékrezgéseket azonositunk és ezekhez keressük meg a megfelelő deformációs rezgéseket.) cm -1 tartományban az O-H, N-H, C-H vegyértékrezgések asszignálása (1 széles jel OH, kettös maximum NH2, 3000cm -1 felett telitetlen CH, alatt alifás CH) cm -1 H-C=O aldehid jel elkülönül cm -1 COOH diffuz sáv, HCl-sók, S-H, Hármas és kumulált C=C=X cm-1 C=X kettös kötések azonositása (-650)cm-1 ujjlenyomat tartomány (vegyérték, deformációs és csoport sáv) 8. Kis intenzitású sávok vizsgálata (kombinációs és felhangsávok) 9. Azonositott funkciós csoportok közötti kapcsolatok vizsgálata (konjugált, asszociált) 10. Molekuláris kölcsönhatások elemzése

48 Infravörös Absorpciós Frekvenciák Szerkezeti egység Frekvencia, cm -1 Vegyértékrezgések (X-H) O H (alkoholok) O H (karbonsavak) N H

49 Infravörös Absorpciós Frekvenciák Szerkezeti egység Frekvencia, cm -1 Vegyértékrezgések(egyes kötések) sp C H sp 2 C H sp 3 C H sp 2 C O 1200 sp 3 C O

50 Infravörös Absorpciós Frekvenciák Szerkezeti egység Frekvencia, cm -1 Vegyértékrezgések(töbszörös kötések) C C C C C N

51 Infravörös Absorpciós Frekvenciák Szerkezeti egység Frekvencia, cm -1 Vegyértékrezgések (Karbonilcsoportok) Aldehidek and ketonok Karbonsavak C O Savanhidridek and Észterek Amidok

52 Infravörös Absorpciós Frekvenciák Szerkezeti egység Frekvencia, cm -1 Deformációs rezgések : alkenek RCH R 2 C CH 2 CH cis-rch trans-rch CHR' CHR' R 2 C CHR'

53 Infravörös Absorpciós Frekvenciák Szerkezeti egység Frekvencia, cm -1 Deformációs rezgések : benzol származékok Monosubsztituált and Orto-disubsztituált Meta-disubsztituált and Para-disubsztituált

54 Néhány fontos és karakteristikus Infravörös Absorpciós Frekvencia and hullámhossz közös vegyértékrezgési mozgásokra Atom Csoport Funkció Frekvencia (cm -1 ) Hullámhossz (m) O-H (szabad) Alcohols (dilute) cm m O-H (H kötés) Alcoholok cm m (koncentralt) Karbonsavak C C H Acetylen (CH) 3300 cm m C C H Benzol (CH), cm m Etilén (CH) C C H Etán (CH) cm m C C Acetilén cm m C N Nitrilek cm m C O Karbonil cm m C C Alken cm m C C Alkan cm m C O Alcoholok, Éterek cm m Általában csak azokat az IR spektrum vegyértékrezgési adatokat használjuk,amelyek energiája magasabb mint 1620 cm -1. Az 1620 cm -1 alatti régióban az egyes kötésű vegyértékrezgéseket (ld. C-C and C-O táblázat.) és a C-H deformációs rezgéseket szoktuk asszignálni.

55 Hexan Infravörös Spectruma C H vegyértékrezgés Deformációs rezgés Def. r. Def. r. CH 3 CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 CH Hullámszám, cm -1 Francis A. Carey, Organic Chemistry, Fourth Edition. Copyright 2000 The McGraw-Hill Companies, Inc. All rights reserved.

56 Infrared Spectrum of 1-Hexene C=C H H C C=C H 2 C=C H 2 C=CHCH 2 CH 2 CH 2 CH Wave number, cm -1 Francis A. Carey, Organic Chemistry, Fourth Edition. Copyright 2000 The McGraw-Hill Companies, Inc. All rights reserved.

57 Infrared Spectrum of 2-Hexanol H C O H CH 3 CH 2 CH 2 CH 2 CHCH 3 OH Wave number, cm -1 Francis A. Carey, Organic Chemistry, Fourth Edition. Copyright 2000 The McGraw-Hill Companies, Inc. All rights reserved.

58 Infrared Spectrum of 2-Hexanone CH 3 CH 2 CH 2 CH 2 CCH 3 H C O C=O Wave number, cm -1 Francis A. Carey, Organic Chemistry, Fourth Edition. Copyright 2000 The McGraw-Hill Companies, Inc. All rights reserved.

59 Infrared Spectrum of tert-butylbenzene Ar H C 6 H 5 C(CH 3 ) 3 H C Monoszubsztituált benzol Wave number, cm -1 Francis A. Carey, Organic Chemistry, Fourth Edition. Copyright 2000 The McGraw-Hill Companies, Inc. All rights reserved.

60 Vegyérték rezgés Deformációs rezgés

61 Vegyérték rezgés Deformációs rezgés

62 Vegyérték rezgés Deformációs rezgés

63 Vegyérték rezgés Deformációs rezgés

64 Vegyérték rezgés Deformációs rezgés

65 Calculated IR bands for CH 2 in formaldehyde Formaldehyde spectrum from: d.htm#ir2 Results gene rate d using B3LYP//6-31G(d) in Gaussian 03W.

66 Infravörös spektrószkópia a gyakorlatban Szerveskémiaszerkezetfelderítés funkcióscsoport meghatározás tautoméria vizsgálata szerves reakciók követése szilárdfázison lejátszódó reakciók követése kombinatorikus kémia konformációs egyensúlyok vizsgálata

67 Lehetöségek és korlátok IR spektrum egyedül nem határozza meg a szerkezetet Néhány szignál bizonytalan lehet A funkciós csoportok általában kimutathatók A szignálok jelenléte határozott bizonyiték a funkciós csoport jelenlétére Ismert minta IR spektrumával való megegyezés a vegyület azonosságát igazolja

68 IR a gyakorlatban: Példák Redox átalakulások C=O COOR CONHR CN C=NR C=NOH NO 2 CH 2 -OH CH 2 NHR Spektrumváltozás 1725cm cm cm cm cm cm cm -1

69 Keto-enol tautomer egyensúly (acetilciklohexanon)

70

71 Infravörös spektrószkópia a gyakorlatban Gyógyszerkémia- Azonosítás gyógyszerkönyvi leírások Stabilitási vizsgálatok (hömérs. nedvesség..) Hatóanyag segédanyagok kölcsönhatása Kristályformák, hidrátok, szolvátok Micronizáció (kristály-amorf arány) Gyógyszerkioldódás Polimerhordozók (Folding, ionizáció..) Felszínen kötött szubsztrátok vizsgálata Metabolikus folyamatok vizsgálata Szerkezet-hatás kapcsolatok elötesztelése

72 Azonositás 72

73 Azonositás 73

74 Azonositás 74

75 Azonositás 75

76 IR azonosítás tablettában atorvastatin calcium (Lipitor) FT-IR FT-Raman 76

77 Lorazepam tabletta IR jellemzése lorazepam standard (vörös spektrum) 0.5mg lorazepam tabletta (kék spektrum) 77

78 Azonositás kapszula 78

79 L-efedrin IR-spectruma D-pszeudoefedrin IR-spectruma 79

80 1.8mg GC-FTIR Azonositás Biológiai közegből 0.032mg 80

81 Penicillin bomlástermékek IR jellemzése 3401 and 3196 (br and s), 2935(m) CH3 stretch; 1715(m) C O stretch (carboxyl); 1652(s) C O stretch (amide); 1602, 1510(s) C C and C N stretch; 780(m) C Cl stretch, 732(m) C H out of plane bend. FT-IR absorption frequencies (cm 1): 3269 (br) NH stretch; 3072 Aryl CH stretch; 2982, 2936 CH3 and CH2 stretch; 1732 C O stretch of COOH; 1669 C O stretch (amide); 1607; 1532 C C and C N; 784(m) C Cl stretch FT-IR absorption frequencies (cm 1): 3397(m) NH stretch; 3086 Aryl CH stretch; 2972, 2933 CH3 stretch; 1735 C O stretch of COOH; 1659 CONH; 1603; 1518, 1432 C C and C N; 780(m) C l stretch Európai Gyógyszerkönyv Fő bomlástermékek : impurity-i 530, impurity-ii 329 impurity-iii

82 Azonosítás és szennyezés IR jellemzése.. 82

83 Azonosítás és szennyezés IR jellemzése Xemilofiban stabilitása és bomlástermékei Bomlástermékek elválasztása HPLC Chiracel OD oszlopon 83

84 Kinolonok IR jellemzése O O OH H 3 C N N Nalidixsav CH 3 O O O OH O N Oxolinsav CH 3 84

85 Fluorokinolonok IR jellemzése IR Raman 85

86 86

87 87

88 IR a gyakorlatban: Példák Fizikai-kémia Molekula állandók kiszámítása (Atomtávolság, kötés eröállandók, vegyértékszögek, H-hidak, dipól-kölcsönhatások) Termodinamikai mennyiségek meghatározása (dh, ds, dg ) Izotóparányok meghatározása Izomer arányok vizsgálata Reakciókinetikai vizsgálatok Tautomer és konformációs viszonyok tanulmányozása Ipari termékek azonosságának és tisztaságának elemzése Szilárd és oldat egyensúlyok analizise

89 Polimorfia Klasszikus példák a polimorfiára -- Konformációs and konfigurciós polimorfia -- Szulfonamidok -- Steroidok -- Barbituratok -- Egyebek -- Szénhidrátok -- Polimorf antibiotikumok -- Polimorfia és kémiai stabilitás -- Polimorfia és biohozzáférhetöség -- Polimorfia és gyógyszerészeti alkalmazásai Hidrátok és Szolvátok Hidrátok - Képzödési körülmények- Hidrát levegőn: hidrátok stabilitása különbözö relativ nedvességtartalom mellett-- Deliquescence and efflorescence -- Szolvátképzödést befolyásolótényezök oldószerelegyekben -- Szerves szolvátumok stabilitása levegön -- Amorf szilárd anyagok tuladonságai

90 Carbamazepine polimorf módosulatai Carbamazepine (CBZ) 90

91 Polimorf analizis Dehydration of caffeine monohydrate NO 2 O CH 3 H 3 C N N O N N CH 3 91

92 Hidrátok IR jellemzése Diclofenac COOH NH Cl Cl 92

93 Polimorf analizis 93

94 Formulálási és drug delivery laborok Szerkezet tisztázása NMR spektroszkópia IR spektroszkópiák Egy kristály szerkezet meghatározás tömegspektroszkópia Fizikai jellemzés Röntgen por diffrakió (XRPD) optikai mikroszkópia differential scanning calorimetry (DSC) termogravimetria (TG) olvadáspont meghatározás nedvesség szorpciós/deszorpciós isotermák infravörös (IR) spektroszkópia Raman spektroszkópia szilárd-állapotú mag mágneses resonancia (NMR) spektroszkópia ultraibolya (UV)spektrum részecske méret eloszlás felületi felszín scanning elektron mikroszkópia Preformulálási Adatok Oldódási egyensúlyok ph oldhatóság pka meghatározás Log P Log D gyorsított fizikai and kémiai szilárd és oldat stabilitás 94

95 Amfetamin származékok IR jellemzése 95

96 Amfetamin származékok IR jellemzése O O R-NH 2 NaBH 4 O HN 96

97 Természetes eredetű extraktumok IR jellemzése 97

98 Infravörös spektroszkópia Elönyök Hátrányok 1.Gyors, olcsó, egyszerü technika 2. Minden halmazállapotban használható (gáz, folyadék, szilárd) 3. Kis anyagmennyiség 4. Sokrétű Információ 5. Kvalitativ és kvantitativ célokra 6. Biológai kölcsönhatásokra 1. Frekvencia függő Érzékenység 2. Pontosság 3. Reprodukálhatóság 4. Információ szeparálás 5. Mintaelökészítés 6. Felvételi körülmények

99 IR Kvantitativ analizis Lambert-Beer törvény E = lg I o / I = e.c.l e= abszorpciós koefficiens (cm 2 /g) c= koncentráció (g/cm 3 ) l= rétegvastagság (cm) Az abszorpciós koefficiens értéke hullámszámtól függ!

100 Kvantitativ analizis szempontjai Érzékenység hullámszámfüggö A legintenzivebb ill. legszelektívebb, átfedéstöl mentes sáv abszorpciós maximumán végezzük a méréseket. Igen hasonló szerkezetek Eltérö infravörös spektrumok Elegyek komponenseinek IR spektrumai összegezödnek. Egymás melletti mérés roncsolásmentes, gyors, egyszerű Kombinált IR spektroszkópia IR-kromatográfia (GC,TLC, HPLC, CE) IR- spektrális módszerek (MS, NMR, UV, Röntgen) Dinamikus IR-módszerek (Ipari folyamatok követése, komponensarányok egyidejű vizsgálata)

101 Kvantitativ analizis korlátai Túlságosan sávdús spektrumok A legfeljebb 3-4 komponensű elegy vizsgálható. Abszorpciós sávok intenzitása jelentősen eltér Nincs általánosan megadható érzékenység. Főkomponens pontossága 1-2 % Komponensek közötti kölcsönhatás Felvételi körülmények azonosságának biztositása Kombinált módszerek hibái összeadódnak. Referencia és standard anyagok biztosítása Módszervalidálás független módszerrel is!

102 IR spektroszkópia hibaforrásai Sugárzási veszteség (reflexió, szóródás ) Minta nem megfelelő szemcseméretei Minta inhomogenitás Készülék szórt fényének zavaró hatása Pontatlan rétegvastagság meghatározás Készülék instabil müködése Sávok átfedése Lambert-Beer törvénytöl való eltérés

103 Mérési eljárások az IR-spektroszkópiában Kompenzációs módszer Referencia sugárútba helyezett referencia anyaggal kompenzálunk Alapvonal módszer Spektrum kompezálatlan részét megfelelő kiértékeléssel küszöböljük ki Extinkciókülönbség módszere Két különböző hullámszámnál mért extinkció különbségét határozzuk meg Differenciál módszer Átfedő abszorpciós maximumok esetén a csúcsok jól elkülöníthetőek.

104 Standardok és belső standardok Standard (tiszta anyag, alkotó komponens) Kvalitativ azonositás, tisztaság Kvantitativ kalibrációs sorozat készítése Belső standard- (inert, független anyag) abszorpciós koefficiensek nem határozhatók meg. Intenziv abszorpciós sávú, de nem sávdús anyagok. Koncentráció % között legyen.

105 Megbízhatóság és pontosság

106 Térbeli feloldóképesség

107

108 Borok szerves savtartalmának analizise Fourier-transform infravörös spektroszkópiával Totál savtartalom : cm -1 Egyedi deformációs rezgések pl. citromsav : cm -1

109 Motorolajok zsiralkohol és zsirsavészter tartalmának meghatározása 3604 és 1743cm -1 értékeknél

110 110

111 111

112 Izomrostok collagén szerkezetének FT-IR vizsgálata 1,690 cm-1 (parallel β-sheets), ca. 1,680 cm-1 (anti-parallel β-sheets), ca. 1,668 cm-1 (β-turns), ca. 1,658 cm-1 (α-helix), ca. 1,647 cm-1 (unordered), 1,638 cm-1 (triple helix), ca cm-1 (parallel β-sheets), and ca. 1,612 cm-1 (β-turns).

113 Ancient biodeterioration: an FT Raman spectroscopic study of mammoth and elephant ivory

114 Fourier transform infrared imaging of osteoarthritis

115 Biohatárfelületek FTIR jellemzése Biomolekulát csatoló linker (pl.. antitest) immobilizálása Szilikon szubsztráton MPS models a tiny antibody!

116 Karbamid csatolás követése

117 Szukcinimid képzödés (evidencia tioéter kötés kialakulására)

118 Attenuated Total Reflection (ATR) Multiple internal reflection: IR in IR out In-situ wet chemistry/electrochemistry contact IR in liquid out electrodes IR out liquid in Multiple internal transmission: (Handbook of Vibrational Spectroscopy, Wiley, Vol.1, p. 1117, 2002) IR in IR out Buried interface

119 Klinikai kémia reagensek nélkül? IR technika klinikailag relevans testfolyadék komponensek meghatározására

120 Nem invázív glukózmérés

121 Infravörös diagnosztika Testfolyadékok analizise Karbamid, kreatinin, protein, aceton, tejsav Termográfia Pl. Gyulladásos folyamatok 121

122 122

123 Infravörös diagnosztika 123

124 Infravörös alkalmazások 124

125 Infravörös alkalmazások 125

126 Infravörös alkalmazások 126

127 Infravörös alkalmazások 127

128 Infravörös alkalmazások 128

129 Infravörös alkalmazások 129

130 Köszönöm a figyelmet! 130

131 Köszönöm a figyelmet! 131