Bakteriofág és bakteriális represszor vizsgálata in vivo és in vitro módszerekkel

Átírás

1 SZENT ISTVÁN EGYETEM Bakteriofág és bakteriális represszor vizsgálata in vivo és in vitro módszerekkel Doktori (PhD) értekezés Ferenczi Szilamér Imre Gödöllő 2008

2 A doktori iskola megnevezése: Biológia Tudományi Doktori Iskola tudományága: Biológia Tudományok vezetője: Dr. Tuba Zoltán tanszékvezető, egyetemi tanár, az MTA doktora SZIE, Mezőgazdasági és Környezettudományi Kar Növénytani és Növényélettani Tanszék témavezetők: Dr. Orosz László tanszékvezető, egyetemi tanár, az MTA levelező tagja ELTE Természettudományi Kar Dr. Papp Péter tudományos főmunkatárs, Ph.D. Mezőgazdasági Biotechnológiai Kutatóközpont Iskolavezető jóváhagyása:. Dr. Tuba Zoltán Témavezetők jóváhagyása: Dr. Orosz László Dr. Papp Péter

3 TARTALOMJEGYZÉK 1. BEVEZETÉS Bakteriofág szabályozó elemek Addikciós modulok 1 2. IRODALMI ÁTTEKINTÉS A 16-3 bakteriofág általános jellemzése Helix turn-helix (HTH) típusú DNS kötő fehérjék A 16-3 fág szabályozó régiója Addikciós modulok Plazmidok stabilizációja addikciós modulok segítségével Az F plazmid ccd lókusza A relbe gének Az Rts1 plazmid higba rendszere Az RK2 plazmid parde génjei A pem és mazef (chp) lókuszok A phd/doc TA rendszer vapbc lókuszok Az ω- ε- ζ lókusz Két speciális csoport A II. típusú restrikciós- modifikációs (RM) rendszerek A hipba lókusz Szerkezet és reguláció az addikciós modulok körében ANYAGOK ÉS MÓDSZEREK Felhasznált baktériumtörzsek és bakteriofágok Felhasznált plazmidok Oligonukleotidok Baktériumok tenyésztéséhez használt táptalajok A plazmidba épített fragment fágba juttatása homológ rekombinációval Plazmid DNS bejuttatása baktériumsejtekbe Bakteriális sejtek transzformálása Konjugáció (három szülős) Plazmid DNS tisztítása Totál-DNS preparátum készítése Totál-RNS preparátum készítése 29

4 3.10. DNS minták emésztése restrikciós endonukleázokkal DNS fragmentumok elválasztása DNS fragmentumok izolálása agaróz gélből Szintetikus oligonukleotidok plazmidba építése DNS fragmentumok ligálása DNS nukleotidsorrend meghatározása Transzkripciós starthely meghatározása (primer extension) Polimeráz láncreakció (PCR) β Galaktozidáz aktivitásmérés Fehérje túltermeltetés Fág DNS tisztítás Fehérjék elválasztása His-tag jelölt fehérjék izolálása, tisztítása Gél-retardációs teszt ( band-shift ) DN-áz I footprint Hidroxil gyök footprint Bioinformatikai módszerek és internet oldalak Vegyszerek és enzimek EREDMÉNYEK 4.1. Bevezetés Egy kópiás in vivo mérőegység előállítása pgsb1 vektor tesztelése a 16-3 fág C represszor fehérje és kötőhelyeinek in vivo vizsgálatára A C represszor felismerő hélix aminosav oldalláncainak fontossága az operátorokkal kialakított kölcsönhatás során (alanin scanning) Operátor mutánsok előállítása Megváltozott specificitású represszor vizsgálata vad és mutáns O R2 operátorokon Megváltozott specifitású mutáns represszor viselkedése O L2 típusú operátoron A. tumefaciens addikciós modul jellemzése pemik homológ TA modul izolálása Promóter régió és transzkripciós starthely azonosítása Toxin -Antitoxin kapcsolódásának és operátorával történő interakciójának kimutatása TA fehérjék komplex alkotásának vizsgálata 51

5 PemIK fehérjék interakció vizsgálata az operátor régióval, operátor azonosítása A pemik fiziológiás szerepe ÚJ TUDOMÁNYOS EREDMÉNYEK KÖVETKEZTETÉSEK ÉS JAVASLATOK Az A. tumefaciens pemik toxin-antitoxin modul jellemzése Transzkripciós starthely maghatározása A pemik operon autoregulációja TA fehérjék komplex alkotásának vizsgálata pemik operátor azonosítása in vivo és in vitro módszerekkel A PemIK rendszer fiziológiás szerepe A. tumefaciens pemik operonjának lehetséges biotechnológiai hasznosítása Plazmid stabilizáció Pozitív szelekciós vektor Önmegsemmisítő baktériumok A pemik TA komplex potenciális antibiotikum target bakteriofág egy kópiás mérőegységének előállítása Alanin scanning Operátor mutánsok vizsgálata Megváltozott specificitású represszor vizsgálata vad és mutáns O R2 operátorokon Megváltozott specifitású mutáns represszor viselkedése O L2 típusú operátoron ÖSSZEFOGLALÁS SUMMARY MELLÉKLETEK KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS 90

6

7 JELÖLÉSEK, RÖVIDÍTÉSEK JEGYZÉKE A. tumefaciens Agrobacterium tumefaciens E.coli Escherichia coli R. meliloti Rhizobium meliloti λ lambda ATP adenozin trifoszfát DNS dezoxiribonukleinsav bp bázispár kbp kilobázispár kda kilodalton nt nukleotid CFU colony forming unit ORF nyitott leolvasási keret (open reading frame) PCR polimeráz láncreakció (polimerase chain reaction) Amp ampicillin Km kanamicin Sp spektinomicin Str streptomicin SD standard deviation, szórás MU Miller Unit EMSA electromobility shift assay TA toxin-antitoxin Wt wild type, vad típus

8

9 1.1. Bakteriofág szabályozó elemek 1. BEVEZETÉS A baktériumokat fertőző vírusok (bakteriofágok) a molekuláris biológiai és genetikai kutatások fontos modell rendszereként szolgálnak. A bakteriofágok tanulmányozásán keresztül nyílt lehetőség számos alapvető biológiai folyamat megértésére. Többek között a génszabályozásra, rekombinációra, DNS replikációra, transzkripcióra vonatkozó ismeretanyagunk nagyrészt a bakteriofág genetikának köszönhető. Napjainkban a fágok nem pusztán a molekuláris biológiai folyamatok megértésének alanyai, hanem többek között a modern biotechnológia eszköztára is jelentősen bővült a fágokból izolált molekuláris eszközök felhasználása révén. Mindezeken túlmenően a bakteriofágok már önmagunkban is érdekesek, változatosak, mennyiségi szempontból is számottevőek, hiszen e kétszálú DNS vírusok a bioszféra legnagyobb csoportját képviselik, kb fág fajt feltételeznek és becslések szerint több mint (Hendrix és mtsai., 2002) nagyságú a kétszálú DNS vírus populáció a világon. Mivel a bakteriofágok kizárólagos paraziták, és egyes feltételezések szerint akár 50 másik, ugyanazt a gazdabaktériumot fertőző fágfajjal kell versengeniük, így a fennmaradásukhoz az egyes vírusok rendkívül változatos szabályozó mechanizmusokat fejlesztettek ki az idők folyamán. A fágok életciklusát szabályozó fehérjéknek az operátoraikkal kialakított kapcsolatai különösen izgalmasak és tanulmányozásuk bepillantást enged a génszabályozás legmélyebb titkaiba Addikciós modulok A baktériumok a stresszhatások leküzdésére számos fegyvert fejlesztettek ki evolúciójuk során. Ezek közül napjaink tudománya által nagy érdeklődéssel kísért hadszínterek a toxin-antitoxin felismerő rendszereken alapuló mechanizmusok (addikciós modulok). Szerepük bizonyított a programozott sejthalál, plazmid stabilitási, transz-transzlációs minőségbiztosítási rendszerekben de az anyagcsere folyamatok és a perzisztens sejt képződésén át egyre több biológiai folyamatban is. A bakteriofágok irodalmának tanulmányozása során találtunk rá a P1 fág stabilitási faktoraként használt addikciós rendszerre, mely végső soron felkeltette az érdeklődésünket a TA rendszerek iránt. Számos típusuk a patogén baktériumok elleni folyamatos harcban potenciális antibiotikum targetként tekinthető, ezért nagyon fontos a tanulmányozásuk, megismerésük mindenki számára. A dolgozat egy fág represszor és egy bakteriális addikciós modul molekuláris elemzését írja le. Kiemelt szerepet kap a témák tárgyalása során a DNS-fehérje kapcsolatok kialakulásának szerepe a génszabályozás során. Kísérleteinket olyan részletességgel terveztük, hogy eljussunk a modellalkotás szintjére. 1

10 2

11 2. IRODALMI ÁTTEKINTÉS 2.1. A 16-3 bakteriofág általános jellemzése A 16-3 lizogén bakteriofágot Balatonberény környékéről származó talajmintából izolálták az as évek elején (Ördögh és Szende, 1961). A 16-3 gazdabaktériuma a Gram negatív, szimbiotikus nitrogénkötő Rhizobium meliloti 41 (Szende és Ördögh, 1960)- legújabb nevezéktan szerint Sinorhizobium meliloti- melynek három szimbiotikus partnere közül gazdaságilag legfontosabb a lucerna (Medicago sativa). A fág életciklusa a fertőzéstől a gazdasejt líziséig 28 C-on 100, 36 C-on 80 perc. Az érett fágrészecske elkészüléséhez 28 C-on 80, 36 C-on 65 percre van szükség (Orosz és Sík, 1970; Orosz és mtsai., 1973). A 16-3 fág kromoszómája kétszálú, lineáris, 60 kbp nagyságú DNS molekula (Dallmann és mtsai., 1979), amely 10 nukleotid hosszúságú 3 túlnyúló, ragadós végekkel ( cos régió) rendelkezik (Ganyu és mtsai., 2005). A 16-3 fág genomjának nukleotidsorrend meghatározása befejeződött (Papp P.P. személyes közlése). A 16-3 fág alapvető genetikai analízisét és genetikai térképezését mintegy 150 hőérzékeny (ts) mutáns 42 komplementációs csoportba sorolásával készítették el (Orosz és Sík, 1970; Sík és Orosz, 1971; Orosz és mtsai., 1980). A genetikai térkép lineáris és 40 térképegység hosszúságú. A térképezett géneket megnyilvánulásuk szerint korai és kései csoportba osztották (Orosz és mtsai., 1973). A kései gének csak akkor nyilvánulnak meg, ha a korai gének megfelelően működnek (Orosz. és mtsai., 1973; Kondorosi és mtsai., 1974). Noha a genetikai térkép lineáris, végpontjai mégsem egyeznek meg a fizikai térkép végpontjaival ( cos régió). Ez részben azzal volt magyarázható, hogy az att és az ún. immx régió között egy rendkívül aktív rekombinációs forró pont van, melynek két oldalán elhelyezkedő gének kapcsoltsága megszűnt (Csiszovszki és mtsai., 2003). A 16-3 egyik legjobban tanulmányozott génje a c regulátorgén, amely a lizogén életciklus szabályozásában játszik alapvető szerepet. Hőérzékeny alléljei 28 C-on vad típusú (turbid), 36 Con tiszta (clear) tarfoltú fenotípust mutatnak. A c gén finomtérképezését kétpontos és intracisztronikus hárompontos térképezéssel oldották meg, elsőként Magyarországon. A mutációk helyes sorrendjét egy deléciós térképpel erősítették meg (Orosz és mtsai., 1980). A c gén finomtérképezésével lehetőség nyílt a 16-3 fág homológ rekombinációs mechanizmusának feltárására (Orosz és mtsai., 1980; Dudás és Orosz, 1980), amely a genetikai térképezési szabályok és a valós crossing over között feszülő ellentmondás feloldásához adott magyarázatot. Később bebizonyosodott, hogy a 16-3 fág rekombinációs útvonala a vártnál sokkal általánosabb érvényű, hiszen pl. a kloroplasztiszok rekombinációs jelenségeit is megmagyarázza. Az említett 3

12 ellentmondás a következőkben rejlik: a térképezési függvényen (Haldane függvény) alapuló géntérképezési logika a véletlenszerű törés-újraegyesülés crossing over modellel számol, azaz azt feltételezi, hogy a crossing overek pontszerű, statisztikus és autonóm események. Ugyanakkor a génkonverzió és a crossing over, ill. rekombináció összefüggéséből tudjuk, hogy a valóságos crossing over nem pontszerű, hanem jelentős hosszúságban érinti a rekombinálódó DNS molekulákat, tehát kiterjedése van. A crossing over esemény valóságos hossza (akár az 5 kbp hosszúságot is elérheti) sokszorosa lehet egy átlagos génnek (c gén pl. 1 kbp hosszúságú). Ugyancsak a génkonverziós jelenségek elemzéséből tudjuk, hogy a fellépő crossing overek nem statisztikusan szóródnak a DNS mentén és nem is teljesen autonóm események. Ennek ellenére a gének finomtérképezésekor alkalmazható volt a törés-újraegyesülésre és az ideális crossing over-re építő Haldane függvény. A 16-3 rekombinációjának vizsgálatából levezetett ún. hosszú Holliday kereszt vándorlás-heteroduplex és mismatch képződés-repair elmaradás modell megmagyarázza, miért használható a Haldane függvény rövid DNS szakaszokra, másrészt az ún. rövid Holliday kereszt vándorlás-mismatch képződés és repair elmaradás modell megmagyarázza, hogy miért használható a háromfaktoros térképezési logika ilyen rövid távolságokban, azaz miért nem lép fel az ún. magas negatív interferencia (high negative interference) jelensége (Orosz és mtsai., 1980). A c gén terméke egy represszor fehérje, amely az O L és O R operátorokon keresztül fejti ki transzkripciót szabályozó hatását. A C represszor szolgál fő szabályozófehérjeként a fág életciklusa során. A 16-3 C represszor két autonóm doménnel rendelkezik. Ennek a rendszernek a tanulmányozására, Magyarországon elsőként alkalmaztak in vivo kísérleti rendszert, elsőként alkalmaztak gél retardációs (EMSA) kísérletet, s kidolgoztak egy tökéletes allélcserét lehetővé tevő eljárást (Dallmann és mtsai., 1987). A fág helyspecifikus integrációja a R. meliloti kromoszómájának meghatározott helyén történik, a cys46 és a met5 gén között, az attb régiónál. Ezt támasztja alá az a tény is, hogy a 16-3 fág képes speciálisan transzdukálni a R. meliloti 41 cys46 génjét (Sváb és mtsai., 1978, Kiss és mtsai., 1980). Meghatározták a fág integrációs rendszerének elemeit (Olasz és mtsai. 1985, Dorgai és mtsai. 1993, Papp és mtsai. 1993, Semsey és mtsai., 1999, 2002). Az integráció során a gazda attb és a fág attp helyei között lejátszódó rekombináció a beépült fágot - azaz a profágot - határoló attl és attr hibrid helyek kialakulásához vezet (Olasz és mtsai., 1985, Papp és mtsai., 1993). A reakciót a fág int génje által kódolt 16-3 integráz enzim (16-3 Int) katalizálja. Az int gént tartalmazó DNS szakaszt meghatározták, majd az általa kódolt integráz fehérjéről bebizonyították, hogy a tirozin rekombinázok családjába tartozik (Semsey és mtsai., 1999). A 16-3 fág kivágódása során fontos szerepet játszó 16-3 Xis fehérje génjét (xis) azonosították és az attp helyet lokalizálták a fág genomján nem messze az int gén 3 végétől (Semsey és mtsai., 1999). Az attb hely szekvenciájának megismerése felfedte, hogy egy feltételezett prolin trns(cgg) gén 3 végével van átfedésben oly 4

13 módon, hogy a feltételezett trns antikodon hurok (loop) része egybeesik az attb hely 16-3 Int kötő B és B szekvenciái közé eső átfedő régióval (Papp és mtsai., 1993). A prolin trns(cgg) gén aktív marad, ugyanis a fág integrációja során keletkező attl régióban helyreáll a prolin trns(cgg) gén szerkezete és működőképessége sértetlen marad. Ez a finom, szinte sebészi precizitású, integráció a fág és a gazdaszervezet szoros koevolúciós kapcsolatára utal (Blaha és mtsai,. 2004). A lizogén R. meliloti felülfertőzéssel szembeni immunitását a 16-3 profág immc, immx és az avirt régióinak kölcsönhatása alakítja ki. Az immc régió a lizogén fejlődési út kialakításáért felelős, és átfed a c gént és az O L, O R operátorokat is tarlalmazó, középső szabályozó régióval. A immx régió két részre osztható: (I) az X U/L rész két nagymértékben átfedő cisztront tartalmaz, melyek a px U és px L fehérjéket kódolják, míg (II) X V rész tartalmazza a X U/L represszió, cisz elemekből álló, célrégióját. A immx régió szerkezeti felépítését nagyfokú egyedülállóság jellemzi. A lizogén állapot felé vezető genetikai útvonalon az immx aktivitása megelőzi az immc működését (Csiszovszki és mtsai., 2003). Az avirt régióról egyelőre azt lehet tudni, hogy kapcsolatban áll az immc és az immx által kifejtett immunitással (Dorgai és mtsai., 1986) Helix turn-helix (HTH) típusú DNS kötő fehérjék A fágok represszorainál a DNS kötő domén általában a fehérje N-terminális részén található, akárcsak a 16-3 fág esetében is (Dallmann és mtsai., 1987). A HTH motívummal (Pabo és Sauer, 1984) rendelkező represszor fehérjék felépítése nagyon konzervatív a DNS kötő hélixet tekintve. A 20 aminosavból felépülő régió által biztosított DNS kötést már számos esetben leírták és szerkezetét kristályszerkezetek is alátámasztják (McKay és Steitz, 1981, Pabo és Lewis, 1982). A bakteriális és fág HTH típusú represszorokhoz hasonlóan a 16-3 fág 263 aminosav hosszú C represszorában is megtalálható az erre a motívumra jellemző két helix. Az első helix hét aminosavból áll, azután van egy rövid helix-törő turn szakasz és a aminosavak alkotják a második, felismerő, hélixet. A motívumról általánosságban is elmondható, hogy a 4., 8., 10., 16. és 18. aminosavak hidrofób jellegűek, melyek a fehérje másik hasonlóan hidrofób részével egy zárt hidrofób magot alkotnak (Harrison és Aggarwal, 1990). Az 5. aminosav általában kis oldalláncú glicin vagy alanin, mert a hosszabb oldalláncú aminosav felborítaná a motívum geometriáját. A hélix-turn-hélix típusú fehérjék felismerő hélix része az, mely a DNS nagy árkába illeszkedve alkot specifikus kapcsolatot a bázisokkal. A HTH represszoroknál a motívumban található mindkét hélix N-terminális része, de főleg az elsőé felelős a nem specifikus DNS foszfát gerinccel kialakított kötéseken keresztül a felismerő hélix helyes pozícionálásáért a specifikus kötőhely felé. A fehérje és DNS komplementaritása, mérete, töltése, alakja határozzák meg összességében a dokkolási elrendeződést, mely feltétele a specifikus kötésnek. A HTH motívummal bíró represszorok 5

14 általában dimerként kötik a célszekvenciájukat, melyek szimmetrikus, palindrom bázis elrendeződést tartalmaznak (Harrison és Aggarwal, 1990). A szabályozó fehérjék és operároraik illeszkedése során a kötőhelyen belüli kis mértékű változtatás is a teljes funkció elvesztésével járhat a legtöbb leírt rendszerben. Csupán néhány represszor képes az eltérő hosszúságú operátorok felismerésére hasonló affinitással. Ilyen például az E.coli ciklikus AMP receptor proteinje (CRP), mely két eltérő hosszúságú operátort ismer fel. A 16 és 18 bp hosszú operátorokat 6 illetve 8 bp centrális spacer választja el egymástól. A DNS-fehérje kapcsolódás során a CRP a kötés kialakulásakor konformáció változást indukál az operátoron. A DNS szerkezete B DNS-ből A-DNS formába alakul át, így lehetővé téve a hosszabb operátor felismerését is anélkül, hogy a spacer régióval kialakítana specifikus kapcsolatot a camp-crp komplex (Ivanov és mtsai., 1995). A másik nagyon érdekes represszor a CytR, mely két oktamer ismétlődő szekvenciát ismer fel direkt vagy ellentétes orientációban 2 bp elválasztó résszel szeparálva. A camp-crp komplex jelenlétében a CytR represszor képes felismerni ellentétes orientációban a kötőhelyeit bp résszel elválasztva, illetve direkt ismétlődő elrendezésben 1 bázissal szeparálva. Az eltérő kötőhelyek felismerését ebben az esetben a camp-crp complex által a CytR represszoron indukált, fehérje-fehérje kölcsönhatásból eredő konformációváltozás teszi lehetővé (Pedersen és Valentin-Hansen, 1997, Kallipolitis és Valentin-Hansen, 2004) (1. ábra). 1. ábra: A camp-crp complex a CytR represszorhoz kapcsolódva konformációváltozást indukál, ami lehetővé teszi az eltérő operátorok felismerését (Pedersen és Valentin-Hansen, 1997). Különleges tulajdonságot mutat az operátor felismerésben az E. coli 186 bakteriofág CI represszora, mely két féle operátorhoz tud kötődni. Az A és B típusnak nevezett oprerátorok közül az A variáns félkötőhelyei 4 illetve 5 bp elválasztó résszel rendelkeznek. A két eltérő operátor kötésében a represszor felismerő hélix eltérő aminosav oldalláncai vesznek részt (Shearwin és mtsai., 2002). 6

15 2.3. A 16-3 fág szabályozó régiója A fág genomon c gént meghatározó ORF jobb és bal oldali határoló régióiban találhatók a represszor kötőhelyei. Az operátorokat részlegesen palindrom modulok (O L1, O L2, és O R1, O R2 ) alkotják. Az O L operátor a rövidebb térközzel (4 bp) rendelkező szemben a O R 6 bp interpalindromikus résszel bíró szabályozó elemmel. Az operátorok (O L és O R ) átfednek a korai gének (P L és P R ) és magának a represszornak a transzkripciójáért felelős (P C ) promóterekkel (Dallmann és mtsai., 1987, Dallmann és mtsai., 1991, Dorgai és mtsai., 1986, Dudás és Orosz, 1980) (2. ábra). 2. ábra: 16-3 fág jobb és bal oldali operátorai (O L és O R ) és a jobb illetve bal kromoszómakarok átírását biztosító P L és P R promóterek fogják közre a C represszort kódoló cisztront. A P C promóter biztosítja a C represszor transzkripcióját. A -10 és -35 a promóter boxokat jelöli. A * a virulenciát okozó O R C -1 operátor mutáció helyét jelöli (Papp és mtsai., 2002). Az operátorok palindróm régióinak nukleotidsorrendje nagy hasonlóságot mutat a 434 lambdoid fág operátoraihoz, azonban a C represszornak csupán a HTH része homológ, mintegy 55%-ban fehérje szinten, a 434 fág fő szabályozófehérjéhez (Dallmann és mtsai., 1987). Ráadásul a 16-3 fág represszora képes felismerni a 434 fág operátorát és ugyanezen fág represszora regulálja a 16-3 O R operátort, azaz a két represszor és operátor keresztregulációra képes (Dallmann és mtsai., 1987; 1991). In vivo és in vitro módszerekkel meghatározták az operátorok pontos méretét és határait (Papp és mtsai., 2002). Az in vitro kísérletek igazolták, hogy az operátorok szimmetrikus csonkolása képes precízen kijelölni a pontos határbázisokat (3. ábra). Ezek alapján O L2 operátor ACAAttgaTTGT nukleotidsorrenddel rendelkezik, míg az O R2 ACAAttgtagTTGT bázissorrenddel. 7

16 3. ábra: EMSA kísérletek csonkolt O L2 és O R2 operátorokkal tisztított C represszor fehérjével. A 4. és 7. csonkolt verziók már nem mutatnak in vitro kötést, ami kijelöli az O R2 és O L2 operátorok fizikai határait. F a szabad (free), B a komplexben kötött (bond) DNS-t jelöli. Az a represszor nélkül, b 100 ng represszor, c 300 ng represszor (Papp és mtsai., 2002). A két operátor interpalindrom szakasz eltérő hossza érdekes DNS-fehérje illeszkedési mechanizmusok létét tételezi fel. Az in vivo mérések eredményeiből kitűnik, hogy ha 1182 bp hosszú növényi DNS fragmentet építettek a két operátor régió közé, ez az architektúra felel meg leginkább az in phage szituációnak, akkor a represszió értéke jelentősen megnőtt, ami a két fehérje-operátor komplex közötti kooperációnak az eredménye (Papp és mtsai., 2002). Az in vitro EMSA kísérletek is kimutatták, hogy nagyobb mennyiségű represszor fehérje jelenlétében a vad típusú operátorokkal magasabb rendű un. sandwich szerkezet kialakulása figyelhető meg (4. ábra). Ezek az eredmények megerősítik a kooperatív kapcsolatok kialakulásának valószínűségét. Cirkuláris permutációs analízissel meghatározták a két vad (O R2 és O L2 ) és egy szintetikus, intermedier O 5 operátorok dihedrális hajlítási szögét, ami a represszor hatására bekövetkezett hajlítások össz eredője (4. ábra) (Papp és mtsai., 2002). Az O 5 intermedier szabályozó egység tervezése úgy történt, hogy egy nukleotid hozzáadása az O R2, míg egy bázis elvétele az O L2 operátorokat eredményezi. A vad operátorok esetén a dihedrális szög 34 ± 3, míg az O 5 esetében ez

17 4. ábra: 16-3 bakteriofág vad, O R2 és O L2, operátorok és szintetikus, intermedier, O 5 operátor cirkuláris permutációs elemzése. F a szabad (free), B a kötésben levő, S a sandwich szerkezetet adó fehérje DNS komplexeket jelöli. A plazmid linearizálását MluI, XhoI és NruI restrikciós enzimekkel végezték (Papp és mtsai., 2002). A szabad formában egyenes, hajlítatlan operátor részt hordozó DNS az O 5 intermedier operátorral olyan szerkezetet alkot, mely egy képzeletbeli síkban marad. Ennek oka, hogy a két félkötőhely 5 bp, azaz fél helikális turn, belső szeparációval rendelkezik. A vad operátorok +1 illetve -1 bp hozzáadása illetve elvétele az intermedier operátorhoz, a képzeletbeli síkból való kitörését okozza a szerkezetnek. Az O R2 a síkból felfelé, az O L2 az ellentétes irányba töri meg a szerkezeti síkot. Az egy nukleotid hozzáadás és elvétel átlagosan ± 36º fokos szerkezeti torzulást okoz a DNS szerkezetben, mely érték gyakorlatilag megegyezik a mért dihedrális szögekkel mindkét vad operátornál (Papp és mtsai., 2002). A komplex eltérő szerkezeteit az biztosítja, hogy a kapcsolódó fehérjék nem rigid, hanem rugalmas illeszkedéssel kapcsolódnak, ami lehetőséget ad a két vad operátor egyformán hatékony kötésére. A komplex leírására javasolt rotációsan flexibilis protein homodimer modell az 5A. ábrán látható. A modell szerint a homodimerek térbeli elrendeződése egymáshoz képest eltérő az O R2 és O L2 operátorokon. A represszor hajlítása más-más irányokban töri meg a síkot a két vad operátor esetében, így tulajdonképpen tükörszimmetrikus elrendeződést mutatnak egymáshoz viszonyítva. Az intermedier operátor a hajlítás során a síkban marad, ahogyan azt a cirkuláris permutáció alapján mért dihedrális szöge is mutatja (4. ábra). Az egyaránt hatékony funkcióért a két vad operátoron a represszor fehérje nagy mértékű rugalmas viselkedése tehető felelőssé. 9

18 A rotációsan flexibilis protein homodimer modell esetében az operátor-represszor komplex létrejötte során más vagy azonos dokkolási elrendeződést is mutathat a két operátor a represszor fehérjével. Ennek a feltevésnek eldöntésére végeztük kísérleteinket Az 5B ábra által javasolt geometrikus homeosztázis modell alapján a represszor hajlítása mindkét vad operátor esetében ugyanolyan irányultságot mutat. Ez feltételezhet egy olyan közös dokkolási elrendeződést, mely alapján mindkét operátor ugyanazokat az atomcsoportokat használja a kapcsolódás során. A két vad típusú operátor azonos viselkedése csak azzal magyarázható, ha az operátorok fizikai hossza egyforma. Ezt úgy lehet elképzelni, hogy az O L2 nyúlik és átalakul O R2 hosszúságúvá vagy fordítva, az O R2 összetömörödik és O L2 operátorral egyező hosszúságú lesz. Estleg van még egy harmadik lehetőség, mégpedig hogy mindkét vad típusú operátor hossza változik és kialakul egy intermedier méretű szerkezet a represszor-kötőhely komplex kialakulása során. A geometrikus homeosztázis modell alapján az O 5 szintetikus intermedier operátornak is hatékonynak kellene lennie a kötés szempontjából. Ennek a kísérleti eredmények azonban ellentmondanak és csak a vad operátorok viselkedésére adhat megfelelő magyarázatot. A modellekben vázolt komplex alkotás pontos mechanizmusa csak a teljes represszor fehérje és a kötőhelyeik kokristályosítása során határozható meg. Ez a jelenlegi módszerekkel nem lehetséges, ezért más megközelítést kell választanunk a DNS-fehérje kapcsolatok tanulmányozására a 16-3 fág esetében. A dolgozatban egy olyan módszert írunk le, mely alkalmas a modell által leírt jelenségek tanulmányozására. 10

19 5. ábra: A 16-3 fág operátor-represszor komplex szerkezetének putatív modelljei. A rotációsan flexibilis protein homodimer modell szerint (A) a represszor fehérjék (tojás alakú formák) eltérő módon kapcsolódnak dimerré a vad operátorokon (O R2 és O L2 ). A geometrikus homeosztázis modell szerint (B) a fehérjék dimerizációja a vad operátorokon egyforma. 11

20 2.4. Addikciós modulok A szabadon élő mikroorganizmusok a folyamatosan változó környezeti feltételekhez történő alkalmazkodás érdekében globális reguláló útvonalakat alakítottak ki az evolúció során. Ezek közül a legújabban felfedezett és egyre részletesebben megismert rendszerek az addikciós modulok vagy másnéven toxin antitoxin rendszerek (TA rendszerek). Lássuk hát röviden, mi is a szerepük a baktériumokban. A baktériumok aminosav és szénforrás limitáció során képesek csökkenteni az RNS (rrns, trns) szintézist azáltal, hogy növelik a tetrafoszfát (ppgpp vagy P 4 G) és pentafoszfátok (pppgpp) intracelluláris koncentrációját. Aminosav éhezés során ezért a RelA, P 4 G szintetáz I, fehérje felelős, melynek aktivációját a töltetlen trns-ek felhalmozódása végzi (Cashel és mtsai., 1996), míg a szénforrás megvonásánál a P 4 G szintézisért a SpoT, P 4 G szintetáz II, enzim a felelős (Murray és mtsai., 1996). A sejteket ért stressz során megemelkedett P 4 G az RNS polimerázhoz allosztérikusan kapcsolódva csökkenti annak affinitását a promóter régióhoz és ez által azok a promóterek, melyek a trns és rrns szintézisért felelősek rövidebb nyitott állapottal rendelkeznek az mrns szintézisben résztvevőkhöz képest. Az RNS szintézis ennek következtében eltolódik az mrns képződés irányába (Chatterji és mtsai., 2001, Barker és mtsai., 2001/A, Barker és mtsai., 2001/B ). Az RNS polimerázokon kívül a P 4 G gátolják az exopolifoszfatázokat, ami polifoszfátok felhalmozódásához vezet az intracelluláris térben (Kuroda és mtsai., 1997, Kuroda és mtsai., 1999). A polifoszfátok direkt kapcsolódhatnak a riboszómális fehérjéket lebontó Lon (La ATP függő DNS kötő proteáz) proteázhoz, ezzel aktiválják az enzim fehérjebontó funkcióját, ami végső soron az aminosavéhezés során a bakteriális sejtnek endogén aminosavforrást szabadít fel a fehérjeszintézis számára (Kuroda és mtsai., 2001). A stresszhelyzet túlélésének érdekében a P 4 G képesek még néhány alternatív szigma faktor (Sigma S, N) transzkripcióban történő részvételének gyakoriságát is növelni, ezzel elősegítve a stresszválaszért felelős gének átírását (Jishage és mtsai., 2002, Laurie és mtsai., 2003). Tehát a P 4 G ről elmondhatjuk, hogy kulcsfontosságú, globális szerepet tölt be a sejt életében a megváltozott tápanyagellátáshoz történő alkalmazkodás során (6. ábra). 12

21 6. ábra: RelA és SpoT által aktivált P 4 G szintézis és szerepe a bakteriális sejt stresszválaszában (Gerdes és mtsai., 2005). RelA: P 4 G szintetáz I, SpoT: P 4 G szintetáz II, PPX: exopolifoszfatáz, PolyP: polifoszfát, Lon: La ATP függő DNS kötő proteáz A legtöbb prokarióta genomja a stresszfolyamatokra történő válaszadásban is fontos szerepet betöltő TA géneket tartalmaz. Ezekre a génekre általánosan jellemző, hogy policisztronikusak, legalább két ORF-et tartalmaznak, melyek minimum két fehérjét kódolnak. Egyik gén kódolja az általában enzimatikus funkcióval rendelkező stabil toxint (T), a másik ORF által kódolt instabilabb rövid fehérje az antitoxinnak (A) nevezett alegység pedig specifikusan képes nagyon erősen gátolni a toxin funkcióját. A két alegység specifikusan összekapcsolódva egy toxin-antitoxin (TA) heterodimert komplexet alkot. Számos már teljesen vagy részlegesen ismert genom összehasonlításával a baktériumok világában megállapíthatjuk, hogy nagyon abundánsak a TA lókuszok az eubaktériumok és az archeobaktériumok körében egyaránt (Gerdes, 2000, Gronlund és Gerdes, 1999, Grady és Hayes, 2003, Mittenhuber, 1999). Érdekes, hogy a szabadon élő mikróbák általában sok, míg az állandó környezetben élő paraziták, patogének kevés fajta TA modult tartalmaznak (Pandey és Gerdes, 2005). Az egyik részről minden bizonnyal rekordernek tekinthető Nitrosomonas europea például 45 TA lókuszt tartalmaz a genoforján, melyek szinte minden típusú addikciós modult reprezentálnak a jelen csoportosítás szerint (Pandey és Gerdes, 2005). A két fizikailag teljesen feltérképezett genomú Mycobacterium tuberculosis törzs 38 illetve 36 TA lókuszt hordoz a kromoszómán, míg a vele 13

22 nagyon közeli rokonságot mutató M. leprae, amely obligát sejtparazita, egyetlen ép TA modult sem kódol (Cole és mtsai., 2001). Ugyanezt a TA modul hiányt tapasztaljuk az extrém sejtparazita Rikettsia és Chlamydia fajok esetében is. A szabadon élő mikróbák közül csupán a Lactococcus lactis nem tartalmaz TA modult, amely azonban tejben élő organizmus és mint ilyen nincs rászorulva az állandóan változó környezethez való alkalmazkodásra (Pandey és Gerdes, 2005). Általában elmondhatjuk, hogy a változó abiotikus és nutritív stressznek kitett baktériumok fejlesztettek ki jelentősebb számban adaptív mechanizmust a túlélésre. A TA lókuszok közül sok található plazmidokon is, ami a vizsgált törzsek addikciós modul tartalmát befolyásolhatja. A bakteriális TA géneknek elsődleges szerepe tehát a környezeti stresszekre adott válasz de a transzkripció és transzláció szabályozásán keresztül szerepük van még a programozott sejthalál beindításában is a baktériumok világában, sőt a plazmidon kódolt TA rendszerek plazmid stabilitási faktorként szolgálnak Plazmidok stabilizációja addikciós modulok segítségével A bakteriális plazmidok képesek autonóm replikációra így a sejtben több kópia is előfordulhat egy adott plazmidból. A bakteriális sejtek hasadása (segregation) során, húzófonalak és más mechanizmus hiányában, az utódsejtek csak véletlenszerűen tartalmazhatnak plazmidot. A TA modullal rendelkező, általában kis kópiás episzómák úgy biztosítják a túlélésüket, átkerülésüket az utód generációkba, hogy citoplazmában a plazmid kópiaszámához képest a toxin-antitoxin komplexek sokkal nagyobb számban vannak jelen, így ha az utód sejtek nem is tartalmaznak plazmidot, viszont nagyobb valószínűséggel TA fehérjéket igen. Ebben az esetben, mivel a gyorsabban lebomló antitoxin nem szintetizálódik, a toxin alegység felszabadulván az antidotum gátló hatása alól aktiválódik és a toxin típusától függően a sejt pusztulását, vagy legalábbis csökkent anyagcserét okoz (7. ábra). Ez a mechanizmus biztosítja a TA modullal felruházott plazmiddal rendelkező sejtek nagyobb kolonizációs képességét egy adott környezetbe szemben a plazmidmentes sejtekkel. Az első ilyen post-segregational killing (PSK) rendszer részletes működését molekuláris szinten (mazef) Engelberg-Kulka jellemezte (Engelberg-Kulka és Glaser, 1999.) 14

23 7. ábra: Plazmid stabilizálás (PSK) TA modul által (Buts és mtsai., 2005) A TA rendszereket nyolc csoportba sorolják aszerint, hogy plazmidon v. kromoszómán lokalizálódnak-e, hogy milyen fiziológiás szerepet töltenek be és milyen baktériumok körében találhatók (1. táblázat). 15

24 1. táblázat Addikciós modulok felosztása TA lókusz Toxin Toxin target Antitoxin Proteáz Előfordulás ccd CcdB DNS giráz CcdA Lon G- relbe RelE mrns hasítás RelB Lon G-, G+, Arch parde ParE DNS giráz ParD nem ismert G-, G+ higba HigB nem ismert HigA nem ismert G-, G+ mazef MazF/ PemK mrns hasítás MazE/ PemI ClpXP/Lon G-, G+ phd/doc Doc transzláció Phd ClpAp G-, G+, Arch vapbc VapC nem ismert VapB nem ismert G-, G+, Arch ω- ε- ζ ζ nem ismert ε nem ismert G Az F plazmid ccd lókusza Gram negatív fajokban leírt plazmidstabilitási rendszerek a replikációs origó környékén helyeződnek az F plazmidnál és a vele hasonló replikonnal rendelkező episzómáknál (Ogura és Hiraga, 1983, Boe és mtsai., 1987, Gerdes, 1995). A plazmidmentes utódsejtek szaporodását gátolják a replikációs és transzkripciós folyamatokban nélkülözhetetlen DNS giráz gátlásán keresztül a citoplazmában jelen levő CcdB toxin fehérjék. Ez a gátlás kétféle mechanizmus alapján megy végbe. Az egyik során a CcdB toxin képes komplexet alkotni a DNS giráz fehérjékkel és ezáltal stabilizálja a kovalensen kötött giráz-dns komplexet, ami direkt blokádot jelent a T7 polimeráz számára in vitro transzkripciós reakcióban. Ez a gátlás CcdA antitoxin hozzáadással feloldható (Critchlow és mtsai., 1997). A másik módja a gátlásnak a toxin nem kovalens komplex alkotásán keresztül valósul meg szabad giráza (GyrA) alegységekkel (Maki és mtsai., 1992, Jiang és mtsai., 2002). Mindkét gátlás ugyanazon gyra mutációval feloldható (Critchlow és mtsai., 1997, Bernard és mtsai., 1993, Bahassi és mtsai., 1995). Nagyon érdekes, hogy a CcdB toxin strukturálisan nagyon közeli rokona a transzkripciót az mrns hasítással gátolni képes MazF családba tartozó toxinoknak, ennek ellenére RNS bontásra nem képes jelen ismereteink szerint (Hargreaves és mtsai., 2002, Kamada és mtsai., 2003). 16

25 8. ábra: CcdB toxin képes gátolni a DNS giráz működését. GyrA és GyrB a giráz enzim alegységei (Buts és mtsai., 2005) A relbe gének A kromoszómális relbe génekről a RelE toxin és a RelB antitoxin fehérjék íródnak át, melyek együtt nem toxikus komplexet alkotnak (Gotfredsen és Gerdes, 1998, Galvani és mtsai., 2001). Az egyik legnépesebb TA csoport, melynek toxin tagjai (RelE) mrns hasításon keresztül befolyásolják a transzlációt és csökkentik a sejtek szaporodását (Gotfredsen és Gerdes, 1998, Christensen és mtsai., 2001, Pedersen és mtsai., 2002). A toxin a riboszóma A kötőhelyénél képes az mrns molekulákat hasítani in vitro és in vivo egyaránt (Pedersen és mtsai., 2003, Christensen és Gerdes, 2003). A vágás során kodon preferenciát is tapasztaltak, hiszen az UAG és UAA helyeken 800 illetve 100 szorosa a hasítási gyakoriság az UGA stop kodonhoz viszonyítva ezen kívül a hasítási helyek mindíg a kódoló régiókat fedik le (Pedersen és mtsai., 2003). A CFU csökkenésének ellenére nem feltétlenül pusztulnak el a sejtek a túltermelő törzsek esetében sem (Pedersen és mtsai., 2002). Érdekes hogy némely kromoszómális relbe gén terméke képes plazmid stabilitási faktorként is működni bizonyos replikonokkal kölcsönhatva (Gotfredsen és Gerdes, 1998), melynek pontos folyamata még nem kellően tisztázott. A csoportban vannak olyan a relbe génekkel nagy homológiát mutató TA rendszerek, melyek episzómákon találhatók és klasszikus plazmid stabilitást növelő faktorok (Smith és Rawlings, 1997, Gronlund és Gerdes, 1999) Az Rts1 plazmid higba rendszere Az Rts1 plazmid higba (host inhibition of growth) lókusza kódolja a HigB toxint és a HigA antitoxin fehérjéket (Tian és mtsai., 1996). Ez a típusú TA modul plazmid stabilitási faktorként hat, a plazmidmentes sejtek növekedését gátolja. A gátlás pontos módja még nem ismert. Ellentétben más addikciós modulokkal a toxin fehérjét kódoló ORF 5 irányban található a kromoszómán az antitoxinéhez képest. A más TA rendszerek közül a HigB legközelebbi rokona a RelE csoportja, 17

26 melyhez jelentős hasonlóságot mutat, de az antitoxin fehérjék teljesen más típusú DNS kötő protein családba tartoznak (Pandey és Gerdes, 2005) Az RK2 plazmid parde génjei Az RK2 széles gazdaspecificitású plazmid stabilitási rendszereként szolgáló parde TA modul a ccdba rendszerhez hasonlatosan a DNS giráz gátlásán keresztül a növekedésre gyakorolt negatív hatásával csökkenti a plazmidmentes utódsejtek szaporodását (Roberts és mtsai., 1994, Sobecky és mtsai., 1996). A TA modul stabilizációs hatását fajspecifikus faktorok is befolyásolják (Sia és mtsai., 1995). A ParE toxinfehérje szintén jelentős homológiát mutat a RelE toxinhoz, de érdekes, hogy más a celluláris hatásmechanizmusa (Pandey és Gerdes, 2005) A pemik és mazef (chp) lókuszok Az ebbe a családba tartozó addikciós modulok a legjobban ismertek és tanulmányozottak. Az R1 és R100 replikonnal rendelkező plazmidok stabilitási komplexei (Bravo és mtsai., 1987, Tsuchimoto és mtsai., 1988), kis/kid (killing suppressor és killing determinant) és a pemik (plasmid emergency maintenance), és ezek kromoszómális homológjai, chpa és chpb (chromosomal homologues of pem) lókuszok (Masuda és mtsai., 1994, Masuda és mtsai., 1993, Metzger és mtsai., 1988) klasszikus TA elrendeződést mutatnak. A chpa lókuszt legújabban mazef néven ismertetik. A MazF toxin a bakteriális programozott sejthalál folyamataiban is részt vesz, többek között a sejt energiaháztartásában eszenciális mazg és era génekről képződő mrns-ek szekvencia specifikus hasításán keresztül fejti ki citotoxikus hatását (Zhang és mtsai., 2003, Zhang és mtsai., 2005). A pem és kis/kid rendszerek szintén képesek mrns szekvencia specifikus hasítására de nem feltétlenül pusztítják el a sejtet, ellenben jelentősen csökkentik a plazmidmentes utódgeneráció növekedését (Jensen és mtsai., 1995). A RelE toxinnal ellentétben a PemK toxin nem igényli a riboszóma jelenlétét az mrns hasítása során. A tisztított MazF fehérje az ACA helyen hasítja az mrns-t (Zhang és mtsai., 2003, Zhang és mtsai., 2005). A hasítás fiziológiás körülmények között nagyobb valószínűséggel történik a kódoló régióban, ami a riboszómák befolyásoló szerepét is valószínűsíti a vágási folyamatban (Christensen és mtsai., 2003). A MazEF hatásmechanizmusában részt vesz egy pentapeptid (NNWNN), mely kikerülve az extracelluláris térbe a szomszédos sejtekben TA modul aktivációt okozva, nem direkt hatva a toxin-antitoxin alegységre, a sejtek pusztulását okozza (Kolodkin-Gal és mtsai., 2007). A tisztított peptid (extracellular death factor, EDF) az E. coli sejttenyészethez adva önmagában is jelentős CFU csökkentő hatással bír (Kolodkin-Gal és mtsai., 2007). 18

27 A phd/doc TA rendszer A P1 profág a sejtben egy genetikailag stabil, extrakromoszómális replikonként viselkedik. Stabilizációjának egyik faktora a phd/doc lokusz. A doc (death on curing) gén kódol egy toxin fehérjét, Doc, a phd (prevent host death) allél pedig egy antitoxin fehérjét, Phd, kódol, amely képes semlegesíteni a Doc fehérjét (Lehnherr és mtsai., 1993). A plazmid stabilizációs hatás más TA rendszerekhez hasonlóan az antitoxin alegység lebomlásán és ezáltal a toxin felszabadulásán keresztül valósul meg (Lehnherr és mtsai., 1995). Az addikciós modul Phd2Doc trimer komplexet alkot (Gazit és Sauer, 1999). Kromoszómális homológjai is megtalálhatók számos baktériumban. Indirekt bizonyítékok arra utalnak, hogy a transzláció gátlásán keresztül fejtik ki növekedésgátló hatásukat az ebbe a csoportba sorolt addikciós rendszerek (Hazan és mtsai., 2001) vapbc lókuszok A vapbc (virulence associated protein) rendszereket és homológjait legelőször a Salmonella dublin (Pullinger és mtsai., 1992) és Shigella flexneri (Sayeed és mtsai., 2000) fajokon írták le, mint virulenciafaktorokat hordozó plazmidok stabilitási rendszereit. A VapB antitoxin neutralizációja az adott plazmid elvesztését okozza a vizsgált törzsekben és növekedéscsökkenéssel vagy akár pusztulással is végződhet a plazmidmentes utódsejteknél (Sayeed és mtsai., 2000). Nagyon népes család mind az eubaktériumok mind az archeobaktériumok körében egyaránt. A VapC toxin hatásának molekuláris mechanizmusa még nem teljesen tisztázott, az azonban nagyon érdekes, hogy mindegyikre jellemző a PIN (domain homologues to the N-terminal domain of the pilin biogenesis protein PilT) domén megléte (Anantharaman és Aravind, 2003). Az eukarióták körében ez a PIN domént tartalmazó fehérjecsalád olyan ribonukleázokból áll, melyek az NMD (nonsensmediated mrna decay) és RNS interferencia folyamatokban vesznek részt (Clissold és Ponting, 2000). Ez egy lehetséges evolúciós kapcsolat lehet a génexpressziós minőségbiztosítási rendszereknél az eltérő szerveződési szintű organizmusok esetében (Anantharaman és Aravind, 2003). 19

28 Az ω- ε- ζ lókusz A Streptococcus pyogenes széles gazdaspecificitású psm19035 plazmidjának TA rendszere egyedülálló a felépítése miatt, ugyanis három fehérje alkotja az addikciós rendszert. A Ω represszor képes autoregulálni az egész ω- ε- ζ operont (de la Hoz és mtsai., 2000). Az ε kódol egy antitoxint és a ζ egy toxin alegységet (Ceglowski és mtsai., 1993, Camacho és mtsai., 2002). A toxin antitoxin általi gátlása egy fehérje-fehérje kapcsolaton keresztül valósul meg (Meinhart és mtsai., 2003) és a toxin aktivációja az antitoxin proteáz általi inaktivációval történik (in vivo) (Camacho és mtsai., 2002), amint az elvárható egy kanonikus TA rendszertől. Ez a TA rendszer is a transzkripcótranszláció, még ismeretlen mechanizmus alapján történő gátlásán keresztül fejti ki hatását, jelentősen csökken a túlélő sejtek száma az antitoxin neutralizációjának következtében (Meinhart és mtsai., 2003). Csak a Gram -pozitív baktériumok körében fordul elő ez a fajta addikciós rendszer Két speciális csoport A II. típusú restrikciós- modifikációs (RM) rendszerek Ez egy speciális csoport, mely plazmidon és kromoszómán egyaránt megtalálható minden baktériumban és főleg a saját és idegen DNS megkülönböztetést szolgálja a sejtek életében (Chang és Cohen, 1977, Bickle és Kruger, 1993), ezáltal a fágfertőzések leküzdésének komponense. Az egyik alegység képes metilálni a target, általában hemimetilált konjugációval bejutott vagy replikáció során keletkezett, DNS-t és ezáltal a vele komplexet alkotó DNS hasító restrikciós endonukleáz nem képes a metil csoport miatt kifejteni a katalitikus aktivitását. Metilálatlan kettős szálú DNS-t -fágfertőzés, plazmid vagy bármilyen más idegen nukleinsav bejutása- az endonukleáz elhasít és az így degradálódik. A plazmidon kódolt RM rendszerek nagyon hatékony plazmid stabilitási faktorként működnek és a plazmidmentes utódsejteket elpusztítják (Naito és mtsai., 1995) A hipba lókusz A baktériumok antibiotikum kezelés hatására és számos stresszhatásra adott válaszukként un. perziszter sejteket hoznak létre. Ez a baktérium populációban 10-6 gyakorisággal kialakuló speciális anyagcserével jellemezhető fiziológiai állapotú sejtvonal képes a stresszhatások túlélésére oly módon, hogy mintegy alvó, rezisztens, állapotba vonulva az anyagcsere folyamatokat leállítja. A perziszter sejtek képződése szorosan összefügg a P 4 G szintézissel és ezen metabolitok 20

29 intracelluláris szintjének emelkedésével. A pontos mechanizmus még nem ismert de a transzkripció, transzláció, replikáció, DNS szintézis leállítása kimutatható volt a perziszter sejt képződés során (Korch és mtsai., 2003). Az irodalom megkülönböztet I. típusú perziszter sejteket, melyek a stacioner fázisban fiziológiás kondíciók mellett képződnek és II. típusúakat, melyek bármilyen fázisban keletkezhetnek stressz hatására (Korch és mtsai., 2006) Az E. coli néhány plazmidján leírt hipba (high persistence) lókusz két polipeptidet kódol: a HipB antitoxint, autoregulációért felelős represszort és a vele komplexet alkotó HipA toxint (Black és mtsai., 1994, Falla és Chopra, 1999). A funkcióképes hipa allélt hordozó E. coli törzsekben a toxin antidotum nélküli túltermeltetése a citoplazmában növeli az I. típusú perziszter sejtek képződésének arányát az antibiotikum kezelés hatására, akár 10-2 re is nőhet a perziszter képződés gyakorisága (Black és mtsai., 1991). A toxint túltermelő sejtek a stressz (penicillin kezelés) hatására nagyon lassan szaporodnak. Ez a növekedés a leglassabb a stacioner fázisba lépő sejtek esetében, melyek friss médiumba történő átoltás hatására elvesztik alvó állapotukat (Balaban és mtsai., 2004). A perziszter sejt képződés mechanizmusának megismerése nagyon értékes lehet orvosi és peszticidkémiai vonatkozásban az új bakteriosztatikumok kifejlesztése során Szerkezet és reguláció az addikciós modulok körében A TA modulok antitoxin alegységei képesek kötődni az addikciós modult 5 irányban megelőző promóter-operátor régióhoz, ezáltal az egész egység transzkripcióját, mint represszor, képes szabályozni a toxinnal, mint korepresszorral, együttműködve (Afif és mtsai., 2001, Santos-Sierra és mtsai., 2002, Zhang és mtsai., 2003, Smith és Magnuson, 2004, Lemonnier és mtsai., 2004). Általában elmondható, hogy a kis méretű antitoxin polipeptid N-terminális része tartalmazza a nagyon változó felépítésű DNS kötő motívumot (2. táblázat). A toxin gátlásáért felelős motívum szeparált a DNS kötő egységtől az antitoxinon belül (Smith és Magnuson, 2004). A represszióban a direkt DNS-fehérje interakció során csakis kizárólag az antitoxin vesz részt, míg a toxin alegység csak ko-represszorként szerepel stabilizálva a DNS-fehérje komplexet és hatékonnyá teszi a transzkripció gátlását (Gotfredsen és Gerdes, 1998, Zhang és mtsai., 2003, Marianovsky és mtsai., 2001, Magnuson és Yarmolinsky, 1998). Az antitoxin önmagában in vitro körülmények között (EMSA kísérletek) csak magas koncentrációban képes kötődni az operátorhoz, amely kötés affinitását a toxin jelenléte nagymértékben növeli (Afif és mtsai., 2001, Bodogai és mtsai., 2006). Ez alól az egyik kivétel a ParD antitoxin, mely egymagában is képes gátolni a parde operon transzkripcióját. A transzkripciós gátlás hatékonysága függ a toxin és antitoxin arányától. A CcdA2-CcdB2 tetramer hatékonyan képes kötődni az operátorához, ellentétben a hexamer (CcdA2-CcdB4) formációval 21

30 (Afif és mtsai., 2001, van Melderen és mtsai., 1994). Általában elmondható, hogy a toxin túl magas koncentrációja csökkenti in vivo és in vitro körülmények között az egész TA komplexnek az affinitását az operátorhoz. Ezt a megfigyelést támasztja alá a ParDE addikciós rendszer viselkedése in vitro kísérletekben magas ParE koncentráció esetében (Johnson és mtsai., 1996) és a phd/doc TA rendszer elemeinek működése magas Doc fehérje koncentráció esetében (Magnuson és Yarmolinsky, 1998). A DNS oldalról megközelítve a fehérje-operátor kapcsolatot, általában a kötőhely architektúrája direkt ismédlődő szekvencia, mint a vapbc családba tartozó ntrpr TA rendszer esetén (9. ábra) (Bodogai és mtsai., 2006) vagy fordítottan ismétlődő (inverted repeat, palindrom) régió, mint a phd/doc, és pemik rendszer esetében (Gazit és mtsai., 1999, Tsuchimoto és mtsai., 1988). Nagyon érdekes a mazef TA rendszer operátora, melyben három kötőhely található. A fehérjék MazE3- MazF2 pentamert alkotnak (9. ábra). A toxin ebben az esetben is csak korepresszorként, stabilizáló kereszthídként szolgál (Marianovsky és mtsai., 2001). 22

31 A. E. coli mazef operátor régiója. A három kötőhely, két direkt és egy fordított ismétlődő rész, lefedi a két promótert (P 2 és P 3 ). A MazF korepresszor nem vesz részt a DNS kötésben, csak a MazE. -10 és -35 a promóter elemei (Buts és mtsai., 2005). B. E. coli pemik 18 bp hosszú operátora két (9-9) teljesen szimmetrikus palindromból áll (aláhúzott nukleotidok), mely átfed a -10 promóter régióval (Masuda és mtsai., 1994) TGGTGTGTTTTTTTAGTGGATGTTATATTTAAATATAACTTTTATGGAGGTGAAGAATG C. R. meliloti ntrpr operonja egy 4 bp által elválasztott direkt ismétlődő szekvenciából áll. Az egyik félkötőhely átfedő a transzkripciós startponttal (Bodogai és mtsai., 2006). D. A CcdB és CcdbA fehérjék szerkezete az operátoron. 9. ábra: Operon szerkezetek a TA modulok körében 23

32 A sejtben jelen levő stabil TA komplex csak akkor képes ellátni funkcióját, toxin aktiváció, ha az antidotumként szolgáló antitoxin lehasad a komplexről. A legtöbb esetben ezt a stresszor által aktivált fehérje végzi. Ilyen például a Lon proteáz, mely aminosav éhezés során és stacioner fázisban aktiválódik, illetve a hibás fehérjéket degradálja. Ez a proteáz képes specifikusan bontani a RelB antitoxint és ezáltal aktiválni a RelA toxint (Christensen és mtsai., 2001, Christensen és Gerdes, 2004). Viszont a MazE antidotum inaktivációját a ClpXP (caseinolytic protease) végzi stacioner fázisban (Aizenman és mtsai., 1996) de indirekt bizonyítékok vannak arra nézve, hogy aminosav éhezés során a Lon proteáz is képes inaktiválni az antitoxint (Christensen és mtsai., 2003). proteáz a b c d - target Antitoxin pemi Toxin pemk higb higa ω ε ζ 10. ábra: Addikciós modulok génszerveződése és sematikus ábra az autoregulációról. Fekete az antitoxin, szürke a toxin cisztron (a). A mazf/pemk család egy promóterrel rendelkeznek az antitoxint 5 megelőző irányban (b). A higb és higa cisztronok átírása külön történik, közös autoregulációval (c). Itt a toxin cisztron (higb) 5 irányban, tehát felborítva a klasszikus TA elrendezést, található az antitoxinhoz (higa) képest. A higa promóter átfed a higb ORF-el. Mindkét promótert a TA komplex autoregulálja. Az ω- ε- ζ lókusz három cisztronja közül a ε és ζ külön promóterrel rendelkezik (d). Az Ω fehérje képes regulálni a ε antitoxin és ζ toxin transzkripcióját. 24

33 3. ANYAGOK ÉS MÓDSZEREK 3.1. Felhasznált baktériumtörzsek és bakteriofágok E.coli DH5α Hanahan, 1983 E.coli BL21(DE3) plys3 Novagen Rhizobium meliloti 41 Szende és Ördögh, 1960 Agrobacterium tumefaciens C58 Cereon λrs45 fág Simons és mtsai., fág Orosz és Sík, Felhasznált plazmidok név rezisztencia referencia pcu101 Cm Thatte és mtsai., 1985 pcu996ω Sp/Str Banerjee és mtsai., 1992 pmlb1109 Amp Papp és mtsai., 1993 prk2013 Km Figurski és Helinski, 1979 psem155 Km Ferenczi és mtsai., 2004) psem289 Km Ferenczi és mtsai., 2004 psem211 Km Ferenczi és mtsai., 2004 psem91 Km Semsey és mtsai., 1999 ppm232 Km Papp és mtsa., 2002 ppm238 Km Ferenczi és mtsai., 2006 pgsb1 Sp Ferenczi és mtsai., 2004 pgsb42 Sp Ferenczi és mtsai., 2004 pgsb62 Sp Ferenczi és mtsai., 2004 pbad24 Amp Guzman és mtsai., 1995 papr1 papr11 papr2 Amp, pgsb1 Acc65I Klenow+ pempr up és pempr low 133 bp fragment Amp, pgsb1 Acc65I Klenow+ pempr up és pemprk low 455 bp fragment Amp, pmlb1109 Acc65I Klenow+ pempr up és pempr low 133 bp fragment 25

34 ppik1 Amp, pbad24 NcoI-BamHI + IbadNco- pemklowbam fragment ppi1 ppk1 Amp, pbad24 NcoI-BamHI + IbadNco- pemilowbam fragment Amp, pbad24 NcoI-BamHI + KbadNco- pemklowbam fragment pet 16 pet 22 Amp Amp Novagen Novagen peti16 Amp, pet16 NdeI-BamHI+pemI antitoxin, N-term. His-Tag (peminde- pemilowbam fragment) petk22 Amp, pet22 NdeI-BamHI+pemK toxin, C-term. His-Tag (pemknde up-pemknoth fragment) peik22 Amp, pet22 NdeI-BamHI+pemI natív és pemk C-term. His-Tag (pemindepemknoth fragment) pprm1 Amp, pmlb1109 Acc65I Klenow+apr low és apr up szint. oligonukl. pprm2 pprm3 Amp, pmlb1109 Acc65I Klenow+aprac3low és aprac3up szint. oligonukl. Amp, pmlb1109 Acc65I Klenow+aprtg4 low és aprtg4 up szint. oligonukl. pk22 Amp, pet 22 NdeI-BamHI+pemK toxin (pemkndeup- pemklow fragment) pi22 Amp, pet 22 NdeI-BamHI+pemI toxin (peminde- pemilow fragment pik22 Amp, pet 22 NdeI-BamHI+ pemik toxin (peminde- pemklow fragment) 3.3. Oligonukleotidok Sp6 up Sp6 low Sp4 up Sp4 low CM-E low XbaIrep5 CMlsI-EagI up CMlsI-EagI low Ala1 up Ala1 low Ala2 up Ala2 low Ala4 up Ala4 low 5` 3` ttgactacaattgtagttgtatatagt actatatacaactacaattgtagtcaa ttgactctacaattgattgtatatagt actatatacaatcaattgtagtcaa ggccggcaaataggttgttgatcgcctgggcgctttg g gataatctagaatgcataaagggacatttcac c caa agc nnn nnn gcg atc aac aac cta ttt gcc ggcc ggc aaa tag gtt gtt gat cgc nnn nnn gct ttg g c caa agc gcc cag gcg atc aac aac cta ttt gcc ggcc ggc aaa tag gtt gtt gat cgc ctg ggc gct ttg g c caa agc caa gcc gcg atc aac aac cta ttt gcc ggcc ggc aaa tag gtt gtt gat cgc ggc ttg gct ttg g c caa agc caa cag gcg gcc aac aac cta ttt gcc ggcc ggc aaa tag gtt gtt ggc cgc ctg ttg gct ttg g 26

35 Ala5 up c caa agc caa cag gcg atc gcc aac cta ttt gcc Ala5 low ggcc ggc aaa tag gtt ggc gat cgc ctg ttg gct ttg g Ala6 up c caa agc caa cag gcg atc aac gcc cta ttt gcc Ala6 low ggcc ggc aaa tag ggc gtt gat cgc ctg ttg gct ttg g Ala7 up c caa agc caa cag gcg atc aac aac gcc ttt gcc Ala7 low ggcc ggc aaa ggc gtt gtt gat cgc ctg ttg gct ttg g pempr up gcggaagccggttattc pempr low cctggcgtcttattttcgtg pemprk low ttcgtccttgatttcgctgcctac laczprex ggcgcgcccccgggtacc IbadNco KbadNco catgccatggccgtgaccacgaaaataa catgccatggtccgcaaccagatccccaagc pemilowbam cgggatccctatcacaacgcttctttgccgaca pemklowbam cgggatcctcaagctggatcgatcatgc peminde ggaattccat atgaccgtgaccacgaaaataaga pemkno th ataagaat gcggccggatcgatcatgctgatga pemknde up ggaattccatatggtccgcaaccagatccccaagc apr up aattcttgacatcatgatgatctgtgctacatatgttgcacag apr low gtacctgtgcaacatatgtagcacagatcatcatgatgtcaag aprac3 up aattcttgacatcatgatgatcagtgctacatatgttgcaccg aprac3 low gtaccggtgcaacatatgtagcactgatcatcatgatgtcaag aprtg4 up aattcttgacatcatgatgatctgttctacatatgttggacag aprtg4 low gtacctgtccaacatatgtagaacagatcatcatgatgtcaag 3.4. Baktériumok tenyésztéséhez használt táptalajok Az Escherichia coli és Agrobacteriu m tumefaciens baktériumtörzsek szaporításához LB ( Sambrook és msati., 1989) komplett tápoldatot és 1,5% agart tartalmazó LB-t, mint szilárd táptalajt, használtunk. A R. meliloti törzseket GTS (Kiss és mtsai., 1980) minimál táptalajon növesztettük. A kísérletek folyamán az E. colit 37 C-on, a R. meliloti 41-et és az A. tumefaciens C58-at 28 C-on szaporítottuk. A szelekció ra használt antibiotikumokat a következő végkoncentrációkban alkalmaztuk: ampicillin: 100 µg/ml; spektinomicin : 50 µg/ml; kloramfenikol 20 µg/ml (E.coli) 27

36 kanamicin: 30 µ g/ml (E. coli), 400 µg/ml (R. meliloti), 100 µg/ml (A. tumefaciens); spektinomicin: 100 µg/ml (A. tumefaciens, R. melilo ti) 3.5. A plazmidba épített fragment fágba juttatása homológ rekombinációval (Simons és mtsai., 1987) A pmlb1109 plazmidba építettük a promótert tartalmazó szintetikus oligonukleotidokat, majd 2% maltózt tartalmazó YTB, folyadékban éjszakán át felnövesztett (10 8 CFU/ml) pmlb1109 plazmid származékát tartalmazó E.coli sejtekhez CaCl 2 és MgCl 2 adtunk 10 mm/ml végkoncentrációban majd λrs45 fágtörzzsel felülfertőztük (10 8 PFU/ml, multiplicitás =1). Az optikai denzitást félóránként mértük, majd amikor már nem csökkent tovább (baktériumok lízisének, burst, vége) tized térfogat kloroformmal leállítottuk a fertőzést. Centrifugálás után a fágokat titráltuk baktérium pázsiton és a kék, rekombináns fággal fertőzött plakkból a lizogén baktériumokat szélesztéssel egy telepre tisztítottuk, majd kompetens sejteket állítottunk elő (Mandel és Higa, 1970) Plazmid DNS bejuttatása baktériumsejtekbe Bakteriális sejtek transzformálása A transzformáláshoz használt E. coli kompetens sejtek előállítása Mandel és Higa módszere szerint történt (Mandel és Higa, 1970). Transzformáláskor a mélyhűtött kompetens sejteket 10 percig jégen tartva felolvasztottuk, majd a plazmid DNS hozzáadása és rövid keverés után 30 percig jégen inkubáltuk. Ezt követően 2,5 perces hősokkot alkalmaztunk 42 C-on, majd 5 percig jégen inkubáltuk a mintákat. Szelektív táptalajra szélesztés előtt 40 percig, LB tápoldatban regeneráltuk a sejteket, 37 C-on Konjugáció (három szülős) A plazmid DNS recipiens sejtekbe juttatásához az E. coli DH5α törzsét használtuk donorként. A folyamathoz a prk2013 vagy a pcu101 plazmidot tartalmazó konjugációs helper törzseket alkalmaztuk. A donor, a recipiens és a helper sejteket szilárd táptalajon -egy éjjelen át- együtt inkubáltuk 28 o C-on, majd a mintákat antibiotikumot tartalmazó LA vagy GTA táptalajra szélesztettük. 28

37 3.7. Plazmid DNS tisztítása A plazmid DNS tisztítását alkalikus feltárással végeztük (Birnboim és Doly, 1979). A nukleotidsorrend meghatározáshoz szükséges nagyobb tisztaságú DNS-t, a QIAGEN cég által gyártott Qiaprep plazmid miniprep kittel izoláltuk. A munka során a gyártó utasítása szerint jártunk el Totál-DNS preparátum készítése Kései logaritmikus fázisig növesztett baktériumkultúrából 1,5 ml-t centrifugálás után 100 µl TE oldatban (50 mm Tris HCl ph 8, 50 mm EDTA) szuszpendáltunk, majd 10 µl lizozim hozzáadása után 20 percig jégen inkubáltunk. A mintákat 25 µl STE (5 mm Tris HCl ph 8, 300 mm EDTA, 0,5% SDS) és 25 µl Proteináz K (10 mg/ml) hozzáadását követően 15 percig inkubáltuk 50 o C-on. A mintákhoz 300 µl vizet, majd 100 µl fenolt és ugyanennyi kloroformot adtunk. Óvatos keverés, majd 10 perces ford./perc végzett centrifugálás után a felső fázishoz, új csőben, 400 µl dietil- Keverést és 10 perces centrifugálást követően, az alsó fázist fenolos/kloroformos, étert mértünk. majd kloroformos kezeléssel tisztítottuk. A DNS-t 40 µl 5 M kálium-acetát és 1 ml izopropanol hozzáadásával csaptuk ki. A preparátumot 75% etanolban mostuk, majd a beszárítást követően 100 µl desztillált vízben felvettük Totál-RNS preparátum készítése A bakteriális totál RNS mintákat QIAGEN RNeasy Mini Kittel a gyártó előírásai szerint végeztük DNS minták emésztése restrikciós endonukleázokkal A DNS mintákat a gyártó által javasolt pufferekben, µl végtérfogatban, 1-16 órán át emésztettük. Több enzimmel való együttes emésztés esetén olyan puffert választottunk, amelyben a felhasznált enzimek legalább 75%-os hatékonysággal működnek. Az emésztéseket az adott enzimhez előírt hőmérsékleten 2-10 U enzim felhasználásával végeztük. 29

38 3.11. DNS fragmentumok elválasztása A restrikciós emésztés és a PCR során keletkező DNS fragmentumokat 0,7-1,0%-os agaróz vagy 2-3%-os NuSieve (FMC) gélen választottuk el. A gélelektroforézist TBE pufferben (90mM Tris-HCl, 90 mm bórsav, 20mM EDTA) végeztük, 1 mg/l etidium-bromid jelenlétében. Az elválasztás eredményét UV fényben tettük láthatóvá DNS fragmentumok izolálása agaróz gélből A DNS fragmentumok izolálására a QIAEX II Gel Extraction kit-et használtunk. A munka során a gyártó utasításait tartottuk szem előtt Szintetikus oligonukleotidok plazmidba építése A szintetikus oligonukleotidokat azonos moláris mennyiségben összekevertük fmol Sequencing kit (Promega) 1x pufferben, majd 80 C-os vízfürdőben 2 percig inkubáltuk. Ezt követően hagytuk kihűlni szobahőmérsékletig. A ligálási reakció után a folyamatot megismételtük és a plazmidoligonukleotid ligátumot kompetens sejtekbe juttattuk transzformációval DNS fragmentumok ligálása A klónozáshoz elengedhetetlen ligálási reakció 20 µl végtérfogatban ment végbe, amely szobahőmérsékleten ragadós végek esetén 1 órát, tompa végek esetén két órát vett igénybe. A reakciót T4 DNS ligáz (Fermentas vagy Promega) katalizálta (1 Weiss unit/ rekció) DNS nukleotidsorrend meghatározása A DNS nukleotidsorrendet didezoxi-terminációs módszerrel határoztuk meg (Sanger és mtsai., 1977). Az fmol Sequencing kit (Promega) használatakor a gyártó utasításai alapján állítottuk össze a reakciókat. A radioaktív jelölést [α 32 P] datp direkt inkorporációval, illetve a DN-áz footprinthez használt molekulatömeg marker esetében végjelölt primer felhasználásával végeztük. A radioaktívan jelölt fragmentumokat 6%-os denaturáló (8 M urea, 38:2 akrilamid-biszakrilamid) 30

39 poliakrilamid gélen választottuk el. Az elválasztás során 1xTBE puffert 70 W teljesítményt és 40 ma áramerősséget használtunk Transzkripciós starthely meghatározása (primer extension) A reakcióhoz tervezett primer (laczprex) 5 végét [γ 32 P]ATP-vel jelöltük T4 polinukleotid kinázzal (Gibco). A reakciót 20 µl térfogatban végeztük, ami tartalmazott 50 µg, totál RNS-t, 2 pmol radioizotóppal jelölt DNS primert, mind a négy nokleotidból 2 mm-t, 2 M betaint, 1 mm MnCl 2 -ot, 10 mm Tris-HCl-t (ph 8,3), 90 mm KCl-ot és 5 egység Tth DNS polimerázt (Promega). A reakcióelegyet 74 o C-on 30 percig tartó inkubálás után etanollal kicsaptuk, majd RN-ázzal emésztettük 37 o C-on 30 percig. A terméket 6%-os denaturáló (8 M urea) poliakrilamid gélen (38:2 akrilamid-biszakrilamid) választottuk el. Az autoradiogrammot Storm 840 Phosphorimager (Molecular Dynamics, Sunnyvale, CA, U.S.A.) készüléken vizualizáltuk Polimeráz láncreakció (PCR) A polimeráz láncreakciót DNS szakaszok amplifikálására használtuk. A fehérje termeltetéshez előállított rekombináns plazmidokba épített inszertek amplifikációját Pfu (Promega) polimerázzal végeztük. Nagyobb méretű DNS darabok amplifikálásánál KlenTaq (Sigma), más esetekben Taq (Promega, Fermentas) polimerázokat használtuk. Az enzimek használatakor a gyártó utasításait követtük. Általában a reakciókat 50 µl végtérfogatban, pmol primer, 2,5 mm MgCl 2, 2µl 2,5 mm dntp oldat, 2-5 U polimeráz és 5 µl 10X polimeráz puffer jelenlétében végeztük β Galaktozidáz aktivitás mérés Az E. coli, R. meliloti és az A. tumefaciens törzsekben végzett β galaktozidáz aktivitásának meghatározása Miller és munkatársai által kidolgozott módszerrel történt (Miller, 1972). 31

40 Represszió értékek (R) meghatározása A repressziót az alábbi egyenlet alapján számítottuk: MU= Miller Unit MU, indukált, fehérjét termelő R= 1 - MU, indukálatlan, fehérjét nem termelő Fehérje túltermeltetés Az expressziós vektorba (pet16, pet22, Novagene) épített DNS fragmentek által kódolt fehérjék túltermeltetésére E. coli BL21(DE3)pLys3 törzset használtuk. A transzformálás során keletkezett telepek éjszakán át szaporított tenyészeteit 100x-ra higítottuk, és OD 600 0,6-0,8 értékig (kései log fázis) növesztettük. Az expresszió indukciójához IPTG-t alkalmaztunk (0,5 mm IPTG) 2-3 órán keresztül 37 C-os inkubációval Fág DNS tisztítás A bakteriofág DNS tisztítását Dallmann és munkatársai (1979) által leírtak szerint végeztük Fehérjék elválasztása A fehérjék elválasztását Laemmli által leírt SDS-poliakrilamid gélelektroforézissel végeztük (Laemmli, 1970). A gélt és a puffereket Sambrook és mtsai által leírtak alapján készítettük. A gélben a fehérjéket Coomassie brillant blue festékkel festettük meg, majd a felesleges festéket 10% ecetsavat és 20% metanolt tartalmazó eleggyel mostuk ki. A glutáraldehid keresztkötés során a tisztított PemI és PemK (His) fehérjéket az EMSA kísérletekben használt összetételű pufferben 1% végkoncentrációjú glutáraldehiddel inkubáltuk 10 percig szobahőmérsékleten és utána a fentieknek megfelelően végeztük az SDS-poliakrilamid gélelektroforézist His-Tag jelölt fehérjék izolálása, tisztítása A His-Tag jelölt fehérjéket QIAGEN QIAexpress kittel tisztítottuk, a gyártó utasításait követve. 32

41 3.23. Gél-retardációs teszt ( band-shift ) A hidroxil gyök interferencia footprint reakciókhoz szükséges EMSA kísérleteket Bodogai és mtsai. által leírtak alapján végeztük (Bodogai és mtsai., 2006) DN-áz I footprint A DN-áz I protekciós footprint kísérleteket Bodogai és mtsai. által leírtak alapján végeztük (Bodogai és mtsai., 2006). Az autoradiogrammokat Storm 840 Phosphorimager (Molecular Dynamics, Sunnyvale, CA, U. S.A.) készüléken vizualizáltuk Hidroxil gyök footprint A hidroxil gyök interferencia footprint vizsgálatokat Papp és munkatársai által leírtak alapján hajtottuk végre (Papp és mtsai., 2000). Az autoradiogrammokat Storm 840 Phosphorimager (Molecular Dynamics, Sunnyvale, CA, U.S.A.) készüléken vizualizáltuk Bioinformatikai módszerek és internet oldalak A vizsgált organizmusok ortológ génjeit az NCBI mikrobiális BLAST programjával azonosítottuk (Pearson és Lipman, 1988). A génsebészeti manipulációkhoz szükséges nukleotid bázissorrend információkat is innen merítettük. ( Vegyszerek és enzimek A felhasznált finomvegyszerek a Reanal, Serva és a Sigma cégektől származtak. A restrikciós endonukleázokat a Promega, az MBI Fermentas és az Amersham cégektől vásároltuk. A Pfu, a Taq polimeráz és Klenow polimeráz enzimeket a Promega, míg a KlenTaq polimerázt a Sigma cégtől szereztük be. A T4 DNS ligázt az MBI Fermentas cégtől vásároltuk. A radioizotóppal jelölt nukleotidokat az Izotóp Intézet Kft. szállította. 33

42 34

43 4. EREDMÉNYEK 4.1. Bevezetés A dolgozat látszólag két eltérő rendszer vizsgálatából épül fel, melyek között a közös kapcsolódási pont, hogy DNS-fehérje interakciós vizsgálatokat használtunk a génszabályozási funkció és a molekuláris szintű szerkezetek tisztázásához. Mindezen elemeket olyan részletességgel vizsgáltuk, hogy elkészíthessünk egy működési modellt, illetve a 16-3 fág represszor esetében egy már meglevő modellt kiegészíthessünk. Kísérleteink során egyrészről az általunk létrehozott egy kópiás in vivo riporter rendszerekkel vizsgáltuk a 16-3 fág eredetű vad és aminosavcserét tartalmazó mutáns C represszor fehérjéknek a kölcsönhatását vad és mutáns operátoraikkal. Célunk ezzel egy olyan szupressziós fenotípust, megváltozott specificitást, adó mutáns represszor izolálása, mely a DNS-fehérje komplex kialakulásának pontosabb megértéséhez közelebb vihet minket. Ezekkel a kísérletekkel a represszor és operátorainak dokkolási mintázatát vizsgálhatjuk, vagyis hogy a két vad operátoron (O R2 és O L2 ) a dokkolási felület használatában létezik-e eltérés. Másrészről A. tumefaciensből izolált pemik ortológ toxin-antitoxin (TA) rendszer operonjának finom molekuláris architektúráját és funkcióját tanulmányoztuk. Vizsgáltuk promóter régióját, azonosítottuk operátorát és regulációs viszonyait. A fehérjék inerakciójának vizsgálatát célzó kísérleteket kiegészítettük fehérje-fehérje kölcsönhatás kimutatására alkalmas keresztkötési eljárásokkal is Egy kópiás in vivo mérőegység előállítása Számos genetikai tanulmány és biotechnológiai manipuláció igényli, hogy a gazdasejtben végezzenek kísérleteket a vizsgálni kívánt szabályozó fehérjékkel és operátoraikkal. A különböző fajok eltérő anyagcserével, belső miliővel (ph, ionerősség stb.) rendelkeznek, mely nem minden esetben teszi lehetővé a pontos tanulmányozást, kizárja például a gazdafaktorok hatásait, egy másik fajban vizsgálva. Amennyiben a legprecízebb összehasonlításokat szeretnénk elvégezni, törekednünk kell a vizsgált operátor riportergén kópiaszámának stabilitására. Ha az operátor riportergén episzómán van jelen, akkor nem állandó a kópiaszáma, hiszen ez változhat bizonyos anyagcserefolyamatok, antibiotikomok, sejtet ért stressz hatására. Ezért szükség van egy stabil, lehetőleg kromoszómára integrált, egy kópiás mérőrendszerre. Ezen kívül ez a felállás modellezi leginkább a profág stádiumot, ami a bakteriofág represszorok és operátoraik vizsgálata során igencsak előnyös helyzet. 35

44 Még szerencsésebb a helyzetünk, ha a mérőegység integrációja nem befolyásolja a sejt életfolyamatait. Munkánk során a R. meliloti fágjának c represszor génje által kódolt C represszor fehérje és operátorainak kölcsönhatását tanulmányoztuk. A gazdasejtben történő in vivo vizsgálatokhoz ezért előállítottunk egy a 16-3 fág helyspecifikus rekombinációs rendszerét is hordozó integratív plazmid vektort. A vektor építése során a psem143 plazmidba (Semsey és mtsai., 2002) beépítettük a 16-3 fág funkcionális attp régióját tartalmazó 261 bp hosszú DNS fragmentet. Az így kapott psem155 plazmidba (Semsey és mtsai., 2002) a psem164 plazmid (Semsey és mtsai., 1999) 16-3 fág helyspecifikus integrációját katalizáló integrázt termelő egységét építettük. Az így kapott psem289 plazmid kanamicin rezisztenciát kódoló PvuII fragmentet deletáltuk és helyére beépítettük a pcu996ω (Banerjee és mtsai., 1996) spektinomicin rezisztenciát kódoló inszertet, majd a plazmid Acc65I feltöltött helyére beépítettük a pmlb1109 plazmid (Papp és mtsai., 1993) 4,2 kbp hosszú DraI fragmentjét, mely tartalmaz egy promoter nélküli lacz gént T 1 T 2 terminátorokkal határolva 5`irányból. Az így kapott pgsb1 plazmidba KpnI/Acc65I restrikciós helyre lehet inszertálni a vizsgálni kívánt operátor-promóter régiót tartalmazó DNS darabot (11. ábra). A pgsb1 plazmid psc101 replikont tartalmaz, mely csak E. coliban biztosítja a replikációt, míg R. melilotiban, és a vele rokonságot mutató számos baktériumfajban, nem. A vektor mob régiója pcu1 eredetű, ami biztosítja pcu101 konjugációs helper plazmid segítségével a vektor mobilizálását konjugációval E.coliból R. melilotiba. Az attp régió és a tac promoter által meghajtott 16-3 int gén lehetővé teszi a célzott helyspecifikus integrációját a plazmidnak az R.meliloti 41genoforjába a cys46 és met5 gének között, az attb régiónál, a bakteriális gének funkcióvesztése nélkül (Blaha és mtsai,. 2004). A lacz gén hatékony riportergén és az upstream található T 1 T 2 terminátorok gátolják a nemkívánatos, zavaró transzkripciót 5`irányból. A spektinomicin rezisztenciát biztosító gén (Sp r ) nagyon jól működő szelekciós marker minden általunk vizsgálni kívánt baktériumfajban. 11. ábra.: pgsb1 vektor térképe az egyedi restrikciós helyek feltüntetésvel. 36

45 pgsb1 vektor tesztelése a 16-3 fág C represszor fehérje és a vad típusú operátorainak in vivo vizsgálatára Sajnálatos módon R. melilotiban nem áll rendelkezésre az E. coliban megszokott promóterek széles tárháza, ezért kénytelenek voltunk egy hatékony, de nem túl magas alapaktivitást mutató R.melilotiban is használható promóter kiválasztására. E célból terveztünk olyan σ 70 típusú promóterhez hasonló oligonukleotidokat, melyek tartalmaztak egy 14 bp hosszú O R2 represszor kötőhelyet a -10 és -35 promóter elemek közé ékelődve, megtartva az ideális 15 bp távolságot a két fontos promóter box között (12A ábra). A -10 régióban az N jelölés bármelyik nukleotid lehet. Azért, hogy R. melilotiban kiválogathassuk a megfelelő promótereket a psem91 plazmid (Semsey és mtsai., 1999) Acc65I restrikciós helyét, ragadós véget vágó restrikciós endonukleáz, emésztés után Klenow polimeráz segítségével feltöltöttük és a pmlb1109 plazmid (Papp és mtsai., 1993) 4,2 kbp hosszú DraI fragmentjét beépítettük. Az így kapott psem211 konjugatív mérőplazmid képes replikálódni R. melilotiban is, ellentétben az integratív, nem replikatív pgsb1 plazmiddal, melynek visszanyerése R. melilotiból nagyon körülményes. Szintetikus degenerált oligonukleotidok felhasználásával a psem211 Acc65I, a fent leírt módon tompa véget generálva, restrikciós helyre építettük a promoter-operátor egységet, majd E. coliba transzformációval bejuttatott plazmidokat konjugációval R. melilotiba juttattuk. A kék színű, magas béta-galaktozidáz aktivitású, kolóniákból plazmidot izoláltunk és nukleotidsorrend meghatározást végeztünk. Az eredmények alapján a TATAGT nukleotidokat tartalmazó -10-es boxot tartalmazó promótert használtuk a fág C represszor és operátorainak kölcsönhatása vizsgálata során (12B ábra). 37

46 A TTGACTACAATTGTAGTTGTATNTANT-3 O R2 operátor B TTGACTACAATTGTAGTTGTATATAGT-3 O R2 operátor 12. ábra: R. melilotiban használható promóter előállítása. (A) Degenerált -10 régióval és 14 bp hosszú O R2 kötőhellyel felruházott szintetikus promoter. (B) Általunk szelektált, a későbbiekben a R. melilotiban használt szintetikus promóter. A szelekció után kiválasztott promóter környezetbe szintetikus oligonukleotidok felhasználásával építettük a pgsb1 Klenow polimerázzal feltöltött Acc65I helyére az O L2 operátort és az O R2 kötőhelyeit tartalmazó szintetikus promóter-operátor egységeket (O L2 5 -TTGACTCTACAATTGATTGTATATAGT -3 tartalmazza a pgsb42 és O R2 5 -TTGACTACAATTGTAGTTGTATATAGT -3 tartalmazza a pgsb62 plazmid) A pgsb42 és pgsb62 integratív, R. melilotiban nem replikálódó, mérőplazmidokat konjugációval stabilan beépítettuk a R. meliloti 41 és az A. tumefaciens C58 kromoszómájába. Az A. tumefaciens esetében is ugyanaz a konzervált prolin-trns-t kódoló genom rész szolgál integrációs célul, mint a R. melilotinál. A plazmidjaink mindkét fajban egyaránt stabil helyspecifikus integrációra képesek (Semsey és mtsai., 2002). Az A. tumefaciens C58 azért is érdekes számunkra, mert széles körben használatos organizmus a biotechnológiában és közeli rokona a R. melilotinak, ezért jó kontroll organizmusként szolgál. Ezt követően a vad típusú 16-3 c gént hordozó (psem91-ből előállított) ppm232 (Papp és mtsai., 2002) R. melilotiban és A. tumefaciensben is replikatív plazmidot, illetve a kontrollként használt represszort nem tartalmazó psem91 plazmidokat konjugációval átjuttattuk a vizsgált baktérium fajokba. A represszort így transz helyzetből plazmidról tudtuk, nagy moláris túlsúlyban, termeltetni és a lacz riportergénen keresztül mértük a represszió értékeket a két vad típusú operátoron (O L2 és O R2 ). A kapott eredményeket a 13. ábra mutatja. 38

47 Represszor Operátor O L2 O R2 R. meliloti A. tumefaciens MU 46 ± ± 5 MU R - R ± ± Vad típus R. meliloti A. tumefaciens 10 ± 0 45 ± ± 1 40 ± ábra. Vad típusú represszor hatásának vizsgálata két vad típusú 16-3 fág operátoron R.meliloti és A. tumefaciens esetében. MU= Miller Unit, R= represszió mértéke A mérések alapján megállapíthatjuk, hogy a két vizsgált vad típusú operátor (OL2 és O R2 ) a genoforra célzottan bejuttatva, a vad C represszort transz helyzetből termeltetve mindkét fajban szinte azonos represszió értékeket adott. Az eredmények alapján, tehát a konstruált mérőegység alkalmas a 16-3 bakteriofág C represszorának és operátorainak tanulmányozására a gazdaszervezetben A C represszor felismerő hélix aminosav oldalláncainak fontossága az operátorokkal kialakított kölcsönhatás során (alanin scanning) A 263 aminosavból felépülő C represszor fehérje felismerő hélix része a homológiák alapján jól prediktálható. A más helix-turn-helix típusú DNS kötő fehérjékhez hasonlóan a DNS kötő motívum egy különálló, a 16-3 C represszor esetében is kilenc aminosavból felépülő hélixet képez ( 14. ábra). A hélix aminosavainak oldalláncai nem mind egyenértékűek a felismerés, dokkolás és kötés tekintetében. A hasonló represszor fehérjék esetében a hélix első, második, ötödik illetve hatodik aminosavainak oldalláncai a legbefolyásosabbak az operátor felismerésben. MHKGTFHMSRLTDTLAAKLEEAGITQAELARRVGQSQQAINNLFAGRAASSMVWRELAR ELGIDEQEMRQMMTEAGRDPEKVTSLAGLRKYRAVLPSPREPFPIIRQQEHLPRPNATIGEE TNMEPRKKKLLPVLGEAVGGEDGEYIFNGSVLDYVDCPPSLENVPNAYAVYIDGESMVPR FRPGETVWVHPTKPPRRGDDVVIQIHPDNEDDGAPPRGFVKEFVGWTANKLVLQQYNPTK KIEFTREQVVSVHPIILAGKYW 14. ábra.: 16-3 bakteriofág C represszorának aminosavsorrendje. Kiemelt aminosavak alkothatják nagy valószínűséggel a DNS nagy árkába fekvő, az ott lévő bázisokkal specifikus kapcsolatot kialakító felismerő vagy 2. hélixet. Azért, hogy meghatározzuk a felismerő hélix egyes aminosavainak részvételét az operátor felismerésében, kötésében, előállítottunk egy olyan kísérleti rendszert, mely alkalmas 39

48 aminosavcserék generálására az általunk vizsgálni kívánt felismerő hélixet is tartalmazó represszor régióban. A fág genomról oligonukleotid primerek felhasználásával PCR-el izolált C represszor fehérjé t kódoló ORF részt tartalmazó ppm232 plazmidot XbaI-EagI restrikciós endonukleázokkal emésztettük, deletálva a represszort kódoló régió egy részét. Ezt követően XbaIrep5 és CM-E low oligónukleotid primerekkel a deletált rész az intakt ppm232 p lazmid DNS tem plátról amplifikáltuk és beépítettük a ppm232 plazmid XbaI-EagI restrikciós endonukleázokkal linearizált vektorba. Így szintetikus oligonukleotid primerek felhasználásával egy olyan, a két hélixet elválasztó turn részre eső, MscI hasítóhelyet tartalmazó represszort kódoló plazmidot hoztunk létre, melynek a transzláció során az aminosav sorrendje identikus a vad represszoréval. Az így kapott ppm238 plazmid MscI- EagI restrikciós helyei közé szintetikus oligonukleitidokat építhetünk, melyek aminosavak kicserélését teszik lehetővé frame shift és más mutáció kizárása mellett (15. és 16. ábrák). T T 1 2 EagI MscI C ME P tac Km r PCU1ori 15. ábra: ppm238 plazmid térképe, feltüntetve a hélix cserét lehetővé tevő régiót és restrikciós endonukleázok hasítóhelyeit. tggc CAA AGC CAA CAG GCG ATC AAC AAC CTA TTT GCC ggccg MscI Gln Gln Ala Ile Asn Asn Leu Phe Ala EagI Q37 Q38 I40 N41 N42 L ábra.: C represszor fehérje felismerő hélixének cseréjére alkalmas DNS szakasz és a mutáltatott aminosavak. Annak eldöntésére, hogy az adott pozícióban jelen levő aminosavak oldalláncai az operátoron történő dokkolásban és kötésben szerepet játszanak-e, nagyon rövid oldalláccal rendelkező alaninra 40

49 cseréltük le a Q37, Q38, I40, N41, N42 és I43 aminosavakat az Ala1, Ala2, Ala4, Ala5, Ala6 és Ala7 oligonukleotid párok beépítésével a ppm238 plazmid MscI- EagI restrikciós helyei közé, a 39. pozícióban a vad típusú represszor is alanint tartalmaz. Az alanin scanning tervezésénél Ebright előírásait tartottuk szem előtt (Ebright, 1991). A nukleotidsorrend ellenőrzését követően a vad és alanin mutáns represszorokat kódoló vektorokat, valamint a represszort nem kódoló, negatív kontrollként szolgáló, psem91 plazmidot a két vad típusú operátort tartalmazó (pgsb42 és pgsb62 integratív plazmidokat már a kromoszómán hordozó) R. meliloti 41 törzsébe juttattuk konjugációval. A lacz riportergénen keresztül meghatároztuk a represszió mértékét az O L2 és O R2 operátorokon az alanin cserés represszoroknak. A kapott eredményeket a 17. ábra mutatja. Represszor Operátor C wt ME C C Q37A C Q38A C I40A C N41A C N42A C L43A OL2 0,80 0,76 0,12 0,30 0,31 0,21 0,34 0,37 OR2 0,81 0,79 0,13 0,24 0,25 0,23 0,43 0, ábra: Vad és alanin cserés mutáns represszorok R értékeinek eredménye vad operátorokon (O L2 és O R2 ). C ME a vad represszorral azonos aminosavsorrenddel rendelkező, aminosavcserét lehetővé tevő konstrukció. SD < 5% A mérések alapján elmondhatjuk, hogy a ppm232 plazmidról átíródó vad represszor hatékonysága a vad operátorokon megegyezik a ppm238 vektorról hajtott MscI- EagI cserélhető panelt tartalmazó vad represszorral identikus aminosavsorrenddel rendelkező represszorral, tehát az új restrikciós hely kialakításával járó nukleotidcserék nem befolyásolták a transzlációt és a funkciót. A kísérleti rendszer tehát alkalmas a represszor mutációk vizsgálatára. A legnagyobb funkciókiesést a Q37 C pozíció, a legkisebb hatású mutációt pedig a C L43 minosavak alanin cseréje okozta. A két operátor viselkedése nem mutatott jelentős eltérést az alanin csere hatására Operátor mutánsok előállítása A két eltérő hosszúságú vad operátor és a C represszor fehérje kölcsönhatása kapcsán felmerül az az alapvető kérdés, hogy a DNS-fehérje komplex kialakulása során azonos vagy eltérő a dokkolási felszín, vagyis a két eltérő hosszúságú operátor esetében ugyanazon atomcsoportok között jön-e létre a kötés vagy eltérő oldallánc és bázis kapcsolatok vesznek részt a komplex kialakulása során. Ennek eldöntésére egy megváltozott specificitású, lényegében szupresszor fenotípust adó, mutáns C 41

50 represszort célszerű izolálni. Az ilyen mutáns fehérje viselkedésének vizsgálata a két vad operátoron egyértelműen eldönti a kérdést. Megváltozott specifitású represszor izolálásához szükséges olyan mutáns operátorok előállítása, melyen a vad represszor alcsony R értéket ad (funkcióvesztés) viszont a mutáns represszor a vad típusú represszornak vad operátorhoz közeli represszióval, funkcióval, rendelkezik. Ha a represszorok in vivo riportergén felhasználásával mért R értékeit összehasonlítjuk a fágon adott funkcionális tulajdonságaival, vagyis hogy milyen represszió értéktől mondhatjuk a vad típusú, lizogén fenotípust adó, represszorról, hogy a fágon is hatékonyan működne, nagyon jó támpont lehet a virulens, immunitás inszenzitív természetes O c r mutáns. Ez a fág egy aszimmetrikus A-G nukleotidcserét hordoz (ACGAttgtagTTGT) az O R2 operátor egyik félkötőhelyén, az O R1 megegyező a vad típuséval. Az in vivo, lacz riportergénen keresztül mért eredmények szerint a mutációt hordozó operátor a vad típusú repressziójának csak 69 %-át ( R=0,54) mutatja a vad repres szor jelenlétében mérve. Ez a 0,54 R érték jelzi, hogy ekkora represszió ért ék nem elég a lizogén fenotípus kialakításá hoz az in phage szitu ációban (Papp és mtsai., 2002). A továbbiakban a pgsb1 plazmidba szintetikus oligonukleotidok felhasználásával olyan mutáns operátorokat építettünk, melyek szimmetrikus mutációkat hordoztak minden pozícióban, ami a kötés szempontjából fontos ( 18. ábra). Promóterként a 12. ábrán látható nukleotidkörnyezet szolgált az O R2 operátor mutánsaihoz. A.: O R2 operátor mutánsok elnevezési topológiája A C A A ttgtag T T G T 1, 2, 3, 4-4,-3,-2,-1 B.: Operátorba épített szimmetrikus mutációk nukleotidsorrendje 18. ábra: O R2 típusú operátorok szimmetrikus mutációinak elrendezése (A) és nukleotidsorrendjeik (B). 42

51 Az operátor mutációkat hordozó vektorokat integráltattuk R. melilotiba és meghatároztuk a represszió értékeket a vad represszorral szemben. A mért adatokat a 2. táblázat mutatja. 2. táblázat.: Mutáns O R2 típusú operátorok represszió értékei vad represszorral mérve. SD < 5% operátor R operátor R operátor R operátor R 1-1/gc O R2 1-1/cg O R2 1-1/ta O R2 wt O R2 0,32 2-2/gc O R2 0,39 3-3/gc O R2 0,73 4-4/gc O R2 0,45 0,50 2-2/ta O R2 0,37 3-3/cg O R2 0,42 4-4/cg O R2 0,66 0,60 2-2/at O R2 0,31 3-3/ta O R2 0,58 4-4/ta O R2 0,53 0,81 A szimmetrikus mutációt tartalmazó operátorokon vad represszorral kapott mérési eredményekből láthatjuk, hogy a leginkább lecsökkent R értékeket, legjelentősebb funkcióvesztés, a 2-2 mutáns operátorok és az 1-1 mutánsok csoportjaiból kerültek ki Megváltozott specificitású represszor vizsgálata vad és mutáns O R2 operátorokon A fenti erdményekből kiindulva a legnagyobb funkciókiesést mutató 2-2 mutáns és az 1-1 mutáns operátorokkal nagy valószínűséggel kapcsolatot kialakító Q37 és Q38 aminosavak mutagenezise lehetőséget adhat megváltozott specificitású represszor izolálására. A represszor fehérje aminosavcseréit a ppm238 plazmid MscI- EagI restrikciós hasítóhelyei közé épített, pozícionálisan degenerált szintetikus oligonukleotidok beépítésével végeztük. A kapott mutáns represszorokat nukleotidsorrend meghatározással ellenőriztük. Az előállított aminosavcseréket az 19. ábra jelöli. A. NNN tggc CAA AGC CAA CAG GCG ATC AAC AAC CTA TTT GCC ggccg NNN MscI Gln Gln Ala Ile Asn Asn Leu Phe Ala EagI B. Q37 Ala, Arg, Leu, Ile, His, Q38 Ala, Arg, Met, Glu, Val Q37 Q38 I40 N41 N42 L ábra.: Aminosav mutációk készítése, részlegesen degenerált (NNN) szintetikus oligonukleotidok felhasználásával (A). A 2. hélix Q37 és Q38 pozícióinak mutagenezise során izolált aminosavcserék az adott régióban (B). Az alanin cserék már rendelkezésre álltak a korábbi kísérletekből. 43

52 A mutáns operátor-promóter egységeket integráltattuk R. meliloti 41 genoforba és konjugációval bejuttattuk az aminosavcserés represszorokat, majd a riportergénen keresztül meghatároztuk a represszióra gyakorolt hatásukat. A mérési eredményeket a 3. táblázat foglalja össze 3. tábláz at.: Operátor mutánsok és represszor mutánsok egymáson mért represszió értékeinek 1-1 összefoglaló táblázata. O per utánsokon kapott értékek C Q37 R2 o átor m mutáns represszorokkal -2 Q38 mérve (A). OR2 2 operátor mutánsokon kapott repressziók adatai C mutáns represszorokkal mérve (B). SD < 5% A. 1-1 O R2 O R2 1-1/gc (R) O R2 1-1/cg (R) O R2 1-1/ta (R) O R2 (R) C wt (ppm232) 0,32 0,52 0,60 0,82 C ME (ppm238) 0,28 0,53 0,61 0,80 C Q37Arg 0,12 0,08 0,1 0,29 Q37Leu C 0,18 0,16 0,18 0,28 C Q37Ile 0,31 0,07 0,13 0,23 Q37His C 0,26 0,24 0,18 0,20 C Q37Ala 0,34 0,90 0,38 0,11 B. O R2 2-2 O R2 2-2/gc (R) O R2 2-2/at (R) O R2 2-2/ta (R) O R2 (R) C wt (ppm232) 0,40 0,31 0,37 0,80 ME C (ppm238) 0,36 0,31 0,36 0,80 38Arg C Q 0,23 0,075 0,13 0,07 C Q38Met 0,13 0,07 0,13 0,15 C Q38Glu 0,20 0,15 0,19 0,22 Q38Val C 0,21 0,32 0,25 0,28 Q38Ala C 0,16 0,21 0,18 0,25 Az eredmények alapján elmondhatjuk, hogy sikeresen izoláltunk egy megváltozott specificitású C Q37Ala represszort, mely képes volt a vad represszorral szemben funkcióvesztett O 1-1/cg R2 mutációt igen nagy hatékonysággal szupresszálni. 44

53 Megváltozott specifitású mutáns represszor viselkedése O L2 típusú operátoron Az O L2 és O R2 operátorok félkötő régiói az eltérő 4 illetve 6 nukleotid szeparáció miatt más térbeli elrendeződést mutatnak. Ennek ellenére funkcionálisan megegyeznek és a mért repressziók értéke a két operátor típuson gyakorlatilag ugyanaz a vad represszorral vizsgálva. Ha a represszor DNS kölcsönhatás során azonos aminosav oldalláncok és nukleotidok vesznek részt, akkor a rövidebb 1-1/cg operátor O R2 op erátorral megeggyező mutációját is képes szupresszálni a megváltozott specificitású alanin cserés represszor. Ennek megvizsgálására létrehoztunk egy olyan pgsb42 alapú konstrukciót szintetikus oligonukleotid primerek felhasználásával, mely az OL2 típusú operátoron is alkalmas a megváltozott specificitású represszor vizsgálatára. A vad O L2 operátort (TTGACTCTACAATTGATTGTAT ATAGT) és az O azonos mutációját hordozó O L2 R2 1-1/ cg 1-1/cg operátorra jellemző nukleotidsorrenddel rendelkező O L2 mutáns operátort (TTGACTCTCCAATTGATTGGATATAGT) integrálta ttuk R. melilotiba és konjugációval a vad és szupresszor represszorokat tartalmazó vektorokkal meghatároztuk a kölcsönhatásaikat. A mérések eredményeit a 4. táblázat mutatja. áblázat: Megváltozott specificitású represszor (C Q37Ala ) vizsgálata mutáns O 1-1/cg 1-1/cg 4. t R2 és O L2 operátorokon. Operátor wt la C (ppm232) R C Q37A R O R2 O 1-1/ cg R2 O L2 1-1/cg O L ,13 0,50 0,89 0,80 0,12 0,24 0,29 A mérések eredményei alapján a megváltozott specificitású C Q37Ala represszor nem volt képes szupresszálni a O L2 1-1/cg mutáns operátort. 45

54 4.3. A. tumefaciens addikciós modul jellemzése pemik homológ TA modul izolálása A növénypatogén baktériumok közül az Agrobacterium tumefaciens (A. tumefaciens) genetikája és fiziológiája a legismertebb, genomjának nuleotidsorrendje meghatározott (Goodner és mtsai., 2001). Semmi nem ismert még azonban az addikciós moduljairól, melyek azonosítása kiszélesítheti a már amúgy is széles körben használt organizmus felhasználási lehetőségeit a biotechnológiában és a gazda-patogén interakciók tanulmányozásában, továbbá új védekezési lehetőségeket, antibiotikumokat, fejleszthetünk ki a növényvédelem, növénytermesztés számára. Az addikciós modulok közül az A. tumefaciens genoforon predikció alapján egy mazef/pemik családba sorolható putatív TA modult találtunk az adatbázisban. Az itt található információk szerint két egymással részlegesen átfedő (egy nukleotid) ORF alkotja az operont. Az egyik fehérje, a PemI feltételezett antitoxin, 267 nukleotid hosszú (M4) és a róla képződő transzkriptum 88 aminosavnyi rövid protein. A PemK homológ feltételezett toxin fehérje 119 aminosavból áll és 360 nukleotidos az ORF-je (M5), mely downstream lokalizálódik az inhibítort (pemi) kódoló ORF-hez képest.(20. ábra). Az A. tumefaciens pemi és pemk aminosav szinten 38% illetve 37% homológiát mutatnak az E. coli ortológokhoz. A génszbályozás és a TA modul működését leíró modell elkészítéséhez nélkülözhetetlen a promóter régió, operátor azonosítása továbbá a két fehérje egymással történő interakciójának meghatározása. Kísérleteinket ezen célok alapján terveztük. promóter-operátor? pemi? pemk? pempr up ORF1 ORF2 1 bp pempr low pemprk low 20. ábra: A. tumefaciens pemi és pemk cisztronok strukturális elrendeződése. Szürkével jelölt rész az átfedést jelöli a két ORF között, a nyilak a promóter azonosítása során használt oligonukleotid primereket jelzik. A? a még azonosítatlan régiókat jelöli. A pontos nukleotidsorrendek megtalálhatók a Mellékletben (M4, M5). 46

55 Promóter régió és transzkripciós starthely azonosítása Első lépésként azt kellett eldönteni, hogy az adott operonban van e aktív transzkripció és ha igen, akkor hány promóter található az ORF-ek előtt, esetleg létezik-e belső promóter. Az E.coli estében a pemi-t 5 irányból határoló régiójában van a szabályozó egység egy promóterrel, a pemk itt nem tartalmaz belső promótert (Masuda és mtsai., 1993). A szabályozó régió azonosításához felhasználható a pgsb1 plazmid, hiszen ez hatékonyan tud integrálódni az A. tumefaciens kromoszómára, amivel a genofor környezet nagyon jól utánozható a transzkripció vizsgálata során. A pempr up és pempr low, az ORF1 előtt 5 irányban található, illetve a pempr up és pemprk low primerekkel, az ORF2 előtt 5 irányban esetlegesen létező belső promótert is kimutatva, PCR amplifikációt végeztünk (20. ábra) A. tumefaciens totál DNS templátról Pfu polimerázzal. A 133 bp és 455 bp hosszú amplikonokat a pgsb1 Acc65I Klenow fragmenttel feltöltött helyére építettük és nukleotidsorrend meghatározással ellenőriztük. A kísérlet tervezésénél figyelembe vettük, hogy olyan és akkora régiót válasszunk az irodalmi adatokból kiindulva, mely nagy valószínűséggel tartalmazhat szabályozó elemeket. Az így kapott promóter-lacz fúziós egységet tartalmazó papr1 és papr11 plazmidokat integráltattuk az A. tumefaciens genoforba, majd OD 600 =0,6 értékig növesztettük és totál RNS-t izoláltunk. Ezt követően Tth polimeráz felhasználásával végzett primer extenzióval meghatároztuk a transzkripciós starthelyet (21. ábra). Primerként a reakció specificitásának növelésére az E.coli eredetű lacz génhez komplementer oligonukleotidot használtuk (laczprex). 47

56 T G G T A A AA T G G T C T A CA T A G T G TT A C A G TA C G A G A C G C A G A C G A T G T G C A transzkripciós startpontok ATGTGAAAATGTGCTACATATGTTGCACAATGCAGGAGCGCAGACGGATG3 21. ábra: A. tumefaciens pemik operon transzkripciós starthelyének meghatározása primer extenzióval. TGCA a referenciaként használt nukleotidsorrend meghatározás megfelelő bázisait jelölik. +1: transzlációs starthely, -18 és -22 : transzkripciós starthelyek a transzlációs starthoz viszonyítva A kapott eredmények szerint három lehetséges startpontról indulhat a transzkripció, melyek közül a legerőteljesebb a pemi cisztron transzlációs startponttól -22 nukleotidnyira található citozin. A pemk régiótól 5 irányban nem találtunk belső promótert. Ezen eredmények alapján elmondható, hogy a két fehérje transzkripcióját a pemi cisztront 5 irányban megelőző promóter egység végzi. 48

57 A toxin -antitoxin kapcsolódásának és az operátorával történő interakciójának kimutatása Miután megbizonyosodtunk az általunk vizsgált DNS fragmentumról induló aktív transzkripcióról, a putatív addikciós modul működőképességét vizsgáltuk. Ezek során olyan kísérleti rendszereket alakítottunk ki, melyek alkalmasak a TA modulok fehérje szintű kapcsolatainak kimutatására, továbbá a lehetséges operátorokkal kialakított interakciók vizsgálatára. A. tumefaciens esetében nem áll rendelkezésre rekombinációban deficiens törzs, sem megbízható, induktív expressziós rends zer, mely nagyon fontos egy a sejt anyagcseréjére esetleg toxikus, gátló h atású fehérje vizsgálata során. Ezen kívül nem ismeretes, hogy milyen más faktorok szabályozzák a TA modulok működés ét ebben a fajban. Ezeknek a nem kívánt hatásoknak az elkerülése miatt, hogy tiszta kísérleti modellünk legyen, heterológ expressziós rendszert alkalmaztunk. A pemik ORF-eket IbadNco és pemklowbam oligonukleotid primerekkel, a PemI fehérjét kódoló DNS fragmentet IbadNco és pemilowbam oligonukleotidokkal és a toxin, PemK, kódolásáért felelős régiót KbadNco és pemklowbam primerek segítségével PCR-el amplifikáltuk és izoláltuk (22. ábra). pemi? pemk? ORF1 1 bp ORF2 IbadNco pemilowbam KbadNco pemklowbam 22. ábra: A. tumefaciens TA modul ORF1 és ORF2 izolálása során használt oligonukleotid primerek ( ) helyzete az operon mentén. A PCR termékeket NcoI-BamHI emésztés után a nagy repressziós hatékonyságú arabinóz operont tartalmazó expressziós vektorként széles körben használt, pbad24 NcoI-BamHI restrikciós enzimekkel linearizált plazmidba építettük. Az így nyert ppik1, ppi1 és ppk1 vektorokról arabinóz indukcióval E. coliban tudunk induktív módon expresszálni PemI és PemK proteineket együtt, illetve antitoxin (PemI) és toxin (PemK) fehérjéket külön-külön. 49

58 A promóter részről itt is szükséges volt egy-kópiás mérőegységet konstruálnunk a precizitás és a genofor környezet mimikrije miatt. Ezt úgy végeztük, hogy az izolált promóter régiót, és feltételezhetően az operátort is tartalmazó, 133 bp hosszú inszertet beépítettük pmlb1109 Acc65I Klenow polimerázzal feltöltött helyére. Az elkészített papr2 plazmidot nukleotidsorrend meghatározás után E. coli DH5α törzsbe transzformáltuk és felülfertőztük, rekombináltattuk a mérőegységet a fág kromoszómára, λrs45 fágtörzzsel. Ezt követően sorozatos passzálás és fertőzés során tiszta lizogén, kék színű kolóniákat szelektáltunk. A mérőegység így már integrálódott a λrs45 fág segítségével az E. coli DH5α genoforba, ahol stabilan integrálódott, egy kópiában. A mérőegységet tartalmazó törzsből kompetens sejteket készítettünk és transzformációval bejuttattuk a toxin, antitoxin expresszióra, illetve toxin és antitoxin koexpressziójára alkalmas vektorainkat (ppk1, ppi1 és ppik1). Méréseinket tehát a genoforra épített promóter-operátor-lacz fúziós riporter egységen és a TA modul különféle elemeit együtt és külön-külön 1% arabinóz jelenlétében induktív módon termelő plazmidokkal végeztük (23. ábra) % PemI PemK PemIK 23. ábra: TA fehérjék autoregulációs képességének vizsgálata A PemIK fehérjék in vivo autoregulálják szintézisüket. x: üres vektor, PemI, PemK és PemIK fehérjéket termelő vektorok, y: promóter aktivitás szálalék, 100% -nak tekintett az üres, fehérjét nem termelő vektor. Az eredmények szerint, ha csak a PemI és PemK fehérjéket indukáljuk a promóter-operátor-lacz fúziós riporter egységgel szemben, nem tapasztalunk promóter aktivitásbeli csökkenést. Ha a két fehérjét koexpresszióra alkalmas felállásban vizsgáljuk, akkor viszont 48%-ra esik le a relatív promóter aktivitás az arabinóz indukció után, a riportergén transzkripciójának csökkenése miatt. Ez azt jelenti, hogy van operátor a promótert is tartalmazó 133 bp-os inszerten, de az csak mindkét 50

59 protein együttes jelenléte mellett represszálható. Az eredmények tehát azt mutatják, hogy a TA fehérjék komplexet alkotnak in vivo az operátorral és így biztosítják autoregulációjukat TA fehérjék komplex alkotásának vizsgálata Az addikciós moduloknál azonban a másik lényeges kérdés, hogy a sejtben az operátoron kívül a toxin létrehoz-e az antitoxinnal valamilyen komplexet a sejtplazmában. A citoplazmás TA komplex kimutatására két in vitro kísérleti rendszert alakítottunk ki. A fehérjéket kódoló ORF-eket pet 16 és pet 22 plazmidokba építettük. A pet16 vektorról N- terminális His-Tag fúziós fehérjéket lehet nagy hatékonysággal expresszáltatni E. coli BL21(DE3)pLys törzsben, a pet22 pedig C-terminális His-Tag jelölt proteinek túltermelésére alkalmas. A pemi antitoxint peminde és pemilowbam, a pemk toxint pemknde up és pemknoth, míg a TA modult együttes termelődését biztosító fragmentet peminde és pemknoth oligonukleotid primerekkel amplifikáltuk. Az antitoxint kódoló PCR fragmentet NdeI-BamHI emésztés után NdeI-BamHI hasítóhelyeknél linearizált pet16 vektorba építettük (peti16). A toxin cisztronját tartalmazó fragmentet NdeI-NotI emésztés után, ugyanezen endonukleázokkal linearizált pet22 plazmidba építettük (petk22). Mindkét cisztront hordozó inszertet NdeI-NotI hasítások után NdeI-NotI emésztett pet22 vektorba inszertáltuk (peik22). A peti16 a PemI fehérje N- terminális His-Tag fúzióval megnövelt 109 aminosav hosszú transzlátumának termelésére alkalmas, a petk22 a PemK toxin C-terminális His-Tag jelölt, 128 aminosavat tartalmazó, rekombináns proteinjének expressziójára használható, a peik22 a PemI antitoxin 88 aminosavból felépülő natív formájának és a PemK toxin C-terminális His-Tag-el felruházott fehérjéjének koexpresszáltatására használható. A rekombináns fehérjéket a QIAexpress System Ni-NTA oszlopon tisztítottuk az Anyagok és Módszerek fejezetben leírtak alapján. A tisztított fehérjéket denaturáló PAGE és festés után, detektáltuk (24. ábra). 51

60 kda M His His His ábra.: A tisztított PemIK fehérjék komplex képzésének vizsgálata. M: molekulatömeg marker. 1. PemI (Nhis), 2. PemI és PemK (Chis), 3. PemK (Chis) A gélelektroforézis mutatja, hogy a koexpresszált TA fehérjék együtt is megjelennek a gélen (2. zseb), annak ellenére, hogy csak a PemK toxin volt His-Tag jelölt. A Ni-NTA oszlopon kötődő PemKHis rekombináns fehérje képes volt kötni a natív PemI antitoxint és az eluálással mindkét fehérje együtt távozott, ami bizonyítja a fehérje-fehérje kapcsolatok létrejöttét in vitro körülmények között. Annak eldöntésére, hogy milyen moláris arányban vannak jelen a fehérjék operátor jelenléte nélkül a TA komplexben, glutáraldehid keresztkötési kísérletet végeztünk (25. ábra). 52

61 glutáraldehid M (kda) ,5 10xHis 6xHis 6xHis PemI PemIK PemK 25. ábra.: Glutáraldehid keresztkötés eredményeként kimutatható PemIK komplex PAGE képe. M: molekulatömeg, 1. tisztított PemI (Nhis), 2. tisztított PemI (Nhis) + 1% glutáraldehid, 3. tisztított PemIK (Chis), 4. tisztított PemIK (Chis) + 1% glutáraldehid, 5. tisztított PemK (Chis), 6. tisztított PemK (Chis) + 1% glutáraldehid A gélképen világosan látható a glutáraldehid keresztkötés eredménye a 25. ábra 4. zsebénél. A kezelés hatására csak ebben a reakcióban megjelenő 25 kda körüli termék szerint a PemI és PemK fehérjék 1:1 arányban, heterodimerként, vannak jelen a citoplazmában jelen levő szabad komplexben PemIK fehérjék interakció vizsgálata az operátor régióval, operátor azonosítása Az operátor pontos azonasítására in vitro footprint és in vivo, mutációkkal módosított operátorok és TA fehérjék interakciójának lacz riporterrendszerrel történő meghatározását végeztük. A DN-áz I protekciós és hidroxil-gyök interferencia kísérletekhez a 133 bp hosszú pempr up és pempr low primerekkel amplifikálható DNS fragmentet használtuk. A kísérleteket az Anyagok és Módszerek fejezetben leírtak szerint hajtottuk végre. A DN-áz I protekciós footprint eredményét az 26. ábra, hidroxil-gyök interferencia footprint képét a 27. ábra mutatja. 53

62 Top T C A G Bottom K K PemIK T C AG PemIK 26. ábra: A. tumefaciens pemik operátor azonosítása DN-áz I protekciós footprinttel. TCAG a referencia nukleotidok sorrendje. K: kontroll, fehérjével nem kezelt DNS, 1: 0,1 µg PemIK (Chis), 0,2 µg PemIK (Chis), 0,5µg PemIK (Chis), 0,8µg PemIK (Chis). 54

63 Top Bottom C C 27. ábra.: A. tumefaciens pemik operátor azonosítása hidroxil-gyök interferencia footprinttel. C: a specifikus nukleotid sorrend kontrollként használt citozin. 1: fehérje nélküli kezelt DNS fragment, 2: fehérjével kötést kialakító komplex, 3: szabad, nem kötött frakció A DN-áz I footprint által kijelölt operátor rész nagyobb és részben asszimmetriát mutat a hidoxilgyök interferencia kísérlethez képest, ami nem meglepő, hiszen a DN-áz I enzim térigénye miatt a fehérje-dns komplex az operátorok határait is lefedheti, így az enzim nem tud hasítani ezeken a protektált területeken sem. A pontosabb azonosításhoz használtuk az interferencia footprintet. Az eljárás során alkalmazott kémiai módosítás a fehérje-operátor komplex kialakulása előtt lehetővé teszi, hogy a TA komplex szelektáljon a DNS szálak közül és csak az épen maradt, módosítatlan operátor részekhez kötődik nagy affinitással. Ez által jelöli ki precízebben az operátort (28. ábra). A footprintek más operátort nem jelöltek a vizsgált régióban. A 28. ábra aláhúzott nukleotidjai a footprint kísérletek alapján kijelölnek egy 20 bp hosszú részleges palindrom régiót. Csak egy bázisnyi eltérés tatálható, melynek pont a közepén van a szimmetriatengelye és így bp hosszú két félkötőhelyet tartalmazó elrendezést feltételezhetünk az operátor szerkezetét illetően. A két félkötőhely egyike átfed a transzkripciós starthellyel. Ez a represszió mechanizmusát is magyarázza, hiszen ily módon direkt gátolja a PemIK komplex az RNS polimerázt, ezáltal csökkenti a transzkriptumok képződésének valószínűségét. 55