Patobiokémia Szarka András, Bánhegyi Gábor

Átírás

1 Patobiokémia Szarka András, Bánhegyi Gábor

2 Patobiokémia Szarka András, Bánhegyi Gábor Szerzői jog 2014 Szarka András, Bánhegyi Gábor, Budapesti Műszaki és Gazdaságtudományi Egyetem, Semmelweis Egyetem

3 Tartalom Patobiokémia... vi... vii 1. Redox egyensúly: oxidatív stressz, antioxidánsok Oxidatív stressz Reaktív oxigénvegyületek Az oxigén tartalmú gyökök termelődésének legfontosabb helyszíne, a mitokondrium A lánc mely pontjain keletkezik a ROS? Más ROS termelő folyamatok a mitokondriumban A ROS alapszintű termelődése és eliminációja Több mint antioxidáns a C-vitamin patobiokémiája Fontos funkcióinak felismerése, hiánybetegsége a skorbut Mi áll a skorbut tüneteinek hátterében? A C-vitamin funkciói A C-vitamin felszívódása, sejtmembránon keresztüli transzportja C-vitamin az endoplazmatikus retikulumban C-vitamin a mitokondriumban Vajon milyen szerepet tölthet be a C-vitamin a mitokondriumban? Mennyi is az annyi? A mitokondriális DNS és a mitokondriális betegségek A mtdns eredete Bevezetés a mitokondriális betegségekbe Mitokondriális genetika: alapok Az emlős mtdns replikációja és transzkripciója Homoplazmia és heteroplazmia A mutáns mtdns szegregációja szomatikus szövetekben A mtdns anyai öröklésmenetének princípiumai A mtdns betegségek klinikai sajátságai Klasszikus mtdns szindrómák Klinikai szindrómák, amelyek hátterében nagy valószínűséggel mtdns eltérés áll A mtdns rendellenességek szerepe gyakori betegségekben Mitokondrium, oxidatív stressz és öregedés Oxidatív stressz és mitokondriális DNS ROS-mtDNS mutáció-ros ördögi kör? Az mtdns mutátor egér Egy váratlan fordulat: az mtdns mutátor egér és a ROS kapcsolata Záró gondolatok, konklúzió A fehérjék nem enzimes glikációja, késői glikációs végtermékek AGE képződés és szerkezet Külsődleges AGE források AGE keresztkötések kialakulása AGE és AGE receptor kapcsolat AGE metabolizmus Az AGE képződés következményei diabéteszben Az AGE képződés, mint terápiás célpont A fehérjetekeredés (folding) patobiokémiája A fehérjeszerkezeti betegségek legnagyobb csoportja az amiloidózisok Az amiloidózisok formái Szisztémás amiloidózisok Szövetspecifikus amiloidózisok Alzheimer betegség Parkinson kór Poliglutamin betegségek Prion betegségek Egyéb konformációs betegségek A szekréciós pálya patobiokémiája és az UPR Fehérjeszintézis az endoplazmás retikulumon A szekréciós fehérjék minőségi ellenőrzése iii

4 Patobiokémia Az endoplazmás retikulum stressz Jelátvitel az endoplazmás retikulum és a sejtmag között Selejtfehérje válasz (unfolded protein response, UPR) A szekréciós pályával összefüggő betegségek Fehérjelebontás a lizoszóma A lizoszomális proteóma kialakulása A lebontandó szubsztrátok felvétele Extracelluláris szubsztrátok Intracelluláris szubsztrátok A végtermékek exportja Lizoszomális betegségek A lizoszóma biogenezis zavarai Lizoszomális tárolási betegségek A lizoszomális ion- és ph homeosztázis zavarai Proteosztázis az ubikvitináció/proteaszóma rendszer Felhasznált és ajánlott irodalom iv

5 Az ábrák listája 1.1. A molekuláris oxigén lépésenkénti redukciója során kialakuló reaktív oxigénvegyületek A Q ciklus A kollagén hidroxilációja Az aszkorbát szerepe a prolin hidroxilációjában A C-vitamin (aszkorbát, DHA) plazmamembrán és intracelluláris transzport rendszerei, transzportja A plazma C-vitamin koncentrációjának alakulása a C-vitamin bevitel függvényében A mitokondriális DNS A fehérjék nem enzimes glikációja A késői glikációs termékek képződése Néhány AGE vegyület szerkezete v

6 Patobiokémia Szarka András, Bánhegyi Gábor Budapesti Műszaki és Gazdaságtudományi Egyetem, Semmelweis Egyetem, 2014 Szarka András, Bánhegyi Gábor Typotex Kiadó, ISBN: Creative Commons NonCommercial-NoDerivs 3.0 (CC BY-NC-ND 3.0) A szerzők nevének feltüntetése mellett nem kereskedelmi céllal szabadon másolható, terjeszthető, megjelentethető és előadható, de nem módosítható. Készült a TÁMOP-4.1.2/A/1-11/ számú, Konzorcium a biotechnológia aktív tanulásáért című projekt keretében. vi

7 Kedves Olvasó! A Patobiokémia tankönyv megírásakor két dologra törekedtünk, arra, hogy az olvasó érdeklődve lapozzon és várja a következő oldalt, élvezettel utazzon a gondolatok fonala mentén a sejtek világába. Emellett fontosnak tartottuk, hogy a tárgyalt probléma időszerű legyen és a legújabb ismereteket közvetítsük. Tekintve, hogy tankönyvünket elsősorban biomérnök M.Sc. hallgatóknak szánjuk feltételezzük, hogy az olvasó alapvető biokémiai, élettani, kórélettani és klinikai kémiai ismeretek birtokában van. Mindezen szempontokat figyelembe véve építettük fel a tankönyvet, amely így nem arra törekszik, hogy átfogó patobiokémiai ismereteket nyújtson, hanem arra, hogy néhány a szerkesztő és a szerzők által érdekesnek ítélt patobiokémiai problémával ismertesse meg az olvasót. Ennek megfelelően mondandónkat három fő, egymással összefüggésben levő problémakör köré szőttük. A tankönyv e három tartópillére az oxidatív stressz, amely területről szinte észrevétlenül váltunk a mitokondriális patobiokémiára, illetve a fehérjék megfelelő térszerkezetének kialakulása, ennek defektusai, illetve ezek megoldására irányuló (pato)biokémiai folyamatok. Ahogy említettük, a tankönyv elkészítésekor rendelkezésre álló legfrissebb irodalmi ismeretekre alapoztunk, ennek velejárója az átlagos tankönyvekhez képest jóval töményebb, szakkifejezésekkel sűrűbben átszőtt nyelvezet. Így reményeink szerint a tankönyv érdekessége mellett, segít be-, illetve átvezetni az olvasót a tudományos szakirodalom világába is, amely egy M.Sc. hallgató esetében kifejezetten kívánatos lehet. A szerzők izgalmakkal teli, élvezetes utazásra invitálják az olvasót a patobiokémia világába. Szarka András Budapest, december 19. vii

8

9 1. fejezet - Redox egyensúly: oxidatív stressz, antioxidánsok Oxidatív stressz Mit is takar az oxidatív stressz kifejezés? Egy gyűjtőfogalom: az összes olyan biológiai folyamatot így nevezzük, amely során megbomlik az oxidáns és az antioxidáns rendszer közötti egyensúly. Az oxidatív stressz leggyakoribb kiváltói a nem kellő helyen és/vagy megnövekedett mennyiségben keletkezett szabad gyökök. A szabad gyökök olyan molekulák vagy molekularészletek, amelyek párosítatlan elektront tartalmaznak a legkülső elektronhéjukon. Tekintettel arra, hogy az elektronok párképzésre hajlamosak, a magányos elektront tartalmazó molekulák nagy intenzitással keresnek más molekulákat, amelyektől elektronokat vonhatnak el. Így a szabad gyököknek nagy a reakciókészségük, könnyen és gyorsan kémiai reakcióba lépnek egymással vagy más vegyületekkel. A biológiai szempontból legfontosabb szabad gyökök az oxigén-, nitrogén- és kéncentrumú reaktív anyagok Reaktív oxigénvegyületek Az élet paradoxona, hogy az aerob léthez nélkülözhetetlen oxigénből a sejtek a biokémiai folyamatok melléktermékeként (a víz mellett) igen káros, redukált oxigénszármazékokat hoznak létre, amelyek nagy része szabadgyök. A molekuláris oxigén alapállapotban (ez a triplet oxigén) egyáltalán nem reaktív, azonban egyik elektron spinjének átfordításával (szinglet oxigén) vagy egy elektron felvételével aktiválódhat (szuperoxid anion, O 2.- ). Ezt követően további egyértékű redukciókon is keresztülmehet (a sor utolsó tagja természetesen a víz) (1.1. ábra). Ezen aktiválódott oxigénszármazékokat összefoglaló néven reaktív oxigénvegyületeknek hívjuk (reactive oxygen species, ROS) ábra - A molekuláris oxigén lépésenkénti redukciója során kialakuló reaktív oxigénvegyületek Fontos megemlíteni, hogy ide tartozik a hidrogén-peroxid is, ami nem szabad gyök, de fémionok hatására hidroxil gyököt képez (Fenton-reakció), amely a jelenleg ismert legerősebb oxidálószer. A hidrogén-peroxid azért is különösen fontos, mert töltéssel nem rendelkezik, így a membránokon könnyedén áthatolhat, ezáltal a sejt nem képes elkülöníteni, karanténba zárni. A reaktív oxigénvegyületek képesek a legtöbb szerves vegyületet oxidálni, vagy gyököt képezni belőlük. Mindkét esetre nézzünk egy példát. Az alábbi egyenletekben (1-4) egy szerves vegyületet hidroxil gyök oxidál, majd ezen alkil gyök redukálódik fémionok, triplet oxigén vagy éppen egy másik alkil gyök által. (1) (2) 1

10 Redox egyensúly: oxidatív stressz, antioxidánsok (3) (4) Az alábbi egyenletekben (5-7) pedig szintén hidroxil gyök indít el egy láncreakciót, melynek során alkilperoxidok és gyökök képződnek mindaddig, míg jelen van oxigén és oxidálható vegyület. (5) (6) (7) A fenti egyenletekből látszik a hidroxil gyök hihetetlen reaktivitása, így nem csoda, hogy a sejt számos védelmi mechanizmust fejlesztett ki, hogy elkerülje képződését. A legveszélyeztetettebb molekulák a telítetlen lipidek (ezáltal a sejtmembránok), a fehérjék és a DNS. A lipidek esetében a hidroxil gyök indítja el a reakciót, mely a telítetlen kötésnél támadva (pl.: linolénsavnál a 11-es szénatomon), egy hidrogén elvonásával vízzé alakul és egy karbon gyököt hagy hátra, melynek párosítatlan elektronja megoszlik a 9-es és 13-as szénatomok között. Ez a gyök már könnyen reagál triplet oxigénnel, amely a sejtben bőségesen megtalálható. Ennek során peroxil gyök képződik, mely további zsírsavakat oxidálhat el. Látható, hogy a hidroxil gyöknek itt szikra-szerű szerepe van, a további reakciók során már csak az alapállapotú oxigén vesz részt. Fehérjék esetén az oxidatív hatás specifikus aminosav módosulásokat, peptid fragmentációkat, keresztkötéseket, megváltozott töltéseloszlást, ezek által megváltozott funkciót eredményezhet. A legérzékenyebbek a kéntartalmú aminosavak: a hidroxil gyök a cisztein tiol csoportjáról egy hidrogén atomot elvonva tiil gyököt képez, amely ezt követően további tiil gyökökkel reagálva keresztkötéseket hozhat létre. Az oxigén a metioninra is addicionálódhat, metionin-szulfoxid származékokat eredményezve. Mindkét származék redukálható a tioredoxin és a tioredoxin oxidáz segítségével. Más oxidatív reakciók nem reverzibilisek, számos aminosav irreverzibilisen módosulhat a fehérje oxidációjakor pl. a fehérjék Fe-S centrumját a szuperoxid végérvényesen működésképtelenné teszi. Az aktivált oxigén számos sérülést okozhat a DNS-ben, pl. deléciót, pont mutációt és más letális genetikai hatásokat válthat ki. Ismert, hogy a DNS cukor és bázis része is érzékeny az oxidációra, a bázis lebomlik, az adott szál elszakadhat, valamint fehérje keresztkötések képződhetnek. A lánc szakadásának oka a cukor hidroxil gyök kiváltotta oxidációja. In vitro sem a hidrogén-peroxid, sem a szuperoxid nem okoz láncszakadást fiziológiás körülmények között, így az in vivo toxicitásuk valószínűleg a fémionok által katalizált reakciók eredménye. A hidroxil gyök támadásának másik eredménye lehet a keresztkötések kialakulása a DNS és a fehérjék közt, melynek során a timin kovalens kötést alakít ki a ciszteinnel. Az ilyen nukleoproteineket nem lehet károsodás nélkül szétválasztani. Bár a keresztkötések kialakulásának esélye egy nagyságrenddel kisebb, mint a láncszakadásé, nehezen javítható, ezáltal az ilyen módosulás könnyen letálissá válhat. A DNS egyértelműen a sejt leggyengébb pontja a reaktív oxigénvegyületekkel szemben, mivel könnyen köti a fémionokat, lehetőséget ad a Fenton-reakció lejátszódására, valamint más makromolekulákhoz képest sokkal kevesebb károsodást visel el. Ez lehet az egyik oka annak, hogy az eukarióta sejtek a DNS tartalmukat, messze a légzési redox folyamatoktól, a sejtmagba helyezték Az oxigén tartalmú gyökök termelődésének legfontosabb helyszíne, a mitokondrium Reaktív oxigénvegyületek a sejt több pontján, organellumában és enzime által képződhetnek. Képződésükhöz jelentősebb mértékben hozzájárulnak a plazmamembrán egyes fehérjéi, mint például a NADPH oxidázok, a peroxiszóma lipid anyagcseréje, illetve változatos citoplazmatikus enzimek, mint például a ciklooxigenázok. Habár mindezek a folyamatok hozzájárulnak a teljes oxidatív terheléshez, a celluláris ROS legjelentősebb része (hozzávetőlegesen 90%-a) a mitokondriumból származik. A mitokondriális ROS termelés az oxidatív foszforiláció következménye. A folyamaté, amely a NADH, illetve a FADH 2 kontrollált oxidációja során a mitokondriális membrán két oldala között proton gradienst, 2

11 Redox egyensúly: oxidatív stressz, antioxidánsok potenciálkülönbséget (ΔΨ) hoz létre, majd ez a potenciálkülönbség hajtja meg az F1-F0 ATP-ázt, hogy az ADPt ATP-vé foszforilálja. A NADH-ról, illetve FADH 2-ről származó elektronok a citokróm lánc (vagy más néven a respirációs elektron transzfer lánc) során számos helyen direkt módon reagálhatnak az oxigénnel, vagy más elektron akceptorral szabad gyökök képződését eredményezve. Korábban a ROS és más szabad gyökök keletkezését egyszerűen csak az elektron transzfer lánc megcsúszásának, vagy egyféle nem produktív mellékreakciónak tekintették. A legújabb kísérleti eredmények azonban azt valószínűsítik, hogy a mitokondriális ROS termelés fontos redox jelátviteli szerepet tölt be, illetve felvetették szerepét az öregedéssel kapcsolatos folyamatokban is. Ez utóbbival külön fejezetben foglalkozunk. Az elsősorban a TCA ciklusból érkező NADH a komplex I-nél oxidálódik. Miközben az elektronok a NADHról az első mobilis elektronszállítóra az ubikinonra kerülnek a felszabaduló energia a mitokondriális mátrixból történő protonpumpálásra fordítódik. Az ubikinon, az I-es komplex megkerülésével, a II-es komplex közvetítésével a FADH 2-ről szintén kaphat elektronokat. Az ubikinol ezt követően a citokróm b-nek adja át az elektronokat a III-as komplexnél. Az elektronok a III-as komplexnél a citokróm c1-re kerülnek, miközben újfent protonok kerülnek a mátrixból a két membrán közti térbe. A citokróm c1-ről a második mobil elektronszállítóra a citokróm c-re kerülnek az elektronok. Az ily módon redukálódott citokróm c ezt követően redukálja a citokróm c oxidázban található citokróm a-t, a3-at a komplex IV-nél, amely aztán végső soron az oxigént vízzé redukálja. Ez utóbbi redox energia disszipáció szintén protonok mátrixból történő kipumpálásával jár együtt. Ily módon a respirációs elektron transzfer lánc a viszonylag stabil NADH és FADH2 redox energiáját a belső membrán két oldala között mérhető membránpotenciál különbséggé alakítja. Az elektrontranszferben történő kisiklás okozza a mitokondriális ROS termelést, amellyel kapcsolatban számos kérdés jogosan merülhet fel bennünk: A lánc mely pontjain keletkezik a ROS? Mi az alap ROS képződési ráta? Mi szabályozza a mitokondriális ROS termelést? Hogyan szabadul meg a mitokondrium a káros ROS-től? A lánc mely pontjain keletkezik a ROS? A jelenleg elfogadott általános nézet szerint két helyen, az I-es és a III-as komplexnél keletkezik ROS nagyobb mennyiségben, azokon a pontokon, ahol az oxigén redukciójához képest nagy elektron potenciális energiaváltozás következik be. Azok a kísérletes manipulációk, amelyek az I-es, vagy III-as komplex redox potenciálját növelik, megnövelik a ROS termelődés mértékét is. Ez alátámasztani látszik azt a vélekedést, hogy ezen komplexek redox potenciálja fontos szerepet játszik a ROS termelődésben. A mitokondriális elektron transzfer lánc kevésbé ismert elemei közé tartozik az I-es komplex. Ez a több alegységből álló komplex mintegy 46 fehérjéből áll össze és molekulatömege meghaladja az 1000 kda-t, legalább 1 flavin mononukleotidot és 8 vas-kén csoportot tartalmaz. Mind a vas-kén csoportok, mind a flavin mononukleotid részletek potenciális ROS termelő helynek számítanak. Harmadik potenciális szuperoxid produkciós helyként az ubikinon komplex I kötőhelyét (Q i) szokták emlegetni. A komplex III esetében a Q ciklus jóval komplikáltabb történet. Ha a mitokondriális ROS termelés számszerű adatait tekintjük, akkor izolált mitokondriumokon nyert adatok alapján elmondhatjuk, hogy oxigénfogyasztásunk, mintegy 2-5%-a szuperoxid anion képződésre fordítódik és ennek a szuperoxid termelésnek mintegy 70-80%-áért a III-as komplex Q ciklusa felelős. Ezen becslések esetében azonban figyelembe kell vennünk néhány további tényt: a szuperoxid termelés sejttípus, illetve légzési állapot függő. Mindezen tényeket figyelembe véve egy jóval reálisabb jóslást kaphatunk, amely szerint fiziológiás körülmények között a szuperoxid termelés a respirációs ráta 0.1%-ának adódik. Ezek után vizsgáljuk meg alaposabban a Q-ciklust! A redukált ubikinol (miután az I-es és II-es komplexek felöl begyűjtötte az elektronokat) a Q o kötési helyére diffundál. Kötési helye a mitokondriális belső membrán citoszólhoz közeli felén található a vas-kén fehérje (Rieske fehérje) közelében. Elsőként egy elektron adódik át az ubikinolról (UQH 2) a Rieske fehérjére két protont a citoplazmatikus oldalra átadva és UQ.- szemikinon gyök marad vissza a Q o helyhez kötve. A Rieske fehérje által átvett elektron továbbadódik a citokróm c1-re, majd a citokróm c-re, végül a citokróm c oxidázra. A második elektron a citoszólikus oldalhoz közel található bl hemre kerül, majd ezt követően ugyanazon fehérje bh hem csoportjára. Jelenleg azt gondoljuk, hogy az UQH 2 és az UQ a hidrofób mag egyik helyéről a másikra szabadon vándorolhat, a proton motoros erőtől függetlenül, mivel ezek a hidrofób szállító molekulák nem rendelkeznek töltéssel. Egy másik a bh közelében található kinon kötőhely, a Q i lehetővé teszi a redukált bh-ról történő egy elektronos elektron transzfert, így a UQ.- képződését. A folyamat eredménye egy Q i kötőhelyhez erősen kötött szemikinon. A Q ciklus, következő szakaszában, egy második UQH 2 molekula oxidálódik a már ismertetett módon a Q o helyen. Újfent egy elektron a citokróm c1-re kerül és egy másik pedig a bl-es keresztül a bh-ra. Ezen elektron révén bekövetkezik a UQ.- UQH 2-vé történő redukciója, amelyhez a két proton a mátrix oldalról származik. Az UQH 2 visszatér a fő ubikinon poolba és a Q ciklus bezárul. A Q o és a Q i ezen modell szerint nem ekvivalensek: kizárólag a Q i köti a szemikinont erősen. A 3

12 Redox egyensúly: oxidatív stressz, antioxidánsok Q o esetében termodinamikai és/vagy kinetikai kényszer hiányában a szemikinon mindössze csak átmenetileg létezik ábra - A Q ciklus 4

13 Redox egyensúly: oxidatív stressz, antioxidánsok 5

14 Redox egyensúly: oxidatív stressz, antioxidánsok Forrás: Rigoulet M, Yoboue ED, Devin A: Mitochondrial ROS Generation and Its Regulation: Mechanisms Involved in H2O2Signaling ANTIOXIDANTS & REDOX SIGNALING 2011, 14, A III-as komplexnél található szuperoxid generátort kicsit jobban szemügyre véve két komponens kerülhet gyanúba, hogy elektronokat ad át az oxigénnek: a szemiubikion, illetve a citokróm b. Annak érdekében, hogy megállapítsák melyikük ad át közvetlenül elektronokat a dioxigénnek, specifikus III-as komplex (elektrontranszfer) gátlókat alkalmaztak. Elektrondonorként szukcinátot használva Antimycin A jelenlétében intakt patkány mitokondriumokat myxothiazollal kezelve, amely meggátolja a Rieske vas-kén fehérje redukcióját, a szuperoxid anionok képződése elkerülhető volt. Ehhez hasonlatosan a mitokondriális citokróm c depléciója gátolta, míg az antimycin A önmagában elősegítette a szuperoxidok keletkezését. Ezen eredmények alapján, úgy tűnik, hogy minden olyan tényező, amely a szemiubikinon képződését gátolja, az gátolja a szuperoxid keletkezését is. Mindezen megfigyelések összhangban vannak azzal a vélekedéssel, amely szerint a komplex III esetében a szemiubikinon az egyetlen redukált elektronszállító, amely képes a dioxigén szuperoxiddá történő redukciójára. A Q ciklus tehát képes a mitokondriális belső membrán belső és külső felszínén is szuperoxidot generálni. A szuperoxid nem képes átjutni a membránon, így igen fontos lenne az intermembrán tér és a mátrix relatív fluxusainak ismerete. Jelenleg azonban erre a kérdésre nem tudunk választ adni Más ROS termelő folyamatok a mitokondriumban Ahogy arról korábban említést tettünk, a respirációs elektrontranszfer lánc komplexeit tanulmányozták legrészletesebben a mitokondriális ROS termelés tekintetében. Mostanság azonban egyre gyakrabban keverednek gyanúba a mitokondriális dehidrogenázok is. Az α-ketoglutarát dehidrogenáz enzimkomplex, amely az α-ketoglutarát szukcinil-koa-vá történő oxidációját katalizálja NADH képződése mellett a citrát körben három enzimből épül fel: α-ketoglutarát dehidrogenáz (E1), dihidrolipoamid szukcinil-transzferáz (E2) és a dihidrolipoil dehidrogenáz (Dld, LADH, E3). Emlős agy mitokondriumok esetében a komplex ROS termeléséről számoltak be. A szuperoxid képződését a Dld flavin kofaktorához kötik. Ez a megfigyelés más mitokondriális flavoenzimek esetében is felveti a ROS képzés gyanúját, mint például a piruvát dehidrogenáz, amely szintén tartalmaz Dld részegységet. A glikolízis során a citoszólban keletkezett NADH mitokondriumba juttatását szolgáló glicerol-3-foszfát inga egy citoszólikus és egy mitokondriális glicerol-3-foszfát dehidrogenázból áll. A mitokondriális forma a belső membrán külső felszínén helyezkedik el és a glicerol-3-foszfátot dihidroxi-aceton-foszfáttá oxidálja, miközben elektronokat juttat az ubikinonra. Tekintve, hogy az enzim nem rendelkezik ubikinon kötőhellyel, ami növelhetné a szemiubikinon védelmét, az enzimet egy potenciális ROS forrásként tartják számon. Jó néhány éve galamb és patkány mitokondrium esetében palmitoil-karnitint alkalmazva szubsztrátként H 2O 2 termelődést lehetett mérni. A hidrogén-peroxid termelődés a respirációs lánctól függetlennek bizonyult és egyértelműen a mátrix oldalon jelentkezett. A lipid anyagcsere és a ROS keletkezés között meglévő kapcsolat felderítése újabb lendületet kapott a felfedezéssel, amely szerint számos rendellenesség, mint például a diabétesz sajátja a megváltozott lipidanyagcsere, illetve oxidatív stressz. Vázizomban kimutatták, hogy az oxidatív stressz inzulinrezisztenciához vezet. A korábbi megfigyeléssel összhangban sikerült kimutatni, hogy alacsony, fiziológiás palmitoil-karnitin koncentráció mellett a vázizmokban szignifikáns mértékű ROS keletkezik, amelynek meglehetősen csekély hatása van a mitokondriális membránpotenciálra A ROS alapszintű termelődése és eliminációja Az irodalom nem egységes azzal a kérdéssel kapcsolatban, hogy milyen mértékben keletkezik az alap mitokondriális oxigénfogyasztás során ROS. Ez nem meglepő, hisz a tanulmányok meglehetősen nagy része izolált mitokondriumokon készül, amelyekben a redox alkotók közel sem fiziológiás állapotban találhatóak, így a redox potenciál értékük is módosult, valamint a reverz elektronáram sem zárható ki (ami tekintélyes mértékű ROS képződést generálhat). Mindezen megfigyelések alapján azt valószínűsítették, hogy a teljes oxigénfogyasztás, mintegy 2%-a fordítódik ROS termelődésére. A korábban említett mesterséges vizsgálati körülményekből fakadó limitáló tényezők ellenére ezt az értéket igen széles körben idézték és alapul vették. Később, a fiziológiás körülményeket sokkal inkább megközelítő körülmények között elvégzett vizsgálatok a korábbi értéket egy nagyságrenddel 0.2%-ra csökkentették. Ez az alacsonyabb érték természetesen nem azt 6

15 Redox egyensúly: oxidatív stressz, antioxidánsok jelenti, hogy az alap ROS szint jelentéktelen, mindössze csak annyit, hogy a mitokondriális ROS termelés a legtöbb szövet esetében nem annyira súlyos mértékű, mint azt korábban gondoltuk. Ahogy arról még szót ejtünk, a szuperoxid diszmutáz (SOD) felfedezése kulcsszerepet játszott a mitokondriális ROS és H 2O 2 termelődés megértése szempontjából. A sejtben két intracelluláris SOD fordul elő: SOD2, egy mangán-függő enzim a mátrixban, illetve a SOD1, egy réztartalmú enzim elsősorban a citoszólban. Mindkét enzim a szuperoxidot (O 2- ) alakítja H 2O 2-dá, amelyet ezt követően a kataláz hatástalanít. Ez utóbbi folyamat során víz és oxigén keletkezik. A kataláz mellett fontos megemlítenünk a glutation peroxidázokat, amelyek szintén a H 2O 2 vízzé alakításában játszanak fontos szerepet. Sőt a mitokondriumban a kataláz hiányában a glutation peroxidázok játszanak igen fontos szerepet. A szuperoxid, amely nem kerül azon nyomban hatástalanításra közvetlenül reagálhat az oxidált citokróm c-vel vagy a citokróm c oxidázzal. A mátrix azon tulajdonságát, amely szerint képes egész nagymértékű ROS terheléssel is megbirkózni jól demonstrálta 1 mm mátrix NADH NAD + -dá és 2 ROS-sá történő rapid fotooxidációja. Ez a rendkívül hatékony ROS eltávolító rendszer azt valószínűsíti, hogy a mitokondriumból felszabaduló és így mérhető ROS mindössze csak igen csekély hányada lehet az ott keletkező teljes ROS mennyiségnek. 7

16 2. fejezet - Több mint antioxidáns a C-vitamin patobiokémiája Az enzimes antioxidánsokon kívül számos kis molsúlyú molekuláról gondoljuk, hogy antioxidáns tulajdonsággal rendelkezik. Ezek között találunk olyanokat, amelyeket szervezetünk képes előállítani, mint például a bilirubint, a liponsavat, az ubikinont, vagy a húgysavat, másokat pedig a táplálékkal kell felvennünk, mint például az E-, vagy a C-vitamint. Természetesen ez a felsorolás sem lehet teljes, ennyi különböző molekulával pedig nem tudunk jelen tankönyv keretében foglalkozni, ezért kiválasztottunk egyet, a sok közül, amellyel egy kicsit bensőségesebb viszonyt teremtünk. Választásunk, talán nem is oly meglepő módon, a C- vitaminra esett. Valószínűleg nincs még egy ilyen molekula, amelyet ennyi legenda övezne és ennyire erős kötelékek kötnének a magyar (pato)biokémia múltjához és jelenéhez Fontos funkcióinak felismerése, hiánybetegsége a skorbut Hiánybetegségét, a skorbutot már az egyiptomiak is leírták, a figyelem középpontjába a XV-XVIII század között a nagy felfedezések idején került, amikor a tengerészek rettegett betegsége lett. A skorbut legjellemzőbb tünetei, melyek patobiokémiai hátterével a későbbiekben foglalkozni fogunk a fragilis erek, fogvesztés, lassú sebgyógyulás, már bezáródott sebek újra kinyílása, csontfájdalmak, csontleépülés, szívelégtelenség, enyhébb hiány esetében, gyengeség, légúti fertőző betegségek kialakulása. A skorbutról és lehetséges kezelési módjáról az első komoly tudományos munkát A treatise of the scurvy címmel James Lind közölte 1753-ban. Dr. Lind a Salisbury hajó orvosaként, a hasonló állapotú skorbutos betegeket csoportokra osztotta, majd mindegyik csoportnak különböző diétát írt elő (kontroll csoport, vitriol, ecet, tenger víz, narancs-citrom, szerecsendió). Az első ismert kontrollcsoportos kísérlet eredményeként megállapította, hogy a skorbut leghatásosabb ellenszere a citrusdiéta. Majd kétszáz év telt el mire kiderült, hogy a James Lind narancsaiban található skorbut ellenes faktor egy hat szénatomos cukorszármazék, az aszkorbinsav. Az aszkorbinsavat marha mellékveséből, narancsból és káposztából elsőként Szent-Györgyi Albert izolálta 1928-ban. Kezdetben egy mellékvesehormonnak vélte és rendkívül csodálkozott, hogy az növényekben is előfordul, ezért kezdetben az ignose (csuda tudja) és godnose (Isten tudja) elnevezéseket javasolta, majd a skorbut ellenes hatásra utalva, az újonnan felfedezett anyag szerkezetének felderítőjével, Walter N Haworth-tel együtt az aszkorbinsav elnevezés mellett döntöttek Mi áll a skorbut tüneteinek hátterében? A C- vitamin funkciói Az aszkorbinsav az emlős sejtekben legalább 8 enzim kofaktora. Ezek közül vitathatatlanul a legismertebb a proli- és lizil-hidroxiláz, amelyek fontos szerepet töltenek be a kollagén bioszintézisben. A prolil- és aszparaginil-hidroxiláz pedig az O 2 érzékelésben. Az említett enzimek mindegyike aktív helyükön vasat tartalmaz. Az aszkorbinsav hiányában szintetizált kollagén nem kellő mértékben hidroxilált és így nem formál megfelelő szálakat, ennek következménye a kötőszöveti elégtelenség, a lassú sebgyógyulás, a fragilis erek. Állapotos nők esetében a nem megfelelő kollagén szintézis a magzatburok korai repedését is okozhatja. A réz tartalmú enzim, a dopamin-β-hidroxiláz szintén aszkorbátot igényel. A szóban forgó enzim, felelős a dopamin noradrenalin átalakulásért. Nem megfelelő működése okozhatja a skorbutban tapasztalható hangulatváltozást, letargiát. A zsírsav anyagcseréjében kulcsszerepet játszó karnitin bioszintézise során két enzim nélkülözhetetlen kofaktora az aszkorbát, így hiányában a karnitin bioszintézis is hiányt szenved, amely következménye az elégtelen zsírsavoxidáció, amely csökkent mértékű oxidatív foszforilációhoz, ATP hiányhoz vezet. Így ez utóbbi következménye lehet a skorbutban tapasztalható gyengeség, fáradtság. További aszkorbátot igénylő enzimek vesznek részt a tirozin anyagcserében, illetve a peptid hormonok stabilitásához szükséges amid csoportok hormonmolekulákra juttatásában. Itt meg kell álljunk egy szóra! A bevezetőben említett legendák közül szeretnénk kettőt kiválasztani és egy kicsit részletesebben foglalkozni velük. Az első ilyen legenda az aszkorbinsav kollagén hidroxilációban betöltött szerepe. Ahogy láttuk a legtöbb skorbut tünet hátterében az elégtelen kollagén hidroxilációból fakadó kötőszöveti rendellenesség áll. 8

17 Több mint antioxidáns a C-vitamin patobiokémiája Az emberi testhőmérsékleten végbementő termostabil tripla helikális kollagén szerkezethez elengedhetetlen a prolin és lizin oldalláncok hidroxilációja. A prolin hidroxilációja -X-Pro-Gly- tripleteknél következik be, a reakciót a kollagén prolil 4-hidroxiláz katalizálja. Az enzim az endoplazmás retikulum lumenében található, 2- oxoglutarátot (α-ketoglutarátot), oxigént, ferro vasat és aszkorbátot igényel működéséhez (2.1. ábra). A kollagénben található lizin hidroxilációja a X-Lys-Gly részleteknél következik be. A folyamatot a lizil 5- hidroxiláz katalizálja, amely a prolil 4-hidroxilázhoz hasonlóan kofaktorként 2-oxoglutarátot, ferro vasat és oxigént igényel. A lizil 5-hidroxiláz szintén az endolpazmás retikulum lumenében található homodimer formában ábra - A kollagén hidroxilációja Ebből fakad az első legenda, amely szerint a hidroxilációhoz aszkorbát szükséges. A valóság azonban az, hogy a hidroxiláció maga nem igényli az aszkorbát jelenlétét. A hidroxilázok két folyamatban játszanak szerepet: az egyikben az oldalláncok hidroxilálódnak, míg a 2-oxoglutarát dekarboxilálódik és molekuláris oxigén fogy (2.2. ábra). A molekuláris oxigén atomjai a hidroxil csoportba, illetve a szukcinát újonnan képződő karboxil csoportjába épülnek be. Ez a reakció aszkorbát-független. A hidroxilázok által katalizált másik reakció a 2- oxoglutarát dekarboxilezése, amely a hidroxilációtól függetlenül zajlik, de szintén molekuláris oxigént igényel azonban aszkorbát-függő (2.2. ábra). Ez esetben, a ferro vas oxidálódik (ferri vassá) és a fehérje mindaddig inaktív marad, amíg a ferri vasat az aszkorbát vissza nem redukálja ferro vassá. Habár ez utóbbi reakcióarány meglehetősen alacsony (1-4%), de még a (hidroxilálandó) szubsztrátfehérjék telítési koncentrációja mellett is lejátszódik, így az aszkorbát elengedhetetlen az oxidált enzim újraaktiválásához. A lizil hidroxiláció esetében az aszkorbátot helyettesíteni tudták DTT-vel és ciszteinnel, igaz jóval kisebb reakció rátával. Az aszkorbinsav 9

18 Több mint antioxidáns a C-vitamin patobiokémiája funkciónak tárgyalásakor a hidroxilációban betöltött szerepét követően egészen biztos antioxidáns szerepköre következik, ha nem ez kerül elsőként tárgyalásra ábra - Az aszkorbát szerepe a prolin hidroxilációjában Antioxidáns sajátságok: Az aszkorbát talán legismertebb kémiai sajátsága, hogy redukálószerként képes viselkedni. Erre kiváló példát szolgáltat, hogy a duodénumban a ferri (III) vasat ferro (II) vassá redukálja, így elősegítve a vas felvételét, a korábban már említett módon a lizil-, aszparaginil- és prolil-hidroxázokat aktív formában tartja azáltal, hogy az aktív centrumban található vas iont ferro vassá redukálja. Ha megnézzük az aszkorbát redox potenciálját (DHA/AFR: -0,17 V, AFR/aszkorbát: 0,28 V), megállapíthatjuk, hogy képes az olyan reaktív vegyületek, mint a hidroxil gyök (OH., H + / H 2O: 2,31 V), és a szuperoxid anion (O 2.-, 2H + /H 2O 2: 0,94), vagy az urát gyök (HU.-, H + /UH 2- :0,59 V) redukciójára. Az aszkorbát egy elektron átadásával (donálásával) szemidehidroaszkorbáttá, vagy más néven aszkorbil gyökké (AFR), ami további oxidációval dehidroaszkorbáttá (DHA) alakul. Az aszkorbil gyök nem túlságosan reaktív, mivel sem igazán oxidáló, sem igazán redukáló sajátságokkal nem rendelkezik és a molekuláris oxigén szuperoxiddá történő redukciójára sem képes lényeges mértékben (ha egyáltalán reakcióba lép vele). Az aszkorbil gyök gyenge reaktivitása adja az aszkorbát antioxidáns sajátságának esszenciáját: a reaktív vegyületek reakcióba lépnek az aszkorbáttal és egy jóval kisebb mértékben reaktív vegyület az aszkorbil gyök képződik. Az aszkorbil gyök lassú diszproporcionálódáson mehet keresztül, amely révén az aszkorbát egy része regenerálódhat. A DHA vizes oldatban igen instabil és a lakton gyűrű felnyílásával diketo-gulonáttá alakul. Az aszkorbát vizes oldatban ph=7.4-en stabil, hacsak nincsenek átmeneti fém ionok az oldatban, amelyek az aszkorbát igen gyors oxidációját katalizálják. A réz sók igen kiváló katalizátorok, így ha C-vitaminban gazdag táplálékot szeretnénk enni, rézedényben ne tároljuk, vagy készítsük el a zöldségeket. A réz és a vas az aszkorbát igen gyors oxidációját váltják ki, amely során H 2O 2 és. OH keletkezik. Az irodalomban számos helyen előforduló beszámolókat, amelyek szerint az aszkorbát károsítja a DNS-t, illetve különféle állati, köztük tumor sejteket minden bizonnyal a médiumban található átmenetifémek kiváltotta ROS képződése okozza. 10

19 Több mint antioxidáns a C-vitamin patobiokémiája Itt az ideje, hogy a másik ködbe vesző aszkorbát legendával foglalkozzunk! A molekula megismerését követően viszonylag gyorsan fellángoltak a viták, hogy milyen mennyiségben érdemes fogyasztanunk. A skorbut kialakulása már 10 mg/nap bevitelével elkerülhető, a napi ajánlott bevitel Magyarországon jelenleg 60 mg/nap, terápiás céllal azonban akár néhány ezer mg/nap aszkorbátot is a szervezetbe szoktak juttatni. Tekintve, hogy a C-vitamin vízoldható molekula kizárólag különböző membránba ágyazott transzporterek segítségével juthat el a sejtekbe, sejtorganellumokba. A következőkben a különböző C-vitamin transzportereket kívánjuk áttekinteni, továbbá a transzporterek kinetikai tulajdonságai alapján gyakorlati érvényű becslést adni az ésszerű aszkorbát bevitelről A C-vitamin felszívódása, sejtmembránon keresztüli transzportja A C-vitamin szükségletünket természetes források és étrend kiegészítők fogyasztásából fedezzük. A C-vitamin, étrendben található leggyakoribb formája, az L-aszkorbinsav és annak oxidált formája, az L- dehidroaszkorbinsav (DHA). Luminális oldali (kefeszegélyű) membrán vezikulum transzportaktivitása alapján megállapíthatjuk, hogy az aszkorbát és a DHA egyaránt felszívódik az emberi bélrendszer teljes hosszában. Mind az aszkorbát, mind a DHA felvétel, növekvő szubsztrát koncentráció hatására telíthetőnek bizonyult. Mindezen megfigyelések nagy affinitású ligand-transzporter kölcsönhatásra utalnak. A redukált forma, az L-aszkorbinsav felvétele aktív mechanizmus során valósul meg, két nátrium-függő C- vitamin transzporter (SVCT1 és SVCT2) segítségével (2.3. ábra), amelyek klónozása először 1999-ben valósult meg. Az SVCT1 egy nagy kapacitású, de kis affinitású (K m: μm) aszkorbát transzporter. Előfordulása igen kifejezett az epitheliális szövetekben, ahol funkcióját, a szervezet C-vitamin homeosztázisának fenntartását, a táplálékkal bevitt aszkorbát felszívása, illetve a vesékben a visszaszívás révén fejti ki. Az SVCT1 transzporter gén kiütése 7-10-szeresére emelte a C-vitamin vizeletbe történő ürítésének mértékét. Ezzel párhuzamosan a C- vitamin vérszintje 50-70%-kal csökkent homozigóta mutánsok esetén a vadtípusú társakhoz képest. Az SVCT2 egy kis kapacitású, nagy affinitású (K m: 8-62 μm) transzporter. Az intracelluláris redox státusz fenntartása érdekében széles körben fejeződik ki, az aktív anyagcserét folytató és specializált sejtekben, szövetekben. Az SVCT2 génkiütött mutánsokkal végzett kísérletek alapján az SVCT2 elengedhetetlen a prenatális aszkorbinsav transzportfolyamatokhoz. Fontos szerepet tölt be a C-vitamin placentán keresztül történő transzportjában. A homozigóta génkiütött mutánsokat légzési elégtelenség és intracerebralis haemorrhagia jellemezte. A human jejunum luminális oldali membránjának DHA felvételi karakterisztikája egyértelműen különbözött az aszkorbát felvételétől. A DHA felvétele kis affinitású (K m 0,8 mm) nátrium-független facilitált diffúzióval valósul meg (2.3. ábra). A glukóz gátolta az aszkorbát felvételét, de a DHA felvételt nem. Ugyanakkor a transzport gátlási profil kizárta az SGLT1 (nátrium-függő glukóz transzporter) szerepét az aszkorbát transzportban. A bélcsatornából történő DHA felszívódásért felelős transzporter fehérjét a mai napig sem sikerült azonosítani ábra - A C-vitamin (aszkorbát, DHA) plazmamembrán és intracelluláris transzport rendszerei, transzportja 11

20 Több mint antioxidáns a C-vitamin patobiokémiája A C-vitamin plazma koncentrációja orális bevitel esetén igen feszes szabályozás alatt áll. Ennek következtében növekvő orális dózisok mellett a C-vitamin plazma koncentrációja egy telítési értékhez tart (2.4. ábra). Ennek két fő oka van: egyrészt, ahogyan arról már az előző bekezdésben szó volt, a transzporter fehérjék kapacitása korlátozott, másrészt pedig a két nátrium-függő transzporter aktivitását, a saját ligandja (az aszkorbát) finomra hangolja. A béllumen megemelkedett aszkorbát koncentrációja az SVCT1 mrns szintjének csökkenését eredményezte enterocitákban. Az aszkorbát hasonló szabályozó szerepéről számoltak be SVCT2 esetén vérlemezkékben is. A közelmúltban derült ki, hogy a vázizom sejtek az SVCT2 transzporter expresszióját redox-állapotuk függvényében szabályozzák. Az SVCT2 mrns és fehérje szintje egyaránt megemelkedett myotubulusok hidrogén-peroxiddal történt kezelését követően, ugyanakkor liponsavas antioxidáns kezelés hatására expressziója csökkent. Valószínűnek tűnik tehát, hogy a sejt redox állapota befolyásolja az SVCT2 expresszióját, ily módon az aszkorbát transzport és az intracelluláris koncentráció befolyásolásával reagálni képes a változó körülményekre. A C-vitamin plazmakoncentrációját nemcsak a felszívódás, de a vesében, az SVCT1 által történő visszaszívás is befolyásolja. Ennek megfelelően a biológiai hasznosíthatósága alacsonyabb dózisoknál majdnem teljes és a dózis növekedtével csökken: 30 mg esetén 87%, 100 mg esetén 80%, 200 mg esetén 72%, 500 mg esetén 63% és 1250 mg esetén kevesebb, mint 50%. Ezt a megfigyelést alátámasztotta a C-vitamin 3-kompartimentum farmakokinetikai modellje is. A modell alapján egyszeri 3 g-os orális dózis a maximális tolerálható egyszeri dózis 206 µmol/l csúcs plazmakoncentrációt eredményez, ehhez képest az 1,25 g-os dózis ettől csekély mértékben különböző 187µmol/l-es plazmakoncentrációt eredményez. Végezetül 200 mg esetén amely mennyiség egy C-vitaminban gazdag táplálék elfogyasztásából származik a koncentrációcsúcs 90 μmol/l körül várható. A DHA és a glukóz között fennálló szerkezeti hasonlóság miatt, már korán felmerült a glukóz transzporterek lehetséges szerepe a DHA sejtbe történő felvételében. S valóban Xenopus oocita expressziós modellrendszerben igazolták a GLUT1, GLUT3 és esetlegesen a GLUT4 részvételét a plazmamembránon keresztüli DHA felvételben (2.3. ábra). A DHA felvételét a szerkezeti analóg 2-deoxi-glukózzal, illetve a facilitált hexóz transzport gátló cytochalasin B gátolta. A látszólagos K m értékek (GLUT1: 1.1 mm, GLUT3: 1.7 mm, for GLUT4: 0.98 mm) az SVCT transzporterekénél kisebb affinitású transzportfolyamatokról tanúskodnak. A gyors intracelluláris DHA redukció egyfelől tekintélyes DHA gradiens fenntartását eredményezi, másfelől egy olyan vegyületet, amely nem szubsztrátja a GLUT transzportereknek. A DHA formában, GLUT transzportereken 12

21 Több mint antioxidáns a C-vitamin patobiokémiája keresztül, sejtekbe jutó C-vitamin mennyiségét mindazonáltal rendkívül nehéz megítélni, nehéz, mert normális fiziológiás körülmények között a glukóz jelentős kompetáló partnerként szerepel, ez a kompetíció a magasabb vércukorszinttel járó diabéteszben természetesen még fokozottabb mértékben jelentkezhet. Érdemes megemlíteni, hogy a vitamin a plazmában elsősorban redukált formában található, ami szintén az SVCT transzporterek hangsúlyosabb transzport szerepét húzza alá. Ugyanakkor fontos megjegyeznünk, hogy a humán diéta a redukált aszkorbát mellett, jelentős mennyiségben DHA-t is tartalmaz, illetve jelentős mennyiségben keletkezik a gasztrointesztinális traktus lumenében az aszkorbát oxidánsokkal történő reakciójában. Ezen kívül a DHA extracelluláris koncentrációja jelentős mértékű növekedést mutat olyan patológiás állapotokban, mint például a gyulladás. Igen valószínű, hogy ilyen és hasonló állapotokban a lokális prooxidáns produkció fokozza az aszkorbát, DHA átalakulást, mely révén előtérbe kerül a glukóz transzportereken keresztül történő C-vitamin transzport is ábra - A plazma C-vitamin koncentrációjának alakulása a C-vitamin bevitel függvényében Forrás: Levine M, Conry-Cantilena C, Wang Y, Welch RW, Washko PW, Dhariwal KR, Park JB, Lazarev A, Graumlich JF, King J, Cantilena LR.: Vitamin C pharmacokinetics in healthy volunteers: evidence for a recommended dietary allowance. Proc Natl Acad Sci U S A. 1996, 93, A transzporterek telíthetősége, illetve a redox státusz redukált irányba történő eltolódása (amely szükségszerűen bekövetkezik magas C-vitamin dózisok esetén) következtében fellépő SVCT transzportfehérje szupresszió miatt az orális adagolás révén elérhető plazmakoncentráció erősen korlátos. Gyakorlatilag mg/nap orális dózis esetén (itt érdemes megjegyezni, hogy a jelenlegi napi ajánlott bevitel mindössze 60 mg/nap) elérjük a telítési (80 μm körüli) plazmakoncentrációt (2.4. ábra). Ennél magasabb plazmakoncentrációt intravénás aszkorbát adagolással lehetséges elérni, ahol az intesztinális korlátok megszűnnek, kizárólag a vesén keresztüli ürüléssel kell komolyan számolnunk. Ezt a módszert alkalmazzák terápiás aszkorbát plazmakoncentráció elérésére C-vitamin az endoplazmatikus retikulumban 13

22 Több mint antioxidáns a C-vitamin patobiokémiája Az aszkorbát intracelluláris importját követően további kompartmentalizáción megy keresztül. Az endomembrán-rendszerhez kötött aszkorbát termelő és felhasználó útvonalak, valamint a fehérje hidroxilációban és luminális reaktív oxigénvegyület képződés eliminálásban betöltött szerepe miatt, korán az érdeklődés homlokterébe került az endoplazmatikus retikulumba (ER) történő aszkorbát és DHA transzport. Patkánymáj endoplazmatikus retikulum eredetű mikroszómán végzett kísérletek alapján az aszkorbát vezikuláris felvétele preferáltan DHA formájában történik GLUT-típusú transzportfehérjéken keresztül, majd a lumenben visszaredukálódik aszkorbáttá (2.3. ábra). Az ER lumenben az aszkorbát több hidroxiláz kofaktora (prolin- és lizin-hidroxiláz), valamint itt történik az ERasszociált L-gulonolakton-oxidáz által katalizált aszkorbát bioszintézis utolsó lépése is az arra képes állati fajokban. Mindemellett az aszkorbát jelenlétét antioxidáns sajátsága nélkülözhetetlenné teszik az itt lejátszódó reaktív oxigénvegyület termeléssel járó folyamatok, mint például a fehérjefolding. Ahogy már említettük a lumenben lejátszódó hidroxiláció nagy szerepet kap a szekrécióra kerülő kollagén termostabil triplahelikális szerkezetének kialakításában. A prolin hidroxilációja a kollagén-prolin-4-hidroxiláz (C-P4H) által katalizált reakcióban X-Pro-Gly tripletmotívumokon történik. A folyamat zavartalan lejátszódásához az enzim 2-oxoglutarát, oxigén, Fe 2+ és aszkorbát kofaktorokat igényel. A C-P4H szerkezete α 2β 2 heterotetramer, amelynek β-alegysége a fehérjefolding folyamatában kiemelt szereppel bíró PDI (Protein Diszulfid Izomeráz). A lizin hidroxilációja a homodimer lizin-5-hidroxiláz (L5H) katalizálta reakció során X-Lys-Gly motívumokon történik. A folyamat zavartalan lejátszódásához az enzim kofaktorigénye megegyezik a C-P4H-val. Számos patológiás, a kötőszövetet érintő betegség köthető a L5H-t kódoló génekhez. Az L5H-1 izoformát kódoló PLOD1 gén mutációja kyphoscoliosis (Ehlers-Danlos Szindróma VI-os típus, EDS VI) kialakulásával jár, míg az L5H-2 izoforma PLOD2 mutációja a Bruck 2-es szindrómával hozható összefüggésbe, amelyben a lizin oldalláncok csökkent mértékű hidroxilációja figyelhető meg. A fent említett hidroxilációs reakciók csökkent aszkorbát mennyiség mellett alulműködnek, és patológiás esetekhez vezetnek. A skorbut kialakulása az aszkorbinsav hiánybetegsége, amely egy részről a kollagén struktúrfehérje csökkent mértékű hidroxiláltságából fakadó stabilitási problémáknak tudható be, másrészről pedig a fáradékonyság és a depresszió az aszkorbinsav-függő metabolitok (mint pl. a karnitin, dopamin) bioszintézisének hiányából fakad C-vitamin a mitokondriumban Habár a mitokondriális aszkorbát/dehidroaszkorbát transzport megléte több mint 30 éve ismert, mégis számos részlet csak a közelmúltban vált ismertté. Szarka András és Bánhegyi Gábor 2004-ben tett megfigyelését, mely szerint a C-vitamin dehidroaszkorbát formában kerül a mitokondriumba egy évvel később Golde és munkatársai humán vese sejtkultúra eredetű mitokondriumok esetén is megerősítették. Sztereoszelektív, a dehidroaszkorbát transzporttal kompetáló mitokondriális D-glukóz felvételt tudtunk megfigyelni. Az in silico tanulmányokkal összhangban, a GLUT1 transzporter mitokondriális jelenlétét (2.3. ábra) alátámasztották a GFP és az immunoblot vizsgálatok is. A GLUT1 kizárólagos mitokondriális C-vitamin transzporter hegemóniáját Lee és munkatársainak 2010-es megfigyelése törte meg, mely szerint az aorta simaizom sejtek, illetve inzulin-stimulálta adipociták mitokondriumaiban jelentős mértékű GLUT10 kifejeződés figyelhető meg. A külsődlegesen kifejezett GLUT10 fokozni tudta a mitokondriumba belépő jelölt dehidroaszkorbát mennyiségét, ezzel párhuzamosan csökkent a hidrogén-peroxid kezelt simaizom sejtekben mérhető reaktív oxigénvegyületek mennyisége is. Ez a védőhatás adipociták esetében fokozható volt inzulinkezeléssel, illetve felfüggeszthető volt glukóz előkezeléssel, vagy GLUT10 mrns interferenciával simaizom sejtekben. Egészen az idei évig úgy gondoltuk, hogy a C-vitamin kizárólagosan dehidroaszkorbát formájában képes a mitokondriális belső membránon átjutni. A redukált forma, az aszkorbát akkumulációja nem volt igazolható sem humán vese, sem patkány májszövet eredetű mitokondriumok esetében. Egy, a közelmúltban megjelent tanulmány azonban nátriumfüggő SVCT2 transzporter expresszióról számolt be U937 humán mieloid leukémia sejtek mitokondriumaiban (2.3. ábra). Ez a megfigyelés arra utalhat, hogy a redukált forma, az aszkorbinsav is képes a mitokondriális belső membránon történő átjutásra. Természetesen ezen transzportmechanizmus általános meglétének és relevanciájának bizonyításához további független kísérletes eredmények szükségesek. 14

23 Több mint antioxidáns a C-vitamin patobiokémiája A különböző GLUT izoformák által a mitokondriumba transzportált dehidroaszkorbát meglehetősen instabil molekula, továbbá antioxidáns tulajdonságokkal kizárólag az aszkorbát rendelkezik, így a mátrixba jutott, vagy ott keletkezett, dehidroaszkorbátnak vissza kell redukálódnia aszkorbáttá, különben fiziológiás körülmények között perceken belül elveszik az instabil lakton gyűrű felnyílása miatt. A patkány májszövet eredetű mitokondrium preparátumhoz adott dehidroaszkorbát a mitokondriumba transzportálódva, ott aszkorbáttá alakulva millimolos nagyságrendű koncentrációt ért el. Az intramitokondriális aszkorbát reciklálással kapcsolatban több mechanizmus is elképzelhetőnek látszik. A mitokondrium képes alfa-lipoinsav függő módon aszkorbáttá redukálni a dehidroaszkorbátot. Szelénium deficiens patkányokból származó mitokondriumokon végzett kísérletek alapján a tioredoxin reduktáz, ha kis mértékben is, de szerepet vállal az aszkorbát mitokondriumon belüli reciklálásában. A dehidroaszkorbát adagolásra megfigyelhető nagyfokú glutation szint csökkenés, illetve a glutation depléció hatására jelentős mértékben visszaeső dehidroaszkorbát redukció alapján valószínűsíthető, hogy a glutation függő aszkorbát redukció emlős mitokondriumban a fő dehidroaszkorbát redukciós útvonalak egyike lehet. A mitokondriális elektrontranszport lánc szubsztrátjait, illetve inhibitorait használva sikerült bebizonyítani az elektrontranszfer lánc szerepét a mitokondriális dehidroaszkorbát redukcióban. A redukció legvalószínűbb helye a mitokondriális komplex III Vajon milyen szerepet tölthet be a C-vitamin a mitokondriumban? A kérdés megválaszolása során figyelembe kell vennünk, hogy az itt működő légzési elektrontranszport lánc miatt a mitokondrium a sejt legjelentősebb reaktív oxigénvegyület termelő organelluma. A megemelkedett reaktív oxigénvegyület szint a mitokondriális membránpotenciál összeomlását idézheti elő, amely aztán apoptózishoz vezethet. Hidrogén-peroxiddal kezelt HL-60-as sejtek esetében a mitokondriális membránpotenciál részleges megőrzését, a mitokondriális citokróm c felszabadulását el lehetett kerülni a sejtek dehidroaszkorbáttal történő előkezelésével. Az előző esethez hasonlóan dehidroaszkorbát előkezeléssel elkerülhető volt a mitokondriális membránpotenciál zsugorodása és a következményes programozott sejthalál FAS kiváltotta apoptózisban monociták esetében, illetve humán endothel sejtekben hipoxia-reperfúzió hatására. Mindezen megfigyelések azt valószínűsítik, hogy a mitokondriális C-vitamin jelentős mértékben hozzájárul a mitokondriális membrán potenciál megőrzéséhez. A C-vitamin anti-apoptotikus hatását minden bizonnyal reaktív oxigén vegyület fogó sajátságán keresztül fejti ki. Egy ma általánosan elfogadott elképzelés szerint az örökítő anyag (membránnal elhatárolt, védett) sejtmagba telepítése, a DNS állomány védelme miatt történt. A humán sejtek (ahogyan minden eukarióta sejt) a sejtmagon kívül is rendelkeznek DNS-sel. Az extranukleáris örökítő anyag, a mitokondriumban található (utalva, annak egykori önálló prokarióta létformájára). A mitokondriális DNS (mtdns) így ugyancsak kitett az ott képződött, erősen mutagén reaktív oxigénvegyületeknek. Így nem meglepő, hogy az aszkorbát egyértelműen védelmet nyújtott a mtdns-ben a 8-oxo-dG (egy DNS oxidációs származék) és az apurinidációs/apiriminidációs helyek mennyiségének felszaporodása ellen. Ezen megfigyelésekhez hasonlatosan jelentős mértékben csökkenteni lehetett retina pigment epithelium sejtek esetében a hidrogén-peroxid kiváltotta mtdns léziókat Mennyi is az annyi? Mind a mai napig nehéz tisztán látni, egyik legfontosabb vitaminunk, a C-vitamin optimális adagolásával kapcsolatban. A plazmamembrán és az intracelluláris membránokban található C-vitamin (aszkorbát és DHA) transzporterek és transzportfolyamatok középpontba állításával szerettünk volna tisztább képet festeni. A transzporterek telíthetősége, illetve redox regulációja miatt, a manapság oly sokszor és a mindennapi élet számos területén hallott, C-vitamin megadózisban történő orális adagolása erősen megkérdőjelezhető. Ugyanakkor, azt is tisztán kell látnunk, hogy a napi ajánlott bevitel (60 mg/nap) a transzporterek telíthetőségétől igencsak messze eső, alacsony érték. Amennyiben kizárólag a transzporterek karakterisztikáját vesszük alapul, ettől jelentősen magasabb napi bevitel ( mg/nap) lenne indokolt. Természetesen ez csak egyféle megközelítés, nem foglalkoztunk a C-vitamin anyagcserével fiziológiás, illetve patológiás körülmények között, és a megadózisban történő adagolás esetleges vesekárosító hatásaival. Az optimális vitaminmennyiség meghatározásához ezen igen fontos tényezők semmiképpen sem elhanyagolhatóak. Végezetül, de semmiképpen sem utolsó sorban, meg kell említenünk az egyes emberek között fennálló 15