Klinikai kémia Szarka, András Keszler, Gergely Szerkesztette Szarka, András

Átírás

1 Klinikai kémia Szarka, András Keszler, Gergely Szerkesztette Szarka, András

2 Klinikai kémia írta Szarka, András, Keszler, Gergely, és Szarka, András Publication date 2014 Szerzői jog Dr. Szarka András, Dr. Keszler Gergely, Budapesti Műszaki és Gazdaságtudományi Egyetem, Semmeilweis Egyetem

3 Tartalom Klinikai kémia... x I. Laboratóriumi diagnosztika... 1 Előszó... v 1. Mintavétel, preanalitikai folyamatok és variabilitásuk Mintagyűjtés Vér (minta) Vénás vérvétel Kapilláris vérvétel Artériás vérvétel A vérvételt befolyásoló tényezők Vizelet Gyűjtött vizeletminták Széklet Gerincfolyadék (liquor cerebrospinalis) Ízületi folyadék Magzatvíz (amniotikus folyadék) Mellhártya, szívburok és hasűri folyadékok (pleurális, perikardiális folyadékok és ascites) Specifikus sejtek A minták kezelése A minták minőségének megőrzése a szállítás, tárolás során Preanalitikai variabilitások Kontrollálható variabilitások Élettani variabilitások Nem-kontrollálható variabilitások Biológiai hatások Környezeti hatások Alapvető egészségügyi állapot Molekuláris biológiai módszerek az örökletes, veleszületett betegségek diagnosztikájában A DNS, a humán DNS főbb jellemzői DNS izolálás A sejt feltárása A sejt saját nukleázainak inaktiválása Szennyező alkotók eltávolítása A DNS szelektív kinyerése A DNS méret szerinti elválasztása gélelektroforézissel Hibridizáció, Southern blot Polimeráz láncreakció (PCR) Real-time PCR, a DNS mennyiségi meghatározása A PCR technika klinikai diagnosztikai alkalmazásai Hosszúságpolimorfizmus okozta betegségek és vizsgálatuk PCR-rel Huntington-kór SNP-k okozta betegségek vizsgálata PCR-re Leiden mutáció Sarlósejtes anémia SNP-k és hosszúságpolimorfizmus okozta betegségek Cisztikus fibrózis STR lókuszok, DNS ujjlenyomat DNS chip Klinikai enzimológia Izoenzime Az enzimaktivitás meghatározásának körülményei Kreatin-kináz Laktát dehidrogenáz (LDH) Aminotranszferázok Gamma-glutamiltranszferáz iii

4 Klinikai kémia 3.7. Alkalikus foszfatáz Kolinészteráz Amiláz Lipáz A vese laboratóriumi diagnosztikája A vesefunkció klinikai kémiai tesztjei A Glomerulus Filtrációs Ráta (GRF) meghatározása Plazma urea Cisztatin C Glomeruláris permeabilitás, fehérje ürítés A vese megbetegedései Akut veseelégtelenség Krónikus vesebetegség Urémia szindróma Vesekövek Vizeletvizsgálat Vizeletcukor Ketontestek a vizeletben Vizelet bilirubin Urobilinogén Vizelet fehérje Vizelet ph Vizelet vér/hemoglobin Vizelet sűrűség Vizeletüledék Májfunkciók laboratóriumi vizsgálata A máj anatómiája A máj biokémiai funkciói Bilirubin lebontás, a bilirubin enterohepatikus körforgása Máj funkciózavar és hiperbilirubinémiák Nem konjugált hiperbilirubinémia Konjugált hiperbilirubinémia A máj megbetegedései A károsodás mechanizmusa és mintázata Vírusos májgyulladások Akut hepatitisz Toxikus hepatitisz Isémiás hepatitisz (Májsokk) Reye szindróma Krónikus hepatitisz Cirrózis A diabetes mellitus laboratóriumi vizsgálata A diabetes mellitus klasszifikációja I. típusú diabetes mellitus Az I-es típusú diabétesz tüneteinek háttere Az I-es típusú diabétesz patogenezise II-es típusú diabétesz A II-es típusú diabetes mellitus patogenezise Gesztációs diabetes mellitus A diabetes mellitus diagnosztikája, differenciáldiagnosztikájuk Glukóz meghatározások Inzulinszint meghatározás C-peptid meghatározás Glikált szérumfehérjék, hemoglobim A 1c Lipid anyagcsere, szérum lipidek laboratóriumi vizsgálata Lipidek emésztése, felszívódása Lipidek szállítása Triglicerid szint meghatározása Koleszterin meghatározás Nagy sűrűségű (HDL) koleszterin meghatározása iv

5 Klinikai kémia 8.6. Könnyű lipoprotein frakciókban található koleszterin meghatározása A koleszterin referenciatartományával kapcsolatos polémia Hiperlipidémiák Hematológia A vér sejtjei és a vérképzés élettana A vér, illetve a vérképzés sejtes elemeinek vizsgálatára szolgáló eljárások A vörösvérsejteket érintő legfontosabb kórképek A fehérvérsejtek rendellenességei A véralvadás laboratóriumi vizsgálata A vérlemezkék (trombociták) szerepe a hemosztázisban A véralvadás szerin-proteáz-rendszere és annak szabályozása A trombinaktivitás kontrollja Plazma proteáz-inhibitorok A protein C/protein S-rendszer A véralvadék feloldása A véralvadás legfontosabb zavarai és azok laboratóriumi vizsgálata A vérlemezkék rendellenességei és vizsgálatuk A plazmatikus fázis (alvadási kaszkád) zavarai (koagulopátiák) és kimutatásuk A vérzékenység differenciáldiagnosztikája Protrombin-idő (PI; Quick-teszt) Aktivált parciális tromboplasztin-idő (apti) A fibrinolízis sebességének meghatározása A trombinidő mérése A XIII-as faktor vizsgálata A trombózisok laboratóriumi diagnosztikája Az alvadási faktorok aktiválódásának kimutatása A hiperfibrinolízis kimutatása Az aktivált protein C (APC) rezisztencia kimutatása II. Endokrinológia Immunanalitikai eljárások Kompetitív immunanalitikai eljárások Immunometrikus, vagy nem kompetitív immunanalitikai eljárások A pajzsmirigy funkciók laboratóriumi vizsgálata Pajzsmirigy hormonok Biológiai funkciójuk Bioszintézis Szállítás Szabályozás Hipotireózis Primer hipotireózis Másodlagos (szekunder) hipotireózis Hipertireózis Mellékpajzsmirigy PTH szint reguláció A PTH hatása Primer hiperparatireózis Szekunder hiperparatireózis PTH hiány Kalcitriol D-vitaminok Kalcitonin Mellékvesekéreg rendellenességek laboratóriumi vizsgálata ACTH-mellékvese tengely, glükokortikoidok Selye János stressz elmélete és annak továbbfejlesztése Az ACTH-kortizol napszaki ingadozása, fontosabb szabályozókörök Glükokortikoidok Mineralokortikoidok A mellékvesekéreg rendellenességei A mellékvesekéreg hipofunkciói A mellékvesekéreg hiperfunkciói Congentitalis adrenális hiperplázia v

6 Klinikai kémia 15. Reproduktív rendellenességek laboratóriumi vizsgálata Férfi nemi működés (reprodukció) A hipotalamusz-hipofízis-gonád tengely szerepe Androgén transzport a vérben A tesztoszteron metabolizmusa Férfi nemi fejlődés Szabad és gyengén kötött tesztoszteron meghatározások Ketoszteroidok meghatározása vizeletből Anabolikus szteroid meghatározások Abnormalitások a férfi reprodukcióban Női reprodukciós biológia Élettani összefoglaló A hipotalamusz-hipofízis-gonád tengely szerepe Ösztrogének Biokémia, élettan Női nemi fejlődés Normális menstruációs ciklus Női reprodukciós abnormalitások Utószó Felhasznált és ajánlott irodalom vi

7 Az ábrák listája 1.1. Vákumos vérvétrli cső Vérvételi hely, előkészített vérvételi eszközökkel Vénás vérvétel helye Vérvételi eszközök A sejtes elemek és a plazma/szérum centrifugálással történő elválasztást követően. A két fázis között látható a mechanikai határvonalat képező gélréteg Kapilláris vérvételi helyek csecsemők esetében Újszülöttek szűrővizsgálata Hemolizált (jobb oldalt) és nem hemolizált (bal oldalt) plazma DNS minták (agaróz) gélelektroforézise DNS minták kapilláris elektroforézise Polimeráz láncreakció A polimeráz láncreakció lépései, hőprogramja Real time PCR TaqMan próbával Real time PCR eredménygörbék és kiértékelésü A kiindulási DNS kópiaszámának logaritmusa és a PCR küszöbciklusszámok között meglévő lineáris összefüggés PCR primerek a Huntingtinben található CAG ismétlődések meghatározására PCR termékek analízise kapilláris elektroforézissel Allél specifikus PCR primerek Allél specifikus PCR gélelektroforézis eredmények STR lókuszok PCR analízise STR lókuszok gélelektroforetogramja (DNS ujjlenyomat) DNS chip A kreatin-kináz aktivitásának meghatározása LDH enzim aktivitásának meghatározása Aminotranszferáz aktivitások meghatározása A GGT meghatározása Az alkalifus-foszfatáz meghatározása A kolin-észteráz meghatározása A vese mint magas nyomású szűrő Transzportfolyamatok a vesében, a vesetubulusok működése A Kreatin kreatinin átalakulás a kreatinin clearance és a plazma kreatinin szint között fennálló kapcsolat A kreatinin meghatározása szarkozin-oxidáz segítségével A Trinder-reakció Az urea enzimes meghatározása Vizelet tesztcsík több reagenspárnával Vizelet tesztcsík leolvasása remissziós fotométerrel Vizeletcukor meghatározása glükóz-oxidáz, peroxidáz kálium-jodid próbával Vizelet ketontest meghatározás Vizelet bilirubin meghatározás Vizelet fehérje meghatározás Vizelet vér (hemoglobin) kimutatása A máj mikroszkópikus felépítése A máj és az epeutak makroszkópikus anatómiája A fázis I. reakciók 90%-át kitevő oxigenáció folyamata A hem gyűrű felnyílása a biliverdin redukálódása bilirubinná A bilirubin UDP-glukuronsavas konjugálása A szérum bilirubin meghatározása diazotálással A GLUT4 transzporterek inzulin hatásra történő plazmamembránba helyeződése Az inzulin jelpálya. ntbiemesvze/thcckz70eai/aaaaaaaaauu/xyiwprc0qum/s1600/insulin_receptor.jpg vii

8 Klinikai kémia A vércukorszint meghatározása glükóz-oxidáz enzimmel A glükóz-oxidáz enzim által generált peroxidáz bontása peroxidázzal, valamint a keletkezett nascens oxigén detektálása Trinder-reakció segítségével Vércukor meghatározása hexokináz segítségével Orális glükóz tolerancia teszt lehetséges eredményei Korai glikáció, Amadori termékek képződése Késői glikációs termékek képződése A triglicerid és alkotói: glicerin és zsírsav A koleszterin A foszfolipidek A trigliceridek emésztése A foszfatidil-kolin emésztése A lipoproteinek felépítése Lipidek emésztése és felszívódása A kilomikron életútja Triglicerid és koleszterinszállítása a májból a perifériára A koleszterin felvétele apo B 100 receptorokon keresztül A koleszterin bioszintézise és annak gátlása statinokkal A koleszterinszintézis szabályozása, esetleges beavatkozési lehetőségek Reverz koleszterintranszport, a HDL életútja A lipdszállítás összefoglalása A koleszterin enzimes meghatározása Bürker-kamra Coulter-számláló Optikai elven működő áramlási citométer Hematológiai automata Bazofil granulociták meghatározása fényszórás méréssel Az egyes fehérvérsejt frakciók meghatározása fluoreszcens technikával A hematológiai automata által szolgáltatott eredmények Vérkenet készítése A glukóz-6-foszfát-dehidrogenáz szerepe a reaktív oxigénvegyületek eltávolításában Agglutináció A fehér trombus létrejötte Gla-kalcium-foszfatidil-szerin kapcsolat K-vitamin és warfarin A véralvadási kaszkád A fibrinogén A heparin hatásmechanizmusa A fibrinolítikus rendszer szabályozása Összecsapzódott vérlemezkék A protrombin idő által jellemzett véralvadási komponensek A DIC kialakulásának mechanizmusa Kompetitív immunanalitikai eljárás Az immounometrikus eljárás Pajzsmirigyhormonok és szintézisük A TRH: tireoid releasing hormone A PTH szekréció szabályozása (Az ábra az alábbi link alapján készült: Section%202.%20Disorders%20of%20Bone%20and%20Mineral%20Metabolism/346.htm) A POMC és hasítási termékei A CRH-ACTH-glükokortikoid tengely (Az ábra az alábbi link alapján készült: Szteroid hormon szintézis (Az ábra az alábbi link alapján készült: hidroxiláz defektus a szteroid hormon szintézisben. (Az ábra az alábbi link alapján készült: a tesztoszteron metabolizmusa viii

9 Klinikai kémia Az ösztrogének Normális menstruációs ciklus ix

10 Klinikai kémia Szarka András, Keszler Gergely Budapesti Műszaki és Gazdaságtudományi Egyetem, Semmelweis Egyetem, 2014 Szarka András, Keszler Gergely Typotex Kiadó ISBN: Creative Commons NonCommercial-NoDerivs 3.0 (CC BY-NC-ND 3.0) A szerzők nevének feltüntetése mellett nem kereskedelmi céllal szabadon másolható, terjeszthető, megjelentethető és előadható, de nem módosítható. Készült a TÁMOP-4.1.2/A/1-11/ számú, Konzorcium a biotechnológia aktív tanulásáért című projekt keretében. x

11 I. rész - Laboratóriumi diagnosztika

12 Tartalom Előszó... v 1. Mintavétel, preanalitikai folyamatok és variabilitásuk Mintagyűjtés Vér (minta) Vénás vérvétel Kapilláris vérvétel Artériás vérvétel A vérvételt befolyásoló tényezők Vizelet Gyűjtött vizeletminták Széklet Gerincfolyadék (liquor cerebrospinalis) Ízületi folyadék Magzatvíz (amniotikus folyadék) Mellhártya, szívburok és hasűri folyadékok (pleurális, perikardiális folyadékok és ascites) Specifikus sejtek A minták kezelése A minták minőségének megőrzése a szállítás, tárolás során Preanalitikai variabilitások Kontrollálható variabilitások Élettani variabilitások Nem-kontrollálható variabilitások Biológiai hatások Környezeti hatások Alapvető egészségügyi állapot Molekuláris biológiai módszerek az örökletes, veleszületett betegségek diagnosztikájában A DNS, a humán DNS főbb jellemzői DNS izolálás A sejt feltárása A sejt saját nukleázainak inaktiválása Szennyező alkotók eltávolítása A DNS szelektív kinyerése A DNS méret szerinti elválasztása gélelektroforézissel Hibridizáció, Southern blot Polimeráz láncreakció (PCR) Real-time PCR, a DNS mennyiségi meghatározása A PCR technika klinikai diagnosztikai alkalmazásai Hosszúságpolimorfizmus okozta betegségek és vizsgálatuk PCR-rel Huntington-kór SNP-k okozta betegségek vizsgálata PCR-re Leiden mutáció Sarlósejtes anémia SNP-k és hosszúságpolimorfizmus okozta betegségek Cisztikus fibrózis STR lókuszok, DNS ujjlenyomat DNS chip Klinikai enzimológia Izoenzime Az enzimaktivitás meghatározásának körülményei Kreatin-kináz Laktát dehidrogenáz (LDH) Aminotranszferázok Gamma-glutamiltranszferáz Alkalikus foszfatáz Kolinészteráz

13 Laboratóriumi diagnosztika 3.9. Amiláz Lipáz A vese laboratóriumi diagnosztikája A vesefunkció klinikai kémiai tesztjei A Glomerulus Filtrációs Ráta (GRF) meghatározása Plazma urea Cisztatin C Glomeruláris permeabilitás, fehérje ürítés A vese megbetegedései Akut veseelégtelenség Krónikus vesebetegség Urémia szindróma Vesekövek Vizeletvizsgálat Vizeletcukor Ketontestek a vizeletben Vizelet bilirubin Urobilinogén Vizelet fehérje Vizelet ph Vizelet vér/hemoglobin Vizelet sűrűség Vizeletüledék Májfunkciók laboratóriumi vizsgálata A máj anatómiája A máj biokémiai funkciói Bilirubin lebontás, a bilirubin enterohepatikus körforgása Máj funkciózavar és hiperbilirubinémiák Nem konjugált hiperbilirubinémia Konjugált hiperbilirubinémia A máj megbetegedései A károsodás mechanizmusa és mintázata Vírusos májgyulladások Akut hepatitisz Toxikus hepatitisz Isémiás hepatitisz (Májsokk) Reye szindróma Krónikus hepatitisz Cirrózis A diabetes mellitus laboratóriumi vizsgálata A diabetes mellitus klasszifikációja I. típusú diabetes mellitus Az I-es típusú diabétesz tüneteinek háttere Az I-es típusú diabétesz patogenezise II-es típusú diabétesz A II-es típusú diabetes mellitus patogenezise Gesztációs diabetes mellitus A diabetes mellitus diagnosztikája, differenciáldiagnosztikájuk Glukóz meghatározások Inzulinszint meghatározás C-peptid meghatározás Glikált szérumfehérjék, hemoglobim A 1c Lipid anyagcsere, szérum lipidek laboratóriumi vizsgálata Lipidek emésztése, felszívódása Lipidek szállítása Triglicerid szint meghatározása Koleszterin meghatározás Nagy sűrűségű (HDL) koleszterin meghatározása Könnyű lipoprotein frakciókban található koleszterin meghatározása A koleszterin referenciatartományával kapcsolatos polémia

14 Laboratóriumi diagnosztika 8.8. Hiperlipidémiák Hematológia A vér sejtjei és a vérképzés élettana A vér, illetve a vérképzés sejtes elemeinek vizsgálatára szolgáló eljárások A vörösvérsejteket érintő legfontosabb kórképek A fehérvérsejtek rendellenességei A véralvadás laboratóriumi vizsgálata A vérlemezkék (trombociták) szerepe a hemosztázisban A véralvadás szerin-proteáz-rendszere és annak szabályozása A trombinaktivitás kontrollja Plazma proteáz-inhibitorok A protein C/protein S-rendszer A véralvadék feloldása A véralvadás legfontosabb zavarai és azok laboratóriumi vizsgálata A vérlemezkék rendellenességei és vizsgálatuk A plazmatikus fázis (alvadási kaszkád) zavarai (koagulopátiák) és kimutatásuk A vérzékenység differenciáldiagnosztikája Protrombin-idő (PI; Quick-teszt) Aktivált parciális tromboplasztin-idő (apti) A fibrinolízis sebességének meghatározása A trombinidő mérése A XIII-as faktor vizsgálata A trombózisok laboratóriumi diagnosztikája Az alvadási faktorok aktiválódásának kimutatása A hiperfibrinolízis kimutatása Az aktivált protein C (APC) rezisztencia kimutatása

15 Előszó A klinikai kémia tankönyv elkészítése során, célunk az örömszerzés volt. Annak az örömnek az átélését szeretnénk minden egyes olvasónknak megadni, amit akkor érez az ember, ha betekintést nyerhet sejtjeink, szöveteink, szerveink és egész szervezetünk működésébe, a fiziológiástól eltérő működés hátterébe, a patológiás működésből fakadó eltérések meghatározásába. Természetesen az egyes eltérések nemcsak egy szövet, vagy szerv működését befolyásolják, további eltéréseket is generálhatnak, így nagyon fontos, hogy (bár a tankönyv különálló fejezetekre tagolódik) mindig az összefüggésekre helyezzük a hangsúlyt. A klinikai kémia sajátosságából adódik, hogy tárgyalásakor közel egyenlő súlyt kell kapnia a patobiokémiai és a kórélettani szemléletnek. Ezt az egyensúlyt igyekeztünk fenntartani, míg a tankönyv mindkét szerzője patobiokémiai gyökerekkel rendelkezik, addig a lektora egy gyakorló laboratóriumi szakorvos. Egy gyakorlati ismereteket nyújtó könyv esetében a jó ábraanyag nélkülözhetetlen. Nincs ez másként jelen könyv esetében sem. A szerkesztő ezúton is szeretne köszönetet mondani Balogh Tibornak és Lőrincz Tamásnak az ábraanyag elkészítésében nyújtott segítségért. A tankönyvben szereplő fényképeket a szerkesztő készítette a Szent Imre Oktatókórház központi laboratóriumában. Budapest, november 13. Szarka András v

16 1. fejezet - Mintavétel, preanalitikai folyamatok és variabilitásuk A megfelelő mintavétel, feldolgozás és tárolás létfontosságú a megfelelő mérési eredményhez. Számtalan hiba forrása lehet, amennyiben nem megfelelően végezzük ezeket a folyamatokat. A felsorolt folyamatok elégtelen elvégzése okozhatja az úgynevezett preanalitikai variabilitást. A preanalitikai variabilitásokat két nagy csoportra oszthatjuk a kontrollálható és a nemkontrollálható variabilitásra. A kontrollálható variabilitások közé tartoznak a mintagyűjtés, szállítás, illetve az adott páciens fiziológiás állapotával kapcsolatos tényezők, mint például a neme, kora, szóban forgó betegsége stb. Egy jó laborosnak tudnia és értenie kell mind a kontrollálható, mind a nemkontrollálható változékonyság testfolyadékokra gyakorolt hatását ahhoz, hogy értel-mezni tudja az eredményeket Mintagyűjtés Lássuk csak, milyen mintákat vizsgál egy klinikai laboratórium: teljes vér, szérum, plaz-ma, vizelet, széklet, nyál, spinális (gerincvelői), szinoviális (ízületi) folyadékot, magzatvizet (amniotikus folyadék), különböző szilárd szövettípusokat, illetve specifikus sejteket. Az egyes mintavételi eljárások jól sztenderdizáltak. Tekintsük át, a legfontosabb mintákat, mintavételi eljárásokat Vér (minta) A vizsgálathoz szükséges vért vénából, artériából és kapillárisból nyerhetjük. Leggyakrabban a vénás vért vizsgáljuk, amelyet vérvétellel nyerünk. Csecsemőktől, illetve ágy melletti (point of care) vizsgálatokhoz kapilláris vért vehetünk. Artériás vérvételre leggyakrabban vérgáz analízishez kerül sor. A vérvételi eljárás latin elnevezése phlebotomia és kizárólag gyakorlott szakember végezheti. (Az angolszász területen és szakirodalomban külön phlebotomist végzi.) A mintavételt követően lehetőségünk adódik, hogy megvizsgáljuk a teljes vért, a plazmát, amelyet az alvadás gátlóval kezelt vér lecentrifugálása révén kapunk. Itt a kiülepedett csapadék a sejtes elemeket, a felülúszó pedig a plazmát tartalmazza. Ezen kívül vizsgálhatjuk a szérumot, amelyet úgy kapunk, hogy hagyjuk megalvadni a vért és ezt követően centrifugálással eltávolítjuk a sejtes elemeket. Ez utóbbi esetben tehát a vérvételi cső nem tartalmaz semmiféle alvadás gátló anyagot Vénás vérvétel Minden olyan mozzanatot magában foglal, amely során megfelelő és beazonosított vér-mintát nyerünk a beteg vénájából ábra - Vákumos vérvétrli cső Megelőző lépések Mielőtt bármit tenne a vérvételt végző személy a legfontosabb és legelső dolga a beteg azonosítása. A folyamat során legalább két-három paraméterre ki kell térnie (ilyenek lehetnek például a név, a TAJ szám, születési idő stb.), amelyeket a mintavételi eszközö-kön a mintavétel előtt fel kell tüntetni (1.1. ábra). Ennél a pontnál kell kérdést intézni az esetleges allergiáról. A legfontosabb a jódérzékenység tisztázása, mert allergia esetén nem alkalmazható jódos fertőtlenítőszer, ezen kívül fontos a latex allergia tisztázása is (az 6

17 Mintavétel, preanalitikai folyamatok és variabilitásuk egészségügyben általában latex kesztyűt használnak, illetve a véna elszorítására használt strangulátor is tartalmazhat latex elemeket). A mintavétel előtt a vérvételt végző személy megfelelő védő öltözéket és védő eszközöket kell, hogy felvegyen. Nagyon fontos, hogy magát, illetve a többi beteget is megóvja az esetleges fertőzésektől. A védőöltözetnek mindig része a köpeny (egyes esetekben ez teljesen áthatolhatatlan folyadékok számára) és a gumikesztyű. Különleges esetekben természetesen, különleges védőruházatra is szükség lehet (pl.: maszk, szemüveg). A betegnek a mintavétel előtt, során kényelmesen kell elhelyezkednie. Kényelmesen le kell ültetni, esetleg fektetni, amennyiben nem lehetséges az ülő pozíció (1.2. ábra). Fontos, hogy annyi ideig legyen ebben a kényelmes helyzetben (a vérvételt megelőzően) ameddig csak lehetséges és a helyzet megkívánja. Járó beteg esetében tanácsos már a személyazonosítást leültetve a későbbi helyzetben végezni, így a relaxáció ideje meghosszabbítható. Álló helyzetben sohasem szabad vért venni! A beteg karját a válltól a csuklóig egyenesen kell, hogy tartsa. El kell kerülni a vérvételt olyan karból, amelyben intravénás kanül, vagy kiterjedt hematóma, seb, vágás található. A vérvételt végző személynek le kell ellenőriznie a kiírt vizsgálatokat, meg kell becsülnie a levenni kívánt vér mennyiségét, illetve ki kell választania a megfelelő számú és típusú mintavételi csövet a vér, a plazma és a szérum számára. A megfelelő csöveken kívül a megfelelő tűt is ki kell választania. A leggyakrabban gauge-s (G-s) tűket használnak (minél nagyobb a G érték annál kisebb átmérőjű a tű). Minél nagyobb a tű, annál kisebb a folyadék, áramlási sebessége, a nyíróerő (ami például a vörösvértesteket károsíthatja). Egy normális vénákkal rendelkező felnőtt esetében általában 20 G-s tűt használnak. Amennyiben a véna összeesésre, kollapszusra hajlamos inkább 21 G-st. Nagyobb mennyiségű (30-50 ml) vér vételére a megfelelő véráramlást biztosítandó G 18-ast (igaz ez a méret a vákuumos csöveknél már nem használatos). A tű általában 3,7 cm (1,5 hüvelyk), vagy 2,5 cm (1 hüvelyk) hosszú. Az utóbbi méretűekhez általában szárnyas, vagy más néven pillangós tű csatlakoznak. Természetesen mindegyik tűnek, sterilnek, hegyesnek, sorjamentesnek kell lennie A vérvétel helye Legyakrabban a vena cubitalis-ból vesznek vért (1.3. ábra), mivel ez a véna nagy és közel fut a bőrfelszínhez. A kézfej és a boka vénái is alkalmasak lehetnek speciális esetekben, ámbátor ezek kevésbé preferáltak és kifejezetten kerülni kell rossz keringéssel rendel-kező személyek (pl. cukorbetegek) esetén ábra - Vérvételi hely, előkészített vérvételi eszközökkel. 7

18 Mintavétel, preanalitikai folyamatok és variabilitásuk A vérvétel helyének előkészítése A vérvételi hely környékét meg kell tisztítani. Erre a célra leggyakrabban négy különféle anyagot használnak: előrecsomagolt alkoholos vattát, 70%-os izopropanollal átitatott gézlapkát, benzalkonium-klorid oldatot, illetve hemokultúra vétele esetén jódos lemo-sásra is szükség van. Benzalkonium-klorid oldatot használnak abban az esetben, ha a mintából alkohol meghatározás történik. A vérvételi hely megtisztítása bentről kifelé irányuló körkörös mozdulatokkal kell, hogy történjen. A bőrnek meg kell száradnia, el kell kerülni, hogy alkohol, vagy más fertőtlenítőszer maradjon a bőrön, mert az hemolízist okozhat és meghamisíthatja a vizsgálatok eredményét. Amennyiben már egy-szer a bőrfelületet megtisztítottuk, akkor azt nem szabad megérinteni, tapogatni, nyomkodni ábra - Vénás vérvétel helye. 8

19 Mintavétel, preanalitikai folyamatok és variabilitásuk Időzítés A laboratóriumi vizsgálatokhoz ideálisan a vérvétel reggel, éhgyomorra történik. A mintavétel időpontja kritikus azokban az esetekben, amikor olyan alkotót vizsgálunk, amelyek hangsúlyos diurnális ingadozással bírnak (mint 9

20 Mintavétel, preanalitikai folyamatok és variabilitásuk például a kortikoszteroidok és a vas). Szintén fontos azokban az esetekben, amikor a mérendő paraméter alapján állítanak be egy adott gyógyszerterápiát. Ezen kívül fontos lehet alkohol és drog meghatározásnál Vénás vérvétel Az alapos nekikészülődést követően tekintsük át magát a vérvétel folyamatát. Miután a bőrfelületet fertőtlenítettük, egy vérnyomásmérő mandzsettát, vagy strangulátort he-lyezzünk cm-rel a tervezett vérvételi pont fölé (felnőttek esetén érvényes távol-ság) (1.3. ábra). Ez a vénás elszorítás megakadályozza, hogy a vénás vér visszaáramoljon a szívbe és kitágítja a vénákat. Amikor vérnyomásmérő mandzsettát használunk a célra nagyjából 60 Hgmm körüli nyomásra szokás felfújni. A strangulátorok puha, gumis anyagból készült textilcsíkok. Általában egy percnél rövidebb ideig szokás fent tartani a strangulátort. Ez alatt az időperiódus alatt a vér összetételbeli változása elhanyagolható, azonban három percet követően már egész jelentős mértékű lehet. Az elsőként levett vér (a vér, amely a strangulátorhoz legközelebb található) összetétele áll a legközelebb a keringő vérhez. Ebből az okból kifolyólag az elsőként levett mintát, olyan meghatározásokra kell felhasználni, mint például a Ca 2+ szint meghatározása, amelyek így megfelelőek a kritikus orvosi döntésekhez. A későbbiek során levett vér egyre inkább magában hordozza a keringés hiányából, a vénás pangásból eredő hatásokat. Ezen változásokat figyelembe véve kell meghatározni a mintavétel sorrendjét. A vénás pangással a víz és a kismolekulák visszaszivárognak (abszorbeálódnak) a sejtbe, ezáltal megnövelve az oldhatatlan anyagok, mint a fehérjék és fehérjékhez kötődő anyagok koncentrációját. Így az első csőben még mindössze 5%-os, addig a sorban harmadjára levett csőben már 10% körüli fehérjekoncentráció növekedéssel kell számolnunk. Hosszabb tartamú vénás pangás során akár 15%-os növekedést is tapasztalhatunk a fehérjékhez kötött anyagok koncentrációjában. A vérvételt megelőzően az ököl pumpálása elkerülendő, mivel a plazma kálium, foszfát és laktát szintjének megemelkedését okozhatja ábra - Vérvételi eszközök A vérvételt leggyakrabban vákuumos vérvételi csőbe végezzük, mert így a vérvétel zárt rendszerben történhet, amivel a fertőzésveszély csökkenthető. Ez a módszer általá-ban olcsóbb, kényelmesebb és egyszerűbb, mint a fecskendővel történő vérvétel. Számos fajtájuk létezik, amelyek térfogatukban, illetve az alkalmazott adalékanyagban térnek el egymástól. A kupak színe utal az adalékanyag minőségére. A különböző csövek tartalmát, az esetleges keresztreakció miatt sohasem szabad keverni, összeönteni. Egy tipikus vákuumos vérvételi cső a hozzá való tűvel az 1.4. ábrán látható. A tűt, vagy szárnyas (pillangó) tűt a vérvételi cső tartójába csavarják. Használat előtt érdemes óvatosan megkocogtatni a csövet, hogy az esetlegesen a kupakjába került adalékanyagokat eltávolítsuk, mielőtt a tűt a vénába szúrnánk. Ezáltal elkerülhető, hogy 10

21 Mintavétel, preanalitikai folyamatok és variabilitásuk esetlegesen a beteg vénájába kerüljön az adalékanyag. A bőrfertőtlenítést követően tehát óvatosan a beteg vénájába kell tolni a tűt, amikor a tű a helyére került, a csövet a tartóba nyomjuk, hogy átszúrja a kupakot a tű (belső fele) és a vákuum kifejthesse hatását. Amikor a vér elkezd a csőbe áramlani a strangulátort ki kell oldani anélkül, hogy megmozdítanánk a tűt. A cső addig telik, amíg a vákuum tart. Az kritikus, hogy a vákuumcső teljesen megteljék. Az adalékanyagok mennyiségét aszerint számították ki, hogy teljesen megtelt csővel kalkuláltak. Amikor a cső teljesen megtelt lehúzzuk a tartóról és óvatosan összekeverjük úgy, hogy nem hirtelen mozdulattal a feje tetejére fordítjuk, majd vissza (a keverő mozdulatot a cső fajtájától függően néhányszor megismételjük). Ezt követően, amennyiben szükséges kicseréljük egy üres csőre. A soron következő csövet ugyanezzel a technikával megtöltjük, oly módon, hogy a csőtartó végig a helyén marad. A vérvételi eszközben egy gumis visszacsapó szelep biztosítja, hogy a csövek cseréjekor ne folyjon ki a vér. Tekintve, hogy különböző metabolikus változások játszódnak le, amennyiben az alvadék, vagy a sejtes elemek közvetlenül érintkeznek a szérummal, illetve a plazmával. Szeparációs gyűjtő csövek alkalmazásával elkerülhető ez a probléma. Mindegyik cső tartalmaz egy tixotróp polimer gélt, amely sűrűsége 1,04 g/cm 3 körül van. Ez a sűrűség pont a plazma, vagy szérum és a sejtes elemek sűrűsége között van. Centrifugáláskor ez a gélszerű anyag felemelkedik a cső aljáról és egy réteget képez a folyékony fázis és a sejtes elemek között. A centrifugálást követően tehát a gél képezte mechanikai határoló réteg révén elkerülhető a fent említett metabolikus változás lejátszódása. A centrifugálásnál alkalmazott relatív nehézségi gyorsulásnak 1100 g körül kell lennie a gél felemelkedéséhez. Az így létrejött mechanikai határréteg több órán, akár néhány napon keresztül is műkö-dőképes. Fecskendővel meglehetősen ritkán vesznek vért, manapság szinte kizárólag olyan betegektől, akik vénájából igen nehézkes a vérvétel, illetve vérgáz analízis céljából. Fecskendővel történő vérvétel esetén a tűt 15º-os szögben szúrjuk a vénába és a fecskendővel finoman szívjuk le a vért. A fecskendőt cserélgetjük, amelyből rögtön vérgáz analízisre kell vinni a mintát, illetve áttölteni egy előre elkészített csőbe. Áttöltéskor különösen figyelni kell, hogy a vér kifecskendezése finoman történjen meg, nehogy hemolizáljon a minta (a vörösvértest membrán sérülésekor tartalma a plazmába kerül és további vizsgálatra alkalmatlanná teszi, meghamisítja az eredményeket) ábra - A sejtes elemek és a plazma/szérum centrifugálással történő elválasztást követően. A két fázis között látható a mechanikai határvonalat képező gélréteg 11

22 Mintavétel, preanalitikai folyamatok és variabilitásuk 12

23 Mintavétel, preanalitikai folyamatok és variabilitásuk Amikor a vérvétel befejeződik a vérszivárgás valószínűségét csökkentendő, megkérjük a beteget, hogy legalább 5 percig szorítson a szúrás helyére egy száraz gézlapkát és tartsa a karját nyújtott állapotban. Ezt követően egy újabb gézdarabkát fel lehet ragasztani, amit nagyjából 15 perc elteltével távolíthat el. Amennyiben a vérvétel hagyományos tűvel történt a csőtartóval együtt kidobjuk a használt tűket gyűjtő edénybe. Amennyiben szárnyas (pillangó) vérvételi eszközzel vettük a vért a szárnyakat előre nyomva befedjük a tűt, az újabb eszközökön található egy gomb, amelyet megnyomva egy rugót old, amely visszahúzza a tűt. Minden csövet az intézeti rendnek megfelelően feliratozni kell (lehetőleg még a vérvétel előtt). A kesztyűket, potenciálisan szennyezettnek kell tekinteni minden esetben, a veszélyes hulladéktárolóba dobjuk. Ezt követően kezet kell mosni mielőtt új kesztyűt húzunk az újabb vérvétel előtt Vénás vérvétel gyerek esetében A vénás vérvétel technikája gyerek és felnőtt páciensek esetén teljesen hasonló. A gyerekek azonban hajlamosabbak váratlan mozdulatokra, így plusz odafigyelés és a mozdulatlanul tartásuk kívánatos lehet Kapilláris vérvétel A kapilláris vérvétel során a bőrt (nyitott rendszerben) egy kis lándzsával megszúrjuk és e kicseppenő kis mennyiségű vért egy kis gyűjtőedénykébe fogjuk fel. A gyakorlatban ezt a módszer alkalmazzuk, amennyiben 1. a mintatérfogat limitált (pl. csecsemők, kisgyerekek esetében), 2. az ismételt vénás vérvételsúlyos vénakárosodással járna, 3. a beteg megégett, vagy be van kötözve és így a vénás vérvétel nem lehetséges. Szintén ezt a technikát alkalmazzák ágy melletti, point of care tesztek esetén. A leggyakrabban ujjbegyből vesznek vért. Ebben az esetben a gyakori használat miatt a hüvelyk és a mutatóujjat, a mérete miatt pedig a kisujjat kizárjuk és a középső és gyűrűs ujj két oldalát (nem középen) szoktuk megszúrni. Amennyiben ez a vérvételi hely akadályba ütközik kapilláris vér vehető a fülcimpából, illetve csecsemők esetén a sarok két oldalából, vagy a nagylábujjból (1.6. ábra) ábra - Kapilláris vérvételi helyek csecsemők esetében 13

24 Mintavétel, preanalitikai folyamatok és variabilitásuk 14

25 Mintavétel, preanalitikai folyamatok és variabilitásuk Természetesen a vénás vérvételhez hasonlóan, ez esetben is a bőr fertőtlenítésével kezdődik a konkrét vérvételi procedúra. Amikor a bőrfelület már megszáradt, egy hegyes lándzsával megszúrjuk. A szúrás mélysége maximum 2,5 mm lehet, hogy elkerüljük az esetleges csontsérüléseket. Amennyiben ujjbegyből történik a vérvétel, úgy kell azt tartani, hogy a gravitáció révén az ujjak végébe áramoljon a vér és a szúrást valamelyik oldalon a körömhöz közel (de nem veszélyesen közel) kell megejteni. Az ujjak véráramlást fokozó masszírozását el kell kerülni, mivel ebben az esetben sérülhetnek a sejtek, szövetek és a szöveti folyadék kiáramolhat. Tekintve, hogy ennek összetétele eltér a plazmáétól meghamisíthatja a mérési eredményt. A véráramlás fokozásának szabályos módja, ha az ujjbegyet, vagy a csecsemők sarkát egy meleg vizes ruhával, vagy speciális eszközzel megmelegítjük. Az első kicseppenő vércseppet letöröljük és az ezt követő(ke)t töltjük éppen csak a vérvételi cső falához érintve. A csőbe töltésnek gyorsnak kell lennie az alvadást elkerülendő, illetve figyelni kell, nehogy levegőbuborék kerüljön a mintába. A kapilláris vérvételi csőbe a kapilláris hatás eredményeképpen kerül a vér. Számos vérvételi kapilláris van kereskedelmi forgalomban, különböző véralvadás gátló anyagokkal, mint a nátrium- és az ammónium-heparin, illetve fényérzékeny anyagok vizsgálatához, mint a bilirubin rendelkezésre áll barna üvegből készült kapilláris is. Az utóbbi időben kezdenek elterjedni a kevésbé törékeny műanyag, vagy műanyag bevonatú vérvételi kapillárisok. Az újszülöttek szűrővizsgálatánál, illetve az egyre gyakoribb genetikai vizsgálatoknál alkalmazott szűrőpapírra történő mintavétel során a szűrőpapírt óvatosan egy nagyobb vércsepphez érintjük és hagyjuk, hogy az felszívja és kitöltse az előre kijelölt kört (1.7. ábra). A procedúrát körönként külön-külön kell elvégezni, ugyanazzal a cseppel több kört nem szabad kitölteni. a szűrőpapírt a levegőn kell megszárítani, figyelve a gombás és bakteriális befertőződés elkerülésére. Ez nagyjából 2-3 óra alatt bekövetkezik és egy előre feliratozott papír borítékban tároljuk. Vérvételi kapillárisba gyűjtött vért sohasem szabad a szűrőpapírra áttranszferálni, mivel a kapillárisban már az részben, vagy teljesen megalvadhatott, így a minta minősége bizonytalan lehet ábra - Újszülöttek szűrővizsgálata Artériás vérvétel Az artériás vérvétel speciális hozzáértést és képességeket igényel és gyakran kizárólag orvos, vagy az erre kiképzett technikus, vagy nővér végezheti. Az artériás vérmintákat elsősorban vérgáz analízisre használják. Az artériás vérminta vétele leggyakrabban a 1. csuklói radiális artériából, 2. a felkari brachialis artériából, vagy 3. a 15

26 Mintavétel, preanalitikai folyamatok és variabilitásuk lágyéki femoralis artériából történik. Tekintve, hogy a femoralis artériából (elsősorban idős embereknél) a vér kiáramlása jóval nagyobb mértékű a karból történő mintavétel jóval gyakoribb A vérvételt befolyásoló tényezők A vérvételt befolyásoló tényezők közé tartoznak az alvadásgátlók, tartósítószerek használata, a vérvétel helye és a hemolízis Alvadásgátlók és vértartósítószerek Plazmát és bármilyen alvadásmentes vérkészítményt kizárólag különböző alvadás gátlók teljes vérhez történő adagolásával nyerhetünk. Számos alvadásgátló készítmény van forgalomban, mint például a heparin, EDTA, savas citrát dextróz (ACD), citrát, nátrium-fluorid, oxalát és a jodoacetát. Heparin: A heparin a legáltalánosabban használt alvadásgátló kémiai és hematológiai vizsgálatok esetén, de nem alkalmazható polimerázláncreakció (PCR) esetén, mivel ez a nagy fehérje molekula gátolja a polimeráz enzimet. A heparin egyik legnagyobb hátránya, magas ára, illetve, hogy kék hátteret ad Wright festéssel készített vérminták esetében. A heparin gátolja a savas foszfatáz aktivitását és interferál a kalcium EDTA kötésével. Szintén befolyásolja a trijódtironin (T3) és a tiroxin (T4) hordozó fehérjéjükhöz kötését, ily módon megnöveli ezen hormonok szabad formájának koncentrációját. EDTA (etilén-diamin-tetraacetát): Az EDTA, mint jó kelátor kétértékű kationokat köt, mint például a Ca2+ és a Mg+. Elsősorban hematológiai vizsgálatok és teljes genomi DNS izolálása esetén használják. Az EDTA-t dinátrium, dikálium, illetve trikálium só formájában alkalmazzák, az utóbbi kettő jobb vízoldhatósággal rendelkezik. Az ICSH (International Council for Standardization in Haematology) ajánlása alapján a hematológiai mérésekhez K 2-EDTA-t kell használni.) Általában 1-2 g/l-es koncentrációban használatos, az ettől magasabb koncentráció hatására zsugorodnak a vörösvértestek. Az alvadást a Ca 2+ megkötése révén éri el. ACD (savas citrát dextróz): Elsősorban molekuláris diagnosztikai célokra szánt minták esetében alkalmazzák, mivel mind a sejtes elemek formáját (citogenetikai tesztek), mind funkcióját megőrzi. Nátrium-fluorid: gyenge alvadásgátló. Tekintve, hogy gátolja a glikolízist a glukózt igen jól konzerválja a vérmintában. Az urea meghatározást zavarja, mivel gátolja az ureáz enzimet is. Citrát (nátrium-citrát): g/l-es koncentrációban alkalmazzák 1 rész citrát, 9 rész vér arányban (3,2%-os citrátot kell használni a véralvadási vizsgálatokhoz). Igen széles körben alkalmazzák koagulációs (véralvadási) tesztekben, mivel hatása könnyen visszafordítható Ca 2+ hozzáadásával. Tekintve, hogy a citrát megköti a Ca 2+ -t, nem alkalmazható antikoagulánsként, olyan esetekben, amikor ezen elem meghatározása a cél. Oxalát (nátrium-, kálium-, ammónium-,litium-oxalát): oly módon gátolja meg az alvadást, hogy viszonylag oldhatatlan komplexet alkot a Ca 2+ -kal. Leggyakrabban a kálium oxalátot alkalmazzák 1-2 g/l-es koncentrációban. Nátrium-jodoacetát: Igen gyakran helyettesítik a nátrim-fluoridot vele, olyan minták esetében, amelyekből mind glukóz, mind urea tesztet akarnak végezni, mivel ez nem gátolja az ureázt. A legtöbb klinikai teszttel nem interferál A mintavétel helye A különböző helyekről vett vérminták összetétele eltérő. A kapilláris vér összetétele sokkal inkább az artériás vér összetételéhez hasonlít, mint a vénás véréhez. A szabadon folyó kapilláris vér és az artériás vér ph, PCO 2, PO 2 és oxigén szaturációja között gyakorlatilag nincs eltérés, míg a vénás vér PCO 2 értéke 6, 7 Hgmm-rel (8, 9 kpa) magasabb. A vénás vér glukóz koncentrációja legalább 0,4 mm-rel alacsonyabb a szöveti metabolizmus következtében. A kapilláris vérvétel során a vér intersticiális, illetve intracelluláris folyadékkal szennyeződik, aminek következtében a vénás vérhez képest megnő a glukóz és kálium koncentrációja, illetve lecsökken a bilirubin, a Ca 2+, a Cl -, a Na + és a teljes fehérje koncentrációja. Amennyiben centrális vénás katéteren, vagy artériás vonalon veszünk vért, meg kell bizonyosodnunk afelől, hogy a páciens szervezetébe juttatott folyadék nem befolyásolja a minta összetételét Hemolízis 16

27 Mintavétel, preanalitikai folyamatok és variabilitásuk A hemolízis a vörösvértestmembrán kiszakadását és a hemoglobin, illetve más sejtalkotók kijutását jelenti. A szérum már szemmel látható változásokat szenved, a hemolízis nyilvánvaló, amennyiben a hemoglobin koncentrációja meghaladja a 200 mg/l-es értéket (1.8. ábra). Az enyhe hemolízis a legtöbb mért paraméter értékét nem befolyásolja jelentős mértékben. A komolyabb mértékű hemolízis, a leggyakoribb kémiai tesztekre enyhe hígítási hatást gyakorol azon összetevők esetében, amelyek szintje az eritrociták belsejében alacsonyabb, mint a plazmában. Sokkal nagyobb a jelentősége azoknak az összetevőknek, amelyek szintje az eritrociták belsejében magasabb, mint a plazmában, ilyenek a laktát-dehidrogenáz (LDH), a kálium, a magnézium és a foszfát ábra - Hemolizált (jobb oldalt) és nem hemolizált (bal oldalt) plazma. 17

28 Mintavétel, preanalitikai folyamatok és variabilitásuk 18

29 Mintavétel, preanalitikai folyamatok és variabilitásuk Vizelet A gyűjtött vizeletfajta milyensége attól függ, hogy milyen vizsgálatokat szeretnénk elvégezni. Általában adott időtartamon keresztül (1, 4, 24 óra) gyűjtött vizeletet szoktunk vizsgálni, mivel a random vett vizeletminta csak erősen korlátozott mértékű kémiai vizsgálatra alkalmas. A tiszta, korán reggel, éhgyomorra, felkelés után vett minta általában a legkoncentráltabb minta ezért ez a legalkalmasabb a mikroszkópos, abnormális anyagok, mint például a fehérjék jelenlétének, illetve szokatlan anyagok, mint a hcg (humán Chorio Gonadotropin) vizsgálatára. Az ürített vizelet első 10 ml-ének bakteriális vizsgálata a legmegfelelőbb az urethritis (húgycsőgyulladás), a középsugaras vizelet pedig a legmegfelelőbb a húgyhólyag rendellenességek megállapítására. A különböző metabolikus rendellenességek vizsgálatára leginkább a rendellenesség tüneteinek jelentkezésével egyidejűleg, vagy közvetlen utána gyűjtött vizelet a legmegfelelőbb. A betegnek tanácsos a genitáliáit megmosni vizeletürítés előtt, hogy a minimálisra csökkentse a felületéről a vizeletbe jutó baktériumok számát Gyűjtött vizeletminták A gyűjtési időnek elegendően hosszúnak kell lennie ahhoz, hogy a rövid idejű biológiai változékonyságot minimálisra csökkentsük. A gyűjtött vizeletminták esetében nagyon fontos, hogy a beteg a mintagyűjtési szabályokat maximálisan betartsa (igen komoly hiba forrása lehet a szabálytalan mintavétel). A gyűjtési periódus kezdetekor a hólyagját teljesen ki kell ürítenie, az így nyert vizeletet ki kell önteni, majd az összes vizeletet fel kell fogni egészen a kijelölt gyűjtési időpont végéig. Amennyiben a betegnek széklete van az ürítési időszak alatt vigyázni kell, nehogy keresztszennyezze a mintát vele. Amennyiben hosszabb időn keresztül tart a gyűjtés a mintát ideálisan 4 C-on kell tárolni. Amennyiben több edénybe történik az ürítés, azok tartalmát egyesíteni kell, hogy homogén minta kerüljön a laboratóriumba. Egyes esetekben kívánatos lehet különböző tartósítószereket (pl. savat) adni a gyűjtött vizelethez. Amint a vizeletgyűjtési idő lejárt a vizeletet rögtön a klinikai laboratóriumba kell vinni analízisre Széklet A széklet vizsgálata szinte kizárólag különböző mikroorganizmusokra, a hasmenés kiváltó okának tisztázására és a vér jelenlétére terjed ki, amelyből a gasztointesztinális fekélyes és rosszindulatú elváltozásaira következtethetünk. Gyerekek székletének triptikus aktivitását cisztás fibrózis diagnózisához szokták vizsgálni. Felnőttek esetében a széklettel ürített nitrogén és zsír meghatározása a felszívódási zavarok (malabszorpció) súlyosságát mutathatja, illetve egyes esetekben a fekális porfirin meghatározása hozzájárulhat a porfiria típusának meghatározásához. Tartósítószert nem szoktunk a székletmintához adni, de a hűtésről egyes esetekben gondoskodni kell, illetve el kell kerülni a vizelettel történő keresztszennyezést Gerincfolyadék (liquor cerebrospinalis) A gerincfolyadékot leggyakrabban a lumbális régióból szoktak venni, de esetenként előfordul, hogy műtétek esetében más területről is. A következő betegségek gyanúja indikálhatja a gerincfolyadék vizsgálatát: 1. cerebrovaszkuláris sérülés 2. meningitisz 3. demielinizációval járó betegségek, 4. malignus betegség agyi áttéttel. A lumbális punkciót kizárólag orvos végezheti. A mintavevő edényeknek sterilnek kell lenniük, különösen, ha mikrobiológiai tesztre kerül sor. Tekintve, hogy az elsőként levett minta szöveti törmelékkel szennyezett lehet ezt kizárólag kémiai és szerológiai vizsgálatokra használhatjuk fel, a másodikat mikrobiológiai, a harmadikat pedig mikroszkópikus és citológiai vizsgálatokra Ízületi folyadék A vizsgálati céllal végzett ízületi folyadékvételi technikát arthrocentesisnek nevezik. Az ízületi folyadékvétel segítségével megállapíthatjuk az arthritis (ízületi gyulladás) típusát, mibenlétét. Normálisan csak igen csekély mennyiségű folyadék található az ízületekben, azonban gyulladás esetén ennek mennyisége igen jelentős mértékben is megnőhet. A mintavételi eljárást orvos végzi steril körülmények között és ő állítja fel limitált mintamennyiség esetén a vizsgálatok prioritási sorrendjét is. A mintavételi eljárás esetenként és ízületenként 19

30 Mintavétel, preanalitikai folyamatok és variabilitásuk jelentős variabilitást mutat. Sima steril csövet használunk molekuláris diagnosztikához, tenyésztéshez, glukóz és fehérje meghatározásokhoz, EDTA-s csövet teljes leukocita, differenciál és eritrocita számláláshoz Magzatvíz (amniotikus folyadék) Analóg módon a magzatvízgyűjtési eljárást amniocentézisnek nevezik. Ezt is kizárólag orvos végezheti, a következő esetekben: 1. veleszületett betegség prenatális diagnózisa, 2. a magzat érettségének megállapítása, 3. Rh-izoimmunizáció, vagy intrauterin fertőzés gyanúja esetén. A mintavétel általában altatásban történik, a lefertőtlenített bőrfelületet egy hosszú tűvel szúrják át és 10 ml folyadékot szívnak le egy fecskendővel. A mintát steril tárolóedénybe töltik és küldik a laboratóriumba analízisre. Amennyiben a magzati tüdő fejlettségét kívánják megállapítani a surfactant, albumin, vagy a lecitin-szfingomielin arány alapján, akkor a mintavételt követően rögtön jégre helyezik. A fényérzékeny anyagokat barna csőbe veszik és így továbbítják a laborba Mellhártya, szívburok és hasűri folyadékok (pleurális, perikardiális folyadékok és ascites) Normálisan ezen szerózus folyadékok a velük szemben található membránfelületeken történő könnyebb csúszás végett nedvesítési funkciókat töltenek be. Gyulladás esetén térfogatuk jelentős mértékben megnőhet Specifikus sejtek A szájüregből vehető bucca sejtekből kiválóan lehet genomi DNS-t izolálni. Két módon szokás mintát venni: 1. speciális összetételű szájvízzel alaposan átöblíti a száját a beteg, majd egy gyűjtőedénybe köpi azt, 2. egy kis darab steril vattával (mint a fülpiszkáló) megdörzsöli a szájüreg belsejét és a vattára tapadt sejtekből izolálunk DNS-t. A másik egyedi sejtgyűjtés a CVS (Chorionic Villus Sampling), azaz a korionboholy mintavétel. A mintavétel során egy katétert, vagy egy tűt tolnak a placentába és (a magzatburokból a placentába nyúló érképződményekből a) korionbolyhokból lecsípnek egy kicsit. A korionbolyhok a magzattal megegyező genetikai háttérrel rendelkeznek, így kiválóan alkalmas genetikai rendellenességek vizsgálatára. Előnye, hogy a héten már elvégezhetőek ezen vizsgálatok, míg a magzatvízből történő hasonló vizsgálatok csak a terhesség hetét követően A minták kezelése A megfelelő vizsgálati eredmény csak reprezentatív, megfelelő módon gyűjtött és megfelelő módon kezelt minta révén érhető el. A megfelelő kezelésnek szerves része az egyértelmű mintajelölés, mintaazonosítás A minták minőségének megőrzése a szállítás, tárolás során Minden hőérzékeny minta esetében a szérum és plazma preparálásához szükséges centrifugálást hűtött centrifugában kell elvégezni. Néhány fényérzékeny alkotót, mint például a bilirubint és a karotint óvni kell a napfénytől és a mesterséges fénytől egyaránt. A vérmintákat a szállítás során óvni kell a hemolízist okozó rázkódástól. Amennyiben pneumatikus csőrendszerben történik a szállítás, ezt úgy kell kialakítani, hogy az ne tartalmazzon hirtelen kanyarokat és megállásokat. Amennyiben ez nem biztosítható, vagy a beteg olyan kezelést kap, aminek következtében sejtjei sérülékenyebbek lesznek, a centrifugálást a szállítást megelőzően el kell végezni. Eleve a szérum és plazma sejtes elemektől történő szeparálását, olyan gyorsan el kell végezni, amilyen gyorsan csak lehet, de mindenképpen két órán belül. Amennyiben ez nem lehetséges inkább szobahőmérsékleten tároljuk a mintát, mint 4 C-on, mivel így csökkenthető a hemolízis mértéke. Számos bomlékony analit esetében, mint például sok hormon a szérumot, plazmát rögtön a centrifugálást követően le kell fagyasztani. A mintatartó csöveket kupakkal együtt kell centrifugálni, hogy megelőzzük a minta összetételének megváltozását, illetve csökkentsük a fertőzésveszélyt Preanalitikai variabilitások 20

31 Mintavétel, preanalitikai folyamatok és variabilitásuk Kontrollálható variabilitások A fent részletezett mintavétellel kapcsolatos tényezők mind a kontrollálható preanalitikai variabilitások közé tartoznak. Szintén ebbe a csoportba sorolhatjuk az élettani variabilitásokat, továbbá a diétával, életvitellel, stimulánsokkal, gyógyszerekkel, gyógynövényekkel és a roboráló szerekkel kapcsolatos tényezőket Élettani variabilitások Testhelyzet: Egy átlagos felnőtt szervezetében nagyjából 10%-kal ( ml) csökken a vértérfogat, ha fekvő testhelyzetből álló helyzetbe kerül. Tekintve, hogy kizárólag fehérjementes folyadék halad át a kapillárisok falán a szövetekbe ez a plazma mennyiségének csökkenését és a plazma fehérjekoncentráció (8-10%-os) emelkedését jelenti. Normális esetben ez a térfogatváltozás 10 perc alatt lejátszódik, azonban ha valaki hosszú távon ágynyugalomra volt kárhoztatva ez az idő hosszabb is lehet. Fekvőbetegek esetén első körben a plazma és az extracelluláris folyadéktérfogat csökken, ami természetesen növekedett fehérje és fehérje-kötött anyag koncentrációval jár együtt. Hosszabb távú fekvés esetén viszont a folyadék visszatartás megnövekszik és a hígítási hatás miatt a plazma albumin és a fehérjekötött anyagok koncentrációja csökken. A hosszan tartó fekvés kihatással van a kis molsúlyú anyagok és számos ion koncentrációjára is. Ezt, valamint azt a tényezőt, hogy csak jóval később (néhány héttel) a hosszú távú fekvőállapot megszűntét követően normalizálódik a helyzet fontos figyelembe venni az eredmények értékelésekor. Fizikai aktivitás: Természetesen figyelembe kell venni, hogy milyen mértékű és időtartamú az aktivitás. Általánosságban csak annyit érdemes megjegyezni, hogy 1. az aktivitással erőteljes folyadékáramlás indul be az intravaszkuláris és interstíciális kompartimentumok között, 2. az aktivitásbeli különbség, jelentős hormonszint változást okoz, 3. a verejtékezéssel jelentős folyadékvesztés jár együtt. A konkrét metabolikus, enzimszintbeli változásokra az aktuális paraméterek tárgya-lásánál fogunk kitérni. Cirkadián változások: A cirkadián változások az analitek 24 óra alatt leírt termelési, szekréciós és koncentráció mintázatát, görbéjét jelenti. A testfolyadékok megannyi alko-tója mutat ilyen ciklikus napi változást. Ehhez a ciklikussághoz számos tényező járulhat hozzá, mint a testhelyzet, aktivitás, táplálkozás, stressz, napfény és sötétség, az ébredés és alvás. Egyes esetekben igen kifejezett is lehet, figyelmen kívül hagyásuk komoly értékelési problémákhoz vezethet, ezeket az adott esetekben feltétlenül meg fogjuk említeni. Menstruációs ciklus: Nők esetében a nemi és más hormonok szintjét is igen jelentős mértékben befolyásolja a menstruációs ciklus. Erre külön fejezetben (reproduktvív en-dokrinológia) is ki fogunk térni. A fent részletezett élettani variabilitásokon kívül még számos kontrollálható variabilitással kell az eredmények kiértékelésekor számolnunk, ilyenek az utazás, a diéta, a különböző táplálkozási szokások (pl. vegetáriánus), a malnutrició, az éhezés és jóltápláltság, az életstílus, amiben fontos szerepet kap a dohányzás és alkoholfogyasztás. A különböző gyógyszerek, táplálék kiegészítők fogyasztása Nem-kontrollálható variabilitások A nem-kontrollálható variabilitások körét a 1. biológiai, 2. környezeti, 3. hosszú távú ciklikus befolyások és az 4. alapvető egészségügyi helyzet adja Biológiai hatások A beteg kora, neme és a rassz, amelybe tartozik, mind befolyásolják laboratóriumi tesztjeinek eredményét. Igen gyakran oly mértékben, hogy különböző referencia tartományokat kell felállítani ezek figyelembevételével. Életkor: Az életkor igen jelentős mértékben befolyásolja a referencia intervallumokat, elsősorban a hormonok esetében. Általában négy korcsoportba szoktuk osztani a betegeket: újszülött és csecsemő (1 éves korig), gyerekek és kamaszok (pubertás), szexuálisan érett felnőttek és idősek. Nem: Egészen a pubertásig csak igen kevés különbség tapasztalható a fiúk és a lányok laboratóriumi paraméterei között. Ezt követően a nemi hormonok és a következményes fiziológiai változások, mint például a férfiak esetében általában előforduló nagyobb izomtömeg már igen jelentős eltéréseket is okozhat. 21

32 Környezeti hatások Mintavétel, preanalitikai folyamatok és variabilitásuk A laboratóriumi paramétereket befolyásoló környezeti tényezők közé tartozik a 1. tengerszint feletti magasság, a 2. környezeti hőmérséklet, a 3. földrajzi hely, lakhely, illetve az 4. évszaki befolyások Alapvető egészségügyi állapot A következő általános egészségügyi állapotot befolyásoló tényezők bizonyosan befolyással vannak a testfolyadékok összetételére: 1. elhízás, 2. vakság, 3. láz, 4. sokkos állapot, trauma, 5. transzfúzió és infúzió. 22

33 2. fejezet - Molekuláris biológiai módszerek az örökletes, veleszületett betegségek diagnosztikájában 2.1. A DNS, a humán DNS főbb jellemzői A sejtjeink DNS állománya által kódolt fehérjék határozzák meg sejtjeink szerkezetét és funkcióját. Amennyiben a DNS állományunk megváltozik, sérül, megváltozhat az általuk kódolt fehérje szerkezete, ezáltal funkciója is, amely igen gyakran betegségekhez vezethet. Vegyük szemügyre kicsit alaposabban genetikai háttértárunkat, sejtjeink DNS állományát. A humán sejtek két kompartimentumban tartalmaznak örökítő anyagot, DNS-t a sejtmagban (nukleáris DNS) és a mitokondriumban. Nukleáris DNS: A sejt DNS állományának legnagyobb része kettős magmembránnal védve, a sejtmagban található. A sejtmagban található DNS mintegy hárommilliárd (3,2*10 9 ) bázispárból áll. Ez a hárommilliárd bázispárnyi DNS 46 db (23 pár) kromoszómán oszlik meg, nagyjából önálló transzkripciós egységet, gént tartalmazva. Az ivarsejtek és még néhány sejt kivételével minden egyes humán sejt minden kromoszómából két kópiát, egy apai és egy anyai eredetű kópiát tartalmaz re ismertté vált a humán genom első, még kissé kiforratlan szekvenciája, 2004-re pedig a finom szekvencia is. A humán genom megismerésével az örökletes, genetikai betegségek diag-nosztikája is nagy lendületet kapott. A hihetetlen adathalmaz több jelentős direkt felfedezést is hozott. Az első közülük az volt, hogy a genom mindössze igen csekély része (1-1,5%-a) a fehérjét kódoló szakasz. Egy átlagos gén mintegy bázispárból (bp) áll. Ha ezt összevetjük azzal, hogy egy átlagos méretű fehérjelánc kódolásához mindössze 1300 bp-ra van szükség, akkor láthatjuk, hogy valóban jelentős méretű a nem kódoló részek aránya. Mi lehet ezen szekvenciák szerepe? Az exon és intron szekvenciákon kívül jelentős méretű regulációs szekvencia is társul minden egyes génhez, amelyek feladata, hogy a megfelelő időben be (vagy ki) kapcsolt állapotban legyen az adott gén, illetve biztosítják, hogy a megfelelő mértékben fejeződjék ki és csak is kizárólag a megfelelő sejttípusban. A teljes genom szekvenciájának ismeretében megválaszolhatjuk a sokakat érdeklő kérdést, hogy mekkora különbség van két különböző fajhoz tartozó élőlény és mekkora két ember DNS szekvenciája között. Egy csimpánz és egy ember DNS szekvenciája mindössze nagyjából 1%-os különbséget mutat. Ha két ember ugyanazon DNS szekvenciáját vizsgáljuk meg, akkor pedig kevesebb, mint 0,1% különbséget találunk. Nyílván az egyes fajok közötti különbség, mint egy adott egyed különbsége (mutációja) jelenik meg először. Az, hogy az adott mutáció megragad-e a populációban és így a fajra jellemzővé válik-e az azon múlik, hogy milyen funkcionális következményekkel jár. Amennyiben a mutáció egyértelműen súlyos, káros következményekkel jár, akkor kiszelektálódik és nem ragad meg a populációban (hordozója méhen belül, vagy születést követően, a legtöbbször utódok nélkül meghal). Következésképp, ha egy egyértelműen előnyös reprodukciót érintő tulajdonságról van szó, az nagyon gyorsan elterjedhet a populációban. A mutációk legnagyobb része se nem káros, se nem előnyös. Ezen szelekciósan neutrális mutációk szintén megragadhatnak és elterjedhetnek, így hozzájárulhatnak a különböző genomok evolúciós változásához. Az emberek között egyik leggyakrabban jelentkező különbség, nagyobb DNS blokkok (melyek mérete nagyjából 1 kilobázispártól néhány megabázispárig terjed) duplikációja, illetve deléciója. Ha egy találomra kiválasztott ember DNS állományát összehasonlítjuk a genom adatbázisban található szekvenciával, nagyjából 100 különbséget (CNV copy number variation) találhatunk, az ilyen hosszú szekvencia blokkok között. Néhány ilyen kópia számbeli különbség gyakrabban, míg mások csak az emberek kis hányadában fog előfordulni. Az egyes fajok, egyedek között fennálló különbségek közül az egy bázis cseréjével járó SNP-k (single nucleotid polimorphism) a legjobban karakterizáltak. Ahogy a nevük is mutatja, mindössze egyetlen nukleotidot érintenek a genomban, amelyben az emberek egy nagyobb populációja egyféle, míg másik jelentős részük egy másik féle nukleotidot tartalmaz. Ha két ember genomját összehasonlítjuk, akkor azok 2,5 millió ilyen helyen (1 az 1300 nukleotid párból) fognak különbözni. Néhány szekvencia részlet kiemelkedik magas mutációs rátájával. Erre jó példát szolgáltatnak a néhány nukleotidból álló ismétlődések, például a CA ismétlődés(ek), amelyek igen gyakoriak a humán genomban (ahogy az összes eukarióta genomban). A (CA) n motívumot tartalmazó DNS részletek viszonylag alacsony fokú hűséggel replikálódnak, mivel a templát és az 23

34 Molekuláris biológiai módszerek az örökletes, veleszületett betegségek diagnosztikájában újonnan szintetizálódott lánc között csúszás van, így az n pontos értéke az egyes genomok között meglehetősen széles skálán változhat. Ezek az ismétlődések, így ideális genetikai markerek, tekintve, hogy minden ember heterozigóta két különböző n értéket hordoznak minden egyes CA ismétlődésre, egyféle hosszt örökölve az anyától (n) és jó eséllyel egy másfajta ismétlődést, hosszúságot örökölve az apától. Így az adott szakasz két kópiájában az ismétlődések hossza egyedre jellemző, és kiválóan felhasználható molekuláris markerként például kriminalisztikai vagy apasági ügyekben. Habár a legtöbb hosszúság polimorfizmus és SNP a fenotípust nem befolyásolja, egy kis hányaduk egyértelműen felelőssé tehető az emberi sajátságok örökletes aspektusaiért. A klinikai kémikus szemével nézve pedig igen nagy a jelentősége, hogy akár egyetlen SNP, vagy akár a DNS hosszának (egy adott szekvencia ismétlődési számának megváltozása: hosszúság polimorfizmusa) olyan fehérjeszerkezetbeli különbséget idézhet elő, amely igen súlyos kórképek kialakulásához vezethet. Mitokondriális DNS: A mitokondriális DNS (mtdns) jóval kisebb méretű, mint a nukle-áris mindössze bp-ból áll. A lineáris nukleáris DNS-sel ellentétben cirkuláris (a bakteriális DNS-hez hasonlóan), ezzel is bizonyítékot szolgáltatva a mitokondrium bakteriális eredetére. A mtdns kizárólag anyai ágon öröklődik, kizárólag a petesejtekben található mtdns-ek határozzák meg a születendő gyerek mtdns-ét. A kisméretű mtdns összesen 37 gént tartalmaz. A 37 gén közül 13 gén fehérjét kódol, 2 gén rrns-t, 22 gén trns-t. Az mtdns által kódolt fehérjék a mitokondriális elektron transzfer lánc fontos alkotói. A II-es komplex kivételével mindegyik komplex rendelkezik egy, vagy több mtdns által kódolt alegységgel (I: 7 db, III: 1 db, IV: 3 db, ATP-szintáz: 2 db). A mtdns által kódolt RNS-ek pedig a mitokondriális transzlációs apparátus alkotói. A mtdns-ben bekövetkezett mutációk, éppen ezért a sejtek energiatermelő folyamataira lesznek ha-tással. Ezért különösen a nagy energiaigényű szövetek (ideg, szívizom, vázizom, máj) esetében kell súlyos következményekkel számolnunk. A mtdns pedig különösen magas mutációs rátával rendelkezik, aminek oka lehet rossz hibajavító apparátusa, a mitokondriumban termelődő nagy mennyiségű reaktív oxigénvegyület, a mtdns nem rendelkezik klasszikus hiszton fehérjékkel, ez tovább fokozza védtelenségét. Mindezek hozzájárulhatnak ahhoz, hogy jelenleg több mint 5000 különféle mtdns mutációt ismerünk. Az mtdns mutációk száma a kor előrehaladtával nő, így az idősebb korosztályt hangsúlyosabban érinti DNS izolálás A klinikai kémiában egyre növekvő szerepet kapnak a molekuláris biológiai módszerek. Felhasználjuk őket: 1. örökletes, genetikai hátterű betegségek diagnosztizálására. Ebben az esetben az előző fejezetben leírtak szerint ismert SNP-ket, vagy a DNS hosszúságának megváltozását keressük. 2. Kórokozók kimutatására. Ebben az esetben ismert idegen eredetű, az adott kórokozóra jellemző szekvenciájú DNS jelenlétét mutatjuk ki. Amennyiben ezt a DNS részletet ki tudjuk mutatni azzal meghatároztuk az adott élőlényt (vírust, baktériumot, gombát, személyazonosítás esetén embert). 3. Egyre nagyobb súlyt kapnak (a személyre szabott gyógyszeres terápia térnyerésével) a farmakogenetikai vizsgálatok (pl. CYP2C9 polimorfizmusok), 4. Végül, de nem utolsó sorban kiemelt szerep jut számukra a vérképzőszervi daganatok diagnosztikájában, genetikai hátterének felderítésében (pl. Philadelphia kromoszóma: t(9,22)). Mindegyik esetben az első feladat megfelelő minőségű DNS izolálása. Tekintsük át röviden, hogy milyen fontosabb lépései vannak a DNS izolálási eljárás(ok)nak. A mintavétel, ahogy az 1. fejezetben írtuk a vizsgálat céljától függő szövetből történhet invazív módon, leggyakrabban vérvétellel, korionboholyból (CVS), illetve nem invazív módon bucca sejtekből, hajból, körömből. Természetesen bármilyen DNS tartalmú minta alkalmas lehet DNS izolálásra, legfeljebb a módszert kell adaptálni, a leggyakrabban gyakorlati megfontolásból az előbb felsorolt mintákból történik a DNS kinyerése A sejt feltárása A DNS-hez hozzá kell férnünk, így első lépésünk a sejt feltárása lesz. Humán sejtek esetében, amelyek nem rendelkeznek sejtfallal legtöbbször elegendő a hipotóniás sokk (valamilyen alacsony koncentrációjú semleges kémhatású pufferbe tesszük a feltárandó sejteket). A komoly sejtfallal rendelkező baktériumok esetében szükséges a sejtfal emésztése lizozimmel. Ezen kívül szövetdarabok, baktériumok esetén szükség lehet mechanikai szövet-, sejtfeltárásra. Ilyen mechanikai feltárók a French press, Waring késes feltáró, a BeadBeater, a Potter-Elvehjem feltáró. Szintén mechanikus feltárási eljárás, a térfogatváltozáson alapuló, ismételt fagyasztás-olvasztás. Kötőszövetekből történő izolálás esetén (kollagenáz) enzimes kezelésre is szükség lehet. A 24

35 Molekuláris biológiai módszerek az örökletes, veleszületett betegségek diagnosztikájában különböző membránszerkezetek megbontása detergensekkel, illetve enzimekkel (leggyakrabban proteináz K) történik A sejt saját nukleázainak inaktiválása Célunk a lehető legkisebb mértékben sérült genomi DNS (egyes esetekben organelláris DNS) kinyerése. Ehhez a sejt saját nukleázait, amelyek felszabdalnák a DNS szálakat inaktiválnunk kell. Ez leggyakrabban EDTA tartalmú pufferek használatával történik meg, mivel ezek a nukleázok működéséhez szükséges ionokat (Ca 2+, Mg 2+) megkötik Szennyező alkotók eltávolítása A legnagyobb gondot a szennyező fehérjék jelenthetik (különösen a leggyakoribb izolálást követő folyamat, a PCR alkalmazása során). A szennyező fehérjéktől leggyakrabban oldószeres extrakcióval (fenol/kloroform/izoamil-alkohol) szabadulhatunk meg. A fenol vízzel rosszul elegyedő folyadék, ha a mintánkhoz, a vizes DNS, fehérje oldathoz adjuk két külön fázis jön létre (hasonlóan mint a víz, olaj rendszereknél). A fehérjék a fenolos, a DNS pedig a vizes fázisba oldódik. A két fázis, centrifugálással elkülöníthető és a vizes-dns fázis lepipettázható. Ezen kívül a fehérjék elkülöníthetők még szelektív kicsapással. A fehérjék eltávolítása ez esetben NH 4OAc-tal, vagy NaCl-dal történő kicsapással történik. A kicsapódott fehérjéket ezt követően centrifugálással leülepíthetjük A DNS szelektív kinyerése A vizes DNS oldathoz, vele megegyező térfogatú, alkohol oldatot adva a hosszú DNS láncok kicsapódnak és centrifugálással könnyen szeparálhatóak. A DNS alkoholos kicsapása történhet 2-propanollal, illetve etanollal. Újabban néhány kromatográfiás módszer is megjelent a piacon. Alkalmazásuk egyelőre meglehetősen drága, ezért széles körben nem terjedtek még el A DNS méret szerinti elválasztása gélelektroforézissel A DNS méret szerinti elválasztása leggyakrabban agaróz gélben szokott történni. A gél alapanyaga az agaróz egy hínárból kivont poliszacharid, amely csak forró vízben oldódik és lehűlve megdermed. A feloldást követően egy téglatest alakú formába töltjük és egy fésűt helyezünk a még olvadt agaróz oldatba. A dermedést követően a fésűfogak lenyomata fogja képezni a gélzsebeket, amelyekbe az elválasztani kívánt DNS oldatot töltjük. Az agaróz tömböt egy pufferrel töltött kádba helyezzük, amelyre egyenáramot kapcsolunk (2.1. ábra). A gélelektroforézis során az áram hatására a foszfát csoport miatt negatív töltésű DNS a pozitív elektróda irányába mozdul el. Az elmozdulást a gélmátrix annál jobban akadályozza minél nagyobb méretű a DNS szál. A gélelektroforézist mindaddig végezzük, amíg a DNS oldathoz kevert kék színű indikátorfesték, például a brómfenol kék el nem éri a gélhasáb szélét. A bróm-fenol kék és társai kis molekulaméretű, negatív töltésű festékek, így a DNS-szálak garantáltan lassabban haladnak és nem futnak ki a gélből a pufferbe. Ekkor, hogy láthatóvá tegyük a DNS-szálakat a gélt etídium-bromid oldatba tesszük. Az etídium-bromid egy fluoreszcens festék, amely a DNS és RNS molekulák bázisai közé interkalálódik. A gélt UV fénnyel átvilágítva a nukleinsav láncokba interkalálódott etidium-bromid élénk színnel fluoreszkál. A DNS-szálak méretét ismert hosszúságú DNS-t tartalmazó, DNS molekula tömeg markerrel, úgy nevezett létrával tudjuk megállapítani. Az azonos utat megtevő DNS csíkok, azonos mérettel rendelkeznek (2.1. ábra) ábra - DNS minták (agaróz) gélelektroforézise. 25

36 Molekuláris biológiai módszerek az örökletes, veleszületett betegségek diagnosztikájában A DNS mérete és a megkívánt felbontás alapján választjuk ki a gél anyagát, töménységét. Az agaróz gélelektroforézis egyszerű, de nem túl jó felbontást tesz lehetővé (viszonylag tömény 2% körüli gél esetében is maximum 10 bp-os felbontás). Az agaróz mellett, kisebb méretű ( bp) DNS-szálak elválasztására alkalmazzák a poliakrilamid gélelektroforézist. Ebben az esetben már 3 bp-os felbontás is elérhető. Ettől komolyabb felbontás, akár 1 bp különbség is elérhető kapilláris gélelektroforézis-sel. Kapilláris gélelektroforézis során egy keskeny kapilláris egyik oldalán történik a mintafelvitel és a hagyományos gélelektroforézissel megegyező módon, a kapilláris két oldalára kapcsolt egyenáram hatására történik meg a különböző gélmátrixot tartalmazó kapillárisban a méret szerinti elválasztás. A kapilláris túloldalán található detektor segítségével történik a nukleinsavak detektálása (2.2. ábra) ábra - DNS minták kapilláris elektroforézise. Eredményként, egy kromatogramhoz hasonló elektroforetogramot kapunk, ahol az eltelt idő, vagy a molekulaméret függvényében ábrázolják a detektor jelének intenzitását (2.9. ábra). Az izolálás során nyert genomi DNS hosszú, különböző mértékben fragmentálódott darabokból áll. Nehezen kezelhető ebben a formában. A DNS minták kezelését megoldja, illetve a további vizsgálatok is megkívánják, hogy kisebb darabokra vágjuk őket. Ebben bakteriális enzimek, a restrikciós endonukleázok vannak a segítségünkre. A DNS-hez kötődnek a specifikus (általában 4-6 bp-ból álló) felismerési helyen és elhasítják a DNS láncot. Eredetileg a baktériumokba behatoló vírusok ellen fejlődtek ki. A saját DNS állományukat nem hasítják, mivel mindegyik restrikciós endonukleáznak létezik egy metiláz párja, amely a saját DNS-t metilálja, ezáltal egy védő jelet téve rá. Az enzimek révén akár SNP-k kimutatása is lehetségessé válik. Ha a kérdéses SNP átfed valamely restrikciós endonukleáz specifikus hasítási helyével, akkor annak megléte, vagy hiánya befolyásolja az adott DNS darab 26

37 Molekuláris biológiai módszerek az örökletes, veleszületett betegségek diagnosztikájában adott enzimmel történő hasítását. Például a vad típusú DNS esetén létrejön a hasítás, az SNP-t (pontmutációt) tartalmazó esetén pedig, mivel megváltozott az enzim hasítási helye nem. Így, amennyiben vad típusú a DNS, két rövidebb darabkát kapunk az enzimmel történt hasítást követő gélelektroforézis során. Amennyiben a vizsgált DNS minta hordozta a szóban forgó SNP-t, akkor pedig egy hosszabbat Hibridizáció, Southern blot A gélelektroforézis és az etídium-bromidos festés segítségével az egyes DNS szálak hossza megállapítható, de a különböző bázissorrenddel rendelkező DNS szálak nem különböztethetők meg egymástól. Az egyes DNS szálak beazonosítása során azt használjuk ki, hogy a kettős szálú DNS vizes oldatban 100 C-on, vagy lúgos ph-n szétbomlik szimpla szálakra (a kettős láncot összetartó hidrogén hidak felbomlása miatt, melynek egyik esetben a magas hőmérséklet okozta hőmozgás, a másikban az enol-oxo tautoméria áll a hátterében). Ha huzamosabb ideig 65 C-on tartjuk újra kettősszálú szerkezetet vesz fel, kialakulnak a komplementer bázispárok között a hidrogén hidak: hibridizál (renaturálódik). Amennyiben a hibridizáció során a keresett DNS szakasszal komplementer, jelölt próbát is adunk a DNS oldatunkhoz, azok a megfelelő (komplementer) régiókkal hibridizálni fognak. A próbák tehát 15 néhány ezer bázispár hosszú radioaktívan, vagy fluoreszcensen jelölt nukleotid szakaszok. Az eljárás tehát két fő részből áll: 1. Elsődleges durva elválasztás gélelektroforézissel (méret szerint) 2. Másodlagos specifikus analízis jelölt hibridizációs próbával A módszert, kifejlesztőjéről, Sir Edwin Southernről, Southern Blot technikának nevezték el. Később hasonló módon, a Southern Blot technikára alapozva megvalósították az RNS szálak: Northern Blot és a fehérjeláncok: Western Blot azonosítását is. S mivel southern angolul annyit tesz, hogy déli az utóbbi esetekben már az eltérő égtájakról történt elnevezés, az eltérő molekulák azonosítására utal. A módszer igen érzékeny és szelektív. A polimeráz láncreakció (PCR), amely szintén a hibridizáción alapul azonban valamelyest háttérbe szorította Polimeráz láncreakció (PCR) A polimeráz láncreakció során melynek ötlete kifejlesztőjének Kary Mullis fejében egy ezüstmetál Honda Civicben töltött hajnali autóút során fogant meg, miután hazavitte barátnőjét és lakása felé hajtott tulajdonképpen a sejtben zajló replikáció folyamatát másoljuk le. A legfontosabb különbség az, hogy míg a replikáció során a teljes genomot lemásolja a sejt, addig a PCR során a minta DNS mindössze egy általunk kiválasztott hosszabb, vagy rövidebb részletéről készül igen jelentős számú kópia (2.3. ábra) ábra - Polimeráz láncreakció 27

38 Molekuláris biológiai módszerek az örökletes, veleszületett betegségek diagnosztikájában Adódik a kérdés, hogy tudjuk mi kiválasztani a megsokszorozni kívánt DNS szakaszt? Bizonyára mindenki emlékszik még rá, hogy a DNS polimeráz, csak egy már megkezdett oligonukleotid láncot tud folytatni. Így a PCR reakcióelegynek tartalmaznia kell egy bp hosszú kezdő DNS oligonukleotid szekvenciát, a primert. A primer szekvenciáját mi adjuk meg és gyártatjuk le egy céggel. A primer a bázis komplementaritás alapján hozzáköt a templát DNS vele komplementer régiójához és a DNS polimeráz ettől a ponttól kezdve folytatja a lánc meghosszabbítását. Mindebből következik, hogy a módszer alkalmazásának előfeltétele, hogy a vizsgálandó DNS-szakasz nukleotid sorrendjét legalább részben, a primerek tapadási helyeinél ismerjük. Tekintsük át, milyen reagensekre van szükségünk a kémcső replikációhoz és pontosan milyen folyamatok is zajlanak a PCR csőben! Hozzávalók: Templát DNS: Ezt az előzőek szerint izoláljuk a betegből származó mintából. PCR puffer Primerek: tervezzük, majd leszintetizáltatjuk dntp Mg 2+ : az újonnan szintetizálandó DNS lánc(ok) építőelemei Hő stabil DNS polimeráz (pl. Taq, Pfu) Történések: Minden alkotót a megfelelő arányban összemérünk egy PCR csőbe és a PCR készülékbe helyezzük. Ez tulajdonképpen egy programozható termosztát. Egy általános PCR hőprogram három lépésből áll. 1. Denaturáció: A lépés során a készülék 95 C-ra melegíti a reakcióelegyet. Ennek hatására a kettős szálú DNS részletek között a hidrogénhidak felhasadnak és egyszálúvá válnak. 2. Primerek betapadása: Az angolszász irodalomban annealing-nek nevezett lépés során a készülék C közé hűti le a reakcióelegyet. Ennek hatására a rövid primerdarabok betapadnak a komplementer DNS részletekhez, létrejönnek köztük a H-hidak és megindul a polimerizáció, a lánchosszabbítás folyamata. 3. Polimerizáció: A lépés során a készülék 72 C-ra melegíti a reakcióelegyet. Ez a hő stabil polimeráz optimális működési hőmérséklete, a polimerizáció folyamata felgyorsul. A PCR reakció során ezt a három lépést ismétli ciklikusan a műszer (2.4. ábra) 28

39 Molekuláris biológiai módszerek az örökletes, veleszületett betegségek diagnosztikájában 2.4. ábra - A polimeráz láncreakció lépései, hőprogramja Egy lépés nagyjából fél percig tart és hozzávetőlegesen szer szoktuk megismételni. A primer, ahogy az ábrán is látjuk az újonnan szintetizált DNS az egyik végét határozza csak meg. Így a kívánt jól definiált hosszúságú termék csak a leányszálakról, illetve azok utódszálairól készülhet. Ez problémát nem okoz, mivel néhány ciklus alatt ezek száma bőven meghaladja (exponenciális mértékű növekedés) a kizárólag a templát DNS-ről készülő nem pontosan definiált hosszúságú DNS szakaszok hosszát (lineáris mértékű növekedés). A PCR tehát lehetőséget ad arra, hogy egy adott DNS szekvencia jelenlétét kimutassuk, hiszen kizárólag abban az esetben keletkezik az adott (a primerpár, tehát általunk meghatározott) hosszúságú PCR termék, ha a primerpárral komplementer szekvencia jelen van. A PCR-t követő gélelektroforézis során ez ellenőrizhető. Így viszonylag gyorsan juthatunk a DNS minőségét mutató eredményhez, tehát információt kaphatunk egy adott mutáció, vagy patogén jelenlétéről, vagy távollétéről. Idővel felmerül az igény, hogy ne csak a DNS minőségéről, hanem mennyiségéről is információhoz jussunk. Ez a hagyományos PCR-rel nem volt lehetséges, hisz a PCR végén mérhető DNS mennyiség nem áll összefüggésben (a PCR során folyamatosan változó hatásfok miatt) a kiindulási DNS mennyiségével. Tehát olyan módszert kellett kidolgozni, amely folyamatosan a reakció során információt szolgáltat a DNS mennyiségéről, azaz valós időben, real-time nyomon tudjuk követni a folyamatot Real-time PCR, a DNS mennyiségi meghatározása Lássuk csak, miben különbözik a real-time (valós idejű) PCR a hagyományos PCR-től! A reagens összetételnél két fontos különbséget kell megemlítenünk: 1. a primerpár mellett, egy fluoreszcensen jelölt harmadik oligonukleotidot is tartalmaz a reakcióelegy. 2. A hőstabil polimeráznak 5 3 exonukleáz aktivitással kell rendelkeznie. A készülék ebben az esetben már nem egy egyszerű programozható termosztát, hanem egy arra ültetett fluorimétert is magában kell foglalnia, amely minden egyes ciklus végén megméri az egyes PCR csövekben található reakcióelegy fluoreszcenciáját ábra - Real time PCR TaqMan próbával 29

40 Molekuláris biológiai módszerek az örökletes, veleszületett betegségek diagnosztikájában Most pedig nézzük meg, miben különbözik a reakció, mi ad lehetőséget a mennyiségi DNS meghatározásra! A real-time PCR működési elvét a TaqMan próbával történő detektáláson mutatjuk be, de fontos megjegyezni, hogy számtalan más detektálási eljárás létezik, jelen könyvnek nem célja ezek részletes bemutatása A primer betapadási lépés során nemcsak a primerek, hanem a harmadik, a fluoreszcensen jelölt oligonukleotid, a TaqMan próba is betapad. A TaqMan próba szekvenciáját úgy tervezzük meg, hogy a megsokszorosított DNS darabka egy belső, rövid szakaszának komplementere legyen. A próba két, fluoreszcensen gerjeszthető festékmolekulát is hordoz. A két festékmolekula eltérő fluoreszcens spektrummal rendelkezik: az R riporter festékmolekula által kibocsátott fényt a próba másik felére kötött (2.5. ábra) Q kioltó festék képes elnyelni, amennyiben a két festék közötti távolság nem haladja meg a 100 nm-t. Tehát kellő közelségben a riporter festék által emittált fény nem detektálható, ha azonban a két festék távolabb kerül egymástól, detektálhatóvá válik a riporter által kibocsátott fény is. A real-time PCR során a polimerizációs lépésben a polimeráz útjába kerül a TaqMan próba, az 5 3 exonukleáz aktivitása révén az hasítani fogja, aminek eredményeképp az 5 végen található riporter festék már kellő távolságba kerül, hogy detektálhatóvá váljon fluoreszcenciája (2.5. ábra). Minden egyes ciklussal a szaporodó DNS-sel arányosan nő a fluoreszcens jel nagysága is. Így a PCR készülékre szerelt fluoriméter segítségével realtime azaz valós időben detektálni tudjuk a DNS mennyiségét. A ciklusszám függvényében egy exponenciálisan növekvő, majd (valamelyik DNS építőelem limitálóvá válásával) telítésbe hajló görbéket kapunk. Az a ciklus, ahol a görbénk az exponenciális növekedési szakaszba lép, ahol a görbe metszi az alapvonalat, (2.6. ábra) a küszöbciklus ábra - Real time PCR eredménygörbék és kiértékelésü 30

41 Molekuláris biológiai módszerek az örökletes, veleszületett betegségek diagnosztikájában Tekintve, hogy a DNS felszaporodása kezdetben exponenciális a mennyiségi meghatározásnak az, az alapja, hogy az amplifikációs görbe exponenciális fázisán belüli küszöbértékhez tartozó PCR ciklusok száma és a DNS kiindulási kópiaszámának logaritmusa között lineáris összefüggés van a 2.7. ábrának megfelelően ábra - A kiindulási DNS kópiaszámának logaritmusa és a PCR küszöbciklusszámok között meglévő lineáris összefüggés A real-time PCR-nél szoros összefüggés van a kiindulási DNS koncentráció (kópiaszám) és a felszaporodás időbeni lefutása között, így ismert koncentrációjú standardok párhuzamos vizsgálata lehetőséget ad a mintánkban jelen levő DNS-szakaszok koncentrációjának meghatározására (2.7. ábra). A módszer alkalmazása révén meghatározható például a Hepatitis C vírustiter. Így kontrollálható az egyes vírusellenes készítmények hatásossága és kiválasztható az, amelyik a legnagyobb mértékben szorítja vissza a vírusszámot A PCR technika klinikai diagnosztikai alkalmazásai 31

42 Molekuláris biológiai módszerek az örökletes, veleszületett betegségek diagnosztikájában A módszerek ismertetését követően itt az ideje, hogy néhány gyakorlati példán bemutassuk alkalmazásukat. Az örökletes betegségeket többféleképpen csoportosíthatjuk: Az olyan betegségeket, amelyek egy gén adott mutációjának következményei, monogénes betegségeknek nevezzük. Ilyen például az V. véralvadási faktor mutációja, a Leiden mutáció, amely fokozott trombózishajlammal jár együtt. Ezen betegségek esetében, különösen, ha súlyos életet veszélyeztető állapotot idéznek elő igen nagy jelentősége van a prenatális diagnosztikának. Ezen elváltozások száma erősen limitált. Az olyan betegségeket, amelyek akkor alakulnak ki, ha több génben történik mutáció poligénes betegségeknek nevezzük. Ebben az esetben egyik, vagy másik gén mutációjának kimutatásakor nem mondhatjuk, hogy biztosan kialakul a betegség, csak azt, hogy az illető rizikófaktorokkal rendelkezik. A poligénes betegségre jó példa a nem inzulindependens cukorbetegség (NIDDM). A DNS-ben történt elváltozás szerint megkülönböztethetjük az egyetlen bázis cseréjével járó SNP-k és a DNS hosszúságának (ismétlődések számának megváltozásával, delécióval, duplikációval) megváltozásával járó hosszúságpolimorfizmusok kiváltotta kórképeket. A két különböző elváltozás eltérő molekuláris biológiai diagnosztikai eljárásokat igényel. A következőkben néhány példát ismertetünk a hosszúságpolimorfizmusok és az SNP-k okozta örökletes betegségekre és kimutatási módszereikre Hosszúságpolimorfizmus okozta betegségek és vizsgálatuk PCR-rel Huntington-kór A Huntington kórt elsőként George Huntington írta le mindössze 22 éves korában. A kór autoszomális domináns módon öröklődő neurodegeneratív megbetegedés ( emberre 5-10 megbetegedés jut a nyugati lakosság körében), amely olyan progresszív neurológiai tünetekkel jár együtt, mint az akaratlan mozgások (chorea: az ujjak zongorázásszerű mozgása, dystonia: a folyamatos izom összehúzódás következtében kialakuló csavaró, hajlító mozdulatok, a testtartással és a járással kapcsolatos abnormalitások), a kognitív funkciók leromlása és pszichés elváltozások. A betegség kifejlődésével nehezítetté válik a rágás, nyelés és a beszéd. A neuropatológiai vizsgálatok a striatumra (az előagy belső része) és kisebb mértékben a cortexre (agykéreg) kiterjedő neurodegenerációt és gyulladást mutatnak. A Huntington kórban szenvedő betegek viselkedésbeli és neuropatológiás tüneteinek kifejlődése évtizedekig tart. A tünetek leggyakrabban éves életkor között jelentkeznek (de gyerekkortól egészen az idős korig előfordulhat megjelenésük) és a betegség, a beteg állapota éven keresztül megállíthatatlanul romlik a motoros szimptómáktól a beteg haláláig ábra - PCR primerek a Huntingtinben található CAG ismétlődések meghatározására 32

43 Molekuláris biológiai módszerek az örökletes, veleszületett betegségek diagnosztikájában A Huntington kór hátterében a CAG tripletek igen nagyszámú ismétlődése áll. Az ismétlődések kódoló régióba esnek, amely így poliglutamin ismétlődést eredményez, az ismeretlen funkciójú, huntingtin fehérje N- terminálisának közelében. A poliglutamin ismétlődések normálisan is előfordulnak, de számuk 6 és 34 ismétlődés között változik, azonban azokban az emberekben, ahol az ismétlődési szám meghaladja a 40-et, mindig kialakul a betegség. A CAG ismétlődések száma fordítottan arányos azzal az életkorral, amikor a motoros tünetek megjelennek és a betegség általuk diagnosztizálásra kerül ábra - PCR termékek analízise kapilláris elektroforézissel 33

44 Molekuláris biológiai módszerek az örökletes, veleszületett betegségek diagnosztikájában A betegség molekuláris biológiai diagnosztikája PCR segítségével történik. Kezdetben a primerpár egyik felét az ismétlődési régión kívülre, míg a másik primert magára a CAG ismétlődésekre tervezték. Ezt követően elegendő volt a PCR termék hosszát kapilláris elektroforézissel megállapítani és eldönthető volt a hosszúság alapján, hogy az ismétlődések száma meghaladja-e a kritikus értéket, az adott személy hordozza-e a genetikai elváltozást. 34

45 Molekuláris biológiai módszerek az örökletes, veleszületett betegségek diagnosztikájában A CAG ismétlődések analízise azonban meglehetősen nehézkes lehet a CAG ismétlődési régiót környező DNS összetétele miatt. A környező terület meglehetősen sok CCG és CCT ismétlődést tartalmaz, amelyek ráadásul igen polimorfok is. A problémát úgy hidalták át, hogy egy primer szettet terveztek kizárólag a CAG régióra (HDF1 és HDR1 primerek), kizárólag a CCG régióra (HDF2 és HDR2 primerek), illetve a CAG+CCG régiókra együtt (HDF1 és HDR2 primerek) (2.8. ábra). A reverz primereket a detektálás végett 5 végükön fluoreszcens jelöléssel látták el. A HDR1 és a HDF2 primerekbe pedig szándékosan hibás, nem komplementer nukleotidot vittek be a 3 végtől visszafelé 2 nukleotidnyira, így fokozva specificitásukat. Tekintve, hogy a CAG ismétlődések szomszédságában található CCG és CCT régiók polimorfok, három PCR reakciót is végeztek, annak érdekében, hogy a CAG ismétlődések számát kellő pontossággal meghatározzák. A PCR termékek hossza a CAG régióra normális allél esetében 116 bp volt, ami 26 ismétlődésnek felel meg, bp, ismétlődés mutációra hajlamos allél, bp, ismétlődés igen erős hajlam, illetve a mutáns allél esetében 158 bp-nál hosszabb, ami több mint 40 ismétlődésnek felel meg (2.9. ábra) SNP-k okozta betegségek vizsgálata PCR-re Leiden mutáció A Leiden mutáció, amely nevét Leiden városáról kapta, ahol a mutációt felfedező kutatócsoport működött, az V- ös véralvadási faktor mutációja. Az 1994-ben felfedezett mutáció az aktivált protein C rezisztenciáját okozza és a vénás trombózis leggyakoribb genetikai rizikófaktora. A vénás tromboembólia (mélyvénás trombózis és pulmonáris embólia) a nyugati civilizációk egyik igen komoly egészségügyi problémája, minden ezredik embert érint, és előfordulása növekvő tendenciát mutat. A genetikai rizikófaktor mellett (ennek hatását jelentősen felerősítendő) számos környezeti rizikófaktor is létezik, mint például a dohányzás, a férfi nem, idősebb életkor, mozgáskorlátozottság, sebészi beavatkozás, malignus neoplázia, terhesség, orális fogamzásgátlók szedése, hormonpótló terápia és különböző gyulladások. Lássuk mi áll a fokozott trombózisveszély hátterében! Az V-ös véralvadási faktor az alvadási kaszkád fontos tagja a Xa faktorral egyetemben a protrombin trombin átalakulásért felelős. Az 1994-ben közölt mutáció az V- ös faktor 10-es exonában történik, az 1691-es pozícióban levő nukleotid esetében egy Guanin Adenin csere. A misszensz mutáció eredménye egy glutamát arginin csere lesz az V-ös faktor nehéz láncának 506-os pozíciójában. Ez az aminosav csere az Va faktor három aktivált protein C hasítási helyének egyikét érinti (a másik a kettő: Arg306 és Arg679). A mutáns fehérje teljesen normális módon aktiválódik és megtartja prokoaguláns funkcióját, csak éppen jóval kevésbé érzékeny az aktivált protein C általi hasításra, inaktivációra, ezáltal hiperkoagulációs állapotra (aktivált protein C rezisztenciára) hajlamosítva tulajdonosát ábra - Allél specifikus PCR primerek 35

46 Molekuláris biológiai módszerek az örökletes, veleszületett betegségek diagnosztikájában A mutáció szűrése az utóbbi időben egyre nagyobb teret kapott. Jelenleg számos módszer áll rendelkezésre, például a restrikciós fragmens polimorfizmus, amely esetében a korábbiakban említetteknek megfelelően azt használjuk ki, hogy a mutáció (SNP) egy restrikciós endonukleáz hasító helyet szüntet meg, vagy hoz létre. Hasonlóan egyszerű eljárás az allél specifikus PCR. Ezen módszer esetében tervezünk egy primerpárt a normális, vad típusú DNS-re és egyet a mutációt tartalmazó DNS-re, úgy, hogy a mutációval szembe kerülő (komplementer, vagy nem komplementer) bázis a primer 3 végére kerüljön. Ez a hely kiemelt jelentőséggel bír, ugyanis, ha itt nem komplementer bázis található jó eséllyel nem jön létre a primer betapadása, nem tudja folytatni a DNS polimeráz a lánchosszabbítást és így nem kapunk PCR terméket (2.10. ábra) ábra - Allél specifikus PCR gélelektroforézis eredmények A reakció specifikussága tovább növelhető a már korábban említett módszerrel, hogy a 3 végtől visszafelé néhány nukleotidnyi távolságban egy másik nukleotidot is kicserélünk. Amennyiben a normális primerrel kapunk PCR terméket egészséges, amennyiben a mutáns primerrel kapunk terméket beteg a vizsgált személy (2.10. ábra és ábra). Amennyiben mindkét primer esetén PCR termékképződést tapasztalunk a vizsgált személy heterozigóta (2.11. ábra). 36

47 Molekuláris biológiai módszerek az örökletes, veleszületett betegségek diagnosztikájában A real-time PCR klinikai laboratóriumokban történő elterjedésével, az előző allél specifikus PCR-hez igen hasonló, de fluoreszcens detektálást alkalmazó módszerek egyre nagyobb teret kapnak. Ezek alkalmazásával elkerülhetők a keresztszennyezésre is alkalmat adó poszt-pcr műveletek és felgyorsítható az eredmény nyerése is. A korábban ismertetett TaqMan próbán alapuló módszer esetében két allél specifikus próbát tervezünk és egy primerpárt. Az egyik próba normális, a másik próba mutáns DNS-sel komplementer. Az egyes próbák eltérő fluoreszcens jelölést kapnak. A PCR-t valós időben nyomon követve látható, hogy melyik jelölést tartalmazó TaqMan próba esetén nőtt meg a fluoreszcens jel, így a vizsgált személy genotípusa meghatározható. Amennyiben mindkét próba esetében ezt tapasztaljuk, megint heterozigóta a vizsgált személy. A mutáció megléte hagyományos alvadási teszttel is kimutatható. Amennyiben a beteg plazmájához aktivált protein C-t adva nem nyúlik meg az alvadási idő a vizsgált személy aktivált protein C rezisztenciában szenved. A Leiden mutáció előfordulási valószínűsége igen változó, a leggyakrabban a kaukázusi rasszhoz tartozó embereket érinti 15%-os előfordulást mutatva, ugyanakkor az ázsiai, afrikai, ausztrál és amerikai őslakosok körében igen ritka vagy szinte ismeretlen. A Leiden mutáció a vénás trombózis kockázatát, más környezeti rizikótényezők hiányában nagyjából 4-7- szeresére növeli heterozigóta esetben és 80-szorosára homozigóta esetben Sarlósejtes anémia Az autoszomális domináns öröklésmenetet mutató sarlósejtes anémiát egy pontmutáció okozza. A humán hemoglobint 4 polipeptid lánc alkotja, melyek mindegyikéhez egy-egy hem tartozik. Ezen hem csoportokhoz kötődhet egy-egy oxigénmolekula. A felnőtt hemoglobin A-t (adult, HbA) két alfa és két béta lánc alkotja. Az alfa lánc génje a 16-os kromoszómán a béta lánc génje a 11-es kromoszómán található. Az egészséges felnőttek vörös vértestjeiben javarészt (96%-ban) ilyen α2β2 szerkezetű HbA, kis mennyiségben HbA2 (α2δ2) és magzati (fötális) HbF (α2γ2) található. A β-génben bekövetkező báziscsere, melynek során a GAG kodon GTG-re cserélődik, a fehérjeláncban egy glutamát valin cserét eredményez. Az így létrejövő hemoglobinforma, a Hb S, belefekszik a szomszédos Hb β- lánc hidrofób részébe és így hosszú füzéreket képez, oldhatósága csökken, a vörös vértesteket sarló alakúra deformálja. A tünetek hátterében is minden esetben az áll, hogy a Hb S-t tartalmazó rugalmatlan, deformált vörös vértestek elzárják a kapillárisokat. A homozigóta forma akár csecsemőkori halált, növekedési, fejlődési rendellenességet okozhat. A heterozigóta forma általában csak hipoxiás körülmények között manifesztálódó tünetekkel jár együtt, ilyenek 1. gyerekekben a lépkárosodás, fokozott szepszishajlam, 2. végtagfájdalmak a csontok hipoxiája miatt, 3. tüdőgyulladás (pneumonia), 4. nehezen gyógyuló fekélyek, 5. elhalások vesében, agyban, hasnyálmirigyben, májban. A kezelés ez esetben is a tünetek enyhítését célozza, például antibiotikum terápia tüdőgyulladás esetén, súlyos esetben vérátömlesztés (transzfúzió) SNP-k és hosszúságpolimorfizmus okozta betegségek Cisztikus fibrózis A cisztikus fibrózis egy meglehetősen gyakori autoszomális recesszív módon öröklődő megbetegedés, amelyet minden ember hordoz a kaukázusi populációban. A betegséget hordozók száma a dél-európai, a latin, az afrikai és az ázsiai populációban jóval alacsonyabb. A betegség hátterében egy több mint bp hosszú génnel rendelkező transzportfehérje defektusa áll. A meglehetősen hosszú gén egy meglehetősen nagyméretű (1480 aminosav) ioncsatorna fehérjét, a CFTR-t (cystic fibrosis transmembrane conductance regulator) kódolja. A gén 1989-es azonosítása és klónozása, illetve az a megfigyelés, mely szerint a cisztás fibrózis hordozók 70%- ában ugyanaz a nukleotid triplett deléció (ΔF508) fordul elő azt a reményt keltette, hogy a veszélyeztetett párok kiszűrhetők, majd genetikai tanácsadásba vonhatóak, illetve szükség esetén prenatális tesztek végezhetők. A közelmúltig azonban több mint 1300 más egyéb mutációról számoltak be, s bár a legtöbbjük meglehetősen ritka, a kizárólag a ΔF508-ra szűrő vizsgálatok mindössze a veszélyeztetett kaukázusi házaspárok 50%-át képes azonosítani. Ez az arány további 5-10 gyakrabban előforduló mutációt bevonva is csak 81%-ig növelhető. Természetesen nem tudunk mind az 1300 jelenleg ismert mutációval foglalkozni, így röviden a leggyakrabban előforduló ΔF508 delécióval szeretnénk foglalkozni, illetve egy rövid áttekintést adni a betegségről. 37

48 Molekuláris biológiai módszerek az örökletes, veleszületett betegségek diagnosztikájában A deléció a CTT triplett kiesését okozza, melynek eredményeképen az 508 pozícióban levő fenilalanin kiesik a fehérjéből. A mutációk számának, illetve gyakoriságának magas számát feltehetően az okozza, hogy ezek szelekciós előnyt jelentettek a kolerával szemben. A homozigóta ΔF508 bélhámsejtek érzéketlenek voltak a koleratoxin szekréciót fokozó hatására. Érdekes módon a fenilalanin kiesése nem okoz direkt funkcióvesztést a fehérjemolekulán belül. Az érett fehérjemolekula az endoplazmás retikulumban, majd a Golgi apparátusban glikozilálódik, majd a membránba transzportálódik. A legtöbb mutáció esetében az endoplazmás retikulum minőségellenőrző rendszere érzékeli a vad típustól eltérő fehérjeszerkezetet és lebontja azt (Ez történik a ΔF508 esetében is.). A változatos mutációs és környezeti háttér miatt a tünetek igen változatosak, de minden esetben a CFTR csatorna elégtelen, hibás működése áll a hátterükben, aminek következtében a mirigyek váladéka alacsony víz és magas iontartalmú lesz. A külső elválasztású mirigyek esetében tapasztalható váladékpangás a kivezető cső elzáródását (obstrukció) okozza, amelynek következménye cisztaképződés, majd fibrózis lesz. A tüdők az esetek jelentős részében érintettek, a hörgőket a sűrű nyák ingerli, a beteg köhög, fullad, igen gyakran lép fel tüdőgyulladás is. A csecsemők egy kisebb részében a béltartalom (meconium) elzárja vékonybelet. A hasnyálmirigy, mint külső elválasztású mirigy szinte minden esetben érintett, az emésztőenzimek hiánya emésztési zavarokhoz vezet. A verejtékmirigyek érintettsége igen szembeötlő, az érintett gyerekek bőre kimondottan sós ízű az iontranszport zavar miatt kialakuló magas só koncentráció miatt, a 60 mm-nál magasabb Cl- koncentráció a betegségre utal, diagnosztikai értékkel bír. A betegek várható élettartama pár évtizede mindössze 2-3 év volt. Manapság, a járulékos betegségek, tünetek, mint például a tüdőgyulladás kezelése antibiotikumokkal, az emésztési problémák kezelése enzimadagolással révén a várható élettartam 40 év környékére emelkedett. Az enyhébb mutációkkal rendelkező emberek várható élettartama nem kevesebb, mint bármelyik mutációt nem hordozó embertársunké (70-80 év). Ahogy, azt már megállapítottuk a nagyszámú mutáció miatt a heterozigóta párok szűrése nem igazán megoldható. Prenatális vizsgálatokat abban az esetben szoktak végezni, ha a párnak már született beteg gyereke. A molekuláris biológiai vizsgálatokat legtöbbször restrikciós fragmens polimorfizmus, vagy allél specifikus PCR segítségével szokták elvégezni STR lókuszok, DNS ujjlenyomat A következő példa nem örökletes betegséghez, de jellegzetes, örökletes DNS tulajdonsághoz kötődik, ezért ebben a fejezetben tárgyaljuk. A humán genom nem kódoló régióiban számos rövid, 2-6 bázispár hosszú ismétlődő DNS szakasz található. Ezen mikroszatelit, vagy más néven short tandem repeat (STR) szekvenciák érdekességét az adja, hogy ismétlődési mintázatuk egyedi. Ezen szakaszok ismétlődésének száma alapján egy adott ember pontosan beazonosítható. Egy példa segítségével próbáljuk meg szemléltetni a gyakorlati jelentőségét, kivitelezését. Vegyük a következő CATTCG szekvenciájú ismétlődő szakaszt. Ez a szakasz Taszilóban kétszer ismétlődhet, míg Katinkában szintúgy kétszer, Arisztidben pedig háromszor. Önmagában tehát egy ilyen ismétlődő szekvencia nem elég ahhoz, hogy megkülönböztessünk két embert, ha azonban vizsgálat tárgyává teszünk még egy másik ilyen szekvenciát (legyen ez mondjuk a TAAGC), ez mondjuk Katinkában négyszer ismétlődik, míg a Taszilóban ez is csak kétszer. Amennyiben kellő számú STR szekvencia ismétlődési számát határozzuk meg, akkor ez alapján beazonosíthatunk egy konkrét személyt is. A vizsgálat alól egyetlen kivétel létezik, az egypetéjű ikrek esete, akik genetikai állománya teljesen megegyezik. Az ő kivételükkel tehát meg tudjuk különböztetni az embereket egymástól. Korábban restrikciós endonukleázokkal készültek az ilyen DNS ujjlenyomatok. Manapság paralel, több STR lókuszra, fluoreszcensen jelölt primert tervezünk és multiplex PCR-t végzünk el a DNS mintákon. A szimultán munkavégzés, detektálás végett különböző fluoreszcens jelölést fogunk alkalmazni a különböző primerek esetében. A primereket úgy tervezzük meg, hogy az egyes primerpárok, az egyes STR lókuszokat közrefogják (2.12. ábra). A PCR termékek kiértékelése ez esetben is kapilláris elektroforézis segítségével történik fluoreszcens detektálást alkalmazva. A (primerek révén) különböző hullámhosszokon fluoreszkáló termékeket meg tudjuk egymástól különböztetni ábra - STR lókuszok PCR analízise 38

49 Molekuláris biológiai módszerek az örökletes, veleszületett betegségek diagnosztikájában Tételezzük fel, hogy egy apasági perben kell az apa kilétét megállapítani. Vegyük az alábbi egyszerű esetet, amikor csak két apajelölt közül kell kiválasztanunk a tényleges, biológiai apa személyét. Ekkor DNS-t kell izolálni az anyából, a gyerekből, és a két apajelöltből. Az anya és a gyerek lókuszai között nyilvánvalóan egyezésnek kell lennie (2.13. ábra), ezt követően összehasonlítjuk a két férfi mintáját a gyerekével (2.13. ábra) ábra - STR lókuszok gélelektroforetogramja (DNS ujjlenyomat). Az egyes STR lókuszok ismétlődési számában (PCR termékek hosszában) egyezést mutató lesz a biológiai apa. Tulajdonképpen a DNS ujjlenyomat nem más, mint ezen, az adott személyre jellemző ismétlődések száma. Az igazságügyi orvostanban, például egy bűntény helyszínén hagyott nyomokból, hajból, körömből tudnak DNS-t izolálni és ezekből megállapítani a tettes, tanúk, áldozat, más helyszínen járt emberek DNS ujjlenyomatát, amelyet később össze tudnak vetni az eljárásba bevont emberek DNS ujjlenyomatával DNS chip A DNS chip, komoly költségvonzata miatt Magyarországon még egy ideig biztosan nem lesz része a rutin laboratóriumi diagnosztika eszköztárának. A tankönyv azonban a jövő számára készül, ezért feltétlenül ismertetni szeretnénk ezt a rendkívül izgalmas, nagy áteresztőképességű analitikai eljárást. Működésének alapelve, tulajdonképpen semmiben sem különbözik a négy évtizede leírt southern blot működésétől: a komplementer bázispárok között kialakuló H-hidak révén történik a megfelelő nukleotidszekvenciák felismerése, tehát ez a módszer is a hibridizációs technikán alapul. A feldolgozott minták számában azonban óriási különbség van a két módszer között. Az újdonságot a DNS-chip esetében az jelenti, hogy egyszerre több, egymástól különböző, akár több tíz-, százezer próbaként használt oligonukleotidot hibridizáltathatunk a mintával mindössze néhány perc leforgása alatt. Ez azt jelenti, hogy több tízezer mutációra tudjuk leszűrni a mintát pár perc alatt, ami különösen nagy áteresztőképességgel ruházza fel ezt az eljárást. A DNS-chip esetében 39

50 Molekuláris biológiai módszerek az örökletes, veleszületett betegségek diagnosztikájában a tervezés, a próbák bázissorrendjének kiválasztása és a chipen történő elhelyezés, ami idő- és szellemi munkaigényes feladat. Maga a chip, egy megközelítőleg 1 cm (0,8-1,5 cm) élhosszúságú szilícium lapka, amelyet sok kisebb szektorra, 30-50μm élhosszúságú kis négyzetekre osztunk fel (2.14. ábra). Minden egyes kis négyzet felületére különböző bázissorrendű oligonukleotid próbát viszünk fel. A chipek síkjára merőlegesen találhatjuk az oligonukleotidokat, a különböző kis szektorokban különböző bázis sorenddel ábra - DNS chip. A DNS-chipek előállítása a nanotechnikában igen népszerű fotolitográfiás technikával történik. A technika és a DNS chip előállításának a lelke a fényérzékeny védőcsoportok. A szilíciumlapka hordozó felületén nukleotidokkal reagáló funkciós csoportok vannak. Ezeket a csoportokat, hogy idő előtt ne reagáljanak el, fényérzékeny védőcsoporttal látják el. Megvilágítás hatására ezek a védőcsoportok elbomlanak, a reakció végbemehet, tehát a nukleotidok 3 vége kapcsolódni fog a reagáló csoporttal. Azok 5 végét szintén ilyen fényérzékeny védőcsoporttal látják el, a reakció tehát a továbbiakban is csak megvilágítás hatására, ellenőrzött körülmények között mehet végbe. Minden egyes oligonukleotid emelet felépítése 4 lépésből áll. Az első emelet első lépésének kezdőmozzanata a maszk elkészítése. A maszk lefedi a teljes DNS chipet, kivéve azokat a szektorokat (kis négyzetecskéket), amelyikre az adott nukleotidot szeretnénk felvinni. Az első nukleotid legyen az adenin. Azon négyzetecskék maszkon megfelelő részét ahova az első emeletre adenint szeretnénk felvinni, azt kivágjuk, tökéletes fedésbe hozzuk a szilícium lapkával, majd megvilágítjuk. Ahol a maszk ki volt vágva, ott a fényérzékeny védőcsoportok elbomlottak, a reaktív csoport előkerült. Majd a maszkot eltávolítjuk, és hozzáadjuk az adenint a lapkához. Az adenin kizárólag oda fog kapcsolódni, ahonnan ezeket a fényérzékeny védőcsoportokat eltávolítottuk. Az első emeletre tehát felkerültek az adeninek. Az első emelet második lépése, hogy ahova mondjuk timint szeretnénk helyezni, ott a maszkot kivágjuk, megvilágítjuk, onnan megint eltűnnek a védőcsoportok, majd hozzáadjuk a timint. Újfent, kizárólag oda kerülnek timinek, ahol a védőcsoport elbomlott. Ugyanezt guaninnal, citozinnal megcsináljuk, és ne feledjük, hogy a szintézishez olyan nukleotidokat használunk, amelyek 5 végén is fényérzékeny védőcsoport van. Amikor az első emelet megépül, akkor jön a második emelet megépítése, szintén 4 lépésben, különböző helyeken kivágott maszkokkal. Ez azt jelenti, ha 20 bázis hosszú oligonukleotid próbákat építünk, akkor azok 20 4, azaz 80 lépésben kerülnek megszintetizálásra. Maga a szintézis meglehetősen gyorsan zajlik, mindössze néhány órás művelet. Röviden tekintsük át egy vizsgálat menetét. A DNS izolálását követően egy PCR reakció során felszaporítjuk az érdeklődésünkre számot tartó DNS szakaszt. (RT-PCR segítségével RNS minták is vizsgálhatóak.) A PCR 40

51 Molekuláris biológiai módszerek az örökletes, veleszületett betegségek diagnosztikájában reakció során fluoreszkáló festékkel jelöljük meg (pl. fluoreszcein, fikoeritrin) a DNS szálakat. A DNS szálakat denaturáljuk, egyszálúvá tesszük, majd a denaturált DNS szálakat a DNS chipre visszük fel, hibridizáltatjuk a DNS chipen található oligonukleotidokkal. Ha ezek komplementerek, megtörténik a hibridizáció. A felesleget lemossuk. Ekkor kizárólag a chipen komplementer szekvenciájú próbával rendelkező PCR termékek maradnak rajta. Legvégül megvizsgáljuk, hogy mely szektorok rendelkeznek fluoreszcenciával. Az adott cella oligonukleotidsorrendje ismert, (mert a chipet mi terveztük), ahol fluoreszkál, ott tökéletes a komplementaritás, ahol nem fluoreszkál, ott nincs komplementaritás. Számítógép segítségével, így a mutáció megléte, vagy hiánya megállapítható. A mutáció vizsgálatát megkönnyíti, ha a PCR-t két különböző fluoreszcens marker jelenlétében végzik el a vad típusnál és a vizsgálni kívánt mintánál. Mondjuk a vad típust fluoreszceinnel (piros), a vizsgált mintát phycoerythrinnel (zöld) jelölik. Ezt követően mindkét mintát megvizsgálják egy-egy DNS chippel. A számítógép a kapott, és memóriában tárolt képeket egymásra vetíti. Ha a két pont színes, tehát a nukleotid sorrendjük azonos, akkor egy harmadik színnel jelöli a pontot, pl. sárgával. Ha csak az egyik pont színes, annak megtartja az eredeti színét. Jelen esetünkben tehát a piros és zöld pontok a két DNS minta eltéréseit mutatják. A chip térképe alapján ezek az eltérések könnyen azonosíthatók. A DNS chip által nyújtott szolgáltatásokra komoly az igény elég csak a rendkívül gyors patogén analízist megemlíteni, de egyre nagyobb igény mutatkozik különböző poligénes betegségek genetikai hátterének felderítésére is. Ez utóbbi esetben a hajlam ismeretében a környezeti faktorok szerepét jelentős mértékben csökkentheti, ezáltal a betegség kialakulását késleltetheti, vagy akár meg is akadályozhatja az érintett személy. Az igény tehát igen komoly a gyors és széles spektrumú tesztekre. Sajnos jelenleg meglehetősen drága az eljárás a magas szintű technikai követelmények és a chiptervezés hosszú, magas szellemi kapacitást igénylő folyamata miatt. 41

52 3. fejezet - Klinikai enzimológia Az enzimek kettős szerepet töltenek be a klinikai laboratóriumi diagnosztikában. Egyfelől számos analit meghatározása zajlik enzimek segítségével. Másfelől a különböző testfolyadékokból (leggyakrabban a plazmából, szérumból) történő enzimaktivitás meghatározások rendelkeznek fontos diagnosztikai szereppel. Az első esetben tehát eszközként használjuk fel őket, a mintához adott reagens tartalmazza őket, nem maguk képezik a vizsgálat konkrét tárgyát, célját. Míg a második esetben magának az enzim aktivitásának a meghatározása a cél, az bír diagnosztikai értékkel. A két eltérő cél, eltérő reakcióparaméter beállítást tesz szükségessé. Mielőtt a két eltérő célnak megfelelő paraméter beállításokkal foglalkoznánk, tekintsük át, milyen diagnosztikai jelentősége van a különböző enzimaktivitás meghatározásoknak. Hogy mekkora diagnosztikai jelentőséggel bírnak az enzim meghatározások, mi sem mutatja jobban, minthogy a rutin klinikai kémiai vizsgálatok bő egyharmadát különböző testfolyadékokból történő enzimaktivitás meghatározások adják. Sejtjeink nagyjából különféle enzimet tartalmaznak, ebből a klinikai laboratóriumban diagnosztikai célból legfeljebb enzim maghatározása történik. Sőt a diagnosztikai spektrum szélességét még tovább szűkíti, hogy a meghatározott (15-20 különféle) enzimaktivitás sok esetben redundáns információval bír. Erre jó példát szolgáltatnak a transzaminázok az ASAT (aszpartátaminotranszferáz) és ALAT (alanin-aminotranszferáz) aktivitások általában paralel szoktak változni, ha az egyik változik, akkor jó eséllyel a másik is változni fog. Szeparált transzamináz emelkedésre nem nagyon ismerünk példát. Maguk a testfolyadékok (plazma, szérum, vizelet stb.) normális élettani körülmények között nem, vagy csak kevés enzimet tartalmaznak. Pontosan ez adja az enzim meghatározások fontos diagnosztikai jelentőségét! A testfolyadékokba jutó enzimek jellemzőek arra a sejt-, szövettípusra, szervre ahonnan az adott testfolyadékba jutottak. Így az enzimaktivitás meghatározása lehetővé teszi, hogy viszonylag olcsón, gyorsan (saját enzimaktivitása révén) információt nyerjünk az adott szövet elváltozásáról (gyulladásáról, pusztulásáról). Az ideális az lenne, ha minden szövettípusra tudnánk ilyen jellegű tesztet végezni. Ennek korlátot szab, hogy kevés olyan nagy tömegű szerv van, amelyből sejtpusztulást követően jelentős mennyiségű intracelluláris, vagy membránhoz kötött, asszociált fehérje kerülhet a testnedvekbe. Ezt a kritériumot a máj, a vázizom és bizonyos mértékig a szívizom teljesíti. A prosztatára jellemző savas foszfatáz már csak immunológiai módszerekkel lehet biztonsággal meghatározni, klasszikus enzim meghatározások erre már nem alkalmasak. Tovább szűkítheti az alkalmas enzimek körét, hogy a sejtekből, sejtorganellumokból kijutva, a miliő megváltozásával, elveszthetik enzimaktivitásukat. Összefoglalva, azok az enzimek lehetnek alkalmasak klinikai labordiagnosztikai szempontból, 1. amelyekből viszonylag nagy mennyiség áll rendelkezésre, 2. nem denaturálódnak az extracelluláris térbe jutva, 3. onnan lassan tűnnek el, 4. aktivitásuk pontosan, reprodukálhatóan meghatározható. A diagnosztikai jelentőség tisztázását követően térjünk vissza az enzimek klinikai laboratóriumban betöltött két különböző, de mindkét esetben nélkülözhetetlen szerepének megtárgyalásához, illetve tisztázzuk a kétféle szerepkör, eltérő paraméter követelményét. Lássuk mi a különbség a két különböző szerepkör között: 1. Analit mennyiségének meghatározása: Az enzimet ebben az esetben eszközként használjuk. A mérés célja valamilyen analit (pl. vércukor) mennyiségének meghatározása. Ebben az esetben az enzimet arra használjuk, hogy az analitet, amely az enzim szubsztrátja, átalakítsuk valamilyen könnyen mérhető anyaggá, vagy az enzimreakcióban az analit mennyiségével arányos koenzim képződést/fogyást határozzuk meg. Tehát ez esetben a reakciósebességnek (és a mérendő paraméternek) az analit mennyiségével arányosnak kell lennie. Ebben az esetben az alkalmazott enzim reakciósebességének a szubsztrát mennyiségével (koncentrációjával) arányosnak kell lennie. Ez a feltétel a Michaelis-Menten egyenlet (lineáris) elsőrendű szakaszában érvényesül (3.1. ábra). Tehát a szubsztrát koncentráció enzimmennyiség arányának beállítására ennek elérésére kell törekednünk. 2. Enzimmennyiség meghatározása: Ebben az esetben az enzimmennyiséggel arányos enzimaktivitás meghatározása a cél. Kizárólag az enzim mennyiségével arányos reakciósebességet a Michaelis-Menten egyenlet nulladrendű szakaszában tudunk mérni (3.1. ábra). Így az enzimmennyiség meghatározásakor úgy kell a szubsztrát koncentrációt beállítanunk, hogy az mindig a Km érték ötszöröse legyen legalább, ekkor már jó közelítéssel a nulladrendű tartományban tudunk mérni. Tekintve, hogy egyes enzimek mennyisége (pl. a májban található transzaminázok intenzív májsejt széteséssel járó állapotokban, hepatitiszben) igen jelentős mértékben, akár több mint százszorosára is megemelkedhet, ezt nem mindig lehet biztosítani. Ilyen esetekben a vizsgált plazma, szérum hígítása jelenthet megoldást. 42

53 Klinikai enzimológia Az enzim meghatározás esetén tehát kétszeresen is indirekt módon gondolkozunk: 1. enzimaktivitást mérünk, amely abban az esetben arányos lesz a mintában lévő aktív enzimfehérje mennyiségével, ha az nulladrendű (vagyis a mért enzimaktivitás kizárólag az enzim mennyiségétől függ), 2. A második feltételezésünk, hogy az így meghatározott enzimfehérje mennyiség arányos a sejt-, szövetkárosodás mértékével, amelynek hatására az enzimfehérje a testfolyadékba került. Miután tisztáztuk ezt a fontos különbséget a továbbiakban kizárólag az enzimmennyiség meghatározásokkal foglalkozunk, az analitek meghatározására és az azokkal kapcsolatos reakciókra az adott analit mérésénél fogunk kitérni ábra Izoenzime Az eltérő aminosavsorrenddel (azaz fehérjeszerkezettel) rendelkező, de azonos reakciót katalizáló enzimeket izoenzimeknek nevezzük. Az izoenzimek regulációja, illetve lokalizációja jelentős különbségeket mutat. Így diagnosztikai jelentőségük is nagy, hisz a különböző izoenzimeket (fehérjéket) meghatározva, megállapítható a szövetkárosodás pontos(abb) helye. Az izoenzim meghatározások leggyakrabban gélelektroforézissel történnek, így nem automatizálhatóak Az enzimaktivitás meghatározásának körülményei Számos mérési körülmény befolyásolja az enzimek aktivitását. Természetesen az elképzelhetetlen, hogy az egyes laboratóriumok között eltérés legyen, ezért 1972-ben a Német Klinikai Kémiai Egyesület kezdeményezésére már megtörtént az enzim meghatározások első szabványosítása. A leggyakrabban meghatározásra kerülő enzimek mérési körülményeinek kidolgozásakor a következő paramétereket vették figyelembe: 1. Szubsztrát koncentráció: Egyrészről teljesülni kell a nulladrendűség fenti gondolatmenet szerinti követelményének, másrészről a szubsztrát koncentráció bizonyos határon túli emelésének határt szab az esetlegesen fellépő szubsztrát gátlás. Így a korábbi gondolatmenetnek megfelelően extrém magas enzimaktivitás esetén a minta esetleges hígítása jelenthet megoldást. A laboratóriumi automaták (legtöbbször) erre figyelmeztetnek, akár maguk el is végzik. 43

54 Klinikai enzimológia 2. Optimális ph: Ebben az esetben az in vitro a reakcióközegre vonatkozó optimális ph-t kell beállítani, ami eltérhet az in vivo tapasztalható ph-tól. Ez utóbbira jó példa az alkalikus foszfatáz, amely in vitro 10-es ph-n mutatja maximális aktivitását, pedig a szervezetünkben ilyen ph nem fordul elő. 3. Ionösszetétel: A ph állandó értéken tartását különböző pufferekkel oldjuk meg, amelyek egy része ugyan előfordul a szervezetünkben (pl.: foszfát) azonban korántsem olyan magas koncentrációban, mint a reakcióközegben. Más puffer oldatok (Mops, TRIS, HEPES, TEA stb.) pedig mesterségesek, meg kell találni azt a koncentrációt, amely kellő puffer kapacitást biztosít, de nem gátolja a reakciót. Gondoskodni kell az enzimek által kofaktorként igényelt ionok jelenlétéről (pl. Mg 2+ foszfát csoport transzferét katalizáló enzimek esetében). 4. Koenzimek: Azon kívül, hogy szükségesek az enzimaktivitáshoz (pl. NADH a laktát dehidrogenáz esetében) gyakran a kofaktorok átalakulása szolgáltatja az indikátorreakció alapját is. Ideális koncentrációjának beállítása eset függő. 5. Hőmérséklet: Az enzimes reakciók hőmérsékletét két tényező szabja meg: 1. mint minden reakció az enzimes reakciók is az Arrhenius egyenlet értelmében exponenciális mértékben függenek a hőmérséklettől, 2. az enzimek, mint minden fehérje esetében számolnunk kell hődenaturációjukkal is. Kezdetben 25 C-on zajlottak a mérések ez a hosszabb reakcióidő miatt kényelmesen nyomon követhető volt és a hődenaturációval sem kellett számolni. Manapság a laboratóriumi automaták korában a gyorsaság inkább előny. Ilyen megfontolásból, a mérések kétharmadát kitevő analit (szubsztrátum) meghatározások egységesen 37 C-on zajlanak, célszerű volt az enzim meghatározásokat is ezen a hőmérsékleten végezni. Így elkerülhető a két különböző hőmérséklet alkalmazása, illetve meggyorsíthatóak az enzim meghatározások is. Ezen a hőmérsékleten gyorsabban zajlanak a reakciók, ugyanakkor a hődenaturáció még nem számottevő. 6. Reakcióidő: Az a legrövidebb idő, amely alatt a normális felső határnak megfelelő enzimaktivitás még jól mérhető, azaz teljesül a linearitási kritérium (nulladrendű marad a reakció) és az abszorbancia változás sebessége hibahatáron belül meghatározható. Az általános megfontolásokat követően vegyük sorra a legfontosabb enzim meghatározásokat Kreatin-kináz A kreatin-kináz egy 82 kda moltömegű dimer fehérje, amely a kreatin ATP terhére történő reverzibilis foszforilációját katalizálja (3.2. ábra). Az izmok összehúzódásakor az ATP ADP-vé alakul és a kreatin kináz az ADP-t visszaalakítja ATP-vé a kreatin-foszfát, mint nagyenergiájú foszfátraktár terhére. A kreatin-foszfát képződés optimális ph értéke 9, míg az ellentétes irányú reakcióé 6.7. A folyamathoz Mg 2+ -ra van szükség, azonban a Mg 2+ túlsúly gátlólag hat. Az enzim a szérumban viszonylag instabil, mivel az enzim aktív helyének tiol csoportjai oxidálódnak. Az enzim oxidációja elkerülhető és viszonylag jól stabilizálható N-acetil-cisztein adagolásával. Legnagyobb mennyiségben a harántcsíkolt- és a szívizomban fordul elő, az agyban, a gasztrointesztinális traktusban és a húgyhólyagban jóval kisebb mennyisében. Az enzim kizárólag dimer formájában aktív a Da-os monomerek egyike sem rendelkezik önállóan enzimaktivitással. A három monomer közül kettő az M (muscle, izom) és a B (brain) szabadon kombinálódhatnak. A harmadik monomer a Mt (mitokondriális) a mitokondriális intermembrán térben található és mind immunológiai, mind elektroforetikus mobilitás szempontjából eltér a másik kettőtől. A szívizom kreatin kináz aktivitásának mintegy 15%-át ez adja. A másik két szabadon kombinálódó monomer három formát hoz létre: MM, MB, BB. Ezen formák eloszlása a szövetek között jelentős különbséget mutat: Vázizom: 97-99% MM, 1-3% MB Szívizom: 78% MM, 22% MB Agy: 100% BB Gasztrointesztinális traktus: 96% BB, 1% MB, 3% MM Húgyhólyag: 92% BB, 6% MB, 2% MM 44

55 Klinikai enzimológia Diagnosztikai jelentősége: A szérum kreatin kináz aktivitás, jelentős mértékben emelkedett az izomdisztrófia minden fajtája esetében. Ez az emelkedés kimondottan hangsúlyos fiatal gyerekkorban, amikor az izomsejtek pusztulása jelentős mértékű és csökken az izomtömeg hanyatlásával. Szintén megemelkedik fokozott izommunka és traumás izomsérülés esetén. Az izomsérülés egy specifikus formája a szívizom elhalással járó szívinfarktus, amely diagnosztikájában elsősorban az izoenzimvizsgálatoknak rendkívül nagy jelentősége van. Meghatározás: Leggyakrabban a fotometriás enzimaktivitás meghatározást végzik. Ebben az esetben a hatszor gyorsabb inverz reakció alapján történik az enzimaktivitás meghatározása. A kreatin kináz (CK) a kreatinfoszfátot kreatinné alakítja, miközben ATP képződik (3.2. ábra). Az első reakcióban képződött ATP-vel foszforiláljuk a glukózt, glukóz-6-foszfáttá (hexokináz, HK segítségével) (3.2. ábra), majd a harmadik reakció során a glukóz-6-foszfát dehidrogenáz által katalizált reakcióban (G6P DH) a koenzim NADP + redukcióját követjük nyomon, annak 340 nm-en mért abszorbancia növekedése által (3.2. ábra). Itt érdemes megjegyezni, hogy a NADP/NADPH és a NAD/NADH koenzimek redukálásának/oxidálásának nyomon követése a klinikai kémia igen kedvelt indikátorreakciója. A jövőben is számtalan esetben fogunk vele találkozni ábra - A kreatin-kináz aktivitásának meghatározása. A szérum CK aktivitás természetesen függ a fizikai aktivitástól, izomtömegtől, így a különböző nemek, korosztályok között különbség mutatkozik: férfiak esetében a referencia tartomány magasabb: U/l, mint nők esetében: U/l. Izoenzim vizsgálatok: A CK izoenzimeket aktivitásfestéssel követett elektroforézissel szokták végezni. Az izoenzim vizsgálatok jelentőségét az adja, hogy a CK-MB izoenzim nagy tömegben kizárólag a szívizomban fordul elő. Így ennek az izoenzimnek a szérumban történő megjelenése egyértelműen szívizomsérülésre, szívinfarktusra utal. Ennek jelentősége rendkívül nagy volt a szívinfarktus diagnózisa során. Ezen a helyen azonban meg kell jegyeznünk, hogy ez a szerep csökkenőben van, ugyanis az Európai Kardiológiai Szövetség irányelve szerint jelenleg a troponin a szívizom elhalás általános markere. A szívinfarktusnak léteznek alattomos néma, fájdalommal nem járó formái (pl. diabéteszes neuropátia esetén). A vizsgálat során az M formára specifikus antitesttel azt lefogták, aktivitását megszüntették, így kizárólag a B forma aktivitása érvényesült. A szérumba zavaró BB forma például agykárosodás esetén (pl. stroke) kerülhet, azonban ennek diagnosztikai és egyben zavaró hatása is csekély, mivel ilyen mértékű agykárosodásnak már szemmel látható jelei is vannak Laktát dehidrogenáz (LDH) A LDH minden sejtben megtalálható, ahol az anaerob glikolízis során képződő piruvátot redukálja laktáttá, NAD + keletkezés közben, vagy az ellentétes irányú folyamatban NADH képződés mellett a laktátot oxidálja piruváttá. A LDH egy 134 kda molekulatömegű tetramer, amelyet két különböző monomer alkot. A két különböző alegységet előfordulási helyüknek megfelelően H: heart és M: muscle betűkel jelöljük. Ezek kombinálódásával 5 különböző izoenzim jöhet létre: LDH-1: HHHH, LDH-2: HHHM, LDH-3: HHMM, LDH-4: HMMM, LDH-5: MMMM. Egy hatodik ritka, pubertást követően kimutatható izoenzim (LDH-X, LDHC) 4 X alegységet tartalmaz, illetve nagyon súlyos betegségben szenvedők szérumából lehet kimutatni a hetedik (elmésen) LDH-6- nak nevezett izoenzimet. Gyakorlatilag minden sejtünk tartalmazza kivétel nélkül a sejtek citoplazmájában. Az LDH izoenzimek eloszlása a különböző szövetek között eltérő: 45

56 Klinikai enzimológia LDH-1, LDH-2: szívizom, vese, eritrociták (vörösvértestek) LDH-3: lép, tüdő, nyirokcsomó, fehérvérsejtek LDH-4, LDH-5: máj, vázizom Diagnosztikai jelentősége: Tekintve, hogy meglehetősen széles az előfordulása, a klinikai esetek meglehetősen széles körében nő meg szérumszintje is. Így emelkedett miokardiális infarktus, hemolízis, illetve máj, vese, tüdő és izom rendellenességek esetén. A súlyos hemolízis a szívinfarktushoz hasonló LDH mintázatot mutat. Megaloblasztos anémiák az LDH-1 és LDH-2 izoenzimek jelentős emelkedésével járnak. Májbetegségekben is jelentősen megemelkedik a szérum LDH aktivitás, azonban ez elmarad az aminotranszferázok emelkedésétől. Szintén jelentős LDH szint emelkedés tapasztalható mononucleosis infectiosában. Meghatározás: A meghatározás a képződött (laktátból történő piruvát képződés esetén), vagy felhasznált (piruvátból történő laktát képződés esetén) NADH alapján történik (3.3. ábra). Elvileg, bármely irányú reakció alkalmazható a meghatározásra. Az egyes izoenzimek fagyasztásra eltérő módon érzékenyek ezért szobahőn tárolt mintából (3 napon belül) kell elvégezni a meghatározást. Hemolizált minta a vörösvértestek magas LDH tartalma miatt nem alkalmas LDH meghatározásra. Izoenzim vizsgálatok: Az LDH izoenzim vizsgálatok leggyakrabban agaróz, illetve cellulóz-acetát gélelektroforézissel történnek. Tekintve, hogy az izoenzimek hőstabilitása is igen eltérő figyelni kell, nehogy felmelegedjen a gél a folyamat közben (hűteni kell a cellát). A gélelektroforézist követően az izoenzim csíkokat aktivitásfestéssel tesszük láthatóvá. Az LDH csíkok (zónák) által generált NADH-t jellegzetes fluoreszcenciája, vagy a nitroblue-tetrazólium színes formazánná történő redukciója alapján mutatjuk ki ábra - LDH enzim aktivitásának meghatározása Aminotranszferázok Az aminotranszferázok aminosavak és 2-oxo savak egymásba történő átalakulását katalizálják egy aminocsoport átvitelével. Klinikai kémiai szempontból az aszpartát aminotranszferáznak (ASAT, AST, GOT), illetve az alanin aminotranszferáznak (ALAT, ALT, GPT) van jelentősége. Az aminotranszferáz reakciók koenzime a pirodoxál-foszfát (és az amino analóg piridoxamin-foszfát). A transzaminázok szintén igen széles körben előfordulnak szervezetünkben. Az ASAT elsősorban a májban, a szívben, a vázizmokban és a vesében, az ALAT elsősorban a májban és a vesében. Míg az ALAT kizárólag citoplazmatikus lokalizációval bír, addig az ASAT a citoplazmában és a mitokondriumban is megtalálható. A 46

57 Klinikai enzimológia két eltérő lokalizációjú homodimer izoenzim eltérő genetikai háttérrel rendelkezik. A szérum ASAT aktivitásának 5-10%-a származik a mitokondriális formából. Diagnosztikai jelentőségük: A szérum emelkedett transzamináz aktivitásának oka leggyakrabb valamilyen májat érintő elváltozás. A legtöbb májbetegség esetében az ALAT aktivitás magasabb, mint az ASAT. Az akut hepatikus nekrózissal járó megbetegedések esetében a szérum ASAT és ALAT aktivitás emelkedése megelőzi a betegség klinikai tüneteinek (mint például a sárgaság) jelentkezését. Mindkét enzimaktivitás értéke akár a felső határ 100-szorosára is megnőhet, de legtöbb esetben szeres emelkedés tapasztalható. Ilyen esetekben az aktivitások tetőzése a 7-12 napon várható, majd a 3-5 hétre visszatér a normál értékre eseménytelen felépülés esetén. A csúcsértékek nem rendelkeznek semmilyen prognosztikai értékkel. Amennyiben az ALAT érték 6 hónapnál hosszabb időn keresztül fennáll, krónikus hepatitiszről beszélhetünk. Ebben az esetben általában a referencia tartomány felső határának hétszeresénél kisebb érték várható. Acetaminofen (gyógyszer) kiváltotta transzamináz emelkedésre a rendkívül gyors lefolyás jellemző. Gyorsan magas értéket ér el és onnan viszonylag gyorsan (4-5 nap alatt) normalizálódik. Az alkoholos és virális hepatitiszen kívül a nem alkoholos zsírmáj (steatohepatitisz) állhat még gyakran az emelkedett aminotranszferáz aktivitások hátterében. Epeút elzáródások esetében annál magasabb értékeket tapasztalhatunk minél hosszabb ideje fennáll az obstrukció. A transzaminázok megemelkedését okozhatják különböző gyógyszerek (antibiotikumok, epilepszia ellenes szerek, nemszteroid gyulladásgátlók, HMG-CoA reduktáz gátló koleszterincsökkentő szerek). Ritkábban előforduló májat károsító kórképek: hemokromatózis, Wilson kór, autoimmun hepatitisz, α 1-antitripszin hiány, primer biliáris cirrhosis, epeút gyulladás ábra - Aminotranszferáz aktivitások meghatározása. A két transzamináz közül az ALAT-ot tartják májspecifikusabbnak. Szívinfarktus, progresszív izomdisztrófia, dermatomyositis esetén is megemelkedett ASAT aktivitás tapasztalható. Meghatározás: Az aminotranszferáz reakcióhoz kapcsolt specifikus dehidrogenázok segítségével történik meghatározásuk. A transzamináz aktivitás során keletkezett 2-oxo savak redukciója során hidroxil savak és NADH csökkenés következik be. Ezt a NADH csökkenést követjük nyomon az abszorbancia 340 nm-en mért csökkenésével (3.4. ábra). Az ALAT által katalizált reakcióban keletkező piruvát laktát dehidrogenáz (LDH) segítségével laktáttá alakul, miközben a NADH mennyisége arányosan csökken (3.4. ábra). Az ASAT által katalizált reakcióban keletkező α-ketoglutarát malát dehidrogenáz (MDH) segítségével maláttá alakul, miközben a NADH mennyisége arányosan csökken (3.4. ábra). Amennyiben a szubsztrát, a NADH és a segédenzimek (malát-, laktát dehidrogenáz) kellő mennyiségben jelen vannak a szűk keresztmetszetet a meghatározni kívánt ASAT és ALAT mennyisége jelenti. Az ASAT szérumban mérhető aktivitása 24 órán keresztül stabil szobahőmérsékleten tárolt minta esetében. A minták hűtve, vagy fagyasztva tárolása szükséges ennél hosszabb tárolás esetén. A transzamináz aktivitások stabilitása szérumban a következőképp alakulnak a tárolási hőmérséklet függvényében: ASAT: szobahőmérsékleten 24 óra, hűtve (2-8 ºC) 1 hét, fagyasztva (-20 ºC) 1 hónap ALAT: szobahőmérsékleten 3 nap, hűtve 1 hét, fagyasztva 1 hét ASAT referencia tartomány: 0-35 U/l. ALAT referencia tartomány férfiak számára: 0-60 U/l, nők számára: 0-40 U/l. 47

58 Klinikai enzimológia 3.6. Gamma-glutamiltranszferáz A gamma glutamiltranszferáz (GGT) a γ-glutamil csoport átvitelét katalizálja peptidekről az akceptor molekulára. A GGT aktivitás vizsgálatához szükséges szubsztrát oldatnak tartalmaznia kell a 1. γ-glutamil akceptort, 2. valamilyen aminosavat, vagy peptidet, 3. vagy vizet, ez utóbbi esetben egy egyszerű hidrolízis zajlik le. Az enzim kizárólag olyan peptideken, peptidszerű anyagokon hat, amelyek terminális (-γ-) karboxil csoporton keresztül kapcsolódó glutamátot tartalmaznak. A glicilglicin az egyik leghatékonyabb ismert akceptor molekula (3.5. ábra). A GGT a következő szövetekben fordul elő (csökkenő mennyiségi sorrendben): vese proximális tubulus, máj, pankreasz, bélrendszer. Habár az enzim intracellulárisan is előfordul, döntő részben az aminosav és peptid transzportban vesz rész a sejtmembránhoz asszociáltan. Diagnosztikai jelentősége: Habár a vesében fordul elő a legnagyobb mennyiségben, a szérumba jutó enzim elsősorban a hepatobiliáris rendszerből származik. Kimondottan érzékeny indikátora bármely máj eredetű elváltozásnak. Klinikai jelentőségét alacsony specificitása csökkenti. Az alkalikus foszfatázhoz hasonlóan, legnagyobb mértékben a májon belüli, vagy az azt követő epeút elzáródások esetében emelkedik meg szérum aktivitása (a referencia tartomány felső értékének 5-30-szorosára). A májat érintő elváltozásokon kívül megemelkedik a pankreászt érintő betegségek esetében is. Emelkedett szintje minden alkoholproblémával küzdő és más, a biotranszformációs enzimrendszert indukáló gyógyszert szedő beteg esetében ábra - A GGT meghatározása. Meghatározás: A korai GGT meghatározási módszerek L-γ-glutamil-p-nitroanilid szubsztrátot tartalmaztak, glicilglicin akceptorral. A reakció során keletkező, sárga színű p-nitroanilin 405 nm-en történő fotometrálásával követték nyomon a reakció alakulását. Az L-γ-glutamil-p-nitroanilid azonban limitált oldhatósággal bír, ezért most már ennek különböző származékait használják (3.5. ábra). A GGT meglehetősen stabil enzim, 4 C-on tárolva egy hónapig, 20 C-on tárolva pedig egy évig biztosan eltartható. GGT referencia tartomány férfiak számára: 0-55 U/l, nők számára: 0-38 U/l. Újszülöttekben a felnőtt aktivitás 6-7-szerese mérhető, amely úgy féléves korukra fokozatosan lecsökken Alkalikus foszfatáz Az alkalikus foszfatáz (ALP) a természetes és mesterséges szubsztrátok tömkelegének alkalikus hidrolízisét katalizálja. Az enzim aktivitását kétértékű ionok, mint a Mg 2+, Co 2+ és Mn 2+ fokozzák, továbbá a Zn 2+ alkotója a holoenzimnek. A foszfát, borát, oxalát és cianid ionok pedig gátlólag hatnak rá. A reakcióközeget biztosító pufferek is jelentős mértékben befolyásolhatják az enzimaktivitást. Az ALP aktivitás testünk majd minden szervében jelen van. Leginkább a sejtmembránokhoz, a sejtek felszínéhez asszociáltan található meg a vékonybél nyálkahártyán, a vese kanyarulatos csatornában, a csontokban (osteoblast), a májban és a placentában (méhlepény). Pontos élettani szerepe nem ismert feltehetően részt vesz a vékonybélben lipid felszívódásában és a csontok kalcifikációjában. Több különböző formában létezik, ezek közt vannak valós izoenzimek, amelyek eltérő gének termékei, de a csont, máj és vese izoformák ugyanazon gén terméke, de szénhidrát alkotójukban (glikozilációjukban) eltérnek. Diagnosztikai jelentősége: A szérum ALP aktivitás emelkedése igen gyakran máj és csont eredetű, így különböző máj és csontbetegségek diagnosztikájában van szerepe. 48

59 Klinikai enzimológia Máj: Bármilyen epeút elzáródással járó állapotban a máj fokozza az ALP expresszióját és az újonnan szintetizált enzimek egy része a keringésbe kerül, megnövelve az enzim aktivitását. ez a növekedés kifejezettebb extrahepatikus obstrukció esetén. Az enzimaktivitás akár a referencia tartomány felső értékének szeresét is elérheti, az obstrukció megszűntét követően normalizálódik. Máj tumorok és gyógyszerterápia szintén markáns emelkedést váltanak ki, míg fertőző májgyulladások csekélyebb mértékűt. Csont: A csontban található ALP-t az osteoblastok szintetizálják és a csontmátrix vezikulumaiban található, amelyek mintegy a sejtmembrán rügyei, lefűződései. Az enzim így gyakorlatilag a teljes csontformáció aktivitásáról ad jó, átfogó képet. A legmagasabb enzimaktivitást Paget kórban lehet mérni. Ebben az esetben az osteoblastok (fokozott aktivitásuk révén) próbálják újraépíteni a csontot, ami az osteoclastok kontrollálatlan aktivitása miatt felszívódott. Ilyenkor a referencia tartomány felső értékének szörösére is felugorhat az enzimaktivitás. Szintén magas értékek mérhetők osteogenikus csontrák esetén. A többi csontot érintő kórkép, mint a primer és szekunder hiperparatireoizmus, a D-vitamin hiány vagy a csonttörést követő, illetve a fejlődés során bekövetkező csontnövekedés jóval kisebb mértékű emelkedést idéz elő. Más esetek: A terhesség harmadik trimeszterében a placenta eredetű ALP 2-3-szoros emelkedést idézhet elő. Ismertek familiáris benignus (jóindulatú) ALP szintemelkedések is. A placenta izoenzimet számos tumor is szintetizálja. Meghatározás: A meghatározás mind az enzimaktivitás mértékére, mind az izoenzim kilétére kiterjed. A leggyakrabban a hasítatlan formában színtelen, de hasított formában sárga színű 4-nitrofenil-foszfát szubsztrátot alkalmazzák az enzimaktivitás nyomon követésére. A foszfát csoport pedig a vízre kerül (3.6. ábra). A meghatározás szérumból és heparinos plazmából végzendő, mivel a többi alvadásgátló megköti az enzim aktivitásához nélkülözhetetlen kétértékű fémionokat. Amennyiben lehetséges 4 órán belül el kell végezni a meghatározást, ha ez nem kivitelezhető a felolvasztott mintát órán keresztül szobahőmérsékleten kell hagyni a teljes aktivitás eléréséhez ábra - Az alkalifus-foszfatáz meghatározása Az ALP aktivitás életkorfüggő a legmagasabb aktivitást a növésben levő gyerekek mutatják. 5 -nukleotidáz: Az 5 -nukleotidáz (NTP) olyan foszfatáz, amely kizárólag nukleozid-5 -foszfátokat hasít. Az NTP egy glikoprotein, amely az egész szervezetünkben megtalálható. Annak ellenére, hogy rendkívül széles körben előfordul, viszonylag specifikus az epe szekrécióját befolyásoló elváltozásokra. A kevésbé specifikus ALP mellett kiegészítő vizsgálatként ezt is meg szokták határozni. Emelkedett szintje megerősíti, hogy az ALP aktivitás emelkedése máj eredetű Kolinészteráz Tulajdonképpen két különböző enzim is fut ezen a néven. 49

60 Klinikai enzimológia Az első az acetilkolinészteráz, vagy valódi kolinészteráz az eritrocitákban, a tüdőben, a lépben az idegvégződésekben és az agy szürkeállományában található. Feladata az idegvégződésekből kikerülő acetilkolin (neurotranszmitter) azonnali hidrolízise. Ez elengedhetetlen, ahhoz, hogy az idegsejt depolarizálódjon és a következő vezetési körben képes legyen újra repolarizálódni. A másik enzim az acilkolin acilhidroláz, vagy más néven pszeudo kolinészteráz (CHE) (ezen kívül még számos néven ismert) a májban, a pankreászban, a szívben az agy fehér állományában, és a szérumban fordul elő. Biológiai szerepe teljes mértékben ismeretlen. A két kolinészteráz néhány szubsztrát irányába mutatott specificitásában különbözik, azonban egymás szubsztrátjai irányában hasonlóan viselkednek. Diagnosztikai jelentősége: A CHE (pszeudokolinészteráz) szérum aktivitásának szerepe van 1. a májfunkció megítélésében, 2. az esetleges rovarírtószer mérgezés megállapításában, 3. az olyan személyek azonosításában, akik az enzim atipikus formáját hordozzák, így a műtéteknél adott izomrelaxánsok hatása elhúzódhat, ami légzési problémákhoz, halálhoz vezethet. Szintén jó információt szolgáltat a máj szintetikus kapacitásáról (30-50% csökkenés akut hepatitiszben, 50-70% máj metasztázis, vagy cirrózis esetén). Sorozatos meghatározása alkalmat ad a májbetegség nyomonkövetésére. A szerves foszforvegyületek (köztük sok rovarirtószer), mint a parathion, sarin, tetraetil pirofoszfát gátolják a CHE működését. Ezek bizonyos szint felett az idegrendszeri kolinészterázt is gátolják és halált okoznak. A szukcinil-dikolin, amelyet műtéteknél izomrelaxánsként alkalmaznak, szintén a CHE szubsztrátja. Normálisan, így pont annyi ideig tart a hatása, ameddig a műtéti beavatkozás megkívánja. Olyan betegek esetében, akik alacsony enzimaktivitással, vagy kevésbé aktív enzimformával rendelkeznek a hatása elhúzódhat és a légző izmok bénulása miatt megfulladhat a beteg. Ezért a CHE vizsgálata része a preoperatív vizsgálatoknak. Meghatározás: A legtöbb meghatározási módszer aciltiokolin-észtereket alkalmaz, mint például a butiriltiokolin (3.7. ábra). A reakció során képződött tiokolin a második lépésben ditio-nitrobenzoáttal (DTNB) reagál, amely a színes merkapto nitrobenzoát képződésével jár, így fotometriásan meghatározható (3.7. ábra) ábra - A kolin-észteráz meghatározása. Az aktivitást szérumból szokták meghatározni, amely mély hűtve évekig felhasználható. CHE referencia tartomány: U/L. Újszülöttekben a felnőtt aktivitás 50%-a mérhető, amely úgy 3-6 éves korukra fokozatosan nő 30%-kal meghaladja a felnőtt értéket, amelyen a pubertás idejére normalizálódik. Glutamát dehidrogenáz: Mitokondriális eredetű enzim. A májban, szívizomban, vesében, agyban, vázizmokban, leukocitákban fordul elő. Elsősorban kiegészítő meghatározása terjedt el, mivel aktivitása jól korrelál a máj sejtpusztulás mértékével Amiláz Az α-amiláz a poliszacharidok 1-4 glikozidos kötéseit hidrolizálja, az elágazásoknál található 1-6 kötéseket nem. Az amiláz működéséhez Ca 2+ -t igényel. Teljes aktivitásához anionok is szükségesek, a leghatásosabbak a Cl és a Br. 50

61 Klinikai enzimológia Az amiláz normális körülmények között is megtalálható a szérumban. Tekintve, hogy kis molsúlyú molekula (54-62 kda) filtrálódik és az enzimek közül egyedüliként megjelenik a vizeletben is. Legnagyobb mennyiségben, a nyálmirigyekben és a hasnyálmirigyben található, de kis mennyiségben előfordul az ondóban, a herékben, petefészkekben, petevezetékben, harántcsíkolt izomban, tüdőben, zsírszövetben. A szekrétumok közül az anyatej és a könny tartalmazza. A nyálmirigy és a pakreász eredetű enzimek izoenzimek. Diagnosztikai jelentősége: A szérum amiláz szint viszonylag alacsony és állandó szintet mutat. A nyálmirigyek és hasnyálmirigy gyulladása esetén jelentős mértékben (4-6-szorosára) megemelkedik. Epekő esetén mintegy 4- szeres emelkedés tapasztalható. Szintén emelkedik veseelégtelenségben a csökkent kiválasztás következményeképp. Meghatározás: A meghatározás mind az enzimaktivitás mértékére, mind az izoenzim kilétére kiterjed. Rövidebb glukóz egységekből álló szubsztrát, segéd és indikátorenzimek találhatók a reakcióelegyben. A tesztek gyakorlatilag minden esetben a glukóz megjelenését mutatják ki. A heparin kivételével mindegyik alvadásgátló gátolja az enzimet is, tekintve, hogy megkötik az aktivitáshoz szükséges Ca 2+ -t. Az amiláz viszonylag hosszú ideig stabil marad a minta tárolása alatt Lipáz A humán lipáz egy 48 kda moltömegű egyláncú glikoprotein. Bár kis molsúlya miatt filtrálódik, mégsem jelenik meg a vizeletben, mivel teljes mértékben reabszorbeálódik. Teljes aktivitásához az epesavas sók, illetve a kolipáz jelenléte szükséges. A lipázok a trigliceridek 1-es és 3-as pozíciójában levő zsírsavait hasítják. A 2-es pozíció rezisztens, csak 3-as pozícióba izomerizálódva bontható. A szérum lipáz meghatározásának diagnosztikai jelentőségét az akut hasnyálmirigy gyulladás kimutatása adja. Tripszin: Ezen szerin proteáz előalakja (tripszinogén) található meg normálisan a szérumban. Amennyiben az aktív, tripszin forma is megjelenik az akut hasnyálmirigy-gyulladásra utal. Kimotripszin, elasztáz: Mindkét szerin proteáz székletből történő meghatározása része a krónikus hasnyálmirigy gyulladás következtében kialakuló hasnyálmirigy elégtelenség (alacsony enzimaktivitások) diagnosztikájának. 51

62 4. fejezet - A vese laboratóriumi diagnosztikája A veseműködés laboratóriumi diagnosztikájával foglalkozó fejezettel megkezdjük a tankönyv azon fejezeteinek sorát, amelyben nagyobb hangsúlyt kap a kórélettani szemléletmód. Természetesen, ezen fejezetekben továbbra is érvényesül a patobiokémiai, kémiai tárgyalásmód is. A vese páros szervünk, 150 g-os tömegének mintegy 40%-át a benne található erek és vér adja. A vesék vérellátása és keringése igen intenzív, a teljes nyugalmi perctérfogat 20-25%-a átáramlik rajtuk. A vese három fő feladatkört is ellát: 1. A hulladékanyagok kiválasztása: habár a májban történik a nem vízoldható toxikus anyagok vízoldhatóvá tétele, azok vízoldható formái a fázis III. transzport folyamatok során (lásd a 6. fejezet) a májsejtből a véráramba kerülnek és a vesébe jutnak. A vesében filtrálódnak, specifikus transzporter hiányában nem szívódnak vissza, majd a húgyutakon keresztül kiürülnek. 2. Az extracelluláris folyadék térfogatának, összetételének fenntartása, szabályozása: Szervezetünk teljes víztartalma hozzávetőlegesen a testsúly 54%-a. Ez az érték gyerekekben magasabb, idősekben alacsonyabb. Továbbá függ a test zsírtartalmától: nőkben (~10%-kal), elhízott emberekben (~10%-kal, súlyos elhízás esetén ~20%-kal) alacsonyabb (sovány testalkatú emberekben akár ~10-kal magasabb is lehet). Az extracelluláris folyadéktér a teljes víztér 27-53%-a (mérési módszertől függően). A napi gyakorlatban 40%- kal szokás számolni. Ez az érték nőkben és idős emberekben magasabb. Az extracelluláris folyadék három fő alkotó között oszlik meg: 1. interstíciális (sejtek közötti) tér: a teljes testvíztér 28%-a, 2. a plazma (8%), és a transzcelluláris (pl. gasztrointesztinális luminális folyadék, központi idegrendszer, szem és különböző nedvesítő folyadékok) víztér (4%). Ezen a ponton érdemes áttekintenünk a különböző testfolyadékok összetételét. elektrolit Plazma (mm) Interstícium (mm) Sejt (mm) Na ,3 13 K + 4,5 4,7 140 Cl ,7 3 Ca 2+ 2,5 2,8 0,5*10 7 HCO ,5 10 P 1,2 1,3 57 Fehérje 1 0,5 2,5 A vese az extracelluláris folyadéktér térfogatát és összetételét viszonylag állandó szinten tartja. Teszi ezt a vizelet térfogatának és összetételének igen széles tartományon belüli változtatása mellett. Erre igen jó példa, hogy a vizelet proton koncentrációja hozzávetőlegesen 4 nagyságrenden belül (ph= 4-8) változhat. 1. Hormonok szintézise (endokrin funkció): A vesék a vér pontosabban a vörösvértestek képződéséhez elengedhetetlen hormont az eritropoetint (EPO), tromboxánokat, prosztaglandinokat, renint és kalcitriolt termelik. A vesék funkcionális egysége a nephron, melyből hozzávetőlegesen vesénként 1 milliót tartalmaznak. A vesekapillárisok tulajdonképpen magas nyomású szűrőként funkcionálnak. A kapillárisban áramló vér átjut a fenesztrált endothelsejteken, majd a folyadék a vese bazális membránján átszűrődve átjut a nefron epithelsejtjein. Tehát sem az endothel-, sem az epithel sejtek nem alkotnak összefüggő réteget (4.1. ábra). Így a bazális membrán az egyik oldalon a vérrel, a másik oldalon a nefron lumenével érintkezik. A glomerularis filtrátum tulajdonképpen a plazma ultraszűrlete ábra - A vese mint magas nyomású szűrő. 52

63 A vese laboratóriumi diagnosztikája A kapilláris endthelium meggátolja a sejtes elemek érpályából történő kilépését a bazális membrán pedig átjárhatatlan a nagymolekulák számára. A méret szerinti szelekció úgy működik, hogy a hemoglobin éppen átjut (64,5 kda) még az albumin pedig éppen nem jut át (68 kda) a bazális membránon. A méreten kívül a molekula töltése is szerepet játszik a szűrés folyamatában, a negatív töltésű molekulák nehezebben, a pozitív töltésű molekulák könnyebben jutnak át. A glomerulus filtrátumból gyakorlatilag az összes fehérje visszaszívódik és lebomlik a proximális kanyarulatos csatorna sejtjeiben, így a vizelettel ürített fehérje mennyisége nem haladja meg normális esetben a 150 mg/24 óra értéket. A filtráció tulajdonképpen egy passzív folyamat, amely függ: 1. a kapilláris vérnyomás és nephron lumen hidrosztatikai nyomásának különbségétől, 2. a glomerulus alapmembrán szerkezetétől, illetve 3. a glomerulusok számától. A normális glomerulus filtrációs ráta (GFR) 120 ml/perc, amely megközelítőleg 170 l/nap (24*60*120= ml/nap) filtrátumnak felel meg. Tekintve, hogy az ürített vizelet mennyisége 1-2 l/nap a bevitt és az izzadsággal (illetve más úton) eltávozott folyadék függvényében, igen jelentős mértékű visszaszívás történik a nefron további részeiben. Röviden tekintsük át a visszaszívás folyamatát. A szűrlet jelentős része már a proximális tubulusban visszaszívódik, a glükóz (Na + -glükóz kotranszporter), az aminosavak, a kálium, a bikarbonát teljes mértékben, a nátrium, mintegy 75%-ban visszaszívódik, az itt található aktív transzporterek révén (4.2. ábra). Az ellenáramlásos elv alapján kialakult hiperozmotikus viszonyok (1200 mosm) további vízvisszaszívást eredményeznek a medullában (vesevelő) (4.2. ábra) ábra - Transzportfolyamatok a vesében, a vesetubulusok működése. 53

64 A vese laboratóriumi diagnosztikája A velő hipertóniájához a gyűjtőcsatornából származó urea is hozzájárul, amely hatása malnutrició (különösen alacsony fehérje, így nitrogén bevitel esetén) következtében hiányozhat. A disztális tubulusba érkező folyadék a felszálló ágban történő nagymértékű Na + és Cl vesztés következtében hipotóniás (150 mosm) lesz. A disztális tubulusban további aldoszteron regulált Na + és vízvisszaszívás történik. Tulajdonképpen itt történik a tubuláris folyadék szervezet igényeinek megfelelő összetétel beállítása, hisz a visszaszívás jelentősebb mértékű része már a proximális tubulusban, illetve a Henle kacsban megtörtént (4.2. ábra). A Na + visszaszívás révén előálló elektrokémiai gradienst a K +, illetve a H + ürítésének elősegítésére használja fel a vese. A folyadék ezt követően bejut a gyűjtőcsatornába, amely áthalad a hipertóniás velőn. A gyűjtőcsatorna sejtjeinek membránjába vazopresszin (ADH: antidiuretikus hormon) hatására aquaporin I vízcsatornák kerülnek, amelyeken keresztül megtörténhet az ozmotikus viszonyoknak megfelelően a víz passzív visszaszívása. Ilyen aquaporin I csatornák találhatók a proximális tubulus, illetve a Henle-kacs leszálló ágának sejtmembránjában is. Vazopresszin hiányában, vagy elégtelen aquaporin működés esetén, így híg nagyobb mennyiségű (diabetes insipidus) vizelet képződik. Most már beláthatjuk, hogy a vesét érintő bármely kóros folyamat igen jelentős hatással lehet a víz-, só-, illetve hidrogénion homeosztázisra, valamint a hulladék anyagok eltávolítására A vesefunkció klinikai kémiai tesztjei A veseműködés vázlatos ismertetését követően tekintsük át, hogy milyen paramétereket, milyen kémiai módszerek segítségével határozunk meg. Tekintve, hogy a glomerulusok fő fukciója, a víz és kis molsúlyú anyagok vérből történő filtrálása, míg a nagy molsúlyú anyagok retenciója a leggyakrabban végzett tesztek a GFR-ről, illetve a glomerulus filtrációs barrierek, leggyakrabban a bazális membrán integritásáról adnak információt. 54

65 A vese laboratóriumi diagnosztikája A Glomerulus Filtrációs Ráta (GRF) meghatározása A vesék funkcionális kapacitásának legmegbízhatóbb, mérhető indikátorának a GFR-t tartják. Szintén ezt az értéket tekintik a legmegfelelőbb információnak a funkcionáló nefronok számáról. Bizonyítottan bármilyen vesefunkcióban történt elváltozás érzékeny és specifikus markere. A GFR meghatározása egy markervegyület clearance-én alapul. A clearance pedig a plazma azon térfogatát jelenti, amelyet az adott anyagtól időegység alatt a vese megtisztít. Az adott anyaggal szemben támasztott kritériumok a következők: 1. stabil plazmakoncentrációval rendelkezik, 2. élettanilag inert, 3. szabadon filtrálódik a glomeruluson keresztül, 4. nem szekretálódik, reabszorbeálódik, szintetizálódik, vagy metabolizálódik a vesében. Ha mindezen feltételek teljesülnek, akkor a glomeruluson keresztül filtrálódott anyag mennyisége megegyezik a vizeletbe kiválasztott anyag mennyiségével. Ekkor a clearance, azaz a GFR megkapható a következő képlet segítségével: (4.1) ahol U = az adott anyag vizeletben mért koncentrációja (μmol/l) V = időegység alatt kiválasztott vizeletmennyiség (ml/ perc, vagy l/nap) P = az adott anyag plazmában mért koncentrációja (μmol/l) A vese mérete és a GFR durva közelítéssel arányos a testmérettel. Éppen ezért szokásos egy átlagos testfelületre (1.73 m 2 ) vonatkoztatni azt. Lássuk, mely anyagok alkalmasak a GFR meghatározására. Exogén anyagok közül az inulint kell megemlítenünk, amely egy 5 kda körüli molekulatömeggel rendelkező fruktóz polimer. Az inulin minden egyes korábban felsorolt kritériumnak megfelel, éppen ezért az inulin clearance ideális a GFR meghatározásához, tulajdonképpen a legjobb GFR standard. A gyakorlati alkalmazása mégsem terjedt el, mivel az inulin nem szívódik fel az emésztő traktusból, folyamatos infúziós adagolása szükséges, amely igencsak megnehezíti rutin laboratóriumi alkalmazását. A gyakorlatban ezért egy másik anyag az endogén kreatinin clearance-t használják a GFR meghatározására. A kreatinin kreatinből keletkezik vízvesztéssel (4.3. ábra), moltömege mindössze 113 Da, szabadon filtrálódik a glomerulusokban, plazmakoncentrációja fordítva arányos a GFR értékével ábra - A Kreatin kreatinin átalakulás. Bár olcsón meghatározható, endogén anyag lévén nem kell a szervezetünkbe juttatni néhány korlátozó tényezővel tisztában kell lennünk: koncentrációját befolyásolja az 1. életkor, 2. a nem, 3. a fizikai aktivitás, 4. néhány gyógyszer (pl. cimetidin), 5. az izomtömeg, 6. a tápláltsági státusz, 7. a húsbevitel. Továbbá a vizelet kreatinin kicsi, de szignifikáns és változó hányada (~7-10%-a) tubuláris szekréciójából származik. Ez különösen veseelégtelenség, igen lecsökkent GFR esetén válik jelentőssé, zavaróvá. 55

66 A vese laboratóriumi diagnosztikája A kreatinin clearance meghatározásának pontatlanságát tovább fokozza, különösen járóbetegek esetén a vizeletgyűjtés bizonytalansága. A gyűjtött vizelet mennyiségének és minőségének problémájával már foglalkoztunk az 1. fejezetben, így itt csak vissza szeretnénk utalni arra. Még megbízható beteg esetében is 10% körül mozog a variációs koefficiens, egy átlag beteg esetében ez ennek 2-3-szorosa is lehet. Fontos megemlítenünk, hogy a GFR változik a korral. 40 éves életkor felett hozzávetőlegesen 1ml/min/1.73m 2 értékkel csökken évente, amely csökkenés 65 éves életkor felett gyorsul. Mindezen pontatlanságok és kényelmetlenségek miatt, gyakran a vesefunkció kevésbé érzékeny indikátorát, a plazma kreatinint szokták csak meghatározni. Sajnos a plazma kreatinin szint egész jelentős vesefunkció romlás következtében emelkedik csak a referenciatartomány felső értéke fölé (4.4. ábra). Nagyon kevéssé érzékeny vesefunkciós teszt. Így önmagában nem alkalmas a vesefunkció megítélésére. Tekintve, hogy a kreatinin, az izomban található kreatin és kreatin-foszfát bomlásterméke az izomtömeg jelentős mértékben befolyásolja vérszintjét. A húsfogyasztás jelentős mértékben emeli. Ezért érdemes az éhgyomri vérvételre odafigyelni. Természetesen a kreatininszint is életkorfüggő, amelyet figyelembe veszünk a referencia tartomány megállapításánál is. A kreatin meghatározása: Két módszert érdemes megemlítenünk. Az első egy igen régen, 1886-ban publikált, de a közelmúltig alkalmazott eljárás a Jaffé módszer. Ennek lényege, hogy a kreatinin lúgos közegben pikrát ionokkal egy jól mérhető vöröses terméket képez. A módszer hátránya, hogy nem túl specifikus. A kreatinin mellett egy sor más anyag (pl. glükóz, karbamid) is adja a reakciót, szerencsére kisebb mértékben és jóval lassabban. Ezért, ahol még alkalmazzák, a kinetikus mérést részesítik előnyben, mivel ez nagyobb specificitást mutat és jól adaptálható a klinikai kémiai automatákra ábra - a kreatinin clearance és a plazma kreatinin szint között fennálló kapcsolat. 56

67 A vese laboratóriumi diagnosztikája A közelmúltban egyre jobban elterjedt az úgy nevezett szarkozin oxidázos kreatinin meghatározás, melynek lényege, hogy a kreatinint egy bakteriális kreatináz enzimmel szarkozinná és karbamiddá bontják, majd a szarkozint szarkozin oxidázzal oxidálják glicinné és formaldehiddé (4.5. ábra). A reakció sztöchiometrikus arányban keletkezett mellékterméke a hidrogén-peroxid, amelyet vízzé és atomos oxigénné bontunk peroxi-dáz enzimmel. Az atomos oxigént az egyik legáltalánosabb indikátorreakcióban a Trinder reakcióban 4- aminofenazon és egy fenolszármazék jelenlétében elreagáltatjuk és az így keletkező színes kininoimin vegyületet fotometriásan meghatározzuk (4.6. ábra) Plazma urea Az urea (karbamid) elsősorban a májban keletkezik az aminosavak lebontásakor, az ornitin ciklus során. Vizeletbe történő kiválasztása a nitrogénürítés elsődleges módja. A glomerulusokban filtrálódik, de passzív tubuláris reabszorpciója egész jelentős mértékű lehet. Mind a mai napig használják a vese glumeruláris funkciójának megállapítására, de meg kell jegyeznünk, hogy a plazma kreatinin szint jobban korrelál azzal. A plazma karbamid szintjét a táplálék fehérjetartalma igen jelentős mértékben befolyásolja. A plazma karbamid szintjének emelkedését azotémiának nevezzük, amely csak akkor alakul ki, ha a kreatinin clearance értéke már ml/min alá csökken ábra - A kreatinin meghatározása szarkozin-oxidáz segítségével ábra - A Trinder-reakció. A karbamid meghatározása: A karbamid ureázos bontása során keletkező ammónium ionokat α- ketoglutaráttal reagáltatjuk glutamát dehidrogenáz és NADPH jelenlétében. A reakció során glutamát és NADP + keletkezik. A reakciót a NADPH fogyás 340 nm-en történő meghatározásával követjük nyomon (4.7. ábra). 57

68 A vese laboratóriumi diagnosztikája Cisztatin C A cisztatin C egy kis molsúlyú (12.8 kda) fehérje, amelyet minden sejtmaggal rendelkező sejt termel. Fiziológiai szerepe a cisztein proteázok gátlása. Kis molsúlya és magas izoelektromos pontja (pi=9.2) révén szabadon filtrálódik, plazma szintjét nem befolyásolja az izomtömeg, a nemi hovatartozás, vagy a táplálkozás. Eliminációjának kizárólag egyetlen ismert útja a glomerulusokon keresztüli filtrációja. Mindezen előnyös tulajdonságai révén kitűnően alkalmas a GFR pontos meghatározására. Különösen előnyös kis, vagy közepes mértékű vesekárosodások detektálására. A módszer egyedüli hátulütője magasabb költsége ábra - Az urea enzimes meghatározása Glomeruláris permeabilitás, fehérje ürítés A glomerulusok mint szelektív szűrők működnek. A 1. fenesztrált endotél réteg, 2. a negatívan töltött proteoglikánokban gazdag bazális membrán és 3. a nagymértékben specializálódott epitel sejtek egy olyan szűrőt alkotnak, amelyen a makromolekulák 1. méret, 2. töltés és 3. alakfüggő módon juthatnak át. Mindezek eredményeként az albuminnál nagyobb méretű (66 kda, átmérő 3.5 nm) fehérjéket a glomerulus visszatartja, azonban számos kisméretű fehérje visszatartása is bekövetkezik. A fehérjeürítés megnövekedhet és proteinuriát (fehérjevizelés) okozhat, ennek három féle eredete lehet: glomeruláris, túlterheléses és tubuláris. Ahogy azt már korábban megjegyeztük a normális fehérjeürítés 150 mg/24 h. Ennek durván felét az albumin adja, a másik felét kisebb, illetve a tubulusok által kiválasztott (többnyire Tamm-Horsfall fehérje) fehérjék. A laboratóriumok által fehérje meghatározásra használt tesztcsíkok általában 300 mg/24 h fehérjeürítésnél szólalnak meg. Az e feletti fehérjeürítés általában patológiás, azonban kivételek akadnak, ilyen például a láz, a testmozgás, vagy a testhelyzet (ortosztatikus) miatt megnövekedett fehérjeürítés. Ez utóbbit úgy lehet kiszűrni, hogy a reggeli (fekvést követő) vizeletből hiányzik. Egyre inkább elfogadottá válik az a szemlélet, hogy a proteinuria nemcsak a következménye, hanem kimondottan hozzájárul a vesebetegség progressziójához. A tubulusokban normálisnál nagyobb mennyiségben felgyülemlő fehérje gyulladásos reakciókat indíthat el, ami hozzájárulhat az interstíciális szerkezeti elváltozásokhoz és tovább rontja a már fennálló vesebetegséget A vese megbetegedései A fejezet elején szeretnénk tisztázni, hogy jelen tankönyv nem egy belgyógyászat tankönyv így inkább csak felvillantani szeretnénk a lehetséges megbetegedéseket, amely révén könnyebben megérthető a mért klinikai paraméterek megváltozása, nem célunk a betegségek részletes tárgyalása. Manapság egyre inkább kiszorul a veseműködés zavarainak akut és krónikus klasszifikációja, de mivel még számos esetben alkalmazzák, röviden kitérünk rá Akut veseelégtelenség 58

69 A vese laboratóriumi diagnosztikája A vese kiválasztó funkciója óráról órára romlik, azonban visszafordítható, ha a beteg túléli az akut fázist. Tekintve, hogy rendkívül gyorsan fejlődik ki, gyors elektrolit, sav-bázis, és folyadék homeosztázis összeomlással jár együtt, amely gyakran nehezen kontrollálható. Gyakorlatilag a kiváltó októl függetlenül anuriával, vagy oliguriával (<400 ml/nap vizelet), illetve tubuláris diszfunkcióra utaló más abnormalitásokkal jár. Amennyiben a beteg túléli, a felépülése napokon, heteken a kiváltó ok megszűntét követően bekövetkezik. A biokémiai tesztek közül a vesefunkció gyors kiesésére utal a gyorsan megugró urea, kreatinin koncentráció, illetve a súlyos, életet veszélyeztető metabolikus zavarok, mint a hiperkalémia (K + ) és a metabolikus acidózis (H + ). A kezelés során, amelynek mindenképpen része a dialízis ezek rendkívül gyors megszüntetésére kell koncentrálni. A felépülési szakasz alatt az elektrolit és folyadék státusz monitorozása miatt a labor szerepe kritikus. A felépülési időszak általában egy poliuriás (sok vizelet) szakasza kezdődik, mivel a glomerulus funkció korábban visszatér, mint a tubuláris. Ennek további következménye a jelentős elektrolit vesztés (K +, PO 4 3 ) és az acidozis. A kiváltó okok alapján az akut veseelégtelenség 3 alcsoportját különböztethetjük meg: 1. prerenális (vese vérátáramlásának csökkenése), 2. intrinsic (a vese belső károsodása), illetve 3. posztrenális (húgyutak obstrukciója). A prerenális akut veseelégtelenséget valamilyen a vesét is érintő keringési rendellenesség okozza. Ilyen lehet 1. a súlyos vérveszteség, 2. az égés, 3. a folyadékveszteség, 4. a szívelégtelenség, 5. a hipotenzió. A lecsökkent vese vérátáramlás vazokonstrikciót és a renin-angiotenzin-aldoszteron rendszer aktiválását idézi elő, amely révén a GFR lecsökken. Amennyiben nem áll helyre rövid időn belül a vese vérátáramlása az akut prerenális veseelégtelenség intrinszik veseelégtelenség kialakulását vonja maga után. Adódhat a kérdés, hogy miért csökken le a kiválasztott vizelet mennyisége (anuria, oliguria)? A hipovolémia, hipotenzió miatt a vese igyekszik folyadékot (vért) menteni, ezért aktiválódik a renin-angiotenzin-aldoszteron rendszer, illetve vazopresszin szekréció indul be. Ezen hatások eredőjeként fokozódik a Na + és víz visszaszívás, aminek eredménye koncentrált, kis mennyiségű és alacsony Na+ koncentrációjú vizelet lesz. A csökkenő GFR eredményeképpen pedig megnő a plazmakreatinin és urea szint. A csökkent H + és K + kiválasztás pedig acidózisban, illetve hiperkalémiában nyilvánul meg. Az intrinsic akut veseelégtelenségnek számos kiváltó oka lehet, de leggyakrabban különböző nefrotoxinok (pl. gyógyszerek, mint az aminoglikozidok és a nem szteroid gyulladás gátlók) és veseisémia áll a hátterében. Mindkettő tubuláris nekrózist idéz elő. Gyakran a GFR a keringés helyreállása után sem normalizálódik. Ennek oka lehet vazoaktív anyagok intrarenális felszabadulása, illetve a tubuluslumen elzáródása törmelék, cilinder, interstíciális ödéma következtében. A postrenalis veseelégtelenség hátterében a vizeletelfolyás elzáródása következtében kialakuló hidrosztatikus nyomás emelkedése áll, amely másodlagos vesetubulus károsodásokat okoz. A vesekárosodás reverzibilitása attól függ, hogy milyen hosszan áll fenn az obstrukció Krónikus vesebetegség A krónikus vesebetegségek körébe sorolnak minden olyan vesebetegséget, amelyek esetében a GFR értéke 60 ml/min/1.73m 2 alácsökken 3 hónapnál hosszabb időre. A krónikus veseelégtelenség hátterében a leggyakrabban 1. a diabetes mellitus, 2. a hipertónia, 3. a glomerulonephritis, 4. policisztás vese, 5. a pyelonephritis áll. A betegség észlelésétől a végstádiumig eltelt idő hetektől, évekig változhat. Sajnálatos tény, hogy a vesefunkció romlása megállíthatatlan, legfeljebb a romlás mértéke befolyásolható. A romlás mértéke általunk nem befolyásolható faktoroktól, mint 1. az életkor, 2. nem, 3. faji hovatartozás, 4. a vesefunkció a diagnóziskor és általunk befolyásolható faktoroktól, mint 1. a proteinuria, 2. vérnyomás, 3. dohányzás függ. A vérnyomás és a proteinuria csökkentése kimondottan kedvezően hat a vesebetegség romlására. A krónikus veseelégtelenség miatt számos komplikáció alakulhat ki, mint például kardiovaszkuláris betegségek, csont betegségek és a vérszegénység. A krónikus veseelégtelenség klinikai kémiai tünetei a kiváltó októl függetlenül igen hasonlóak: 1. (4 l/nap alatti) poliuria, 2. koncentráló, hígító funkció romlása (nikturia), 3. a Na + egyensúly GFR = 20 ml/min értékig megmarad általában, 4. hiperkalémia, 5. acidozis hajlam, 6. csökkent foszfát és ammónia kiválasztás Urémia szindróma Az urémia szindróma egy olyan tünet együttes, amelynek hátterében a vesefunkció olyan mértékű leromlása áll, hogy az képtelen már kielégítő módon fenntartani a kiválasztó, (folyadék, elektrolit háztartás) szabályozó és 59

70 A vese laboratóriumi diagnosztikája endokrin funkcióit. Ezt tartják a veseelégtelenség terminális stációjának. Urémia szindróma esetén legalább 90 olyan anyagról számoltak be, amelyek, kiválasztásuk hiányában, feldúsulnak a plazmában. Példaképp néhányat felsorolunk: karbamid, kreatinin, húgysav, cianát, poliolok, fenolszármazékok, cisztatin C, IL-6, TNF-α stb. Ezek jelentős része toxikus. Mindezek előidézik az urémia klasszikus tüneteit: fáradékonyság, gyengeség, étvágytalanság, hányinger, hányás, izomtömeg vesztés, remegés, abnormális mentális funkciók, gyakori, felszínes lélegzés, metabolikus acidózis. A szindróma kezeletlen esetben eszméletvesztéshez, kómához, majd halálhoz vezet. A kezelés dialízis és vesetranszplantáció lehet. A plazma összetétele igen érzékenyen reagál az 1. étrendre, 2. a hidratáltsági fokra, 3. a gasztrointesztinális vérzésre, 4. hányásra, 5. hasmenésre, 6. gyógyszeres kezelésre. A szindróma diagnosztikai kritériuma 15 ml/min alatti GFR érték. Gyakorlatilag ezen érték alatt vesepótló kezelésre szorul a beteg. A korábban, a krónikus veseelégtelenségnél, felsorolt klinikai kémia paraméterek további romlása is bekövetkezik. Ezeken kívül a romló endokrin funkciók miatt lecsökken az eritropoetin és a kalcitriol szintézise, amely következményes anémiában és osteomaláciában nyilvánul meg. A vérnyomás elégtelen szabályozása pedig általában hipertenzióhoz vezet Vesekövek A nyugati lakosság mintegy 5-10%-nak 70 éves életkora előtt legalább egy veseköve képződik és a vesekőképződés valószínűsége növekvő tendenciát mutat. Mind férfiak, mind nők esetében az első vesekő képződése egyre fiatalabb életkorban bekövetkezik. A vesekőképződést táplálkozási és környezeti faktorokra szokták visszavezetni, azonban genetikai és anatómiai abnormalitások is állhatnak a hátterében. Kövek kialakulhatnak a vese gyűjtőcsatornájában, az uréterben, illetve a húgyhólyagban. A kő vándorlása rendkívüli fájdalommal jár, amit vese kólikának neveznek és 15 perctől néhány órán keresztül is eltarthat, gyakran hányingerrel és hányással jár együtt. A kövek leggyakrabban kalcium-oxalátból (foszfáttal, vagy anélkül) (67%-os előfordulási valószínűség), magnézium-ammónium-foszfátból (12%), kalcium-foszfátból (8%), urátból (8%), cisztinből (1-2%) illetve ezek keverékéből (2-3%) állnak. Ezek a rendkívül alacsony oldhatósággal rendelkező vegyületek egy szerves mátrixba kristályosodnak. 60

71 5. fejezet - Vizeletvizsgálat A vizeletvizsgálatokkal kapcsolatos fejezet egyrészről a vesefunkciók vizsgálatával kapcsolatos fejezet folytatása, másrészről több attól, mivel látni fogjuk, hogy a vizeletbe kerülő anyagok a rendellenességek igen széles körére (más szervek diszfunkciójára is) utalhatnak. Ezért úgy döntöttünk, hogy megkülönböztetjük a többi testfolyadéktól és külön fejezetben foglalkozunk vele ábra - Vizelet tesztcsík több reagenspárnával. 61

72 Vizeletvizsgálat A vizeletvizsgálat tipikusan jó szűrővizsgálati módszer, mivel 1. a mintavétel nem invazív, 2. a betegek (vagy talán jobb kifejezés a vizsgálandó emberek) igen széles köre bevonható, 3 elvégzése nem igényel mélyebb laboratóriumi szaktudást. A leggyakrabban mégis a központi laboratórium feladatkörébe tartozik, mivel így összevonhatók a már komoly szaktudást és gyakorlatot igénylő, rendkívül informatív vizeletüledék vizsgálattal. 62

73 Vizeletvizsgálat Természetesen a vizeletvizsgálat során számos hátránnyal és korláttal is szembesülnünk kell. Ahogy azt a vesefunkció vizsgálatával foglalkozó fejezetben már említettük a vese úgy biztosítja az extracelluláris folyadéktérfogat és összetétel állandóságát, hogy a vizelet térfogatát és összetételét meglehetősen tág határok között változtatja. Így meglehetősen nagy különbség lehet a vizelet mennyiségében, illetve a vizeletben oldott anyagok koncentrációjában. Ezt a problémát áthidalhatjuk, úgy hogy csak minőségi analízist végzünk, csak azzal foglalkozunk, hogy az adott analit jelen van-e a vizeletben, vagy sem. Illetve megoldás lehet, hogy a vizelet térfogatától független viszonyítási alapot keresünk. Mindenesetre a néhány szemikvantitatív vizeletvizsgálat, amely a vizeletben megjelenő kóros analitek kimutatására irányul az általános betegvizsgálat részét képezi. További hátrányt jelent a nagyszámú minta gyűjtése, kezelése. Ez ahhoz vezethet, hogy a laboratóriumba érkező minta nem friss, emiatt vizsgálhatósága korlátokba ütközhet. Az úgy nevezett kémcsőpróbákat gyakorlatilag már nem alkalmazzák a laboratóriumok, leggyakrabban analitek (pl. glükóz, bilirubin, urobilinogén, ketontestek, nitrit, vér/hemoglobin, fehérje, aszkorbinsav) kimutatására kizárólag tesztcsíkokat alkalmaznak. A tesztcsíkok vékony műanyagcsíkra felragasztott szűrőpapír, üvegrost párnácskákból állnak, amelyekben a megfelelő reagensek megtalálhatóak (5.1. ábra). A csíkot a vizeletbe mártjuk, majd a vizelet feleslegét az edény peremén lehúzzák. Itt gondosan figyelni kell arra, hogy a csíkot ne tartsuk huzamosabb ideig a vizeletben, mert ez esetben a reagensek kioldódhatnak és az egyébként intenzív szín gyengülhet, a reakció csak korlátozott mértékben, vagy egyáltalán nem játszódik le. A kiértékelés szemmel történik a tesztcsík dobozára ragasztott színskálához viszonyítva. A reakció következtében kialakult szín igen gyakran nem tartós, így a kiértékelést néhány percen belül el kell végezni ábra - Vizelet tesztcsík leolvasása remissziós fotométerrel. A tesztcsíkok egy részét remissziós fotométerrel (5.2. ábra) is kiértékelhetjük, sőt ezeket a fotométereket gyakran automatává építik ki. Ez esetben ezen szemikvantitatív vizsgálatok pontossága megközelítheti a mennyiségi analitikai meghatározások pontosságát. Ehhez szükséges a leíratok pontos betartása, a pontos inkubációs idő (a vizelettel nedvesítés és a leolvasás között eltelt idő) betartása. 63

74 Vizeletvizsgálat Szintén fontos elem, hogy a vizelet minél gyorsabban, a minta megromlása, további változása nélkül analízisre kerüljön. A tesztcsíkok reagens párnái igen érzékenyek a nedvességre, így a tároló kupakban nedvességmegkötő szilikagél található, ügyelni kell a gyors és tökéletes zárásra használatukat követően. A többféle analit meghatározására szolgáló több reagens mezős tesztcsíkok különböző reagens mezői nem egy időben inaktiválódnak a helytelen, vagy hosszú (lejárati időn túli) tárolás esetén. Természetesen ezen szemikvantitatív vizeletvizsgálatok minőségét is ellenőrizzük megfelelő kereskedelmi forgalomban kapható, liofilizált kontroll vizeletkészítmények segítségével. Az általános megfontolásokat követően lássuk a legfontosabb vizeletből meghatározott analitek sorát Vizeletcukor Ez a gyakorlatban a vizelet glükóz tartalmának meghatározását jelenti. A glükóz a vese glomerulusokban filtrálódik, majd a proximális tubulusban teljes mértékben visszaszívódik, így normális esetben a vizeletben nincs jelen. Vizeletben történő megjelenésének legvalószínűbb oka a magas vércukorszint. Az emelkedő vércukorszinttel a proximális tubulus glükóz transzporterei is telítődnek és a telítési koncentráció felett már nem képesek visszaszívni (transzportálni a glükózt). Ekkor az megjelenik a vizeletben. Ez a telítés 9-10 mm-es vércukor koncentráció esetén következik be. Nagyon nagy mennyiségű gyorsan felszívódó szénhidrát (elsősorban monoszacharid, glükóz) fogyasztását követően ez fiziológiásan is bekövetkezhet, de leggyakrabban cukorbetegségre (diabetes mellitusra) utal. Amennyiben tehát a vizeletben glükózt találunk, a következő lépés mindenképpen a plazma glükóz koncentrációjának meghatározása kell, hogy legyen. A glükóz vizeletben történő megjelenése (glükózuria) előfordulhat normális plazma glükózkoncentráció esetén is. Ennek oka lehet a proximális tubulus glükóz transzportereinek örökletes, vagy szerzett defektusa (renális glükózuria) ábra - Vizeletcukor meghatározása glükóz-oxidáz, peroxidáz kálium-jodid próbával. 64

75 Vizeletvizsgálat Meghatározás: A tesztcsíkok glükóz párnácskái glükóz-oxidáz, peroxidáz enzimeket és kálium-jodidot tartalmaznak. Amennyiben a vizelet glükózt tartalmaz a glükóz oxidáz azt glükonsavvá oxidálja. A reakció sztöchiometrikus arányban keletkező mellékterméke a hidrogén-peroxid, amelyet a reagens párna peroxidáz tartalma atomos oxigénre és vízre bontja. Az így képződött atomos oxigén a jodidot (KI) jóddá oxidálja. A káliumjodid jelenlétében a képződött jód oldódik a vizes közegben és a reagens párna elszíneződését okozza (5.3. ábra). A tesztcsík viszonylag széles határok között alkalmas a vizelet glükóz tartalmának szemikvantitatív meghatározására. Igen gyakran a glükóz meghatározásra készült tesztcsíkok tartalmaznak aszkorbát reagens mezőt is, mivel a nagymennyiségben fogyasztott C-vitamin, a vese aszkorbát visszaszívási küszöbét meghaladva (a glükózhoz hasonlatosan) a vizeletbe kerülhet és mint antioxidáns a hidrogén-peroxidot, atomos oxigént megköti, ezáltal gátolja a fenti reakció lezajlását Ketontestek a vizeletben A ketontestek közé soroljuk az acetoacetátot, a β-hidroxi-butirátot. Az acetoacetát egy része spontán módon acetonná dekarboxilálódik. Az aceton jellegzetes szaga miatt, a beteg aceton szagú lehelete révén igen könnyen, akár laboratóriumi háttér nélkül is, diagnosztizálható a ketoacidózis. Normális esetben a plazma mindössze μm-os acetoacetát és β-hidroxi butirát koncentrációval jellemezhető. Éhezés során ez 3-4 mm-ra emelkedik, diabetes mellitus esetén pedig elérheti akár a mm-es plazmakoncentrációt is (a részletes reakciómechanizmust a cukorbetegséggel foglalkozó fejezetben ismertetjük). Jó vízoldhatóságuk miatt, magas plazma ketontest koncentráció esetén a ketontestek megjelennek a vizeletben is. A vizeletbe mind az acetoacetát, mind a β-hidroxi butirát bekerül, arányuk viszonylag állandó 75-80% acetoacetát, 20-25% β-hidroxi butirát. A laboratóriumban leggyakrabban alkalmazott módszerrel csak az acetoacetát és a belőle dekarboxilációval keletkező aceton mutatható ki, -hidroxi butirát arány miatt ez nem jelent gondot. (Ez alól kivételt képez a diabeteses betegek ketoacidózisa, ahol az arányok épp fordítottak: 78% hidroxi-butirát, 20% acetoacetát, 2% aceton, ami miatt kialakul az a paradoxon, hogy a beteg kezelésével a ketózis látszólag romlik, mert a hidroxi-butirát acetoacetáttá konvertálódik.) 5.4. ábra - Vizelet ketontest meghatározás Meghatározás: A reagens párna nátrium-nitropruszidot (dinátrium-pentaciano-nitrozil-ferrát(iii)) és dinátriumhidrogénfoszfátot tartalmaz. Utóbbi biztosítja az enyhén lúgos ph-t, amelyen a nátrium-nitropruszid színes (ibolyásbarna) terméket képez az acetoacetáttal és az acetonnal (5.4. ábra) Vizelet bilirubin A bilirubin, a hem lebontási terméke, amelynek biotranszformációjával, szervezetből történő kiürülésével részletesen a máj funkciós fejezetben foglalkozunk. Most röviden csak annyit jegyeznénk meg, hogy a bilirubin hidrofób sajátságú vegyület, a keringésben albuminhoz kötődve szállítódik, mivel az albumin sem filtrálódik, így a hidrofób sajátságú (nem konjugált) bilirubin sem kerül a vizeletbe. A hidrofób sajátságú vegyületet a máj felveszi, majd itt UDP-glukuronsavval konjugálódik, így vízoldható lesz. A vízoldhatóvá tett bilirubin az epébe ürül, normális esetben nem jelenik meg, legfeljebb csak igen kis mennyiségben a keringésben, majd a vizeletben. A vizeletben megjelenő (konjugált) bilirubin annak a jele, hogy annak szintje a keringésben μm fölé emelkedett. Ennek igen gyakori oka az epeút elzáródása. A vizelettesztek 7-8 μm-es (konjugált) vizelet bilirubin koncentráció fölött válnak pozitívvá. Meghatározása: A bilirubin jelenléte szemmel is jól látható, a vizeletet sárga-vöröses sárga színűre színezi. Ezen kívül feltűnő lehet intenzív habosodása, amelyen nem a bilirubin, hanem az epeút elzáródással szintén a keringésbe, majd a vizeletbe kerülő detergens hatású epesavak okoznak. A vizelet bilirubin meghatározása tesztcsíkokkal történik. A tesztcsík bilirubin párnácskája valamilyen diazóniumsót (pl. 2,6-diklór-benzoldiazónium-tetra-fuoroborát) tartalmaz, amely elszíneződés kíséretében diazotál-ja a bilirubint (5.5. ábra) ábra - Vizelet bilirubin meghatározás. 65

76 Vizeletvizsgálat 5.4. Urobilinogén Az urobilinogén az epével a bélcsatornába kerülő konjugált bilirubinből keletkezik. A vizelet urobilinogén mennyisége a bilirubin enterohepatikus körforgásának mértékét tükrözi. A vizelet urobilinogén tartalmának kimutatásakor, a hozzá hasonlóan, a kimutatásra szolgáló reagenssel reagáló, szintén epefesték mezobilinogén és szterkobilinogén is kimutatásra kerül. Kis mennyiségű urobilinogént a vizelet fiziológiásan is tartalmaz, tehát az abszolút negatívvá váló urobilinogén a bilirubin enterohepatikus körforgásának hiányára (leggyakrabban epeút elzáródásra) utal. Fokozott enterohepatikus bilirubin körforgás esetén az urobilinogén (és társainak) mennyisége is megnő a vizeletben a reakció színintenzitása is fokozódik. Ilyen emelkedett UBG kiválasztás tapasztalható például hemolítikus ikterusz, hepatitisz esetén. Meghatározása: A tesztcsíkok UBG párnácskája az UBG-re specifikus diazóniumsót (pl. 4-metoxibenzoldiazónium-tetrafluoroborátot) tartalmaz. A bilirubinhoz hasonlóan a keletkező színes vegyület indikálja a reakció lezajlását, az UBG jelenlétével arányos szín kifejlődését. Fontos megjegyeznünk, hogy a vizelet UBG szintje cirkadián ingadozást mutat, melynek maximuma délután 2-4 óra között van. Állás közben a légköri oxigén hatására urobilinné, illetve szterkobilinné oxidálódnak a bilinogének, amelyek már kisebb intenzitással adják a színreakciót, így a vizsgálatot célszerű friss vizeletből végezni Vizelet fehérje Ahogy azt korábban a vesefunkcióval foglalkozó fejezetben említettük a vizelet mindig tartalmaz kis mennyiségű fehérjét. A vizelettel ürített fehérje mennyisége normálisan nem haladja meg a 150mg/24h értéket. Az e feletti fehérjeürítés kórosnak tekintendő. A tesztcsíkok kimutatási határa 0.1 g/l-es koncentráció körül van. A gyakorlatban különösen nagy figyelmet kell fordítani a diabetes mellitushoz, a hipertóniához és az autoimmun folyamathoz társuló mikroalbuminuriára. Meghatározás: A tesztcsíkok fehérje reagens párnája valamilyen savas kémhatású puffert és tetrabrómfenolkék indikátort tartalmaznak. A vizelettel történő érintkezéskor az indikátor gyakorlatilag teljes mértékben nemdisszociált formában fordul elő és az erre jellemző sárga színt mutatja. Amennyiben a vizelet fehérjét tartalmaz, akkor azok savas ph-n (ez a savas puffer oka) kvaterner ( NH 3+ ) formában található amino csoportjaival reagál, disszociál és megjelenik a disszociált formára jellemző kék szín (ez a sárga háttér előtt zöldnek látszik) (5.6. ábra). A tesztcsík elsősorban albuminra érzékeny és számos vegyület, például a kvaterner ammónium ionokat tartalmazó fertőtlenítőszerek zavarják. Tekintve, hogy ezen meghatározás is szemikvantitatív, a diabéteszes nefropátia nyomon követésére az albumin kvantitatív meghatározása vizeletből (albuminuria) megfelelőbb ábra - Vizelet fehérje meghatározás Vizelet ph 66

77 Vizeletvizsgálat A vese az extracelluláris folyadéktér térfogatát és összetételét viszonylag állandó szinten tartja. Ez alól az állandó ph biztosítása sem kivétel. Ennek, következménye, hogy a vizelet összetétele, így a vizelet ph értéke is igen széles tartományon belül változhat (ph ). A vizelet ph-jára komoly hatást gyakorol a táplálkozás, nagyobb mértékű húsfogyasztás a savas, a vegetáriánus életmód pedig a lúgos irányba tolja el. Meghatározás: a teszt csíkok ph reagens mezője univerzál indikátorpapír tulajdonképpen, általában metilvöröst és bróm-timolkék indikátorokat tartalmaz. Figyelembe kell venni, hogy a vizelet ph meghatározását különböző gyógyszerek, illetve a vizeletbe kerülő nagyobb mennyiségű fehérje zavarja, valamint az állás során jelentős mértékben változhat Vizelet vér/hemoglobin A vizeletüledék vizsgálat helyettesítheti, mivel az pontosabb képet ad a vizeletbe került vérsejtekről (és baktériumokról) mint a tesztcsíkok tájékoztató jellegű eredményei. Kimutatásuk: A tesztcsíkok vér/hemoglobin párnácskái valamilyen szerves peroxidot, leggyakrabban kumolhidroperoxidot, illetve nagy kapacitású puffert (pl. citromsav-citrát) és egy redox indikátorfestéket tartalmaznak. A hemoglobin pszeudo peroxidáz aktivitása révén a tesztcsík vizeletbe mártásakor az ott levő szabad hemoglobin, vagy a vörösvértestek felbomlása révén oda kerülő hemoglobin a szerves peroxidot atomos oxigénre és vízre bontja. A felszabaduló atomos oxigén a csíkban található színtelen aromás redoxindikátort oxidálja, az oxidált forma színes lévén a párna elszíneződését okozza (5.7. ábra). Az egyenletes elszíneződés hemoglobin, a pöttyök kialakulása vörösvértest jelenlétére utal ábra - Vizelet vér (hemoglobin) kimutatása A vizeletbe került fehérvérsejtek kimutatása a leukociták észteráz aktivitásán alapul. A reagens párna a szubsztátot, naftol AS-D klóracetátot és egy stabilis diazóniumsót (2-klór-4-benzamido-5-metil-benzil)-benzoldiazónium-kloridot tartalmaznak. A tesztcsíkot a vizeletbe mártva, amennyiben a vizelet leukocitákat tartalmaz, annak észteráz aktivitása a szubsztrátban található észterkötést hidrolizálja, a szabaddá váló naftolvegyület pedig a diazóniumsóval egy vöröses színű terméket képez. A vizeletben lévő leukociták jelenléte valamilyen bakteriális húgyúti fertőzésre utal. Ez megerősíthető a vizelet nitrittartalmának vizsgálatával. A vizelet ugyanis nitritet nem, csak nitrátot tartalmaz. A vizeletben lévő baktériumok a nitrátot nitritté alakítják. Így tehát a nitrit vizeletben történő megjelenése bakteriális fertőzésre utal. A nitrit párnácska Griess-Ilosvay reagenst tartalmaz. A reakció két lépésből áll, az első a szulfanilsav diazotálása a savanyítás hatására keletkező salétromossavval, a második az így keletkezett diazóniumsó kapcsolása az α-naftilaminnal vörös diazofestékké: NH 2-Benzol-SO 3H + NH 2-Naftalin + NO 2 + H + HSO 3-Benzol-N=N-Naftalin-NH 2 + 2H 2O 67

78 Vizeletvizsgálat Itt fontos megjegyeznünk, hogy a Gram pozitív baktériumok nem alakítják át a nitrátot nitritté, viszont, ezek is okoznak húgyúti fertőzést (pl. S. saprophyticus), tehát negatív eredmény esetén sem zárható ki a bakteriális fertőzés. Akár pozitív, akár negatív a nitrit, leukocitáknak lenniük kell a vizeletben infekció kapcsán Vizelet sűrűség Az egyetlen vizsgált fizikai paraméter a vizeletvizsgálatok közül. Elsősorban a vesék által kiválasztott víz mennyisége határozza meg. Amennyiben a vizeletben normálisan jelenlevő sókon és nitrogéntartalmú anyagokon (főleg karbamid) kívül más anyag is megjelenik, megnő a fajsúlya. Ilyen anyagok lehetnek a glükóz és a fehérje. A vizelet fajsúlyának meghatározására a vesék koncentráló funkciójának vizsgálatakor kerül elsődlegesen sor Vizeletüledék A vizeletüledék vizsgálata a vese és húgyutak vizsgálatának kulcsmódszere. A vizsgálat történhet mikroszkóp segítségével manuálisan, vagy laboratóriumi vizeletüledék automata alkalmazásával. A manuális módszerrel történő vizsgálat, tapasztalt személyzet esetén nem tart hosszú ideig. A minták jelentős része negatív, a pozitív minták jó része pedig nem igényel hosszasabb mérlegelést (gennyes és/vagy véres). A manuális vizsgálathoz általában nagy nagyítást (HPF) 40x-es nagyítású objektívet használunk leggyakrabban, de a cilinderek vizsgálatához kis nagyítást (LPF) 10x objektívvel. A minták általában 6-8 látótér alapján már megítélhetőek. A vizsgálatot lehetőleg friss, 1-2 óránál nem régebbi vizeletből végezzük. A mintát 10 ml-es centrifugacsőbe töltjük, majd 5 percig 1000 g-n centrifugáljuk. A tiszta felülúszó 9 tizedét leszívjuk, majd a maradék egy tized térfogatban felszuszpendáljuk a pelletet. A szuszpenziót tárgylemezre cseppentjük. A vizeletüledék automata esetében a minta előkészítése hasonló módon történik. Ez esetben a különbség annyi, hogy a kicseppentett minta egy automatába kerül, amely hasonló nagyítás mellett egy CCD kamera segítségével fényképet készít a mintáról. Ezt követően egy program az üledékben található sejtes és nem sejtes elemeket alakjuk (morfológiájuk) alapján beazonosítja. Ezen kívül léteznek a hematológiai automatákhoz hasonló elven (Coulter-elv) működő vizelet üledék automaták is (Sysmex UF sorozat). A vizelet mintavételezése az első fejezetben leírtak szerint kell, hogy történjen. Fontos a betegek figyelmét felhívni a megfelelő tisztálkodásra és a középsugaras vizeleti mintavételre, másképp a minta a sok laphámsejt miatt nem, vagy csak igen nehezen értékelhető. Sejtes elemek Vörösvértestek: Könnyen felismerhetők méretük és szemcsézetlen szerkezetük (nem rendelkeznek sejtorganellumokkal) alapján. Az alsó húgyutakból származó friss vörösvértestekkel szemben, a húgyhólyagból és a felső húgyutakból származó vörösvértestek vadgesztenye formájúak, zsugorodottak. Fehérvérsejtek: Lehetnek élő fehérvérsejtek, elhalt leukociták és gennysejtek. Az élő leukociták eltérő nagyságúak, a sejtmagjuk kicsi, ezzel szemben az elhalt leukociták egyforma méretűek, sejtmagjuk kerek alakú az élő sejtekhez képest puffadtak. Akut vesegyulladás esetén a leukociták összecsapzódnak, sejtes szerkezetük elmosódik, illetve a sejtek között szemcsés törmelék látható. Laphámsejtek: A húgycsőnyílás környékéről mosódnak a mintába. Veszélyük az, hogy elfedik a diagnosztikai szempontból érdekes sejtes elemeket. A hólyagból is származhatnak, ezek általában kisebb számban vannak és végeik kihúzottak, kis farok-szerű képződményük van. A hámsejtek mennyisége megnő bakteriális fertőzés, fűszeres ételek és bizonyos gyógyszerek hatására. Spermiumok: Idősebb férfiakban állandó jelenlétük az ondóvezeték gyulladására utalhat. Gombasejtek: elsősorban cukrot ürítő cukorbetegek vizeletében találni élesztősejteket, illetve hüvely candidiasisban szenvedő nők vizeletében Candida albicans fonalakat. Cilinderek: A cilinderek a vesecsatornákban képződő legömbölyített végű, pálcika, vagy csavar alakú képződmények. A fehérjetartalmú glomerulusfiltrátumból képződnek a vizelet ph változása révén. Alakjukat a vesetubulusoktól, mint öntőformától nyerik. A tiszta cilinderek a proteinuriával azonos jelentést hordoznak. Amennyiben a fehérjetartalmú tubuláris vizelet sejtes elemeket is magával visz, akkor ezek belekerülnek a képződő cilinderbe és a sejt típusától függően vörösvértest, fehérvérsejt, hámsejt, vagy ezek kombinációjából 68

79 Vizeletvizsgálat álló cilinderek jönnek létre. A sejtes-cilinderek fontos diagnosztikai jelentősége az alsó húgyúti és vesegyulladások elkülönítésében rejlik. Kristályok Bár a vizeletüledékben található kristályok és a vesekövek között csak laza összefüggés van, érdemes megvizsgálni őket. Beazonosításuk viszonylag könnyen megtehető morfologiájuk alapján, majd az étrend változtatásával tehetünk kialakulásuk (mértéke) ellen. Oxalát: A savas ph mellett megjelenő oxalát kristályok oktaéderesek, míg semleges és lúgos ph mellett ovális alakúak. Általában Ca-oxalát formában vannak jelen. Tanácsos friss (meleg) vizeletből végezni a vizsgálatot, mivel hideg vizeletből az állás során akkor is kiválik, ha fiziológiásan nem volt jelen. Húgysav, urátsók: Az oxalát sókhoz hasonlóan könnyen kiválik az állni hagyott vizeletből savas ph-n vaskos tompa végű, lúgos ph-n mandragóragyökér alakú kristályokat képez. A különböző foszfát kristályok közül magnézium-ammóniumfoszfát jelenléte bakteriális fertőzésre utalhat. 69

80 6. fejezet - Májfunkciók laboratóriumi vizsgálata A máj központi szerepet tölt be az anyagcserében, az emésztésben, a méregtelenítésben és a különböző anyagok szervezetből történő eltávolításában. Az emésztőtraktusból érkező teljes vérmennyiség elsőként a májon keresztüláramlik, ahol megtörténik az emésztésből származó anyagok feldolgozása, átalakítása, raktározása. Igen fontos szerepet tölt be a szénhidrátok, fehérjék és lipidekanyagcseréjében, szintén itt történik az epesavak koleszterinből történő szintézise, amely elősegíti a koleszterin, keringésből történő eltávolítását, valamint a lipidek és zsíroldható vitaminok felszívódását. A máj biotranszformációjuk során elvégzi mind az endogén, mind az exogén anyagok (mint például különböző gyógyszerek, toxinok) feldolgozását, amely lehetővé teszi szervezetből történő eltávolításukat. A máj ezen kívül endokrin szerepkörrel is bír, mivel itt zajlik a pajzsmirigy hormon, a kortizol, a D vitamin katabolizmusa, illetve az inzulin-szerű növekedési faktor I (IGF-I), az angiotenzin és az eritropoetin szintézise. Ezen májfunkciók bármelyike vizsgálható a klinikai laboratóriumban, hogy betekintést nyerjünk a máj integritásába. A máj, mint nagyméretű szerv meglehetősen nagy tartalék kapacitással rendelkezik. Éppen emiatt számos, akár súlyos májkárosodással járó betegség esetében képes a normális májfunkciók viszonylag hosszú időn keresztül történő fenntartására. Ezekben az esetekben a májat ért károsodásra csak az abnormális teszteredmények utalhatnak. Leggyakrabban erre, a májban található enzimek szérumszintjének és azok eltérő mintázatának meghatározását használjuk. A krónikus májbetegségek igen gyakran járnak együtt a máj kötőszövetesedésével, a kötőszövetesedési folyamat markerei gyakran a májkárosodás jó indikátorai. A fejezet elején egy nagyon rövid anatómiai ismertetést követően rátérünk a máj biokémiai funkcióinak ismertetésére és azok laboratóriumi vizsgálatának módszereire A máj anatómiája Egy felnőtt ember mája megközelítőleg kg súlyú. A diafragma (rekeszizom) alatt, az abdomen (hasüreg) jobb felső kvadránsában (negyedében) a bordák által védve helyezkedik el. Rögzítéséről szalagszerű képződmények gondoskodnak. Vérellátás: A máj kettős vérellátással rendelkezik. Az első a portális véna, amely a lépből és a tápanyagokban gazdag vért szállítja az emésztőtraktusból. Nagyjából a máj teljes vérellátásnak 70%-át ez biztosítja. A másik a hepatikus artéria. Ez utóbbi a központi keringésből származó oxigén dús vérrel látja el a májat. Legvégül ez a két vérellátási forrás egyesül és a máj szinuszoidokba ömlik. A májszinuszoidok a különálló, egysejt réteget alkotó hetatociták között levő tér (6.1. ábra). A májból történő vénás elfolyás a hepatikus vénákon keresztül történik, amely aztán a vena cava inferiorba torkollik közel annak jobb pitvarba torkollásához. Epeutak: Az epeelfolyás az epe kanalikulusoknál ered. Az epe kanalikulusok a szomszédos májsejtek között található kis árkok, amelyek csatornácskákat formálnak, majd ezek egyesülnek és az intrahepatikus epevezetékeket alkotják (6.1. ábra) ábra - A máj mikroszkópikus felépítése. 70

81 Májfunkciók laboratóriumi vizsgálata Ezek végül egyesülnek és a jobb és bal hepatikus epecsatornát alkotják, amelyek a porta hepatikán lépnek ki és a közös hepatikus csatornát alkotva egyesülnek. A hepa-tikus csatorna egyesül az epehólyagból érkező cisztikus csatornával, hogy együtt alkossák a közös epevezetéket (6.2. ábra), amely a duodenumba ömlik. Az epehólyag, amely a jobb májlebeny alatt helyezkedik el az epasavas sókból és hulladék anyagokból álló epét tárolja és koncentrálja. A táplálék elfogyasztása által kiváltott hormonális stimulus hatására az epehólyag izmos fala összehúzódik és epesavas sókat juttat a vékonybélbe, hogy elősegítse a zsírok emésztését. Mikroszkópikus felépítés: A máj funkcionális anatómiai egysége az acinus, amely a portális véna, hepatikus véna és epecsatorna által alkotott portális triáddal határolt. Minden egyes acinus egy máj paranchyma által alkotott gyémánt alakú szövetdarab. Az acinus ellátásáról a portális véna és a hepatikus artéria végső elágazásai gondoskodnak és az epeelfolyást az epecsatornácska végső elágazásai biztosítják. A vérerek a periféria irányába haladva szinuszoidokat alkotnak, amely átöblíti a májat és végül a központi májvénába ömlik. A szinuszoidok fenesztrált endotél sejtekkel határoltak, ezáltal lehetővé teszik a vér szabad filtrálódását (6.1. ábra). Szintén itt találhatóak a Kupffer sejtek, amelyek monocitákból származnak és lizoszóma tartalmuk révén képesek a fagocitált baktériumok lebontására. Ők felelősek a véráramban található antigén-antitest komplexek kiszűréséért, eliminálásáért is ábra - A máj és az epeutak makroszkópikus anatómiája. 71

82 Májfunkciók laboratóriumi vizsgálata A máj legfontosabb funkcionáló sejtjei a hepatociták, ők felelősek a legtöbb metabolikus és szintetikus funkcióért. A csillagsejtek a hepatociták és a szinuszoidok bélését adó endotél sejtek között helyezkednek el. Normális körülmények között feladatuk az A vitamin raktározása és a NO szintézise. Külsődleges stimulusra kollagén termelő sejtekké alakulnak, így ők felelősek a máj kötőszövetesedéséért, a cirrózis kialakulásáért. A hepatociták ultraszerkezete: Nagy meglepetés nem éri a biokémiát ismerő embert. A mitokondriumok felelősek az energia előállításáért. A durva felszínű endoplazmás retikulum a fehérjeszintézisért, a sima felszínű endoplazmás retikulum tartalmazza a biotranszformáció, a koleszterin és az epesavas szintéziséért felelős enzimrendszereket. A peroxiszómák felelősek a zsírsavak β-oxidációjáért (7-18 C atomszám között), valamint részt vesznek az alkohol lebontásában. A lizoszómák hidrolitikus enzimeket, vasat, lipofuscint, epe pigmenteket és rezet tartalmaznak, raktároznak. A Golgi apparátus pedig különböző anyagok, mint az epesavak és az albumin szekréciójában vesz részt A máj biokémiai funkciói A máj biokémiai funkcióinak sorát a méregtelenítéssel, a biotranszformációs folyamatok ismertetésével kezdjük. A biotranszformáció folyamatai elsősorban a máj parenchy-masejtjeiben zajlanak, azonban meg kell jegyeznünk, hogy más szervekben is lejátszódnak, így a tüdőben, a bőrben, a bélben és a vesében is. A biotranszformáció során azok az endogén (pl.: hormonok, bilirubin) és azok az idegen (vagy xenogén) anyagok (pl.: különböző gyógyszermolekulák, toxinok), amelyek felhalmozódnának a szervezetben átalakításra, majd kiürítésre kerülnek. A biotranszformációs reakciók során általában egy adott vegyület oldhatósága megváltozik, a zsíroldható vegyületek vízoldhatóvá válnak, kijutnak a sejtből, a vérpályán keresztül a vesébe jut, ahol már, mint vízoldható molekula filtrálódik és a vizelettel ürül. Másik lehetséges eltávolítási mód, hogy az epekanalikulusokba választódik ki az epével együtt, a bélbe jut és a széklettel távozik. A biotranszformáció folyamatait három szakaszra osztjuk. I. Előkészítő 1. fázis: a kiválasztandó molekulán konjugációra alkalmas funkciós csoportok (pl. hidroxil, karboxil, amino, tiol) kialakítása, 90 %-ban monooxigenázok katalizálják 72

83 Májfunkciók laboratóriumi vizsgálata II. Konjugációs 2. fázis: a reaktív (konjugációra alkalmassá tett) molekulákhoz általában vízoldható molekula kötése. Ennek révén maga a molekula is vízoldhatóvá válik. III. Transzport 3. fázis: a vízoldhatóvá tett molekula transzportja a sejtből A biotranszformáció enzimei alacsony K m értékkel és széles szubsztrát specificitással jellemezhetőek. Így a toxikus anyagok igen széles körét, már igen alacsony koncentrációban képesek átalakítani, majd kiüríteni. Röviden tekintsük végig a biotranszformáció három fázisának történéseit, majd egy endogén és egy xenogén szubsztrát szervezetből történő eliminálását. Előkészítő 1. fázis Az előkészítő fázis során alakulnak ki a konjugációra alkalmas funkciós csoportok. Elméletileg ez bekövetkezhet 1. oxidáció (oxigenáció), 2. redukció, vagy 3. hidrolízis révén. Gyakorlatilag az 1. fázis reakciók 90%-a oxigenáció, mely során a légzési oxigén molekula egyik oxigén atomja a konjugációra előkészítendő molekulába épül a másikból pedig egy vízmolekula képződik (6.3. ábra). Az oxidációs folyamatokat a sima felszínű endoplazmás retikulum membránhoz kötve egy többkomponensű enzimrendszer katalizálja. Az enzimrendszer által katalizált folyamat, mivel hasonlít a légzési elektrontranszfer láncra, mikroszómális légzési láncnak nevezték el. Az oxigenációt végző citokróm P 450 enzimek, nevüket onnan kapták, hogy CO-dal alkotott komplexük 450 nm-es hullámhosszúságnál mérve jellegzetes abszorpciós maximumot mutat. A mikroszómális oxigenációs enzimrendszer működéséhez NADPH-t és O 2-t igényel. Így nem meglepő, hogy fokozott aktivitás (pl. betegség esetén gyógyszerszedése következtében) esetén megnő a máj NADPH, O 2 igénye is. A szervezetünkben található endogén és a környezetünkből felvett xenogén anyagok oxigenációját végző citokróm P450 enzimcsaládnak jelenleg nagyjából 700 izoenzim tagját írták le. Természetesen adódik a kérdés, hogy mi váltotta ki a citokróm P450 enzimek ilyen nagyfokú differenciálódását, hiszen a szervezetünkbe jutó sokféle toxikus anyag jelentős hányada, a vegyipar 19. századi fejlődésével jelent meg ábra - A fázis I. reakciók 90%-át kitevő oxigenáció folyamata. 73

84 Májfunkciók laboratóriumi vizsgálata A differenciálódás alapja minden bizonnyal a növényvilág. A növényi táplálékkal számos, nem hasznosítható, vegyület is a szervezetünkbe jut, amelyeket ki kell üríteni és ki kellett üríteni már több száz, ezer évvel ezelőtt is. Ezen vegyületek növények által történt szintézisének és az állatok ezen vegyület lebontására kifejlesztett képességének hátterében feltehetően a növények és az állatok között fennálló versengés lehet. A vegyületeket tehát felfoghatjuk, mint a növények védekezését az őket pusztító állatokkal szemben. A citokróm P450 enzimek pedig megvédenek minket ezekkel a növényi mérgekkel szemben. Az alábbi táblázat néhány gyakrabban fogyasztott növényt és az általuk termelt, citokróm P450 enzimek által lebontott vegyületeket tartalmazza. Növények Fokhagyma, zeller, kelbimbó káposzta, répa, petrezselyem Vegyületek indol-3-karbinol, diallil-szulfid psoralen A változó környezeti feltételekhez alkalmazkodva, az igényeknek megfelelő mértékű a citokróm P450 enzimek kifejeződése. Amennyiben nagyobb mennyiségű endogén, vagy xenogén szubsztrát kerül a szervezetünkbe a citokróm P450 enzimek szintje megnő, indukálódik (Indukálódás: a fehérjeszintézis fokozása valamilyen behatásra) a megfelelő enzim. A különböző növények (vegyületek) különböző citokróm P450 enzimek szintézisét fokozzák. Az alábbi táblázatban felsoroltunk néhány citokróm P450 családot és legfontosabb induktoraikat. CYP1 benzpirén, teofillin, dioxinszármazékok 74

85 Májfunkciók laboratóriumi vizsgálata CYP2 CYP3 CYP4 szteroid gyógyszerek, paracetamol, etanol, aceton több antibiotikum, fogamzásgátló klofibrát (hiperlipidémiás gyógyszer) Az indukció mértéke akár több 100-szoros is lehet a citokróm P450 enzimek esetében. Konjugációs 2. fázis A 2. konjugációs fázis során célunk az első fázis során előkészített molekula vízoldhatóvá tétele. Ennek elérése érdekében az első fázis során kialakított funkciós csoport(ok)ra különböző vegyületeket, konjugációs faktorokat kapcsolunk. Ilyen konjugációs kofaktorok: a glukuronsav, metil-, acetil-, szulfát csoportok, a glutation, az aminosavak. A konjugációs reakciók közül kiemelkedik a glukuronsavval történő konjugálás, a glukuronidáció, amely a konjugációs reakciók mintegy 80%-át teszi ki. Ezen kívül gyakran előfordul még a szulfatálás, illetve a glutationnal történő konjugálás. Az alábbi táblázatban összefoglaltuk a három leggyakoribb konjugációs folyamot katalizáló enzimeket. Folyamat Glukuronidáció Szulfatálás Konjugáció glutationnal Enzimek UDP-glukuronoziltranszferázok szulfotranszferázok glutationil-s-transzferáz A konjugációs reakciók viszonylag aspecifikus folyamatok egyazon vegyület ugyanazon csoportja akár többféle anyaggal is konjugálódhat. Erre jó példa az Aspirin hatóanyagának vázát adó szalicilsav, amely karboxil csoportja egyaránt konjugálódhat glukuronsavval és glicinnel. A glukuronidációt végző UDP-glukuronoziltranszferázok (UDPGT) a citokróm P450 enzimekhez hasonlóan indukálhatóak, igaz jóval kisebb mértékben. További rokon vonás, hogy ez is egy izoenzim család, amelyek az endoplazmás retikulum membránjához kötöttek. A reakció kofaktora, a glukuronsav glukózból képződik, így a konjugáció egy molekula glukóz veszteséget jelent a máj számára. Transzport 3. fázis: A második konjugációs fázis során konjugálódott molekulák a 3. fázis transzportereinek ligandjaivá váltak. Ezen transzporterek egy jelentős része ATP-kötő, úgy nevezett ABC transzporter (ATP Binding Casette). Különösen jól ismertek a multidrog rezisztencia transzporterek (MDR, MRP). Ezen transzporterek a májsejtek epekanalikulus és laterális plazmamembránjában találhatóak. Bár a citokróm P450 és az UDPGT enzimek indukciójáról szóltunk már, röviden meg kell emlékeznünk a koordinált enzimindukcióról. Ez azt jelenti, hogy nemcsak a már említett enzimek, hanem a kofaktorellátásért és más kapcsolódó folyamatokért felelős enzimek is a méregtelenítő enzimekkel együtt indukálódnak. Ilyen folyamatok és enzimek például a 1. NADPH ellátás és az érte felelős glükóz-6-p dehidrogenáz, 2. a glukuronsav ellátás, 3. a citokróm P450 enzimek prosztetikus csoportjának a hem szintéziséért felelős enzimek Bilirubin lebontás, a bilirubin enterohepatikus körforgása A máj biotranszformációs funkcióját, a funkció sérülését, annak következményeit és laboratóriumi diagnosztikáját kiváló módon lehet bemutatni a bilirubin lebontása révén. A bilirubin a hem bomlásterméke. Kövessük hát nyomon a hem lebontásának folyamatát. Ha a vér kilép az érpályából, megszűnik az oxigenizációja a hemoglobin, dezoxi hemoglobinná alakul, ezt könnyen nyomon tudjuk követni színének változása révén, amíg az oxi hemoglobin élénkpiros színű, addig a dezoxi forma kék. Ez a jelenség és a további történések is könnyen megfigyelhetők a mindennapok során is, egy tompa sérülés közvetlen következményeként a zúzódás helye, ahová a vér kiáramlott először megkékül (a dezoxi hemoglobin színét mutatja), majd a folt egy idő elteltével megzöldül, később sárgás színű lesz. A háttérben a hemből történő biliverdin (zöld), majd bilirubin (sárga) képződése áll. A hem gyűrű felnyitásáért a hemoxigenáz felelős (6.4. ábra), a gyűrű felnyitásával a hem vasatomja is felszabadul a keletkező biliverdin pedig leválik a globin fehérjeláncról. 75

86 6.4. ábra - A hem gyűrű felnyílása Májfunkciók laboratóriumi vizsgálata Az ily módon keletkezett biliverdin, a biliverdin reduktáz hatására bilirubinná redukálódik (6.5. ábra) ábra - a biliverdin redukálódása bilirubinná 76

87 Májfunkciók laboratóriumi vizsgálata A bilirubin erősen hidrofób karaktere miatt gyakorlatilag vízben nem oldódik, a vérben albuminhoz kötődve szállítódik. Az albuminhoz kötött bilirubin (ahogy az albumin sem) nem filtrálódik a vesében, eliminációja attól függ, hogy milyen ütemben veszi fel a máj, konjugálja és üríti ki az epével. Az albuminhoz kötött bilirubint a hepatociták specifikus receptorokon keresztül felveszik, majd itt egyből egy fehérjéhez kapcsolódik megakadályozván véráramba történő visszajutását. A hepatocitában UDPGT enzimek segítségével bilirubin molekulánként 2 molekula UDP-glukuronsav kapcsolódik (6.6. ábra) ábra - A bilirubin UDP-glukuronsavas konjugálása 77

88 Májfunkciók laboratóriumi vizsgálata A konjugáció révén vízoldhatóvá tett bilirubin-diglukuronid az epével a bélcsatornába jut. Az epeutak elzáródása esetén a már vízoldható bilirubin diglukuronid a vérkeringésbe kerül, vízoldható molekula lévén filtrálódik és a vizeletbe kerül ahogy azt már a vizeletvizsgálat fejezetben leírtuk. A vizeletben található bilirubin tehát minden esetben konjugált bilirubin. A bélbe jutott bilirubin egy részét a bélbaktériumok dekonjugálják, másik részét pedig a vízoldható urobilinogénné alakítják. Az urobilinogén egy része felszívódik 78

89 Májfunkciók laboratóriumi vizsgálata a bélből és a portális keringésbe kerül, a máj nem veszi fel az urobilinogén teljes mennyiségét és egy csekély része a szisztémás keringésbe kerülve a vesén keresztül filtrálódik. Normális esetben, ahogy azt már a vizeletvizsgálatok esetén megjegyeztük a vizelet minimális mennyiségű urobilinogént tartalmaz. A bélben maradó urobilinogén egy része szterkobilinogéné, majd ezek oxidációs termékeivé urobilinné és szterkobilinné alakul. A széklet színét elsősorban a barna szterkobilin adja. Epeút elzáródás esetén éppen ezért nemcsak a konjugált bilirubin szint nő meg a szérumban és jelenik meg a vizeletben, hanem a vizelet urobilinogén negatívvá válik, valamint a hiányzó bél urobilinogén miatt a székletből eltűnik a szterkobilin és abnormálisan világos színű lesz. Hozzávetőlegesen 300 mg bilirubin képződik naponta. Ahogy említettük a máj meglehetősen nagy tartalék kapacitással bír, így akár ezen érték tízszeresét is képes konjugálni, kiválasztani. Éppen ezért a plazma bilirubin koncentráció meghatározása nem tekinthető a májfunkció érzékeny tesztjének. Az albuminhoz kötött bilirubin fény hatására mind in vivo, mind in vitro bomlik. A keletkező bomlástermékek polárosabbak, mint a bilirubin ezért in vivo lassan képesek a vesén keresztül kiválasztódni. Ezt terápiás céllal fel is használják a születést követően besárgult újszülöttet ezért szokták kék fénnyel megvilágítani ábra - A szérum bilirubin meghatározása diazotálással 79

90 Májfunkciók laboratóriumi vizsgálata Meghatározása: Színes vegyület lévén egész érzékenyen meghatározható a beteg szemrevételezésével. Igen jól lehet látni már az enyhe ikteruszt (sárgaságot) a beteg szemfehérjéjének (sclera) szemrevételezésével. A bilirubin laboratóriumi meghatározása leggyakrabban fotometriásan történik, ez a bilirubin diazotálásával keletkező színes bilirubinszármazék meghatározását jelenti (6.7. ábra). A módszer előnye a direkt fotometriás módszerrel szemben (színes vegyület lévén, akár így is meghatározható a bilirubin), hogy a diazotálással megszűnik a bilirubin fényérzékenysége és a diazo-bilirubin moláris abszorpciós együtthatója is jóval magasabb. Egy kis időt érdemes még eltölteni a plazma bilirubin meghatározásával. Ahogy azt korábban említettük normálisan a vér bilirubin tartalmának döntő része (96-97%-a) albiminhoz kötve található. Ez a konjugálatlan bilirubin vizes közegben csak igen lassan diazotálódik, az így végbemenő lassú reakcióval mérhető az úgy nevezett direkt bilirubin. Gyakran ezt a kifejezést szokták (még szakmai körökben is) egyszerűen a konjugált bilirubin szinonimájaként alkalmazni. Normális körülmények között annyira alacsony a konjugált bilirubin vérszintje, annak magas clearance értéke miatt, hogy nem is éri el a kimutatási határt. Ebben az esetben mérhető 3-5 μm-nyi direkt bilirubin a vizes közegben gyéren, de reagáló konjugálatlan bilirubinból származik, tehát ekkor a két fogalom nem fed át, nem igazán helyes szinonimaként történő használatuk. Ha azonban emelkedik a vér konjugált bilirubin tartalma az alacsony tubuláris maximum miatt megnő a vér konjugált bilirubin tartalma, tehát ekkor a vér direkt bilirubin tartalma már jól korrelál a konjugált bilirubin szinttel. A direkt bilirubin meghatározásának tehát csak a teljes bilirubin meghatározás mellett van diagnosztikai értéke. Technikailag a két különböző típusú bilirubin meghatározása abban különbözik, hogy a direkt bilirubin meghatározás során nem, az indirekt bilirubin meghatározás során pedig egy gyorsító adalékot alkalmaznak, amely a nem vízoldható bilirubint a fe-hérjék kicsapása nélkül oldatba viszi és ily módon már a konjugált bilirubinnal azonos sebességgel reagálhat a diazotáló reagenssel. Erre a célra három különböző reagens, módszer is született: 1. a klasszikus Jendrassik-Gróf eljárás gyorsító vegyülete az enyhén savas koffein oldat, 2. DMSO (dimetil-szulfoxiddal) történő gyorsítás. Ez automaták esetében inkább ajánlott. 3. savas közegben detergens jelenlétében végzett bilirubin meghatározás Máj funkciózavar és hiperbilirubinémiák Bár még a máj számos biokémiai funkciójának ismertetésével adósak vagyunk, most mégis rátérünk a patológiás elváltozások és azok laboratóriumi diagnosztizálási lehetőségeinek ismertetésére. Tesszük ezt azért, mert számos esetben a bilirubin lebontás ad az elváltozások meghatározására lehetőséget. A fejezet elején szeretnénk leszögezni, hogy a májat érintő elváltozások nem mindig járnak együtt magas bilirubin szinttel (hiperbilirubinémiával) és a hiperbilirubinémia hátterében sem mindig húzódik meg májbetegség Nem konjugált hiperbilirubinémia A nem konjugált hiperbilirubinémia elnevezés találó, hiszen utal a probléma gyökerére, valamilyen oknál fogva az albuminhoz kapcsolódott hidrofób karakterű bilirubin mennyisége felszaporodik a vérben. A (nem konjugált) bilirubin koncentrációja ritkán haladja meg a 100 μm-os értéket. A probléma hátterében állhat a megnövekedett hemolízis (hemolitikus anémia), amely következtében megnő a hem lebontása, így a lebontási termék bilirubin mennyisége is. Hemolitikus anémiát okoz például a glükóz-6-foszfát-dehidrogenáz deficiencia, amely mintegy 400 millió embert érint a Földön. A fokozott bilirubin termelődés miatt ilyen esetekben megnő az epébe kiválasztott konjugált bilirubin és a bélben abból képződő urobilinogén mennyisége is, melynek következménye lesz a vizelet urobilinogén szint emelkedése. A máj ebben az esetben semmilyen funkciózavarral nem rendelkezik, egész egyszerűen, csak a nagy tartalék kapacitása ellenére sem képes a nagymértékben megnövekedett bilirubinmennyiség konjugálására, kiválasztására, ezért ez esetben a sárgaságot prehepatikus ikterusznak nevezzük. Az elnevezés utal arra, hogy a májat megelőző okok miatt alakul ki a hiperbilirubinémia. Nem konjugált hiperbilirubinémia alakulhat ki a konjugáló enzim defektusa miatt is. A gyerek születését követően még alacsony a konjugáló enzimek aktivitása, majd hormonális hatásra megnő. Ez okozhatja az újszülötteknél kialakuló sárgaságot, amihez hozzájárulhat a fokozott hemolízis. A bilirubin konjugációjában legnagyobb jelentőséggel az UGT1A1 (UDP-Glukuronozil-Transzferáz1A1) rendelkezik. Ennek kismértékű örökletes (autoszomális recesszív) expressziós zavara áll a jóindulatú Gilbert kór hátterében, amelyben a bilirubin vér szintje nem emelkedik 60 μm fölé. Előfordulása meglehetősen gyakori a teljes populáció mintegy 5-6%-a érintett. Ettől jóval súlyosabb a helyzet a szintén örökletes Crigler-Najjar szindrómában. A szindrómának két eltérő klinikai formája ismeretes: 80

91 Májfunkciók laboratóriumi vizsgálata I. bilirubin 340 μm felett: azonnali májtranszplantáció szükséges a születést követően II. bilirubin μm kezelhető UGT induktorokkal: pl. fenobarbitállal. A szállításért felelős albumin 300 μm körüli bilirubin koncentrációnál telítődik, a hidrofób bilirubin molekula átjut a vér-agy gáton a glia, illetve agysejtek károsodását okozza, kialakul a kernikterusz. Természetesen ezeken az örökletes májenzim defektusokon kívül más, szerzett májbetegség következtében is kieshet a máj konjugáló funkciója, ami szintén a bilirubin felszaporodásához vezethet, mivel ez esetben a máj defektusa okozza a sárgaságot hepatikus ikteruszról beszélünk. A szerzett májbetegségekről egy kicsit később fogunk értekezni Konjugált hiperbilirubinémia Konjugált hiperbilirubinémia, akkor alakul ki, ha az elfolyás gátlása, akadályoztatása révén a hepatocitákból, vagy az epeutakból a véráramba kerül a konjugált bilirubin. A konjugált bilirubin vízoldékony lévén, kiválasztódik a vizeletbe sötét narancs, barna színűre festve azt. Egyúttal az elfolyás akadályoztatása miatt a bilirubin enterohepatikus körforgása megszakad, nem jut el a bélbe, ennek eredményeként a széklet abnormálisan világos színű lesz. Amennyiben az epeutak elzáródása okozza a magas bilirubin szinttel együtt járó sárgaságot poszthepatikus ikteruszról beszélünk. Konjugált hiperbilirubinémiát okoz az MRP2 transzportfehérje hiánya, amely így transzport harmadik fázis betegségnek tekinthető. A Dubin-Johnson szindróma néven ismert autoszomális recesszív módon öröklődő betegségben az exréciós zavar pigmentlerakódást, májmegnagyobbodást (hepatomegáliát) okoz A máj megbetegedései A máj jól definiált módon reagál az őt ért károsodásokra. Az akut májkárosodás akár tünetmentes is lehet, de igen gyakran jár sárgasággal. A két legfontosabb akut májbetegség az akut májgyulladás (hepatitisz) és a kolesztázis (az epeút elzáródása). A krónikus májbetegségek leginkább a krónikus hepatitisz formájában jelentkeznek, amelyek hosszú távon cirrózishoz és hepatocelluláris karcinomához vezetnek A károsodás mechanizmusa és mintázata A károsodás célsejtje tulajdonképpen meghatározza a károsodás mintázatát. A májsejtek (hepatociták) károsodása hepatocelluláris betegséghez az epesejtek károsodása kolesztázishoz vezet. Minden sejtkárosodás, mint adaptációs, vagy gyógyulási válasz fibrózist válthat ki, a károsodás időtartamától és a genetikai faktoroktól függően cirrózis és végül karcinóma alakulhat ki. A sejtek elhalása apototikus és nekrotikus, vagy mindkettő lehet. A laboratóriumi tesztek segítenek megkülönböztetni 1. a károsodás mintázatát (hepatocelluláris, vagy kolesztatikus), 2. krónikus, vagy akut mivoltát, 3. a károsodás súlyosságát. Nagy általánosságban, a klinikai enzimológia fejezetben már részletezett aminotranszferáz (ASAT, ALAT) és az alkalikus foszfatáz aktivitások révén eldönthető, hogy a károsodás hepatocelluláris, vagy az epeutakat érinti-e. A plazma albuminszintje alapján eldönthető, hogy krónikus, vagy akut problémával állunk szemben, a súlyosság foka pedig alvadási paraméterek és faktorszintek (elsősorban V- ös faktor) alapján megítélhető Vírusos májgyulladások Öt különböző vírust azonosítottak (Hepatitisz A, B, C, D, E, G), amelyek elsődleges célpontja a máj. Ezeken kívül számos más vírus fertőzheti meg a májat egy generális több szervet érintő fertőzés keretében, ilyen például a citomegalovírus (CMV), Epstein-Barr vírus (EBV) és a herpes szimplex vírus (HSV). A hepatitisz vírusokkal részletesebben az egészségügyi mikrobiológia foglalkozik, de röviden a legfontosabb, leggyakrabban előforduló Hepatitisz A, B, C vírusokról ejtünk néhány szót. Hepatitisz A vírus (HAV): Észak-Amerikában és Európában az akut hepatitisz leggyakoribb kiváltó oka. Terjedése feko-orális úton történik legtöbbször szennyezett ivóvízzel, illetve élelmiszerrel. Nem válik krónikussá, felnőttek esetében sárgaság kísérheti, a gyerekek igen gyakran tünetmentesek, illetve hasmenéses betegség formájában zajlik le. Incidenciája az egyre terjedő vakcináció miatt csökkenő tendenciát mutat. 81

92 Májfunkciók laboratóriumi vizsgálata Diagnosztikája: A HAV ellenes totál antitestek a fertőzést, vagy vakcinációt követően jelennek meg és a keringésben maradnak egész életünk során, de a vakcinációt követően legalább 20 évig. Az IgM anti-hav igen gyorsan megjelenik a fertőzést követően és 3-6 hónapig detektálhatóak. Hepatitisz B vírus (HBV): A krónikus virális májinfekciók közül ez a leggyakoribb. A föld lakosságából hozzávetőlegesen 350 millió ember krónikusan HBV-vel fertőzött és mintegy harmada van kitéve a fertőzésnek. A HBV testnedvekkel terjed, leggyakrabban parenterálisan és szexuális úton. Vakcinációja mind aktív, mind passzív immunizációval történhet. Diagnosztikája: A vírus által termelt HBsAg használatos a vírus laboratóriumi kimutatására. Mind a krónikus, mind az akut fertőzésben jelen van. Antitestek közül a hepatitisz B magi antigént (anti-hbc), mutatjuk ki a leggyakrabban. Két vizsgálati mód terjedt el: a totál anti HBc és az IgM. A totál antitest vizsgálat mind az IgM, mind az IgG antitesteket méri és a kitettséget követően az egész élet során pozitív. Az IgM az akut fertőzést követően 3-6 hónapig pozitív. A Hepatitisz B felületi antigénje elleni antitest (anti-hbs) az immunitásra utal és azokban fordul elő, akik hepatitisz B elleni vakcinációban részesültek, a fertőzést követően e mellé mindig társul az anti-hbc is. A HBeAg és az anti-hbe a krónikus HBV fertőzés kimutatására szolgál. A HBeAg a replikálódó vírus partikulákkal együtt termelődik, de nem része magának a vírus partikulának. Így, mint marker szerepel, jelzi, hogy replikálódó stádiumba került a vírus és meg kell kezdeni az anti-virális kezelést. Ahogy a molekuláris biológiai módszereket taglaló fejezetben már említettük a vírus DNS direkt kimutatása is lehetséges. Klinikailag jelentős virémiának minősül a kópia/ml feletti érték. Hepatitisz C vírus (HCV): A föld lakosságából hozzávetőlegesen 170 millió ember fertőzött HCV-vel. A fertőzés többnyire vérrel terjed. A legfontosabb rizikófaktorok az I.V. adagolt drog és a vérvizsgálat előtti (1990-t megelőző) transzfúzió. Sajnos meglehetősen mutagén, 6 különböző fő genotípus és számos alvariánsa ismeretes. Jelenleg nem rendelkezünk védőoltással ellene. Visszaszoruló incidenciájának hátterében a véradók tesztelése, illetve a biztonságosabb injekciós gyakorlat áll. Diagnosztikája: A legfontosabb diagnosztikai teszt az anti-hcv antitest kimutatására irányul. A 2. generációs tesztek 12 héttel, a harmadik generációs tesztek 9 héttel a vírussal történő találkozást követően lesznek pozitívak. Az aktív fertőzés kimutatása a HCV RNS detektálásán alapul Akut hepatitisz Az akut hepatitisz a májsejtek (hepatociták) ellen irányuló direkt, vagy indirekt akut ká-rosodás. Direkt májsejtkárosodást okoz néhány gyógyszer, mint például az acetaminofen és az isémia. Az indirekt károsodást az immunrendszerünk mediálja és hepatitisz vírusok, a gyógyszerek jelentős része és az alkohol váltja ki. Direkt károsodás következtében gyakorlatilag azonnal megemelkedik számos citoszólikus enzim plazmában mérhető aktivitása. A legfontosabb ilyen enzimek az ASAT, ALAT és az LDH (referencia tartomány érték felső értékének legalább 5-6-szorosa). Az emelkedést követően hasonlóan gyorsan lecsökken az aktivitásuk (féléletidejükhöz közelítő gyorsasággal). Habár a sárgaság a legszembeötlőbb akut hepatitisz tünet, mégis sokszor hiányzik. Az alkalikus-foszfatáz szint emelkedése általában igen mérsékelt legfeljebb a referencia tartomány felső értékének háromszorosa szokott lenni. A bilirubin szint emelkedése, amennyiben jelen van hasonló mintázatú, mint az epeút elzáródás esetében. A máj szintetikus funkciói általában megtartottak akut hepatitisz esetén. A prognózis általában kedvező, a felépülés megtörténik, a máj regenerálódása pedig normális szerkezetű és funkciójú szervhez vezet. Néhány virális infekció esetén azonban a hepatitisz krónikussá válik. Az akut esetek kisebb hányadában, a súlyos májkárosodás pedig akut (fulmináns) májelégtelenséghez vezet, amely mortalitása igen magas (hacsak nem történik meg a máj transzplantációja). A virális hepatitiszek akut fázisa hasonló lefolyást mutat: A transzaminázok jelentős mértékben, a referencia tartomány felső értékének 8-50-szeresére emelkednek. Az ALAT általában magasabb kisebb clearance értéke miatt. Az enzim értékek tetőzése megelőzi a bilirubin szint tetőzését és 4-5 hétig a plató értéken maradnak. Az egyes vírusok közötti differenciálás a vírus antigének, ezekre termelődő antitestek (esetleg nukleinsavak) specifikus meghatározásán alapul. Az antigének szintje néhány héttel (4-8 hét), az antitestek szintje néhány hónappal (3-6 hónap) a fertőzést követően emelkedik meg Toxikus hepatitisz 82

93 Májfunkciók laboratóriumi vizsgálata A toxikus hepatitisz során valamilyen toxin, vagy toxikus metabolit direkt módon káro-sítja a hepatocitákat. A toxikus hepatitiszek döntő részében az acetaminofen főszerepet játszik. Az Egyesült Államokban és Európában az akut májkárosodások feléért-harmadáért az acetaminofen túladagolás felelős. Az acetaminofen mérgezés kezdeti, nem specifikus tünetei a hastáji fájdalom, gyengeség, étvágytalanság. Valamivel később lesznek kimutathatók az emelkedett szérum enzimszintek, a megnövekedett protrombinidő, valamint az artériás ph csökkenése. Súlyos acetaminofen túladagolás vagy későn elkezdett, esetleg elmulasztott kezelés esetén fulmináns májelégtelenség, hepatikus kóma is kialakulhat, szükségessé válhat a májátültetés Isémiás hepatitisz (Májsokk) A hospitalizált betegek esetében mérhető emelkedett szérum enzimszintek hátterében leggyakrabban a máj hipoperfúziója áll. Legtöbbször minimális bilirubin szintemelkedéssel jár együtt, amely tetőzése néhány nappal a szérum enzim szintek tetőzését követi. Igen gyakran akut veseelégtelenség súlyosbítja a helyzetet. A laboratóriumi paraméterek megváltozása egyébiránt a toxikus hepatitiszhez hasonló Reye szindróma Aszpirin adagolását követő akut hepatitisz. Akut májmegnagyobbodással, az ammónia vérbeli felszaporodásával, az aminotranszferázok szintemelkedésével, illetve a protrombin idő megnyúlásával jár Krónikus hepatitisz A krónikus hepatitisz a hepatociták 6 hónapnál hosszabb ideig tartó folyamatos gyulladásos károsodásával jellemezhető, amely gyakran jár együtt hepatocita regenerációval és hegesedéssel. A krónikus hepatitisz hátterében állhat hepatitisz B és C fertőzés, auto-immun hepatitisz, Wilson-kór, különböző gyógyszerek (ide értendő az alkohol is),α 1-antitripszin hiány. A legtöbb beteg tünetmentes, de számos nem specifikus velejárója lehet, mint a gyengeség, koncentrálóképesség leromlása, hiánya és a kimerültség. Mindezen enyhe klinikai tünetek ellenére a háttérben folyamatosan zajlik a májsejtek pusztulása, hegesedése, amelyek szép lassan a funkcionáló májsejtek számának drasztikus lecsökkenéséhez, cirrózishoz vezetnek. A krónikus hepatitisz kis mértékben megemelkedett aminotranszferáz aktivitásokkal (1-5-szörös referencia felsőhatár érték) jár együtt. Azonban az aminotranszferáz aktivitások, különösen HCV fertőzésben és nem alkoholos zsírmáj esetében (NASH: non-alcoholic steatohepatitis), hosszabb időn keresztül is a referenciatartományon belül maradhatnak. A többi laboratóriumi teszt általában normális értéket mutat. A krónikus hepatitisz két legfontosabb komponense a fibrózis és a nekroinflamatorikus aktivitás. A fibrózis kiterjedtsége szorosan korrelál a cirrózis kialakulásának rizikójával. Az ALAT aktivitás a nekroinflammatorikus folyamatok jó indikátora Cirrózis A cirrózis anatómiai definíciója szerint diffúz módon előforduló kötőszövetesedés, csomópontokban előforduló regenerációval. Ez az állapot jelenti krónikus májkárosodásokban a hegesedés és regeneráció végstádiumát. Gyakorlatilag minden krónikus májbetegség cirrózishoz vezet. A krónikus hepatitisz cirrózis átmenet korai szakaszában, amelyet sokszor kompen-zált cirrózisnak is neveznek, sok esetben semmilyen tünet, vagy jel sem utal a májbetegségre. Laboratóriumi abnormalitások azonban gyakran megjelennek a klinikai tünetek jelentkezését megelőzően. Később a csökkent albuminszintézis miatt lecsökken a keringésben az albumin mennyisége, amely maga után vonja az ozmotikus egyensúly felbomlását, folyadék lép ki az érpályáról és kialakul az ascites. A férfiakban a biotranszformációs funkció romlása következtében felszaporodnak a női nemi hormonok, ami impotenciával és ginekomasztiával (mellmegnagyobbodás) jár együtt, nőies küllemet adva a betegnek. A máj véralvadási faktorokat szintetizáló funkciójának következményeként alvadási problémák lépnek fel, bevérzések keletkeznek. Mindezen tünetekkel együtt jelentős mértékben megnő a portális vérnyomás. A máj transzaminázok szintjéről nagyon nehéz általános megállapítást tenni. A kis mennyiségű még funkcionáló májsejtek szétesése már nem szokta jelentős mértékben megemelni a plazma transzamináz aktivitását. 83

94 Májfunkciók laboratóriumi vizsgálata Ahogy a cirrózis előrehalad, bekövetkezik a beteg dekompenzációja a portális hipertenzió fokozódik, majd végül bekövetkezik a halál. 84

95 7. fejezet - A diabetes mellitus laboratóriumi vizsgálata A cukorbetegséget (diabetes mellitus) szokás a modern kor egyik népbetegségének titulálni. A betegség korántsem új keletű, első említésének sokak véleménye szerint a Théba környéki ásatásokon előkerült i.e re datált, a kutatásokat vezető régészről Ebers-papirusznak nevezett tekercset tartják. Annyi bizonyos, hogy ebben említés történik egy poliuriás betegségről. A kórkép tényleges leírása és a diabetes szó használata sokkal régebbi keletű. Az elnevezést első alkalommal, i.e. 230-ban, Memfiszi Apolloniusz használta, jelentése túláradás, amely a betegségben jelentős mértékben megnövekedett vizelet mennyiségére utal. A ma típusosnak tekintett tünetek összefoglalása az i.sz. I. században élt Kappadóciai Aretaeus nevéhez fűződik. A betegségre oly jellemző édes vizelet ürítését az angol Thomas Willis írta le a XVII. században. Az édes íznek cukorral való azonosítása (1776) egy honfitársa Matthew Dobson érdeme. Ő észlelte, hogy a betegek plazmája édes és gyakran tejszerű. Ez tekinthető a diabeteses hiperglikémia és hiperlipidémia első leírásának. Az édes ízre, cukorra utaló mellitus jelző William Cullentől ( ) származik. Így a betegséget megkülönböztették a szintén poliuriával járó diabetes insipidustól (lásd vesefunkciók vizsgálata). A XIX. századtól kezdve mind gyakrabban végezték a vizelet cukortartalmának meghatározását. A vér cukortartalmának meghatározását lehetővé tevő eljárások a XX. század első évtizedeiben váltak általánosan hozzáférhetővé. A diabétesz növekvő gyakoriságának, a minél korábbi diagnózis szükségességének felismerése, a veszélyeztettek felkeresése iránti igény a szűrővizsgálatok elterjedéséhez vezetett. A betegségre helyezett fokozott figyelmet indokolja, hogy az utóbbi pár évtizedben a cukorbetegek száma világszerte jelentősen emelkedik. A betegség előfordulását a teljes földi populációban 2000-ben 2.8%-ra, míg 2030-ra 4.4%-ra jósolják. Ez konkrét számadatokban 171 millió főről (2000) 366 millió főre (2030) történő emelkedést jelent A diabetes mellitus klasszifikációja A cukorbetegséget sokáig egységes megbetegedésnek tartották, noha számos klinikai megfigyelés egyértelmű különbséget tett a rendszerint sovány testalkatú gyerekekben, fiatal felnőttekben, viharos tünetekkel kezdődő kórforma és az inkább idősebb korban, gyakran tünetszegényen induló diabetes mellitus között. Az egységes elméletet az endogén inzulin meghatározás kifejlesztése döntötte végleg meg. Kiderült, hogy a zömmel gyerek-, illetve fiatal felnőttkorban kezdődő cukorbetegségre a diagnózis után gyorsan tapasztalható endogén inzulinhiány, az idősebb korban kialakuló diabéteszre pedig a kórisme után még hosszú ideig kimutatható, gyakran a normális értéket meghaladó, endogén inzulinszint jellemző. Endokrin Pankreász A hasnyálmirigy endokrin funkcióiért felelős szigetsejtekről első ízben Paul Langerhans német orvos számolt be 1869-ben diplomamunkájában. Az exokrin állománytól elkülönülő szigetsejtek a pankreasz tömegének csupán 1-2%-át teszik ki. Az endokrin állomány legalább 5 különböző hormon elválasztásáért felelős: 1. Inzulin: β-sejtek termelik 2. Glukagon: α- sejtek termelik 3. Szomatosztatin: δ-sejtek termelik, gátolja az inzulin és a glukagon szekrécióját 4. Pankreász polipeptid: a PP-sejtek termelik elválasztásának fő stimulusa a táplálékbevitel, részt vesz az étvágy és a táplálékbevitel csökkentésében 5. Islet Amiloid PoliPeptid (IAPP): 37 aminosav hosszú polipeptid, a β-sejtek az inzulinnal együtt szekretálják (100:1 arányban), gátolja az inzulin szekréciót, lassítja a bélürülést, gátolja a posztprandiális (étkezést követő) glukagon szekréciót A vércukorszint szabályozásában a fő szerepet az inzulin és a glukagon kapja. Az inzulin képződése két prekurzoron keresztül történik. Első körben a Da molekulatömegű preproinzulin keletkezik, amelyről in situ lehasításra kerül a szignál szekvencia, így alakul ki a 9000 Da-os proinzulin. A proinzulinban az inzulin A- (21 aminosav) és B láncát (30 aminosav) egy összekötő, vagy C (connectiv) peptid (31 aminosav) köti össze. Az 85

96 A diabetes mellitus laboratóriumi vizsgálata A- és B- láncok között kialakul 2 intermolekuláris és az A-láncon belül egy intramolekuláris diszulfid híd. Ezt követően a proinzulin a β-sejteken belül a Golgi apparátusba kerül, ahol megindul a C-peptid polipeptid láncból történő kihasítása, amely a szekréciós granulumokban folytatódik, fejeződik be. A proteolítikus folyamat végén a C peptid és az inzulinláncok csatlakozásánál 2-2 bázikus dipeptid kihasad és így a C peptid kiválik az inzulin molekulából, de továbbra is együtt tárolódnak a szekréciós granulumokban. Itt az inzulin cink ionokkal hexamer kristályokat alkot, amely megakadályozza a további proteolízist. Stimulus hatására a két peptid ekvimoláris arányban jut a keringésbe. Normális körülmények között az elválasztott hormon 90-95%-a inzulin (és C-peptid) és mindössze 5-10%-a nem konvertált proinzulin. Az erőltetett inzulin bioszintézis és kibocsátás során, amikor nincs elegendő idő arra, hogy a proteolítikus folyamatok tökéletesen végbemenjenek, a keringésbe jutó hormon akár 20-80%-a is proinzulin lehet. A glukagon a Langerhans szigetek α-sejtjei által termelt 29 aminosavból álló poli-peptid. A két hormon egymással ellentétes, az inzulin a vércukorszint csökkentésében, a glukagon pedig annak emelésében játszik fontos szerepet ábra - A GLUT4 transzporterek inzulin hatásra történő plazmamembránba helyeződése Az inzulin legfontosabb vércukorszint csökkentő hatása abban nyilvánul meg, hogy elősegíti a sejtek glükóz felvételét. A glükóz másodlagos aktív transzporttal kerül a bélhámsejtekbe és szintén ezzel a mechanizmussal történik a vesetubulusokban a visszaszívódása. A többi sejtünkbe passzív transzporttal kerül be a GLUT család közvetítésével. A család 14 tagját írták le, ezek közül ötöt karakterizáltak részletesen. GLUT 1 található a vörösvértestben, agyban, izomban, zsírszövetben működése nem inzulinfüggő. GLUT 2 található a májsejtekben, pancreas β-sejtekben, vesében, a vékonybél hámsejtek bazális oldalán, nagy kapacitású, kis affinitású (magas K m és V m érték jellemzi) transzporter. GLUT 3 található az idegsejtekben, kis kapacitású, nagy affinitású (alacsony K m és V m érték jellemzi). GLUT 4 található az izom, zsírszövetben, inzulindependens. Így a vércukorszint szabályozása szempontjából ez utóbbi érdemli a legnagyobb figyelmet. Nyugalmi állapotban (alacsony inzulinszint mellett) a GLUT 4 transzporterek csak mintegy 10%-a található a sejtek plazmamembránjában, azonban inzulin hatására 2-3 perc alatt az intracelluláris membránvezikulák a plazmamembránhoz vándorolnak, összeolvadnak azzal, így a GLUT 4 transzporterek a plazmamembránba helyeződnek (7.1. ábra) ábra - Az inzulin jelpálya. ntbiemesvze/thcckz70eai/aaaaaaaaauu/xyiwprc0qum/s1600/insulin_rece ptor.jpg 86

97 A diabetes mellitus laboratóriumi vizsgálata A rendkívül összetett inzulin jelátviteli útvonal (7.2. ábra) csak egyik eleme a GLUT 4 transzporterek plazmamembránba helyeződése, az inzulin csökkenti a sejtben a camp szintet, aktiválja a glikogén-szintáz foszfatázt, ezáltal előtérbe kerül a glikogén felépítés folyamata. A glukokináz, a foszfofruktokináz I és a piruvát kináz aktiválása révén fokozza a glukóz glikolízis során történő lebontását. Ezen kívül fokozza a glikolízis végtermék piruvát Ac-KoA-vá történő átalakítását a piruvát-dehidrogenáz defoszforilációja révén. A glukagonnak, ezzel szemben pont ellentétes a hatása, növeli a celluláris camp szintet, aktiválja a glikogén glükózzá történő lebontását, illetve a glükóz glukoneogenezis során történő felépítését. Az inzulin szénhidrát anyagcserére kifejtett hatásán kívül a zsír és fehérje anyagcserére is jelentős hatást gyakorol. Fokozza a zsírsav, a triglicerid és a koleszterin szintézisét, illetve ugyanezen anyagok lebontását gátolja. A zsírsavszintézis egyrészt a fokozódó Ac-KoA-karboxiláz aktivitás (malonil-koa keletkezése), másrészt a korábban említett piruvát-dehidrogenáz aktivitás fokozódásának következménye. A zsírsavoxidáció gátlása főleg a mitokondriumok belső membránjában található karnitin-palmitoil-transzferáz-i aktivitás csökkenése miatt jön létre. A triglicerid szintézis növekedése a glicerin-foszfát észteresítésének fokozása révén alakul ki, elsősorban a zsírsejtekben. A lipolítikus enzimek foszforilációjának csökkentése révén (camp dependens protein kináz aktivitásának csökkenése miatt) az inzulin gátolja a zsírbontást. A koleszterinszintézis növekedése a HMG-KoA-reduktáz aktiválásának következtében alakul ki. Ennek révén érvényesül az inzulin ketontest képződést csökkentő hatása is. Az inzulin a fehérje anyagcsere esetében is egyértelműen anabolikus hatással rendelkezik I. típusú diabetes mellitus A diabétesz ezen altípusát korábban inzulin dependens (IDDM), vagy fiatalkori (juvenilis) diabetes mellitusnak is hívták. A diabéteszben szenvedők körülbelül 5-10%-a tartozik ebbe a csoportba. A betegek nagy többsége 87

98 A diabetes mellitus laboratóriumi vizsgálata (~75%-a) fiatalabb, mint 30 éves a betegség kialakulásakor. A betegség klasszikus tünetekkel indul, mint a 1. poliuria (nagy mennyiségű vizelet ürítése), 2. polidipsia (szomjúság, nagy mennyiségű folyadék fogyasztása), 3. polifágia (nagy mennyiségű táplálék fogyasztása), 4. fogyás. Gyakran előforduló tünetek még az altesti viszketés, piogén bőrinfekciók, nőknél kezelés hatására sem múló fluor, acetonos lehelet. A tünetek mindegyikének hátterében az inzulintermelő β-sejtek elpusztulása következtében kialakuló inzulinhiány, illetve a következményes hiperglikémia (magas vércukorszint) áll. A következőkben röviden szeretnénk ismertetni a pankreász endokrin funkcióit, az inzulintermelő β-sejtek pusztulásának folyamatát, illetve az inzulin anyagcserében betöltött szerepét, amelynek kiesése a fent ismertetett tünetek kialakulásához vezet Az I-es típusú diabétesz tüneteinek háttere Az inzulin szintézisét, szerkezetét, biokémiai funkcióját ismertető fejezet után térjünk vissza az I. típusú diabétesz ismertetéséhez. Most már kitűnően megérthetjük miért alakulnak ki a klasszikus és gyakori tünetek: 1. poliuria: A nagy mennyiségű vizelet ürítése az inzulin hiányában nagy mennyiségben a vérben maradó glükóz következménye, hisz ~10mM-es vércukorkoncentráció felett elérjük a vesetubulus glükóz transzporterek telíthetőségét. A vizeletbe nagy mennyiségű glükóz kerül, a glükóz, mint vízben kitűnően oldódó anyag (jó ozmotikum), nagy mennyiségű vizet visz magával. 2. polidipsia (szomjúság, nagy mennyiségű folyadék fogyasztása): A nagy mennyiségű folyadékveszteséget pótolni kell ezért lesz szomjas és fogyaszt nagy mennyiségű folyadékot a hiperglikémiás beteg. 3. polifágia (nagy mennyiségű táplálék fogyasztása): Az a furcsa paradox helyzet áll elő, hogy bár a vér cukorkoncentrációja igen magas, a cukor inzulin hiányában nem tud a (zsír és izom) sejtekbe jutni, mivel az inzulindependens GLUT 4 transzporterek a sejtek belsejében maradnak. A sejtek tehát a magas vércukorszint ellenére éheznek és éhezési programot indítanak el, aminek fokozott zsírsavlebontás és ketontest termelés lesz a következménye (7.3. ábra, 7.4. ábra) ábra - A betegek így nagyon lefogynak. A rendkívül nagy mennyiségben keletkezett vízoldható ketontestek (vérszint: 5-20 mm) pedig filtrálódásuk során még több vizet visznek magukkal, tovább fokozva a szervezet kiszáradásának veszélyét. 88

99 A diabetes mellitus laboratóriumi vizsgálata A betegek súlyos esetben kómába eshetnek lévén az agy igen érzékeny az ozmotikus egyensúly felborulására. A savas ph értékű ketontestek ketoacidózis kialakulásához vezetnek. A gyakran előforduló altesti viszketés, piogén bőrinfekciók, nőknél kezelés hatására sem múló fluor a bőr és a nyálkahártya felszínén megjelenő nagy mennyiségű cukor hatására kialakuló bakteriális és gombás fertőzések következménye Az I-es típusú diabétesz patogenezise A legtöbb esetben egy T sejt közvetítette autoimmun β-sejt károsodás áll az I-es típusú diabétesz hátterében. Az α, δ és más szigetsejtek megtartottak, nem érintettek. A szigetsejtek mononukleáris sejtekkel infiltráltak. Az autoimmun folyamat hónapokkal, évekkel a klinkai kórkép megjelenése előtt elkezdődik, azonban, amíg a β- sejtek 80-90%-a el nem pusztul, addig a tipikus tünetek nem fejlődnek ki. A keringésben jelenlévő autoantitestek jó markerei a β-sejtes autoimmunitásnak. A vérben a következő antitestek szoktak hónapokkal, évekkel a betegség manifesztálódása előtt, az autoimmun folyamat elindulásakor megjelenni: 1. szigetsejt ellenes antitestek (ICA: islet cell cytoplasmic antibodies), 2. inzulin autoantitestek, 3. glutamát dekarboxiláz antitestek (GAD), 4. két inzulinoma-asszociált antigén (IA-2A és IA-2β), ezek két tirozin-foszfatáz ellen termelődött antitestek ábra - A betegségre való hajlam valamilyen mértékben örökölhető, azonban az öröklődés módja rendkívül összetett és mind a mai napig nem teljesen felderített. A HLA rendszer bizonyos génjei szerepelnek a diabéteszre hajlamosító gének között, azonban ezen gén konstellációk igen sok nem diabéteszes egyénben is előfordulnak. Az örökletes komponens erősségére jellemző, hogy az I-es típusú diabéteszes emberek mindössze 10%-ának van diabétesszel érintett első fokú rokona. A betegség kiváltásában szerepet játszó környezeti faktorok közül említést érdemel az anyatejes táplálás időtartama (minél hosszabb, annál kisebb az esélye), a nitrozamin tartalmú táplálékok fogyasztása, számos vírusinfekció (pl.: rubeola, mumpsz, coxsackie B), tehéntej fogyasztása (csecsemőkorban). A késői expozíciós tényezők közül említést érdemel a pubertás korban felgyorsult növekedés következtében megnövekedő perifériális inzulinigény II-es típusú diabétesz A korábban nem inzulindependens diabetes mellitus (NIDDM) néven ismert kórforma teszi ki a diabéteszes megbetegedések döntő részét, mintegy 90%-át. A betegek tünetszegények, gyakran tünetmentesek, nem 89

100 A diabetes mellitus laboratóriumi vizsgálata érzékenyek ketózisra és inzulin megvonásra ketoacidózis nem fejlődik ki náluk. Ahogy korábban megjegyeztük már a betegek inzulinszintje a referencia tartományon belül szokott lenni, amennyiben eltér attól, igen gyakran magasabb. A betegséget nem az inzulin abszolút hiánya váltja ki, hanem a csökkent mértékű inzulinhatás. A betegek úgy nevezett inzulinrezisztenciában, relatív inzulinhiányban szenvednek. Igen gyakran elhízottak (az elhízás inzulinrezisztenciához vezet) és már maga a testsúlycsökkentés rendezheti a szénhidrát anyagcseréjüket, normalizálhatja a vércukor szintjüket. Míg az I-es típusú diabétesz, az abszolút inzulinhiányból fakadóan kizárólag külsődleges forrásból származó inzulin bejuttatásával kezelhető, addig a II-es típusú diabétesz esetében több lehetőség is fennállhat: 1. a már említett testsúlycsökkenés normalizálhatja az inzulinrezisztenciát, 2. szükség lehet diéta bevezetésére, 3. orális antidiabetikum szedésére, 4. inzulin adagolására (az I-es típusú diabéteszhez hasonlóan). A legtöbb beteg 40 évesnél idősebb a betegség jelentkezésekor, azonban az egyre fiatalabb korban bekövetkező és egyre jelentősebb mértékű elhízással (és mozgásszegény életvitellel) már megjelent a fiatalabbak, sőt a gyerekek között is. A kifejlődő és hosszú időn keresztül fennálló inzulinrezisztencia előbb-utóbb β-sejt diszfunkcióhoz vezethet, amikor a β-sejtek már nem képesek az inzulinrezisztencia következtében megnövekedett inzulinigénnyel lépést tartani. Így a kezdeti relatív inzulinhiány a későbbiek során abszolút inzulinhiánnyá alakulhat át. A II-es típusú diabétesz egy rendkívül heterogén betegség, amely semmiképpen sem vezethető vissza egyetlen kiváltó okra. A betegség kialakulásában mind örökletes, mind környezeti faktorok szerepet játszanak. Ahogy láttuk az inzulinrezisztencia, a keringésben jelenlevő normál mennyiségű inzulinra adott csökkent válaszreakció a betegség központi problémája. Fontos kiemelnünk az elhízás hatását. Minden túlsúlyos ember inzulinrezisztens! A heterogén, több komponensű háttér és a II-es típusú diabéteszre jellemző szénhidrát anyagcserezavarhoz társult, lipid anyagcserezavar miatt újabban komplex metabolikus szindrómáról, vagy X- szindrómáról szoktunk beszélni. A metabolikus X-szindrómában megfigyelhető 1. az inzulinrezisztencia, 2. hiperinzulinémia, 3. elhízás, 4. diszlipidémia (magas triglicerid, alacsony HDL koleszterinszint) 5. magas vérnyomás. Az inzulinrezisztencia következtében megnövekedett inzulinigény hatalmas nyomást helyez a β-sejtekre, amely előbb-utóbb progresszív β-sejt funkcióvesztéshez vezet, ez pedig éhomi hiperglikémiát von maga után. A legfontosabb defektus a glükóz kiváltotta inzulin felszabadulás eltűnése lesz. A hiperglikémia gyakorlatilag érzéketlenné teszi a β-sejteket a glükóz stimulusra. Az inzulinszekréció elveszti pulzáló karakterét. A hiperglikémia következtében kialakult állandó fokozott mértékű inzulinszekréció következtében a szekretált prohormon, proinzulin mennyisége fog dominálni, az inzulinhoz képest A II-es típusú diabetes mellitus patogenezise A II-es típusi diabétesz kialakulásában igen nagy hangsúlyt kap a genetikai háttér. Az egypetéjű ikervizsgálatokban a konkordancia aránya közel 100%-os volt, míg az I-es típus esetében ez mindössze 30% körül mozgott. Egy túlsúlyos egyénben 10-szer nagyobb a II-es típusú diabétesz kialakulásának valószínűsége, ha volt a szülei között II-es típusú diabéteszes mint egy olyan ugyanolyan mértékben elhízott egyénben, akinek nem volt a szülei között II-es típusú diabéteszes. A betegség poligénes, így öröklésmenete szinte kiszámíthatatlan. A környezeti faktorok közül ki kell emelnünk a táplálkozás és a mozgás szerepét. Egyértelmű összefüggés van az elhízás és a II-es típusú diabetes mellitus kialakulása között. Habár azt érdemes megjegyeznünk, hogy a diabéteszesek 60-80%-a elhízott, mégis csak az elhízott emberek 15%-a diabéteszes. Viszont az is tény, hogy minden elhízott ember inzulin rezisztens és hiperinzulinémiás. Fontos megjegyezni, hogy az elhízás időtartama és módja is fontos tényező (az alma típusú veszélyes). Ugyanakkor inverz összefüggés van a mozgás és a II-es típusú diabétesz előfordulása között. Ennek hátterében a mozgás inzulinérzékenyítő hatása áll Gesztációs diabetes mellitus A cukorbetegség azon típusa, amely a terhesség során kezdődik, vagy annak kapcsán fedezik fel. Oka részben a gesztáció során egyre fokozódó kontrainzuláris hormonelválasztás következtében kialakuló inzulinrezisztencia. Azokban a terhes nőkben, akikben az inzulintermelés nem fedezi a megnövekedett inzulinszükségletet, szénhidrát anyagcserezavar jelenhet meg. A betegek egy része a szülést követően egészséges anyagcseréjű lesz, a kisebb része cukorbeteg marad. A normalizálódott anyagcseréjű gesztációs diabéteszes nők között viszont nagyobb arányban fejlődik ki a későbbiek során II-es típusú diabétesz. 90

101 A diabetes mellitus laboratóriumi vizsgálata 7.2. A diabetes mellitus diagnosztikája, differenciáldiagnosztikájuk Láttuk, hogy az egyes diabétesz típusok meglehetősen különböző patogenezissel és klinikai tünetekkel rendelkeznek, azonban mindegyik esetben biztosan van egy közös vonás: a magas vércukorszint, a hiperglikémia. Így a diagnosztika kapcsán elsőként a különböző vércukor meghatározási eljárásokat kell számba vennünk Glukóz meghatározások Az 1960-as években használt Hagedorn-Jensen és az 1970-es években alkalmazott O-toluidines eljárásnak maximum történelmi jelentősége van, így nem is foglalkozunk velük. Az es évektől kizárólag a specifikus és érzékeny enzimes módszereket alkalmazzák a vércukorszint meghatározására. Glukóz-oxidáz-peroxidáz (GOD-POD) A reagensben található flavinenzim, glükóz-oxidáz glükonsavvá oxidálja a plazma glükóz tartalmát a légköri oxigén felhasználásával. Az enzim működése során a szubsztráttal megegyező mennyiségű H 2O 2 képződik (7.5. ábra). A glükóz meghatározás során, tulajdonképpen az ily módon melléktermékként keletkező hidrogénperoxid mennyiségét határozzuk meg ábra - A vércukorszint meghatározása glükóz-oxidáz enzimmel. A keletkezett hidrogén-peroxidot egy másik, szintén a reagens oldatban található, enzim a peroxidáz vízre és atomos oxigénre bontja (7.6. ábra) ábra - A glükóz-oxidáz enzim által generált peroxidáz bontása peroxidázzal, valamint a keletkezett nascens oxigén detektálása Trinder-reakció segítségével. 91

102 A diabetes mellitus laboratóriumi vizsgálata A hidrogén-peroxid bontásakor keletkező atomos oxigén meghatározására kétféle indikátorreakció terjedt el. Az egyik a vizzel glükóz meghatározás során már ismertetett jodid jóddá oxidálása, a másik a Trinder reakció. A Trinder reakcióban atomos oxigén jelenlétében a fenol és 4-aminofenazon vöröses kininoimin vegyületté egyesül (7.6. ábra). A cukorszint így egyszerű kolorimetriás módszerrel meghatározható. Jelenleg mind a klinikai laboratóriumokban, mind a tesztcsíkokkal működő point of care készülékek a GOD-POD módszer szerint határozzák meg a vércukorértéket. Hexokináz Az etalon, referenciamódszer azonban a hexokináz enzimmel történő glükóz meghatározás. A módszer lényege, hogy első lépésben a glükózt hexokináz katalizálta folyamatban ATP felhasználásával glükóz-6-foszfáttá alakítjuk (Ez a lépés a glikolízis első lépése.) Majd a második reakció során glükóz-6-foszfát dehidrogenáz segítségével 6-foszfoglükono-d-laktonná oxidáljuk, miközben ekvimoláris mennyiségű NADPH képződik (a NADP redukciójával). Mind a két lépés ekvimoláris a keletkező NADPH mennyisége (a redukció mértéke) pedig igen pontosan nyomon követhető 340 nm-en történő fotometrálással (7.7. ábra) ábra - Vércukor meghatározása hexokináz segítségével Orális glukóz tolerancia teszt (OGTT) Magas szénhidráttartalmú táplálék elfogyasztását követően a vércukorszint fiziológiásan is emelkedik, az emelkedő vércukorszint fokozott inzulinszekréciót vált ki, ezt követően az inzulinhatásnak köszönhetően a gyomorürüléssel párhuzamosan hozzávetőlegesen 2-3 óra elteltével a vércukorszint visszaáll az éhomi szintre. A relatív inzulin hiány első megnyilvánulása szokott lenni, hogy ez a folyamat lelassul, csökkent szénhidrát, vagy csökkent glükóz tolerancia (IGT: impaired glucose tolerance) alakul ki. Az orális glükóz tolerancia teszt során a táplálkozást jól definiált körülmények között modellezzük. A szénhidrátot glükóz oldat formájában juttatjuk a szervezetbe, így nincs szükség emésztésre. Fontos megjegyeznünk, hogy nem a már diagnosztizált, manifeszt diabétesz kimutatására szolgál. Manifeszt diabéteszes emberen tilos az OGTT elvégzése. A vizsgálat sikere igen erősen attól függ, hogy mennyire sikerül a vizsgálat körülményeit sztenderdizálni: 1. Nem áll fenn acidózis, ketoacidózis, lázzal járó betegség, hipokalémia, hipomagnézia, gyomor-béltraktus, májbetegség (hasmenés, ismert felszívódási zavar, ikterusz, gyógyuló hepatitisz), menstruáció (női beteg esetében) 2. Előkészítés: minden glükózanyagcserét befolyásoló gyógyszert el kell hagyni a kezelés előtt egy héttel: szteroidok, három nappal: nem-szteroid gyulladás gátlók, diuretikumok. 3. Előző este már ne étkezzen, de legalább 12 órával a vizsgálat megkezdése előtt. Hívjuk fel pl. a cukros kávé, tea és más szénhidráttartalmú ételek, italok fogyasztásának elkerülésére is a figyelmet. A vizsgálat menete: 1. Éhgyomri vérvétel, ebből vércukor meghatározása 2. A betegnek 75 g glükózt tartalmazó oldatot adunk, amelyet egyszerre fogyaszt el (gyerekeknél 1.75 g glükóz/ttkg). 92

103 A diabetes mellitus laboratóriumi vizsgálata 3. Vérvétel és vércukorszint meghatározás 120 perccel a glükóz oldat elfogyasztását követően. A beteg ez alatt az idő alatt nem vehet magához ételt, ital (víz kivételével). Érdemes megkérni a beteget, hogy lehetőleg maradjon nyugalomban, pl. olvasson, de semmiképpen se intézze a dolgait. Az eredmények értékelése az ábrának megfelelően történik ábra - Orális glükóz tolerancia teszt lehetséges eredményei Amennyiben 2 óra (120 perc) elteltével a vércukor értéke meghaladja a 11.1 mm-os értéket, az illetőt cukorbetegnek tekinthetjük. Amennyiben ez az érték mm közé esik, akkor csökkent glükóztoleranciáról beszélhetünk (7.8. ábra) Inzulinszint meghatározás Az inzulin több szempontból úttörő molekula. Elsőként ezen polipeptid szekvenciáját határozta meg Frederick Sanger 1953-ban (Nobel-díj 1958-ban), elsőként az inzulin térszerkezetét határozták meg (Dorothy Hodgkin, Nobel díj 1964-ben) és elsőként ezt a hormont határozta meg Yallow és Berson kompetitív radioimmunassay segítségével 1959-ben (Nobel díj Roslyn Yallow számára 1977-ben). Ez lehetővé tette a két fő diabétesz forma az I-es és a II-es típus elkülönítését. Napjainkra a β-sejtek inzulintermelését a C-peptid mennyiségével határozzuk meg, így az inzulinszint meghatározása az inzulin túltermeléses állapotok (inzulinómák) megfigyelésére szűkült be C-peptid meghatározás Klinikai jelentőségét az adja, hogy vérszintjének mérésével a β-sejt működés olyan állapotokban is jól megítélhető, amikor az inzulin-assay (legtöbbször inzulinkezelés miatt) nem használható. A C-peptid meghatározását a vérben lévő inzulin és inzulinantitestek nem zavarják. Elvégezhető akár vizeletből is (a C- peptid kis molekula lévén szabadon filtrálódik) a 24 órás vizelettel kiválasztott C-peptid mennyisége jól korrelál az integrált napközi szérumértékkel Glikált szérumfehérjék, hemoglobim A 1c A glikáció a cukrok és a fehérjék primer amino csoportjai között létrejövő reakció. A folyamathoz enzimre nincs szükség, a kapcsolódás a fehérje teljes szintézisét követően, poszttranszlációsan jön létre. A glikáció minden 93

104 A diabetes mellitus laboratóriumi vizsgálata emberben (a nem cukorbetegekben is) végbemegy, hisz minden ember vére tartalmaz glükózt. A cukorbetegekben azonban sokkal dominánsabban jelentkezik, mivel az átlagos vércukorszintjük magasabb a normálisnál. A glikáció megfigyelhető az inzulindependens sejtekben, a sejtfelszíni fehérjestruktúrákban, a keringő fehérjékben és a különböző szövetek szerkezeti fehérjéiben. A glikációnak két formája különíthető el, az érintett fehérje élettartamától, metabolizmusától függően. A korai glikáció azokban a fehérjékben figyelhető meg, amelyek életideje rövidebb, annak tartama hetekre tehető. A nem enzimes glikáció során először a glükóz és a fehérjék szabad amino csoprotjai között az aldimin kötést tartalmazó, labilis Schiff bázis alakul ki (7.9. ábra). Hosszabb idő (néhány hét) alatt egy lassabb izomerizáció következik be, amelynek eredményeképpen stabil, de mégsem teljesen irreverzibilis szerkezetű vegyület, a ketoamin kötést tartalmazó, Amadori termék jön létre (7.9. ábra) ábra - Korai glikáció, Amadori termékek képződése Hemoglobim A 1c: A hemoglobin korai glikációs termékének, a hemoglobim A 1c-nek fontos gyakorlati jelentősége van az ábrán látható Amadori átrendeződés ütemére utal az, hogy a k 2 értéke a k 1 1.6%-nak felel meg. A hetek alatt zajló folyamat végül egyensúlyi állapotba jut. Az ekkor mért glikációs termék értéke a megelőző hetek biokémiai folyamatait összesítve tükrözi, az a magyarázata annak, hogy a hemoglobim A 1c értéke a korábbi kb 1-2 hónapos anyagcsere helyzetéről (vércukor értékéről) ad felvilágosítást. A rövidebb féléletidejű albumin glikációs terméke a szérum fruktózamin, pontosan a rövidebb féléletidő következtében a vércukor megelőző 1-3 heti átlagos értékéről ad információt. Ezért a Diabetes Társaság ajánlására ez utóbbit már nem határozzák meg széles körben, azonban hemoglobinopátiák pl. thalassemia esetében viszont csak a fruktózamin használható, mert a HbA 1c fals alacsony eredményt ad. A hemoglobim A 1c meghatározását az automaták HPLC-vel, vagy affinitás kromatográfiával végzik ábra - Késői glikációs termékek képződése 94

105 A diabetes mellitus laboratóriumi vizsgálata Késői glikációs végtermékek: A hosszú életidejű szerkezeti fehérjékben (pl. kollagén, krisztallin, mielin) a glikáció eredményeként létrejött Amadori termékek további áta-lakulásokon mennek keresztül. Az igen lassan zajló folyamatok (átrendeződés, dehidratáció, keresztkötések kialakulása) eredményeképpen egy nagyon heterogén vegyületcsoport a késői glikációs végtermékek (advanced glycation endproducts: AGE) jönnek létre (7.10. ábra). A poszt-amadori folyamatok lassúak és irreverzibilisek, ennek következtében az AGE mennyisége hosszú diabétesz tartam és magas vércukor értékek esetén felszaporodhat. Habár az AGE vegyületek csoportja rendkívül heterogén és kémiai szerkezetük nehéz vizsgálhatóságuk miatt kevésbé ismert, az általánosan elfogadott, hogy az AGE-k egyik hatása a fehérjék keresztkötése, amely akkor jön létre, amikor egy már glikált fehérje reakcióba lép egy másik fehérjével. Diabéteszben, azért van nagy jelentősége, mert a késői glikáció azokat a fehérjéket érinti, amelyeknek szerepük lehet a cukorbetegség késői szövődményeinek kialakulásában. 95

106 8. fejezet - Lipid anyagcsere, szérum lipidek laboratóriumi vizsgálata A fejezet elején célszerű definiálni milyen anyagok tartoznak a lipidek közé. A vegyületcsoport rendkívül heterogén, de a definíció meglehetősen egyszerűen hangzik, lényegében azok az anyagok, amelyek vízben nem, csak apoláros oldószerben oldódnak. Testünkön belül történő szállításuk során pont az apoláros karakterük jelenthet problémát, hiszem a vérplazma egy (hidrofil) vizes oldatnak tekinthető. A lipid szállítás problémaköre, vizsgálata, annak fontossága talán úgy érthető meg a legjobban, ha nyomon követjük a lipidek útját Lipidek emésztése, felszívódása A lipidek (is) a táplálkozás során jutnak szervezetünkbe. A kiegyensúlyozott étrend gyenge felét (45-50%-át) a szénhidrátok, a jó harmadát (35-40%-át) a zsírok, a bő tizedét (10-15%) a fehérjék teszik ki. Tehát az étrend bő harmadát alkotják a lipidek. Ezen belül a legjelentősebb részt (~90%) a trigliceridek (8.1. ábra) teszik ki, a maradékon osztozik a koleszterin (8.2. ábra), koleszterin-észterek, foszfolipidek (8.3. ábra), zsírsavak (8.1. ábra) ábra - A triglicerid és alkotói: glicerin és zsírsav ábra - A koleszterin. 96

107 Lipid anyagcsere, szérum lipidek laboratóriumi vizsgálata 8.3. ábra - A foszfolipidek. 97

108 Lipid anyagcsere, szérum lipidek laboratóriumi vizsgálata A lipid tartalmú táplálékot elfogyasztva a lipid komponenseket a lipázok valamilyen szinten elkezdik a szájüregben emészteni, amely folyamat a gyomorban is folytatódik. Meglehetősen jelentéktelen mértékű a gyomorban, vagy a szájüregben zajló lipid emésztés. A tényleges emésztés a vékonybélben történik, ahol az epesavak emulgeálják a lipideket, így az emésztés felülete jelentős mértékben megnövekszik. A gyomortartalom bélbe történő jutása kolecisztokinin és szekretin elválasztását váltja ki. Hatásukra lipáz és kis mértékben specifikus észterázok jutnak a hasnyálmirigyből a vékonybélbe, amelyek elkezdik a lipidek emésztését. A hasnyálmirigy lipázt a kolipáz, horgonyozza le a hidrofób-hidrofil határfelületen, a vizes közeg és a zsírcseppecskék határfelületén. A lipáz a glicerin 1-es és 3-as C atomján található OH csoportjairól hidrolizálja le a zsírsavakat, így 2-monoglicerid és zsírsavak keletkeznek (8.4. ábra) ábra - A trigliceridek emésztése. 98

109 Lipid anyagcsere, szérum lipidek laboratóriumi vizsgálata A foszfolipideket bontásáért a foszfolipiáz A 2 felelős. Az enzim nem aktív, előfor-mában szintetizálódik, hiszen a sejtmembránjaink is meglehetősen nagy mennyiségű foszfolipidet tartalmaznak. Hasonlóan a fehérjék emésztéséért felelős enzimekhez, ez is a bélben aktiválódik. A foszfolipáz A 2 tripszin hatására alakul aktív foszfolipázzá. A foszfolipáz katalizálta hidrolízis eredménye lizofoszfatidilkolin és zsírsav (8.5. ábra). Ezt követően az előbbi továbbalakul, egy újabb zsírsavvá és glicerolfoszfokolinná, amely vagy további bontás után felszívódik, vagy a széklettel ürül. Meglehetősen túltervezett a lipid bontó kapacitásunk, normálisan a széklettel nem ürül zsír. Amennyiben mégis zsírt tartalmaz a széklet, az valamilyen hasnyálmirigy, vagy máj rendellenességre utal ábra - A foszfatidil-kolin emésztése. 99

110 Lipid anyagcsere, szérum lipidek laboratóriumi vizsgálata A koleszterin kisebb mennyiségben szabadon, nagyobb részt a hidroxil csoportján hosszú szénláncú karbonsavakkal észteresítve, koleszterin-észterek formájában fordul elő, amelyeket különböző észterázok bontanak koleszterinné és zsírsavakká. A béllumenben a lebontott lipidek az epesavakkal micellákat képeznek, majd felszívódnak a bélhámsejtekbe. A sejt belsejében a hosszú szénláncú zsírsavak észteresítik a 2- monoglicerideket újra triglicerideket alkotva, a koleszterinből is újfent koleszterin-észter képződik Lipidek szállítása A feladat ettől kezdve tehát adott, a plazma vizes közegében nem oldódó lipideket egyrészt a vékonybélből el kell juttatni azokhoz a szervekhez, amelyek zsírok oxidálásával tudnak energiát termelni, illetve a májhoz, ami a központi anyagcsere (így a lipid anyagcsere) központi szerve. A májban szintetizálódó lipideket el kell juttatni a felhasználás helyére. Harmadrészt pedig a zsírszövetből, mint raktárból éhezés során felszabaduló lipideket szintén el kell szállítani lebontásuk helyszínére. A hidrofób lipidek szállítására két stratégia alakult ki: 1. A keringésben a zsírsavak több mint 95%-a trigliceridekben, foszfolipidekben és koleszterin-észterekben található, amelyeket a következőkben részletesen ismertetésre kerülő 2. szállítási stratégia szerint lipoproteinek szállítanak. A keringő zsírsavak néhány százaléka azonban nem észteresített formában és nem 100

111 Lipid anyagcsere, szérum lipidek laboratóriumi vizsgálata lipoproteinekben található. Ezek a szabad zsírsavak, amelyek albuminhoz kötve szállítódnak. (Erre más hidrofób anyag pl. a bilirubin esetén már láttunk példát.). A metabolizmusban a szabad zsírsavak nagyon fontos szerepet játszanak. A zsírszövetekben raktározott trigliceridekből éhezéskor felszabaduló zsírsavak a keringésben szabad zsírsavként jelennek meg. A keringésben a zsírsavak egy kis hányada ténylegesen szabadon, albuminhoz nem kötve van jelen, ami egyensúlyban van az albuminhoz kötött zsírsavval. A szervek a nem kötött zsírsavat veszik fel, ami azonnal pótlódik az albuminhoz kötött zsírsav terhére. Ez újra a szervek rendelkezésére áll. A keringő szabad zsírsavak így nagyon gyorsan a szervek rendelkezésére állnak. A szabad zsírsavak mennyisége a metabolizmus állapotától függ: éhezéskor és erőteljes izommunka során megnő, étkezés után, amikor elegendő glükóz áll rendelkezésre az energiaigény fedezésére, csökken a szabad zsírsav mennyisége. A szabad zsírsavak a szöveti lipidek szintézisére is felhasználhatók. A májba felvett szabad zsírsavak a ketontestek szintézisével pedig az agy számára is fontos energiaforrást jelentenek. Táplálkozást követően tehát a szénhidrátokra bízzuk az energiaellátás szerepét, szénhidrátokból pedig tartalékot képzünk zsírsav formájában, hiszen, ha a szénhidrátokat lebontjuk, abból acetil-koenzima lesz, ebből két C atomos egységenként fel tudnak épülni a zsírsavak. Fordítva ez nem játszódik le jelentős mértékben, lipidekből jelentős mértékben képtelenek vagyunk szénhidrátot, glükózt előállítani. 2. A második szállítási stratégia révén történik a koleszterin, koleszterin-észterek, trigliceridek szállítása. Ezek a hidrofób vegyületek hidrofil felszínű csomagokba lipoproteinekbe pakolódnak. A lipoproteinek általános jellemzője, hogy bennük a hidrofób lipidek egy hidrofil burokba csomagolva és ezáltal a plazma vizes közegétől elválasztva találhatók. A burok részben fehérjéből áll, amelyeket apoproteineknek nevezünk, továbbá foszfolipidekből, amelyek poláros csoportjaikkal a vizes közeg, apoláris csoportjaikkal pedig a lipoprotein belseje felé irányulnak. Ebben a burokban orientáltan foglal helyet a koleszterin, OH csoportjával a foszfolipidek poláros feje felé fordulva. A lipoproteinek belsejében helyezkednek el az apoláris lipidek, a trigliceridek és a koleszterin-észterek (8.6. ábra). Ez a szerkezeti felépítés minden lipoproteinre jellemző. A különböző lipoproteinekben eltérő a lipid és fehérjetartalom. Ennek következtében a sűrűségük (denzitásuk) is különböző, minél magasabb a fehérjetartalom, annál magasabb a sűrűségük. A sűrűségük alapján csoportosítjuk a lipoproteineket: kilomikron, VLDL (very low density lipoprotein), IDL (intermediate density lipoprotein), LDL (low density lipoprotein) és HDL (high density lipoprotein). Az apoproteinek szerepe a lipoproteinek funkcióiban sokrétű: részt vesznek a lipoproteinek szerkezetének kialakításában, felszíni markerként viselkednek, a lipid anyagcserében fontos enzimeket, fehérjéket regulálnak ábra - A lipoproteinek felépítése. Mennyiségileg ugyan nem jelentős, minőségileg viszont annál inkább, hogy a zsíroldható vitaminok is így szállítódnak (pl.: A-, E-vitamin). 101

112 Lipid anyagcsere, szérum lipidek laboratóriumi vizsgálata Most pedig térjünk vissza a bélhámsejtekbe felszívódott és ott újraszintetizált lipidekhez (8.7. ábra), kövessük nyomon szervezetünkben további sorsukat. A lipidek a bélhámsejtekbe jutva kilomikronba csomagolódnak (8.7. ábra). A kilomikron a legkisebb sűrűségű lipoprotein. Feladata a lipidek bélhámsejtektől a periféria, a szövetek irányába, illetve (a maradék) májba történő szállítása. Lipid tartalma igen magas, ennek megfelelően a legkisebb sűrűségű lipoprotein. A bélhámsejtekbe felszívódott lipidekből létrejött micella a sima felszínű endoplazmás retikulumban kiegészül a rá jellemző apoproteinekkel (apo B- 48, A-I, A-IV) és létrejön a nascens kilomikron ábra - Lipidek emésztése és felszívódása Ez a nascens kilomikron a bélhámsejteket a nyirok kapillárisok felé hagyja el és a nyirokereken, majd a mellvezetéken keresztül a vénás keringésbe kerül (8.8. ábra). A nascens kilomikron a véráramban érik, újabb apoprotein (apo C-II-t és apo E-t a HDL-től) és lipid komponenseket vesz fel. A zsírszövetben, a szívben, a harántcsíkolt izomban és a laktáló emlőben a kapillárisok egy extracelluláris enzimet tartalmaznak. Ez a lipoprotein-lipáz, amely a kilomikron által szállított triglicerideket glicerinre és zsírsavra bontja (8.8. ábra). Az enzimet a kilomikron apo C-II apoproteinje aktiválja (amely egyben az enzim kofaktora is). A glicerin a keringéssel a májba kerül, ahol részt vehet a glükoneogenezisben, vagy trigliceridek szintézisében. A zsírsavakat a szövetek veszik fel. A triglicerid tartalmának jelentős részét elvesztő kilomikron, nagyobb sűrűségű, kisebb méretű kilomikron maradvánnyá alakul. Apo-E felszíni markere révén a májsejtek felismerik, endocitózissal felveszik (8.8. ábra). Lipid tartalmú táplálék elfogyasztását követően vett vérmintában kilomikron partikulák apró zsírcseppecskék láthatóak. A kilomikron viszonylag rövid időt (5-10 perc) tölt a keringésben. Amennyiben az éhomi vérvétel esetén is opálos (lipémiás) a plazma az valamilyen lipidszállítási, lipidanyagcsere problémára utal. A májból a lipideket a perifériális szövetek irányába a VLDL szállítja (8.9. ábra). A VLDL 10% fehérje, 90% lipid tartalmú lipoprotein. Az általa szállított lipidek döntő része triglicerid. Ezen trigliceridek zsírsav tartalma eredhet 1. a kilomikron maradvánnyal felvett táplálékból származó zsírsavakból, 2. a máj által felvett keringő szabad zsírsavakból, 3. a májban, elsősorban szénhidrátokból, de novo szintetizált zsírsavakból. A VLDL szállítja el a májból a koleszterint is, amely egyrészt a táplálékból származik, másrészt a májsejtek de novo koleszterinszintéziséből ered. A VLDL-ben a koleszterin:triglicerid arány általában 1:4, de koleszterin dús táplálkozás esetén ez 1:1-re is módosulhat. Jellegzetes apoproteinje az apo B100. A VLDL 102

113 Lipid anyagcsere, szérum lipidek laboratóriumi vizsgálata a keringéssel szállítódik a szövetekhez. Itt, a kilomikron transzport során ismertetett, lipoprotein-lipáz lebontja triglicerid tartalmának jelentős részét ábra - A kilomikron életútja. Az ily módon VLDL-ből kialakult IDL koleszterint és kevés maradék trigliceridet tartalmaz (8.9. ábra). További trigiceridet távolít el az IDL-ből a máj, triglicerid-lipáz aktivitása révén és ezáltal az IDL átalakul LDL-lé. Az LDL fő lipid komponense a koleszterin-észter, jellegzetes apoproteinje az apo B-100. Az IDL durván felét felveszik a májsejtek, endocitózissal visszakerülnek az apo E és B receptorokon keresztül (apo E és B100 kötésére képesek). Normál körülmények között nagyon kevés IDL van a keringésben gyors eliminációja, illetve LDL-lé történő átalakulása miatt ábra - Triglicerid és koleszterinszállítása a májból a perifériára. 103

114 Lipid anyagcsere, szérum lipidek laboratóriumi vizsgálata Az LDL a koleszterin fő szállítója, elsősorban koleszterin formájában. Az LDL 2/3-a B-100 receptorokon keresztül hagyja el a keringést. A receptorhoz való dokkolást követi az endocitózis, majd az endocitotikus vezikula fúziója lizoszómákkal, a szabad koleszterin felszabadítása (8.10. ábra). A koleszterin, keringésből történő eltávolításában kiemelt szerepet kap a máj, a bélrendszer, a mellékvese és a gonádok. A koleszterint minden sejt felhasználja sejtmembránjának alkotójaként. Ezen kívül fontos kiinduló vegyület a szteroid hormonok és az epesavak szintézise során. A sejtbe jutott koleszterin gátolja a HMG-KoA reduktázt, a koleszterinszintézis sebesség meghatározó lépését katalizáló enzimet, illetve az LDL (apo B-100) receptor szintézist (8.10. ábra). Ezen túl stimulálja a koleszterin-észterek képződését az acil-koa:koleszterinaciltranszferáz (ACAT) enzim aktivitásának fokozása révén ábra - A koleszterin felvétele apo B 100 receptorokon keresztül. 104

115 Lipid anyagcsere, szérum lipidek laboratóriumi vizsgálata Az LDL receptorok telíthetők, az intracelluláris koleszterinszint emelkedése számukat csökkenti. A keringő monocitákból származó makrofágok koleszterint eltakarító (scavenger) receptoraik révén fel tudják venni az LDL-t. Ez a folyamat felel az LDL kisebb részének (1/3) eltávolításáért normális körülmények között. Ez a folyamat azonban fokozódhat az LDL koncentrációjának növekedésekor, illetve, ha az LDL oxidálódik. Amikor a makrofágok koleszterin-észterrel túlterheltté válnak, átalakulnak habsejtekké, amelyek az érelmeszesedést okozó plakkok tipikus összetevői. Születést követően a plazma LDL koncentráció jóval alacsonyabb, mint felnőttekben. Az LDL koncentráció folyamatosan növekszik, a felnőttekre jellemző szintet pubertás után éri el. Az LDL receptorok számának, vagy működésének elégtelensége súlyos koleszterin anyagcserezavarokhoz vezet. A familiáris hiperkoleszterinémiák mutációk következtében jönnek létre. Leggyakrabban a receptorok szintézisének hiányát okozzák, de megváltozhat a receptorok térszerkezete is (így már nem képesek ellátni feladatukat). Heterozigóta familiáris hiperkoleszterinémia esetében a receptorok száma a normális fele, ennek megfelelően csökken az LDL keringésből történő kivonása. A homozigóta esetben gyakorlatilag hiányoznak a működőképes receptorok. Ebben az esetben egyedüli terápiás lehetőség a mielőbbi máj transzplantáció. A heterozigóta kórforma esetében hatékony terápiás lehetőség a HMG-KoA reduktáz gátlók (8.11. ábra) (statinok), illetve epesav kötő gyanták alkalmazása. A statinok gátolják a sejtek de novo koleszterinszintézisét, amely fokozott keringésből történő felvételt von maga után. Az epesav kötő gyanták megakadályozzák a bélből történő epesav felszívódást, megszakítják enterohepatikus körforgásukat, így azok pótlása kizárólag újabb koleszterinmolekulákból kiinduló bioszintézissel lehetséges (8.12. ábra) ábra - A koleszterin bioszintézise és annak gátlása statinokkal. 105

116 Lipid anyagcsere, szérum lipidek laboratóriumi vizsgálata 106

117 Lipid anyagcsere, szérum lipidek laboratóriumi vizsgálata ábra - A koleszterinszintézis szabályozása, esetleges beavatkozési lehetőségek. A legnagyobb sűrűségű lipoprotein partikula a HDL. Az eddigiekben ismertetettel ellentétes irányú koleszterin transzportot valósít meg (reverz koleszterin transzport). Felveszi a koleszterint az öregedő sejtekből és más lipoproteinekből, elszállítja azt a kilomikron remnanthoz (maradvány), amit felvesz a máj. A HDL tehát, mint egy jó takarító az extrahepatikus sejtekből, a perifériáról, artériafalból, perifériális sejtekből szedi össze a koleszterint, és szállítja a máj irányába (8.13. ábra). Ezért is szokták védő, vagy jó koleszterinnek nevezni, hiszen a reverz irányú koleszterintranszporttal az érelmeszesedés ellen hat (ellentétben az LDL-ben található rossz koleszterinnel ). A HDL membránszerkezete máj, illetve bél eredetű, a naszcens, frissen szintetizált HDL korongszerű, lapos képződmény. Miután összegyűjti a koleszterint az érfalból, szövetekből, ez bekerül ebbe a korongszerű képződménybe, a partikulában az LCAT (lecitin:koleszterin-aciltranszferáz) felelős a koleszterin koleszterin-észterré történő átalakításáért (8.13. ábra). Ahogy azt már korábban megjegyeztük, a koleszterin a lipoprotein partikulában irányítottan helyezkedik el, az OH csoportját kifelé a hidrofil rész felé fordítja, első körben felvételekor tehát a burokban foglal helyet. Miután az LCAT észteresíti a hidroxil csoportját teljesen hidrofóbbá válik és bediffundál a partikula belsejébe. Ennek eredményeként a korongot szétfeszíti, és egy gömbszerű képződmény lesz belőle. A HDL triglicerid tartalmának egy részét, az IDL kialakulásában is szerepet játszó, hepatikus lipáz bontja. Így kialakul egy nagyobb és egy kisebb triglicerid tartalmú HDL alfrakció (HDL2 és HDL3) ábra - Reverz koleszterintranszport, a HDL életútja. 107

118 Lipid anyagcsere, szérum lipidek laboratóriumi vizsgálata Egy kevés HDL2-t a máj (apo A-1 receptora révén) felvesz, azonban a reverz irányú koleszterintranszport állomása a kilomikron maradvány lesz, amelynek a HDL átadja koleszterintartalmának jelentős részét, majd az apo E apoproteinjei révén a májba szállítja azt (8.13. ábra). Röviden tekintsük át a lipidszállítást! A lipidek a bélhámsejtekbe jutva a legkisebb sűrűségű lipoproteinbe a kilomikronba csomagolódnak. A feladata alapvetően a lipidek bélhámsejtektől a periféria (szövetekhez) és a máj irányába (maradék) történő szállítása. A májban szintetizálódott, vagy újraszintetizálódott lipideket a VLDL szállítja a periféria irányába. Ebből triglicerid tartalmának jelentős részét leadva alakul ki az IDL. Az IDL nagyjából fele visszakerül a májba, másik fele pedig LDL-lé alakul. Az LDL által szállított fő lipid komponens a koleszterin, koleszterinészter lesz. A HDL felelős a reverz, a szövetektől a máj irányába mutató koleszterintranszportért (8.14. ábra) ábra - A lipdszállítás összefoglalása. 108

119 Lipid anyagcsere, szérum lipidek laboratóriumi vizsgálata A lipidanyagcsere laboratóriumi diagnosztikája során a következő fő célokat tűzzük ki: a. A partikulák által szállított fő lipidkomponensek (trigliceridek, koleszterin) mennyiségi meghatározása b. Érthető módon kíváncsiak vagyunk, hogy a koleszterin hogyan oszlik meg az LDL és HDL lipoproteinek között. Fontos diagnosztikai értéket hordoz, hogy az érelmeszesedésért felelős, plakképző LDL, vagy a védő funkcióval rendelkező HDL koleszterinből van több Triglicerid szint meghatározása A triglicerid meghatározást a glicerin meghatározására vezetjük vissza. A triglicerideket lipáz segítségével glicerinre és zsírsavakra bontjuk. A glicerint glicerin-kináz segítségével glicerin-3-foszfáttá alakítjuk. Majd a glicenin-foszfátot dihidroxi-aceton-foszfáttá oxidáljuk. Az oxidáció során (a korábban leírt kreatinin, vagy glukóz meghatározáshoz hasonlóan) ekvimoláris mennyiségű hidrogén-peroxid keletkezik, melyet peroxidáz enzimmel vízre és atomos oxigénre bontunk. Az atomos oxigént a korábban ismertetett Trinder-reakcióval határozzuk meg Koleszterin meghatározás A koleszterin meghatározása egyike a legrégebben végzett klinikai laboratóriumi teszteknek. Liebermann, koleszterin meghatározási módszerét 1855-ben publikálta. A ma már csak történelmi érdekességű meghatározás során a mintát, ecetsavanhidridet és tömény kénsavat tartalmazó, erősen nedvszívó reagenssel kezelve intenzív kék színű telítetlen szénhidrogén polimerek keletkeznek. A veszélyes reagensek és a vízmentes közeg igénye miatt ma már nem használatos. A korábban ismertetett triglicerid meghatározáshoz hasonlatosan a minta koleszterintartalmát koleszterinoxidázzal reagáltatva a koleszterin hidroxil csoportja oxo csoporttá oxidálódik miközben ekvimoláris mennyiségben hidrogén-peroxid képződik. Ezt peroxidázzal bontva a koleszterin meghatározása is Trinderreakcióval végezhető (8.15. ábra) ábra - A koleszterin enzimes meghatározása. 109

120 Lipid anyagcsere, szérum lipidek laboratóriumi vizsgálata Az össz koleszterin mennyiségét tehát már megismerhetjük, azonban szükségünk van az egyes lipoprotein frakciók koleszterinszintjének ismeretére is. A lipoproteinek elkülöníthetők eltérő sűrűségük alapján ultracentrifugálással, illetve gélelektroforézissel. Azonban egyik módszer sem alkalmas a klinikai laboratóriumban előforduló nagy mennyiségű minta analízisére. A klinikai laboratóriumban megbízható, könnyen kivitelezhető, jól automatizálható eljárásra van szükség Nagy sűrűségű (HDL) koleszterin meghatározása Az automatizálható direkt HDL koleszterin meghatározása két elven történhet. Az első szerint a plazmához szintetikus polianiont adunk, ami befedi az LDL, VLDL, kilomikron (kis sűrűségű) lipoproteinek felületét és így azokat detergenssel nem lehet disszociálni. Amikor a reakcióelegyhez detergenst adunk, az a koleszterint csak a polianionnal nem fedett HDL-ből szabadítja fel. A mért koleszterin érték a HDL koleszterin. A másik direkt koleszterin meghatározási módszer első lépésében a kis sűrűségű lipoproteineket (kilomikron, VLDL, LDL) megfelelő detergenssel elimináljuk. A szabad és a koleszterin-észteráz hatására szabaddá váló koleszterin, koleszterin-oxidáz hatására (hasonlóan a Trinder reakció első lépéséhez) D4-koleszteronná oxidálódik és H 2O 2 keletkezik. A H 2O 2-t viszont nem peroxidázzal, hanem katalázzal bontjuk el. Ekkor nem keletkezik atomos oxigén, így ez nem hajtja meg a Trinder színreakciót. A módszer második lépésében további detergens hozzáadása révén felszabadítjuk a HDL-ben található koleszterint és azt egy Trinder színreakcióval határozzuk meg. Az első lépésben a flavin enzim (koleszterin-oxidáz) által termelt H 2O 2-t hatástalanító kataláz a második reakciót azért nem zavarja, mert az elegy Na-azidot tartalmaz. Bár mind a kataláz, mind a peroxidáz hemoprotein, így aziddal gátolható a kataláz Na-azid érzékenysége fokozott, viszont a peroxidáz csak 3-4 nagyságrenddel magasabb azid koncentrációval gátolható. Mind a két módszer az ultracentrifugálással és az elektroforézissel szeparált lipoprotein koleszterin meghatározásokhoz igen közeli eredményt szolgáltat Könnyű lipoprotein frakciókban található koleszterin meghatározása Az LDL és VLDL koleszterin meghatározások jelentősége csökken, mivel az esetleges hiperlipoproteinémia osztályba sorolása az érelmeszesedés kockázatának megállapítására a plazma lipidek a HDL koleszterin és az egyes apoproteinek elegendő támpontot adnak. A könnyű lipoproteinekben szállított koleszterin meghatározásának a legegyszerűbb módja, hogy a plazma összkoleszterinből kivonjuk a HDL koleszterin mennyiségét. 110