Compare microsatellite (SSR) analysis of some Vitis sylvestris (GMEL.) accessions of the Szigetköz and Fertő- Hanság National Park.

Átírás

1 Nagy Zóra Györffyné Jahnke Gizella Koltai Gábor Májer János A Szigetközben és a FertőHansági Nemzeti Park területén előforduló ligeti szőlő (Vitis sylvestris GMEL.) genotípusok összehasonlító mikroszatellit (SSR) vizsgálata Compare microsatellite (SSR) analysis of some Vitis sylvestris (GMEL.) accessions of the Szigetköz and Fertő Hanság National Park zoranagy@gmail.com NAIK Szőlészeti és Borászati Kutatóintézet Badacsonyi Kutató Állomás, kutatási referens NAIK Szőlészeti és Borászati Kutatóintézet Badacsonyi Kutató Állomás, tudományos főmunkatárs NyugatMagyarországi Egyetem, Mezőgazdaság és Élelmiszertudományi Kar; Mosonmagyaróvár, tudományos főmunkatárs NAIK Szőlészeti és Borászati Kutatóintézet Badacsonyi Kutató Állomás, tudományos főmunkatárs, mb. igazgató. Bevezetés A termesztett szőlő (Vitis vinifera L) kialakulására több elmélet létezik. DE CANDOLLE () szerint a szőlő őshazája a legnagyobb valószínűség szerint Oroszországnak a transzkaukázusi része lehetett. Az ott kialakult szőlő faj, vagy fajok magvai azután a természetes tényezők hatására (madarak, szél, légáramlatok) még az ember által termesztésbe vonás előtt nagy területen elterjedtek. Később a szőlő az emberi termesztés hatására nagymértékben megváltozott, és egyre nagyobb területeken elterjedt. A vadon termő szőlők ezután a már termesztésbe vont alakok hatására jelentős mértékben átalakultak. A jégkorszak után felmelegedő Eurázsiában a fennmaradt ligeti szőlő (Vitis sylvestris GMEL.) elterjedt egész Európában, s felhatolt egészen Skandinávia déli részéig is. Termését természetes elterjedési területén a negyedidőszakban megjelenő ember kedvelte, gyűjtögette és fogyasztotta. Az i. e. II. évezred elejéről, közepéről származó ásatási leletek között találták meg az első Vitis vinifera L. típusú magvakat ( mmnél hosszabb, fejlett csőrű magvak). Nyugat és dél felé haladva fokozatosan későbbi korokból maradtak fenn Vitis vinifera típusú magleletek. Ez azt bizonyítja, hogy a Vitis sylvestrist a Kaukázuson túlról vonták be a termesztésbe egykor az ősi Ázsia népei. Tőlük vették át később a már Vitis viniferat az ókori nyugatázsiai és az Égeitenger szigetein élő népek, akik továbbterjesztették a Földközitenger északi és déli partvidékein (KOZMA, ). TERPÓ () véleménye szerint a Vitis vinifera L. faj ugyanakkor nem egységes, hanem több eredeti szőlőfaj származéka, fő alapfajai a Vitis sylvestris GMEL. mellett a kétivarú virágú V. hissarica és a V. nuristanica lehetett. TERPÓ () a Vitis sylvestris GMEL. új fajon belüli rendszerét dolgozta ki. Rendszerének lényege, hogy a ligeti szőlőket a levél szőrzet alapján alfajokba, a levél formája alapján, pedig változatokba sorolta. A Vitis vinifera faj földrajziökológiai fajtacsoportjait (convarietas) ezekből a típusokból közvetlenül vagy közvetve vezette le. KOZMA () szerint a természetes evolúció teremtette meg a Vitis sylvestris GMEL. fajt és ebből alakult ki a termesztés hatására a Vitis vinifera L. faj. A kultúrevolúció jelentős foka volt a hímnős virágú szőlő (Vitis vinifera) megjelenése. A legtöbb Vitis faj, köztük a Vitis sylvestris GMEL. is funkcionálisan váltivarú, kétlaki. Ez a váltivarúság a törzsfejlődés során az idegen megporzáshoz való alkalmazkodás folyamatában, a hímnős virág

2 porzó, illetve termőleveleinek a redukciója révén jött létre. A Vitis sylvestris GMEL. hímnős virágú formája rügymutációval jött létre a funkcionálisan hímvirágú egyedeken. A kultúrában megváltozott anyagcserefolyamat válthatta ki a növényeken ezt az ősi szőlőfélékre (Cissites) atavisztikusan visszaütő jelenséget. A Vitis vinifera L. földrajzi fajtacsoportjai tehát valószínűleg nem egyszerre, hanem különböző ligeti szőlő változatokból egymás mellett, illetve egymással kereszteződve alakultak ki a következők szerint: A legkorábban a pontuszi (convar. pontica) fajtacsoport alakult ki Nyugat és KeletGrúziában valamint Kis Ázsiában. Kiindulási formája a helyi ligeti szőlő a Vitis sylvestris GMEL. var. balcanica, Vitis sylvestris GMEL. var. typica (var. sylvestris) lehetett. A keleti (convar orientalis) fajtacsoporton belül a subconvar. caspica az ókori előázsiai szőlőtermesztő államokban jött létre a Kaszpitóval határos területek ligeti szőlőjéből (Vitis sylvestris GMEL. var. abberans). A convar. orientalis subconvar. antasiatica későbbi eredetű. A nyugati (convar. occidentalis) fajták kiindulási formái a helyi ligeti szőlők (Vitis sylvestris) és pontuszi fajták természetes úton létrejött hibridjei (KOZMA, ). Hasonló nézeteket vall TERPÓ () is, aki szerint a Vitis vinifera földrajzi változatcsoportjai az egyes Vitis sylvestris GMEL. változatokból levezethetők. A szőlő genomjának vizsgálatára nemzetközi együttműködés, a GENRES (European Network for Grapevine Genetic Resources Conservation and Characterisation) keretein belül és között indult el Európában a szőlőfajták jellemzése mikroszatellit DNS markerekkel. A kutatási programban mikroszatellit primerpárt határoztak meg és ajánlottak a fajták jellemzésére. Először a Furmint, Merlot, Sultanina, Touriga nacional és a Trebbiano Toscano fajták mikroszatellit profilját határozták meg laboratóriumban. Első lépésként a résztvevő országoknak azt javasolták, hogy a saját őshonos fajtáit, majd az ott előállított új fajtákat jellemezzék az ajánlott primer párokkal. Magyarországon ezt a munkát az FVM SzBKI Pécs a SZIE Genetika és Növénynemesítés Tanszékével együttműködve több mint kárpátmedencei fajta és néhány új fajta esetében elvégezte. januárjában indult, az előző projekt folytatását jelentő európai együttműködés, a GRAPEGEN további DNS mikroszatellit markereket tervez bevonni a kísérletekbe és nagy hangsúlyt kíván helyezni a szőlő géncentruma közelében lévő, még nem Európai Uniós országok ősi fajtáinak jellemzésére. A GRAPEGEN kiemelt feladatként kezeli a Vitis sylvestris GMEL. populációk felkutatását, insitu és exsitu fenntartását, valamint jellemzését molekuláris markerek segítségével. A Vitis sylvestris Gmel. faj védett növényünk. Populációinak felkutatása és megőrzése ezért természetvédelmi szempontból, valamint a biodiverzitás megőrzésének szempontjából is jelentős. Az eddigi elméleti és gyakorlati kutatási eredmények alapján feltételezik, hogy ez a faj egyedül, vagy esetleg más fajokkal kereszteződve lehetett a mai kerti szőlő (Vitis vinifera L.) őse. Vizsgálati eredményeink ezért nagymértékben hozzájárulhatnak a Vitis vinifera L. származásának, valamint a kerti szőlő földrajziökológiai fajtacsoportjainak (convarietas) kialakulásának tisztázásához. Gyakorlati szempontból is fontos lehet a falkutatott egyedek exsitu megőrzése, mivel azok esetlegesen rezisztenciagének forrásaként szolgálhatnak, és a későbbi szőlőnemesítési programokban felhasználhatóvá válhatnak.. Anyag és módszer DNS t vontunk ki szőlőalanyból, Vitis vinifera (L.) fajtából és Vitis sylvestris genotípusból (. táblázat). A szőlőalanyok és a vizsgált Vitis vinifera (L.) fajták a NAIK Szőlészeti és Borászati Kutatóintézetéből, Badacsonyból és a Pannon Egyetem Georgikon Kar cserszegtomaji szőlőültetvényéből származtak. A Vitis sylvestris egyedek a Szigetközből és a Fertő Hansági Nemzeti Parkból kerültek Badacsonyba és exsitu megőrzés szempontjából zöldoltással alanyra lettek oltva. A vizsgálatokhoz szükséges mintákat ban gyűjtöttük.

3 Sorszám Jelölés Fajta neve Genetikai származás Származási hely S Sylvestris B Vitis sylvestris GMEL. S Sylvestris B Vitis sylvestris GMEL. S Sylvestris B Vitis sylvestris GMEL. S Sylvestris B Vitis sylvestris GMEL. S Sylvestris B Vitis sylvestris GMEL. S Sylvestris B Vitis sylvestris GMEL. S Sylvestris B Vitis sylvestris GMEL. S Sylvestris B Vitis sylvestris GMEL. S Sylvestris B Vitis sylvestris GMEL. S Sylvestris B Vitis sylvestris GMEL. S Sylvestris B Vitis sylvestris GMEL. S Sylvestris B Vitis sylvestris GMEL. S Sylvestris B Vitis sylvestris GMEL. S Sylvestris B Vitis sylvestris GMEL. S Sylvestris B Vitis sylvestris GMEL. S Sylvestris B Vitis sylvestris GMEL. S Sylvestris B Vitis sylvestris GMEL. S Sylvestris B Vitis sylvestris GMEL. Badacsony, Hungary (Collected form Szigetköz and FertőHanság National Park) ALHAROS Alháros Vitis sylvestris GMEL. Cserszegtomaj, DORGO Dorgó Vitis sylvestris GMEL. Sarga_ortlibi Sárga ortlibi Vitis vinifera L. Purcsin Purcsin Vitis vinifera L. Budai_goher Budai góhér Vitis vinifera L. Torok _goher Török góhér Vitis vinifera L. Balafant Balafánt Vitis vinifera L. Valtozo_Furmint Változó Furmint Vitis vinifera L. Piros_Furmint Piros furmint Vitis vinifera L. Koverszolo Kövérszőlő Vitis vinifera L. Primitivo Primitivo Vitis vinifera L. Fiano Fiano Vitis vinifera L. N._Mex. V. Novo Mexicana V. riparia x V. candicans Aramon_rup_G Aramon Ganzin N V. vinifera x V. rupestris V._vip._Ggb Riparia Grand glabre V. riparia V._rip._GdM Gloire de Montpellier V. riparia V._rup._FW Fort Worth N V. rupestris V._rup._FW Fort Worth N V. rupestris V._rup._FW Fort Worth N V. rupestris TC Teleki C E V. berlandieri x V. riparia SO TelekiFuhr SO () V. berlandieri x V. riparia BB TelekiKober BB V. berlandieri x V. riparia Táblázat: A vizsgált fajták Hungary Badacsony, Hungary Cserszegtomaj, Hungary

4 DNS kivonás A DNS kivonást a növény nyugalmi állapotában gyűjtött veszző háncs részőből végeztük, melyhez a DNS Plant Mini Kitet (Quiagen) használtuk, a gyártó utasítása szerint. A DNS mennyiségét és minőségét spektrofotométerrel határoztuk meg. A DNS t ng/ml. koncentrációra higítottuk. SSR analízis A mikroszatellit (SSR) vizsgálatokat lókuszban végeztük el (. Táblázat) A lókuszok kiválasztásánál azt vettük figyelembe, hogy köztük ne legyen kapcsoltság, ugyanakkor nagymértékű polimorfizmussal rendelkezzenek. A lókuszok kiválasztásánál figyelembe vettük azt is, hogy mely lókuszokról állnak rendelkezésre saját, hazai és külföldi irodalmi adatok (HALÁSZ et al.,.; SEFC et al.,.; COSTANTINI et al., ;). A PCR reakciókhoz a következő reakcióelegy bizonyult megfelelőnek ( µl):, µl Hot Start Master Mix (Quiagen),. µm forward és reverse primer, és ng templát DNS. A következő hőmérséklet profilt használtuk: () perc Con ; () perc Con, annealing hőmérsékletnél (. Táblázat ) perc, C on perc/ fordulaton ; () perc Con Minden primer pár egy primerjét fluorescensen megjelöltük FAMal (FAM) a DNS lánc végén. A PCR reakcióval kapott fragmensek hosszát a PEApplied Biosystem félautomata DNS szekvenáló készülékkel végztük el. A fragmenshosszokat Gene Scan.o szoftverrel értékeltük ki (Applied Biosystem). Kapcsoltsági csoport a SSR locus név annealing hőmérséklet Kapcsoltsági csoport SSR locus név annealing hőmérséklet A o C G o C VVMD o C VrZag o C VrZag o C F o C C o C VrZag o C D o C H o C G o C NGE o C Scuvv o C VVIM o C E o C akapcsoltsági csoportok ADAMBLONDON et al. () alapján. Táblázat: Vizsgált SSR lókuszok

5 Adatok elemzése A fajták közti genetikai különbségek becslésére az un. Jaccard indexet használtuk (JACCARD, ). A nemzedékeknél a távolság matrix és UPGMA dendogramm szerkesztésére a MolMarker nevű platform független szoftver demo verzióját használtuk.. Eredmények és értékelésük Az SSR analízis eredményei a. táblázatban vannak feltüntetve. Az adatok egyszerűségi mártixxal a Jaccard index segítségével lettek számolva (nincsenek feltüntetve ezek az adatok). A matrix által UPGMA dendogram lett szerkesztve (. ábra). A V. sylvestris, V. vinifera, és az alany fajták négy fő csoportba sorolhatók. Látható, hogy a Vitis sylvestris GMEL. egyedek kivéve Dorgó két elkülönülő csoportot alkot. Az Aramon Genzin N (V. vinifera x V. rupestris) alany a nagyobbik V. sylvestris csoport és V. vinifera csoport között helyezkedik el, ami nem meglepő a fajták hibrid eredetét tekintve. A nagyobbik V. sylvestris csoport közelebb van a Vitis vinifera fajtákhoz, mint az alanyokhoz. Ez azt valószínűsíti, hogy ezek a ligeti szőlők valóban Vitis sylvestrisek. A kisebbik V. sylvestris csoport és a Dorgó hasonlóságot mutatnak az alanyokkal., ami valószínűleg a hibrid eredetükre utal (V. sylvestris x V. ripara). A kapott eredmények pontosításához további genetikai, molekuláris és morfológiai erelmzések szükségesek.. Irodalmi áttekintés ADAMBLODON A. F., ROUX C., CLAUX D., BUTTERLIN G., MERDINOGLU D., THIS P. (): Mapping SSR markers on the Vitis vinifera genome: a tool for grape genetics. Theoretical and Applied Genetics :. COSTANTINI L., GRANDO M. S., FEINGOLD S., ULANOVSKY S., MEJIA N., HINRICHSEN P., DOLIGEZ A, THIS P., CABEZAS J. A., MARTINEZZAPATER J. M. (): Generation of a Common Set of Mapping Markers to Assist Table Grape Breeding American Journal of Enology and Viticulture :. DE CANDOLLE A. (): Termesztett növényeink eredete.. p. Budapest: Királyi Magyar Természettudományi Társulat p. HALÁSZ G., VERES A., KOZMA P., KISS E., BALOGH A., GALLI ZS., SZŐKE A., HOFMANN S., HESZKY L. (): Microsatellite fingerprinting of grapevine (Vitis vinifera L.) varieties of the Carpatihian Basin. Vitis :.

6 KOZMA P. (): Szőlőtermesztés. Budapest: Mez_gazdasági Kiadó,. p. KOZMA P. (): A szőlő és termesztése I. Budapest: Akadémiai Kiadó SCOTT K. D., LEE L. S., DOW T., HENRY R. J. (): Isolation and characterisation of new grape microsatellites. Acta Horticulturae :. SEFC K. M., LOPES M. S., LEFORT F., BOTTA R., ROUBELAKISANGELAKIS K. A., IBAÑEZ J., PEJIC I., WAGNER H. W., GLÖSSL J., STEINKELLNER H. (): Microsatellite variability in grapevine cultivars from different Eurpean regions and evaluation of assignment testing to assess the geographic origin of cultivars. Theoretical and Applied Genetics :. TERPÓ A. (): A kultúrfajok eredete.. p. In: TERPÓ A (szerk.): Növényrendszertan az ökonómbotanika alapjaival I. Budapest: Mezőgazdasági Kiadó THOMAS M. R., SCOTT N. S. (): Microsatellite repeats in grapevine reveal DNA polymorphism when analysed as sequence tagged sites (STSs). Theoretical and Applied Genetics :. Munkánkat az Országos Tudományos és Kutatási Alap (OTKAPD) támogatta.

7 . Ábra: Dendogramm a mikroszatellit vizsgálatok eredményei alapján (Jelölések a. táblázatban). Táblázat: A mikroszatellit (SSR) vizsgálatok eredményei lókuszon ( jelölés hiányzó adat vagy null allél)

8 ID F D G VV MD H VVI M C VrZa g NG E G Scu vv E G VrZa g VVS S S S S S S S S S S S S S S S S S S AL HA RO S DO RG O Sar ga_ ortli bi Pur csin Bud ai_g oher Tor ok _go her Bal afan t Valt ozo _Fu rmi