Tartalomjegyzék FOCUS MEDICINAE

Átírás

1 FOCUS MEDICINAE Felelõs szerkesztõ: Dr. Szolnoky Miklós Fõszerkesztõ: Dr. Karabélyos Csaba Szerkesztõbizottság: Dr. Bencsik Krisztina Prof. Czirják László Dr. Futó Judit Prof. Horváth Örs Péter Dr. Kalmár Ágnes Dr. Mátrai Zoltán Dr. Nemes László Dr. Paál Mária Dr. Pál Katalin Prof. Zeher Margit Szerkesztõbizottság tanácsadó testülete: Prof. Fekete György Prof. Kiss Attila Dr. Kiss István Prof. Komoly Sámuel Prof. Lipták József Prof. Mándi Yvette Prof. Maródi László Prof. Medgyesi György Dr. Mészner Zsófia Dr. M. Tóth Antal Dr. Nagy Kálmán Prof. Pálóczi Katalin Prof. Perner Ferenc Prof. Pénzes István Prof. Péter Ferenc Prof. Romics Imre Prof. Rozgonyi Ferenc Prof. Sas Géza Prof. Schuler Dezsõ Dr. Siklós Pál Prof. Szegedi Gyula Dr. Szita János Prof. Tekeres Miklós Prof. Tímár László Dr. Trestyánszky Zoltán Prof. Tulassay Tivadar Alapító: Biotest Hungaria Kft. Kiadja és a nyomdai munkáért felelõs: Dursusz Bt. Szerkesztõség és levelezési cím: 2045 Törökbálint, Torbágy u. 15/A ISSN: Megjelenik: évente négyszer Elõfizetési díj: évre 2009,- Ft + 5% áfa Tartalomjegyzék Focus Medicinae Genetika, genomika, posztgenomika: múlt, jelen, jövõ 2 /Genetics, genomics, postgenomics: past, present, future/ Dr. Németh Krisztina, Prof. Fekete György Hogyan mûködnek a természetes killersejtek? (Az NK sejtek genomikája) 8 /How does the natural killer cells work? (Genomics of the NK cells)/ Dr. Benczúr Miklós Autoimmunitás: alapmechanizmusok és azok szerepe endokrin betegségekben 17 /Autoimmunity: basic mechanisms and their role in the endocrine diseases/ Dr. Kalmár Ágnes, Dr. Szolnoky Miklós A vércsoportszerológia elmúlt 10 éve 23 /The recent 10 years of the red serology/ Dr. Hoffer Izabella Biomarkerek a procalcitonin szerepe a diagnosztikában 27 /Biomarkers the role of procalcitonin in the diagnostics/ Prof. Molnár Zsolt 1

2 Genetika, genomika, posztgenomika: múlt, jelen, jövõ Genetika, genomika, posztgenomika: múlt, jelen, jövõ Dr. Németh Krisztina, Prof. Fekete György Semmelweis Egyetem, II. sz. Gyermekgyógyászati Klinika, Budapest Összefoglalás: A Human Genom Program mérföldkõ volt a genetika történetében. Lehetõséget adott arra, hogy kilépjünk a klasszikus genetika korszakából és beléphessünk a genomika világába. A genomika, amely a szervezet teljes genomjának szerkezetét vizsgálja, egy egész sor új tudományterület kialakulását tette lehetõvé. Ehhez természetesen szükség volt a laboratóriumi technikák valamint a számítástechnika, illetve a bioinformatika ugrásszerû fejlõdésére is. A farmakogenomika célja a személyre szabott gyógyszeres kezelés kifejlesztése. A komparatív genomika a homológia felhasználásával igyekszik a gének funkcióját meghatározni. A strukturális- és funkcionális genomika a genomban kódolt fehérjemolekulák térszerkezetét vizsgálja, majd a térszerkezethez igyekszik párosítani a funkciót. A populációgenomika feladata az egyes populációk genetikai összetételének, illetve a genetikai összetételt megváltoztató mechanizmusoknak a vizsgálata. A genetikai betegségek gyógyítási módja a jövõben reményeink szerint a hatékony génterápia lesz, amelynek kifejlesztése napjaink nagy kihívása. Miközben még tart a genomika korszaka, már kibontakozóban van a posztgenomika is, amely teljesen új értelmezést ad a genetikai eredetû betegségek kialakulásáról alkotott eddigi elképzeléseinknek. Kulcsszavak: Human Genom Program, microarray, bioinformatika, genomika, génterápia, posztgenomika Summary: The Human Genome Project was a milestone in the history of genetics. It presented the opportunity for crossing over the era of classical genetics into the world of genomics. Genomics as a science of analysing the whole human genome has been promoting a great number of new scientific disciplines. The significant leap of laboratory techniques, as well as computer science and bioinformatics was necessary for this development. The aim of pharmacogenomics lies in the individually tailored pharmaceutical therapy. Comparative genomics has the intention to identify gene functions by using homology studies. Structural and functional genomics are analysing the three-dimensional structures of coded protein molecules, combining construction and action. Treatment of genetic diseases will be the successful gene therapy in the future, and the processing of the necessary methods seems to be an important challenge of our time. Since genomics being still going on, post genomics has been also developing, providing a completely new explanation of the aetiology of hereditary diseases. Key words: Human Genome Project, microarray, bioinformatics, genomics, gene therapy, post-genomics Genomika: Az új korszak kezdete Az 1990-ben kezdõdött Human Genom Program elsõ közvetlen célokat tartalmazó szakasza 1993-tól 1998-ig tartott. Minden kitûzött célját sikerrel elérte, kifejlesztette azokat a technikai lehetõségeket, amelyek az eredetileg évekre tervezett következõ szakaszban lehetõvé tették a teljes humán genom DNS szekveciájának meghatározását (4). Ezt a feladatot, a 3,2 milliárd nukleotid sorrendjének meghatározását azonban jóval korábban, már 2000 júniusára megoldották. Hat ország tizenhat nagy kutatólaboratóriumának több, mint ezeregyszáz biológusa és informatikusa foglalkozott ezzel a páratlanul nagyszabású feladattal. Az eredményekrõl február 15-én a Nature, a következõ napon pedig a Science számolt be mindkettõ különkiadásban. Azóta tehát ismerjük az emberi genom kémiai szerkezeti képletét. Ezzel a munka korántsem fejezõdött be, sõt az igazi, érdemi része csak ezután következett, nevezetesen a DNS-ben kódolt gének azonosítása, mûködésük meghatározása, a gének bekapcsolási sorrendjének, a kapcsolatok rendszerének feltárása, valamint az, hogy megértsük a nem kódoló szakaszok funkcióját. A végül 2003-ban lezárult vizsgálatok a következõ eredményekkel gazdagították a tudományt. Megállapí- tották, hogy 99,9%-os az egyezés a nukleotid bázisokban az összes emberben, és, hogy a korábbi becslésekkel ellentétben amelyek ezer emberi gént feltételeztek mindössze ezer gén található a humán genomban. Megtudták, hogy a gének több mint 50%- ának nem ismert a funkciója valamint, hogy a genom kevesebb, mint 2%-a kódol fehérjéket. Felismerték, hogy a gének a genomnak mindössze 1,3%-át teszik ki, a genom legalább 50%-a pedig ismétlõdõ, fehérjét nem kódoló szekvenciákból áll. Az alternatív splicing (kivágódás) segítségével pedig egy génrõl több különbözõ fehérjetermék képzõdhet. A Human Genom Program mérföldkõ volt a genetika történetében. Lehetõséget adott arra, hogy kilépjünk a klasszikus genetika korszakából, és beléphessünk a genomika világába. Mi a különbség a kettõ között? Míg a genetika egyes tulajdonságok öröklésével, egyes gének szerkezetével és mûködésével foglalkozik, addig a genomika tárgya az élõ szervezet DNS-ének egésze. A genomika tehát a szervezet teljes genomjának szerkezetét vizsgálja, beleértve a gének számát, méretét és eloszlását, de vizsgálatának tárgya a gének közötti DNS-szakaszok szerkezete, elhelyezkedése és biológiai szerepe is. Ezeken túlmenõen foglalkozik a különbözõ szervezetek genomjainak összehasonlításával is. Míg a geneti- 2

3 ka azt vizsgálja, hogy ismert funkciókat és tulajdonságokat milyen genetikai háttér kódol, addig a genomika fordított sorrendben, elõbb a DNS-szerkezetet határozza meg és már annak ismeretében keresi a DNS-szakaszokhoz tartozó funkciót, tulajdonságot. Microarray (chip) technológia A genetikából a genomika korszakába való átlépéshez azonban a genomprogramok befejezésén kívül más fontos tudományos eredmények megjelenése is szükséges volt. Az egyik technikai jellegû áttörés, amely nagymértékben elõsegítette a genomika alkalmazását, a microarray (chip) technika kidolgozása. Ennek segítségével nemcsak nagyságrendekkel nõtt meg a párhuzamosan vizsgálható gének száma, hanem azok nukleotid-sorrendjének meghatározása mellett funkcionális információkhoz (génkifejezõdés, expresszió) is juttatta a kutatót. A DNS-chipek felhasználásával mutációk jelenléte vagy hiánya vizsgálható. Ez a módszer veleszületett, öröklõdõ betegségek genetikai hátterének kimutatására használható, de betegséget önmagában nem okozó, úgynevezett single nucleotide polymorphism (SNP) vizsgálatára is alkalmas. Génexpressziós microarray segítségével expressziós vizsgálatok végezhetõk egy adott sejt- vagy szövettípus géntermékeinek (hírvivõ RNS-ek vagy fehérjék) jelenlétének, mennyiségének, valamint jelenlétük idõtartamának meghatározása céljából. A génexpressziós mintázat segítségével információ kapható a vizsgált sejt vagy szövet aktuális állapotáról, illetve funkciójáról. Egészséges és beteg személyek meghatározott szövetébõl készült expressziós összehasonlító vizsgálatokkal kiszûrhetõk azok a gének, illetve géncsoportok, amelyek expressziója vagy éppen elcsendesedése az adott beteg sejtre vagy szövetre jellemzõ, míg egy egészséges sejtre vagy szövetre nem. Bioinformatika A másik tudományterület, amely elengedhetetlen a genomika által szolgáltatott hatalmas adattömeg kezelésére, a bioinformatika. A bioinformatika az a tudományág, amely a biológiai tudományok területén keletkezett információkat, adatokat korszerû informatikai, matematikai és számításechnikai eszközökkel tárolja, összesíti és feldolgozza. Ezek az információk a genomok analízise eredményeképpen kapott nukleinsav és aminosav szekvenciák, valamint az azokhoz tartozó, már megfejtett szerkezeti, funkcionális és egyéb információk. A chipek által szolgáltatott adathalmaz bioinformatikai elemzése során a számítógép clusterekbe, csoportokba rendezi a kapott információkat. Single nucleotide polymorphism (SNP) A DNS-chipek segítségével mutációk jelenléte vagy hiánya mutatható ki. Ennek a technikának a segítségével rövid idõ alatt akár több gén egyidejû vizsgálatával veleszületett génhibák deríthetõk fel, de az úgynevezett single nucleotide polymorphism (SNP) vizsgálatára Genetika, genomika, posztgenomika: múlt, jelen, jövõ is használható. A SNP olyan pontmutáció vagyis egyetlen nukleotid kicserélõdése egy másik nukleotidra amely legalább egy populációban 1%-nál nagyobb gyakorisággal fordul elõ. Az egyes személyek DNS állományában a nukleotidbázisok körülbelül minden ezredik ponton különböznek vagyis a teljes haploid genomban mintegy hárommillió SNP van de természetesen eloszlásuk nem egyenletes. Független genetikai allélként öröklõdnek, tehát több SNP együttes vizsgálatával az adott egyénre jellemzõ genetikai jellegeket tudjuk követni. (10 SNP együttes mintázata egymillió, míg 20 SNP már egymilliárd ember között tud különbséget tenni). Mivel már több ezer SNP-t azonosítottak, a lehetõségeink szinte korlátlanok. Az SNP-könyvtárak használata nagyon sok segítséget nyújthat például az igazságügyi orvostanban (apasági tesztek, kriminalisztikai vizsgálatok), de nagy remények fûzõdnek a személyre szabott gyógykezelés kialakításához a gyógyszermellékhatások prediktív feltárása segítségével (farmakogenomika). Az SNP-profilok vizsgálata az evolúciós genetikában is sok új információhoz vezethet el. Mivel az SNP-k mindössze körülbelül 1%-a található a gének exonjaiban vagy szabályozó régióiban, õk maguk közvetlenül betegséget nem okozó, csak jelzõ funkcióval rendelkezõ markerek. A humán genetikai variációkat összefoglaló adatbázisok (pl. Hap-Map) sok hasznos adattal látják el a humángenetikai kutatásokat. A bioinformatikai módszereket felhasználva diagnosztikai és prognosztikai következtetéseket egyaránt levonhatunk. Ezenkívül lehetõvé válik olyan géncsoportok azonosítása, amelyek alkalmasak valamely betegség, szövõdmény vagy mellékhatás bekövetkezésének elõre jelzésére. Napjainkig több mint 100 olyan régiót azonosítottak, amelyek SNP variánsai elõsegíthetik egyes gyakran elõforduló megbetegedések (például cukorbetegség, koszorúér-betegség, prosztataés emlõrák, rheumás ízületi gyulladás, gyulladásos bélbetegség, idõskori maculadegeneráció) kialakulását. Farmakogenomika Régi tapasztalat, hogy az egyes betegek nem egyformán reagálnak a gyógyszeres beavatkozásra. A nagyszámú emberen bevált gyógyszerek egyeseknél kevésbé, másoknál fokozottan hatékonyak. Még az is elõfordulhat, hogy ugyanabban a betegségben szenvedõk között egyeseknél kifejezetten ártalmas lehet az a gyógyszeres kezelés, amely másoknál elõnyösen alkalmazható. A farmakogenomika célja éppen az, hogy elõre jelezni tudjuk egy betegnek az adott gyógyszerre való érzékenységét, illetve a gyógyszer által a betegben kiváltott mellékhatást. E feladat megoldásának a kulcsa a genomprogram termékeként felfedezett SNP-k vizsgálata, illetve a vizsgálati eredményeknek bioinformatikai módszerrel történõ analízise (6). Az SNP-k vizsgálata különösen nagy jelentõséggel bír akkor, amikor a különbözõ betegek ugyanazon gyógyszeres kezelésre adott eltérõ válaszait tanulmányozzák. Hogyan is történik ez a gyakorlatban? A vizsgálat során egy adott betegségben szenvedõ egyének közül kiválasztanak egy olyan betegcsoportot, amely egy adott gyógyszerre mellékha- 3

4 tást mutat és egy másik csoportot, amelyik nem. Ezután az SNP-chipek használatával szerzett eredményeket bioinformatikai módszerekkel elemezve olyan SNP-mintázatot keresnek, amely az egyik, vagy a másik csoportra jellemzõ. Ha sikerül különbséget találni a két csoport között természetesen számítógépes programokkal, bioinformatikai eljárással, akkor a következõ betegben már csak az SNP-profil meghatározása a feladat és ebbõl jó eséllyel megjósolható az, hogy ajánlott vagy nem javasolt számára az adott gyógyszer szedése. Mindenképpen említésre érdemes, hogy a bioinformatikai módszerek és a rendelkezésre álló hatalmas nemzetközi adatbázisok lehetõvé tették számunkra az in silico megközelítést, vagyis segítségükkel laboratóriumi háttér nélkül is korszerû, alkotó jellegû genomikai kutatás végezhetõ. Természetesen a számítógépen végzett kutatások, elõrejelzések nem helyettesítik az in vitro vagy in vivo kísérleti munkát, de nagy segítséget jelenthetnek az azt követõ manuális laboratóriumi munka megtervezésében. Komparatív (összehasonlító) genomika A genomika természetesen nemcsak az egyes genomokat tanulmányozza. A nagy hatékonyságú vizsgálati módszerek és nemzetközi adatbázisok segítségével kialakulhatott a komparatív (összehasonlító) genomika, amelynek feladata a homológia felhasználásával a humán gének funkciójának tisztázása. Ismeretes, hogy a különbözõ szervezetekben az azonos funkciót ellátó és közös evolúciós eredetû fehérjéket homológoknak, az ugyanazon információt kódoló génszekvenciákat pedig homológ szekvenciáknak nevezik. Ha különbözõ fajok homológ szekvenciáit egymás mellé helyezzük, azonosítani tudjuk azokat a konzervált domén-szerkezeteket, amelyek egy adott fehérjetermék mûködésére utalnak. Az elmúlt években sok hasznos, új információ született a közelebbi és távolabbi rokonságban álló szervezetek teljes genomjainak szerkezeti összehasonlításával. A múltban a fehérjék funkciójának meghatározása volt az elsõ lépés és ezt követte az azonosított fehérjemolekula szerkezetének megismerése. Ez idõigényes, röntgensugárzást és mágneses magrezonanciát alkalmazó vizsgálat volt. Ezzel ellentétben a strukturális genomika elõször a fehérjemolekula szerkezetét határozza meg és csak ezután vizsgálja azt, hogy milyen funkciót lát el. Ennek meghatározása pedig már egy újabb tudományterület, a funkcionális genomika feladata (7). Strukturális (szerkezeti) genomika A strukturális genomika feladata tehát a genomban kódolt összes fehérje térszerkezetének meghatározása. Tudjuk, hogy az élõvilág fehérjéi mindössze néhány ezer alaptípusba sorolható fehérje-doménbõl épülnek fel, és az egy rokonsági körbe tartozó, homológ fehérje-domének térszerkezete nagymértékben hasonló. Vagyis egy fehérjecsalád új tagjának térszerkezetét a homológia alapján modellezni lehet. A kísérleti szerkezeti genomika célja éppen az, hogy a genomból kiválassza azokat a célfehérjéket, amelyek térszerkezetét kísérleti úton Genetika, genomika, posztgenomika: múlt, jelen, jövõ (pl. röntgenkrisztallográfia) meghatározva az összes többi fehérje homológia-modellezési távolságon belül lesz. (Ez azt jelenti, hogy a szekvenciák kb. 20%-ban azonosak). Ilyen módon minden fehérje térszerkezete homológiamodellezéssel megjósolható lesz. Az így megszerzett információk azután felhasználhatók a genomika más területein, például a funkcionális genomikában. Funkcionális genomika A genomikai korszak egy másik új tudományága a funkcionális genomika. E tudományterület feladata többlépcsõs. Elsõként a genomszekvenciákban rejlõ gének azonosítása szükséges, majd ezután következhet az azonosított génekrõl képzõdött fehérjetermékek funkciójának meghatározása. Segítségével megtudhatjuk, hogy az adott fehérjének milyen biokémiai reakcióban van katalizáló szerepe, esetleg milyen molekula megkötésére képes, illetve, hogy a sejt egészének funkciós rendszerében hol foglal helyet. A bioinformatikai módszerek egyre érzékenyebbé és megbízhatóbbá válásával mind hatékonyabbá válik a genomszekvenciában a gének azonosítása. Meghatározható a gének által kódolt mrns-ek nukleotid- és a róluk termelõdõ fehérjék aminosav szekvenciája és térszerkezete. Ennek ismeretében pedig összehasonlító vizsgálattal valószínûsíteni lehet azok biológiai funkcióját, mûködési mechanizmusukat. A fehérje funkciójának azonosítása történhet a térszerkezet ismeretében fold (gomboly) alapján, illetve az aktív hely geometriája szerint. Az elsõ módszer azonban csak akkor alkalmazható, ha az adott funkció és gomboly között egyértelmû kapcsolat áll fenn. Ez nem minden esetben igaz, gyakran ugyanazt a funkciót többféle gomboly is elláthatja, de ugyanaz a gomboly többféle funkciót is megvalósíthat. Populációgenomika Az evolúciós biológia egyik lényeges feladata az ökológiai szempontból fontos jellegeket meghatározó gének azonosítása, illetve a gének ismeretében ezután ezen lókuszok természetben elõforduló genetikai variációinak vizsgálata. A cél annak meghatározása, hogy az egyes genetikai variációk milyen fenotípusos következményekkel járnak. Ezen feladat megoldására több új megközelítési módot alkalmaztak, köztük a populációgenomikát. A populáció-genomikai elemzés során különbözõ környezeti körülmények között élõ egyénekben egyidejûleg több molekuláris markert vizsgálnak. A cél az, hogy olyan markermintázatokat találjanak, amelyek az eltérõ környezeti feltételek között élõ egyénekben különböznek. Így szûrhetõk ki azok a gének, amelyek változékonyságuk miatt a természetes szelekció mûködésére utalhatnak. Ez a fajta megközelítési mód igen kényelmes, mert egyszerre nagyon sok genetikai markert vizsgálhatunk, nincs feltétlenül szükség a fenotípus és a vizsgált személyek családi vonatkozásainak ismeretére sem. A genetikai változatok felfedezése azonban a munkának csak a kezdete, hiszen ezzel kapcsolatban egy egész sor kérdésre kell a választ megta- 4

5 lálni. Vajon a hasonló környezeti körülményekhez való alkalmazkodásért egy fajon belül vagy fajok között is ugyanazon gének vagy mutációk felelõsek? Az alkalmazkodásért felelõs allélek meglévõ genetikai variációk, vagy újonnan keletkezett mutációk? Hogyan változtatja meg a szelekció a genetikai állományt? Hogyan befolyásolják a demográfiai tényezõk és a véletlenszerû események a szervezet alkalmazkodóképességét a megváltozott környezeti körülményekhez? A populációgenomika ezekre a kérdésekre keresi a választ (9). Génterápia Genetika, genomika, posztgenomika: múlt, jelen, jövõ A veleszületett öröklõdõ betegségek túlnyomó többsége ma még nem gyógyítható. Az egyetlen kezelési mód a klinikai tünetek enyhítése, de a betegség okának megszüntetése, a génterápia bevezetése még nagyrészt a jövõ feladata. Számos nemzetközi munkacsoport már évtizedek óta végez kutatásokat ebben az irányban. A feladat az, hogy a hibás gént hordozó sejtekbe az ép gént bejuttassuk, amely a sejtben átveszi a hibás gén feladatát. A legnagyobb probléma e feladat megoldása során a megfelelõ közvetítõ (vektor) kiválasztása. A vektor lehet természetes vagy mesterségesen elõállított cirkuláris DNS (plazmid), illetve mesterséges kromoszóma. A vektor sejtbe juttatása történhet fizikai úton (elektroporáció, mikroinjektálás), kémiai módszerrel (pl. pegilált-immunliposzóma), illetve biológiai úton vírusok segítségével. Az adenovírusokkal sejtbe juttatott gén nem, míg a retrovírusokkal bejuttatott gén beépül a genomba április 28-án a Science folyóiratban számoltak be az elsõ sikeres génterápiás kezelésrõl (3). Két beteg, egy 11 és egy 8 hónapos, X-SCID ADA (autoszomális recesszív öröklõdésû severe combined immune adenosine-deaminase deficiency) betegségben szenvedõ gyermek elõzõleg eltávolított csontvelõ sejtjeibe retrovirális eredetû vektor segítségével juttatták be a betegségért felelõs hibás génszakaszt, majd a transzformálódott sejteket visszajuttatták a szervezetükbe. A kezelés sikeres volt, a gyermekek T-, B- és NK sejtjeiben az IL2Rγ expresszálódott, normális ellenanyagszintjük alakult ki a beavatkozás után, további terápiára nem volt szükségük. A kezelés következtében azonban 30, illetve 34 hónap elteltével mindkét betegnél akut limfoid leukémia alakult ki, amelyet kemoterápiával sikeresen meggyógyítottak. Egy másik betegcsoport, akiknél a génterápia kifejlesztésével az elmúlt 10 évben rengeteget foglalkoztak, a cisztás fibrosisban szenvedõ betegek. Mivel ebben a betegségben a tüdõ érintettsége a legsúlyosabb tünet, és általában a halál oka is, a cél aerosol formájában közvetlenül a tüdõ sejtjeibe juttatni az ép CFTR gént, illetve a róla szintetizált cdns-t. Éppen a betegség következtében azonban a tüdõ felszínét sûrû váladék borítja, ami nehezíti a kezelés kivitelezését. Különbözõ munkacsoportok egy sor vírus és nem vírus eredetû vektort használtak. A legnagyobb problémát a vírus eredetû vektorok alkalmazása során a kialakuló immunválasz jelentette. Egyetlen kivételt találtak, a lentivírusok csoportját, amely lényegesen kisebb immunreakciót eredményezett. Napjainkban is zajlanak azok a vizsgálatok, amelyek célja, hogy lentivírus eredetû közvetítõ segítségével kifejlesszék a leghatékonyabb légúti terápiát CF betegek számára. Az Egyesült Királyságban ugyanakkor egy másik munkacsoport olyan kísérleteket végez, amely nem virális, hanem liposzóma eredetû vektor alkalmazását célozza. Ezek a vektorok elõnyösebbek a vírus eredetû vektoroknál, mivel lényegesen kisebb immunreakciót váltanak ki, de hatékonyságuk elmarad azokétól. A jövõ azonban más lehetõségeket is rejt a CF-es betegek hatékony génterápiájának megoldásában. Bíztató in vitro kísérletek vannak sirns (egyszálú, kis interferáló RNS) használatával a génelcsendesítés módszerével történõ génterápiás beavatkozás alkalmazására. Kimutatták, hogy az endoplazmás retikulum (ER) BAP31 proteinjének gátlásával a ΔF508 mutációt hordozó fehérjemolekulák képessé válnak arra, hogy eljussanak a sejtfelszínre. Ilyen módon már több különbözõ sejttípuson sikerült a normális klorid szekréció helyreállítása (5). A génterápia tehát nemcsak az ép gén sejtbe juttatását, illetve túlexpresszálását jelentheti, hanem ellenkezõleg, a hibás gén elcsendesítését is. Ebben a feladatban vehetik fel a harcot a betegséggel a sirns molekulák, illetve az RNS interferencia nemrég felismert jelentõsége. mirns, sirns, RNS interferencia A genomprogramnak köszönhetõen felismerték, hogy az emberi genom nem kódoló régióiban olyan mintázatok találhatók, amelyek fehérjekódoló gének szekvenciáinak komplementereit tartalmazzák, ráadásul ezek is átíródnak RNS-sé. Ezek az RNS-molekulák részben egyszálú, úgynevezett mikrorns-ek, részben rövid duplaszálú RNS-ek. Ez utóbbiakból szintén egyszálú, kis interferáló RNS molekulák (sirns) képzõdnek ban orvosi-élettani Nobel-díjjal jutalmazták az RNS interferencia jelenségének felfedezését. Ez addig a génmûködés szabályozásának egy teljesen ismeretlen módja volt, amelynek során sirns molekulák specifikusan gátolják egyes gének kifejezõdését oly módon, hogy a velük komplementer, hírvivõ RNS (mrns) molekulákhoz kapcsolódva egy enzimkomplex mûködését indítják be, amely a mrns lebontását eredményezi. Az RNS interferencia óriási lehetõséget ígér a jövõ kezelési eljárásaira vonatkozóan. A sejtekbe mesterségesen bejuttatott sirns-ek lehalkíthatnak meghatározott, kiválasztott géneket. Már napjainkban is igen bíztató kísérleti eredményeket értek el az RNS interferencia hasznosításával a gyakorlatban. Például egerekben in vitro és in vivo egyaránt sikerült a vér koleszterinszintjét csökkenteni a megfelelõ gén gátlásával. A kísérlet során koleszterin molekulához kapcsolt, az ApoB génnel homológ sirns molekulát juttattak be a szervezetbe. Ennek megfelelõen a sirns csak koleszterinkötõ sejtfelszíni receptorokkal rendelkezõ sejtekbe volt képes bejutni. Ezek éppen azok a sejtek, amelyek a vér koleszterinszintjének változását érzékelik a májban és a vékonybélben. A vizsgálat során a kísérleti állatok vérében az LDL koleszterin-szint 44%-os csökkenése mel- 5

6 lett a HDL koleszterin-szint is 25%-kal csökkent. Mivel a sirns molekula csak a megfelelõ sejtekbe jutott be, más gének mûködését nem befolyásolta, így a kezelésnek káros mellékhatásai nem voltak (8). Egy világszerte milliókat érintõ szembetegség, az idõskori macula degeneráció RNS-interferenciával való kezelése már a sikeresnek bizonyuló állatkísérletek után a klinikai kipróbálás fázisába jutott. A kezelés pozitív hatását a klinikai vizsgálatok is igazolták. A közvetlenül szembe injekciózott sirns a vascularis endothelialis növekedési faktort kötõ receptor fehérjetermék (VEGFR-1) képzõdését akadályozza meg, így a betegek szemében csökken az új erek képzõdése. A tapasztalat szerint a kezelt betegek látásélessége is javult. A hatás tartóssága a gyógyszer adagjától függ. Káros mellékhatásokat nem tapasztaltak (1). Napjainkban számos munkacsoport foglalkozik az RNS-interferencián alapuló hatékony daganatterápia kifejlesztésén is (10). Az RNS-interferenciának a klinikumban való használatában a génterápiánál említetthez hasonlóan a megfelelõ hordozó kiválasztása, illetve a sejtbe való bejuttatás hatékony módszerének kifejlesztése a legnehezebb feladat. A duplaszálú, dsrns molekulák sejtvonalakba történõ bevitelére már sikerült elõállítani olyan vektorokat, amelyek hosszú távú hatást biztosítanak, de a klinikai kipróbálások még csak most zajlanak (2). A mirns molekulák mindössze nukleotid hosszúságú egyszálú RNS szakaszok. Az emberi genomban több száz mirns-t sikerült már azonosítani, amelyeknek mintegy 80 százaléka az emlõsök között evolúciósan konzervatív. Ma ismeretes funkciójuk szerint képesek hozzákapcsolódni a hírvivõ RNS-molekulákhoz, ezzel gátolva a fehérjeszintézis folyamatát. Kevésbé specifikusak, mint a sirns molekulák, így egyegy mirns molekula több különbözõ mrns-hez tud kapcsolódni. Vagyis egyidejûleg nem csupán egyetlen, hanem sok gén mûködését képes befolyásolni. Bár a jelenségre magyarázatot még nem tudunk, de egyre több onkogén és tumor szuppresszor gén szabályozásának vizsgálata során fedezik fel, hogy mirns-mintázatuk a normálistól eltérõ. E felismerésbõl adódik az a remény, hogy a jövõben a mirns-eknek fontos szerepe lehet a daganatos betegségek elleni küzdelemben. Ha a feltételezések igazolódnak, akkor a tumorsejtekbe juttatott megfelelõ mirns-ek segítségével esetleg egész onkogén géncsaládok mûködését lehetne egyidejûleg megakadályozni (11). Posztgenomika a jövõ Genetika, genomika, posztgenomika: múlt, jelen, jövõ A klasszikus genetika a genomot lineáris módon olvassa. A genomika amely a legmodernebb informatikai módszerekkel az egész biológiát komplex tudományként új alapokra helyezte ezen a talajon nõtt fel. Genomikai módszerekkel ugyanis egy sejtnek több (akár valamennyi) génjének mûködése párhuzamosan vizsgálható. Elemezhetõ a gének összes változata, illetve meghatározható a gének expressziós (kifejezõdési) mintázata. Az így nyert információk felhasználásával késõbb összehasonlító elemzések is végezhetõk. A genom legnagyobb része azonban még mindig ismeretlen a kutatók elõtt. Mint ismeretes, a genom 98,7%-a nem kódol fehérjét. Mivel errõl a hatalmas DNS mennyiségrõl szinte alig van információnk, azt ma is az eredeti hulladék DNS (junk DNA) néven tartják nyilván. Az elsõ elméletek szerint a junk DNS-nek mindössze mechanikai szerepe van a gének közötti távolságok biztosítására. A másik feltevés az volt, hogy ezek valamiféle tartalék szekvenciák. Késõbb azonban azt is felfedezték, hogy ez a tartomány olyan DNS szakaszokat is tartalmaz, amelyek egymástól távol álló fajok között is igen hasonlóak (konzervatív szekvenciák). Az információk értelmezésében a nagy áttörést a matematikai elemzés hozta meg. A genomszekvenciát fraktálgeometriai vizsgálatnak vetették alá, és igencsak meglepõ módon a nem kódoló DNS régiókban geometriai mintázatokat, fraktálokat fedeztek fel. A fraktálok olyan matematikai alakzatok, amelyeknek egy kis részletét fölnagyítva az egész alakzathoz hasonló szerkezetet kapunk. A junk DNS-ben a lineáris elemzések során elõ nem kerülõ ismétlõdõ szekvenciákat fedeztek fel. Ezek az értelmetlennek tûnõ ismétlõdések fraktálgeometriai módszerekkel elemezve azonban jelentõs információt hordozhatnak. Napjainkig már millió olyan szakaszt azonosítottak, amelyek feltételezések szerint alapvetõ szerepet játszhatnak a génkifejezõdés szabályozásában. A posztgenomika fejlõdésében a következõ lépés a piknonok azonosítása volt. A humán genomban legalább 40-szer elõforduló, legalább 16 nukleotid hosszúságú DNS szakaszokat nevezzük piknonoknak. A genom nem kódoló részében már több millió piknont, illetve százezernél több piknonmintázatot azonosítottak. Ezeknek megfelelõ nukleotidszakaszok szinte minden ismert génben megtalálhatók. A génszabályozásban betöltött pontos szerepük meghatározása még a jövõ feladata, de már vannak olyan kórképek, amelyek egyértelmûen köthetõk nem kódoló DNS szakaszokhoz. A junk DNS-sel kapcsolatos betegségek listája szinte napról napra bõvül. A betegségekkel kapcsolatos információkat tartalmazó weblap bárki számára elérhetõ, és a legfrissebb eredmények tekintetében is pontos tájékoztatással szolgál ( diseases.html). Nagyon valószínû tehát, hogy a hulladék DNSbõl származó elemek, (mirns-ek, sirns-ek, az ismétlõdõ szatellit-dns-ek és a génekben található intronok) a géneket mintegy a háttérbõl irányítva a genetikai betegségek kialakulásában legalább olyan fontos szerepet töltenek be, mint eddigi ismereteink szerint a gének kódoló, szabályozó régiói. Irodalomjegyzék 1. Buch P.K., Bainbridge J.W., Ali R.R.: AAV-mediated gene therapy for retinal disorders: from mouse to man. Gene Ther., 15(11), , Bumcrot D., Manohara, M., Koteliansky V. et al.: RNAi therapeutics: a potential new class of pharmaceutical drugs. Nat. Chem. Biol., 2, ,

7 3. Cavazzana-Calvo M., Hacein-Bey S., de Saint Basile G. et al.: Gene Therapy of Human Severe Combined Immunodeficiency (SCID) X1 Disease. Science 288(28), , Collins F.S., Patrinos A., Jordan E.l. et al.: New Goals for the U.S. Human Genome Project: Science, 282(5389), , Griesenbach U., Alton E.: Gene transfer to the lung: Lessons learned from more than 2 decades of CF gene therapy. Advanced Drug Delivery Reviews, 61, , Lengauer T. (ed.). Bioinformatics from genomes to drugs. Weinheim: Wiley-VCH, Vols. I and II., 2002 Genetika, genomika, posztgenomika: múlt, jelen, jövõ 7. Skolnick J., Fetrow J.S., Kolinski A.: Structural genomics and its importance for gene function analysis. Nat. Biotech., 18, , Soutschek J., Akinc A., Bramlage B.: Therapeutic silencing of an endogenous gene by systemic administration of modified sirnas. Nature, 432, , Stinchcombe J.R., Hoekstra H.E.: Combining population genomics and quantitative genetics: finding the genes underlying ecologically important traits. Heredity, 100, , Takeshita F., Ochiya T.: Therapeutic potential of RNA interference against cancer. Cancer Sci., 97(8), , Wang V., Wu W.: MicroRNA-Based Therapeutics for Cancer. Biodrugs, 23(1), 15-23, 2009 Megrendelõlap (Focus Medicinae) Alulírott, postai úton megrendelem a Focus Medicinae címû kiadványt évre,... példányban. A folyóirat éves elõfizetési díja: 2009,- Ft + 5% áfa. Megrendelõ neve:... Címe:... Megrendelését az alábbi címre kérjük elküldeni: Dursusz Bt Budapest, Juhász u. 47/A. Telefon/Fax: (1) Mobil: (06-30) dursusz@mail.datanet.hu 7

8 Hogyan mûködnek a természetes killersejtek? Hogyan mûködnek a természetes killersejtek? (Az NK sejtek genomikája) Dr. Benczúr Miklós Országos Vérellátó Szolgálat Központ, Budapest Összefoglalás: A limfoid õssejtbõl származó, a sejtsorból kifejlõdõ természetes killersejtek (NK, natural killer) a veleszületett, (nem-adaptív) immunapparátus részei. A szervezetben hármas funkciót látnak el: a.) citotoxikus reakcióval pusztítják el a folyamatosan, a környezeti hatásokra véletlenszerûen képzõdõ (mutáns) tumorsejteket, a vírus-fertõzött sejteket és egyes sejten belüli élõsködõ kórokozókat (parazitákat), b.) aktivációt követõen számos szabályozó-üzenetközvetítõ molekulát (un. citokint) termelnek, szabályozva ezzel az immunválaszt, c.) végül sejtfelszíni receptoraik révén erõsítõ-kiegészítõ (co-stimulációs) jelet továbbítanak a T- és B-lymphocyták felé. Beigazolódott, hogy felismerõ receptor-családokkal bírnak, amelyeken keresztül gátló- vagy aktiváló hatású jelátvitel történik. Mind jobban ismertté váltak az NK sejtek receptorai és az általuk felismert MHC-I molekulák. E hármas funkció révén a szervezet integritásának megõrzése mellett a szervezet immunválaszát szabályozó mûködést végeznek. Az MHC génektõl eltérõ genetikai kódoltság folytán az NK receptorok a HLA-I ligandumoktól függetlenül öröklõdnek. Az immunglobulin-szerû KIR receptor család (killer cell immunglobulin-like receptor) a 19-es kromoszómán kiterjedt genetikai szervezõdést és szerkezeti változatosságot mutat, a lektin receptorok pedig ettõl eltérõen a 12-es kromoszómán kifejezetten konzervatív szerkezetet jelentenek. Az utóbbi években ismertté váltak azok a genetikai módszerek, amelyek segítségével az egyes NK sejtcsaládok közelebbi típusa meghatározható, a klinikumban pedig napvilágot láttak azok az eredmények, amelyek a rosszindulatú hematológiai betegségek gyógyítására alkalmazott õssejt átültetésekben az NK sejtek receptor-ligand kapcsolatának és kompatibilitásának szerepét igazolták. Kulcsszavak: NK sejtek, tumor, citokin, receptor, ligand, MHC Summary: Natural killer cells (NK cells) originating from Bevezetés Már több mint 3 évtizede ismerjük a vérben keringõ és a szövetekben fellelhetõ természetes ölõsejteket (NK, natural killer) amelyek legfontosabb tulajdonsága, hogy a szervezetben az idegen sejteket megölik minden korábbi immunizálódás nélkül. Az NK sejtek így a velünk született (természetes) immunrendszer részét képezik. Szoros rokonságban állnak a T-lymphocytákkal, mivel közös õssejtbõl származnak. Mûködésükhöz elengedhetetlen, hogy sejt-sejt kapcsolatokat hozhassanak létre, ezért számos kapcsolatot képzõ felismerõ molekulával (receptorokkal) bírnak, amelyek elsõsorban a minden magvas sejt felszínén megtalálható MHC-I (HLA) struktúrák felismerését szolgálják. Ez jelenti a saját megkülönböztetését az idegen sejtektõl. lymphoid stem cells and developing from cell line are parts of congenital (non adaptive) immune apparatus. They have triple functions in the organism: a.) they destroy tumor cells continuously developing randomly (mutant) due to environmental effects, virus infected cells and some intracellular pathogens (parazytes) by cytotoxic reaction, b.) after activation they produce numerous regulating and messenger molecues (the so called cytokines), that way regulating the immune response, c.) finally through their cell-surface receptors they transmit a strengthening-complement (co-stimulating) sign towards T- and B- lymphocytes. It has been proven that they have recognition receptor families, through which there is a sign transmittion with either inhibitor or activator effect. The receptors of the NK cells have become more and more known and the MHC-I molecules recognised by them. Due to these triple functions while maintaining the integrity of the organism they function regulating the immune response of the organism. Because they are genetically not coded as MHC genes, NK receptors are inherited independently of HLA-I ligands. The immunoglobulin-like KIR (killer cell immunglobulin-like receptor) receptor family shows an expanded genetic organization and structural variety on chromosome 19, while lectin receptors on chromosome 12 have a distinctly conservative structure. Genetic methods have become well known in the past few years, which help to define a more precise type of NK cell families, in the field of clinics results have been published that in stem cell transplantations to cure malignant haematological diseases the role of the receptor-ligand connection and compatibility of NK cells was confirmed. Key words: NK cells, tumor, cytokine, receptor, ligand, MHC Gátló receptoraik révén funkcionálisan is képesek megkülönböztetni a saját sejteket a potenciálisan veszélyes idegen sejtektõl, amelyek elvesztették, vagy nem kellõen fejezik ki MHC-I sejtfelszíni struktúrájukat. (ez az ún. missing self (elvesztett saját) hipotézis (15). Az NK sejtek elsõsorban a sejtfelszíni MHC-I struktúrát ismerik fel, amely egy tiltó jelet hoz létre, megakadályozva a saját sejtek megölését, ezért a saját MHC-I elvesztése/hiánya az NK sejtek citotoxikus mechanizmusát indítja be, amely az idegen sejtek megöléséhez vezet. Az NK sejtek épp úgy idegennek tekintik a megváltozott saját, pl. vírusok által megfertõzött sejteket, mint a testünkben állandóan képzõdõ (mutáns) sejteket, amelyek egy részébõl daganatok képzõdhetnek. A szervezetben folyamatosan képzõdõ, életképes mutációknak (daganatoknak) és vírust-hordozó sejteknek is az 8

9 MHC-I struktúrák levedlése az egyik túlélési módjuk, amely a T-sejtes (adaptív) immunválasz elkerülésére fejlõdött ki. Az MHC-I-et elvesztõ mutáns sejtek azonban az NK sejtek martalékai lesznek. A vérben és a szövetekben az NK sejtek állandóan készen állnak az idegen sejtek elpusztítására, szemben a T-sejtes adaptív celluláris immunválasszal, amelynek teljes-erejû kifejlõdéséhez 8-12 nap szükséges. A plazmasejtek által termelõdõ specifikus ellenanyagok (antitestek) közremûködésével az adaptív immunválasz részét is képezik, mivel az antitest-függõ celluláris citotoxicitás (ADCC) effektor sejtjeiként is szolgálnak, amelyben sejtölõ hatást fejtenek ki. Ölõ mûködésük mai tudásunk szerint azonos a T-lymphocyták közvetlen toxikus hatásával (citoplazmikus enzimeik, perforinok és más enzimek által kifejtett ozmotikus lízis és/vagy a természetes sejthalál (apoptosis) indukciójával (6). A biológia új integráló területe, a genomika, a gének és géntermékek gyors és könnyebb analízise útján elõsegítheti, jelentõsen felgyorsíthatja és részleteiben is módosíthatja az NK sejtek funkciójának mélyebb megértését. A természetes és a kórokozók (antigének) hatására kialakuló ún. adaptív immunválasz együttmûködésének lehetünk itt tanúi. Az NK sejtek számos területen mûködnek a szervezet egységét és szabályozását szolgálva. Klinikai megfigyelések összefüggést mutattak ki az NK sejtek és az átültetett õssejtekkel szembeni reakcióval (GVHD), különbözõ gyulladásos megbetegedések és az NK sejtek KIR receptorainak gátló/aktiváló tulajdonságaival. Különleges szubpopulációjuk a terhesség elsõ trimeszterében védi az embrió beágyazódását és fejlõdését a nem klasszikus HLA antigénekkel való együttmûködés révén. A KIR receptorok kiterjedt vizsgálata és a szervezet egészséges mûködésének megõrzésében még minden részletében nem tisztázott szerepük számos megbetegedésben bizonyára szükségessé teszik a KIR receptorok tipizálását. Különbözõ eredetû hiányuk vizsgálata pedig értékes adatokat nyújthat valódi fiziológiás mûködésük megismerésére. A humán NK sejtek legfõbb tulajdonságai Az NK sejtek a T- és B-lymphocytáktól eltérõen térlátásuk révén ismerik fel a szervezetben képzõdõ malignus-, vagy fertõzött sejteket, észlelve a sejtfelszín mintázatának változásait. Ez a felismerés aktiváló és gátló struktúrák, az immunglobulin-szerû, ún. KIR receptorok útján történik (12). Újabb felismerés, hogy az aktiváló jelet kiváltó receptorok elsõsorban a természetes immunrendszer kórokozók elleni védekezõ funkciójának szolgálatában állnak és MHC-I (HLA) struktúrákat felismerõ képességük háttérbe szorul (23). Jellegzetes morfológiájuk is megkülönbözteti az NK sejteket a többi leukocytától; nagy lymphocyták, amelyeknek mérsékelten babalakú magvuk, kifejezett nucleolusuk van és a citoplazmájukban jól látható azurofil granuláció észlelhetõ egyszerû Giemsa festéssel, amelyek enzimei (perforin, szerin-eszterázok, ún. granzimek) a citotoxicitásban vesznek részt. E jellegzetesség alapján nagy granuláris lymphocytának (large granular lymphocyte LGL-sejtek) is nevezik e sejteket. A perifériás vérben 5-15%-ban fordulnak elõ (32). Az emberi NK sejtek érése, differenciálódása Felismerésük és az elsõ jellemzésük óta eltelt három évtized kiterjedt kutatásai és megfigyelései tisztázták, hogy ezek a sejtek a limfoid/lymphocyta rendszer õssejt vonalából (vérképzõ õssejtekbõl) több, ma már genetikai módszerekkel elkülöníthetõ szakaszból álló differenciálódási-érési folyamaton mennek át. A hematopoietikus õssejtben a korai NK fejlõdés során 15 specifikusan kifejezõdõ gént mutattak ki, míg az NK prekurzor sejtekben 30 ilyen gén fejezõdött ki (11). E bonyolult folyamat sikeréhez több növekedési és átíródási/transzkripciós faktor, citokin szabályozás és a környezet hatása is szükséges. A fejlõdési sor végén megjelenõ korai NK sejtek számos szabályozó citokint termelnek. A klinikai gyakorlatban a sejtek fejlõdési állapota a sejtek felszínén megjelenõ molekulákkal jellemezhetõ (ún. CD markerek), amelyek valójában a sejtfelszínen megjelenõ fontos funkcionális struktúrák. Az NK sejteket CD16+/ -CD56+++ markerrel jellemzik, noha a CD56 neurális adhéziós molekulának az NK sejteken gyakorolt funkciója bizonytalan (6). A legújabb kutatások szerint ettõl lényegesen jobb jellemzés is alkalmazható: az NK sejtek NKp46 pozitív, IL-15 citokin-függõ, IL-12-re válaszoló limfoid sejtek, amelyek az érés során az IFN-γ citokin korai forrásai, és jellemzõen erõs sejtölõ tulajdonsággal bírnak. Nem zárható ki, hogy ezeket a sejtfunkciókat a különbözõ NK sejtcsaládok megosztva végzik (35). A korai NK sejtcsalád Hogyan mûködnek a természetes killersejtek? Ez a populáció nem, vagy csak kis sûrûségben hordozza a CD16-FcRIII-R(FcIII-receptor) struktúrát, citoplazmájában pedig kevés finom eloszlású azurofil testecske látható, amelyet a sejtölés szolgálatában álló enzim molekulák alkotnak (ún. granzimek, szerinészterázok). A nagy lymphocyta morfológiát mutató sejtek membránján megtalálhatók azok a jellegzetes, elsõsorban a MHC-I antigéneket felismerõ NK-receptorok, amelyek részletes tárgyalására késõbb térünk ki. A sejtcsalád jelentõs mennyiségben termel számos citokint (IFN-γ, TNF-α-β, GM-CSF, IL-10, IL13) és citokin receptorokkal is bír. Ez a perifériás vérben mintegy 1-5%-ot kitevõ korai sejtcsalád az immunrendszer szabályozásában vesz részt. A szöveti NK sejtek nagy részét is ezek a sejtek alkotják. A nagy-kötõerejû IL-2 citokin receptor (IL2-Rαβγ), csak ezen az NK sejtcsaládon kifejezett. Újabb vizsgálatok szerint a nyirokcsomók parafollicularis régiójában tízszer annyi korai NK sejt található, mint késõi. Feltételezik, hogy a T-és NK sejtek közötti információcserét a nagy aviditású IL-2R segíti elõ (18). Ebben a részleteiben még nem ismert folyamatban, az idegen fehérjét bemutató dendritikus sejtek is részt vesznek, amelyek végsõ érését az NK sejtek γ-ifn termelése segíti elõ. A sejtcsaládon belül további alpopulációk kü- 9

10 löníthetõk el, így pl. a γ-ifn termelést csak egy CD8 negatív alosztály végzi. A sejtek membránján a sejt-sejt kapcsolatot elõsegítõ molekulák; L-selectin és kisebb mennyiségben integrinek fejezõdnek ki (18). A késõi NK sejtcsalád A késõi NK sejtek a keringõ vérben az NK sejtek 85-95%-át adják. A sejtek felszínén a sejt-sejt kapcsolatot elõsegítõ struktúrák találhatóak (LFA1, CD2, PSGL- 1/PEN5, CD44). A sejtcsalád az NK sejtek speciális gátló és aktiváló receptoraival bír. Más védekezõ rendszerekkel együttmûködésben a késõi sejtcsalád a szervezet immunológiai integritását felügyeli. A sejtek felszínén citokin receptorok fejezõdnek ki (IL-7R, IL-15R, IL-2R, IFN-γ-R, IL-21R), amelyek együttesen kontrollálják a saját sejtek stressz okozta változásait (vírus infekció, parazita infekció, malignus átalakulás, hõsokk). A funkcióból következik, hogy IL-2 aktiválódására erõteljes citotoxikus választ adnak. Minden elkülönítés ellenére, mind a mai napig vita folyik arról, hogy a két sejtcsalád a természetes fejlõdési sor egyes állomásait, vagy elkülönülten kifejlõdõ sejtcsaládok tagjait képviseli-e? (18). A nagy kötõerõvel bíró CD16/FcRIII receptor mellett a citoplazmában kifejezett azurofil granulumok láthatók. Sejtölõ (citotoxikus) mechanizmusuk azonosan mûködik, mint a T-lymphocytáké, vagyis citoplazmatikus enzimjeik, (perforinok és más enzimek) a sejtfalon lyukakat fúrnak, ami ozmotikus sejthalálhoz vezet. Ezentúl a sejtekben programozott természetes sejthalált (apoptosis) indítanak be a FAS-ligand, TNF vagy TRAIL ligand útján (6). Az NK sejtek vándorlása Az NK sejtek, hasonlóan a T-lymphocytákhoz, kiléphetnek az érfalon keresztül a szövetekbe a sejt-sejt kapcsolatot elõsegítõ (adhéziós) molekulák, szelektinek, kemokinek segítségével (L-selectin, CCR7, CXCR3, CXCR4, CCR5). Az immár szöveti NK sejtek a korai NK sejtekhez hasonlóak (17). A szöveti NK sejtek elsõsorban a gyulladásos nyirokcsomók külsõ (paracorticalis) régiójába vándorolnak, ahol az NK sejtek által termelt IFN-γ stimulációja elõsegíti a dendritikus sejtek érését. Az NK sejtek citokin termelése ezen az úton befolyásolhatja a segítõ (CD4 + helper) T-sejteket (34). Az NK sejtek felismerõ képessége, a receptorok Hogyan mûködnek a természetes killersejtek? Emberi daganatsejt-vonalakkal végzett kísérletek azt mutatták, hogy az NK sejtek receptoraik révén felismerõ képességgel bírnak. Korábbi saját kísérleteink azt igazolták, hogy idegen (ún. allogén) emberi lymphocytákat (legalább 7 különbözõ csoportot) is meg tudnak különböztetni, ami finom különbségek felismerésére képes receptorokat tételez fel (4). A receptorok és az általuk felismert molekulák, az ún. ligandumok, vagy ligandok tanulmányozása rámutatott, hogy az emberi NK sejtek az immunválasz sokoldalú együttmûködésében vesznek részt. A közelmúltban e folyóirat hasábjain megjelent munkánkban a receptorokkal részletesebben is foglalkoztunk (2). A korábbi közlemények az NK receptorokat szerkezeti alapon (KIR2DL1, KIR2DL2/3, KIR3DL1) csoportosították, aszerint, hogy a HLA-C α láncban a 80-as pozícióban aszparagin, vagy lizin-, illetve a 77-es pozícióban aszparagin vagy szerin csoportot hordozó I. osztályú HLA, illetve a HLA BW4 allélekkel, mint ligandumokkal tudtak kapcsolódni (25). Ezzel a felosztással is fontos klinikai összefüggéseket lehetett kimutatni (ld. késõbb). Az utóbbi idõben azonban számos olyan receptor-ligand komplexet ismertünk meg, amelyek elõsegítették az emberi NK sejtek felismerõ képességének és mûködésének jobb megértését (1,34). Táblázatba foglalva láthatóak az eddig megismert receptorok és ligandumok, amelyekre az NK felismerés irányul. Megjegyzendõ, hogy több esetben a ligandumok még nem ismertek (1. táblázat). 1. A KIR receptorok a szerkezeti hasonlóság alapján az immunglobulin szupergén családba sorolhatók a domén szerkezeti hasonlóság alapján. Csak az NK sejteken és a memória sejtek egy szubpopulációján fordulnak elõ ezek a sejtmembránba lehorgonyzott glikoprotein molekulák. A KIR receptorok a 19q13.4 leukociyta receptor gén komplexben kódoltak (1. ábra). Általánosságban a hosszú citoplazmikus farokkal bírók (hosszú, long L) gátolnak, míg a rövid (short, S) molekulák aktiváló hatást fejtenek ki, ez azonban nem szigorú törvényszerûség. Az aktiváló receptorok ún. adaptor proteinek (DAP10, DAP12) közvetítésével a tirozin kinázok (Syk és ZAP70) felé továbbítják a szabályozó jelet. A KIR receptorok az MHC-I (HLA-C,-B és -A) allélokat ismerik fel. Az észlelt specifikusság az MHC-I törzsfejlõdése során az õsi régiók felismerésére irányult (5,24). A gátló receptorok, amelyeken át az NK sejtek fõ funkciója érvényesül, hosszabb intracitoplazmikus láncuk révén, közvetlenül a foszfatázok (SHP-1, SHP-2) felé továbbítva fejtik ki szabályozó (gátló/aktiváló) mûködésüket, amely fõként citotoxikus jel továbbítását jelenti. 2. A lektin receptorok az egyik legõsibb gátló/aktiváló molekulák, amelyek az NK funkciót szabályozzák. Génjeik a 12p.13. kromoszómán találhatók (2. ábra). A két azonos láncú, a citoplazmába benyúló fehérjemolekula, az NKG2-A-F képezi a további NK receptorokat. A CD94 Ca-függõ lektinnel, kovalens kötésû heterodimer struktúrát alkotnak. Az MHC-I antigének felismerése kevésbé szigorú és a T-lymphocyták egy alosztályának (CD8 + CD28 - TCRαβ +, ún. memóriasejtek) felszínén is kimutathatók. Ligandjuk a nem klasszikus HLA-E molekula. Fontos feladatot látnak el az aktivált T-sejteken (CD8 + ) is a vírus infektált sejtek elölésében és az IFN termelés szabályozásában is (38). 3. Emberi NK sejtek toll receptorokkal (TLR) is bírnak, amelyek a patogének molekuláris mintázatát (PAMP) ismerik fel, így a természetes immunválasz korai fázisában, közvetlen módon képesek védeni a szervezetet. (Az NK sejteken csak az ILT-2 toll receptor fordul elõ). 10

11 Hogyan mûködnek a természetes killersejtek? NK RECEPTOR LIGANDUM FUNKCIÓ EPITÓP MEGJEGYZÉS Immunglobulin 19q kromoszómán szuperfamilia (IgSF) receptorok 2DS1 HLACw Lys80 aktiváló N77 K80 P50.1 protein CD158h 2DS2 HLAC1 Asn80 aktiváló S77 N80 P50.2 protein CD159j 2DS3 HLAC1 gátló? P50 protein protektiv GVHD-re 2DS4 HLACw Lys80? aktiváló P50.3 protein CD158l 2DS5? aktiváló P50 protein 2DS6 P50 protein CD158c KIRX 2DL1 HLAC2 Lys80 gátló N77 K80 P58.1, DAP12- adaptor molekulával CD158a 2DL2,3 HLAC1Asn80 gátló S77 N80 P58, DAP12- CD158b1/b2 2DL3? gátló S77 N80 P58 2DL4 HLA-G, HLA-A3, gátló/ aktiváló P58 minden NK/T sejten jelen van, citokin HLA-B46, HLA-B7 termelést vált ki, nem citotoxicitást 2DL5? gátló/aktiváló P58 3DL1 HLA-Bw4 B27 B51 gátló P70, NKB1 3DL2 HLA-A3,A11, gátló P140 CD158k 3DL3? gátló 3DS1 HLA-Bw4? aktiváló? 3DL2 HLA-A3,A11, gátló P140 CD158k minden NK/T sejten jelen van 3DL3? gátló minden NK/T sejten jelen van 2DP1 pseudogén 3DP1 pseudogén C-típusú Lektin-receptorok 12. kromoszómán CD94/NKG2A HLA-E gátló CD94-el kovalens kötés CD94/NKG2C HLA-E aktiváló CD94-el kovalens kötés Citotoxikus /Aktiváló Receptorok ILT HLA- gátló immunglobulin szerû átirat LIR HLA-G gátló leukocita Ig-szerû receptor NKG2D MICA,MICB, ULPB aktiváló homodimer molekula, nem kapcsolódik CD94-el NKp30? aktiváló CD3?- malária falciparum NKp44? aktiváló vírus hemagglutinin ligandum? NKp46? aktiváló vírus hemagglutinin ligandum? NKp80? aktiváló, citotoxicitás 2B4 (CD244) CD48 aktiváló koreceptor, citokin termelés CD2 LFA-2 aktiváló koreceptor LFA-1 ICAM-1 aktiváló koreceptor CD16 Fc?IIIR aktiváló TLR PAMP aktiváló Toll receptorok Citokin közös?-lánc IL2-,IL15- IL21 proliferáció, citotoxicitás IFN?-R IFN? proliferáció citotoxicitás c-kit proliferáció PEN5 CD62L -PSGL1- CD40L CD40 apoptosis indukció 1. táblázat: Emberi természetes killersejtek (NK) sejtfelszíni receptorai. Az egyes receptoroknál látható az ismert ligandum és a receptorok fõ funkciója 11

12 Hogyan mûködnek a természetes killersejtek? 1. ábra: KIR-receptorok emberi NK sejtek gátló és stimuláló receptor génjei a 19q kromoszómán. Ig-SF receptorok (Lanier Curr. Op. Immunol., 2003 nyomán) 4. Az NK sejtek számos aktiváló receptorral bírnak. Az NKp46, NKp30 és az NKp44 elsõdlegesen citolitikus/aktiváló reakciót kiváltó NK receptorok. Az NKp46 mivel csak az NK sejteken fordul elõ, az NK sejtek markerének használható, bár ligandumuk biztonsággal nem ismert (35). Kiemelt jelentõségû az NKG2D receptor, amely valamennyi nyugvó és aktivált NK sejten (és egyes T- sejteken is) jelen van. Aktiváló szabályozó mûködést és γ-ifn-termelést fokozó cascade-jelet ad (22). Genetika Az immunglobulin szupercsalád (IgSF) receptor gének Az NK gének részben a 19q13.4 kromoszómán, az úgynevezett leukocyta receptor clusterben helyezkednek el (1. ábra). A centromer felé olyan fontos jeltovábbító molekulák génjei találhatók, amelyeket az NK receptorok is használnak mûködésük során (DAP10/KAP10, DAP12). A KIR receptorok specificitása az MHC-I molekulákra irányul, azonban azoktól függetlenül öröklõdnek. A receptorok 2 vagy 3 immunglobulin-szerû zárt lánccal (doménnel) bírnak, a sejt citoplazmájába benyúló farok részen pedig gátló motívum (ún. ITIM) található. A gének öröklõdésébõl következik, hogy mindenki számos olyan HLA-struktúra ellen irányuló KIR receptorral bír, amelynek liganduma nem is fordul elõ a saját szervezetében, azonban minden NK sejtnek van a saját HLA antigénjére specifikus receptora. Ez azt jelenti, hogy õssejt átültetés esetén a KIR receptorokkal szembeni (NK) inkompatibilitás valószínûsége jelentõsen emelkedik. Egy emberben a KIR gének (izotípusos és allotípusos) variációjának megfelelõen legalább 15 különbözõ KIR haplotípus fordul elõ. Az emberek között tehát több száz örökölhetõ variáció fordul elõ. Ezt a magas fokú eltérést a gének-, a génpárok-, valamint a rekombinációs helyek magas száma okozza. Egy haplotípust mintegy 8-14 KIR gén határoz meg. A haplotípusok szerkezetét meghatározó (framework) gének minden NK sejten kimutathatók (14). Az egyes genotípusok eltérõ gyakorisággal (1-9%) fordulnak elõ, a gének száma 6 (9%) és 15 (3%) között változik. A leggyakrabban a 2DL1, 2DL3, 2DL4, 3DL1, 3DL2, és a 3DL3 receptor gének mutathatók ki (19). Egy NK sejt tulajdonságát az aktiváló és gátló receptorok egyensúlya fogja meghatározni, amely a képzõdõ tumorsejtekkel szembeni reakció irányát is befolyásolja. Figyelembe véve az NK sejtek- 2. ábra: lektin receptorok emberi NK sejtek gátló és stimuláló receptor génjei a 12-es kromoszómán (Lanier Curr. Op. Immunol., 2003 nyomán) 12

13 nek a HLA rendszertõl független szegregálódását és genetikai polimorfizmusát, a jövõben várható, hogy az õssejt átültetéseknél az NK sejtek genetikai tipizálása bevezetésre kerülhet. Az NK sejtek reziduális leukémia sejteket elpusztító hatása, amely különösen akut myeloid leukémiás esetekben, haplo-identikus átültetéseknél igazolt, szintén támogatja ezt a folyamatot (ld. késõbb). Az NK-receptorok(KIR) jelzése a korábbi standard elnevezés szerint történik (20): KIR elsõ 2 betûje a domének számát jelzi, pl. 2D, 3D. Gátló (ITIM) motívumot fõként a hosszú (L, long) citoplazmikus farokkal bíró receptorok hordoznak pl. 2DL, 3DL. Aktiváló hatást általában a rövid, (S short) citoplazmikus farokkal bíró receptorok fejtenek ki, pl. 2DS, 3DS. Az utolsó digit azt jelöli, hogy milyen fajta (1-5) intracitoplazmikus résszel kapcsolódott a receptor: pl. 3DL4. C-típusú lektin gének Termékeik a kálcium függõ, a sejtfalon áthatoló fehérjék, amelyek a C-típusú, lektinkötõ külsõ doménnel bírnak. Az MHC komplexben kódolt, stressz indukált struktúrákat ismernek fel (MICA és MICB). Az NKG2 gének izoformjai (-A-H) számos glikoprotein receptort alkotnak a diszulfid híddal kapcsolódó CD94-el. Gátló, vagy aktiváló tulajdonságot hordoznak. Az emberi leukocyták lektin típusú receptorai a 12p12 p13 kromoszóma régióban kódoltak (2. ábra). A 28 génbõl álló komplex csak részben kódol NK receptorokat. Ezek egyrészt a nem klasszikus HLA E molekula receptorai (NKG2A), másrészt a további HLA-F és H molekulával (NKG2-C E, -H) kapcsolódnak (5). Az NKG2A NKG2F receptorok a CD94 molekulával kovalens kötéssel kapcsolódnak. Kivételt képez a kétláncú formában fontos aktiváló receptorként mûködõ NKG2D, amely nem kapcsolódik a CD94-el. A KIR család a 19-es, a lektin receptor család pedig a 12-es kromoszómán helyezkedik el kifejezetten konzervatív struktúrát jelentve. Így mind a receptorok mind a ligandumok egymástól függetlenül öröklõdnek. Az MHC (HLA) génektõl eltérõ öröklõdés (6-os kromoszóma) azt jelenti, hogy HLA-antigénekben egyezõ õssejt donorok az NK sejtek KIR receptoraiban még a nem egypetéjû ikrek esetében is eltérõek lehetnek (37). NK-fenotípusok Az utóbbi években lehetõség nyílt az NK sejtek KIR receptor fenotípusának standard genetikai módszerekkel (PCR) történõ meghatározására, mivel a szükséges primerek rendelkezésre állnak (8,28). Ennek fontosságát az újabb klinikai adatok tükrében ítélhetjük meg. Érdekesek azok a micro-array vizsgálatok, amelyek arról számolnak be, hogy bizonyos NK gének csak a korai, mások a késõi NK sejtekben mutathatók ki és végül a gének egy része mindkét sejtcsaládban kimutatható. További kutatómunka szükséges ahhoz, hogy a gének és az NK sejtek mûködésének összefüggését megismerhessük (36). Hogyan mûködnek a természetes killersejtek? Újabban az NK sejtek átíródási aláírásáról számolnak be a kutatók. Ezen számos DNS micro-array vizsgálat adatainak analízisébõl kialakított olyan átírt (fehérje) struktúrákat értenek, amelyek együttesen jellemzõek és megkülönböztetik az NK sejteket más sejttípusoktól, különösen a T-, B- és NK/T sejtektõl (79 ilyen gén jellemzõ kombinációjáról számolnak be) (35). Klinikai megfigyelések Elöljáróban megemlítendõ, hogy az eddigi klinikai megfigyelések azt bizonyítják, hogy az õssejt donor és a befogadó szervezet (recipiens) közötti NK kompatibilitás szintje egyértelmûen befolyásolhatja a beültetett sejteknek a gazda szervezet ellen meginduló immunreakcióját, amely az életet veszélyeztetõ ún. graft versus host (GVH) betegség formájában nyilvánul meg. További megfigyelések kellenek azonban ahhoz, hogy ennek a viszonynak a részleteit is megismerhessük. Ésszerû tehát, hogy az NK sejtek receptorainak genetikai módszerekkel történõ meghatározása tért nyerjen és az eddigi eredményekbõl bevezetésre kerüljenek azok az eljárások, amelyek a betegek javát szolgálhatják. Ismeretes, hogy a fehérvérûségek (leukémiák) gyógyításának elõkészítésénél (kondicionálás) a lehetséges maximális sejtölõ kezelés (besugárzás + kémiai szerek) szinte teljesen elpusztítja a befogadó szervezet saját immunkompetens- és vérképzõ sejtjeit, azonban a leukémia sejtekbõl rezisztens sejtpopulációk maradnak a szervezetben, amelyekbõl a malignus folyamat kiújulhat. Az õssejt átültetéseket (csontvelõ transzplantáció) követõ regenerációban a periférián megjelenõ elsõ sejtcsaládot az NK sejtek alkotják, amelyek donor NK sejtek jellemzõit hordozzák. Fontos kiemelnünk, hogy az utóbbi években az NK sejtek felszíni receptorainak részletes analízisére egyszerû genetikai módszerek (PCR) állnak rendelkezésünkre, amellyel a sejtek allo-specificitása vizsgálható (8,28). Az õssejt átültetések jelentõs részében nem található optimális családi donor, ezért a 90-es évek elején, az állatkísérletekbõl szerzett kutatási eredmények alapján megindultak a családon belüli haplo-identikus õssejt átültetések, amelyek a teljes kompatibilitású rokon donor hiányát és a HLA kompatibilis nem rokon donor-keresés idõt veszítõ és költséges voltát kívánták áthidalni. Ezzel a folyamattal együtt járt a T-sejt-mentesítés eljárásainak és mértékének, valamint a kondicionáló kezelések módszerének fejlõdése is, amely szükséges a nagyon érzékeny egyensúlyi állapot elérésére és fenntartására a maradék leukémia sejtek elölése és a GVH reakció minimalizálása céljából (33). Az átültetett NK õssejtekben ugyanis hiányoznak a beteg HLA antigénjeire specifikus gátló receptorok, amelyek a gátlás hiányában elpusztítják a maradék leukémia sejteket. Az NK sejtek nagy affinitással bírnak a csontvelõi sejtek irányában. Ez lehet a további magyarázata annak, hogy a maradék repopulálódó leukémia sejteket elpusztítják, meggátolva a betegség kiújulását. In vitro és egér kísérletek arra utalnak, hogy a limfoid leukémia sejtek ellen- 13

14 állók az NK-killinggel szemben a myeloid sejtekhez képest (25). Az allo-reaktív NK sejtek felismerik és szintén eliminálják a recipiens antigén-prezentáló dendritikus sejtjeit (APC), amely a hematopoietikus affinitáson túl tovább magyarázza, hogy az allo-reaktív NK sejtek nem váltanak ki GVH reakciót (13). Érdekes megfigyelés, hogy leukémiák heterogén csoportjában a HLA-BW6 csoport gyakoribb leregulálását észlelték, mint a HLA- BW4-csoportba tartozó ligandumokét. Ismeretes ugyanis, hogy a BW6 csoportot az NK sejtek nem látják, így leregulálásuk, és a BW4 csoport megtartása (amit az NK sejtek látnak ), a leukémia sejteket mind az NK-, mind a T-sejtes citotoxikus immunmechanizmus elõl megmenekíti (33). A közleményekben megjelenõ klinikai megfigyelések és a különbözõ analízisek összehasonlítása nehézségekbe ütközik, mivel eltérõ diagnózisokat, betegségcsoportokat alkotnak, amelyet a kondicionáló kezelés, az életkor, az összehasonlításra alkalmazott paraméterek eltérései és még számos más faktor tovább bonyolítanak, megnehezítve, hogy statisztikai módszerekkel összevethetõ eredményekhez jussunk. Korábbi vizsgálatok a HLA azonos õssejt átültetésekben azt mutatták, hogy ha a befogadó szervezet KIR genotípusában megtalálható volt a nem rokon (idegen) donor KIR genotípusa, akkor 100%-ban fejlõdött ki GVH betegség, amíg rokon donor esetében, ha a recipiens genotípusa benne elõfordult, nem fejlõdött ki GVHD. Az összes további kombinációban 60% volt a GVH-betegség elõfordulása (8). A nehézségek ellenére nagyobb betegcsoport folyamatos analízisével tisztázódni látszanak azok az immunológiai folyamatok, amelyek az õssejt átültetéseknél jelentõs szerepet játszanak. Korábbi, 112 magas kockázatú akut leukémiás beteg kezelésébõl nyert eredmények egyértelmûen bizonyították az allogén reaktív NK sejtek szerepét a betegek túlélésében. A reaktív immungenetikai viszonyban végzett átültetések után nem következett be az átültetett õssejtek kilökõdése és a legalább II. fokozatú GVHD sem alakult ki (0% vs.13,7%). Ugyanakkor már ez a tanulmány is rámutatott arra, hogy a kedvezõ hatás elsõsorban AML kezelésében tapasztalható. Az 5 éves túlélés során relapsust sem észleltek (0% vs. 75%) AML-ben (27). Más közleményükben, 85 progresszív stádiumú AML beteg ( között transzplantált) esetében jelentõsen csökkent a relapsusok száma az allo-reaktív NK csoportban (17% vs. 79%) és a betegek 52%-a esemény mentesen élt túl a nem-reaktív csoporttal szemben (7%) (25). A recipiens MHC-I ligandjaival reagáló donor NK sejtek transzplantációját követõen több, mint 100 magas kockázatú, felnõtt AML beteg analízisével bizonyították, hogy mind a transzplantáció veszélyét jelentõ GVH-betegség kockázata, mind az alapbetegség kiújulásának veszélye egyértelmûen csökkent. Az alloreaktív NK- (un.reagáló) donor az egyik független prognosztikai tényezõnek tekinthetõ a betegek túlélésében is. A családi alloreaktív donorok alkalmazásának határa van, ugyanis immungenetikai okok miatt a családtagok egyharmada nem reaktív (26). AML-ben és MDS-ben azt észlelték, hogy azok a betegek, akikben hiányzott a donor KIR genotípusnak megfelelõ HLA ligandum, szignifikánsan hosszabb betegség-mentes és átlagos túlélési idõt mutattak (10). Hasonlóképpen ugyanez volt megfigyelhetõ 372 korai stádiumú myeloid leukémiás betegnél (CML) is akiknek egyik KIR ligandjuk (MHC-I) hiányzott (21). A KIR-receptorok jelentõségét újabb fontos eredmények húzzák alá. 202 HLA azonos testvér közötti õssejt-transzplantált beteg klinikai adatainak elemzésével bizonyították, hogy a transzplantáció eredményessége függ a donor- és recipiens KIR genotípusától. Aktiváló típusú KIR receptor jelenléte a donor sejteken emelte az immun-reaktivitást, ugyanakkor a befogadó szervezet gátló KIR receptorai az elfogadást segítették elõ. Az alapbetegség kiújulása nélküli túlélés különösen AML-ben bizonyult kifejezetten hosszabbnak. A legutóbbi és korábban megjelent klinikai közlemények (29) rávilágítanak a HLA egyezõség vizsgálata mellett a gátló- és aktiváló KIR receptorokkal bíró NK sejtcsaládok szerepére az átültetett õssejtek megtapadásában, valamint a GVH betegség kiváltásában. További kiterjedt vizsgálatok és klinikai megfigyelések szükségesek a fenti ígéretes eredmények megerõsítésére és az aktiváló/gátló KIR receptorok immungenetikai tesztelésére, amelyek jelentõsen megváltoztathatják az õssejt transzplantációs terápiás eljárásban eddig követett kiválasztási stratégiánkat (13). Az NK sejteknek az õssejt transzplantációkban betöltött szerepével a közelmúltban megjelent munkánkban részletesen is foglalkoztunk (2). Azt is észlelték, hogy nem rokon õssejt átültetést követõ GVHD erõsségét növelte, ha a leukémiás betegek több gátló KIR receptorral bírtak, mint a donorok és/vagy a donoroknak több aktiváló receptora volt, mint a betegeknek. Végül csökkent a betegség kiújulása, ha a donoroknak KIR2DS1 és 2DS2 receptoruk volt (29). Japán szerzõk 379 vastagbél-daganatos beteg vizsgálatával megállapították, hogy a magas NK aktivitásvédõhatású ebben a daganattípusban (7). A klinikai megfigyelések közül még megemlítenénk azt a gyakorlati szempontból is fontos adatot, hogy átültetett máj transzplantátumok sikeres befogadására lehet következtetni, ha a KIR2DL1/S1 (CD158a), illetve a KIR2DL2/3/S2 (CD158b) pozitív NK és memória T- sejtek száma az átültetés elõtt az egészséges kontrollokéhoz hasonló, illetve a mûtét után jól regenerálódik (16). Ez utóbbi közlemények azt az egyébként logikus következtetést támasztják alá, hogy az NK sejtek mind a hematopoietikus, mind a szervátültetésben fontos immunológiai funkciót töltenek be. A magzat védelme Hogyan mûködnek a természetes killersejtek? Az elsõ trimeszterben a méhben egy különleges NK sejtcsalád alkotja a limfoid sejtek mintegy 70-90%-át. Ezek az uterus NK sejteknek (unk) nevezetett sejtek aktivált populációnak tekinthetõk, amelyek a méh átalakult nyálkahártyájában hormonális szabályozás alatt 14

15 állnak, eltérõ sejtfelszíni markereik pedig a korai NK sejtekre emlékeztetnek. A méhbe beágyazódó petesejt genetikai okok miatt immunológiailag félig idegen (szemi-allogén). Az embrió burkokon a HLA-C mellett, a nem klasszikus HLA-G és HLA-E fejezõdik ki. A G-molekula, LIR-1 receptorain keresztül gátolja, hogy az unk sejtek felismerjék a szemi-allogén trophoblast sejteket, amely elõsegíti a foetus beágyazódását és fejlõdését (24). További, és újabb vizsgálatok szerint elõtérben álló gátló mechanizmus a HLA-E molekula és a CD94-NKG2 (-A és -C) lektin receptor kapcsolat, amely fiziológiás terhesség esetén gátló hatást fejt ki. Mindeddig az a logikus munkahipotézis, hogy az unk sejtek a szemi-allogén foetust ismerik fel és végsõ soron az elsõ trimeszterben a terhesség fennmaradásában, illetve a spontán vetélésekben a legfontosabb immunológiai tényezõt jelentik (12), kellõképpen még nem bizonyított. Korábbi munkánkban ezzel a kérdéssel részletesebben is foglalkoztunk. A hormonális szabályozás és progeszteron indukálta blokkoló faktor kapcsolatában magyar kutatók értek el figyelemre méltó eredményeket (PIBF)(9, 30,31). Jól ismert tény, hogy a kísérletes vizsgálatok eredményei csak igen lassan és kellõ kritikai vizsgálatok után szûrõdnek át a klinikumba. Örömmel látjuk az újabb közleményeket, amelyek azt jelzik, hogy az évtizedek kísérletes eredményei, különösen a genomikai vizsgálatok révén a klinikumban hasznosulnak. Irodalomjegyzék 1. Arnon T., Markel G., Mandelboim O.: Tumor and viral recognition by natural killer cells receptor. Semin. Cancer Biol., 16, , Benczúr M.: Emberi NK sejtek allogén felismerõ képessége és funkciója az õssejtek transzplantációjában. Hemat. Transzf., 39, 5-9, Benczúr M.: Emberi természetes ölõsejtek (NK) genomikája és mûködése. Magyar Tudomány, 4, , Benczúr M., Petrányi G Gy., Pálffy Gy.et al.: Dysfunction of natural killer cells in multiple sclerosis: a possible pathogenetic factor. Clin. Exp.Immunol., 39, , Borrego F., Kabat J., Dae-Ki K. et al.: Structure and function of major histocompatibility complex (MHC) class I specific receptors expressed on human natural killer (NK) cells. Mol. Immunol., 38, , Cooper M., Fehniger M.A., Caligiuri M.A.: The biology of human natural killer-cell subsets. Trends Immunol., 22, , Furue H., Matsuo K., Kumimoto H. et al.: Decreased risk of colorectal cancer with the high natural killer activity NKG2D genotype in Japan. Carcinogenesis, 29(2), , Gagne K.G., Brizard B., Gueglio N. et al.: Human Relevance of KIR gene polymorphisms in bone marrow transplantation outcome. Immunology, 63, , 2002 Hogyan mûködnek a természetes killersejtek? 9. Hammer C.A., Polgár M., Hartmann R. et al.: Human trophoblast cells express the immunomodulator progesterone-induced blocking factor. J. Reprod. Immunol., 79, 26-36, Hsu K.C., Keever-Taylor C.A., Wilton A. et al.: Improved outcome in HLA-identical sibling hematopoietic stem-cell transplantation for acute myelogenous leukemia predicted by KIR and HLA genotypes. Blood, 105, , Hyung-Sik K., Kimb E-M., Sanggyu L.: Stage-dependent gene expression profiles during natural killer cell development. Genomics, 86, , Lanier L.L: NK receptors. Ann. Rev. Immunol., 16, , Leung W.R., Iyengar V., Turner P. et al.: Determinants of antileukemia effects of allogeneic NK cells. J. Immunol., 172, , Li Hao: Evolution of natural killer cell receptor genes. PhD értekezés. Pennsylvania State Univ., Ljunggren H.G., Kärre K.: In search of the missing self: MHC molecules and NK cell recognition. Immunol. Today, 11, , Lopez-Álvarez M. et al.: Analysis of KIR2D receptors on peripheral blood lymphocytes from liver graft recipients. Transplant. Immunol., 17, 51-54, Loza M.J., Perussia B.: The IL-12 signature: NK cell terminal CD56+ high stage and effector functions. J. Immunol., 172, 88 96, Maghazachi A.A.: Compartmentalization of human natural killer cells. Mol. Immunol., 42, , Malmberg K-J. Schaffer M., Ringdén O.: KIR-ligand mismatch in allogeneic hematopoietic stem cell transplantation. Mol. Immunol., 42, , Marsh S.G., Parham B., Dupont D.E. et al.: Killer-cell immunoglobulin-like receptor (KIR), nomenclature report, Tissue Ant., 62, 79-86, Miller J.S., Cooley,S., Parham P. et al.: Missing KIR ligands are associated less relapse and increased graft-versus host disease (GVHD) following unrelated donor HCT. Blood, 109, , Moretta L., Bottino C., Pende D. et al.: Human natural killer cells: Molecular mechanisms controlling NK cell activation and tumor cell lysis. Immunol. Letters, 100, 7-13, Moretta A., Bottino M., Pende D.: Surface NK receptors and their ligand on tumor cells. Semin. Immunol., 18, O Connor G.M., Hart O.M., Gardiner C.M.: Putting the natural killer cell in its place. Immunology, 117, 1-10, Ruggeri L., Capanni M., Mancusi A. et al.: Natural killer cells as a therapeutic tool in mismached transplantation. Best Practice &Res. Clin. Haematol., 17, , Ruggeri L., Capanni M., Urbani et al.: Effectiveness of donor natural killer cell alloreactivity in mismached hematopoietic transplants. Science, 295, , Ruggeri L., Mancusi A., Burchielli E. et al.: Natural Killer cell recognition of missing self and haploiden- 15

16 tical hematopoietic transplantation. Sem. Cancer Biol., 16, , Steffens U., Vyas Y., Dupont B. et al.: Nucleotide and amino acid sequence alignment for human killer cell inhibitory receptors (KIR). Tissue Ant., 51(4), , Sun J.Y., Gaidulis L., Dagis A. et al.: Killer Ig-like receptor (KIR) compatibility plays a role in the prevalence of acute GVHD in unrelated hematopoietic cell transplants for AML. Bone Marrow Transpl., 36, , Szekes-Bartho J., Faust Zs., Varga L. et al.: The immunological pregnancy protective effect of progesterone is manifested via controlling cytokine production.; Am.J. Reprod. Immunol., 35, , Szekeres-Bartho J., Kilar F., Falkay G. et al.: The mechanism of the inhibitory effect of progesterone on lymphocyte cytotoxicity I. Progesterone-treated lymphocytes release a substance inhibiting cytotoxicity and prostaglandin synthesis. Am. J. Reprod. Immunol. Microbiol., 9, 15 18, 1985 Hogyan mûködnek a természetes killersejtek? 32. Trinchieri G.: Biology of disease of human NK cells: Biological and pathological aspects. Lab. Invest., 50, , Verheyden S., Demanet C.: NK cell receptors and their ligand in leukemia. Leukemia, 22, , Vivier E.: What is natural in natural killer cells? Immunol. Letters, 107, 1 7, Walzer T., Jaeger S., Chaix J. et al.: Natural killer cells: from CD3-NKp46+ to post-genomics meta-analyses Curr. Op. Immunol., 19, , Wilk E., Kalippke K., Buyny S. et al.: New aspects of NK cell subset identification and inference of NK cells regulatory capacity by assessing functional and genomic profiles. Immunobiol., 213, , Wilson M.J., Torkar M.A., Haude T. et al.: Plasticity in the organization and sequences of human KIR/ILT gene families. PNAS USA, 97, , Zhang C., Zhang J., Wei H.: Imbalance of NKG2D and its inhibitory counterparts: How does tumor escape from innate immunity? Internat. Immunopharmacol., 5, , 2005 Megrendelõlap (Focus Medicinae) Alulírott, postai úton megrendelem a Focus Medicinae címû kiadvány... számát,... példányban 650,- Ft + 5% áfa/pld. áron. Megrendelõ neve:... Címe:... Megrendelését az alábbi címre kérjük elküldeni: Dursusz Bt Budapest, Juhász u. 47/A. Telefon/Fax: dursusz@mail.datanet.hu 16

17 Autoimmunitás: alapmechanizmusok és azok szerepe endokrin betegségekben Dr. Kalmár Ágnes, Dr. Szolnoky Miklós Autoimmunitás: alapmechanizmusok és azok szerepe endokrin betegségekben Fõvárosi Önkormányzat Szent János Kórháza és Észak-budai Egyesített Kórházai, Budapest Összefoglalás: A saját antigénekkel szembeni immunválasz szabályozása magába foglalja az autotolerancia fenntartását is. Ha a tolerancia sérül, az immunrendszer a sajátot idegenként ismeri fel, és celluláris valamint humorális immunreakciót hoz létre ellene, ami autoimmun betegség kialakulásához vezet. A tolerancia megváltozásában genetikai és környezeti tényezõk egyaránt közrejátszanak. A tolerancia aktív folyamat, centrális és perifériás része is van, mindkettõben részt vesznek a T- és B- lymphocyták. A tolerancia elvesztése elméletileg számos módon megtörténhet. Ezek közül a legkézenfekvõbb a perifériás tolerancia károsodása azokban az autoimmun betegségekben, amelyek igen szelektív módon csak egyes szerveket érintenek. Mivel egyes endokrin betegségekhez gyakrabban társulnak egyéb autoimmun endokrin és nem endokrin kórképek, az ilyen betegségek fennállása esetén rendszeres szûrõvizsgálatokkal keresni kell a társult kórképet. Továbbá szisztémás autoimmun betegségekhez gyakran társulhatnak autoimmun endokrin kórképek, így lehetséges az is, hogy a felfedezett endokrin megbetegedés esetleg egy szisztémás autoimmun betegség részjelensége. Ezért is fontos a pontos diagnózis felállítása és a lehetséges endokrinológiai kapcsolatok tisztázása. Kulcsszavak: antigén bemutatás, autoantigén, autoantitest, autoreaktív lymphocyta, kostimulációs molekulák, MHC, regulátoros T-sejtek, tolerancia, CTLA-4, PTPN22, CD40, Aire gén, FoxP3, HLA régiók, MHC, monoklonális antitest terápia Rövidítések jegyzéke: MHC = major histocompatibility complex TCR = T-sejt receptor T1D = 1-es típusú diabetes mellitus Treg = regulátoros T-sejtek Th = helper T-sejtek HLA = human leukocyta antigén Aire = autoimmun regulátor TGF-β = transforming growth factor IL = interleukin CTLA-4 = citotoxikus T-lymphocyta asszociált faktor 4 AITD = autoimmun pajzsmirigy betegség SLE = szisztémás lupus erythematodes SNP = single nucleotide polymorphism PTPN22 = protein tirozin foszfatáz GAD = glutaminsav dekarboxiláz enzim NOD = non-obese diabetic IA-2 = inzulinoma-asszociált-2 ICA = islet cell antigén - szigetsejt antigén APECED = autoimmune polyendocrinopathy, candidiasis, ectodermal dystrophy IPEX = immune dysregulation, polyendocrinopathy, enteropathy, X-linked IVIG = nagydózisú intravénás immunglobulin Summary: The regulation of immune-response against the own antigens includes the maintenance of autotolerance. If the tolerance is destroyed, the immune system detects the own as foreign, thus forces cellular and humoral immune reaction against them, which causes the formation of an autoimmune disease. Some genetic and ambient factors play role in the modification of tolerance as well. The tolerance is an active process, it has central and periferal parts, the T- and B-lymphocytes take part in both of them. The lost of tolerance can happen on more ways theoretically. The most plausible the impairment of the peripheral tolerance in such autoimmune diseases, which are selective to certain organs. While some other autoimmune endocrine and non-endocrine diseases can be joined to certain endocrine illnesses, in the persistance of these cases more frequently the associated disease must be looked for by frequent screenings. Furthermore some autoimmune endocrine diseases can be joined to systemic autoimmune illnesses frequently, therefore a detected endocrine disease might be a partsymptom of a systemic autoimmune illness. Because of it the exact diagnosis and clarifying of the possible endocrine contacts are important. Key words: antigen presentation, autoantigen, autoantibody, autoreactive lymphocyte, costimulations molecules, MHC, regulatory T-cells, tolerance, CTLA-4, PTPN22, CD40, Aire gene, FoxP3, HLA regions, MHC, monoclonal antibody therapy Bevezetés A saját antigénekkel szembeni immunválasz szabályozása komplex folyamat, amely magába foglalja az autotolerancia fenntartását a hatékony immunválasz kifejtésének megõrzésével egyidejûleg. Ha a tolerancia sérül, az immunrendszer a sajátot idegenként ismeri fel, és sejtes valamint humorális immunreakciót hoz létre ellene, ami autoimmun betegség kialakulásához vezet. A tolerancia megváltozásában genetikai és környezeti tényezõk egyaránt közrejátszanak. Az autoimmun betegségek létrejöttében különbözõ gének polimorfizmusának szerepét vetették fel, ezt bizonyos esetekben már igazolták is. A környezeti ágensek közül is több, de mindeddig nem kellõen bizonyított tényezõ hatása is felmerült: infekciók, stressz, dohányzás. A különbözõ faktorok egyénenként változó jelentõséggel bírnak, ezért az autoimmunitás kialakulása tekintetében nincs egyértelmû genotípus-fenotípus kapcsolat (2,3). Autotolerancia Az autoimmun reakció során patogén autoantitestek és a saját ellen fellépõ sejtes immunválasz egyaránt 17

18 Autoimmunitás: alapmechanizmusok és azok szerepe endokrin betegségekben létrejönnek. Ezt a folyamatot általában az immunológiai tolerancia szorítja határok közé. A tolerancia aktív folyamat, centrális és perifériás része is van, mindkettõben részt vesznek a T- és B-lymphocyták is. A centrális T-sejt tolerancia a thymusban a T-sejtek érése folyamán alakul ki. Azok az érõ T-sejtek, melyek nagy kötõerõvel (aviditással) ismerik fel a saját MHC (major histocompatibility complex) saját peptid komplexeket klonális deléción esnek át és elpusztulnak. Ugyanakkor az érõ B-sejtek is átesnek tolerizáción: az IgM pozitív, éretlen, naív B-sejtek antigénnel való találkozáskor vagy anergiássá válnak, vagy elpusztulnak. A T-sejt ontogenezis során nem minden antigén kerül be a thymusba, ezért szükséges a perifériás T-sejt tolerancia fennállása is. A T-sejt aktiváció kezdetéhez két szignál szükséges. Az egyik antigén-specifikus, és az MHC-T-sejt receptor (TCR) komplexen keresztül jut érvényre, míg a második nem specifikus, pl. a T-sejteken levõ CD28 kostimulációs molekula és az antigén bemutató sejteken levõ B7 kölcsönhatásából származik. Perifériás tolerancia akkor alakul ki, ha a második jel hiányzik, ez a klonális anergia. Ennek az elvesztése az 1-es típusú diabetes mellitus (T1D) kialakulásának egyik alapmechanizmusa. A perifériás tolerancia további formái: autoreaktív T-sejtek deléciója, ignorancia, aktív szuppresszió regulátoros T-sejtek (Treg) által (4). A perifériás B-sejtes tolerancia a T-sejtes tolerancián keresztül alakul ki, ehhez is két szignál szükséges. Az elsõ a B-sejt receptor (felszíni antitest) és az antigén kölcsönhatásából származik, a második helper T-sejtektõl (Th). Ha ez utóbbi hiányzik (mert a T-sejtek toleránsak), a B-sejtek nem aktiválódnak, nem proliferálnak és nem történik meg az immunglobulin osztályváltás, így a B-sejtek nem termelnek IgG típusú autoantitesteket nagyobb mennyiségben. Autoimmun betegségek kialakulása: a tolerancia elvesztése A tolerancia elvesztése elméletileg számos módon megtörténhet. Ezek közül a legkézenfekvõbb a perifériás tolerancia károsodása azokban az autoimmun betegségekben, amelyek igen szelektív módon csak egyes szerveket érintenek. További elméletek a tolerancia elvesztésére: a klonális deléció elmaradása, antigén szekvesztráció, saját antigének megváltozása, károsodott MHC-II expresszió, szuperantigén elmélet és poliklonális B-sejt stimuláció. A folyamatok genetikusan programozottak, specifikus immunválasz géneken keresztül jutnak érvényre. Antigén bemutatás Az aktív immunválasz vagy tolerancia kialakulásának elsõ lépése az antigén felismerése. Az antigén bemutatásban az MHC-I és MHC-II molekuláknak döntõ jelentõsége van, hiszen a T-sejtek az ezekkel kötõdött antigéneket ismerik fel az antigén bemutató sejteken. Az MHC molekulák átírását kódoló HLA (human leukocyta antigén) régió a 6-os kromoszómán helyezkedik el, amely számos immunválasz gént is tartalmaz. Ide sorolható az Aire (autoimmun regulátor) gén, amely számos autoantigén, pl. az inzulin transzkripcióját elõsegíti, és szerepel az autoreaktív thymocyták negatív szelekciójában. Hiányában tehát az autoreaktív T-sejtek nem pusztulnak el a thymusban, és ez alapot teremt több endokrin szervben az autoimmun betegség létrejöttéhez (ld. APS1). A legfontosabb antigén bemutató sejtek a dendritikus sejtek. Az indukált dendritikus sejtek autoantigént mutatnak be a T-sejtek számára, és ezáltal biztosítják nyugalmi állapotban a perifériás toleranciát. Bizonyos körülmények között azonban tolerancia helyett (pl. anti- CD40-el való kezelés) T-sejt aktiváció lép fel. 1-es típusú diabetes mellitusban B-sejtek is közremûködnek az antigén bemutatásban és ezáltal autoreaktív T-sejtek indukálásában. Így pl. B-sejt hiányos egerekben késõbb alakul ki insulitis, nem jön létre a fõ autoantigénekkel, GAD65-el és HSP60-al szemben autoreaktív T-sejt válasz sem. Ezért terápiásan kiaknázható lehet a B-sejt depletáló monoklonális antitestek alkalmazása. Regulátoros T-sejtek A CD4+CD25+Foxp3+ Treg sejtek az immunrendszer fõ szabályozói. Normális állapotban fenntartják a sajáttal szembeni toleranciát, túlmûködésük azonban gyengíti a tumorsejtek és paraziták feletti immunfelügyeletet. A természetes Treg sejtek biztosítják nyugalmi helyzetben a kontrollt, míg az indukált Treg sejtek gyulladásos körülmények között, amikor citokin termelés is szükséges a gátló folyamatok erõsítéséhez. A regulátoros T-sejtek feladata az effektor T-sejt válaszok gátlása, mely az autoreaktív T- sejteket is érinti. A természetes Treg sejtek Foxp3 pozitívak, amely a CD4+CD25+ regulátoros T-sejtek funkciójáért felelõs transzkripciós faktor. Ezen kívül egyéb markereket is hordoznak: GITR, CTLA-4, LAG-3, FR4 (folát receptor), kemokin receptorok, homing molekulák. Utóbbiak révén alakul ki a szervspecificitás, mely terápiásan is kihasználható lehet ezen molekulák indukciójával, mint az alább látható. A Foxp3 mutációja a Treg sejtek képzésének zavarához vezet. IPEX szindrómában (immun disregulatio, polyendocrinopathia, enteropathia, X-linked) a Foxp3 gén defektusa áll fenn. Ezek a betegek fatális kimenetelû autoimmun betegségben szenvednek, ideértve a pajzsmirigy betegségeit is. Állatkísérletben a betegség kialakulása CD4+CD25+ sejtek átvitelével megelõzhetõ. Az indukált regulátoros T-sejtek a perifériás limfoid szervekben alakulnak ki saját antigén expozíció hatására, amikor TGF-β (transforming growth factor) termelõ Th3 (helper) sejtek képzõdnek. Ezek a sejtek bystander szuppresszióra is képesek, ami azt jelenti, hogy nemcsak a kiváltó antigénnel szemben érvényesül a szabályozás. Ismételt antigén behatásra Tr1 (regulátoros) sejtek fejlõdnek ki, melyek interleukin 10-t (IL-10) termel- 18

19 Autoimmunitás: alapmechanizmusok és azok szerepe endokrin betegségekben nek. Újabban CD8+ regulátoros T-sejteket is izoláltak, melyek Foxp3-t, CTLA-4-t, GITR-t expresszálnak (9,10). A hormonok fontos szerepet töltenek be a Treg sejtek kifejlõdésében és fenntartásában. Az ösztrogén kezelés in vivo is emeli a Treg sejtek, sõt az IL-10 termelõ Tr1 sejtek számát is. A zsírszövet is számos hormont termel. Ezek közül a leptin immunregulátoros sajátságokkal is rendelkezik, gátolja a Treg sejtek expanzióját (mivel azok leptin receptort hordoznak). Ebbõl kifolyólag leptin receptor ellenes antitestekkel a Treg sejtek proliferációja elõsegíthetõ. Mindez aláhúzza az endokrin és immunrendszer kölcsönhatásának jelentõségét. Infekciók szerepe az autoimmunitás kialakulásában A fertõzõ ágensek hatékony stimulust jelentenek az immunrendszer számára, és arra érzékeny egyénekben autoreaktív T-sejtek szelekciójához is vezethetnek. Több infekció és autoimmun betegség között fedeztek fel kapcsolatot (T1D), de a patogenetikai összefüggés a mai napig nem tisztázott. Az egyik magyarázat a molekuláris mimikri, amely akkor lép fel, ha egy saját antigén és egy idegen antigén között keresztreakció áll fenn, aminek következtében a sajátot idegenként ismeri fel az immunrendszer. A keresztreaktivitást a T-sejt epitópok korlátozott felismerõ-képessége is okozhatja, mivel egy T-sejt receptor több hasonló szerkezetû antigént is felismerhet, intrinsic keresztreaktivitást eredményezve. A peptidek MHC-hez való kötõdési erõssége is döntõ: az instabil komplexek nem érnek el negatív szelekciót a thymusban, de a periférián T-sejt proliferációt képesek elindítani. Másik lehetõség a keresztreaktivitás kialakulására, ha egy T-sejten két TCR van, különbözõ specificitással. Ha az egyik patogén specifikus, pozitívan szelektálódik, ezáltal lehetõséget teremtve, hogy a másik autoreaktív TCR kikerülje a negatív szelekciót és elérje a perifériát (példa rá: inzulin specifikus TCR-t hordozó T-sejtek). Mindettõl függetlenül a keresztreaktivitás nem elegendõ az autoimmun betegség kialakításához, más tényezõk is hozzá kell, hogy adódjanak. Az ún. bystander aktiváció nem-specifikus mechanizmus, aminek a folyamatában különbözõ kemokinek és citokinek termelõdnek, amelyek bystander sejteken is hatnak és azokat aktiválhatják. Coxsackie vírusfertõzésben láthatunk ilyet, amikor állatkísérletes adatok szerint az immunválasz során kialakult gyulladás elindíthatja diabetes kifejlõdését autoreaktív T-sejtek kialakulását erõsítve. Az epitop spreading egy másik alternatív mechanizmus, amellyel az autoimmunitás kezdetét magyarázzák. Ennek értelmében, ha a sejt valamilyen okból károsodik, saját antigének kerülhetnek bemutatásra, és kihívást jelentenek az immunrendszer számára. Környezeti hatások A higiéne hipotézissel magyarázzák, hogy emelkedik az autoimmun betegségek száma a kevesebb infekció, a védõoltások eredményeképpen. A szocio-ökonomikus körülményekben és az infekciók számában fennálló különbségek hatását példázza az a vizsgálat, amely finn és orosz gyerekeket hasonlít össze, azzal az eredménnyel, hogy a finnekben gyakoribb az anti-tpo és anti-tg elõfordulása. Gén polimorfizmusok jelentõsége Molekuláris genetikai vizsgálatokkal számos olyan gént, gén polimorfizmust találtak, melyek részben közös autoimmun hajlamosító gént jelentenek, részben olyanokat, amelyek az egyes szervek autoimmun betegségének létrejöttét segítik elõ. A közös, autoimmun regulációban részt vevõ gének közül néhánynak a jelentõségét részletezzük. A CD40 gén az egyetlen gén, amely a B-sejt regulációban vesz részt. A CD40 B-sejt aktivációs molekula, ligandja a CD154 a helper T-sejteken. A stimulált B-sejt második aktivációs jel hiányában rövid életû lesz, és csak kevés, mérsékelt affinitású antitestet fog termelni, melyek IgM izotípusúak. Ezt bizonyítja, hogy a CD154 elleni monoklonális antitestek meggátolják mind a primer, mind a szekunder antitestválasz kialakulását, és a kísérleti autoimmun betegségek (Graves betegség) fellépését is. A CD40 C allél (Kozak polimorfizmus) a T-allélhez képest fokozza a CD40 mrns transzkripcióját, és ily módon a CD40 B-sejteken való expresszióját, ezáltal a B-sejtek könnyebben aktiválhatóvá válnak és autoimmun betegség a legkisebb behatásra elindulhat. A B- sejtek CD40 úton való aktivációja fokozódó IL-10 képzéshez és ezen keresztül a Th1/Th2 egyensúly Th2 felé való eltolódásához vezet, ami humorális autoimmun betegségek, pl. Graves betegség szempontjából kockázati tényezõt jelent. A CD40 megjelenik a thymocytákon, amelyek ezen kívül MHC-II expresszióra is képesek és ily módon antigén bemutató sejtként szerepelhetnek. Ugyanakkor Th1 dominanciájú autoimmun betegségekben (Hashimoto) a CD40 Kozak polimorfizmus nem játszik szerepet. A CTLA-4 molekula (citotoxikus T-lymphocyta asszociált faktor 4) a T-sejt aktivitás legfõbb negatív mediátora. A CTLA-4 monoklonális ellenanyaggal való blokkolása T-sejt aktivációhoz és IL-2 termelõdéshez vezet. Több polimorfizmust találtak, amely autoimmun betegségekkel összefügg, amelyek a CTLA-4 expresszióját vagy mûködõképességét befolyásolják, így a T-sejtek aktivációja fokozódik, minek folytán autoimmun folyamat elindulhat. A CTLA-4 polimorfizmusa számos autoimmun betegséggel összefügg, T1D, Addison kór, autoimmun pajzsmirigy betegség (AITD) minden formája, szisztémás lupus erythematodes (SLE): általános autoimmun génlokusznak tekinthetõ. Az, hogy mely szervben indul el az autoimmun folyamat, függ a környezeti tényezõktõl és a szervekre specifikus genetikai meghatározottságtól (pl. inzulin gén polimorfizmus) vagy egyéb genetikai hajlamosító génlokuszok polimorfizmusától (MHC) (7). A G allél esetében emelkedett a thyreoglobulin és TPO ellenes autoantitestek szintje, AITD relatív kockázatát 2,0-nek találták. A 3 UTR mikroszatellita jelenléte 19

20 Autoimmunitás: alapmechanizmusok és azok szerepe endokrin betegségekben a Graves betegség relatív kockázatát 2,1-rõl 2,8-ra emeli. A GG polimorfizmus a Graves betegség súlyosságával is összefüggést mutat, az ezt hordozó betegek között kevesebben kerülnek 5 év alatt remisszióba. Két Graves betegséggel kapcsolt polimorfizmust találtak, a CTLA-4(AT)n mikroszatellita és a CTLA- 4(49)A/G single nucleotide polymorphism (SNP). Ezek az allélek befolyásolhatják a thyreotoxicosis súlyosságát, az ophthalmopathia kialakulását és társuló autoimmun betegség fellépését is (T1D). Ezek az allélek a genetikai fogékonyság csaknem harmadát reprezentálják. Részt vesznek az autoimmun hypothyreosis kialakításában és a pajzsmirigy autoantitestek képzésében is. A protein tirozin foszfatáz (PTPN22) gén által kódolt fehérje szintén a T-sejt aktiváció hatékony inhibitora. A R620W SNP, amely funkcionális eltérést eredményez a limfoid kinázban, befolyásolja a jelátvitel szabályozását. A PTPN22 polimorfizmusa általában összefüggésben van az autoimmun betegségek kialakulásával, kiemelten szerepel T1D és Graves betegség patomechanizmusában. Thyreoglobulin: pajzsmirigy specifikus hajlamosító gén A teljes genom vizsgálatok az AITD fogékonysági génjét a 8q24 kromoszóma régióra lokalizálták: ez a thyreoglobulin gén. A kóros thyreoglobulin és ennek kötõdése MHC-II-höz az antigén bemutatás folyamatában döntõ, ebben a HLA szerepe kiemelkedik: a Drβ- Arg74 képes a kóros thyreoglobulin optimális bemutatására. Egerekben thyreoglobulin immunizáció autoimmun thyreoiditist válthat ki, melyben CD4+ T-sejtek játszanak meghatározó szerepet (5). A TSH receptor gén A Graves betegség jellemzõje a stimuláló hatású TSHR elleni autoantitestek termelõdése. A TSHR vonatkozásában 3 fontos single nucleotide polymorphism ismeretes: kettõ a TSHR extracelluláris (D36H és P52T), egy az intracelluláris részén (D727E) helyezkedik el (6,7). Autoimmun betegségek immunintervenciós kezelése Az autoimmun folyamatok részletes megismerése lehetõséget teremt olyan kezelési stratégiák bevezetésére, amelyek ezen folyamat valamelyik szakaszán beavatkozva akadályozzák meg a betegségek kifejlõdését. Az alábbiakban ezt példázzuk néhány újabb terápiás próbálkozás bemutatásával (a terjedelem korlátai miatt a teljesség igénye nélkül). Monoklonális antitestekkel aktivációs molekulákat lehet gátolni, sejtek mûködését kiiktatni, citokinek hatását befolyásolni. Számos ilyen antitestet fejlesztettek ki és próbáltak állatkísérletekben vagy humán vizsgálatokban autoimmun betegségek kezelésében. A B-sejtek jelentõs szerepet töltenek be, mint antigén bemutató sejtek. Elméleti síkon az autoantitestmediálta kórképekben az önmagukat stimuláló autoreaktív B-sejtek által generált circulus vitiosus megszakítása a B-sejtek átmeneti kiiktatásával terápiás hatékonyságú lehet. Ezért próbálkoznak B-sejt deplécióval anti-cd20 monoklonális antitesttel, T1D-ben valamint más autoimmun betegségben, pl. Graves betegségben is, helye lehet többek között súlyos ophthalmopathia megelõzésében. A sejt depléciót nem okozó anti-cd3 monoklonális antitesttel való kezelés is hatékony lehet. Egerekben, sõt emberben is lassítja T1D-ben a β-sejtek funkcióvesztésének folyamatát, a hatás azonban emberben nem tartós. Egérkísérletekben szolubilis CTLA-4 és IgG1 Fc régió fúziós proteinnel diabetes létrejöttét meg lehet elõzni (rheumatoid arthritis kezelésre már emberben is elfogadott). Az autoimmun folyamatok kontrollálásában a regulátoros T-sejtek töltik be a karmester szerepét. Ezért fordult újabban a figyelem ismét feléjük, hatékony kezelési módszerek kidolgozása érdekében. A Treg sejtek indukciójával erõsíthetõ a tolerancia, egérkísérletekben ez elérhetõ autoantigének mucosalis bejuttatásával (inzulin, GAD). Per os adott inzulin TGF-β termelõ Th3 sejteket, nazális úton bejuttatott IL-10 képzõ sejteket indukál, amelyek szupprimálják a CD8+ T-sejteket. A módszert pajzsmirigy betegségek megelõzésére is sikerrel alkalmazták, kifejlõdött autoimmun betegség kezelésére azonban nem alkalmas. T1D megelõzésében és kezelésében értek már el jó eredményeket in vitro expandált antigén (szigetsejt) specifikus Treg sejtekkel. Ezek a sejtek TGFβ-t és IL-10-et termelnek és gátolják a CD4+ effektor sejteket. Ha NOD (non-obese diabetic) egérbe a Treg sejteket diabetogén T-effektor sejtekkel együtt juttatják be, akkor is képes hatékonyan megakadályozni a kezelés a diabetes kialakulását. Az õssejt terápia magasan differenciált sejtek, pl. inzulin-termelõ pancreas β-sejtek alkalmazása kimeríthetetlen õssejt forrásból. Felnõtt pancreas ductus képletek is tartalmaznak õssejteket, de transzdifferenciálódás elérhetõ enteroendocrin, mesenchymális õssejteken vagy perifériás vér monocytákon is, intestinalis K sejtek is képesek lehetnek hormontermelésre bizonyos elõkezelés hatására. Olyan autoimmun betegségekben, ahol nem ismert a kiváltó autoantigén, a sejtek aktivációjához szükséges második jel kiiktatásával, a különbözõ kostimulációs utak gátlásával (pl. CD28-CD80/86) érhetõ el tolerancia autoimmun betegségekben. Az alapkoncepció az, hogy kostimulatorikus jelek döntik el azt, hogy immunválasz vagy tolerancia alakul-e ki az aktivációs jel átvitele folyamatában (8). A nagydózisú intravénás immunglobulin (IVIG) hatása az immunpatogenezisû kórképekben igen összetett. A kóros B-sejt klónra, az idiotípus-antiidiotípus hálózatra, a citokinek termelésére, a makrofágok Fc receptoraira, a komplement rendszerre stb. hatva többek között csökkenti az autoantitest termelést és a keringõ autoantitestek és immunkomplexek mennyiségét, továbbá az aktivált sejtek és komplementrendszer down-re- 20