A trehalóztermelés új gazdaságosabb eljárásai

Átírás

1 ÉLELMISZERIPARI BIOTECHNOLÓGIÁK A trehalóztermelés új gazdaságosabb eljárásai Tárgyszavak: trehalóz; fehérjestabilizálás; élelmiszeripar; bioszintézis, enzimtermelés. A trehalóz diszacharidról (α-d-glükopiranozil-α-d-glükopiranozid) legelőször a 19. század elején tettek említést mint az anyarozs egyik komponense. Később széles körű természeti előfordulásáról számoltak be növény- és állatfajokban, különösen az anhidrobiotikus szervezetekben. Ezek a rendkívüli szervezetek, például az úgynevezett feltámadó növény (Selaginella lepidophylla), egyes tengeri garnélarákok, fonalférgek, sütőélesztők azzal a hihetetlen képességgel rendelkeznek, hogy évekig túlélik a dehidrációt. A rehidráció után abban az esetben is azonnal képesek életfolyamataikat folytatni, ha előzetesen szervezetük víztartalmának 99%-át elveszítették. A trehalóznak kezdetben csak szénhidráttároló funkcióját ismerték, majd az utóbbi időben kimutatták, hogy megvédi a biológiai molekulákat a környezeti stresszhatásokkal szemben. A vizsgálatok során megállapították, hogy élesztőben fiziológiai körülmények között akkumulálódásra is képes. A trehalóz kémiailag a nem reaktív cukrok közé tartozik. Erős stabilitása annak tulajdonítható, hogy a két hexózgyűrűt összekötő glükozid-oxigén kötésnek nagyon kicsi az energiája (1 kcal/mol). Összehasonlításképpen, a szintén nem-redukáló tulajdonságú szacharóz diszacharid kötési energiája 27 kcal/mol. Ez azt jelenti, hogy a trehalóz nem disszociál két redukáló monoszacharid alkotórészre, csak extrém hidrolitikus körülmények között vagy trehaláz hatására. A trehalóz mikroorganizmusokon belüli akkumulációja széles körű alkalmazási lehetőséget rejt magában, például a kozmetikai iparban, gyógyszergyártásban, mezőgazdasági és élelmiszeripari szektorban. A biomolekula stabilizációjának mechanizmusát először Fourier-transzformációs infravörös spektroszkópia (FTIR) alkalmazásával tanulmányozták a fehérjék és cukrok közötti kölcsönhatások jellemzése céljából. Ezt követően infravörös (IR) és Raman-spektroszkópia segítségével kimutatták, hogy a diszacharid legjelentősebb funkciója, hogy koncentrálja a maradék vizet a fehérje közelében. A trehalóz fehérjestabilizáló képességét különféle alkalmazási területeken hasznosíthatják; a kozmetikai iparban pl. hidratáló készítményekben, az élelmiszeriparban tartósítószerekként, a gyógyászatban a chaperone elnevezésű anyag-

2 ként, amely segítséget nyújt a Creutzfeld Jacob kórt, cisztás fibrózist és amiloid rendellenességeket okozó fehérjeaggregáció megelőzésében. A trehalóz legérdekesebb alkalmazásai között említhető az oltóanyagok stabilizálása szobahőmérsékleten való tárolás céljára, enzimek konzerválása, illetve emlős sejtek liofilizálás alatti károsodástól való védelme. Szakemberek szerint a fejlődő országok egészségügyi ellátása sokkal fejlettebb lenne, ha megvalósítanák az oltóanyagok többségének szobahőmérsékletű stabil tárolását. Az eddig elvégzett kísérletek alapján biztató eredményekről számolhattak be; a járványos gyermekbénulás elleni orális oltóanyagok trehalóz jelenlétében szárítva 45 C-on stabilak maradtak, összehasonlítva a 4 C-on lefagyasztott folyékony oldattal. Az α α-trehalózt az újabb vizsgálati eredmények alapján a kozmetikai iparban liposzómastabilizátorként, az élelmiszeriparban pedig stabil édesítőszerként alkalmazhatják. Édessége a szacharózénak csak 45%-a, ezért kombinációban is lehet használni más édesítőszerekkel a termék eredeti ízének megtartása mellett. A trehalóz előnyös tulajdonságai közé tartozik az is, hogy más diszacharidoktól eltérően, az előállítás folyamán nem lép kémiai reakcióba aminosavakkal vagy fehérjékkel, és ez megakadályozza a termék barnulását (Maillard reakció). Különös tekintettel az egyre bővülő élelmiszeripari alkalmazásokra (1. táblázat), a trehalóz termelése hatékonyabb és gazdaságosabb módszert igényel a növényekből és sörélesztőből végzett extrakció mellett. A trehalóz lehetséges alkalmazásai az élelmiszeriparban 1. táblázat Élelmiszer típusa Szárított élelmiszerek Mélyhűtött ételek Édességek Cukrászsütemények Italok Fermentált élelmiszerek Koncentrátumok Tabletta Egyéb Példák tojás, zöldségek, hal, hús, gabonafélék, bab, aludttej, tejpor, gyümölcsök, levesek stb. főtt ételek cukorkák, csokoládé stb. sütemények, dzsemek, krémek kávé, tea, gyümölcslé és tejalapú italok kenyér és joghurt szörpök tabletta formájú élelmiszerek és gyógyászati termékek fagylaltok, mártások, édesítőszerek és fűszerek A trehalóz enyhén édes íze, megfelelő oldékonysága, jelentéktelen rákkeltő tulajdonsága, kismértékű higroszkópossága, a gyártás és tárolás során tapasztalt megfelelő stabilitása előnyös az élelmiszeripar számára.

3 A 90-es évek elején 1 kg trehalóz ára elérhette a 700 USD-t. Az előállítási költségek csökkentésére azóta már több gazdaságosabb eljárást javasoltak. Egy brazil kutatócsoport pl. Saccharomyces cerevisiae-t késztette trehalóz túltermelésére. Más szakemberek az élesztő fiziológiáját tanulmányozták, ha szilárd mátrixon immobilizálták, amelynek során a végső trehalóztartalom növekedését tapasztalták. Az eredmények hozzájárultak ahhoz, hogy a trehalóz árát 50%-kal csökkentették. Ez az ár most már elérhető volt a specifikus gyógyszeripari szakterületek számára, viszont még drága volt a folyamatosan bővülő élelmiszeripari alkalmazásokhoz. Ez a kutatómunka további folytatására ösztönözte a szakembereket. A leggazdaságosabb módszerek szabadalmaztatásával és sikeres alkalmazásával a trehalóz kereskedelmi ára tovább csökkent 5 6 USD/kg-ra. A trehalóztermelés újabb eljárásai előnyben részesítik az enzimatikus biotranszformációt a biomasszából megvalósítható extrakcióval szemben. Ez ideig három jelentős enzimes utat fedeztek fel a trehalóz előállítására (1. ábra): gombában és élesztőben található foszforilázrendszer segítségével; mezofil baktériumok (mint pl. az Arthrobacter faj) vagy extremofil szervezetek glikoziltranszferáz-hidroláz rendszerével; maltózból intramolekuláris transzglikozilációt katalizáló trehalózszintáz alkalmazásával (Pimelobacter sp., Thermus spp. stb.). Ezeknek az enzimes rendszereknek a hasznosítása a szakirodalomban még rendkívül vitatott, mostanáig még kevés biotechnológiai módszert fejlesztettek ki ezek alkalmazására. Két lépésből álló konverzió keményítőből foszforilázrendszer segítségével A trehalóz hagyományos előállítása mikroorganizmusok (élesztő) tenyésztésével történik. Japán szabadalom alapján a tenyésztést követően a sejteket széttördelik, majd extrakciós eljárásokat alkalmaznak hőkezeléssel és alkohol visszaáramoltatásával. A trehalóz bioszintézise az élesztőben az 1. ábra I. típusú útja alapján megy végbe. Trehalóz képződhet maltózból is maltózfoszforiláz és trehalózfoszforiláz katalizátor segítségével (a reakciók abban térnek el az I. típusú reakcióktól, hogy α-glükóz-1-foszfát helyett β- glükóz-1-foszfát termelődik). Ez a japán eljárás azonban nem alkalmas ipari méretű termelésre, mivel a mikroorganizmusokban kiindulási anyagként jelen levő trehalóztartalom rendszerint 15 %(m/m), illetve az extrakciós és tisztítási lépések bonyolultak. A foszforilázok alkalmazásának hátrányai közé tartozik, hogy enzimatikus rendszereinek reverzibilitása következtében az elérhető trehalózhozam viszonylag kicsi, másrészt pedig a reakciórendszerek stabilitásának fenntartása nehézségekbe ütközik.

4 a) I. típus keményítő szacharóz (maltóz) α-1,4-d-glükánfoszforiláz GP (D-gluc) n-1 + α(β)- glükóz-1-foszfát D-glükóz + α-glükóz-1-foszfát trehalózfoszforiláz TP α-α-trehalóz + ortofoszfát b) II. típus maltodextrinek (n glükóz alegység) maltooligoziltrehalózszintáz MTS/TDFE trehalozil-maltodextrinek trehalozil-maltodextrinek α- α-trehalóz + oligoszacharid maltooligoziltrehalóz- (n-2 glükóz alegység) trehalohidroláz MTH/TFE c) III. típus maltóz trehalózszintáz GT α-α-trehalóz Rövidítések: GP: glükóz/glükánfoszforiláz; GT: glükoziltranszferáz; MTH: maltooligozil-trehalóz-trehalohidráz; MTS: maltooligozil-trehalózszintáz; TDFE: trehalozil-dextrin-képző enzim; TFE: trehalózképző enzim 1. ábra Trehalóz bioszintézise, a különféle szubsztrátok nem-redukáló diszachariddá alakításának főbb mechanizmusai: a) két lépésből álló átalakulás glükóz(maltóz) foszforiláz és trehalózfoszforiláz egymást követő reakciójának segítségével; b) baktériumokban és archaeabaktériumokban található konverziós mechanizmus, maltodextrin trehalózzá alakul két egymást követő lépésben, amelyeket MTSáz és MTH katalizál; c) maltózból egyetlen reakcióban képződik trehalóz, intramolekuláris transzglikoziláció hatására, GTázt mezofil és termofil szervezetekben észlelték

5 Az utóbbi időben a kutatások során felfedeztek egy trehalózfoszforilázt (TP-áz), amely katalizálja a trehalóz szintézisét D-glükózból és α-d-glükóz-1- foszfátból Grifola frondosa gombából. Ezt a trehalózfoszforilázt ezután Escherichia coliba klónozták. A rekombináns sejtek a fehérje 50%-át termelték oldhatatlan frakció (zárványtestek) formájában. A folyamatban termelődött trehalóz végső mennyisége 35 mol% (trehalóz/össz mól) értéket ért el. Két lépéses átalakítás trehalózzá 1994-ben egy japán biokémiai laboratóriumban szabadalmaztattak egy új nem-redukáló szacharidot képző enzimet (malto-oligozil-trehalózszintáz MTSáz) és egy trehalózfelszabadító enzimet (malto-oligozil-trehalóz-trehalohidroláz MTH-áz), amelyek elérhetőek például a Rhizobium sp. M-11 és az Arthrobacter sp. Q36 fajok tenyészetéből (1. ábra, II. típus). Az első enzim a redukáló maltodextrinek α-1,4 kötésének átalakulását katalizálja α-1,1 formává a redukáló végen; a második enzim az α-1,1 kötéssel szomszédos α-1,4 kötésre hat, amelynek során trehalóz és egy kisebb molekulatömegű maltooligoszacharid szabadul fel. A trehalóz enzimatikus szintézise jelenleg az MTS-áz és MTH-áz segítségével valósítható meg, a japán biokémiai laboratórium fenti eljárása alapján. A továbbiakban hasonló biokatalizátorok izolálását kutatják termofil forrásokból. A termofil enzimek alkalmazása a szénhidrátok biotranszformációjában javítja a szubsztrátok oldékonyságát (keményítő vagy nagy molekulatömegű dextrinek), csökkenti a viszkozitást és a szennyeződések kockázatát ben a termoacidofil Sulfolobus solfataricus szervezetben észleltek először trehalóztermelő bioszintetikus utat. A mechanizmus tisztázására akkor került sor, amikor a Sulfolobus acidocaldarius ATCC33909 elnevezésű mikroorganizmusból trehalozil-dextrin-képző és trehalózfelszabadító enzimeket tisztítottak, majd jellemezték azokat. A trehalóz-bioszintézis géneket klónozták a Sulfolobus acidocaldariusból, az aminosavak-szekvenciákat összehasonlították az Arthrobacter Q36-ból és Sulfolobales más mikroorganizmusaiból származó megfelelő enzimekkel. A Sulfolobus solfataricus KM1 sejt homogenizátumai keményítőbontó aktivitást mutattak az oldékony keményítő trehalózzá alakítása során. A glikoziltranszferáz és α-amiláz enzimaktivitásának meghatározásához kifejlesztettek egy hatékony módszert maltopentóz és maltotriozil-trehalóz szubsztrátumok alkalmazásával. Laboratóriumban a Sulfolobus shibatae DSM 5389-ből izolálták a trehalóz szintéziséért felelős trehalozil-dextrin-képző (TDFE) és trehalózképző enzimet (TFE). A kémiai fizikai és kinetikai jellemzés során megállapították, hogy ezek az enzimek nagyon hasonlóak más Sulfolobalesekből kimutatott enzimekhez. Maltoheptóz trehalózzá alakításának kinetikai vizsgálata során a köztitermékeket és végtermékeket HPLC-vel határozták meg. Az enzimek jellegzetességeinek összehasonlítását a 2. táblázat tartalmazza.

6 2. táblázat A trehalóztermelésért felelős enzimek kémiai fizikai tulajdonságainak összehasonlítása Mikroorganizmus Enzim T OPT ( C) ph OPT Km (mm) Termelés Trehalózhozam (%) Gombák és élesztők Baktériumok TPS (1. lépés) TPP (2. lépés) 50 6,8 28(MD) 1 1,2 U/g biomassza GP 25 6,9 40 TP Pimelobacter R48 GT 45 7,0 Pseudomonas putida Thermus aquaticus GT 65 6,5 31,4 U/g biomassza 81 (40 C) 71 (60 C) Arthrobacter sp. Q36 MTS 40 7,0 1,4(M6) 16,3 U/ml tenyészet 92 Brevibacterium helvolum Rhizobium sp. M-11 Archaeabaktériumok Sulfolobus acidocaldarius Sulfolobus solfataricus KM1 Escherichia coli JM109 expresszálás Sulfolobus solfataricus KM1 enzimek MTH 40 7,0 7,0(MT4) 25,1 U/ml tenyészet MTS MTH MTS MTH MTS MTH MTS α-amiláz 35 6,5 8 U/ml tenyészet 12 U/ml tenyészet ,0 6,0 7,0 7,0 5, , ,5 5,5 1,5 U/ml tenyészet 2,0 U/ml tenyészet 5,7(M6) 3,7 MT4) 2,7(M6) 1,2 U/g biomassza 3,4 U/g biomassza MTS 10 U/g biomassza α-amiláz 2822 U/g biomassza Sulfolobus shibatae TDFE 70 4,5 5,5 2,0(M6) 1,2 U/g biomassza E. coli Rb-791 expresszálás Sulfolobus solfataricus MT4 enzimek TFE 85 4,5 5,5 1,0(MT4) 3,5 U/g biomassza TDFE U/g biomassza TFE U/g biomassza Rövidítések: GP: glükóz/glükánfoszforiláz; GT: glükoziltranszferáz; M6: maltohexóz; MD: maltodextrinek; MT4: trehalozil-maltotetróz; MTH: maltooligozil-trehalóz-trehalohidratáz; MTS: maltooligozil-trehalózszintáz; TDFE: trehalozil-dextrin-képző enzim; TFE: trehalózképző enzim; TPáz: trehalózfoszforiláz; TPP: trehalóz-foszfátfoszfatáz; TPS: trehalóz-foszfátszintáz.

7 Sulfolobus solfataricus MT4-ben hasonló biokatalitikus aktivitásokat tapasztaltak 87 C-os optimális tenyésztési hőmérsékleten. Ezek a TDFE és TFE enzimek jelentős termostabilitásuk mellett alkalmasnak bizonyultak a trehalóztermelés újabb bioeljárásának kifejlesztésére, az enzimek ipari méretű alkalmazása azonban kisebb költségráfordítást igénylő termelési módszert és stabil biokatalizátorok kifejlesztését igényli. TDFE és TFE előállítása a vad típusú törzsből nagyon drága az extremofil tenyészetekre jellemző kis mennyiségű biomasszahozam következtében, emiatt a gazdaságosabb termelékenység elérése céljából mezofil gazdába való expresszálás után mikroszűrős bioreaktort alkalmaztak. Az enzimek megfelelő termostabilitása két lépésből álló gyors tisztítási eljárást hőkezelést és kromatográfiás meghatározást tett lehetővé. Az utóbbi időben a két katalitikus aktivitás összekapcsolásának javítására a TFE és TDFE kódoló szekvenciáit egyesítették egy új kiméra fehérje kinyerése céljából, amely alkalmas a dextrinek trehalózzá alakítására magas hőmérsékleten (75 C) egymást követő enzimatikus lépésekben. Intramolekuláris transzglükozilációt katalizáló glükoziltranszferáz α α-trehalóz termelésére A Pimelobacter sp. R48 sejtmentes extraktumából izolált trehalózszintáz enzim katalizálta a maltóz konverzióját trehalózzá egy lépésben intramolekuláris transzglükozilációval (1. ábra, III. típus). A folyamat optimális ph-értéke 7,5, optimális hőmérséklete pedig 20 C volt. A Thermus aquaticus ATCC ból izolált trehalózszintázt a kinetikai vizsgálatok során termostabilabbnak és termoaktívabbnak tapasztalták a Pimelobacter sp. R48-ból és Pseudomonas putida H262-ből tisztított megfelelő biokatalizátoroknál. A konverzió 6,5-ös ph-n és 60 C-os hőmérsékleten játszódott le a leghatékonyabban. A trehalóztermelés biológiai folyamatai A kutatások során kifejlesztett biokatalizátorok többsége hatékonynak bizonyult trehalóz nagyipari méretű termelésére. A 2. táblázat az egyes módszerek kémiai fizikai jellemzőit, kinetikai paramétereit és trehalózhozamait hasonlítja össze. Az alábbiak az elmúlt néhány évben elért legérdekesebb eredményeket ismertetik. Az Arthrobacter Q36-ból izolált MTSáz és MTHáz enzimeket olyan eljárásban is hasznosították, amelyben szubsztrátként előkezelt kukoricakeményítőt alkalmaztak. Az így kapott oldat főként trehalózt ( 66 (m/m)%), illetve kisebb mennyiségben redukáló oligoszacharidokat, glükoziltrehalózt és glükózt tartalmazott. A Sulfolobus solfataricus KM1-ből izolált glükoziltranszferáz és α-amiláz enzim felhasználásával többféle maltooligoszacharidból is termeltek trehalózt. Az amilóz polimerizációs fokának növelésével a trehalóz hozama is nőtt. A

8 Sulfolobus solfataricus rekombináns glükoziltranszferáz és α-amiláz enzimeinek 1:1 arányú alkalmazásával szintén kifejlesztettek egy trehalóztermelő eljárást keményítőből. Schizophyllum commune BT2115-ből trehalózfoszforilázt, Corynebacterium callunae DSM20147-ből keményítőfoszforilázt izoláltak. Mindkét enzimet immobilizálták és töltött ágyban használták trehalóztermeléshez keményítőből: szubsztrátumként maltodextrint, glükózt és foszfátot alkalmaztak. A Grifola frondosa bazidiumos gombából származó trehalózszintázt, amely képes trehalózt előállítani α-d-glükóz-1-foszfátból és D-glükózból, szacharózfoszforilázzal együtt használták szacharózból nem-redukáló diszacharid képzésére nagy hozammal. A trehalóz 18 mmól/h sebességgel keletkezett és hozama 90mol% mennyiséget ért el. Vizsgálták a Sulfolobus solfataricus MT4-ből szervezetből származó enzimek hasznosításával a magasabb hőmérsékleten végbemenő trehalóztermelés lehetőségét is. A biológiai eljárás kivitelezése permeabilizált rekombináns TDFE és TFE enzimaktivitást tartalmazó E. coli sejtek alkalmazásán alapult. A vizsgálatok során összehasonlították a szakaszos reaktor működését egy koimmobilizált bioreaktor működésével maltohexóz trehalózzá alakításában. A szakaszos bioreaktor alkalmazásánál a maltohexóz trehalozil-maltodextrineket, trehalózt és glükózt tartalmazó szénhidrátkeverékké alakult át; a koimmobilizált sejtes bioreaktor a szubsztrátum gyorsabb biotranszformációját eredményezte nem-redukáló diszachariddá, köztitermékek akkumulációja nélkül. Ez a javulás a két enzim fizikai közelségének tulajdonítható, amely kisebb mértékű transzportakadályt eredményez. Összefoglalás Az elmúlt évtizedben számos tanulmány tisztázta a trehalóz in vivo és in vitro stabilizációs mechanizmusait. A kutatási eredmények alapján a trehalóz rendkívül hasznos biotechnológiai eszköz lehet számos gyógyszerészeti alkalmazási területen, kozmetikai hidratáló készítményekben, illetve élelmiszeripari termékek alkotóelemeként. A gazdaságos és hatékony alkalmazások megvalósítása azonban beható kutatómunkát igényel az enzimológia területén a termelésben megfelelően hasznosítható biokatalizátorok felfedezésére. Az új termelési technológia már eddig is rendkívüli csökkenést eredményezett a trehalóz árában (700 USD-ről 6 USD-re), és a megfelelő expressziós rendszerek kifejlesztése, az extremofil biokatalizátorok sikeres alkalmazása még tovább csökkentheti a diszacharid előállítási költségét. (Molnár Kinga) Schiraldi, C.; Di Lernia, I.; De Rosa, M.: Trehalose production: exploiting novel approaches. = Trends in Biotechnology, 20. k. 10. sz p Guo, N.: Trehalose expression confers desiccation tolerance on human cells. = Nature Biotechnology, 18. k. 1. sz p