A c-erbb családba tartozó onkofehérjék normális lepényben és terhességi trophoblast-betegségekben (in vitro vizsgálatok)

Átírás

1 A c-erbb családba tartozó onkofehérjék normális lepényben és terhességi trophoblast-betegségekben (in vitro vizsgálatok) Fülöp Vilmos dr., Végh György dr. és Doszpod József dr. Semmelweis Egyetem, Budapest, Egészségtudományi Kar, Szülészeti- és Nőgyógyászati Klinika (igazgató: Doszpod József dr.) Ebben a tanulmányban az epidermális növekedési faktorreceptor (EGFR) és a c-erbb-2, c-erbb-3, valamint c-erbb-4 onkogének expresszióját vizsgálták terhességi trophoblast-betegségekben és elsõ trimeszterbeli normális lepényben. Emellett annak a lehetõségét is vizsgálat tárgyává tették, hogy a makrofág (IL-1α, IL-1β, TNF) és lymphocyta (IL-2, γ-ifn, GM-CSF) eredetû citokinek hatásait az EGFR expressziójában bekövetkezõ változások közvetítik-e. Az EGFR, a c-erbb-2, a c-erbb-3 és a c-erbb-4 fehérjék jelenlétének immunhisztokémiai vizsgálatára 16 részleges molából, 25 komplett molából, 10 choriocarcinomából és 11 gyógyászati vetélésbõl származó paraffin metszetben került sor. Az EGFR-mRNS kimutatása in situ hibridizációval történt. A JEG-3 humán choriocarcinoma-sejteket az interleukin 1-α, interleukin 1-b, interleukin 2, γ-interferon, granulocyta-makrofág kolóniastimuláló faktor és a tumornekrózis faktor különbözõ koncentrációival együtt inkubálva, az EGFR felszíni expressziójának mérését radioimmunassay-el végezték, az EGFR-re specifikus egér monoklonális ellenanyag segítségével. Az EGFR immunhisztokémiai festõdése a terhességi trophoblastbetegségek és a normális lepény valamennyi sejttípusában megfigyelhetõ volt. A choriocarcinoma-sejtekben, valamint a komplett mola syncytiotrophoblast és cytotrophoblast sejtjeiben az EGFR expressziójának szintjei szignifikánsan nagyobbak voltak, mint akár a normális lepény, akár a részleges mola syncytiotrophoblastjaiban és cytotrophoblastjaiban (p < 0,01, p < 0,01). A c-erbb-2immunreaktivitása a choriocarcinomában és a komplett mola bolyhon kívüli trophoblastjaiban szignifikánsan erõsebb volt, mint a részleges mola és normális lepény bolyhon kívüli trophoblastjaiban (p < 0,02, p < 0,01, külön-külön). A komplett mola bolyhon kívüli trophoblastjaiban az EGFR (p = 0,02) és a c-erbb-3 (p < 0,01) erõs immunfestõdése szignifikáns összhangban volt a molát követõ perzisztáló terhességi trophoblast-tumor kialakulásával. Az IL-1α, IL-1β és a TNF makrofág eredetû citokinek szignifikánsan szuppresszálták a sejtek növekedését és ez az EGFR expressziójának szignifikáns növekedésével társult. A lymphocyta (IL-2, γ-ifn, GM-CSF) eredetû citokineknek sem az EGFR expressziójára, sem a sejtek növekedésére nem volt jelentõs hatásuk. Adataik azt az elképzelést támogatják, hogy a citokinek feltehetõleg az autokrin folyamatok parakrin mediátoraiként fejtik ki hatásukat, amely magában foglalja a choriocarcinoma-sejtek növekedésének szabályozását azáltal, hogy módosítják a sejtfelszíni növekedési faktor-receptor-expressziót. Az onkogének EGFR-rel rokon családja fontos szerepet tölthet be a terhességi trophoblast-betegségek patogenezisében és prognózisában. The c-erbb family related oncoproteins in normal placenta and gestational trophoblastic diseases (in vitro study). In this study the expression of epidermal growth factor receptor (EGFR) and c-erbb-2, c-erbb-3 and c-erbb-4 oncogenes were investigated in gestational trophoblastic diseases and normal first trimester placenta. Furthermore, the possibility that macrophage (IL-1α, IL-1β, TNF) and lymphocyte (IL-2, γ-ifn, GM-CSF) cytokines effects are mediated by changes in EGFR expression were studied. Paraffin sections of 16 cases of partial mole, 25 cases of complete mole, 10 cases of gestational choriocarcinoma and 11 cases of therapeutic abortion were studied immunohistochemically for EGFR, c-erbb-2, c-erbb- 3 and c-erbb-4 proteins. The presence of EGFR mrna was studied using in situ hybridization. JEG-3 human choriocarcinoma cells were incubated with varying concentrations of interleukin 1-α, interleukin 1-β, interleukin 2, γ-interferon, granulocyte-macrophage colony stimulating factor and tumor necrosis factor-α, and the expression of EGFR was measured by radioimmunoassay using a murine monoclonal antibody with specificity for EGFR. Staining for EGFR was detected immunohistochemically in all cell types in gestational trophoblastic diseases and normal placenta. The levels of expression of EGFR in choriocarcinoma and syncytiotrophoblasts and cytotrophoblasts in complete mole were significantly greater than those in syncytiotrophoblasts and cytotrophoblasts in both normal placenta and partial mole (p < 0.01, p < 0.01). The immunoreactivity of c-erbb-2was significantly stronger in choriocarcinoma and extravillous trophoblast in complete mole than that in extravillous trophoblast in partial mole and normal placenta (p<0.02, p < 0.01, respectively). Strong immunostaining for EGFR (p = 0.02) and c-erbb-3 (p < 0.01) in extravillous trophoblasts of complete mole was found to be significantly correlated with the development of persistent postmolar gestational trophoblastic tumor. Macrophagederived cytokines IL-1α, IL-1β and TNF significantly suppressed cell growth; this was associated with a significant increase in EGFR expression. The lymphocyte (IL-2, γ-ifn, GM-CSF) cytokines had no significant effect on either EGFR expression or cell growth. These findings support the concept that cytokines may act as paracrine mediators of autocrine processes involved in choriocarcinoma cell growth regulation by modulating growth factor receptor expression. The EGFR-related family of oncogenes may be important in the pathogenesis and prognosis of gestational trophoblastic diseases. Kulcsszavak: epidermális növekedési faktor-receptor, c-erbb-2, c-erbb-3, c-erbb-4, citokinek, terhességi trophoblast-betegségek Key words: epidermal growth factor receptor, c-erbb-2, c-erbb-3, c-erbb-4, cytokines, gestational trophoblastic diseases Orvosi Hetilap 2001, 142 (22),

2 A laboratóriumainkban korábban elvégzett kísérletek, azt mutatják, hogy a citokinek a choriocarcinoma-sejtekben mind a sejtek proliferációját, mind HLA-antigén-expressziójukat befolyásolhatják (1, 4). A trophoblast-sejtek számos protoonkogén terméket szintetizálnak és bőséges mennyiségű epidermális növekedési faktor (EGF)-receptort tartalmaznak felszíneiken (24); ugyanakkor ez a receptorfehérje jelentős szerkezeti hasonlóságot mutat az erb-b-2 onkoproteinnel (10). Az EGF-receptor, ha aktivált állapotban van, befolyásolni tudja a sejtek növekedését és anyagcseréjét (2, 3, 22). A sejtek proliferációs kapacitása a sejtek felszínén kifejezett növekedési faktor-receptorok számától függ (17). Az epidermális növekedési faktor-receptor (EGFR) és az azzal rokon c-erbb onkogén család fehérjetermékei: EGFR (c-erbb-1), a c-erbb-2, a c-erbb-3, a c-erbb-4, közeli szerkezeti hasonlóságot mutatnak a tirozinkináz aktivitású szignáltranszdukciós transzmembrán fehérjékkel, melyek összefüggésbe hozhatók a sejttranszformációval és a tumorok kialakulásával (10, 27). Amellett, hogy az EGFR onkofehérjét kimutatták több malignus tumorban, szerepet játszhat a terhességi trophoblast-betegségek kialakulásában is. Az EGFR expressziója összefüggésben van a hcg-szekrécióval és kemoterápiát követően a choriocarcinoma-sejtek felszínén az EGFR-ok száma jelentősen lecsökken (8, 9). Míg az EGFR expresszióját fehérje- és DNS-szinten többen vizsgálták placentában és terhességi trophoblast-tumorokban in vitro és in vivo, az expresszió intenzitásában és annak klinikai jelentőségében a különböző tanulmányok adatai ellentmondóak (9, 11, 19, 23). A c-erbb-2, c-erbb-3 és c-erbb-4 fehérjéket is számos malignus-folyamatban vizsgálták (12, 14, 18). A normális lepények és a terhességi choriocarcinomák beágyazódási helyei lymphocytákkal és makrofágokkal infiltráltak (10). Miután a terhességi choriocarcinomát infiltráló lymphocyták és makrofágok nagy valószínűséggel apai eredetű antigének és onkoproteinek hatásainak vannak kitéve, a sejtek potenciálisan aktivált sejtekké válnak. Az aktivált immunsejtek ezután citokineket választanak ki, amelyek mint parakrin közvetítőanyagok szabályozzák és elősegítik a helyi sejtfolyamatok, köztük a növekedés megfelelő alakulását. Ebben a tanulmányban az EGFR, c-erbb-2, c-erbb-3, c-erbb-4 onkogének expresszióját vizsgáltuk normál lepényben, részleges és teljes molában, valamint choriocarcinomában immunhisztokémiai és EGFR-ra in situ mrns hibridizációs módszerrel. Tanulmányoztuk továbbá ezeknek az onkoproteineknek a lehetséges szerepét a posztmoláris gesztációs trophoblast-tumorok kialakulásában és klinikai kimenetelében, valamint a különböző emberi rekombináns citokinek in vitro hatásait az EGF-receptorok expressziójára egy emberi choriocarcinoma sejtvonalban, a JEG-3 sejtekben. Anyag és módszer Sejtek A JEG-3 humán choriocarcinoma (CCA)-sejtvonalat az American Type Culture Collectiontól (ATCC, Rockville, Maryland, USA) szereztük be. A sejteket folyamatosan növekvő egyrétegű sejtkultúrákban 12% borjúszérumot, 2 mm L-glutamint és 100 U/ml penicillin-streptomycin keveréket tartalmazó RPMI 1640 tápfolyadékban tenyésztettük 37 C-on, 5% CO 2 -t és 95% párásított levegőt tartalmazó termosztátban. Monoklonális ellenanyagok A dalton molekulasúlyú epidermális növekedési faktor (EGF)-receptorát felismerő murine típusú monoklonális ellenanyagot a Genzyme (Boston, Massachusetts, USA) Corporationtől vásároltuk, míg a kontrollként használt aspecifikusan kötődő MOPC-21 nevű murine típusú monoklonális ellenanyagot a Duke Egyetem kutatója, Desombre Karen bocsátotta rendelkezésünkre (Durham, NC, USA). Ezen G1 immunglobulin (IgG1) osztályba tartozó ellenanyagokat proteina kromatográfiával tisztították. Az EGF-receptorok kifejeződésének vizsgálata radioimmunassay-jel (RIA) A JEG-3 CCA sejteket olyan 96 vájulatú, lapos aljú szövettenyésztő lemezeken tenyésztettük, melyekben az egyes vájulatokat egymástól könnyen el lehetett választani (Dynatech Laboratories, Inc., Chantilly, VA, USA). A lemez minden vájulatába 0,2 ml tápfolyadékot pipettáztunk, amiben CCA sejt volt szuszpendálva. 24 óra múlva a tápfolyadékot óvatosan leszívtuk és a murine típusú humán EGF-receptorellenes monoklonális ellenanyag, valamint a MOPC-21 murine aspecifikus monoklonális ellenanyag 1:2 arányú, csökkenő koncentrációjú sorozathígításait tartalmazó tápfolyadékból 0,1 ml-t pipettáztunk a sejtekre. Minden egyes antitest-koncentrációt 33 vájulatban egy órán át inkubáltunk a CCA sejtekkel, 37 C-on. Ezután az antitestet tartalmazó tápfolyadékot eltávolítottuk és 125-ös jódizotóppal ( 125 I) jelzett birka eredetű egérellenes immunglobulin (Ig) F(ab ) 2 fragmentumait (New England Nuclear, Boston, Massachusetts, USA) tartalmazó tápfolyadék 0,1 ml-ével helyettesítettük. Miután a reakcióelegyet 37 C-on 1 órán át inkubáltuk, a reakciót úgy állítottuk le, hogy a sejtfelülúszókat leszívtuk. Ezután minden vájulatot kimostunk egyszer RPMI tápfolyadékkal, majd a vájulatokat könnyed töréssel elválasztottuk egymástól, külön-külön ampullákba helyeztük azokat és gamma-számlálóban mértük a vájulatok radioaktivitását. Párhuzamosan futtattunk egy másik, 96 vájulatú szövettenyésztő lemezt is ugyanilyen körülményekkel, kivételt az jelentett, hogy ezen lemez vájulatai 0,08% nátrium-azidot (NaN 3 ) tartalmazó tápfolyadékot kaptak. Citokinek A kereskedelmi forgalomban elérhető citokinek a következők voltak: interleukin 1-α (IL-1α), interleukin 1-β (IL-1β), interleukin 2 (IL-2), γ-interferon (γ-ifn), granulocyta-makrofág kolóniastimuláló faktor (GM-CSF) (Collaborative Research, Inc., Bedford, Massachusetts, USA): tumornekrózis faktor (TNF) (Genzyme Corporation). A citokineket tápfolyadékban hígítottuk a következő koncentrációkban: IL-1α és IL-1β; nagy dózis, 510 U/ml; közepes dózis, 51 U/ml; alacsony dózis, 5,1 U/ml (alapkoncentráció); IL-2: nagy dózis, 500 U/ml; közepes dózis, 50 U/ml; alacsony dózis, 5 U/ml (alapkoncentráció); γ-inf: nagy dózis, U/ml; közepes dózis, U/ml; alacsony dózis, 1400 U/ml (alapkoncentráció); GM-CSF: nagy dózis, 5000 U/ml; közepes dózis, 500 U/ml; alacsony dózis, 50 U/ml (alapkoncentráció); és TNF: nagy dózis, U/ml; közepes dózis, 1000 U/ml; alacsony dózis, 100 U/ml (alapkoncentráció). Az egység (unit, U) annak a hígításnak a reciproka, amely 50%-os stimulációt idéz elő a lymphocytaaktiváló faktor (LAF) vizsgálatban. Az EGF-receptorok expressziójának vizsgálata RIA-val a citokin-kezelések után A JEG-3 CCA sejteket ugyanolyan körülmények között tenyésztettük a szövettenyésztő lemezek vájulataiban ( sejt/0,1 ml tápfolyadék), mint ahogy korábban már leírtuk. Két órával azután, hogy a CCA sejteket a fenti koncentrációban a lemez vájulataiba pipettáztuk, 0,1 ml, tápfolyadékkal hígított különböző koncentrációjú citokint adtunk 33 vájulatba minden egyes hígításból, majd a lemezeket 37 C-on inkubáltuk. 24 órával később a felülúszókat leszívtuk és a tápfolyadékban hígított EGF-receptorellenes monoklonális ellenanyag receptortelítési értékének ötszörösével reagáltattuk a CCA sejteket egy órán keresztül. A telítési értéket korábban, citokinekkel nem kezelt JEG-3 CCA sejteken határoztuk meg. A JEG-3 sejteken az EGFreceptorok expressziójának mennyiségét a már előzőleg leírt 1148

3 RIA-val határoztuk meg a szövettenyésztő lemez minden egyes vájulatában. A kontroll sejttenyészetekben a sejtek életképességét 48 óra inkubálás után Tripán-kék teszttel vizsgáltuk. A sejtszám meghatározása kvantitatív DNS-analízissel Radioaktivitásuk megmérése után a szövettenyésztő lemez elválasztott vájulatait eltávolítottuk a gamma-számlálóban használt és korábban már említett ampullákból és a vájulatokat szobahőmérsékleten kiszárítottuk. Ezután a sejtek feloldására minden egyes vájulatba 50 ml 1% nátrium-dodecil-szulfátot (SDS) tartalmazó pufferolt foszfátsót pipettáztunk és 30 percig szobahőmérsékleten inkubáltuk a rendszert. Miután az oldatokat eltávolítottuk a vájulatokból, további 50 ml 1%-os SDS oldattal kimostuk azokat és ezen mosófolyadékokat is összegyűjtöttük. A feloldott sejteket tartalmazó oldatot ezután 10-szeresére hígítottuk nátriumsó-citrát pufferben (0,154 M NaCl, 0,015 M Na 3 -citrát, ph: 7,0), 57 C-on 30 percig melegítettük és a vájulatoknak megfelelően hármasával fluorometriásan vizsgáltuk. Ezen analízishez Hoechst fluorokrómot (Sigma Chemical Company, St. Luis, MO, USA) és egy Turner Model 112 fluorométert (Sequoia-Turner Corporation, Mountain View, CA, USA) használtunk. A gerjesztési (excitatiós) hullámhosszúság 360 nm volt, a kibocsátást 450 nm-nél regisztráltuk. Klinikai adatok és szövettani minták Ebben a tanulmányban 51 terhességi trophoblast-betegségben szenvedő beteg és kontrollként 11 normális, első trimeszteri terhességmegszakítás szövettani anyagát dolgoztuk fel. A terhességi trophoblast-betegek közül 16 részleges mola, 25 teljes mola és 10 choriocarcinoma szerepelt. Az átlagos gesztációs kor a terhességmegszakítások esetében 9,5 terhességi hét (812 hét), részleges és teljes moláknál 8,4, illetve 9,9 terhességi hét volt. A terhességi trophoblast-betegségek, köztük a mola hydatidosa (üszögterhesség), az invazív mola és a choriocarcinoma az egymással kapcsolatban lévő daganatok olyan csoportját alkotják, amelyek terhességből fejlődnek ki és különböző mértékű helyi invazív és metasztatizáló tulajdonságokkal rendelkeznek. A mola hydatidosa megelőzheti a perzisztáló terhességi trophoblast-daganatok, köztük az invazív mola és a choriocarcinoma kifejlődését. Mai tudásunk szerint általánosan elfogadott, hogy a mola terhességben két különböző entitás létezik, a teljes (komplett) és a részleges (parciális) mola terhesség, amelyeknek különböző hisztopatológiai és kromoszomális tulajdonságai vannak. A teljes mola hydatidosák közül 8 esetben (32%) alakult ki perzisztens posztmoláris terhességi trophoblast-tumor. Amíg a perzisztens betegségben szenvedő pácienseknek összesen 11 ciklus kemoterápia adása volt szükséges, addig a többi komplett mola a méhkiürítés után spontán remisszióba került. A 10 choriocarcinomás esetből nyolc I. stádiumú, kettő pedig III. stádiumú volt és összesen 28 ciklus kemoterápiát kaptak a betegek. Minden beteg él, panasz és tünetmentes. A terhességi trophoblast-betegek kezelési és utánkövetési protokollja egységes volt és minden esetben megegyezett. Immunhisztokémiai analízis Az avidin-biotin immunperoxidáz eljárást alkalmaztuk 5 µm vastagságú metszeteken formalinban fixált, paraffinba ágyazott szövetekből. A metszeteket xilénben deparaffinizáltuk, majd csökkenő koncentrációjú alkoholsorozatban és desztillált vízben hidráltuk, végül az endogén peroxidáz aktivitást 0,3%-os hidrogén-peroxiddal metanolban blokkoltuk. Miután a nem specifikus antigéneket normál lószérummal blokkoltuk, a metszeteket nedves kamrában az elsődleges antitesttel 16 órán át 4 C-on inkubáltuk. Az EGFR (nyúl, poliklonális), c-erbb-3 (egér, monoklonális), c-erbb-4 (nyúl, poliklonális) antitesteket 1:400 hígításban (Oncogene Research Products) és a c-erbb-2 (egér, monoklonális) antitestet 1:100 hígításban (Novocastra) alkalmaztuk. A festék jelöléséhez c-erbb-2 és c-erbb-3 esetében egérellenes, EGFR és c-erbb-4 esetében nyúlellenes biotinilált másodlagos ellenanyagot, majd az ABC torma-peroxidázt (Vectastain Elite ABC Kit-Vector Labs) használtuk. A reakciótermékeket DAB (diaminobenzidin) kromogénnel (Vector Labs) tettük láthatóvá. Végül a metszeteket növekvő koncentrációjú alkoholsorozatban dehidráltuk, xilénben tisztítottuk és montíroztuk. Negatív kontroll esetében az elsődleges antitestet normál szérummal helyettesítettük. Pozitív kontrollként az alkalmazott onkofehérjékre ismerten pozitív petefészekrákos eseteket használtunk. A citoplazmatikus és membránfestődést a normál lepény, a részleges és teljes mola syncytio-, cyto- és bolyhon kívüli trophoblastjaiban, valamint a choriocarcinoma esetek tumorsejtjeiben szeparáltan vizsgáltuk. Az immunreakciókat negatívként, gyengén pozitívként és erősen pozitívként értékeltük. Erősen pozitívnak fogadtuk el, ha a sejtek több mint 50%-a mutatott erős, intenzív festődést, gyengén pozitívnak értékeltük, ha a sejtek több mint 50%-a gyengén, kevésbé intenzíven festődött, illetve negatívként, ha a sejtek több mint 50%-a nem mutatott immunreakciót. In situ mrns-hibridizáció Az EGFR-mRNS kifejeződését in situ hibridizációs módszerrel is vizsgáltuk normál lepényben, részleges és teljes mola terhességben és choriocarcinomában. Mindegyik szövettani típusból 55 metszetet használtunk és az eredményeket összehasonlítottuk az immunhisztokémiai reakciókkal. Formalinban fixált, paraffinba ágyazott szövetekből 4 µm vastagságú metszeteket RNáz-mentes környezetben speciális ProbeOn Plus tárgylemezekre (Fisher Scientific) vittünk fel. A specifikus EGFR mrns polyd(t)20 oligonukleotid próbát (Research Genetics) 1:100 hígításban hibridizáltuk 45 C-on a Microprobe Manual Staining System (Fisher Scientific) használatával, követve a protokollban leírtakat (25). Kiértékelve az eredményeket, az immunhisztokémiához hasonlóan negatívként, gyengén és erősen pozitívként kategorizáltunk. Statisztikai analízis A citokinek hatását a JEG-3 CCA sejtek növekedésére és EGFreceptor-kifejezésére minimálisan 4 megismételt kísérletben vizsgáltuk. Az adatok feldolgozását mindegyik kísérlet után a variáns kétutas analízisével (ANOVA), StatView II Komputer szoftver program felhasználásával végeztük, Macintosh komputerrel. A citokinek hatását az EGF-receptor expressziójára és a CCA sejtek növekedésére akkor tartottuk szignifikánsnak a kontrollhoz viszonyítva, ha p < 0,05. A további eredmények adatait a χ 2 és a Fisher-féle χ 2 -teszt használatával a StatView 4,5 statisztikai szoftvercsomag segítségével elemeztük. Eredmények Az EGFR fehérjét immunhisztokémiai eljárással a normális lepény és a terhességi trophoblast-betegségek összes sejttípusában kimutattuk (1. táblázat, 1/a. ábra). A 20 eset kapcsán végzett EGFR-mRNS kimutatása in situ hibridizációval az immunhisztokémiával kapott eredményeinket alátámasztotta (1/b. ábra). Mind a 10 choriocarcinomában erős EGFR immunfestődés figyelhető meg. A reakció intenzitása choriocarcinomában és a teljes mola syncytiotrophoblastjában szignifikánsan erősebb, mint a részleges mola és a normális lepény syncytiotrophoblast-sejtekben (p < 0,01, p < 0,01), külön-külön). Az EGFR ugyancsak szignifikánsan erősebben fejeződik ki a teljes mola cytotrophoblast-sejtekben, mint a részleges molában és a normális lepényben (p < 0,01, p = 0,05, külön-külön). Statisztikailag szignifikáns különbség van a choriocarcinoma és a teljes mola cytotrophoblast (p = 0,03), valamint a choriocarcinoma és a teljes mola bolyhon kívüli trophoblast (p < 0,04) EGFR festődése között. A c-erbb-2 onkoprotein kizárólagosan a bolyhon kívüli trophoblast-sejtekben fejeződik ki, a boholy-trophoblast mindkét sejttípusa festetlenül maradt (1/c. ábra). Erős pozitív festődést találtunk 1 placentában (9%), 2 részleges molában (12,5%), 20 teljes molában (80%) és 7 choriocarcinomában (70%). A normál lepényhez, vagy a részleges molához ha- 1149

4 sonlítva a pozitív festődési reakció szignifikánsan erősebb a teljes molában (p < 0,01, p < 0,01, külön-külön) és a choriocarcinomában (p < 0,02, p < 0,02, külön-külön). A c-erbb-3 protein 1 normális lepény kivételével valamennyi esetben és az összes vizsgált sejttípusban jelen van (1/d. ábra). Míg 6 choriocarcinoma (60%) mutatott erős immunreaktivitást c-erbb-3-ra, addig a normál placenta, a részleges és teljes molaszövetek kevesebb, mint 50%-a festődött erősen. A csoportok között azonban nem találtunk statisztikailag szignifikáns különbséget. 1. táblázat: Az immunhisztokémiai reakciók a vizsgált onkoproteinek esetében EGFR c-erbb-2 c-erbb-3 c-erbb-4 negatív gyengén + erősen + negatív gyengén + erősen + negatív gyengén + erősen + negatív gyengén + erősen + Placenta (n=11) ST 9 (81,8) CT 10 (91,0) BKT 2 (18,2) 2 (18,2) 11 (100) 1 (9,0) 11 (100) 9 (81,8) 6 (55,0) 4 (36,0) 1 (9,0) 1 (9,0) 1(9,0) 6 (55,0) 5 (45,0) 6 (55,0) 4 (36,0) 5 (45.5) 5 (45,5) 9 (81,8) 4 (36,0) 7 (64,0) 2 (18,2) 7 (64,0) 4 (36,0) Részleges mola (n=16) ST 10 (62,5) 6 (37,5) 11 (100) CT 12 (75,0) 4 (25,0) 11 (100) BKT 5 (31,2) 11 (68,8) 4 (25,0) 10 (62,5) 2 (12,5) 11 (68,8) 5 (31,2) 14 (87,5) 2 (12,5) 10 (62,5) 6 (37,5) 10 (62,5) 7 (43,7) 9 (56,3) 6 (37,5) 9 (56,3) 7 (43,7) Teljes mola (n=25) ST 4 (16,0) 21 (84,0) 25 (100) CT 10 (40,0) 15 (60,0) 25 (100) BKT 9 (36,0) 16 (64,0) 1 (4,0) 4 (16,0) 20 (80,0) 13 (52,0) 12 (48,0) 16 (64,0) 9 (36,0) 16 (64,0) 9 (36,0) 17 (68,0) 8 (32,0) 16 (64,0) 9 (36,0) 12 (48,0) 13 (52,0) Choriocarcinoma (n=10) TS 10 (100) 3 (30,0) 4 (40,0) 6 (60,0) 8 (80,0) 7 (70,0) ST= syncytiotrophoblast; CT= citotrophoblast; BKT= bolyhon kívüli trophoblast; TS= tumorsejt; n=100% 1. ábra: Az EGFR, c-erbb-2, c-erbb-3 pozitivitás terhességi trophoblast-tumorokban (A): EGFR choriocarcinomában immunhisztokémia (nagyítás: 40 ); (B): EGFR choriocarcinomában in situ hibridizáció (nagyítás: 200, a nyilak a tumorsejtekre mutatnak); (C): c-erbb-2 teljes mola hydatidosában (nagyítás: 100 ); (D): c-erbb-3 teljes mola hydatidosában (nagyítás: 100, a nyilak a bolyhon kívül trophoblast-sejtekre mutatnak) (20,0)

5 Pozitív c-erbb-4 immunfestődés figyelhető meg minden esetben. A normális lepényben, részleges és teljes molákban, valamint choriocarcinomában hasonló a c-erbb-4 onkofehérje immunreakciója, nincs szignifikáns különbség a csoportok között. A posztmoláris terhességi trophoblast-tumorok kialakulását vizsgálva azonban a teljes mola hydatidosákban, amelyekből perzisztens betegség fejlődött ki, az EGFR és a c-erbb-3 onkofehérje szignifikánsan erősebben festődött a bolyhon kívüli trophoblast-sejtekben. Míg erős immunreaktivitás figyelhető meg EGFR-ra azon teljes molabolyhon kívüli trophoblast-sejtek 100%-ában, amelyekből perzisztens trophoblast-tumor alakult ki (8/8), addig a később spontán remisszióba került teljes moláknak csak 47%-a mutat erős pozitivitást (17/8). A c-erbb-3 fehérje esetében ez az arány 75% (8/6) és 17,6% (17/3) a két csoportban. Előzetes próbakísérleteket végeztünk, hogy a szövettenyésztő lemezek vájulataiban meghatározzuk a JEG-3 sejtek optimális tenyésztési körülményeit a radioimmunassay-k és a mennyiségi DNS-analízis céljaira. Ha a JEG-3 sejteket folyamatos egyrétegű sejtkultúraként tenyésztettük, a sejtek számának megduplázódásához szükséges idő mintegy 22 óra volt. Ha egy vájulatba (96 vájulatú lemezben) sejtet helyeztünk és 48 óráig inkubáltuk, a sejteknek több mint 95%-a élő maradt, az EGF-receptorellenes ellenanyag kötődési értékeiben a különbségek maximálisak voltak és megfelelő számú sejt állt rendelkezésünkre, hogy a mennyiségi DNS-analízist elvégezzük. (Megjegyzendő, hogy a fenti kedvező tenyésztési körülmények a többi BeWo, Jar CCA-sejtvonalra is érvényesek voltak a különböző kísérletekben.) Az EGF-receptorellenes ellenanyaggal 37 C-on végzett kötési vizsgálatok szerint a MOPC-21 nevű, nem specifikus monoklonális ellenanyag kötődése elhanyagolható értékeket adott. A monoklonális EGF-receptorellenes ellenanyag kötődése dózisfüggő volt és szembetűnően 100 ng/ml ellenanyag-koncentráció felett következett be a receptortelítődés. 0,08% Na-azid jelenlétében ami gátolja az EGF-receptorok internalizációját csak 20%-kal kevesebb EGF-receptorellenes kötődési érték alakult ki. A JEG-3 CCA-sejteken a citokinekkel történő inkubációt követő EGF-receptor expressziójának mérésére 500 ng/ml ellenanyag-koncentrációt választottunk. A citokinekkel inkubált JEG-3 sejtek EGF-receptor kifejezését felmérő reprezentatív kísérlet eredményei a 2. ábrán láthatóak. A pozitív kontroll sejtjeit csak tápfolyadékkal inkubáltuk és nem tettük ki semmiféle citokinhatásnak. A negatív kontroll sejtjeit szintén csak tápfolyadékban inkubáltuk és a kötődési kísérleteket a nem specifikus MOPC-21 monoklonális antitestekkel végeztük el e sejteken. Az IL-1α és az IL-1β mindegyik dózisban, míg a TNF nagy- és közepes dózisokban idézte elő az EGF-receptor fokozott expresszióját a hatásuknak kitett sejtekben. Ezen megnövekedett EGF-receptor-expresszió mintegy 25%-kal több EGF-receptorellenes ellenanyag kötődését jelenti a pozitív kontrollsejtekhez viszonyítva (p < 0,05). Azok a sejtek azonban, amelyek az IL-2, a γ-ifn és a GM-CSF összes dózisaival, továbbá a TNF alacsony dózisaival inkubáltak együtt, nem mutattak szignifikáns változást az EGF-receptor expressziójában. Összehasonlítva a nem kezelt kontrollsejteken kapott értékekkel, a citokinkezelés nem befolyásolta a nem specifikus monoklonális ellenanyag, a MOPC-21 kötődését a sejtekhez. A 3. ábra egy mennyiségi DNS-analízis kísérlet adatait mutatja. A nem kezelt pozitív és negatív kontrollsejtek számában nem észleltünk szignifikáns különbséget. Egyértelmű volt azonban a növekedést gátló hatás, azokban a JEG-3 sejtekben, amelyeket az IL-1α, az IL-1β és a TNF különböző dózisaival inkubáltunk együtt (p < 0,01). Az ezen citokinek hatása alatt álló JEG-3 sejtek a dózistól függetlenül közel 25%-kal kisebb növekedést mutattak, mint a nem kezelt sejtek. Az összes dózist alapulvéve, úgy tűnik, hogy az IL-2, a γ-ifn és a GM-CSF nem változtatja meg jelentősen a sejtek növekedését a kontrollcsoportokéhoz viszonyítva. A 4. ábra grafikonja a radioimmunassay és a sejtszámszámoló kísérlet eredményeit vonja össze. Az IL-1α, IL-1β és TNF citokinek, amelyek szignifikánsan növelték a JEG-3 sejtek EGF-receptor-expresszióját egyidejűleg a sejtek növekedését is gátolták (p < 0,05). Ebből következően a sejtszámok különbségeihez való arányosítás után, az IL-1α, IL-1β és a TNF citokinekkel kezelt sejtek minden alkalmazott dózisban körülbelül 1,6-szor több EGF-receptort fejeztek ki felszínükön, mint akár a pozitív kontrollsejtek, akár az IL-2, GM-CSF vagy γ-ifn citokinekkel kezelt sejtek (p < 0,05). Mindezeken túlmenően, a sejtszámok különbségeihez történt arányosítás után, a nagy dózisú IL-1α-val, IL-1β-val és TNF-tel kezelt sejtek közel 1,8-szor több EGF-receptort fejeztek ki, mint a pozitív kontrollok és az IL-2-vel, γ-ifn-al, valamint GM-CSF-el kezelt sejtek (p < 0,01). 2. ábra: Az EGF-receptor-expresszió radioimmunassay-je különféle citokinek hatásai után magas dózis: IL-1α és IL-1β: 510 u/ml; IL-2: 500 U/ml; IFNγ: U/ml; GM-CSF: 5000 U/ml; TNF: U/ml közepes dózis: IL-1α és Il-1β: 51 U/ml; IL-2: 50 U/ml; IFNγ: U/ml; GM-CSF: 500 U/ml; TNF: 1000 U/ml alacsony dózis: IL-1α és IL-1β: 5,1 U/ml; IL-2: 5 U/ml; IFNγ 1400 U/ml; GM-CSF: 50 U/ml; 50 u/ml; TNF: 100 U/ml A JEG-3 sejteket 48 óráig különféle citokinek változó koncentrációival inkubáltuk három nagyságrendet átfogó dózistartományban. A JEG-3 sejteken az EGF-receptor-expresszió mennyiségét EGF-receptorellenes monoklonális ellenanyag használatával mértük. A kontrollsejteket csak szövettenyésztõ tápoldattal inkubáltuk és semmilyen citokinhatásnak nem tettük ki azokat. Mintegy az ellenanyag-specificitás kontrolljaként, a csak szövettenyésztõ tápoldatban inkubált sejteket nem specifikus MOPC-21 monoklonális ellenanyaggal reagáltattuk. A számértékek a pozitív kontrollhoz viszonyítva arányosak az egy vájulatban található EGF-receptorok számával. Az oszlopok egy reprezentatív kísérletbõl származó, hármasával felállított minták átlagértékét ± SEM mutatják. Négy további kísérletben hasonló eredményeket figyeltünk meg. *p < 0,

6 3. ábra: Mennyiségi DNS-analízis a sejtszám megállapítására citokinekkel történõ inkubáció után magas dózis: IL-1α és IL-1β: 510 u/ml; IL-2: 500 U/ml; IFNγ: U/ml; GM-CSF: 5000 U/ml; TNF: U/ml közepes dózis: IL-1α és Il-1β: 51 U/ml; IL-2: 50 U/ml; IFNγ: U/ml; GM-CSF: 500 U/ml; TNF: 1000 U/ml alalcsony dózis: IL-1α és IL-1β: 5,1 U/ml; IL-2: 5 U/ml; IFNγ 1400 U/ml; GM-CSF: 50 U/ml; 50 u/ml; TNF: 100 U/ml A citokinek hatása utáni EGF-receptor-expresszió radioimmunassay-jét követõen a sejteket minden egyes szövettenyésztõ vájulatban kiszárítottuk, majd 1% nátrium-dodecil-szulfátot tartalmazó pufferolt foszfátsóban feloldottuk. A DNS-tartalmat minden egyes szövettenyésztõ vájulatban fluorometrikusan teszteltük Hoechst fluorokróm használatával. A sejtek számát egy standard görbébõl kivetítéssel származtattuk. Az oszlopok az elõzõ ábrán mutatott reprezentatív kísérletbõl származó, hármasával felállított minták átlagértékét ± SEM mutatják. Három további kísérletben hasonló eredményeket kaptunk. *p < 0,01 4. ábra: A sejtenkénti eltérõ EGF-receptor-expresszió magas dózis: IL-1α és IL-1β: 510 u/ml; IL-2: 500 U/ml; IFNγ: U/ml; GM-CSF: 5000 U/ml; TNF: U/ml közepes dózis: IL-1α és Il-1β: 51 U/ml; IL-2: 50 U/ml; IFNγ: U/ml; GM-CSF: 500 U/ml; TNF: 1000 U/ml alalcsony dózis: IL-1α és IL-1β: 5,1 U/ml; IL-2: 5 U/ml; IFNγ 1400 U/ml; GM-CSF: 50 U/ml; 50 u/ml; TNF: 100 U/ml A radioimmunassay-s és a sejtszámoló kísérletekbõl származó eredményeket vontuk össze ennek a grafikonnak a létrehozásához, amely az elõzõ értékek hányadosait fejezi ki. Az adatokat az egy perc alatt sejtenként kötõdött radioaktivitás-számmal fejeztük ki. Az oszlopok a hármasával felállított minták átlagértékét ± SEM mutatják. *p < 0,01. Az oszlopok magassága arányos a sejtek EGF-receptor-kifejezésével Megbeszélés A malignus betegségek egyik karakterisztikus jellemzője a kontrollálatlan sejtproliferáció, ezért a növekedési faktorok és azok receptorai a rákkutatás központi témái közé tartoznak (6, 7, 16, 26, 27, 29). Az EGFR és a c-erbb-2 fehérjékről több tanulmányban leírták, hogy szerepelnek számos humán malignus daganat patogenezisében és klinikai viselkedésében, például: gyomor-, vastagbél-, emlőrák (6, 16). Továbbá kimutatták, hogy a c-erbb-2 onkofehérje erős pozitív festődése a malignus betegség rossz prognózisának előrejelzője lehet (13). A c-erbb-3 és c-erbb-4 azok az utolsó évtizedben kimutatott onkoproteinek, amelyek szintén az EGFR-hoz hasonló c-erbb onkogén család fehérjetermékei. Ezen két fehérje erős pozitív expresszióját találták gyomor-, colorectalis, pajzsmirigy- és cervixcarcinomákban (6, 14, 26, 29). Az irodalomban az EGFR kifejeződésére vonatkozóan a terhességi trophoblast-tumorokban fellelhető adatok ellentmondásosak. Ladines-Llave és munkatársai csökkent EGFR-értéket találtak choriocarcinomában immunperoxidáz eljárással (19). Szemben ezzel a megfigyeléssel Filla és munkatársai tízszer nagyobb koncentrációban mutatták ki az EGFR fehérjét choriocarcinomában, mint normál cytotrophoblastban ELISA (Enzyme-linked immunosorbent assay) módszerrel (11). Eredményeinkhez hasonlóan Chen és munkatársai, valamint Steller és munkatársai erős EGFR expressziót találtak RRA (Radioreceptor assay) módszerrel choriocarcinoma-sejtkultúrákban (12, 28). Tanulmányunkban azt figyeltük meg, hogy az EGFR kifejeződése choriocarcinomában és a teljes mola syncytioés cytotrophoblast sejtjeiben szignifikánsan erősebb, mint a részleges mola és a placenta syncytio- és cytotrophoblastjaiban mind immunhisztokémiai, mind pedig in situ mrns-hibridizációs módszerrel. Ugyancsak szignifikánsan nagyobb a c-erbb-2 onkoprotein koncentrációja choriocarcinomában és a teljes mola bolyhon kívüli trophoblast-sejtjeiben, mint részleges molában és normális lepényben. A c-erbb-3 és c-erbb-4 fehérjék megjelenése azonban nem különbözött a normál lepény és a terhességi trophoblast-betegségek csoportjai között. Végül kimutattuk, hogy az EGFR és a c-erbb-3 onkofehérjék felerősödése a teljes mola hydatidosák bolyhon kívüli trophoblast-sejtjeiben összefüggésben lehet a posztmoláris perzisztens trophoblast-tumorok kialakulásával. Az epidermális növekedési faktor tehát egy potenciális mitogén, ami a normál sejtek és a tumorsejtek széles skálájában képes befolyásolni a metabolikus folyamatokat (2, 3, 22). Kamata és mtsai viszont kimutatták, hogy a humán squamosus ráksejtekben amelyek túlzott mértékben fejezik ki az EGF-receptorokat felszínükön az EGF specifikusan gátolja a sejtek növekedését (15). Más kutatók az aktivált EGF-receptor-koncentráció bifázisos természetét írták le a sejtek proliferációjában: a sejtproliferáció egyenesen arányos az aktivált EGF-receptorok koncentrációjával, úgy, hogy alacsony receptorkoncentrációknál fokozott sejtproliferáció történik, míg nagy receptorkoncentrációknál a sejtnövekedés gátlása tapasztalható (17, 22). Az aktivált növekedési faktor-receptor koncentrációja mind a ligand, mind pedig magának a receptornak a koncentrációjától függ. A jelenlegi tanulmányunkban azt találtuk, hogy a humán rekombináns citokinek, mint az IL-1α, IL-1β és TNF szignifikánsan fokozzák az epidermális növekedési faktor receptorainak expresszióját JEG-3 choriocarcinoma-sejteken és jelenlétükkel széles koncentrációtartományban gátolják ezen sejtek növekedését. Azok a kötődési kísérletek, amelyeket a nátrium-azid jelenlétében vagy hiányában végeztünk el, azt mutatják, hogy vizsgálatainkban a receptorokhoz kötődött EGF internalizációjának alig van 1152

7 hatása a receptorok expressziójának mérésére a sejtfelszínen. Adataink, azt az elméletet támasztják alá, hogy a citokinek legalábbis részben beavatkoznak a choriocarcinoma-sejtek proliferációjába azáltal, hogy befolyásolják azok EGF-receptor-kifejezését. A citokinek biológiai hatásait az elmúlt évtizedben széles körben és alaposan tanulmányozták. Az IL-1α és IL-1β ugyanazt a receptort aktiválják, hasonló kötődési tulajdonságokkal és jellemzőkkel rendelkeznek (21). Az IL-1 és a TNF aktivitásaiban sok átfedés mutatható ki, többek között a közvetlen sejttoxikus hatásuk, valamint közvetítő (mediátor)-szerepük a monocyták tumorsejtekkel szembeni sejttoxicitásában (20). Míg az IL-2, az IFN-γ és a GM-CSF citokinek elsősorban lymphocyta forrásokból erednek in vivo, addig az IL-1-et és a TNF-et főként mononukleáris fagocyták szintetizálják. Az IL-1 és a TNF a sejtfelszíni molekulák módosításán keresztül szabályozzák az endothelialis sejtfolyamatokat (5). Jelen tanulmányban azt észleltük, hogy az IL-1α, az IL-1β és a TNF hasonló hatást fejtenek ki a JEG-3 choriocarcinomasejteken, azaz fokozzák az EGF-receptorok expresszióját a sejtek felszínén és valamennyien gátolják a sejtek növekedését. Továbbá, ha összehasonlítottuk az IL-1α és az IL-1β hatásait, azt is megfigyeltük, hogy közöttük nincs különbség az EGF-receptorok kifejezésének fokozásában vagy a sejtnövekedés gátlásában. Amíg a citokinek hatása a tumorsejtek növekedésére meglehetősen összetettnek tűnik, az is világos, hogy további kutatás szükséges azoknak a mechanizmusoknak a tisztázására, amelyeken keresztül a citokinek, mint a helyi sejtfolyamatok parakrin közvetítőanyagai (mediátorai) hatnak. A trophoblast-sejtek és az immunrendszer közötti kölcsönhatás kutatása segítséget adhat azoknak az immunológiai faktoroknak a jellemzésében, amelyek mind a normális lepény, mind a terhességi trophoblast-tumorok növekedésére és működésére hatnak. Bár az embrionális differenciálódás során végbemenő szabályozott és rendezett növekedés eredendően különbözik a choriocarcinomákra jellemző anaplasztikus sejtek proliferációjától, bizonyos protoonkogének közös expressziója a két rendszerben rendkívül meglepő. Összefoglalva az eredményeinkből arra következtethetünk, hogy az EGFR és a vele rokon c-erbb onkogéncsalád expressziója kulcsszerepet játszik a terhességi trophoblast-betegségek patogenezisében és megjelenésében. Ugyanakkor az EGFR és c-erbb-3 onkoproteinek emelkedett koncentrációja teljes molákban korai markerként jelezheti a perzisztens posztmoláris terhességi trophoblast-tumorok kifejlődését a méhkiürítést követően. Az EGFR és a hasonló jellegű c-erbb onkogéncsalád és fehérjetermékeinek pontos biológiai jelentősége, még további alapos kutatómunkát igényel a terhességi trophoblast-betegségek és egyéb malignus daganatok kialakulásának felderítésében. IRODALOM: 1. Anderson, D. J., Berkowitz, R. S.: γ-interferon enhances expression of class I MHC antigens in the weakly HLA + human choriocarcinoma cell line BeWo, but does not induce MHC expression in the HLA - choriocarcinoma cell line Jar. J. Immunol., 1985, 135, Bahn, R. S., Speeg, K. V. Jr., Ascoli, M. és mtsa: Epidermal growth factor stimulates production of progesterone in cultured choriocarcinoma cells. Endocrinology, 1980, 107, Benveniste, R., Speeg, K. V. Jr., Carpenter, G. és mtsai: Epidermal growth factor stimulates secretion of human chorionic gonadotropin by cultured human choriocarcinoma cells. J. Clin. Endocrinol. Metab., 1978, 46, Berkowitz, R. S., Hill, J. A., Kurtz, C. B. és mtsa: Effects of products of activated leukocytes (Lymphokines and monokines) on the growth of malignant trophoblast cells in vitro. Am. J. Obstet. Gynecol., 1988, 158, Bevilacqua, M. P., Pober, J. S., Majeau, G. R. és mtsai: Recombinant tumor necrosis factor induces procoagulant activity in cultured human vascular endothelium: characterization and comparison with the actions of interleukin 1. Proc. Natl. Acad. Sci., 1986, 83, Bodey, B., Bodey, Jr., Groger, A. M. és mtsai: Clinical and prognostic significance of the expression of the c-erbb-2 and c-erbb-3 oncoproteins in primary and metastatic malignant melanomas and breast carcinomas. Anticancer Res., 1997, 17, Chang, J., Tsao, Y., Liu, D. és mtsai: The expression of type I growth factor receptor in the squamous neoplastic changes of the uterine cervix. Gynecol. Oncol., 1999, 73, Chao, H., Lei, Z. M., Rao, Ch. V.: Transcriptional and posttranscriptional mechanisms in epidermal growth factor regulation of human chorionic gonadoptropin (hcg) subunits and hcg receptor gene expression in human choriocarcinoma cells. Endocrinol., 1994, 135, Chen, F., Goto, S., Nawa, A. és mtsai: Receptor binding of epidermal growth factor in cultured human choriocarcinoma cell lines: effect of actinomycin-d and methotrexate. Nagoya J. Med. Sci., 1990, 52, Downward, J., Yarden, Y., Mayes, E. és mtsai: Close similariry of epidermal growth factor receptor and v-erb-b oncogene protein sequences. Nature, 1984, 307, Filla, M. S., Kaul, K. L.: Relative expression of epidermal growth factor receptor in cytotrophoblast and choriocarcinoma cell lines. Placenta, 1997, 18, Fülöp, V., Mok, S., Genest, D. R. és mtsai: c-myc, c-erbb-2, c-fms and bcl-2 oncoproteins. Expression in normal placenta, partial and complet mole, and choriocarcinoma. J. Repr. Med., 1998, 43, Fülöp V., Szigetvári I., Szepesi J. és mtsai: Újabb adatok a normál lepény és a terhességi trophoblast-betegségek onkogenetikájához. Nőgyógy. Onkol., 1997, 3, Haugen, D. R., Akslen, L. A., Varhaug, J. E. és mtsa: Expression of c-erbb-3 and c-erbb-4 proteins in papillary thyroid carcinomas. Cancer Res., 1996, 56, Kamata, N., Chida, K., Rikimaru, K. és mtsai: Growth-inhibitory effects of epidermal growth factor and overexpression of its receptors on human squamosus cell carcinomas in culture. Cancer Res., 1986, 46, Karameris, A., Kanavaros, P., Aninos, D. és mtsai: Expression of epidermal growth factor (EGF) and epidermal growth factor receptor (EGFR) in gastric and colorectal carcinomas. An immunohistological study of 63 cases. Pathol. Res. Pract., 1993, 189, Kawamoto, T., Mendelsohn, J., Le, A. és mtsai: Relation of epidermal growth factor receptor concentration to growth of human epidermoid carcinoma A431 cells. J. Biol. Chem., 1984, 259, Kraus, M. H., Issing, W., Miki, T. és mtsai: Isolation and characterization of erbb-3, a third member of ERB/epidermal growth factor receptor family: evidence for overexpression in a subset of human mammary tumors. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1989, 86, Ladines-Llave, C. A., Mauro, T., Manalo, A. M. és mtsa: Decreased expression of epidermal growth factor and its receptor in the malignant transformation of trophoblasts. Cancer, 1993, 71, Le, J., Vilcek, J.: Tumor necrosis factor and interleukin 1: cytokines with multiple overlapping biological activities. Lab. Inv., 1987, 56, Matsushima, K., Akahosi, T., Yamada, M. és mtsai: Properties of a specific interleukin 1 (IL-1) receptor on human EpsteinBarr virus-transformed B lymphocytes: identity of the receptor for IL 1-α and IL 1-β. J. Immunol., 1986, 136, Miyachi, Y., Terazono, T., Nagao, N. és mtsai: Epidermal growth factor (EGF) receptors in human chorionic gonadotropin-producing tumor. Transplantation in nude mice and the effect of EGF on tumor growth. J. Clin. Endocrinol. Metab., 1990, 71, Muhlhauser, J., Crescimanno, C., Kaufman, P. és mtsai: Differentiation and proliferation patterns in human trophoblast revealed by c-erbb-2 oncogene product and EGFR. J. Histochem. Cytochem., 1993, 41, O Keefe, E., 1153

8 Hollenberg, M. D., Cuatrecasas, P.: Epidermal growth factor: Characteristics of specific binding in membranes from liver, placenta and other target tissues. Arch. Biochem. Biophys., 1974, 164, Parks, C. S., Brigati, D. J., Manahan, L. J.: Automated molecular pathology: onehour in situ DNA hybridization. J. Histotechnol., 1991, 14, Poller, D. N., Spendlove, I., Baker, C. és mtsai: Production and characterization of a polyclonal antibody to the c-erbb-3 protein: examination of c-erbb-3 protein expression in adenocarcinomas. J. Pathol., 1992, 168, Prigent, S. A., Lemoine, N. R.: The Type I. (EGFR-related) family of growth factor receptors and their ligands. Prog. Growth Factor Res., 1992, 4, Steller, M. A., Mok, S. C., Yeh, J. és mtsai: Effects of cytokines on epidermal growth factor receptor expression by malignant trophoblast cells in vitro. J. Repr. Med., 1994, 39, Travis, A., Pinder, S. E., Robertson, J. F. és mtsai: c-erbb-3 in human breast carcinoma: expression and relation to prognosis and established prognostic indicators. Br. J. Cancer, 1996, 74, (Fülöp Vilmos dr., Budapest, Szabolcs u ) 1154