ÁLTALÁNOS VIZSGÁLÓ MÓDSZEREK

Átírás

1 ÁLTALÁNOS VIZSGÁLÓ MÓDSZEREK SPEKTROFOTOMETRIA FEHÉRJEKONCENTRÁCIÓ MÉRÉSE 1. Fotometria A spektrofotometria az egyik leggyakrabban használt analitikai eljárás a biokémiában. A módszer igen alkalmas kismennyiségű anyag gyors, egyszerű, rutinszerű mérésére. A mérés feltétele az, hogy a vizsgált anyagnak a színkép valamelyik pontján abszorpciós maximuma legyen. Ha az abszorpciós maximum a spektrum látható tartományába esik, az anyag színes. A látható tartományban elvégezhető analízisek száma igen nagy. Ha a vizsgálandó anyagnak magának nincs színe, valamilyen kémiai reakciót kell végezni a kérdéses anyaggal, ami színes vegyület képződéséhez vezet. Ezen kívül az ultraibolya tartományú analízisek is széles körben elterjedtek, mivel sok színtelen anyagnak van ezen a területen ( nm) intenzív elnyelési sávja. A spektrofotometriás mennyiségi analízisek az oldatok fényelnyelésére vonatkozó Lambert-Beer-törvényen alapulnak. A fényelnyelés nagyságából az abszorbeáló komponens koncentrációjára lehet következtetni, a következő összefüggések alapján. Ha a fény I 0 intenzitása a közeg L vastagságú rétegén áthaladva I-re csökken, akkor a Lambert-Beer-törvény értelmében: A = log I0 = ε c L I A log I0 kifejezést extinkciónak (E) vagy abszorbanciának (A), esetleg optikai I sűrűségnek (optikai denzitás, OD) nevezzük. Olyan hullámhossznál, amelynél az oldószer nem abszorbeál, a Lambert-Beer-törvény szerint A arányos az oldat c koncentrációjával, ha az oldott anyag a hígítás alkalmával nem megy át molekuláris változáson. A törvény csak adott hullámhosszú monokromatizált fény esetén érvényes. ε az oldott anyag koncentrációjától független állandó, melyet extinkciós koefficiensnek hívunk. Ha a koncentrációt mol/l-ben fejezzük ki, akkor moláris extinkciós koefficiensről, vagy moláris abszorptivitásról beszélünk. A moláris abszorptivitás megadja, hogy adott hullámhosszon 1 cm-es rétegvastagság esetén 1 mol/l (M) koncentrációjú oldatnak mekkora extinkció felel meg, mértékegysége a M -1 cm -1. Értéke az adott anyagra jellemző, de függ az oldószertől és a hőmérséklettől. A fenti összefüggések alapján tehát a fényelnyelés mértékéből a koncentráció kiszámítható: c = A ε L

2 Ha ε a moláris extinkciós koefficiens, akkor a c moláris koncentrációnak adódik. L a küvetta (plánparallel üvegből, műanyagból, vagy kvarcból készült mérőedény) optikai úthosszúsága cm egységben kifejezve. Ha a mérendő anyag nem követi pontosan a Lambert-Beer törvényt, egyéb módon pontosan meghatározott koncentráció sorozat segítségével kalibrációs görbét készítünk. Ennek alapján megfelelő korrekcióval elvégezhetőek a mérések. Régebbi fotométerekben a transzmisszó (transzmittancia) értékét mérték: T = I/I 0 vagy T % = I/I 0 x100 Összefüggése az extinkcióval: E = log 100 T% vagyis E = 2 - logt% 2. Az UV-VIS fotométer A spektrofotométer abszorbancia mérésére alkalmas műszer, amely egy általunk meghatározott hullámhosszúságú fényt állít elő, a mintára irányítja (amely általában oldott állapotban egy küvettában van), és megméri az átjutó fénysugár intenzitását. Mindehhez fényforrás, monokromátor, mintatartó, detektor és kijelző egység szükséges. A fényforrás a 200 és 320 nm közötti tartományban deutérium, nagynyomású hidrogén, esetleg nagynyomású xenon lámpa, a látható és közeli infravörös tartományban pedig wolframszálas lámpa. Egy kombinált UV-VIS spektrofotométerben mindkét típusú lámpa megtalálható. A monokromátor feladata az említett fényforrások folytonos spektrumából egy adott hullámhosszúságú fény kiválasztása. A modern készülékekben a régebben használt prizma helyett rácsos monokromátor van. A kilépő fény nem szigorúan monokromatikus, egy viszonylag szűk hullámhossz tartománnyal jellemezhető. A monokromátorban a be - és kilépő fény réseken halad keresztül, melyek szélessége meghatározza a sávszélességet. Minél szélesebb a rés, annál szélesebb a kilépő fény hullámhossz tartománya. Ugyanakkor a rés szűkítésével a fényintenzitás is csökken, tehát a rés megfelelő beállításával kompromisszumot keresünk a spektrális tisztaság és a kellő fényintenzitás között. A mintatartó: a fény keresztülhalad a mintán, amit műanyagból, üvegből, kvarcból vagy egyéb átlátszó anyagból készült mintatartóba helyeztünk. A műanyag és az üveg olcsó, de 280 illetve 320 nm alatt nem használhatók, mert itt túl nagy a fényelnyelésük. Rövidebb hullámhosszak esetén kvarc küvettát használunk. A küvetta minősége és állapota a mérés kritikus tényezője. Egyes készülékek alkalmasak arra, hogy a mérés során a minta hőmérsékletét állandó értéken tartsuk, ami például kémiai reakciók sebességének mérésekor fontos. Az olcsóbb készülékek általában egysugarasak, azaz egy küvetta befogadására alkalmasak. A jobb minőségű készülékek kétsugarasak, vagyis két küvettán mérnek egyszerre. Az egyikben a mintát tartalmazó oldat van, a másikban (referencia) pedig olyan oldat van, amely a mintát nem tartalmazza, de ettől eltekintve összetétele megegyezik az előző oldatéval. A készülék a minta abszorbanciájából automatikusan kivonja a referenciaoldat abszorbanciáját, így differenciálspektrumot mér, ami egyrészt jobban jellemzi a mérendő molekulát, 3

3 másrészt a kivonás a lámpa fényintenzitásának ingadozásából eredő hibát is csökkenti. A detektor: a mintán átjutó fény intenzitását fényérzékeny elektronikus eszközzel (fotodióda, fotoelektron-sokszorozó) mérik. Ennek fajtája, minősége erősen befolyásolja a készülék tulajdonságait. A fotoelektron-sokszorozókat rendkívül nagy sebesség és széles hullámhossz tartományban is nagy érzékenység jellemzi. A kis méretettel és mérsékelt érzékenységgel jellemezhető fotodiódákat az ún. fotodiódasoros (diode-array) készülékekben használják, melyekben egyidőben zajlik egy teljes spektrum felvétele. Nemcsak egyetlen hullámhosszon mérhetünk, hanem a hullámhosszat változtatva spektrumokat is felvehetünk, amely az abszorbancia hullámhossztól való függését mutatja meg. Az egyszerűbb készülékek mérési tartománya 0-1 abszorbancia egység (AU), komolyabb készülékek 0-2 AU, vagy még szélesebb tartományban mérnek. 3. A fotometria során leggyakrabban felmerülő problémák a.) Ha a minta zavaros, az hibát eredményez, hiszen a fény szóródik, és egy része nem jut a detektorba, tehát látszólag elnyelődik. b.) Ha egy molekula asszociációra képes, és az asszociált ill. disszociált formák fényelnyelése eltérő, akkor nem érvényesül a Lambert-Beer törvény, hiszen a disszociáció foka függ a koncentrációtól. c.) Nagyon fontos, hogy a küvetta legyen karcolásmentes és tiszta. A küvetta fényútba eső oldalait nem szabad megfogni. 4. Fehérjekoncentráció meghatározása A gyakorlatban sokszor van szükség oldott fehérjék mennyiségének pontos meghatározására. Erre számos módszer létezik. Kromogén (színképző) eljárásnak nevezzük, amikor a fehérje és egy szerves vegyület által létrehozott színes komplex elnyelését mérjük. A koncentráció meghatározható a fehérjék saját UV-elnyelése alapján is. Érdemes megjegyezni, hogy bármelyik eljárást választjuk, mindegyiknél előfordulhat, hogy más-más fehérjék azonos mennyiségeire eltérő eredményt adnak, és az is igaz, hogy egy adott fehérje esetén az egyes módszerek adhatnak eltérő értékeket. Nincs tökéletes fotometriás fehérje-meghatározó eljárás. Mindegyik módszernek van előnye és hátránya, ezeket mérlegelve kell választani közöttük. A legfontosabb szempontok a specificitás, az érzékenység, a mérhető koncentrációtartomány, a pontosság, a mérendő fehérje természete, a mérést zavaró anyagok jelenléte, és a mérésre szánt idő. Biuret-módszer A két, vagy több peptidkötéssel rendelkező molekulák alkalikus körülmények között reagálnak Cu 2+ ionnal, és lila komplex keletkezik. A koordináció a peptidkötések nitrogénje és a rézion között jön létre. A keletkezett komplex mennyisége arányos a peptidkötések számával. A gyakorlatban a fehérjemennyiség meghatározását kalibrációs görbe alapján végezzük, amelyet ismert mennyiségű fehérje segítségével készítünk. A biuret 4

4 reagenssel kezelt fehérjét a színes termék kialakulása után fotometráljuk 540 nmen. Előnye: csak néhány anyag zavarja (pl. Trisz és aminosav pufferek), gyorsan elvégezhető, nem érzékeny a mérendő fehérjék aminosavösszetételére. Hátránya: kicsi az érzékenysége, a méréshez legalább 1 mg fehérje szükséges. Lowry (Folin)-módszer Érzékeny eljárás. A színes termék kialakulása hasonlóan történik, mint a biuret reakciónál, de egy második reagenst (Folin-Ciocalteu) is alkalmaznak a szín erősítése érdekében. A keletkező erős kék színt itt két reakció okozza: (1) a peptid kötés nitrogéjének koordinációja rézionnal, és (2) a (fenollal reagáló) Folin- Ciocalteu-reagens (foszfomolibdát-foszfowolframát) tirozin általi redukciója. A mérés 750 nm-en történik. A biuret-módszernél leírtakhoz hasonlóan itt is kalibrációs görbét készítünk például BSA-val, és az ismeretlen fehérje koncentrációját a görbéről olvassuk le. Előnye: ez a módszer nagyon érzékeny, akár 1 µg fehérjét is képes kimutatni. Hátránya: kivitelezéséhez meglehetősen hosszú időre van szükség, számos anyag (pl. ammóniumszulfát, glicin, és merkaptánok) zavarja, és az inkubálási idő is kritikus. Mivel a különböző fehérjéknek más a tirozintartalma, a színképződés a különböző fehérjéknél eltérő. Ennek megfelelően a módszer azonos fehérjét tartalmazó oldatok koncentrációjának összevetésére inkább alkalmas, mint abszolút meghatározásra. Bradford-módszer Viszonylag új, mégis talán a legelterjedtebb fehérjemeghatározási módszer. Az eljárás a Coomassie Brilliant Blue G-250 festék azon tulajdonságán alapszik, hogy savas közegben kötődik a fehérjékhez (elektrosztatikus és van der Waals kölcsönhatással), és ekkor elnyelési maximuma 465-ről 595 nm-re tolódik el. Előnye: nagyon érzékeny, a hasznos mérési tartomány 1-20 µg, és gyorsan kivitelezhető. Viszonylag kevés olyan anyag van, ami zavarja a mérést (urea és guanidin-hidroklorid jelenlétében is lehet mérni vele), de sajnos a detergensek ilyenek. Nyomnyi mennyiségű mosogatószer is meghamisíthatja a kapott eredményt. Hátránya: a módszer meglehetősen aminosavösszetétel-függő és megfesti a küvettákat is. A 2. gyakorlaton ezzel a módszerrel történik az apiráz enzim mennyiségének meghatározása. Spektrofotometriás módszer UV-elnyelés alapján A módszer alapja, hogy az aromás aminosavak közül a triptofán és tirozin 280 nm környékén erős elnyelési csúcsot mutat. Előnye, hogy gyors és egyszerű. Mivel nem kell a méréshez a fehérjéket kémiai reakcióba vinni, ezt az eljárást használják fehérjék ill. peptidek kromatográfiás elválasztásának folyamatos követésére. Hátránya, hogy mivel az egyes fehérjék különböző arányban tartalmaznak aromás aminosavakat, inkább csak ugyanazon fehérje különböző oldatainak összevetésére alkalmas, nem abszolút módszer. A probléma kiküszöbölhető, ha ismerjük a fehérjemolekulában található tirozin és triptofán aminosavak számát, amiből a moláris extinkciós koefficiens jól becsülhető. A módszer érzékenysége mérsékelt, 50 µg körül van. A mérést zavarja minden 280 nm-en elnyelést mutató anyag, leggyakrabban DNS (a nukleinsavak elnyelési maximuma 260 nm-nél van, és 280 nm-en még erős elnyelést mutatnak). Warburg és Christian módszere kiküszöböli a 5

5 nukleinsavak által okozott hibát. Eszerint meghatározzuk a minta A 280 /A 260 értékét, majd egy táblázatból keressük ki a megfelelő fehérje és nukleinsav arányát. A fehérjekoncentráció számolható a következő összefüggés alapján: c prot (mg/ml) = 1,55 x E 280nm 0,76 x E 260nm. Megjegyzendő, hogy a fehérjék ill. a peptidek nm között is igen intenzív elnyelést mutatnak, ami a peptidkötéseknek és a karboxiloldalláncoknak tulajdonítható. Mennyiségi meghatározásra azonban ez a hullámhossz tartomány csak rendkívül tiszta oldatok esetén használható, mert ebben a tartományban számos más anyag nagy mértékben elnyel. 6

6 OPTIKAI AKTIVITÁS, FORGATÓKÉPESSÉG MÉRÉSE: POLARIMETRIA Azokat az anyagokat melyek a poláros fény síkját az eredeti iránytól elfordítják optikailag aktív anyagoknak, magát a jelenséget optikai aktivitásnak nevezzük. Az optikailag aktív szénvegyületek forgatóképességének számszerû jellemzésére a fajlagos forgatóképességet [ α ]-t használják. l. c [ α ] = ahol: α = az elforgatás szöge (a leolvasott érték fokokban) l = az átvilágított réteg hossza ( dm ) c = az oldat koncentrációja ( g / 100 ml ) Mivel [ α ] értéke függ a hõmérséklettõl, a fény hullámhosszától, az oldószertõl illetve a koncentrációtól, ezeket az értékeket mindig meg kell adni a forgatóképesség értékének megadásakor. 20 [ α ] = - 40 ( c = 2, CHCl 3 ) D Ez a kifejezés tehát azt jelenti, hogy a vizsgált anyag balra forgató ( - ), fajlagos forgatóképessége 40, a mérést a Na D vonalának megfelelõ monokromatikus fényben, 2 g / 100 ml koncentrációjú kloroformos oldatban 20 o C hõmérsékleten végeztük. Az optikai forgatóképességet polariméterrel mérjük. A mérés elve a következõ: A polarizált monokromatikus fény, amelyet általában egy Na lámpa és egy polarizátor (Nicolféle prizma) szolgáltat, áthalad a mérendõ mintát tartalmazó küvettán és az abban levõ anyag a fény síkját bizonyos szögben elforgatja. Az elforgatott fénysugár egy másik Nicol-féle prizmába jut (analizátor). Egy mechanikai rendszer segítségével az analizátort addig forgatjuk, amíg a fénysugár intenzitása maximális nem lesz. Az elforgatás szögét megállapítjuk. A méréshez alkalmazott készülékek a detektálásban, az elforgatás módjában és az elforgatás szögének mérésében különböznek egymástól. A legegyszerûbb polarimétereknél az elforgatás manuálisan, a detektálás vizuálisan (a látómezõ két felének fényintenzitását szemmel összehasonlítva), az elforgatás szögének leovasása egy skáláról történik. A gyakorlaton használt készülék teljesen automatizált, a küvetta behelyezését követõen az elforgatás szöge digitális kijelzõn jelenik meg. 7

7 ELEKTROFORÉZIS Az elektroforézis töltéssel rendelkezõ részecskék elmozdulása elektromos erõtérben. Az elmozdulás függ az alkalmazott térerõtõl, a molekula töltésétõl, az elválasztás idõtartamától. Az egységnyi idõ alatt, egységnyi térerõ hatására történõ elmozdulás a molekula elektroforetikus mobilitását jelenti. A fehérjék töltése a ph függvénye, így az elektroforetikus mobilitás megadásakor mindig utalni kell a puffer ph-jára, ionerõsségére, összetételére. Az elektroforézisnek két formája ismeretes annak megfelelõen, hogy a molekulák folyadékban vándorolnak ( szabad elektroforézis ), vagy valamilyen hordozó közegben ( zóna elektroforézis ). A két forma csak módszerében különbözik egymástól. A zóna elektroforézis hordozója lehet szûrõpapír, cellulózacetát-membrán, agar-, keményítõ-, poliakrilamid-gél elektroforézis során érvényesül a gél "molekulaszûrõ" hatása is. A klinikai rutin laboratóriumokban igen elterjedt a cellulóz-membrán és az agar-gél elektroforézis, s mindkettõ immundiffúzióra, immunelektroforézisre is alkalmas. A legújabb elektroforézis technika a kapillár-elektroforézis, melyben a hordozó kis átmérõjû kvarc kapilláris, vagy arra felvitt hordozó anyag. Számos elõnye van a hagyományos elektroforézis technikákkal szemben. Detektálási módja általában fotometriás, ezért rendkívül érzékeny, kis mintamennyiségeket és kevés puffert igényel, a kapilláris többször használható, ezért jól reprodukálható, egyszerûen alkalmazható technika. Biokémia gyakorlaton csak a zóna-elektroforézis különbözõ típusaival találkozunk, melyek közül a következõkben részletes ismertetõt adunk a poliakrilamid-gél elektroforézisrõl. 8

8 Agaróz gél elektroforézis A DNS fragmentek elválasztására, identifikálására és a fragmentek tisztítására legáltalánosabban használt módszer az agaróz gél elektroforézis. A technika egyszerû, gyors és a gélben lévõ DNS közvetlenül láthatóvá tehetõ: a DNS csíkok a gélben festhetõk kis koncentrációjú interkaláló festékkel, az ethidium-bromiddal; már 1 ng DNS látható a gélen UV fényben. A DNS elektroforetikus vándorlási sebessége az agaróz gélben 4 fõ paramétertõl függ: A DNS molekula mérete: A lineáris kettõs szálú DNS (amely feltehetõen egyik végével elõrefele vándorol a gél mátrixban) sebessége fordítottan arányos a molekulasúly tizes alapú logaritmusával. Az agaróz koncentrációja: A DNS elektroforetikus mobilitásának (µ) a logaritmusa és a gélkoncentráció (τ) között egyenes arányosság van, amely a következõ egyenlettel írható le: log = log 0 K r ahol µ 0 a szabad elektroforetikus mobilitás, K r pedig a retenciós együttható, amely függ a gél tulajdonságaitól és a vándorló molekula méretétõl, valamint alakjától. A DNS koformációja: Az azonos molekulasúlyú zárt cirkuláris (I. forma), nicked cirkuláris (II. forma) és a lineáris (III. forma) DNS különbözõ sebességgel vándorol az agaróz gélben. A három forma relatív mobilitása elsõsorban az agaróz koncentrációjától függ, de hat rá az áramerõsség, a puffer ionerõssége és az I. formán levõ szuperhelikus menetek sûrûsége. Bizonyos körülmények között az I. forma gyorsabban vándorol, mint a II. forma, máskor a sorrend fordított. Ebben az esetben egyre nagyobb mennyiségû ethidium-bromid kötõdika DNS-hez, az I. forma negatívan csavarodott szuperspiráljai kitekerednek és a molekula vádorlási sebessége csökken. Egy bizonyos kritikus szabad festék koncentrációnál ahol a molekula teljesen kiegyenesedik, a DNS I. formájának avádorlási sebessége eléri a minimumot. Az alkalmazott áram: Alacsony feszültségen a lineáris DNS vándorlása arányos a feszültséggel. A DNS bázisösszetétele és a hõmérséklet: A DNS viselkedése az agaróz gélben nem függ lényegesen sem a DNS bázisösszetételétõl, sem a hõmérséklettõl. 9

9 1. ábra: Az agaróz gélre felvitt minták felülrõl lefelé futottak, bal szélen létra látható. Poliakrilamid-gél elektroforézis ( PAGE) A poliakrilamid gélen mint hordozón végzett különbözõ elektroforetikus módszereket széleskörûen alkalmazzák a modern fehérje- és nukleinsav kutatásban. A poliakrilamid gél akrilamid és N,N'-metilén-bisz-akrilamid polimerizációs terméke. A monomer akrilamidból felépülõ poliakrilamid láncokba beépül a térhálósító bisz-akrilamid, s több szomszédos lánccal is kapcsolatot teremt. Igy a töltéskülönbségen alapuló szétválasztással egyidõben a molekula alak és méret szerinti elválása is lejátszódik a térhálós poliakrilamid gélben, ami a poliakrilamid gél rendkívül nagymértékû felbontóképességét adja. A gél rácsszerkezetét, azaz a szomszédos láncok közötti keresztkötések számát, az akrilamid monomer koncentrációjának és a térhálós szerkezet kialakítását biztosító metilén-biszakrilamid koncentrációjának a százalékos aránya határozza meg. A gél rácsszerkezete pedig a gél átlagos pórusméretét adja. A gél átlagos pórusmérete szabja meg, hogy a molekulaszûrõ hatás milyen molekulasúly tartományban effektív. A poliakrilamid kedvezõ tulajdonságai: A poliakrilamid gél igen elõnyös és alkalmas közeg az elektroforézis számára. A gél mechanikai tulajdonságai 4-20 % akrilamid koncentrációtartományban nagyon kedvezõek. A poliakrilamid hidrofil karakterû, nem tartalmaz azonban töltött csoportokat. Kémiailag közömbös, stabil vegyület, fehérjékkel, nukleinsavakkal nem lép specifikus kölcsönhatásokba, továbbá nem zavarja az azok detektálására szolgáló különbözõ festési reakciókat. Kompatibilis a legtöbb általánosan használt pufferrel. Nem denaturáló körülmények közt, általában 0 o C körüli hõmérsékleten végzett elektroforézis során számos enzim megõrzi natív állapotát és így enzimatikus aktivitásuk alapján detektálhatók. 1

10 Különös jelentõségre tett szert a nátrium-dodecil-szulfát (SDS) jelenlétében végzett gélelektroforézis a fehérjék alegységsúlyának meghatározásában. A poliakrilamid gél képzõdésének optimális körülményei: Akrilamid monomer oldatához, amely az akrilamid mennyiségére számított 1-3% N,N'- metilén-bisz-akrilamidot is tartalmaz, megfelelõ ph-jú pufferoldatot keverünk. Az akrilamid polimerizációja gyökös folyamat. Katalizátorként leggyakrabban ammónium-peroxidiszulfátot használnak, amelyek vizes közegben lejátszódó spontán bomlása szabad gyök keletkezéséhez vezet: S 2 O SO 4 2- Egy másik katalizátor a riboflavin, melynek látható fénnyel történõ gerjesztése eredményez szabad gyököt tartalmazó molekulát. Mindkét katalizátor esetében szükség van egy ún. iniciátor molekulára is a polimerizáció elindításához. Iniciátorként általánban tercier aminokat alkalmaznak, leggyakrabban a tetrametilén-diamint (TEMED). Iniciátor alkalmazása azért szükséges, mert a katalizátorokból képzõdõ primer szabad gyökök nem képesek az akrilamid kettõs kötését felhasítva a polimerizációt elindítani. Képesek viszont a TEMED molekula gerjesztésére és az ekkor keletkezõ szabad gyök már megfelelõ a polimerizáció iniciálására. Az akrilamid polimerizálása során nagy molekulatömegû lineáris polimer keletkezik, mely vízben nagy viszkozitású oldatot képezve oldódik. Gél struktúra akkor alakul ki, ha az akrilamidhoz néhány százaléknyi bifunkciós N,N'-metilén-bisz-akrilamidot adunk. A metilén hidak összekapcsolják az egyes lineáris polimer szakaszokat, ezért az akrilamid gél egyetlen óriásmolekulának tekinthetõ. A gél készítése során a körülményeket (katalizátor és iniciátor koncentrációja) úgy kell megválasztani, hogy a gél "bepolimerizálása" perc alatt lejátszódjon. Technikai kivitelezés: Elektroforézishez a gélt két különbözõ formában állíthatjuk elõ. A korábbi eljárás szerint a pufferrel, iniciátorral, katalizátorral összekevert akrilamid és metilén-bisz-akrilamid oldatot egyik végükön lezárt kis üvegcsövecskékbe töltjük. Ezen mûveletet gyorsan kell elvégezni, mivel eközben már folyik a polimerizáció. A másik technika szerint két üveglap között akrilamid lemezt öntünk. Ilyenkor egy gélen több mintát is futtathatunk egymás mellett, ami nagymértékben megkönnyíti a kiértékelést. Ez a technika lehetõvé teszi a kétdimenziós elektroforetikus szeparálások végrehajtását is. Pufferrendszerek hatása az elektroforetikus mobilitásra: Az elektroforézis sikerét nagyban befolyásolja a gél koncentráció és a ph helyes megválasztása. Fehérjék elektroforézisét általában az izoelektromos pontnál magasabb ph-n szokták végrehajtani. A puffer szerepe nemcsak az, hogy a ph-t állandó értéken tartsa, (ez biztosítja a reprodukálhatóságot), hanem a puffer ionjai végzik az áram vezetését is. Legtöbb esetben a fehérjeionok az áram vezetésében csak nagyon csekély mértékben vesznek részt. Ha azonban a puffer koncentrációja túl alacsony, megnõ a fehérjeionok szerepe az áram vezetésében, ami rendszerint diffúz, elkenõdött fehérjesávok kialakulásához vezet. Az optimálisnál nagyobb pufferkoncentráció esetében viszont a fehérjék mobilitása csökken, ami szintén károsan befolyásolja az elválasztás minõségét. 1

11 Az alkalmazott pufferrendszerek szempontjából a különbözõ gélelektroforetikus technikákat két nagy csoportra oszthatjuk. Folytonos (kontinuus) a pufferrendszer akkor ha ugyanazt a puffert alkalmazzuk a gélben és az elektroforézis tankokban. Ez a módszer igen egyszerû,azonban valamivel rosszabb a felbontóképessége, mint a jóval bonyolultabb un. diszkontinuus pufferrendszert alkalmazó metodikáké. A diszkontinuus (diszk) technikák két különbözõ koncentrációjú gélt és három különbözõ pufferendszert alkalmaznak. A futtató gél fölé egy un. koncentráló gélt polimerizálnak. Ennek akrilamid koncentrációja a futtató gélénél jóval alacsonyabb, ezért itt a molekulaszûrõ hatás nem érvényesül. Ha a szeparálandó makromolekulák negatív töltésûek, vagyis az elektroforézist az izoelektromos pont feletti phn végezzük a következõ megállapítások érvényesek: A három különbözõ pufferrendszerben két különbözõ aniont alkalmaznak. Mind a koncentráló, mind a futtató gélben a puffer anion komponense olyan ion, melynek disszociációfoka nem függ a közeg ph-jától, vagyis egy erõs sav savmaradéka. Ez az ion általában a klorid ion. Az elektrolizáló puffer viszont olyan aniont tartalmaz, amely gyenge sav savmaradéka, pl. glicinát anion. A kis térfogatú fehérje mintát a koncentráló gél felszínére rétegzik. Az áram bekapcsolása után néhány perccel a fehérjeionok bejutnak a koncentráló gélbe. Minthogy a gélben csak klorid, az elektrolizáló pufferben csak glicinát anionok vannak, a koncentráló gélben kialakul egy klorid-glicinát front. A koncentráló gél ph-ja 6,5-6,8. Ezen a ph-n a glicin disszociációfoka viszonylag csekély, és ennek következtében, ha a fehérjeionok a glicin fázisba kerülnek relatív töltésük és így mobilitásuk is nagyobb lesz mint a glicinát anionoké. A fehérje ionok tehát gyorsabban mozognak mint a glicinát anionok, viszont mihelyt a kloridfázisba kerülnek, a helyzet megfordul, itt a klorid ionok mobilitása nagyobb. Ennek következtében a fehérjék, minthogy a glicinát anionoknál gyorsabban a klorid ionoknál lassabban mozognak, a klorid/glicinát határfelületen koncentrálódnak. Ez a jelenség tükrözõdik a gélrész elnevezésében is. Az elektroforézis során a klorid/glicinát határfelület végighalad a koncentráló gélen, majd belép az un. szeparáló gélbe. Ennek ph-ja Ezen a ph-n a glicin teljes mértékben disszociál és ezért mobilitása nagyobb lesz mint a fehérje ionoké. A klorid/glicinát front lehagyja a fehérjéket, melyek ezután különbözõ fajlagos töltésük következtében különbözõ sebességgel vándorolnak a gélben. A szeparáló gél akrilamid koncentrációját úgy kell megválasztani, hogy az elválasztani kívánt fehérje méret- tartományban a maximális molekulaszûrõ hatást fejtse ki. Detektálási módok: Fehérjefestés: A leggyakrabban alkalmazott fehérjefestékek a Coomassie Brilliant Blue R250, a savas Fast Green, az amidofekete és a brómfenol kék. A legérzékenyebb a Coomassie Brilliant Blue festék, mellyel már 0,1-0,5?g fehérje is detektálható. Enzimaktivitás mérés: Számos olyan színreakció ismeretes, melynek segítségével különbözõ dehidrogenázok, ATP-ázok, proteázok a poliakrilamid gélben kimutathatók. Ha fehérjefestésre nincs lehetõség, akkor a futtatás után a gélt egyenlõ, 1-2 mm-es darabokra vágják és minden egyes darabbal kémcsõreakció formájában elvégzik az enzimaktivitás meghatározását. Egyéb detektálási módok: A fehérjék detektálásának más módja az, hogy a vizsgálandó fehérjébe fluoreszcens molekulákat vagy izotóppal jelzett aminosavakat építünk be még az elektroforézis végrehajtása elõtt. Mind a fluoreszcens, mind a radioaktív detektálási technika rendkívül érzékeny, sok esetben 1-10 ng a kimutathatósági határ. 10

12 KROMATOGRÁFIÁS MÓDSZEREK A kromatográfiás eljárások vegyületkeverékek elválasztására alkalmasak azon az alapon, hogy az egyes vegyületek különbözõ megoszlást mutatnak a nagy felületû álló, és egy azon átáramló mozgó fázis között. A két fázis között végbemenõ egyenlõtlen megoszlás feltétele az, hogy az egyes komponensek fázisokhoz való affinitása, vagy diffúziós lehetõsége a fázisokban eltérõ legyen. Az elválasztás során álló és mozgó fázis érintkezik. A két fázis között beálló egyensúlyi állapotok eredményeként az anyagok gyorsabban, vagy lassabban vándorolnak. Az elválasztást eredményezõ határfelületi jelenségek alapján a kromatográfiás módszereket a következõ csoportokba sorolhatjuk: Adszorpciós kromatográfia: Az egyik fázisban oldott keverék egyes összetevõi a másik fázis határfelületén koncentráció különbséget mutatnak. A határfelületen gyakran a komponensek koncentrálódása következik be. A jelenség az adszorpció. Ha az egyik fázis mozog, a benne oldott anyagok, az álló fázison történõ különbözõ adszorpciójuk alapján szétválaszthatók. Az álló fázis szilárd, míg a mozgó fázis folyadék, vagy gáz halmazállapotú lehet. Adszorpciós jelenségek két egymással nem elegyedõ folyadék határfelületén is felléphetnek, de a komponensek elválasztása szempontjából ebben az esetben jelentõsebb a komponensek két fázisban mutatkozó eltérõ oldhatósága. Megoszlási kromatográfia: Két egymással részlegesen, vagy egyáltalán nem elegyedõ folyadék határfelületén az oldott anyagok megoszlási együtthatójuknak megfelelõen oszlanak meg a két fázis között. A megoszlási hányados egy anyag állófázisbeli és mozgófázisbeli egyensúlyi koncentrációjának hányadosa. A megoszlási kromatográfiában az állófázis is folyadék, amelyet rendszerint nagy felületû, szilárd hordozó felületére visznek fel. Ha az álló fázis a poláros, a vele érintkezõ mozgó fázis apoláros (szerves)oldószer, normál fázisú kromatográfiáról beszélünk. Néhány estben jobb elválás érhetõ el ha a fázisok polaritását megcseréljük. Ilyenkor az álló fázis az apoláros, a mozgó fázis pedig poláros (vizes)oldószer. Ezt fordított fázisú kromatográfiának nevezzük. Megoszlási kromatográfia megvalósítható gáz és nem illékony folyadék fázissal is. Ebben az esetben a szilárd hordozóra rögzített folyadék fázis és a gáz fázis közti megoszlás az elválasztás alapja. Az adott hõmérsékleten az illékonyabb, vagy a folyadékfázisban kevésbé oldódó komponensek a vivõgázzal nagyobb sebességgel haladnak így elválnak a többi komponenstõl. Ioncserélõ kromatográfia: Kétfázisú rendszer képezhetõ duzzasztott ioncserélõ szemcsék és ionokat tartalmazó vizes fázis érintkezésével is. Az ioncserélõ vízben oldhatatlan makromolekula, mely felületén töltéssel rendelkezõ funkciós csoportokat, ioncserélõ gyököket tartalmaz. Ezekhez kapcsolódik az ellentétes töltésû ellenion. A nagy töltéssel rendelkezõ ionok affinitása nagyobb az ioncserélõhöz, mint a kis töltésûeké. Az ioncserélõ kromatográfia alapját a keverék komponenseinek töltés különbözõsége képezi. 11

13 Ha az ioncserélõ makromolekula töltése negatív, a hozzá kapcsolódó ellenionok pozitívak, tehát az anyag kationcserélõként mûködik. Ha a makromolekula töltése pozitiv, akkor az anyag anioncserélõ. Azok az összetevõk, amelyek iontöltésben, ionogén csoportjuk disszociációs állandójában, vagy ionméretben eltérnek egymástól az ioncserélõ szemcsékhez különbözõ erõvel kötõdnek. Ezeket a tényezõket a ph és az ionerõsség változtatásával befolyásolhatjuk, ezért az ioncserés kromatográfia során vizes, pufferolt eluensekket alkalmaznak. Affinitás kromatográfia: Az elválasztásra biospecifikus szorpciós, deszorpciós folyamatokat alkalmaznak. A kölcsönhatások olyan vegyületpárok között lépnek fel, amelyek oldatban nagy szelektivitással reagálnak egymással. Ilyenek pl. antitest-antigén, enzim-szubsztrát, enzim-inhibítor stb. A specifikusan kapcsolódó párok egyike, funkciójának károsítása nélkül alkalmas hordozóhoz kötve a pár másik tagjának oldatból való szelektív megkötésére használható. A megkötött komponens szelektíven eluálható egy deszorbeáló folyadékkal. Gélkromatográfia: A gélszûrés is a kromatográfia elvén alapszik. Az álló fázist a megduzzasztott gélszemcsék képezik, a mozgó fázis a szemcsék közötti vizes oldat. A gélkromatográfia elméleti és gyakorlati vonatkozásait külön fejezetben ismertetjük. Megkülönböztethetjük a kromatográfiás módszereket a kifejlesztés módja szerint is. Eszerint frontális, kiszorításos és eluciós kromatográfiáról beszélhetünk. A módszerek gyakorlati jelentõsége egyáltalán nem azonos, a leggyakoribb az eluciós technika. Elució: Az elválasztani kívánt keveréket, lehetõleg az eluensben oldva, kis térfogatban visszük az állófázisra. A továbbiakban a tiszta oldószert, az eluenst áramoltatjuk át az állófázison. Folyamatosan ismétlõdõ egyensúly beállások következtében az összetevõk lassan haladnak át az állófázison. Mozgásukat a komponens-állófázis-oldószer kölcsönhatás szabályozza. A komponensek teljesen elvált zónákat képeznek, közöttük a tiszta oldószer zónái vannak, így távoznak az állófázisról. A módszer mind analitikai, mind preparatív elválasztásokra alkalmas. GÉLKROMATOGRÁFIA (Méretkizárási kromatográfia) Az elsõ alkalmazása óta eltelt évtizedek alatt a gélkromatográfia egyike lett a legfontosabb biokémiai elválasztási módszereknek. Számos enzim, poliszacharid, nukleinsav, fehérje és más biológiai makromolekula tisztítására alkalmazzák. A biológiai makromolekulák olyan speciális funkciójú anyagok, melyeket in vivo a környezetükben végbement kis változások szabályoznak. A ph-ban, fémion-, kofaktor-, stb. koncentrációban történõ változások lényeges hatással lehetnek a vizsgált molekulára, ezért szükségesek olyan finom elválasztási módszerek, melyek ezen faktoroktól függetlenül mûködnek. A gélkromatográfia egyike ezen módszereknek. 12

14 A gélkromatográfiának a szakirodalomban számos szinonim, az elválasztás mechanizmusára utaló elnevezése ismert, mint pl. gélszûrés, molekulaszûrés, kizáródási kromatográfia, géláthatolási kromatográfia. A különbözõ és gyakran megtévesztõ terminológiák helyett egyre inkább terjed a racionális gélkromatográfia elnevezés használata. Kolloidkémiai meghatározásuk szerint a gélek félszilárd halmazállapotú, alakállandó, rugalmas difform rendszerek, amelyek egy gélképzõ vegyület és a szolvatáló közeg kölcsönhatásából keletkeznek. A gélekkel szemben támasztott követelmények 5. A kromatográfia kísérleti körülményei között az elválasztandó anyagokkal vagy oldószerekkel ne lépjenek kémiai reakcióba. 6. A gélszerkezetnek megfelelõ kémiai stabilitása legyen. A poliszacharid-típusú gélek glikozidkötései erõs ásványi savakra, a karbonsavamid tartalmú akrilamid gélek pedig lúgokra érzékenyek. 7. Mikroorganizmusoknak, bakteriális bomlásnak lehetõleg ellenállók legyenek. A kitûnõ táptalajnak tekinthetõ poliszacharid típusú géleket általában NaN 3 -dal (0,02%-os oldatban) védjük a fertõzés ellen. 8. A gélek szerkezete lehetõség szerint minimális ionos csoportot tartalmazzon. 9. Az azonos kémiai szerkezetû mátrix a különféle feladatok megoldására alkalmas legyen (pl. Sephadex, Bio-Gél típusok). 10. A gél elõállítása során homogén, jól ellenõrizhetõ méretû és eloszlású, megfelelõ mechanikai szilárdságú szemcsék keletkezzenek. Gélképzõ anyagok 1. Természetes gélképzõ anyagok A gélkromatográfia céljára elõször a természetes eredetû poliszacharidokat és polimereket alkalmazták. Ezek túlnyomó része, mint pl. a keményítõ és az agar, ma már csak történeti érdekességû. A természetes eredetû gélek közül napjainkban csak az agarózt használjuk. Az agaróz D-galaktóz és 3,6-anhidro-L-galaktóz egységekbõl felépített lineáris poliszacharid. Az agaróz kis koncentrációju vizes oldata (0,5% alatt) is már könnyen gélt képez. A gélek pórusmérete az agaróztartalomtól függ. Minél kisebb a gél agaróztartalma, annál nagyobb méretû molekulák képesek a gél szerkezetébe behatolni. Makropórusos szerkezetük folytán az agarózgélek igen nagyméretû molekulák pl. nukleinsavak, poliszacharidok, nukleoproteidek, antigének stb. kromatográfiájára is használhatók. Sepharose néven kerülnek forgalomba. 13

15 2. Félszintetikus gélképzõ anyagok A félszintetikus géleket természetes alapanyagok, elsõsorban a dextrán ipari-üzemi méretû tisztításával, frakcionálásával és kémiai átalakításával állítják elõ. A legismertebb félszintetikus géleket a Pharmacia cég gyártja. Két fõ típusuk a Sephadex G, amely hidrofil gél és a Sephadex LH, a Sephadex G gélekbõl hidroxi propilezéssel elõállított organofil gél. A Sephadex gélek alapanyaga a dextrán. A dextrán glükózegységekbõl 1,6-?-glükozid kötésekkel felépített lineáris poliszacharid. A polimer helyenként 1,2-, 1,3-, vagy 1,4- glükozid-kötésekkel kapcsolódó oldalláncokat tartalmaz. A nyers dextránból részleges hidrolízissel kapott és átlagos molekulatömegû dextrán-frakciókat epiklórhidrinnel reagáltatják. Az epiklórhidrin a dextránláncok között 1,3-glicerid-éterkötéseket hoz létre. A keresztkötési reakciók hatására a dextránból vízben oldhatatlan hálózat keletkezik. A keresztkötések rendszere döntõen meghatározza a dextrán gélek pórusméretét és molekulatömeg (méret) szerinti frakcionálási tartományát. A keresztkötések számával csökken a gélek pórusmérete és annak a molekulatömegnek (méretnek) a határértéke, amely a gél szerkezetébe még éppen behatolhat. 3. Szintetikus gélképzõ anyagok Az alapanyagok szempontjából a szintetikus gélek három csoportját különböztethetjük meg: - akrilamid-akrilát kopolimerek - sztirol-divinil-benzol kopolimerek - egyéb, kevert típusu gélek A szintetikus gélek közül az akrilamid-akrilát géleket a legelterjedtebben alkalmazták a gélkromatográfiában. Az akrilamid és a N,N'-metilén-bisz-akrilamid kopolimerizálásával állítják elõ. A poliakrilamid gélszemcse pórusméretét elsõsorban a monomer akrilamid koncentrációja, másodsorban a keresztkötéseket létrehozó N,N'-metilén-bisz-akrilamid aránya határozza meg. A két tényezõ variálásával a géltípusok széles skálája állítható elõ. A poliakrilamidgélek poláris, hidrofil tulajdonságait a szerkezet karbonsavamid csoportjai adják. A savamidkötéseket erõs lúgok megbontják, és hidrolízisük a gélek ioncserélõ tulajdonságainak növekedését hozza létre. Kromatográfiás célokra a homogén méretû, duzzasztott gélszemcséket használják. A kereskedelmi forgalomba kerülõ géltípusokat emulgeálásos módszerrel kondenzált gyöngypolimer szemcsék formájában készítik. A homogén szemcseméretû frakciókat a duzzasztott termék szitálásával kapják.a kromatográfiás tulajdonságok szempontjából a poliakrilamidgélek reverzibilisen száríthatók. A legismertebb kereskedelmi poliakrilamidgélek a Bio-Gel P típusok. A poliakrilamidgélek elõnye a dextrángélekkel szemben, hogy a szemcsék ridegebbek, mechanikai hatásoknak ellenállóbbak. Másik igen nagy elõnyük, hogy mint szintetikus anyagok, táptalajként a mikroorganizmusok számára nem megfelelõek, és a bakteriális hatások iránt közömbösek. A gélkromatográfia nevezéktana Belsõ térfogat (V b ): az a térfogat melyet a gél belsõ szerkezetéhez tartozó oldószermolekulák töltenek ki. 14

16 Külsõ térfogat (V k ): a gélszemcsék között elhelyezkedõ oldószer térfogat, tulajdonképpen a gélkromatográfia mozgó fázisa. A gélmátrix saját térfogata (V x ): a gél szerkezetét képezõ polimerhálózat térfogata. Teljes térfogat (V t ): V t = V b +V k +V x Eluciós térfogat (V e ): az elválasztandó anyag megjelenéséig a gélágyon átfolyt oldószer térfogata. Az eluciós térfogat a gélágy térfogati megoszlásától, a gél minõségétõl és az elválasztandó anyag tulajdonságaitól függ. Retenciós térfogat (V e -V k ): az oldott anyag által a gélfázisban elfoglalt térfogat Elválasztási térfogat (V sz ): az eluciós térfogatok különbsége V sz = V e2 - V e1 Volumetrikus megoszlási hányados (K d ): V e - V k K d = V b Definíciója szerint a K d csak a gélszemcsék belsõ térfogatának a molekulák rendelkezésére álló részét veszi figyelembe. Másik definició szerint: V e - V k K av = V t - V k A volumetrikus megoszlási hányados az oldott anyagok molekuláinak méretétõl (molekulatömegétõl) és a gél belsõ szerkezetétõl (pórusméretétõl) függõ anyagi állandó. Értéke 0 és 1 között változhat. Ha K d = 0, az oldott anyag molekulái a gél belsõ térfogatából teljesen kizáródnak, az eluciós térfogat megegyezik a gélágy külsõ térfogatával. Ha K d = 1, az oldott anyag molekulái a gél teljes belsõ térfogatát igénybe vehetik, az eluciós térfogat az oszlop teljes oldószer-térfogatával egyenlõ. A K d = 1 értéket csak az elektrolitok közelítik meg, és a K d értéke a 0,8-0,9-et általában nem haladja meg. Az egynél nagyobb K d értékek a gélkromatográfiához társuló adszorpciós vagy ioncserélõ folyamatokat jelzik. A gélkromatográfia mozgófázisa Az eluens összetétele nem befolyásolja közvetlenül az elérhetõ gélkromatográfiás elválasztást. A töltés nélküli anyagok esetében desztillált vizet alkalmazhatunk eluensként. Általában a gélkromatográfiás elválasztások vizes közegben történnek. Ha az elválasztandó anyag töltéssel bíró csoportokat tartalmaz, a megfelelõ ph és ionerõsség beállítására pufferoldatokat alkalmazunk eluensként, a lehetséges ionos kölcsönhatások megakadályozására. Erre a célra a nátrium-klorid is használható. 15

17 Ha a terméket liofilizálni akarjuk, illékony puffereket alkalmazhatunk. Ilyen pl. az ammóniumacetát, ammónium-bikarbonát. A leglényegesebb szempont a gélkromatográfiás eluens kiválasztásában, annak hatása az elválasztandó molekulára. A puffer ph-ja és ionösszetétele, disszociáltató közeg, vagy detergensek jelenléte konformációváltozásokat, a fehérjék alegységekre történõ disszociálását, enzim és kofaktor, hormon és hordozó molekulák disszociálását okozhatja, amelyet számításba kell venni a gél kiválasztásánál és az erdmények értékelésénél. Speciális esetekben szerves oldószerek is (etanol, metanol) alkalmazhatók eluensként. Ilyen pl. az Sephadex LH gélen történõ kromatográfia. Oszlopkészítés 1. A gél duzzasztása A gélkromatográfiában alkalmazott gélek nagyobb részét (Sephadex, Bio-Gél) száraz por formában hozzák forgalomba, ezért szükséges duzzasztásuk a megfelelõ pufferben, használat elõtt. A duzzasztás ideje alatt kerülni kell a keverést, mert ez a gélszemcsék roncsolódását okozhatja. A duzzasztási idõ csökkenthetõ forró vízfürdõ alkalmazásával. A szerves oldószerben történõ kromatográfiánál a megfelelõ Sephadex LH gélt a kiválasztott szerves oldószerben duzzasztjuk. 2. Oszloptöltés Az oszloptöltés a gélkromatográfia igen kritikus lépése. A rosszul töltött oszlop turbulens áramlást, zónaszélesedést és rossz elválást okoz. A várható átfolyási sebességet is befolyásolja. Rendszerint 75 %-os gélszuszpenziót alkalmazunk, melyet a felöntés elõtt vákuumban légtelenítettünk.az oszlopba öntést célszerû üvegbot mellett végezni. Az összes gélszuszpenziót egyszerre kell az oszlopba önteni. Az oszlop feltöltése után azonnal indítsuk meg az átfolyást, hogy egyenletes ülepedést érjünk el. Miután a gél leülepedett, az oszlopot összekötjük az eluenst tároló edénnyel és még 2-3 oszloptérfogatnyi eluenst folyatunk át rajta, hogy stabilizáljuk a gélágyat és ekvilibráljuk az eluenssel. A gélkromatográfia alkalmazási teületei 1. Csoportelválasztás és frakcionálás Lényeges különbség van a két különbözõ elválasztási mód között. A csoportelválasztásban a molekulák mérete közötti különbség olyan nagy, ami lehetõvé teszi, hogy úgy válasszuk ki a gélt, amelyre a nagy molekulák K d értéke 0, a kis molekuláké pedig közelítõleg 1. Ilyen elválasztás pl. a makromolekulák sómentesítése, a puffercsere, és a reakciók lezárása makromolekulák és alacsony molekulatömegû reagensek között. A frakcionálás esetén hasonló méretû, következésképpen a K d értékben kevésbé különbözõ molekulák elválasztásáról van szó. Ezért a gél helyes megválasztása, és a kisérleti körülmények igen lényegesek ahhoz, hogy jó elválasztást érjünk el. 16

18 2. Molekulatömeg meghatározása A gélkromatográfia, eltérõen az elektroforetikus módszerektõl, lehetõséget nyújt natív, vagy denaturált fehérjék molekulatömegének vagy méretének meghatározására, különbözõ ph értéknél, ionerõsségnél és hõmérsékleten. A megfelelõ géllel töltött oszlopot ismert molekulatömegû fehérje standarddal kalibráljuk és a kalibrált oszlopot szinte korlátlan ideig használhatjuk mind molekulatömeg meghatározásra, mind rutin elválasztásra. 3. Polimerek molekulatömeg-eloszlásának meghatározása A molekulatömeg-eloszlás igen fontos jellemzõje mind a természetes, mind a szintetikus polimereknek. A klasszikus módszerekkel végzett analízis nehéz és fáradságos, minthogy a makromolekulákat kicsapással frakcionálja, és minden frakcióban meghatározza a molekulatömeget és az anyagmennyiséget. A gélkromatográfia jobb lehetõséget biztosít számos polimer eloszlási analízisére. Az eluciós görbét folyamatosan lehet felvenni, vagy meghatározni az egyes fraciókra. Nem szükséges külön meghatározni a polimerek molekulatömegét az egyes frakciókban, ha kalibrált oszlopot használunk, tekintve, hogy az oszlopok kromatográfiás viselkedése nagymértékben reprodukálható. Ezzel a módszerrel számos vízoldható polimer (dextránok, zselatin preparátumok) molekulatömeg-eloszlását határozták meg. Alacsony molekulatömeg-tartományban a Sephadex LH-20 vagy LH-60 felhasználásával, szerves oldószerekben oldódó polimerek eloszlási analízise is elvégezhetõ. VÉKONYRÉTEG-KROMATOGRÁFIA (VRK) A vékonyréteg-kromatográfia (VRK) széles körben elterjedt, elsõsorban analitikai célú elválasztástechnikai módszer. Gyors és egyszerû, ezért széles körben alkalmazzák szerves anyagok kimutatására, tisztaságvizsgálatára és mennyiségi meghatározására. Erre alkalmassá teszi szelektivitása, érzékenysége, valamint az, hogy kis mintamennyiségeket igényel, ugyanakkor különbözõ futtatórendszereket, rétegeket és elõhívókat alkalmazva szinte minden területen használható. A vékonyréteg-kromatográfia a réteg anyagától függõen lehet: -adszorpciós vékonyréteg-kromatográfia -megoszlási vékonyréteg-kromatográfia -ioncserélõ vékonyréteg-kromatográfia -gélkromatográfia Bár a rétegek házilag, manuálisan is elõállíthatók, ma már a kész rétegek használata terjedt el, lévén ezek egyenletesebbek a házilag készítettnél és minden elképzelhetõ szorbenssel kaphatóak analitikai és preparatív méretben egyaránt. Az eluensek kiválasztásának megkönnyítésére szolgálnak az úgynevezett eluotróp sorok, melyekben az adott rétegen növekvõ eluálóképességük szerint sorba rendezett oldószereket és oldószer rendszereket adnak meg. 17

19 Gyakorlati tudnivalók a vékonyréteg-kromatográfia alkalmazásához: 1. Minta felvitel: Az oldatban levõ vizsgálati anyagot kapillárissal vagy mikrofecskendõvel a lemez aljától kb. 1,5-2 cm távolságban, egymástól legalább 1 cm-re, minnél kisebb foltban cseppentjük fel. Nagyobb mintamennyiségek illetve kevésbé illékony oldószer esetén hajszárítóval, hideg, vagy ha az anyag nem hõérzékeny, meleg levegõárammal száríthatjuk. 2. Kifejlesztés vagy elució: A felcseppentett lemezt az elõzetesen kiválasztott eluenst tartalmazó futtatókádba ( jól zárható üvegedénybe) helyezzük. Az oldószerréteg ne érje el a felcseppentett foltokat. Az oldószer a kapilláris hatás következtében vándorol a rétegen. Általában a réteg felsõ szélétõl 1-2 cm távolságig futtatjuk az eluenst. A jobb elválasztás érdekében akalmazhatunk túlfuttatást, többszöri eluciót illetve két vagy több dimenziós futtatást is. A vékonyréteg-kromatográfia viszonylag új ága a nagynyomású vékonyrétegkromatográfia, amit angol nevének rövidítése alapján OPTLC-nek ( Overpressure Thin Layer Chromathography) is hívnak.az OPTLC alkalmazásakor a hagyományos vékonyrétegen az eluenst egy pumpa segítségével nagy nyomással áramoltatják. Ily módon jelentõsen lerövidíthetõ a futtatás ideje. Az OPTLC mintegy átmenetet képez a vékonyréteg- és a nagynyomású folyadékkromatográfia között. 3. Elõhívás: Az értékeléshez a foltokat láthatóvá kell tenni. Színes anyagok esetén erre nincs szükség, de az anyagok nagy része nem színes. Ezek az anyagok UV fényben vizsgálva, vagy megfelelõ reagenssel bepermetezve "elõhívhatók", láthatóvá tehetõk. A különbözõ vegyületcsoportokra számos elõhívószer ismert, mint például a szerves vegyületek esetén általánosan használt cc. kénsav és jódgõz, illetve a különbözõ funkciós csoportok színreakcióit felhasználó speciális elõhívók. Ezek számos irodalomban megtalálhatók. 4.Értékelés: A kapott kromatogramok minõségi értékelése az úgynevezett retenciós faktor ( R f ) alapján történik. DM R f = DF ahol: DM= a minta foltjának távolsága a felcseppentés helyétõl DF= az oldószerfront távolsága a felcseppentés helyétõl A mennyiségi értékelésre a következõ módszerek használhatók: - vizuális értékelés a folt átmérõje alapján - elució a lemezrõl és az oldat elemzése - bioautográfia: biológiailag aktiv anyagok esetén - radioautográfia: radioaktív anyagokra -denzitometria: fényvisszaverõdésen alapuló fotometriás mérési módszer, mellyel a rétegen levõ szines, vagy UV aktiv anyagok mérhetõk. 18

20 GÁZKROMATOGRÁFIA (GC) A gázkromatográfia elsõsorban analitikai célú elválasztástechnikai módszer. Az elválasztás elvi alapja a minta komponenseinek két fázis közötti különbözõ megoszlása. A mozgó fázis (az eluens) mindig gáz, amely az állófázisról mossa le (eluálja) a minta komponenseit. Az állófázis lehet szilárd (ebben az esetben gáz-szilárd kromatográfiáról beszélünk) vagy folyadék. Ez utóbbi a gyakoribb, ekkor gáz-folyadék kromatográfiáról beszélünk, ebben az esetben a folyadékban oldódik az elemzett anyag. A gáz-folyadék kromatográfiában a komponenseket a vivõgáz hajtja végig az álló fázison. Az álló fázis egy nem illékony folyadék, melyet egyenletes szemcseméret-eloszlású hordozóra, vagy kapilláris csõ falára vékony film formájában visznek fel.az állófázis a minta komponenseit különbözõképpen tartja vissza a megoszlási hányadosuknak megfelelõen. A komponensek a vivõgázzal együtt hagyják el a kolonnát. Ezt követõen valamilyen módon detektáljuk a vivõgáz anyagtartalmát és ezt az idõ függvényében ábrázoljuk. A kromatográfiás elemzés eredménye a kromatogram, melyet a detektorjel idõbeni változásának regisztrálásával kapunk. A kromatogramon az egyes komponenseknek egy-egy csúcs felel meg, vagyis az anyagkeverék legalább annyi komponensbõl áll, mint ahány csúcsot kapunk az elemzés során. A csúcsok maximumának megjelenési ideje a retenciós idõ, amely az adott elemzési körülmények között az anyagi minõségre jellemzõ. A csúcs alatti terület az anyagmennyiséggel arányos, mennyiségi elemzésre használható. A gázkromatográfia igen érzékeny módszer. Szennyezõ komponensek meghatározásánál például ppm ( 10-6) koncentrációjú komponens nehézség nélkül elemezhetõ. A gázkromatográf felépítése: 1. Vivõgáz: A vivõgáz kémiailag semleges, nagy tisztaságú gáz, mely az adott rendszerben az adott detektorral használható. A vivõgáz nem léphet reakcióba sem az elemzendõ anyaggal, sem az állófázissal, és nem tartalmazhat olyan szennyezõket sem, amelyek ezekkel reakcióba léphetnek. (pl. víz, oxigén) Bizonyos esetekben egyes vivõgázokat a detektor mûködési elve kizár. A vivõgázt nagynyomású acél palackokban tárolják, myomáscsökkentõn keresztül egyenletes sebességgel áramoltatják át a rendszeren. Leggyakoribb vivõgázok: N2, He, Ar, H2, Ar-CH4 elegy. 2. Injektor: Az injektor az elemzendõ minta bevitelének helye. Feladata a minta teljes elpárologtatása. A minta bevitele rendszerint oldat formájában történik mikrofecskendõ segítségével egy szilikongumi membránon (a szeptumon) keresztül. Az injektor a készülék többi részétõl függetlenül temperálható arra a hõmérsékletre, ami a minta elpárologtatásához szükséges. 3. Kemence: A kemence tartalmazza a kolonnát. Feladata a kolonna temperálása, az elválasztáshoz szükséges hõmérséklet nagypontosságú tartása. A kemence hõmérséklete a mérés során tetszõleges sebességgel változtatható, ezt nevezzük hõmérséklet programozásnak. 4. Kolonna: A kolonna a gázkromatográf legfontosabb része, ezen történik a komponensek elválasztása. Rendszerint acélból vagy üvegbõl készült hosszú csõ, melybe a hordozóra felvitt állófázis van betöltve. A hordozó egy kémiailag semleges, egyenletes szemcseméretû, nagy felületû anyag (pl. szilikát szemcsék,szintetikus gyöngypolimer). A nedvesítõ, vagy állófázis vékony film formájában van a hordozón. Fontos, hogy az elemzés hõmérsékletén a nedvesítõ gõznyomása elhanyagolhatóan kicsi legyen, ellenkezõ esetben az állófázis lassan elpárolog a hordozóról, a kolonna tönkremegy. A gázkromatográfiában több 19