A TRPC6 ioncsatorna potenciális szerepe a szerzett proteinuriák kialakulásában

Átírás

1 A TRPC6 ioncsatorna potenciális szerepe a szerzett proteinuriák kialakulásában Dr. Szabó Tamás Ph.D DE OEC Gyermekgyógyászati Intézet DE OEC Élettan Intézet

2 Filtrációs Barrier GBM + Podocyta Signaling Network Citoszkeletális hálózat Podocin, nephrin, α-actinin, CD2AP Ioncsatornák NSCC, Cl -, TRPs Metabotróp receptorok AT-R 1,2, PG-R, ET 1 -R, LTC 4 -R, LTB 4 -R, BK-R 2, P 2Y2, H 1 R, Adrenerg Rs, Thrombin-R, DRs, Chemokin-Rs Intracelluláris jelátvitel [Ca 2+ ] i, kináz rendszerek

3 Congenitalis NS Struktúrális gén mutáció Finn-típusú nephropathia (AR) NPHS1 19q13

4 Podocyta eredetű öröklődő vesebetegségek Korai megjelenés Mutáció Szindróma WT-1 Wilms tumor, FSGS (AR) Laminin β2 Pierson??? Nephrin Finn-típusú NS Podocin Steroid-res. NS (AR) Késői megjelenés Mutáció Szindróma α-actinin Familiaris FSGS (AD) IV-es típusú collagen Alport??? WT-1 Frasier???, Steroid-res. NS

5 Valami új Nem-citoszkeletális mutáció!!! Korai megjelenés Mutáció Szindróma WT-1 Wilms tumor, FSGS (AR) Laminin β2 Pierson??? Nephrin Finn-típusú NS Podocin Steroid-res. NS (AR) TRPC6 Steroid-res. NS (c. heterozyg) Késői megjelenés Mutáció α-actinin IV-es típusú collagen WT-1 TRPC6 Szindróma Familiaris FSGS (AD) Alport sy. Frasier sy., Steroid-res. NS Familiaris FSGS (AD)

6 A TRPC6-ról röviden TRPC család 7 tagú, TRPC3, 6, 7 alcsaládban 75 %-os szekvencia-homológia látható 6 TM helikális domén, tetramer, nem-szelektív kationcsatorna N-és C terminál intracelluláris lokalizáció TRPC6 nagy Ca-permeabilitású TRPC6 aktiváció: GPCR/PLC útvonal és/vagy DAG-on keresztül, intracelluláris Ca-raktárak depléció TRP-csatornák szignál komplexekben működnek számos más fehérjével kapcsoltan ( signaloplex )

7 A TRPC6 gain-of-function mutációja familiaris FSGS kialakulásához vezet Chr. 11q, Pro-to-Gln (P112Q) Winn, Science, 25

8 A TRPC6 kolokalizációja a slit-diaphragma fehérjéivel Reiser, Nat Genet, 25

9 A TRPC6 in vivo overexpresszója a podocytákban proteinúriát okoz (egér) Möller, JASN, 27

10 A TRPC6 expresszója fokozódik a podocytákban NS model (patkány) I. Puromycin aminonucleoside (PAN) által kiváltott nephritis Möller, JASN, 27

11 A TRPC6 expresszója fokozódik a podocytákban NS model (patkány) II. Puromycin aminonucleoside (PAN) által kiváltott nephritis Möller, JASN, 27

12 A TRPC6 overexpresszója észlelhető humán vesebetegségekben Betegségek: Minimal Change NS Membranosus GN Passive Heymann GN Möller, JASN, 27

13 Hypothesis A TRPC6 szerepet játszik szerzett proteinúriával járó vesebetegségek kialakulásában Módszer: vesebetegségek pathomechanizmusának modellezése in vitro sejtrendszerekben (podocyta és humán TRPC6 expresszáló heterológ sejtvonalak). Célkitűzés: A receptor intracelluláris szabályozásában (funkció, expresszió) fontos szignál útvonalak feltérképezése.

14 TRPC6 és egyéb podocyta markerek expressziója egér podocyta sejttenyészetben Immuncitokémia Western blot NC NK NC NK TRPC6 TRPC6 TRPC6 16 kda 4x 2x 33 C nem-differenciáltatott 6x 37 C differenciáltatott 33 C 37 C Immuncitokémia Western blot 33 C Differenciáltatott 37 C 33 C Differenciáltatott 37 C TRPC podocin α-actinin synaptopodin

15 TRPC6 és egyéb podocyta markerek expressziója (podocin, α-actinin 4, synaptopodin) humán podocyták Immuncitokémia Western blot NK NK TRPC6 TRPC6 TRPC6 TRPC6 16 kda 6x 6x 4x 33 C 37 C 33 C nem-differenciáltatott 37 C differenciáltatott Immuncitokémia Western blot 33 C Differenciáltatott 37 C 33 C Differenciáltatott 37 C TRPC podocin α-actinin synaptopodin

16 Elméleti háttér: festék: Fluo-4 AM (hozzákapcsolt acetoximetilészter: AM) Fluo 4 AM a sejtben az AM-t nem-specifikus észterázok leemésztik a festékmolekuláról Fluo-4 szabaddá válik Ca 2+ -t köt megváltozik a fluoreszcencia intenzitása kijutását megelőzendő ABC transzporter gátlószer: 2,5 mm probenecid Ca Ca Fluo 4 AM észterázok Fluo 4 Ca AM Ca Probenecid

17 TRPC6 agonista hatása az intracelluláris Ca 2+ koncentrációra - Ca 2+ -imaging, Fluo4-AM, FLIPR - Relatív fluoreszcencia (az alapvonalra normálva) OAG Kontroll 75 µm 1 µm 15 µm Idő (sec) A Ca 2+ tranziensek amplitúdója (RFU, maximális válasz=1%) OAG koncentráció (μm) A TRPC6 ismert agonistája az OAG (1-oleoil-2-acetil-sn-glicerol) dózisfüggő módon növeli a podocyták [Ca 2+ ] IC -ját. Három független kísérlet eredményének átlaga.

18 A TRPC6 csatorna funkcionálisan aktív egér és humán podocytákban Egér podocyta Ca 2+ -imaging (Fluo 4-AM) Humán podocyta Fluoreszcencia intenzitás Fluoreszcencia intenzitás Idő (sec) Idő (sec) kontroll 2 µm OAG 2 µm OAG alacsony [Ca 2+ ] EC kontroll 4 µm DOG 4 µm DOG alacsony [Ca 2+ ] EC Fluoreszcencia intenzitás Fluoreszcencia intenzitás Idő (sec) Idő (sec) kontroll 5 µm OAG 5 µm OAG alacsony [Ca 2+ ] EC kontroll 75 µm DOG 75 µm DOG alacsony [Ca 2+ ] EC

19 A TRPC6 aktivációját módosító ágensek -Ca 2+ -imaging Fluo4-AM, FLIPR µm OAG 25 2 µm OAG 25 2 µm OAG Relatív fluoreszcencia nm inzulin Kontroll Idő(sec) 2 µm OAG Relatív fluoreszcencia Idő(sec) 2 µm OAG Kontroll 1 nm PMA Relatív fluoreszcencia ng/ml PGE 2 Kontroll Idő(sec) 2 µm OAG Relatív fluoreszcencia µm bradikinin Kontroll Idő(sec) Relatív fluoreszcencia µm thapsigargin Idő(sec) Kontroll Relatív fluoreszcencia Kontroll 18 µm ATP Idő(sec) A podocytákat 3 percig kezeltük az egyes anyagok feltüntetett koncentrációjával, majd vizsgáltuk a TRPC6 aktiváció hatására kialakuló tranziens [Ca 2+ ] IC változásokat. Egyes anyagok jellegzetes változásokat okoznak a TRPC6-hoz kapcsolódó Ca 2+ szignalizációban. PMA forbol-12-mirisztát-13-acetát AA arachidonsav BK bradikinin HIS hisztamin INS inzulin TG - thapsigargin

20 Különböző koncentrációjú OAG kezelés (24h, 48h, 72h) nem okoz apoptózist, sem nekrózist egér podocytákban Fluoreszcencia intenzitás Fluoreszcencia intenzitás h - OAG ctrl LYSIS CCCP 1 µm 5 µm 75 µm 1 µm 15 µm 3 µm 48 h - OAG ctrl LYSIS CCCP 1 µm 5 µm 75 µm 1 µm 15 µm 3 µm Fluoreszcencia intenzitás DilC1(5) - apoptózis Sytox - nekrózis Lysis: nekrózis pozitív kontrollja CCCP: apoptózis pozitív kontrollja 72 h - OAG ctrl LYSIS CCCP 1 µm 5 µm 75 µm 1 µm 15 µm 3 µm

21 Különböző anyagok hatása a TRPC6 csatorna aktivációjára Metabotróp receptor agonisták: arachidonsav, ATP, PGE 2, bradikinin Tirozin receptor agonista: inzulin Intracelluláros kinázok modulátora: forbol észter (PMA) Arachidonsav ATP PGE 2 Bradikinin Inzulin PMA Egér podocyta OAG indukálta- [Ca 2+ ] IC emelkedése Humán podocyta OAG indukálta- [Ca 2+ ] IC emelkedése

22 A PMA-val történő 3 perces előkezelés lecsökkentette (megszüntette) az OAG által kiváltott [Ca 2+ ] IC emelkedést Fluoreszcencia intenzitás Egér podocyta 2 µm OAG 2 µm OAG - előkezelve Előkezelés: 3 perc 1µM PMA 2 µm OAG Idő (sec) Fluoreszcencia intenzitás Humán podocyta Előkezelés: 3 perc 1µM PMA 75 µm OAG 75 µm OAG 75 µm OAG - előkezelve Idő (sec) Relatív fluoreszcencia intenzitás OAG * 1µM PMA - OAG Relatív fluoreszcencia intenzitás OAG * 1µM PMA - OAG * p <,5

23 A PKC rendszer szerin/treonin kinázok 12 különböző PKC izoenzim aktivációs mechanizmusaik alapján: 1. klasszikus (cpkc): α, β 1, β 2, γ DAG és Ca kalcium-independens (npkc): δ, ε, η, θ csak DAG 3. atípusos izoenzimek (apkc): PKC ζ és λ/ι sem DAG, sem Ca PKC µ gátlószerek: 1. Gö6976 cpkc, 2. GF1923X cpkc és npkc, 3. Rottlerin PKC delta Klasszikus (α, β I, β II, γ) Novel (δ, ε, η, θ) Atípusos (λ/ι, ζ) PKCµ Regulatórikus domén Katalitikus domén V1 V2 V3 V4 V5 N C1a C1b C2 C3 C4 C pszeudoszubsztrát Ca 2+ régió TM ATP szubsztrát-kötő hely

24 Az általunk vizsgált PKC izoformák (alpha, beta 1, delta, gamma, epszilon, zeta, eta, teta) a β 1 kivételével mrns szinten expresszálódnak humán podocytákban 3,5x1-2 Q-PCR Relatív expresszió (GAPDH=1) 3,x1-2 2,5x1-2 2,x1-2 1,5x1-2 1,x1-2 5,x1-3, Alpha 6% Alpha PC2 Alpha diff Gamma 6% Gamma PC2 Gamma diff Delta 6% Delta PC2 Delta diff Epszilon 6% Epszilon PC2 Epszilon diff Zeta 6% Zeta PC2 Zeta diff Eta 6% Eta PC2 Eta diff Teta 6% Teta PC2 Teta diff

25 PMA-val történő előkezelés kivédi az OAG által kiváltott [Ca 2+ ] IC emelkedést Egér podocyta CTRL 1 µm PMA - előkezelve 1 µm Gö előkezelve 1 µm GF1923X- előkezelve 1 µm Rottlerin - előkezelve Humán podocyta Fluoreszcencia intenzitás 2 µm OAG Idő (sec) Fluoreszcencia intenzitás µm OAG Idő (sec)

26 Az immortalizált egér és humán podocyták funkcionálisan aktív TRPC6 csatornával rendelkeznek A TRPC6 csatorna aktivátor OAG nem befolyásolja a sejtek életképességét egér podocytákban Humán podocyták esetében pedig az arachidonsav, az ATP és a bradikinin csökkenti a jel nagyságát Az inzulin humán podocytákban csökkenti az aktivitás mértékét A PKC aktivátor PMA konzekvensen csökkentette a csatorna aktivációra kialakuló [Ca 2+ ] IC emelkedést mindkét sejttípusban A PKC izoformák közül legnagyobb mennyiségben az α, a δ és a ζ van jelen humán podocytákban A PKC rendszer gátlásával nagyobb mértékű lett az OAG-gal kiváltott [Ca 2+ ] IC emelkedés, ezért feltételezhető, hogy a PKC rendszer a csatorna tónusos gátlását tartja fenn

27 PKC rendszer-trpc6 akt/expr.- szerzett proteinuriák HG/PMA a TRPC6 expressziót csökkenti, következményesen az ANG II mediált hatások csökkentek Graham S et al. Am J Physiol Cell Phys. 211 Hyperglycemia diabetesben csökkenti a TRPC6 expressziót MC sejtekben és következményesen csökkent ANG II mediált hatások észlelhetők. cpkc-inhibitorok a HG okozta TRPC6 expr. változásokat csökkentették A TRPC6 mediált változások kizárólag a vesében (MC, podocyta) észlelhetők TRPC6-ANG II cross-talk? PKC aktiváció protektív TRPC6 down-regulációt eredményezhet? ANG II módosítja a TRPC6 expresszióját mrns és fehérje szinten podocytákban Nijenhuis T et al. Am J Pathol. 211 ANG II infúzió fokozza a glomeruláris TRPC6 expressziót Állatkísérletekben a glomeruláris TRPC6 expr. ANG II dependens módon nőtt Az ANG II fenti hatása függ mind a TRPC6-dependens Ca influxtól és a calcineurin aktivációtól (NFAT szignál útvonal) A calcineurin gátlása (CsA) csökkenti a TRPC6 expressziót és proteinuriát

28 A TRPC6-kapcsolt szignalizáció szerepe a tenyésztett podocyták biológiai folyamatainak szabályozásában Magas glükóz cc. RAS aktivációt indukál podocytákban, részben direkt renin aktiváción, másrészt non-ace útvonalon növelve az ANG II szintjét. Magas glükóz növeli az AT1R és a prorenin receptor expresszióját is. LN, MPGN, MNP, (PKCα,β upreg.) ANG II + HG TRPC6 expr. Calcineurin dependens (CNI gátolja) downregulatio TRPC6? Winn et al

29 1. Metabotróp receptor: (arachidonsav, ATP, PGE 2, bradikinin) 2. Tirozin kináz receptor (inzulin) TRPC6 és cpkc expresszió vizsgálata 3. Forbol észter (PMA) 4. Angiotenzin (ANG II mediált modulációja a TRPC6 ioncsatornának) 5. mtor inhibitorok (rapamycin) 6. Calcineurin inhibitorok (cyclosporin, tacrolimus) 7. Komplement rendszer Humán vesebiopsziás minták vizsgálata (cpkc, TRPC6 expr.)

30 Köszönöm a figyelmet! Köszönetnyilvánítás Dr.Bíró Tamás Dr.Cziffra Gabriella Ambrus Lídia Zákány Nóra OTKA 7665