VI. TENYÉSZTÉSES VIZSGÁLATI MÓDSZEREK

Átírás

1 VI. TENYÉSZTÉSES VIZSGÁLATI MÓDSZEREK A tenyésztéses módszerek egyrészt lehetıséget teremtenek mikroorganizmusok különbözı célra történı fenntartására és elszaporítására, másrészt ezen eljárások segítségével megoldható egyes mikrobacsoportok vagy fajok jelenlétének kimutatása. Ugyancsak ezen módszerek képezik az élısejtszám-meghatározás alapját. A mikroorganizmusok szaporodásának feltétele a megfelelı tápanyagellátás és környezeti tényezık (hımérséklet, ph, redoxpotenciál, vízaktivitás) biztosítása. Laboratóriumi körülmények között ezt a célt szolgálják a különbözı összetételő tápközegek, amelyekkel a vizsgált mikrobák tápanyag-, ph-, vízaktivitás- és redoxpotenciál-igénye kielégíthetı. A szükséges hımérséklet termosztátokkal állítható be. TÁPKÖZEGEK A táptalajoknak fedezniük kell a mikrobák változatos tápanyag- és energiaforrás-igényét, valamint biztosítaniuk a kívánt fizikai-kémiai körülményeket. l. A táptalajok összetétele A táptalajoknak tartalmazniuk kell mindazokat az anyagokat, amelyekre a mikroorganizmusoknak szüksége van, és amelyeket maguk szintetizálni nem képesek. Feltétlenül szükséges táptalajkomponensek: Víz: A víz az élı szervezet alapvetı komponense, szerepet játszik minden élılény anyagcsere-folyamataiban. Emellett a táptalajokban a mikroorganizmusok számára, mint környezeti tényezı is nélkülözhetetlen. A táptalajok készítéséhez általában egyszer desztillált vizet kell használni. Szén- és energiaforrás: a táptalajokban a redukált széntartalmú vegyületek kettıs célt szolgálnak: egyrészt asszimilatív oxidációs folyamataik révén energiát nyernek belıle, másrészt ezekbıl építik fel a mikroorganizmusok saját széntartalmú anyagaikat. Az autotróf mikroorganizmusok képesek a levegı szén-dioxid tartalmát is hasznosítani, a mikrobák döntı többsége azonban a kemoheterotróf csoportba tartozik. A számukra hasznosítható szerves szénforrások igen széles skálája mikrobafajonként eltér, s ez a tulajdonság vizsgálata a mikroorganizmusok azonosításának igen fontos lépése. A leggyakrabban használt szén- és energiaforrások az egyszerő cukrok (glükóz, laktóz stb.), a pepton és a húskivonat. (E két utóbbi egyben nitrogénforrás is.) Nitrogénforrás: az élı anyag bioszintéziséhez szükséges, igénytıl függıen szerves vagy szervetlen nitrogén-vegyületek. A levegı molekuláris nitrogéntartalmát csak néhány baktériumfaj képes hasznosítani (Rhizobium, Azotobacter fajok). A különbözı nitrogénforrások eltérı hasznosíthatósága - hasonlóan a szénforrásokhoz - diagnosztikai célokra kihasználható. A leggyakrabban használt szervetlen nitrogénforrások az ammónium-, nitrit- és nitrátsók, szervesek pedig a húskivonat, természetes fehérjék, peptonok, triptonok és az aminosavak. Ásványi anyagok: fontos szerepet játszanak egyrészt a sejt ozmotikus nyomásának kialakításában a sejthártya aktív transzportfolyamatai révén, valamint kofaktorként az enzimaktivitás szabályozásában. A mikroorganizmusok ásványianyag-igényét gyakran a

2 csapvíz is kielégíti, de a szervetlen foszforvegyületeket - a makroerg foszfátkötések révén a sejt energiaforgalmában betöltött döntı szerepe miatt - megfelelı mennyiségben a táptalajhoz kell adni. Feltételesen szükséges táptalajkomponensek: Vitaminok, biosz anyagok: a különbözı anyagcsere-folyamatokban - igen kis mennyiségben - szükséges anyagok, amelyeket a mikroorganizmus nem képes elıállítani. Ezek az anyagok elsısorban a koenzimként játszanak szerepet az anyagcserében. A baktériumoknak zsírban oldódó vitaminokra és C-vitaminra nincs szükségük. A legtöbbjük a B-vitaminokat is szintetizálni képes, azonban amelyek nem, azoknak ezeket készen kell kapniuk. A laboratóriumi gyakorlatban legáltalánosabban használt komplex vitaminforrás az élesztıkivonat.. Szervetlen és szerves hidrogén-donorok és -akceptorok: baktériumok légzési láncában képzıdı hidrogén-ionokat felvevı terminális anyagok. Csak akkor szükséges a táptalajhoz adni, ha a táptalajban lévı többi komponens egyike sem képes ezt a funkciót ellátni. 2. A táptalajok csoportosítása 2.1. A táptalajok csoportosítása összetétel szerint Összetétel szerint megkülönböztetünk természetes, félszintetikus és szintetikus táptalajokat. A természetes táptalajok természetes anyagok felhasználásával készülnek, ezért összetételük pontosan nem definiálható. Ebbe a csoportba tartozik a húsleves, a melasz vagy a maláta. Félszintetikus tápközegek összetevıinek egy része olyan természetes anyag, amelynek összetétele nem teljesen ismert, vagy alkotóinak aránya változó. Ebbe a csoportba tartozik minden olyan táptalaj, amely agart tartalmaz. A szintetikus táptalajok minden összetevıjét kvantitatíve és kvalitatíve is ismerjük. Hátrányuk, hogy igen drágák. 2.2 A táptalajok csoportosítása halmazállapot szerint Halmazállapot szerint beszélhetünk folyékony, félfolyékony és szilárd táptalajokról. A folyékony táptalajokra jellemzı, hogy a különbözı tápanyagokat szuszpenzióban, valódi vagy kolloid oldat formájában tartalmazzák. A folyékony halmazállapotú tápközegek közül a természetes vagy félszintetikus táptalajokat leveseknek nevezzük, a szintetikus táptalajokat pedig tápoldatnak. A szilárd táptalajok a folyékony táptalajokból származtathatók szilárdító anyagok (agar-agar, zselatin, szilikagél) hozzáadásával. Régebben a zselatin volt a legelterjedtebb szilárdító anyag, ma egyre inkább háttérbe szorul, ami egyrészt igen alacsony olvadáspontjával (35 C) magyarázható, másrészt azzal a ténnyel, hogy a zselatint számos baktériumfaj elfolyósítja zselatináz enzime révén. Éppen ezért ma már inkább csak diagnosztikai céllal használjuk. Az agar kétkomponenső gélképzı poliszacharid-keverék, amelyet egyes tengeri vörösalgákból vontak ki. Az agar nagy elınye, hogy C-on megdermed, olvadáspontja azonban 98 C. Mivel az agar természetes anyag, összetétele nem definiálható pontosan, csak természetes és félszintetikus táptalajokhoz használható. A szintetikus táptalajokban szilárdítóanyagként zömmel szilikagél szerepel. A szilárd táptalaj megjelenési formája szerint lehet kémcsıben elkészítve magas- vagy ferdeagar, Petri-csészébe leöntve pedig agarlemez. A félfolyékony

3 táptalajok is tartalmaznak szilárdítóanyagot, de lényegesen kevesebbet, mint a szilárd táptalajok A táptalajok csoportosítása a felhasználás célja szerint Alaptáptalajok: Az alaptáptalajok olyan médiumok, amelyek összetételüknél fogva általánosan (de nem univerzálisan) használhatók, a szaporodáshoz szükséges tápanyagokon kívül más speciális anyagot nem tartalmaznak. Elektív táptalajok: olyan táptalajok, amelyekben összetételüknél fogva csak bizonyos mikrobacsoportok minimális tápanyagigényét elégik ki, így azok a környezetükben élı kísérı mikroflórából kiemelhetık. Szelektív táptalajok: A szelektív táptalajok olyan kiegészítı komponenst tartalmaznak, amelyek egyes mikrobacsoportok szaporodását gátolják (pl. antibiotikumok, festékek, szulfonamidok stb.). Természetesen ezek a táptalajok gyakran tartalmaznak olyan alkotókat is, amelyek a keresett, mikrobacsoport szaporodását segítik. A szelektív táptalajok közé tartoznak a módosított ph-jú (erısen savas vagy lúgos) médiumok is. Differenciáló vagy indikátor táptalajok: a mikroorganizmusok differenciálására, azonosítására szolgáló táptalajok, amelyek kémiai indikátort, vagy egyéb jelzırendszert (pl. Durham-féle fermentációs csı) tartalmaznak, amely spciális reakciókat (pl. savtermelést) jelez. Jellemzıjük, hogy egyes komponenseik szabad szemmel is látható reakciót adnak a mikroorganizmusok bizonyos anyagcseretermékeivel vagy enzimeivel. Speciális táptalajok: különbözı vizsgálati céllal összeállított, különleges vizsgálatokat szolgáló tápközegek. 3. A táptalajok és hígítófolyadékok készítése és tárolása Táptalajok és hígítófolyadékok készítéséhez csak kifogástalan minıségő és tisztaságú, bakteriológiai célokra alkalmas alapanyagok használhatók fel. A hıkezelés nélkül felhasználásra kerülı alapanyagokat aszeptikusan kell kezelni. Az alapanyagokat tisztán tartott, száraz, rovaroktól és rágcsálóktól mentes helyiségben kell raktározni. A higroszkópos anyagokat légmentesen zárható edényben kell tárolni. A beméréseket tiszta eszközökkel, analitikai körülmények között kell elvégezni. A táptalajokat és hígítófolyadékokat csak tiszta, hıálló üvegedényben, rozsdamentes acélból készült vagy hibátlan tőzzománcos edényben szabad elkészíteni. A készítés során az alábbi mőveleti sorrendet kell betartani: az alapanyagok elıkészítése, - az alapanyagok bemérése, az alapanyagok oldása a receptekben megadott sorrend szerint, állandó keverés közben, ph-ellenırzés, szükség szerint beállítás - kiegészítés végsı térfogatra, agar táptalajoknál a szilárdsági próba elvégzése, - kiszerelés, sterilezés. A táptalaj ill. hígítófolyadék ph-mérése hımérsékletkompenzációs ph-mérıvel történjen, a ph-beállítását 1 n NaOH-, ill. HCI-oldattal kell végezni.

4 A táptalajok és hígítófolyadékok többségét telített, túlnyomásos gızzel, C-on autoklávban kell sterilezni 15 percig. A behatási idıt attól az idıponttól kell számítani, amikor a munkatér hımérséklete az adott nyomásnak megfelelı értéket elérte. Csavaros kupakkal záródó palackok sterilezése elıtt a zárókupakot meg kell lazítani, majd az autoklávból történı kiszedés után szorosra meg kell húzni. A rakomány felmelegítése minél gyorsabb legyen, a sterilezés után a túlnyomás megszüntetését viszont lassan kell végezni. Az autokláv ajtaját csak akkor szabad kinyitni, ha a táptalajok hımérséklete már Cra lehőlt. Bizonyos táptalajokat frakcionált sterilezésnek kell alávetni, tehát három egymás után következı napon C-os hımérsékleten 1-2 óra hosszat hıkezelni. A hıkezelés közötti idı alatt a táptalajokat a spórák germinációjának elısegítése céljából szobahımérsékleten kell tartani. Olyan táptalajokat vagy táptalaj-alapanyagokat, amelyeket még C-on sem lehet hıkezelni, szőréssel (0,2-0,45 µm pórusnagyságú membránszőrı) kell sterilezni. A nagyobb mennyiségben elkészült táptalajokat általában literes térfogatú, papírvattadugóval lezárt üvegekben kell tárolni. Az üvegben tárolt táptalajokat áramló gızben kell felolvasztani, és a még szükséges összetevık hozzáadása után további hevítés nélkül mielıbb szétmérni. Csak annyi alaptáptalajt szabad felolvasztani, amennyire szükség van; az ismételt felolvasztás a táptalajt károsíthatja! Az agar táptalajok hımérséklete a lemezekbe történı kiöntés alatt a kondenzvíz képzıdés csökkentése érdekében 60 C-nál nagyobb ne legyen. Az agar táptalajokból a szokványos Petri-csésze aljába kb. 20 ml-t kell önteni. A táptalajokat általában hőtıszekrényekben, 4-8 C-on kell tárolni. A Petri-csészébe fejtett szilárd táptalajokat fordított helyzetben, kell a hőtıszekrénybe helyezni. Kiszáradt, elszínezıdött, vagy baktériumos szennyezıdés jeleit mutató táptalajokat nem szabad felhasználni. A táptalaj készítésének napját a győjtıkosáron, ill. az egyedi táptalajedényen fel kell tüntetni. A hőtıszekrényben tárolt táptalajokat beoltás elıtt szobahımérsékletre kell felmelegíteni. OLTÁSI ÉS TENYÉSZTÉSI MÓDSZEREK Az oltás a mikroorganizmusok tenyésztését megelızı, alapvetıen fontos mikrobiológiai mővelet. Lényege: steril oltóeszköz segítségével steril tápkötegbe juttatjuk azokat a mikróbákat, amelyeket szaporítani kívánunk. Az oltáshoz felhasznált mikróba sejttömeget inokulumnak nevezzük. Tenyésztés alatt értjük a baktériumok és gombák meghatározott táptalajokon történı mesterséges szaporítását. A mikroba-tenyésztés célja lehet egy már meglévı tenyészet fenntartása, tiszta tenyészet készítése, a szükséges mikroorganizmusok tömeges elszaporítása, illetve egy vizsgálati minta élısejt-számának meghatározása. Ügyelnünk kell arra, hogy oltás és tenyésztés közben tenyészeteink ne fertızıdjenek be idegen mikroorganizmusokkal, ezért mindig be kell tartanunk az aszeptikus (fertızésmentes) munka követelményeit. Néhány gyakorlati tanács az oltási munkák helyes kivitelezéséhez: Ha lehetıségünk van rá, csírátlanítsuk ultraibolya sugárzású lámpákkal annak a helyiségnek a levegıjét, amelyben dolgozni fogunk. Munkaasztalunk felületét mossuk le fertıtlenítıszerrel.

5 Soha ne végezzünk oltási munkát nyitott ablak mellett, vagy huzatos helyiségben. Mindig gázláng mellett dolgozzunk. Tenyészetbıl inokulumot venni, oltást végezni csak steril oltoeszközzel szabad. Forró oltóeszközzel ne vegyünk inokulumot, mert a mikróbák elpusztulnak, s oltásra nem használhatók. Várjuk meg az oltóeszköz lehőlését, vagy hőtsük le azt oltás elıtt steril tápfolyadékba mártással, illetve steril tápközegbe való behúzással. Ha nagyobb mennyiségben, pipetta tartóban sterilezett pipettákat használunk, mindig gázláng közelében nyissuk és zárjuk a doboz fedelét egy-egy pipetta kivételekor. A kivett pipettát célszerő használat elıtt egyszer gázlángon áthúzni. Ha mikróba tenyészetet, vagy steril tápközeget tartalmazó üvegedényt inokulum kivételkor, oltáskor kinyitunk, majd lezárunk, az üvegedény száját lelángolással kell sterilizálnunk rögtön kinyitás után és bezárás elıtt is! A gázlángban történı lelángolás (flammálás) egyrészt csírátlanítja az üvegedény száját, másrészt melegítés hatására a kémcsıben lévı levegı kifele áramlik, így a külsı légtérbıl nem történhet levegıbeszívás. Ezzel kizárható az egyik legjelentısebb külsı fertızési forrás. Steril tápközeget vagy tenyészetet tartalmazó üvegedény kinyitásakor a vattadugót vagy kémcsı kupakot jobb kezünk kis és győrős ujjával a tenyerünkhöz szorítva vegyük ki, s tartsuk ott a kémcsı zárásáig. Vigyázzunk, hogy a dugó kémcsıbe kerülı részét ne fogjuk meg és ne érintsük semmihez. Petri-csészében való tenyésztéshez mindig szilárd tápközeget használunk. A légmentesen záró, steril Petri-csészét gázláng mellett és a tetı oldalra billentésével csak résnyire nyissuk fel, hogy a levegıbıl történı mikróba fertızést elkerüljük. A különbözı oltóeszközökkel végezhetı oltási típusok: Folyadék tenyészetbıl Szilárd tenyészetbıl oltókaccsal táptalaj felületére táplevesbe Folyadék tenyészetbıl pipettával felolvasztott, 45 C-ra visszahőtött tápagarba táplevesbe Szilárd tenyészetbıl oltótővel táptalajba szúrással táplevesbe Inokulálásról, beszélünk, ha a vizsgálati anyag egy részével (inokulum) beoltjuk a szaporításra szolgáló táptalajt. Minden olyan esetben, amikor hígítófolyadékból vagy tápközegbıl viszünk mikroorganizmust a szaporítást szolgáló táptalajra (törzsfenntartás, tiszta tenyészet készítése stb.) átoltásról beszélünk. A tenyésztés a mikroorganizmus oxigénigényének megfelelıen aerob vagy anaerob körülmények között történik. Aerob módon tenyészthetı minden olyan mikroorganizmus, amely anyagcseréjéhez oxigént igényel, vagy amelyek szaporodását az oxigén nem gátolja jelentıs mértékben (aerotolerans). Anaerob módon kell tenyészteni minden olyan mikrobát, amelynek anyagcseréjét, szaporodását az oxigén gátolja. A mikroorganizmusoknak egy

6 csoportja viszont csak csökkentett oxigénnyomáson, szén-dioxiddal dúsított légtérben képes szaporodni. Ezeket a mikrobákat mikroaerofiléknek nevezzük. l. Aerob tenyésztési eljárások Az aerob tenyésztési eljárásoknál biztosítani kell a szaporításra szolgáló közeg oxigénellátását. Ez a legtöbb esetben nem jelent problémát, mert a Petri-csészékbe öntött és megszilárdult, néhány mm vastag táptalajba a levegıbıl bediffundáló oxigén elegendı a szaporodáshoz. Hasonló módon, fémkupakkal, vagy laza papírvatta-dugóval lezárt kémcsövekben is elegendı az oxigén-ellátás ferde agaros tenyészetek vagy egyszerő levestenyészetek esetében. Nagyobb térfogatú folyadéktenyészeteknél a nyugvó folyadék felületén át történı oxigénátadás már nem elegendı, ezeket a tenyészeteket rázatással vagy steril levegıvel történı buborékoltatással kell "levegıztetni". Ezt a célt szolgálják a laboratóriumi rázógépek, vagy rázóvízfürdık, illetve a fermentorok, amelyek segítségével az intenzív oxigén-bevitel biztosítható. 2. Anaerob tenyésztési eljárások Az obligát anaerob baktériumok -330 mv-nál magasabb redoxpotenciálú környezetben nem szaporodik. Az atmoszférikus levegıvel egyensúlyban lévı vízben a redoxpotenciál +800 mv. Anaerob tenyésztési körülmények eléréséhez tehát csökkenteni kell a redoxpotenciált. A redoxpotenciál csökkenthetı az oxigén kizárásával, vagy redukálóanyagok hozzáadásával. A levegı kiszorításának egyik legegyszerőbb módja a tápközeg fedése paraffindugóval, vagy paraffinolajjal. Ezt az eljárást kémcsıben készített tenyészetek esetén célszerő alkalmazni. Agarlemezek esetében célszerőbb az un. anaerob edények alkalmazása. Az anaerob edények olyan légmentesen zárható edények, amelyekbıl az oxigént kémiai úton (pl. pirogalluszsav és kálium-hidroxid összekeverésével) vonjuk el. Az edénybe az anaerob körülmények meglétének ellenırzése céljából redoxindikátorral átitatott szőrıpapírt, kell helyezni. Nagy mintaszámmal dolgozó laboratóriumok esetében a legcélszerőbb az anaerob termosztát használata. Az anaerob termosztát légmentesítése a levegı kiszivattyúzásával, vagy kémiai úton az oxigén vízzé alakításával hidrogén jelenlétében palládium katalizátor segítségével történik. A táptalajhoz adott redukaló hatású adalékanyagként leggyakrabban merkapto-, vagy szulfhidril csoportot (-SH) tartalmazó anyagot (marhamáj, darált hús, cisztein, nátriumtioglikolát) adunk. TISZTATENYÉSZETEK KÉSZÍTÉSE (szélesztéses eljárás) Az elektív, szelektív és differenciáló táptalajok alkalmazásával csak a mikroorganizmusok egy-egy szőkebb csoportját tudjuk elkülöníteni, de ezek teljes körő azonosításra nem alkalmasak, ezt a célt a különbözı diagnosztikai vizsgálatok (biokémiai, szerológiai stb.) szolgálják. Az azonosíthatóságnak, a mikrobafaj meghatározásának minden esetben elıfeltétele a tiszta tenyészet elıállítása.

7 A tiszta tenyészet készítésé során egyetlen sejt elszaporodásából származó telepbıl kell kiindulni. Az átoltás során a vizsgálandó mikroorganizmusokat tartalmazó tenyészetbıl egysejt eredető mikroorganizmusokat viszünk át friss, steril táptalajra. A tiszta tenyészet készítésének számos formája használatos a kiindulási és a készítendı táptalaj típusának függvényében. A legelterjedtebb forma az elektív, szelektív vagy, differenciáló, folyékony, vagy szilárd táptalajból alaptáptalajra történı átoltás ritkító szélesztéssel. A ritkító szélesztés célja olyan "vonáskultúra" készítése, melynek eredményeként az inkubálást követıen szoliter telepeket is kapunk. A ritkító szélesztés technikáját az alábbi rajz mutatja: Különbözı szélesztéses technikák GYAKORLAT Szükséges anyagok és eszközök: oltókacs, krumpli-agarlemez (PDA: Potato-Dextrose Agar), YGC agarlemez Mikroorganizmusok: Saccharomyces cerevisiae és Penicillium expansum vegyes tenyészete szelektív élesztıkivonat-glükóz-chloramphenicol-agarlemezen (YGC) A gyakorlat menete: A gyakorlat célja Saccharomyces cerevisiae tiszta tenyészet elıállítása PDA-lemezen. A szelektív YGC-lemezen telepmorfológia alapján kell elkülöníteni az élesztı- és a penésztelepeket. A penészgombák által képzett valódi micélium vattaszerő, spórásodás elıtt fehér, utána szürke. Az élesztıgomba pszeudomicéliumai a baktériumtelepekhez hasonló, a penésztelepeknél kisebb, kompakt állományú telepek. Az átoltáshoz ki kell választani egy különálló élesztıgomba telepet, majd a lelángolt és kihőlt oltókaccsal a táptalaj felszínérıl leemeljük, és vonalkultúraként a PDA-lemezre felvisszük, majd a fenti ábra szerint elszélesztjük. A különbözı irányú szélesztések között az oltókacsot mindig le kell lángolni és kihőteni. A lemezeket szobahımérsékleten (24 C) 48 órán át kell inkubálni. Megfigyelések:

8 TÖRZSFENNTARTÁS (ferdeagaron) A mikrobiológiai munka elengedhetetlen feltétele, hogy a laboratóriumban mindenkor fellelhetık legyenek olyan azonosított mikrobatörzsek, amelyek a fajra jellemzı tulajdonságokat mutatják, és ezáltal kontroll-kultúraként alkalmazhatók. Ezeket a törzseket permanensen fenn kell tartani. Ez meghatározott idıközönkénti átoltást követel meg a táptalaj beszáradása, a káros anyagcseretermékek felhalmozódása, az egyes táptalajkomponensek-elfogyása következtében bekövetkezı "öregedés" kiküszöbölése érdekében. A törzseket általában kémcsövekben, folyékony táptalajban, vagy ferde agaron tenyésztik. A törzsfenntartáshoz használt táptalajok az alaptáptalajok közé tartoznak. GYAKORLAT Szükséges anyagok és eszközök: oltókacs, glükóz-élesztıkivonat-pepton (GYP) ferdeagar, vagy TSA (triptose-soya-agar) ferdeagar Mikroorganizmus: Saccharomyces cerevisiae GYP-ferdeagar tenyészete, vagy Bacillus subtilis TSA-ferdeagar tenyészete A gyakorlat menete: A Saccharomyces cerevisiae, (vagy Bacillus subtilis) tenyészetet tartalmazó csı nyakát a dugó körül lelángoljuk, majd belıle lelángolt és kihőtött oltókaccsal egy kacsnyi mennyiséget kiveszünk, és ezt a steril GYP-ferdeagar felszínére hullámos vonalban kikenjük. A kupak visszahelyezése elıtt a kémcsı száját lelángoljuk. A beoltott csövet 48 órán át szobahımérsékleten inkubáljuk, majd a tenyészet ellenırzése után 4-8 C-on tároljuk. A régi tenyészetet addig nem szabad megsterilezni és kidobni, amíg meg nem bizonyosodtunk arról, hogy az átoltás sikerült. Megfigyelések:

9 MOZGÁSVIZSGÁLAT FÉLFOLYÉKONY TÁPTALAJBAN A baktériumok mozgásának vizsgálatára többféle módszer alkalmazható. Ezek közül a függıcsepp-készítmény már az elızı gyakorlatok során bemutatásra került. A mozgásképesség kimutatható félfolyékony magasagarba szúrásos technikával történı oltással is. Az atrich baktériumok ugyanis csak a szúrási csatorna mentén növekednek, míg a csillós baktériumok a szúrási csatornától radiális irányban, rajzanak. 4 cm atrich csillós baktériumok GYAKORLAT Szükséges anyagok és eszközök: oltótő, félfolyékony mozgásképesség agar (FF MOT) Mikroorganizmus: Proteus vulgaris, vagy Proteus mirabilis ferdeagaros tenyészete A gyakorlat menete: A Proteus vulgaris ferdeagaros tenyészetébıl lelángolt és kihőtött oltótővel kis mennyiséget kiveszünk, majd az oltótőt beleszúrjuk a félfolyékony mozgásvizsgálat agarba. 37 C-on 48 órán át történı inkubálás után bíráljuk el a csöveket. Megfigyelések:

10 MIKROORGANIZMUSOK SZÁMÁMAK MEGHATÁROZÁSA l. Decimális hígítási sor készítése A vizsgálati mintában (élelmiszer-, víz-, talajminta stb.) a keresett mikroorganizmusok számát mindig a minta 1g-jára, vagy 1 ml-ére vonatkoztatva adjuk meg. A "Mintaelıkészítés" címő fejezetben már szó volt róla, hogy tekintettel a minták mikroflórájának egyenlıtlen eloszlására a vizsgálati anyagot elıször homogenizálni kell, célszerően kilencszeres mennyiségő higítóvízzel. Általában a vizsgálati anyag a minta 10 g- ja illetve 10 ml-re, egyes esetekben fıleg patogén mikroorganizmusok jelenlétének vizsgálatakor (Salmonella, Listeria monocytogenes)a vizsgálati anyag 25, esetleg 100 g illetve ml is lehet. A homogénezéssel elkészített un. alaphígítás (10-1 ) képezi az alapját az alábbiak szerint elkészítendı, un. decimális hígítási sornak: az alaposan összerázott alaphígításból steril pipettával 1 ml-t kell 9 ml hígítófolyadékhoz mérni a következı (2-es hígítás, 10-2 ) elkészítéséhez, majd a folyamatot folytatni a szükséges hígítási fokig. Minden hígítás elkészüléséhez új pipettát kell használni. A higítási fokokat úgy kell megválasztani, hogy telepszámlálásos módszer esetén a várható telepszám legyen, míg MPN-módszer esetén az utolsó hígításban feltételezhetıen már ne legyen a vizsgálandó mikroorganizmus. 2. Mikroorganizmusok számának meghatározása MPN-módszerrel Az MPN (Most Probable Number = legvalószínőbb élısejt szám) módszer használatakor a mikroorganizmusokat folyékony táptalajban szaporítjuk el, és a mikrobaszaporodást mutató csövek száma alapján, statisztikai alapon következtetünk a keresett mikroorganizmusok számára. Az MPN-módszer alkalmazhatóságnak alapfeltétele, hogy a sejtek eloszlása az alapszuszpenzióban véletlenszerő legyen, vagyis a sejtek a szuszpenzió bármely részében azonos valószínőséggel legyenek megtalálhatók, és a folyékony táptalajban mikrobaszaporodás legyen tapasztalható már 1 élı sejtet tartalmazó inokulum beoltása esetén is. A határhígításos módszer - a táptalajtól és a tenyésztési technikától függıen egyaránt alkalmazható az összes (aerob mezofil) élı csíraszám és valamely kiválasztott mikrobacsoport vagy mikroorganizmus számának meghatározására. A vizsgálandó anyagból alapszuszpenziót kell készíteni, majd ezt decimális alapon addig hígítani, míg az utolsó hígítás 1 ml-ében már valószínőleg már nem található a keresendı mikroorganizmus egyetlen sejtje sem. Ezért azt a technikát határhígításos módszernek is nevezik. Azt, hogy melyik az a hígítás, amelybıl kioltva már feltehetıleg nem tapasztalunk mikrobaszaporodást a minta jellege, és a keresett mikroorganizmus határozza meg. A hígításokból steril pipettával 1-1 ml-t kioltunk folyékony táptalajt tartalmazó csövekbe. Amennyiben a kioltást a hígabb szuszpenziótól kezdjük, a kioltás végrehajtható egy pipettával is. A sejtszám-meghatározás pontosságának megbízhatósága növelhetı a hígítás léptékének csökkentésével (pl. 2-es alapú hígítás), a hígítási fokokból történı leoltások (párhuzamosok) számának növelésével, és az ismétlések, vagyis az alaphígítások számának növeléséve. A mindennapi gyakorlatban általában a párhuzamosok számának növelésével emelik a megbízhatóságot. A megkívánt pontosságtól függıen 2-5 párhuzamos leoltására van

11 szükség. Leggyakrabban a 3-3 párhuzamos leoltással hajtják végre a legvalószínőbb élıcsíra-szám meghatározását. Az elbírálás elsı lépése az elıírt inkubálás után a kulcsszám meghatározása. A kulcsszám egy háromjegyő szám, amelyet három egymást követı hígítási szinten a mikrobaszaporodást mutató pozitív csövek számából határozunk meg. A kulcsszám elsı tagjának azt az utolsó hígítási szintet kell kijelölni, amelyen a pozitív csövek száma még maximális (ha pl. 3 párhuzamos leoltást végeztünk, akkor lehetıleg 3). A második számjegy az ezután következı hígítási lépcsıben talált pozitív csövek számát adja meg. A harmadik számjegy pedig a következı nagyobb higítás pozitív csöveinek számára utal. Elıfordulhatnak az értékelés során, hogy olyan kulcsszámot kapunk, amelyben a magasabb hígításhoz több pozitív csı tartozik. Ez a mikroorganizmusok egyenlıtlen eloszlására vagy a hígítás hibájára utal! Ezt követıen az un. Hoskins-féle táblázatból ki kell keresni a kapott kulcsszámhoz tatozó alapértéket, majd ezt meg kell szorozni a kulcsszám elsı tagjához tartozó hígítási fokkal. Az így kapott értéket normál alakba hozva adjuk meg a vizsgálat eredményét. 1. táblázat: Hoskins-féle táblázat a millliliterenkénti legvalószínőbb élısejtszám megállapításához (hígításonként 3-3 leoltás esetén) Kulcsszám Alapérték Kulcsszám Alapérték Tovább higítani! Például hígításonként 3-3 leoltással az alábbi eredményeket kapjuk: Hígítás Pozitív csövek száma A kulcsszám: (aláhúzott számok). Az ennek megfelelı alapérték (a táblázatból kikeresve): 15. A kulcsszám elsı tagjának hígítási szintje: Ezekbıl az adatokból az alapszuszpenzió legvalószínőbb élıcsíraszáma: 15x10 3 =1,5x10 4 sejt/ml

12 2.1. Mezofil (szulfitredukáló) anaerob spórás baktériumok vegetatív és spórás alakja számának meghatározása MPN-módszerrel. Mezofil(szulfitredukáló) spóraképzı anaerob baktériumok alatt azokat a Bacillaceae család Clostridium nemzetségébe tartozó, 30 C hımérsékleten anaerob körülmények között növekvı mikroorganizmusokat értjük, amelyek adott feltételek mellett a szulfitot szulfiddá redukálják. szulfit redukció (vas)-szulfid (fekete szín) A vizsgálathoz D-glükóz - nátrium-szulfit - vas-ammónium-citrát - B-polimixin tartalmú folyékony szelektív és differenciáló táptalajt (DRCM) használunk. A táptalaj szelektivitását a Bacillus polimixa által termelt polimixin nevő antibiotikum biztosítja, amely gátolja a nem spórásodó mikroflóra szaporodását. A Bacillus nemzetség tagjainak fejlıdését az anaerob; viszonyok akadályozzák. A táptalaj alkalmas a szulfitredukció kimutatására, amelynek alapanyaga a nátrium-szulfit; a keletkezı szulfidionokat a vas-ammónium-citrát "jelzi" oly módon, hogy a vas-ion a szulfid-ionokkal kapcsolódva feketére színezi a tápközeget. Az anaerobiozis ellenırizhetısége érdekében a táptalaj rezazurin nevő redoxindikátort tartalmaz. Az oxigénmentes táptalaj világos sárgásbarna színő, oxigén hatására pedig rózsaszínő. A táptalajból felhasználás elıtt az oxigénnyomokat forralással el kell távolítani. GYAKORLAT Szükséges anyagok és eszközök: Vízfürdı, steril pipetták, steril hígítóvíz 9 ml-ként csövekbe adagolva, DRCM-leves 10 mlként csövekbe adagolva, paraffinolaj Mikroorganizmus: Clostridium butyricum vizes szuszpenziója A gyakorlat menete: A vizsgálathoz két alapszuszpenziót kell készíteni, és az egyiket vízfürdıben 75 C-on 15 percen át hıkezelni a vegetatív alakok inaktiválása céljából. Ezt követıen mindkét alaphígításból decimális hígítási sort kell készíteni, majd a hígításokból 3-3 párhuzamos leoltást végezni DRCM-levest tartalmazó csövekbe. A beoltott csöveket az anaerob körülmények kialakítása érdekében 2-3 mm vastagságban parafinolajjal fedni kell, majd 30 C-on 44 ± 4 órán át inkubálni. Pozitív esetben a beoltott tápközeg fekete elszínezıdést mutat. A hıkezeletlen mintából kapott eredmény adja meg az összes (vegetatív és spórás) mezofil szulfitredukáló Clostridiumok számát, a hıkezelt mintából pedig a spórás alakok számát kapjuk meg. Eredmények:

13 2.2. Kóliform baktériumok és feltételezetten Escherichia coli számának meghatározása MPN-módszerrel Kóliform baktériumok alatt értjük azokat az Enterobacteriaceae családba tartozó aerob és fakultatív anaerob, G(-), spórát nem képzı baktériumokat, amelyek a laktózt 30 oc hımérsékleten óra alatt sav- és gáztermelés közben bontják. Ezek a baktériumok MPN-módszerrel szelektív, laktóztartalmú táptalajokban mutathatók ki. A kóliform baktériumok határhígításos módszerrel történı kimutatásához leggyakrabban a brillantzöld-epe-laktóz tartalmú szelektív levestáptalajt (BBL) használják. A brillantzöld és a szárított marhaepe gátolják a kísérıflóra szaporodását. A laktózbontást kísérı gáztermelés a táptalajba szájával lefelé elhelyezett Durham-féle fermentációs csı segítségével vizsgálható. A kóliform baktériumok csoportjába tartozik az egyik legjelentısebb ételmérgezı baktérium, az E. coli. Ennek kimutatása a kóliform baktériumokkal egyidejőleg a táptalajhoz adott "MUG" (4-metil-umbelliferil-ß-D-glükuronid) nevő adalékanyag segítségével történik. A MUG az E. coli baktériumok által termelt glükuronidáz enzim egyik lehetséges szubsztrátja. Az enzim a MUG-ról lehasítja a glükuronsavat, a visszamaradó 4-metil-umbelliferon nevő termék UV-fényben fluoreszkál. A fluoreszkálás mértéke néhány csepp 1 mólos nátrium-hidroxid oldattal felerısíthetı. GYAKORLAT Szükséges anyagok és eszközök: Steril pipetták, steril hígítóvíz 9 ml-ként csövekbe adagolva, MUG-ot tartalmazó BBL-leves 10 ml-ként csövekbe adagolva Mikroorganizmus: Kóliform baktériumok és E. coli vegyes vizes szuszpenziója A gyakorlat menete: A vizsgálathoz alaphígítást, majd abból decimális hígítási sort kell készíteni, és a hígításokból 3-3 párhuzamos leoltást végezni MUG-os BBL-levest tartalmazó, Durham-féle fermentációs csıvel ellátott csövekbe. A beoltott csöveket 30 C-on órán át kell inkubálni. Az értékelést a Hoskins-táblázat alapján kell elvégezni. Kóliformokra nézve pozitívnak kell tekinteni minden olyan csövet, amelyben a Durham-csınek legalább 1/10 részét gázbuborék tölti ki. A kóliform pozitív csövek közül E. coli baktériumot tartalmaznak a fluoreszkáló csövek. Megjegyzés: A címben a feltételezetten E. coli-szám meghatározás arra utal, hogy ez a vizsgálat nem teljes körő, az E. coli jelenlétét a továbbiakban még meg kell erısíteni. (Biokémiai vizsgálatok)