NEUROTRANSZMISSZIÓBAN RÉSZTVEVŐ ENZIMEK VIZSGÁLATA

Átírás

1 Biokémiai és Molekuláris Biológiai Intézet Általános Orvostudományi Kar Debreceni Egyetem BIOKÉMIA GYAKORLAT NEUROTRANSZMISSZIÓBAN RÉSZTVEVŐ ENZIMEK VIZSGÁLATA elméleti bevezetés Dr. Köröskényi Krisztina 2015

2 TARTALOMJEGYZÉK RÖVIDÍTÉSEK JEGYZÉKE 2 ELMÉLETI BEVEZETŐ 3 1. Neuronális kommunikáció, idegi szinapszis 3 2. Neurotranszmisszió, kémiai szinapszis 4 3. Neurotranszmitterek Acetilkolin Kolinészterázok A pszeudo-kolinészteráz (PChE) aktivitásának meghatározása A kolinerg rendszer farmakológiája A kolinészteráz-aktivitás meghatározásának klinikai jelentősége Monoamin neurotranszmitterek Monoamin-oxidázok A monoamin-oxidázok aktivitásának meghatározása A monoamin-oxidázok jelentősége a klinikumban 12 1

3 RÖVIDÍTÉSEK JEGYZÉKE 4-AA acetil-coa ACh AChE DTNB GABA KIR machr MAO nachr PChE TNB 4-aminoantipirin acetil-koenzim A acetilkolin acetilkolin-észteráz ditio-nitro-benzoát gamma-amino-vajsav központi idegrendszer muszkarinos acetil-kolin receptor monoamino-oxidáz nikotinos acetil-kolin receptor butirilkolin-észteráz, pszeudo-kolinészteráz, plazma kolinészteráz 5-tio-2-nitrobenzoát 2

4 NEUROTRANSZMISSZIÓBAN RÉSZTVEVŐ ENZIMEK VIZSGÁLATA ELMÉLETI BEVEZETŐ 1. Neuronális kommunikáció, idegi szinapszis A neuronok egymással az úgynevezett szinapszisokon keresztül kommunikálnak, melyek a preszinaptikus sejt axonterminálisa, illetve a posztszinaptikus sejt dendritje, sejtteste vagy ritább esetben axonja között találhatóak. Az emberi agy nagyszámú szinaptikus kapcsolattal rendelkező neuronhálózat, melyben a közel idegsejt mindegyike átlagosan 7000 szinapszist alakít ki más neuronokkal. Az intenzív fejlődéssel jellemezhető gyermeki agy megközelítőleg (1 kvadrillió) szinapszist tartalmaz, mely a kor előrehaladtával csökken. A szinapszisok hatásuk szerint excitatórikusak (posztszinaptikus neuron aktivitását fokozó) vagy inhibitorikusak (posztszinaptikus neuron aktivitását gátló) lehetnek. Működésüket tekintve két alaptípusukat - elektromos és kémiai szinapszist - különböztetjük meg (1. táblázat). ELEKTROMOS SZINAPSZIS a pre- és posztszinaptikus neuron membránját réskapcsolat (gap junction) köti össze, mely lehetővé teszi a töltések, ezáltal az elektromos ingerület akadálytalan áramlását előnye a sejtek közötti gyors jeltovábbítás KÉMIAI SZINAPSZIS a preszinaptikus neuron elektromos aktivitása neurotranszmitter felszabadulásához vezet, mely a posztszinaptikus neuronon lévő receptoraihoz kötődik a receptorok bonyolult intracelluláris jelátviteli rendszere miatt a neurotranszmitter kötődése komplex hatást gyakorol a poszt-szinaptikus neuron működésére 1. táblázat: Az elektromos és kémiai szinapszis fő jellemzői 3

5 2. Neurotranszmisszió, kémiai szinapszis Az ingerületátvivő anyagok (neurotranszmitterek) felszabadulásával és posztszinaptikus neuronon lévő receptoraihoz való kötődésével járó folyamatot ingerületátvitelnek, neurotranszmissziónak nevezzük. A neurotranszmisszió fő lépései a következőek: 1. Neurotranszmitter szintézise: a neuronok sejttestében, axonjában illetve axonterminálisában zajló folyamat. 2. Neurotranszmitter tárolása: az axonterminálisokban található granulumokban és vezikulumokban. 3. Neurotranszmitter felszabadulása: az axon terminálist érő küszöb-potenciál vagy fokozódó (gradált) elektromos potenciál hatására feszültségfüggő Ca 2+ -csatornák nyílnak meg és Ca 2+ ionok lépnek be az axonterminálisba. Az intracelluláris Ca 2+ jel a neurotranszmitter szinaptikus résbe történő felszabadulásához vezet. 4. Neurotranszmitter receptor kötődés: felszabadulását követően a neurotranszmitter a szinaptikus résben diffundálva eléri a posztszinaptikus neuron membránjában lévő receptorait és kötődik azokhoz. A ligand-receptor kapcsolódás olyan komplex változásokat idéz elő, melyek hatására fokozódik vagy csökken a posztszinaptikus neuron aktivitása. A kifejtett hatások egy része gyors és rövidtávú (pl. membránpotenciál megváltozása), míg mások hosszútávú hatást gyakorolnak a posztszinaptikus neuronra. 5. Termináció: a posztszinaptikus neuron megfelelő válaszadásának érekében a receptorhoz való kötődést, illetve a biológiai hatás kiváltását követően a neurotranszmitter molekulákat el kell távolítani a szinaptikus résből. Az eltávolítás többféle módon történhet: 1. ábra: A kémiai szinapszis szerkezete (forrás: Wikipedia) a neurotranszmitter szinaptikus résből történő eldiffundálásával a szinaptikus membránokhoz kötött enzimek általi inaktivációval/lebontással az axonterminálisba történő, specifikus pumpák általi visszavétellel A kémiai szinapszisokat a felszabaduló neurotranszmitter alapján csoportosíthatjuk. A leggyakoribbak a glutamáterg, GABAerg, kolinerg és adrenerg szinapszisok. 4

6 3. Neurotranszmitterek A neurotranszmitterek olyan speciális, endogén hírvivő molekulák, melyek feladata a jel továbbítása egyik idegsejttől a másikig, illetve az izom- vagy mirigysejtekig. Több mint 100 különféle neurotranszmitter ismert, leggyakoribb képviselőiket és fő típusaikat foglalja össze a 2. táblázat. TÍPUS AMINOSAVAK MONOAMINOK AMINOK NYOM-AMINOK PEPTIDEK PURINOK GÁZOK IONOK EGYÉB NEUROTRANSZMITTER glutamát, aszpartát, GABA (γ-amino-vajsav), glicin dopamin, szerotonin (5-HT), noradrenalin, adrenalin, hisztamin triptamin, tiramin, feniletilamin szomatosztatin, substance P, opioidok, CART (kokain- és amfetamin-regulált transzkript ) ATP (adenozin trifoszfát), adenozin CO (szén-monoxid), H 2 S (kén-hidrogén), NO (nitrogén-monoxid) cink acetilkolin (ACh), anandamid 2. táblázat: A neurotranszmitterek fő típusai Legtöbbjük az idegrendszerben termelődik, csak ott található meg és ott fejti ki hatását, de vannak, amelyek a vérben szétterjedve szisztémás hatással is rendelkeznek (pl.: adrenalin). Néhányuk a testben hormonként funkcionál, az agyban pedig neurotranszmitter szerepet tölt be. A leggyakoribb neurotranszmitter a serkentő hatású glutamát, mely az emberi agyban található szinapszisok mintegy 90%-ában szerepel ingerületátvivőként Acetilkolin Az elsőként felfedezett neurotranszmitter acetilkolin (ACh) az autonóm idegrendszer legfontosabb ingerületátvivő molekulája, mely mind a perifériás, mind a központi idegrendszerben (KIR) elengedhetetlen szerepet tölt be. Az ACh a motoros neuronokat és izmokat összekötő neuromuszkuláris junkció kizárólagos neurotranszmittere. Míg a KIR-ben és a szív szabályozó rendszerében a kolinerg rendszer általában gátló hatást közvetít, addig a vázizom neuromuszkuláris junkcióban excitatórikus neurotranszmitterként viselkedik. Az ACh hatásának szisztémás blokkolása izombénulást (légzés- és szívleállás) okozhat. A kurare nyílméreg a nikotinos ACh receptorok blokkolásán, a butulin az ACh felszabadulásának gátlásán, a feke- 5

7 te özvegy pók mérge pedig az ACh túlzott felszabadulásán keresztül zavarja meg a kolinerg szinapszisok működését. Az ACh speciális idegsejtben képződik kolin és acetil-coa prekurzorokból kolinacetiltranszferáz enzim segítségével, míg lebontásáért a szinaptikus résben jelenlévő kolinészteráz enzimek felelősek, melyek kolinná és ecetsavvá alakítják az ACh-t. Az ACh hatásait nikotinos (nachr) és muszkarinos (machr) receptorokon fejti ki (3. táblázat). NIKOTINOS ACh RECEPTOR (nachr) ACh és nikotin stimulálja Na +, K + és Ca 2+ ionokra szelektív ionotróp receptor (ligandvezérelt ioncsatorna) gyors és rövidtávú hatást gyakorol a célsejtekre nagy mennyiségben van jelen a motoros véglemezekben, az autonóm idegrendszerben és a KIR-ben MUSZKARINOS ACh RECEPTOR (machr) ACh és muszkarin stimulálja metabotróp receptorként a neuronok hatását hosszabb távon befolyásolja a KIR-ben, valamint a periferiás idegrendszer szívet, tüdőt, felső tápcsatornát és verejtékmirigyeket beidegző részében dominál 3. táblázat: A nikotinos és muszkarinos acetilkolin receptorok jellemzői Kolinészterázok Az ACh lebontását a kolin-észterázok végzik (2. ábra). A reakcióban kétféle kolin-észteráz vehet részt: (1) az idegvégződésekben és az agy szürkeállományában valamint a vörösvérsejtekben és a lépben funkcionáló acetilkolin-észteráz (AChE; valódi kolinészteráz) illetve a (2) butirilkolin-észteráz (PChE, pszeudo-kolinészteráz, PChE, plazma kolinészteráz), mely a szérumban, hasnyálmirigyben, váz- és szívizomban és az agy fehérállományában mutatható ki. A máj, tüdő és a vegetatív ganglionok mindkét kolinészterázt tartalmazzák. 2. ábra: Kolinészteráz reakció 6

8 A neuromuszkuláris junkció és a kolinerg szinapszisok pre- és posztszinaptikus membránjához asszociált acetilkolin-észteráz (AChE) az ACh inaktiválásán keresztül kulcsszerepet játszik az ingerületátvitel terminálásában. Az ACh bontásakor keletkező kolin a preszinaptikus idegvégződésekbe vevődik vissza és foszforilkolin formájában tárolódik, majd ACh-ná alakulva újrahasznosul a neurotranszmisszióban. Az AChE aktivitásának csökkenése (genetikai abnormalitások vagy enzimgátlás miatt) az ACh felszaporodásához vezet, mely a neurotranszmissziót gátolva izombénulást, rohamokat és akár halált is okozhat. A pszeudo-kolinészteráz (PChE) nem-specifikus kolinészteráz, mely különféle kolinésztereket képes hidrolizálni. Fiziológiás szerepe kevéssé tisztázott, hiányában nem alakul ki betegség. A szérumban lévő PChE talán a feleslegben lévő ACh lebontásában játszik szerepet. Farmakológiai és toxikológiai szempontból azonban fontos szereppel bír: az észter-alapú helyi érzéstelenítőként használt hatóanyagok (pl.: szukcinilkolin, prokain) valamint a heroin és kokain lebontásában nélkülözhetetlen enzim. Csökkent vagy hiányzó aktivitása esetében elmarad az előbb említett hatóanyagok lebontása, illetve fokozódnak azok nemkívánt szisztémás hatásai A pszeudo-kolinészteráz (PChE) aktivitásának meghatározása A gyakorlat során a PChE aktivitását egy szintetikus szubsztrát, a butiril-tiokolin alkalmazásával határozzuk meg. A butiril-tiokolin nem szubsztrátja az AChE-nek, alkalmazásával a PChE és AChE aktivitás elkülöníthető. 3. ábra: A PChE aktivitásának kolorimetriás meghatározása Az enzim a szubsztrátot butirátra és tiokolinra hidrolizálja. A keletkező tiokolin ditio-nitro-benzoáttal (DTNB) reagálva sárga színű terméket (5-tio-2- nitrobenzoát, TNB) eredményez (3. ábra), melynek fényelnyelési maximuma 410 nm körül van. Gyakorlaton a PChE aktivitását a 405 nm hullámhosszon mért abszorbancia-változás alapján számítjuk ki. 7

9 A kolinerg rendszer farmakológiája Az ACh hatását befolyásoló hatóanyagok az orvostudomány számos területén használt terápiás szerek. A kolinerg rendszer működését az ACh receptor agonisták (pl.: karbakol, muszkarin, nikotin) stimulálják, az antagonisták (pl.: atropin, szkopolamin, hexametónium, pankurónium, rokurónium) pedig gátolják. Az ACh receptorokon kifejtett direkt hatásuk mellett mindkét hatóanyagcsoport indirekt módon is, például a kolinészteráz enzimek befolyásolásán keresztül, képes módosítani a kolinerg rendszer működését. 4. ábra: Hazai forgalomban lévő prometazin hatóanyagú gyógyszer A Prometazin egy antihisztamin hatóanyag, mely altató, nyugtató és hányáscsillapító hatással bír. A készítmény egyes allergiás betegségek tüneteinek kezelésére, émelygés, hányinger, hányás megelőzésére és kezelésére, rövid távú nyugtatásra, műtéti érzéstelenítés során a nyugtató, illetve fájdalomcsillapító hatás fokozására, valamint utazási betegség megelőzésére és kezelésére alkalmazható. A Prometazin fő farmakológiai célpontjai a H1 hisztamin receptor (antihisztamin hatás) és a D2 dopamin receptor (nyugtató és hányáscsillapító hatás). Ezek mellett erős antikolinerg, valamint antiadrenerg és antiszerotoninerg hatást is kifejt. A kolinerg rendszerben egyrészt az ACh receptorokat (a M1 típusú machr antagonistája), másrészt a kolinészterázokat (AChE és PChE gátlószer) blokkolva fejti ki hatását. Az AChE gátlószerei az élet különféle területein vannak jelen: növényi és állati méreganyagok komponensei, rovarirtószerként használatosak a mezőgazdaságban, a kémiai hadviselés eszközei, valamint terápiás eszközök az orvostudományban. A klinikai gyakorlatban izomrelaxánsok hatásának visszafordítására és bizonyos betegségek (myasthenia gravis, glaucoma) kezelésére használják őket. Emellett kiemelkedő szereppel bírnak a KIR egyes betegségeihez (Alzheimer-kór, schizophrenia, autizmus, a demencia speciális formái) társuló kognitív tünetek (memória- és tanulási problémák) mérséklésében is. Az orvostudomány a viszonylaggyorsan (órák alatt) lebomló reverzibilis AChE inhibítorokat használja terápiás céllal. Leggyakoribb képviselőik: Neostigmin (neromuszkuláris gátlószerként használt altató- és érzéstelenítőszerek hatásának visszafordítása, ritkábban myasthenia gravis terápiája), Physostigmin (glaucoma és antikolinerg drogok 8

10 túladagolásának kezelése). A koffein az AChE nem-kompetitív inhibítora, míg a tetrahidrokannabinol az AChE kompetitív inhibítora. Az AChE irreverzibilis gátlószerei izombénulást, zavartságot, légzési nehézséget, kritikus esetben pedig fulladás miatt bekövetkező halált okozhatnak. Ezek a főként szerves foszfátészter típusú vegyületek javarészt rovarirtószerek (pl.: Malation, Paration) és vegyifegyverek (pl.: Sarin, Soman, Tabun, VX gáz) komponensei A kolinészteráz aktivitás meghatározásának klinikai jelentősége A PChE referencia tartománya humán minták esetében: U/L. Napjainkban leggyakrabban két célt szolgál a kolinészterázok aktivitásának meghatározása: 1. Szerves foszfát-észter mérgezés (növényvédőszerek, harci gázok): akut mérgezés megállapítása illetve szerves foszfát vegyületeknek folyamatosan kitett személyek (pl.: mezőgazdasági és ipari dolgozók) követése. Expozíciót követően az AChE és PChE aktivitás 20%-kal történő esése semmilyen tünettel nem jár, 60%-kal történő csökkenés viszont súlyos tüneteket okoz. A PChE alkalmazásának egy speciális területe az idegrendszerre ható úgynevezett szerves foszfát-észter hatóanyagokkal történő mérgezés, mely során profilaktikus céllal adagolják az érintett egyéneknek az enzimet. 2. Szukcinilkolin érzékenység: az emberi populáció kb. 3%-a rendelkezik csökkent aktivitású PChE variánssal (genetikai polimorfizmusnak köszönhetően). Ezekben az egyénekben az általános izomrelaxánsként alkalmazott szukcinilkolin adása elnyújtott hatással járhat, mely fokozza a nemkívánatos posztoperatív események (légzési problémák, súlyos esetben halál) kockázatát. Olyan betegek esetében, akiknél korábban, illetve családjukban előfordult a szukcinilkolin adását követően légzési probléma, érdemes a beavatkozást megelőzően PChE aktivitás meghatározást végezni. 9

11 3.2. Monoamin neurotranszmitterek A monoamin neurotranszmitterek aromás gyűrűt, valamint ahhoz két szénatomos láncon (-CH 2 -CH 2 -) keresztül kapcsolódó amino csoportot tartalmazó vegyületek, melyek aromás aminosavakból (fenilalanin, tirozin, triptofán) és tiroid hormonokból keletkeznek dekarboxilációval. A monoaminerg idegi hálózatok kulcsszerepet játszanak a kognitív folyamatok (pl.: érzelmek), az ébrenlét és a memória bizonyos formáinak folyamatában. A monoamin rendszert befolyásoló hatóanyagok sikeresen használhatóak a különféle pszichiátria betegségek (pl.: depresszió, szorongás, schizophrenia) kezelésében. A klasszikus monoamin neurotranszmitterek közé tartozik a hisztamin, a katekolaminok (adrenalin és noradrenalin, dopamin) és a triptaminok (szerotonin, melatonin). A sejtekben keletkező monoamin ingerületátvivő anyagok szekréciójáért specifikus monoamin transzporterek a felelősek, míg a szinaptikus résből történő eltávolításuk döntően visszavétellel (a visszavett monoaminok vezikulumokban raktározódnak és újrahasznosulnak) vagy 5. ábra: Monoamin-oxidáz reakció monoamin-oxidázok (MAO) általi lebontással történik Monoamin-oxidázok Az oxidoreduktázok közé tartozó monoamin-oxidázok a külső mitokondriális membránhoz kapcsolódó flavoproteinek, melyek monoaminok oxidatív dezaminációját katalizálják. Az amin csoport eltávolításához molekuláris oxigént használnak fel, a reakció végterméke ammónia és a monoaminból származó aldehid (5. ábra). Az emberi szervezetben két típusuk van jelen: a MAO-A és a MAO-B (4. táblázat). Míg a MAO-A leginkább szerotonint, dopamint, norad-renalint és tiramint bont le, addig a MAO-B elsősorban a dopamin metabolizmusában játszik szerepet. 10

12 SZÖVETI EXPRESSZIÓ FUNKCIÓ MONOAMIN-OXIDÁZ A (MAO-A) neuronok, asztroglia máj, tüdő érfali endotélium, tápcsatorna, placenta táplálékkal felvett monoaminok lebontása monoamin neurotranszmitterek inaktivációja MONOAMIN-OXIDÁZ B (MAO-B) neuronok, asztroglia vérlemezkék monoamin neurotranszmitterek inaktivációja SZUBSZTRÁT SPECIFICITÁS szerotonin, melatonin, adrenalin, noradrenalin benzilamin, fenetilamin egyenlő mértékben vesznek részt a dopamin, tiramin és triptamin lebontásában 4. táblázat: A monoamin-oxidázok fő jellemzői A monoamin-oxidázok aktivitásának meghatározása A különféle aktivitásmérési módszerek közül a legelterjedtebbek a MAO reakcióban keletkező aldehid illetve hidrogén-peroxid (H 2 O 2 ) mennyiségi meghatározásán alapuló technikák. A gyakorlat során az utóbbit alkalmazzuk. A meghatározás elvét az 6. ábra szemlélteti. 6. ábra: A MAO aktivitásának kolorimetriás meghatározása A reakcióban szubsztrátként használt benzilamint a MAO benzaldehiddé alakítja. A folyamat során keletkező hidrogén-peroxid a 4-aminoantipirin (4-AA) peroxidáz általi oxidációjában hasznosul. A 4-AA oxidált származéka az ún. Trinder-reakcióban fenollal reagálva vörös színű terméket ad, melynek mennyisége fotometriás módszerrel meghatározható. A mintákban 11

13 jelenlévő kataláz képes a hidrogén-peroxidot vízzé bontani, ennek megakadályozására nátrium-azidot (kataláz inhibítor) adunk a reakcióelegyhez A monoamin-oxidázok jelentősége a klinikumban Míg a MAO-A genetikai defektusa szellemi visszamaradottsággal és viselkedési zavarokkal jár együtt, addig a MAO-B esetében a vizelet megemelkedett fenetilamin tartalmát leszámítva semmilyen fenotípusos abnormalitás nem figyelhető meg. A MAO-A genetikai polimorfizmusára irányuló vizsgálatok kimutatták, hogy a magasabb aktivitással rendelkező variánsok jelenléte major depressziós megbetegedésekkel és erőszakos viselkedéssel jár együtt. Az alacsonyabb MAO-A aktivitás viszont az autizmussal mutat kapcsolatot. MAO-B esetében egyes polimorf variánsok fokozzák a különféle pszichiátriai megbetegedések (pl.: depresszió, szenvedélybetegségek) kockázatát. A MAO-B agyban mért szintje Alzheimer- és Parkinson-kór esetében magasabb, illetve a korral fokozatosan emelkedik, mely felveti annak a lehetőségét, hogy a MAO-B szerepet játszik az idősebb korban jelentkező neurológiai betegségek és a normális szellemi hanyatlás kialakulásában. A profilaktikus céllal alkalmazott MAO-B inhibítorok öregedést lassító hatása élénk vita tárgyát képezik. A kétféle MAO szubsztrátspecificitásában mutatkozó különbségeket kihasználva a MAO-A inhibítorokat a depresszió, míg a MAO-B gátlószereit a Parkinson-kór terápiájában alkalmazzák sikeresen. 12