Fehérjék szerkezete. Fehérjék aminosavsorrendjének meghatározása

Átírás

1 Fehérjék szerkezete $IHKpUMpNIpOHDPLQRVDYEyOpS OQHNIHO(]HNDN YHWNH]Nglicin, alanin, valin, leucin, izoleucin, fenilalanin, tirozin, triptofán, cisztein, metionin, szerin, treonin, lizin, arginin, hisztidin, aszpartát, glutamát, aszparagin, glutamin, prolin. Az aminosavakban egy C- atomhoz az α-c-atomhoz egy karboxilcsoport ( COOH), egy aminocsoport ( NH 2 ), egy H-atom és egy oldallánc kapcsolódik. Az eltérés az aminosavak között az oldalláncokban van. Az aminocsoport protonálódhat ( NH 3 + ), a karboxilcsoport disszociálhat ( COO ). Ezen csoportok ionizációs állapota a ph-tól függ. Savas ph-n csak az aminocsoport ionizálódik, lúgos ph-n csak a karboxilcsoport, semleges S+QiOWDOiEDQPLQGNHWW$]WDS+WDPelyen a fehérjék nettó töltése nulla azaz ugyanannyi NH 3 + csoportjuk van, mint COO, a fehérje izoelektromos pontjának nevezzük. A pk az a ph, amelyen egy gyenge savban vagy gyenge lúgban ugyanannyi ionizált molekula van, mint amennyi nem ionizált. Az aminosavak egyszerre savak is és lúgok is, ezért külön beszélünk az aminocsoporthoz tartozó pk-ról és a karboxilcsoporthoz tartozó S.UyO(OEELXWyEEL(]W EEQ\LUHPLQGHQDPLQRVDYUD megegyezik. Fehérjékben ezek az értékek 8,0-ra és 3,1-re változnak. Minden aminosavnak kétféle konformációja lehetséges: L-izomer és D-izomer. Ezek az α&dwrpn U OLQpJ\FVRSRUWHOUHQGH]GpVpEHQN O QE ]QHNHJ\PiVWyO/L]RPHUDPLQo- VDYDNEDQD]ROGDOOiQFIHOOYLVV]DQp]YHD]aminocsoport, a karboxilcsoport és a H-atom ilyen sorrendben az óramutató járásával ellentétes irányban követik egymást, D-izomer aminosa- YDNQiOPHJIRUGtWYD$IHKpUMpNEHQNL]iUyODJ/L]RPHUHNIRUGXOQDNHO Az aminosavak peptidkötésekkel kapcsolódnak össze polipeptid lánccá: A SHSWLGN WpVW OpWHVtW QpJ\ DWRP HJ\ VtNEDQ KHO\H]NHGLN HO D N WpV PHUHY D &±1 kötés körül nem valósulhat meg forgás. Az C α N kötés körül valamint a C α C kötés körül YLV]RQWDOiQFHOIRUGXOKDW$]HOIRUGXOiVV] JpWD]HOEELHVHWEHQφ-vel, az utóbbi esetben ψ- vel jelöljük. G. N. Ramachandran észrevette, hogy hogy egy polipeptidláncban az egy aminosavhoz tartozó φ és ψ szögek nem vehetnek fel akármilyen értékeket. Ramachandran ábrák: I JJOHJHVWHQJHO\HQDψ, vízszintes tengelyen a φ. A fehérjék közötti különbségeket az aminosavsorrend határozza meg. Az aminosavsorrend és a diszulfidhídak lokalizációja tehát a kovalens kötések teljes leírása HJ\ WWNpSH]LDIHKpUMpNHOVGOHJHVV]HUNH]HWét. Fehérjék aminosavsorrendjének meghatározása (OVOpSpVNpQWDszekvenálni kívánt peptidlánc aminosav-összetételét határozzuk meg (a sorrendjük nélkül). Ezt könnyen elvégezhetjük úgy, hogy kb. 120 C-on, 10 atm nyomáson, VDYDVN ]HJEHQWDUWMXNNHWyUiLJ(]DODWWDpeptidlánc szétbomlik aminosavaira, amik valamilyen kromatográfiai módszerrel szétválaszthatók. Festésükre ninhidrint vagy IOXRUHV]NDPLQW KDV]QiOQDN (OEEL D] DPLQRVDYDNDW NpNUH D] iminosavakat (prolin) sárgára festi, utóbbi az α-aminocsoporttal fluoreszcens származékot hoz létre. Az aminosavak azonosítása a kimosásukhoz szükséges puffer mennyisége alapján történik. A szekvencia meghatározása az ún. Edman-degradálássalYpJH]KHWHO$]HOMiUiVVorán fenilizotiocianátot kevernek a fehérjéhez, ami hozzákapcsolódik annak semleges láncvégi aminocsoportjához, majd enyhén savas közegben a láncvégi aminosavval együtt leválik a lánc VpUWHWOHQPDUDGpNUpV]pUO$OHYiOWUpV]Wfeniltiohidantoin (PTH) - aminosav -nak nevezzük

2 és valamilyen kromatográfiás módszerrel azonosíthatjuk. A lánc maradék részére ezután megismételhetjük a fenti eljárást és azonosíthatjuk a második aminosavat. A fenti módszerre alapozva kifejlesztettek egy automatizált és gyorsabb eljárást, melyben a fehérjét vékony filmre viszik fel, amit egy forgó lemezen rögzítenek. A szükséges rea- JHQVHNHWiWiUDPROWDWMiNDOHPH]I O WWPDMGDNHOHWNH]PTH- aminosav komplexeket nagynyomású folyadék kromatográfiával (high pressure liquid chromatography, HPLC) azonosítják. Ezzel az Edman-degradálás egy lépése mindössze két órát vesz igénybe, de csak kb. 50 aminosavból álló láncok szekvenciája határozható meg vele megbízhatóan. Hosszabb láncok V]HNYHQiOiViKR]D]RNDWHOEEV]pWNHOOV]DEGDOQLNLVHEENEDPinosavat tartalmazó) egységekre, azokat kromatográfiával egymástól el kell választani, majd a kapott szakaszokat Edman-degradálással szekvenálhatjuk. A láncok feldarabolására alapveten két módszer kínálkozik: kémiai és enzimatikus feldarabolás. Kémiaira példa a cianogénbromid (CNBr), ami a metionin karboxilcsoportjainál szakítja meg a láncot. Enzimatikusra SpOGDDWULSV]LQDKDVQ\iOPLULJ\EHQWHUPHOGIHKpUMHERQWyHQ]LPDPLD]arginin és a lizin karboxilcsoportjainál hidrolizál. Az egész lánc aminosavsorrendjét ezek után még nem tudjuk meghatározni, ehhez valamely másik anyaggal más aminosavaknál is el kell szakítani a láncot, az így kapott kisebb szakaszokat ismét szekvenálni kell, és így mivel ezek a szakaszok átfednek a korábban kapott szakaszokkal, a teljes lánc aminosavsorrendje meghatározható. Ez az eljárás azonban csak egyláncú és diszulfid hidakat nem tartalmazó fehérjékre alkalmazható. Olyan fehérjék esetében, melyekben több polipeptidlánc kapcsolódik össze QHPNRYDOHQVN WpVHNNHODIHKpUMpNHWHOV] UGHQDWXUiOyYHJ\V]HUHNNHO±SpOGiXONDUEDPLGGDO vagy guanidin-hidrokloriddal láncaira bontjuk, a kapott láncokat elkülönítjük egymástól, majd alkalmazzuk a fenti eljárást. A diszulfid hidakat β-merkaptoetanollal vagy ditiotreitollal szakíthatjuk fel, majd a rekombinálódás megakadályozása érdekében jódacetátot (ICH 2 COO ) alkalmazunk, ami hozzákapcsolódik a kénatomokhoz. A diszulfid hidak helyének meghatározására szolgál az átlós elektroforézis. Ebben elször a polipeptidláncokat kisebb peptidekre bontjuk olyan körülmények között, hogy a diszulfid hidak épen maradjanak. Ezután elektroforézist hajtunk végre a mintán, majd az így kapott IHKpUMpNHW WDUWDOPD]y JpOW VDYDV J]EH KHO\H]] N DKRO D GLV]XOILG KLGDN LV IHOV]DNDGQDN miközben SO 3 -csoportok alakulnak ki rajtuk. Ekkor újabb HOHNWURIRUp]LVWYpJ] QND]HO] LUiQ\iUDPHUOHJHVHQ$]RNDpeptidek, amelyek nem tartalmaztak diszulfid hidakat, most is XJ\DQRO\DQPR]JpNRQ\DNOHV]QHNPLQWD]HOVelektroforézisben, ezért a gélen az átló mentén helyezkednek el, a diszulfid hidakat tartalmazó fehérjék mozgékonysága viszont megváltozik, H]pUWH]HND]iWOyWyOWiYRODEENHU OQHNtJ\N QQ\HQpV]UHYHKHWKRJ\PHO\LNpeptidek között alakult ki diszulfid híd. A V]HNYHQiOiVEDQQDJ\HOUHOpSpVWMHOHQWHWWDrekombináns DNS-technika felfedezése, amelyben a DNS Ei]LVVRUHQGMpWKDWiUR]]XNPHJDPLEOD]DPLQRVDYDNkodonjainak ismeretében a DNS által kódolt fehérje aminosavsorrendje meghatározható. Ez az eljárás megkönynyítette és meggyorsította a fehérjék V]HNYHQiOiViW VW QDJ\RQ KRVV]~ DPLQRVDYEyO iooy IHKpUMpN HVHWpQ H] D] HJ\HWOHQ OHKHWVpJ PLYHO D '16 HVHWpEHQ KRVV]~ OiQFRN LV Yiszonylag könnyen szekvenálhatók. Mindez azonban nem teszi szükségtelenné a fehérjék közvetlen vizsgálatát, hiszen a WpUV]HUNH]HW NpVDP&N GpV NFVDNtJ\YL]VJiOKDWy(]HQNtY ODIHKpUMpNHONpV] OpVHXWiQ még számos ún. posztszintetikus módosulásban vehetnek részt, például foszfát- vagy szulfátcsoportok kapcsolódhatnak hozzájuk (amiket a foszfatáz, ill. a szulfatáz enzimek tudnak le- YiODV]WDQLW OWpVWDGYDDIHKpUMpQHNWRYiEEiGLV]XOILGKLGDNM KHWQHNOpWUHYDJ\N O QE ] oldalcsoportok kapcsolódhatnak valamelyik aminosavhoz, például a membránfehérjék eseté-

3 EHQ V]pQKLGUiW HJ\VpJHN N WGQHN D] aszparaginsav oldalláncokhoz stb. Ezek rekombináns DNS-technikával nem vizsgálhatók. Fehérjék másodlagos szerkezete A fehérjék másodlagos szerkezete a helikális szerkezetet és a β-réteg szerkezetet foglalja magában. A hélixeknek három fajtáját különböztetjük meg: 3-10-hélix: minden harmadik aminosav létesít hidrogénhidat, α-hélix: minden negyedik aminosav létesít hidrogénhidat, π-hélix: minden ötödik aminosav létesít hidrogénhidat. A β-rétegek fajtái: paralell: a párhuzamos peptidláncok egy irányba futnak, antiparalell: a párhuzamos SHSWLGOiQFRNHOOHQNH]LUiQ\EDIXWQDN β-turn: a peptidlánc 180 -os fordulata. α-hélix Az α-hélix menetemelkedése 5,4 Å, egy meneten 3,6 aminosav foglal helyet, így két szomszédos aminosav között 100 -ot fordul a lánc és 1,5 Å-öt emelkedik. Az α-hélixek lehetnek jobbkezesek (right-handed) és balkezesek (OHIWKDQGHG(OEELHVHWEHQ~J\WXGXQNHOUehaladni a láncon, ha az óramutató járásával PHJHJJ\H]LUiQ\EDQKDODGXQNUDMWDQRUPiOFVavarok menete), utóbbi esetben meg fordítva. A fehérjékben csak jobbkezes α-hélixek fordul- QDNHO$]α-hélixek hossza 40 ÅWOÅ-ig terjed. Két vagy több α-hélix össze is fonódhat egy kábellé. Ezek angol elnevezése α helical coiled coil (α helikális tekercselt tekercs).,o\hq ILJ\HOKHW PHJDNHUDWLQEDQKDMDmiozinban és a tropomiozinban (izom), az HSLGHUPLQEHQEUpVDILEULQEHQYpU

4 β-réteg A β-rétegben a polipeptidlánc csaknem teljesen ki van terítve, a szomszédos aminosavak tengely mentén mért távolsága 3,5 Å, szemben az αkpol[uh MHOOHP]Å-mel. A β- réteget szintén H-kötések stabilizálják az NH és a CO csoportok között, ám itt ezek a kötések a szomszédos láncokat kötik össze, és nem egy láncon (szakaszon) belül hatnak. β-turn-ben az nhglndplqrvdy+n WpVVHON WGLND]n+3-ik aminosavhoz, és ezáltal HJ\KDMW&FVDYDUM QOpWUHβ-turn gyakran antiparallel β-láncokat köt össze innen kapta a nevét. A harmadlagos szerkezet az α-hélix és a β-réteg lánc menti eloszlását jelenti. A több polipeptidláncból álló fehérjéket a negyedleges szerkezet is jellemzi, ami az egyes polipeptidláncok egymáshoz viszonyított helyzetét illetve kapcsolatát jelenti. $ IHKpUMpN V]HUNH]HWpUO KDV]QRV LQIRUPiFLyNDW Q\HUKHW QN D],QWHUQHW ROGDODLUyO ( ill. melyeken sok fehérje szekvenciája, másodlagos szer- NH]HWHpVWpUV]HUNH]HWHPHJWDOiOKDWy$PiVRGODJRVV]HUNH]HWHWDWpUV]HUNH]HWEOKDWiUR]]iN meg pl. '663PyGV]HUUHO$N O QE ]PyGV]HUHNIOHJD]α-hélixek, illetve a rendezetlen szakaszok meghatározásában különbözhetnek egymástól. Fehérjék szerkezetének meghatározása energiaminimalizációval Az alapállapotot azáltal definiáljuk, hogy a hozzá tartozó energia minimális. Fel kell tuqxqnwhkiwhj\srwhqfliolvhqhujldnpsohwhw(uuhn O QE ]DODN~HPSLULNXV~WRQIHOiOOtWRWW ún. forcefieldek léteznek, melyek tartalmazzák a kötéshosszakat, kötésszögeket, torziós szögeket, out of SODQHNRRUGLQiWiNDWD]H]HQ~QEHOVNRRUGLQiWiNN ]WLFVDWROiVRNDWYDODPLQWD van der Waals- és Coulomb-kölcsönhatást. Az említett koordináták függvényében felrajzolhatjuk az energiafelületet. A minimumkeresésben az alapállapottól távol a legmeredekebb esés, az alapállapothoz közel a konjugált gradiensek módszere bizonyul a legeredményesebbnek. A legmeredekebb esés módszerében minden lépésben úgy változtatjuk meg a konfigurációt, hogy az energia csökkenése a legnagyobb legyen, azaz az energiafelület gradiensének irányába mozdulunk el. A konjugált gradiensek módszerében az egyensúlyi helyzet körüli oszcillációkat elke- U OHQGPHJMHJ\H]] ND]HO]OpSpVLUiQ\YHNWRUiWpVJUDGLHQVpWpVH]HNILJ\HOHPEHYpWHOpYHO hatáur]]xnphjdn YHWNH]OpSpVLUiQ\YHNWRUiW A számítások meggyorsítására a párkölcsönhatásokat csak az általunk definiált ún. cutoff-távolságokon belül vesszük figyelembe. Ezen FXWRIIWiYROViJRNDWFpOV]HU&~J\GHILQiálni, hogy az összetartozó töltött molekularészek egy csoportba tartozzanak. A cutofftávolságokat természetesen minden lépésben újra kell definiálni, de használatos az ún. dulpa- FXWRIIPyGV]HULVDPHO\EHQNHWWFXWRIIWiYROViJRWGHILQLiOXQNPHO\HNN ] ODN OVWFVDN bizonyos számú lépés után frissítjük. Az oldószer hatásának pontos meghatározása az oldószermolekulák nagy száma miatt iowdoiedqqdj\rqvrnlgwyhqqhljpq\ehh]puwfvdndohiuq\pnroykdwivwyhvv] NILJ\HOHPEH HJ\WiYROViJI JJdielektromos állandó bevezetésével. A molekulák konformációváltozásainak szimulációja során a potenciális energia (IRUFHILHOGQHJDWtYJUDGLHQVpEOV]iPROWHUNUHROGMXNPHJD1HZWRQHJ\HQOHWHNHWQXPHUikus integrálással. A kezdeti sebességeket a 0D[ZHOO%ROW]PDQQHORV]OiVQDNPHJIHOHOHQYé- OHWOHQV]HU&HQ UHQGHOM N KR]]i D] HJ\HV DWRPRNKR] D KPpUVpNOHWHW D NLQHWLNXV HQHUJLiEyO származtatva. A cirkuláris dikroizmus (CD) spektroszkópia

5 A CD-spektroszkópia fehérjék másodlagos és harmadlagos szerkezetének és szerkezetváltozásának vizsgálatára szolgál. Lényege, hogy bizonyos frekvenciatartományban (UV) a N O QE ]LUiQ\RNEDFLUNXOiULVDQSRODUL]iOWHOHNWURPiJQHVHVVXJiU]iVWDIHKpUMpNN O QE ]képpen törik és nyelik el. Ennek magyarázata a delokalizált elektronok viselkedésében rejlik. A távoli UV tartományban (180 nm-260 nm) az amidcsoportok delokalizált elektronjai KDWiUR]]iNPHJD&'VSHNWUXPRWH]pUWH]DPiVRGODJRVV]HUNH]HWUHMHOOHP]$NDSRWWVSHNt- UXPUDH]XWiQLVPHUWV]HUNH]HW&IHKpUMpN&'VSHNWUXPDLQDNOLQHiULVNRPELQiFLyMiWLOOHV]WM N $]LOOHV]WpVHUHGPpQ\pEODN O QE ]V]HUNH]HWLHOHPHNDUiQ\DPHJKDWiURzható. A közeli UV tartományban (260 nm-320 nm) felvett CD-spektrum az aromás oldallán- FRN HOKHO\H]NHGpVpUH pv tj\ D KDUPDGODJRV V]HUNH]HWUH MHOOHP] H]pUW VHJtWVpJpYHO H]HN megváltozását követhetjük nyomon. $VtNEDQSRODUL]iOWVXJiU]iVWHKiW±PHO\HOiOOtWKDWyNpWHOOHQWpWHVLUiQ\EDFLUNXOiUisan polarizált fény szuperpozíciójaként a fehérjemintán áthaladva elliptikusan polarizált lesz. Így felvehetjük az HOOLSWLFLWiVWDIUHNYHQFLDI JJYpQ\pEHQDPLMHOOHP]DIHKpUMHV]HUNezetére. /pwh]ln HJ\ PiVLN HOMiUiV LV DPHO\EHQ FVDN D] DEV]RUSFLyNpSHVVpJ N O QE ]VpJpW használják ki a kétféle cirkulárisan polarizált fényre. Ekkor a Lambert Beer-törvényben sze- UHSO DEV]RUSFLyV NRHIILFLHQVHN N O QEVpJpW YHKHWM N IHO D IUHNYHQFLD I JJYpQ\pEHQ DPL szintén alkalmas a fehérjék szerkezetének jellemzésére. Fehérjék szerkezetének vizsgálata kalorimetriával (DSC) A kalorimetriai mérés során a fehérjék térszerkezetének megváltozását a termodinamikai paramétereik vizsgálatán keresztül követjük nyomon. Általában az állandó nyomáson vett KNDSDFLWiVW PpUM N DPLEO N YHWNH]WHWKHW QN D] HQWDOSLD HQWUySLD pv D V]DEDG HQWDOSLD megváltozására. Az eljárás neve differenciális pásztázó kalorimetria (differential scanning calorimetry, DSC). /pq\hjhkrj\n O QE ]KPpUVpNOHWHNHQPpUM NDNpWPLQWDWDUWyEDQHOKHO\H]HWWRldat KNDSDFLWiViQDN N O QEVpJpW DPLW tj\ D KPpUVpNOHW I JJYpQ\pEHQ ieui]rokdwxqn ËJ\ kapjuk a DSC-görbét. Az egyik mintatartóba a referencia-oldatot töltjük, ami a tiszta puffer, a másikba a vizsgált fehérje oldatát. A fehérje átalakulása (denaturációja) alatt a KNDSDFLWiVD HUVHQPHJYiOWR]LNtJ\DDSC-görbén éles csúcs jelentkezik. A csúcs maximumának megfe- OHOKPpUVpNOHWHWWHNLQWM ND]iWDODNXOiVLKPpUVpNOHWQHN A szabad entalpia változását a G = RT lnk összefüggés alapján követhetjük nyomon, DKRO.DQDWtYpVDGHQDWXUiOWiOODSRW~PROHNXOiNV]iPiQDNDUiQ\D.DKPpUVpNOHWI JJYé- Q\HpV~J\KDWiUR]KDWyPHJKRJ\D]DGRWWKPpUVpNOHWLJNLV]iPtWMXNDJ UEHDODWWLWHU OHWHWpV HORV]WMXNDWHOMHVWHU OHWWHO.pUWpNHQ YHNYKPpUVpNOHWWHOGXUYiQOLQHiULVDQFV NNHQ