(11) Lajstromszám: E (13) T2 EURÓPAI SZABADALOM SZÖVEGÉNEK FORDÍTÁSA

Átírás

1 !HU T2! (19) HU (11) Lajstromszám: E (13) T2 MAGYAR KÖZTÁRSASÁG Szellemi Tulajdon Nemzeti Hivatala EURÓPAI SZABADALOM SZÖVEGÉNEK FORDÍTÁSA (21) Magyar ügyszám: E (22) A bejelentés napja: (96) Az európai bejelentés bejelentési száma: EP (97) Az európai bejelentés közzétételi adatai: EP A (97) Az európai szabadalom megadásának meghirdetési adatai: EP B (1) Int. Cl.: C12N 7/00 (06.01) C12N /07 (.01) (87) A nemzetközi közzétételi adatok: WO PCT/IB 04/ (30) Elsõbbségi adatok: EP FR (72) Feltalálók: GUEHENNEUX, Fabienne, Orvault (FR); PAIN, Bertrand, F Lyon (FR) (73) Jogosult: Vivalis, 4940 Roussay (FR) (74) Képviselõ: dr. Svingor Ádám, DANUBIA Szabadalmi és Jogi Iroda Kft., Budapest (4) Poxvírusok elõállítása madáreredetû, kitapadó és nem kitapadó sejtvonalakon HU T2 A leírás terjedelme 30 oldal (ezen belül 12 lap ábra) Az európai szabadalom ellen, megadásának az Európai Szabadalmi Közlönyben való meghirdetésétõl számított kilenc hónapon belül, felszólalást lehet benyújtani az Európai Szabadalmi Hivatalnál. (Európai Szabadalmi Egyezmény 99. cikk (1)) A fordítást a szabadalmas az 199. évi XXXIII. törvény 84/H. -a szerint nyújtotta be. A fordítás tartalmi helyességét a Szellemi Tulajdon Nemzeti Hivatala nem vizsgálta.

2 A találmány tárgya eljárás élõ vagy gyengített, natív vagy módosított vírusok elõállítására madáreredetû embrionális õssejtekkel, amely eljárás sejtek vírusrészecskékkel történõ fertõzését tartalmazza. A vakcinia vírust sikeresen alkalmazták himlõ elleni immunizálásra, és a WHO szerint ez tette lehetõvé a betegség teljes eltörlését 1980-ban. Azóta nem végzik a vakcinálást. Jelenleg, a vírus újjászületését olyan potenciális veszélyként tartják számon, amely a védtelen populációra nézve pusztító lehet. A probléma az, hogy az USA-ban csak 1 millió dózis mennyiségû himlõvakcina érhetõ el. Az FDA útmutatást bocsátott ki és szerzõdéseket kötött a himlõ elleni vakcina egységnyi dózisainak nagy mennyiségben történõ elõállítása érdekében. További információk a http: //www. bt.cdc.gov/agent/smallpox/smallpoxconsensus.pdf honlapon érhetõk el. Azonban, a gyártás felgyorsításához új termelési eljárásokra és alkalmas sejtvonalakra van szükség. A találmány szerinti megoldásban, madárfajokból származó új (kitapadó és nem kitapadó) sejtvonalak vannak leírva, amelyek gyógyászati társaságok vakcinatermelésre tudnak alkalmazni szubsztrátumként. Ezen új sejtek madárembriókból származnak és ezek helyettesíthetik a jelenleg alkalmazott tojásokat vagy promer embriófibriblasztokat. Hagyományosan, a vakcinák a fertõzõ ágens gyengített vagy inaktivált változatának alkalmazásával indukálnak immunitást. Jelenleg, a gyengített himlõvírusok tulajdonságai, mint például az emberi sejtekben történõ replikáció hiánya és az immunválasz jó indukálása lehetõvé teszi a például MVA (Modified Virus Ankara, Ankara módosított vírus) alkalmazásán alapuló új vakcinastratégiák kifejlesztését. Az MVA a vakcinia vírus egy rendkívül legyengített törzs, amelyet eredetileg biztonságos vakcinaként fejlesztettek ki a himlõ megszüntetésére. Az MVA¹t az Ankara törzsbõl, primer csirkeembrió-fibroblaszton (CEF) végzett több mint 70 passzázolással állították elõ, és ezen adaptáció következményeként a parentális törzshöz képest számos nagy genomi deléciót tartalmaz. Az MVA a legtöbb emlõseredetû sejtvonalban már nem képes replikálódni és állatokra nem patogén. Lényegesebb, hogy több mint embernek, köztük immundepresszált egyedeknek himlõ elleni vakcinaként beadott MVA-val kapcsolatban nem jelentettek súlyos komplikációt. A molekuláris biológia klasszikus eljárásaival lehetséges gyógyászati szempontból érdekes specifikus peptideket vagy fehérjéket kódoló, idegen DNS¹t tartalmazó rekombináns MVA¹t elõállítani. In vivo injektálás után, e rekombináns vírusok képesek serkenteni az immunrendszert specifikus antigének, például daganatantigének, ellen. Jelenleg, ezen új generációs vakcinavektorok kifejlesztése folyik vagy ilyenek kifejleszthetõk embereket vagy állatokat fertõzõ betegségek és különféle daganattípusok (melanóma, prosztatarák, mellrák, tüdõrák, petefészekrák, májrák stb.) ellen. Drexler és munkatársai [J. Gen Virol. 79, (1998)] megfigyelték, hogy a rendkívüli módon legyengített Ankara Módosított Vakcinavírus (MVA) hörcsögfiókák veséjébõl származó sejtekben ugyan replikálódik (a vírus szaporításának egy potenciális gazdája), ám különféle, emberi eredetû transzformált vagy primer sejtekben nem szaporodik, így az a kör, amely az MVA számára gazda lehet, korlátozott. Továbbá, ez a nagyon legyengített himlõvírustörzs nem képes produktív fertõzéseket létrehozni [Moss, Dev Biol Stand 1994: 63]. például, Blanchard és munkatársai [J. Gen. Virol. 79, (1998)] leírták, hogy a Ankara Módosított Vakcinavírus korlátozott mértékû replikáció megy át emberi sejtekben és számos immunmodulációs fehérje hiányzik belõle. Továbbá, a kitermelés mértékének a himlõvírus tömegtermelésének gazdasági életképességével összemérhetõnek kell lennie. Az MVA-val kapcsolatos szilárd biztonságossági nyilvántartás és a vakcinált egyedekben az általa kiváltott hatékony sejtes és humorális immunválasz jelentõs tudományos és ipari érdeklõdést váltott ki az MVA rekombináns vektorként való alkalmazásában az embereket és állatokat fertõzõ betegségek, elõnyösen az HIV és rák, elleni immunizálásra. A CEF-hez való adaptációja révén, az MVA nagy koncentrációban szaporítható ilyen sejtekben és az MVA vakcinajelöltek jelenlegi klinikai tételeit primer CEF¹en állítják elõ. Azonban, a CEF¹ek létrehozásához a primer szövettenyészetek elõállításában való jártasság szükséges és a speciális, kórokozóktól mentes körülmények között tartott baromfik tojásaitól függ. Továbbá, az elõállítási folyamat rendkívül munkaigényes és nehéz standardizálni, mivel a primer sejtek csak néhány passzálást képesek túlélni, és így azokat embrionált tojásokból folyamatosan elõ kell állítani. Bár a vakcinagyártók tudják kezelni az I. és II. fázisú klinikai tesztekre szánt MVAtételek gyártásainak ilyen korlátait, a III. fázisú klinikai tesztekhez a CEF¹en alapuló termelési folyamat léptéknövelése és végsõ fokon a termék késõbbi piacra bocsátása súlyos kihívás marad. A találmány által megoldani kívánt probléma a vakcinavírus replikációjára szolgáló sejtvonal elõállítása, amely elhárítja a fenti problémákat és amely megfelelhet a szabályozó hatóságok által támasztott követelményeknek. Ez a találmány szerinti megoldás célja. Ideális esetben, egy ilyen sejtvonalnak teljes mértékben meg kellene felelnie az elõírásoknak, és ismerni kellene a sejt összes jellemzõjét. Továbbá, a sejtvonal nem lehet daganatképzõ, genetikailag módosítatlannak és hosszú idõtartamú tenyésztés során stabilnak kell lennie. A sejtvonalnak képesnek kell lennie a vírus replikációjára és szérumtól mentes tápközegben stabil kitapadásos és szuszpenziós tenyésztésre adaptálhatónak kell lennie. Ebben a vonatkozásban, a madáreredetû sejtek vírusreplikációra való alkalmazását vizsgáltuk. Leírtuk, hogy a létrehozott új, madárembrióból származó és a párhuzamosan benyújtott PCT/FR03/0073 számú nemzetközi bejelentésben (WO03/ számú nemzetközi közzétételi irat) részletezett õssejtvonalak himlõvírusok, elõnyösen variolavírusok, például a vakciniavírus, replikációjára elõnyösen alkalmazhatók. Mivel a vakcina tömegtermeléséhez korlátlan sejtosztódásra van szükség, megvizsgáltuk a madáremb- 2

3 rióból származó õssejtek képességét vírusok replikálására. Azonban, madárembrióból származó õssejtek hosszú ideig való in vitro fenntartásához figyelembe kell venni a Pain és munkatársai [Development 122, (1996); US számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi irat és EP számú európai szabadalmi irat] által leírt specifikus tenyésztési és fenntartási körülményeket, és e tenyésztési körülményeknek költséghatékonyak. A probléma a madárembrióból származó õssejtek tenyészetben való fenntartása volt valamilyen gazdaságos tápközegben, miközben el kellett kerülni az olyan gondokat, mint a sejtdifferenciálódás és az öregedés. A találmánnyal összefüggésben, felismertük, hogy a növekedési faktorok, szérum és/vagy tápláló rétegek elvonása olyan, madárembrióból származó õssejtek populációjának izolálásához vezet, amely alaptápközegben korlátlanul képes szaporodni. Emellett, a legnagyobbrészt kitapadó hematopoietikus õssejtektõl eltekintve, a technikában eddig nyert sejtek kitapadó fenotípust mutatnak. Azonban, virális vakcinák ipari elõállításához a nem kitapadó sejtek elõnyösek. E fenotípus a disszociációra alkalmazott proteolítikus enzimek nélküli könnyû kezelhetõség miatt és az in vitro tenyésztett nem kitapadó sejtekkel elért nagy sejtsûrûség szempontjából egyaránt elõnyös. A találmány olyan, madárembrióból származó õssejtvonalak elõállítását írja le, amelyek spontán nem kitapadóvá válnak, vagy amelyeknél a kitapadást a tápréteg (feeder layer) megvonásával érjük el. Mivel szuszpenzióban szaporodnak, e sejtvonalak bioreaktorban történõ ipari vakcina-elõállítására tökéletesen alkalmasak. Alap tápközegben való szaporodási képességük mellett, felismertük azt is, hogy e sejtvonalak lehetõvé teszik bizonyos vírusok olyan mennyiségben való replikációját, amelynek kitermelése a jelenlegi eljárásokkal elérhetõ szinttel azonos vagy azt meghaladja, és ennek révén e sejtek különösen alkalmasak vakcinák tömeggyártására. Leírás Ennek megfelelõen, a találmány egy elsõ szempontja szerint, a találmány tárgya eljárás vakciniavírus, például natív vagy rekombináns vakciniavírus replikálására madárembrióból származó õssejtekben, ahol a találmány szerinti eljárás a következõ lépéseket tartalmazza: a madárembrióból származó õssejtek inokulálása vírusrészecskékkel és a sejtek tenyésztése bazális tápközegben sejtlízis jelentkezéséig és az újonnan elõállított vírusrészecskék a tápközegbe jutása, ahol a madárembrióból származó õssejtvonalhoz a következõkbõl álló folyamattal jutunk: a) madárembrióból származó õssejtek tenyésztése az SCF, IGF-1, BFGF trofikus faktorokat és az LIF, interleukin 11, interleukin 6, interleukin 6 receptor, CNTF, onkosztatin és kardiotrofin alkotta csoportból választott citokineket, és tápréteget, elõnyösen inaktivált és szérummal kiegészített tápréteget, tartalmazó komplett tápközegben; b) a tápközeg módosításával végzett passzálás, a faktorok, a szérum és/vagy a tápréteg progresszív vagy teljes elvonása céljából, c) exogén növekedési faktorok, a szérum és/vagy az inakivált tápréteg hiányában bazális tápközegben osztódásra képes kitapadó vagy nem kitapadó, madáreredetû sejtvonalak létrehozása. A folyamatban, a c) lépés szerinti bazális tápközeg még tartalmaz kevés (azaz, körülbelül 2% vagy annál kevesebb mennyiségû) szérumot. A folyamat adott esetben egy további d) lépést is tartalmaz, amely exogén növekedési faktorokat, inaktivált tápréteget és kevés szérumot már nem tartalmazó bazális tápközegre való átállás, amely tápközeg a következõk közül választott: szérummal kiegészített bazális tápközeg (i) és annak hígítása szérumtól mentes tápközeggel, majd a madársejtek tenyésztése az (i) bazális tápközegben végzett egymást követõ passzálásokkal, ahol a tápközegben a szérummentes tápközeg aránya progresszíven növekedik addig, amíg a bazális tápközeg teljesen el nem tûnik és az exogén faktoroktól, inaktivált táprétegtõl és kevés szérumtól nem lesz teljesen mentes; szérummal kiegészített szérummentes tápközeg (SFM), és a madársejtek tenyésztése a (ii) tápközegben végzett egymást követõ passzálásokkal, amely tápközegben a szérum aránya a progresszíven csökkentésre kerül a szérummentes tápközeg eléréséig; szérumtól mentes tápközeg (SFM) (iii), majd a madársejtek tenyésztése a (iii) tápközegben, ezt követõen a madársejtek fenntartása a szérumtól mentes tápközegben addig, amíg azok nem adaptálódnak a tápközeg cseréjéhez. A leírás szerinti értelemben, a madár kifejezés az avia rendszertani osztályba tartozó bármilyen fajt, alfajt vagy rasszt jelent, például minden korlátozás nélkül tyúk, pulyka, kacsa, liba, fogoly, fácán, papagáj, pinty, sólyom, varjú, strucc, emu és kazuár. A kifejezésbe beletartoznak a Gallus gallus különféle fajtái (például, White Leghom, Brown Leghorn, Barred-Rock, Sussex, New Hampshire, Rhode Island, Ausstral orp, Minorca, Amrox, California Gray, Italian Partidge-colored) és a különféle pulyka¹, fácán¹, fogoly¹, kacsa¹, struccfajták és más hétköznapi baromfik. A találmány egy elõnyös megvalósítási módjában, a találmány szerinti madársejt baromfisejt. A leírás szerinti értelemben, a szaporodásukat lehetõvé tevõ faktor kifejezés a madársejtek tenyészetben való túléléséhez és szaporodásához szükséges növekedési faktorokat jelenti. A találmány szerint, a növekedési faktorok közé trofikus faktorok és citokinek tartoznak. A trofikus faktor elsõsorban az SCF, IGF¹1 és bfgf. A citokinek fõként olyan citokinek, amelyek a gp130 fehérjével asszociált receptorokon át fejtik ki hatásukat (például, LIF, interleukin 11, interleukin 6, interleukin 6 receptor, CNTF, onkosztatin és kardiotrofin). Az a) lépés szerinti madársejtek madárembrióból származó õssejtek közül vannak kiválasztva. A leírás 3

4 szerinti értelemben, a sejtek totipotens vagy pluripotens madárembrió-õssejtek, amelyek madárembrióból, elõnyösen csirkeembrióból származó disszociált stádiumú X blasztodermális õssejtek szuszpenziós populációjából lettek izolálva [lásd EYAL-GILADl-féle osztályozás, Eyal-Gilaldi és Kochan, General Morphology Dev. Biol. 49, (1976)]. Ezen madárembrióból származó õssejteket a 39 C hõmérsékleten tartott tenyészetben 48 és 72 óra közötti idõtartamú lassú megkettõzõdési idõ jellemzi. A találmány szerinti eljárás b) lépése szerinti tápközeg növekedési faktorok, szérum és/vagy tápréteg részleges vagy teljes elvonására irányuló módosítása végezhetõ egyidejûleg, egymást követõen vagy elkülönülten. A tápközeg elválasztásának sorrendjét a következõk közül választhatjuk ki: tápréteg/szérum/növekedési faktorok; tápréteg/növekedési faktorok/szérum; szérum/növekedési faktorok/tápréteg; szérum/tápréteg/növekedési faktorok; növekedési faktorok/szérum/tápréteg; növekedési faktorok/tápréteg/szérum; A találmány tárgyát képezi a fentiekben leírt eljárás, amelyben a létrehozott sejtvonalakat az inaktivált tápréteg hiányában proliferálódó kitapadó sejtek képezik. Ebben a vonatkozásban, a fentiekben leírt eljárás b) lépése a tápközeg összetevõinek (növekedési faktor önmagában vagy szérum önmagában vagy növekedési faktorok és majd a szérum, vagy esetleg szérum és majd a növekedési faktorok) megvonását tartalmazza. A találmány egy másik megvalósítási módjában, a találmány tárgya a fentiekben meghatározott eljárás, amelyben a létrehozott sejtvonalakat exogén növekedési faktoroktól mentes tápközegben lévõ szuszpenzióban proliferálódó, nem kitapadó õssejtek alkotják. Ebben a vonatkozásban, a fentiekben leírt eljárás b) lépése a tápréteg progresszív vagy teljes elvonását és adott esetben a tápközeg más összetevõinek (növekedési faktorok és szérum) elvonását tartalmazza. A találmány egy másik megvalósítási módjában, a találmány tárgya a fentiekben meghatározott eljárás, amelyben a létrehozott sejtvonalakat szérumtól mentes tápközegben lévõ szuszpenzióban proliferálódó, nem kitapadó õssejtek képezik. A találmány egy másik megvalósítási módjában, a találmány tárgya a fentiekben meghatározott eljárás, amelyben a létrehozott sejtvonalakat exogén növekedési faktoroktól és szérumtól mentes tápközegben lévõ szuszpenzióban proliferálódó, nem kitapadó õssejtek képezik. Egy másik alternatív lehetõségben, a találmány tárgya az, hogy a b) lépés a növekedési faktorok progresszív vagy teljes elvonását tartalmazza, majd ezt követi adott esetben a szérum progresszív elvonása. Egy másik alternatív lehetõségben, a találmány tárgya az, hogy a b) lépés a növekedési faktorok és/vagy szérum progresszív vagy teljes elvonását tartalmazza, majd ezt követi adott esetben a tápréteg progresszív elvonása A találmány egy elõnyös megvalósítási módjában, a c) lépés szerinti létrehozott vonalak nem kitapadó, õssejt-szuszpenziós sejtek, amelyek exogén faktoroktól, tápláló sejtektõl és szérumtól mentes tápközegben szaporodnak. Ezen eljárás olyan klónok kiválasztását teszi lehetõvé, amelyek addig adaptálódnak ezekhez az új, fokozatosan drasztikussá váló körülményekhez, amíg alacsony szérumtartalmú vagy szérumtól teljesen mentes tápközegben szaporodásra képes stabil sejtvonalakhoz nem jutunk. Pontosabban, a folyamat a) lépése tartalmazhatja a tenyésztõ flaskák körülbelül 7 4 /cm 2 és 8 4 /cm 2 közötti koncentrációjú madársejtekkel való beoltását a teljes tápközegbe. Elõnyös, ha a betelepítés körülbelül 7,3 4 /cm 2 (4 6 sejt/ cm 2 vagy 4 6 sejt/0 mm csésze) mennyiségû sejttel történik. A leírás szerinti értelemben, a teljes tápközeg kifejezés növekedési faktorokkal és állati szérummal kiegészített bazális tápközeget jelent. Teljes tápközeg például Pain és munkatársai közleményében [Development 122, (1996)], az EP számú európai szabadalmi iratban és az US számú, US számú, US számú és US 830 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi iratokban van leírva. A leírás szerinti értelemben, a bazális tápközeg olyan klasszikus tenyésztõ tápközeg, amely önmagában lehetõvé teszi legalább a sejtek túlélését, és még inkább a sejtek szaporodását. Bazális tápközegnek számít például, a BME (basal Eagle Medium), MEM (minimum Eagle tápközeg), 199¹es tápközeg, DMEM (Dulbecco s modified Eagle tápközeg), GMEM (Glasgow modified Eagle tápközeg), DMEM-HamF12, Harn-F12 and Ham-F, Iscove s Modified Dulbecco s tápközeg, MacCoy s A tápközeg, RPMI Bazális tápközeg tartalmaz szervetlen sókat (például, CaCl 2, KCl, NaCl, NaHCO 3, NaH 2 PO 4, MgSO 4, ), aminosavakat, vitaminokat (tiamin, riboflavin, folsav, D¹Ca-pantotenát stb.) és más összetevõket, például, glükózt, ¹merkaptoetanolt, nátriumpiruvátot. A növekedési faktorok nagyjából két családra oszthatók: a citokinek és a növekedési faktorok. A citokinek fõként olyan citokinek, amelyek a gp130¹as fehérjével asszociált receptoron át fejtik ki hatásukat. Ennek megfelelõen, az LIF, interleukin 11, interleukin 6, interleukin 6 receptor, CNTF, onkosztatin és kardiotrofin hasonló módon, a monomer vagy néha heterodimer formában lévõ gp130 fehérje egyik specifikus láncán található receptor szintjén és a receptorral kombinálva fejti ki hatását. A trofikus faktorok fõként SCF, IGF¹1 és bfgf. A találmány szerint, a teljes tápközeg bazális tápközeget, inzulin növekedési faktor 1¹et (IGF¹1), cilliáris neurotróf faktort (CNTF), interleukin 6¹ot (IL 6), interleukin 6 receptorát (IL 6R), õssejt faktort (SCF), bázikus fibroblaszteredetû növekedési faktort (bfgf), adott esetben interleukint 11¹et (IL 11) és állati szérumot tartalmaz. Az a) lépés szerinti madárembriósejtek a teljes tápközegben számos passzálással tenyészthetõk. A tápközeg kiegészíthetõ legalább egy, a következõk közül választott növekedési faktorral: LIF, IGF-1, 4

5 CNTF, IL 6, IL 6R, SCF, bfgf, IL 11, onkosztatin és kardiotrofin A leírás szerint, a teljes tápközeg IGF-1¹el, CNTF¹el, IL¹6¹al, IL 6R¹el, SCF¹el, bfgf¹el, adott esetben IL 11¹el kiegészített bazális tápközeg. A bazális tápközegben az IGF-1, CNTF, IL 6, IL 6R, SCF, bfgf, adott esetben IL 11 koncentrációja körülbelül legalább 0,01 ng/ml és legfeljebb ng/ml, elõnyösen 0,1 ng/ml és legfeljebb ng/ml közötti és elõnyösebben körülbelül 1 ng/ml. Körülbelül 3 passzálás után, a teljes tápközegbõl elvonjuk a növekedési faktorokat (b lépés). Elõnyös, ha a növekedési faktoroknál az elvonás közvetlenül egy lépésben, egyik passzálásról a másikra történik. Esetleg, a növekedési faktor elvonása fokozatosan is történhet, a teljes tápközegben a növekedési faktor koncentrációjának progresszív csökkentésével. A növekedési faktorok elvonása legalább két növekedési faktort illetõen egyidejûleg is végezhetõ. A növekedési faktorok elvonása két elvonási lépésben történhet: elõször a teljes tápközegbõl közvetlenül eltávolítjuk az SCF, IL6, IL6R, adott esetben IL11 növekedési faktorokat; a madársejteket ekkor legalább egy passzálásra IGF1¹et és CNTF¹et, adott esetben IL 11¹et tartalmazó és állati szérummal kiegészített teljes tápközegben tartjuk fenn. Másodszor, az IGF1¹et és CNTF¹et, adott esetben IL 11¹et közvetlenül eltávolítjuk a tápközegbõl, amely így csak a szérummal kiegészített bazális tápközeget fogja tartalmazni. Általában, a növekedési faktorok elvonása a tápközegbõl a 30. passzálás körül történik. A táplálósejtek eltávolítására a növekedési faktorok elvonása után kerülhet sor. A táplálósejtek eltávolítása progresszív folyamat és számos passzálás alatt kerül rá sor. A madársejtek az a) lépésben megadottnál alacsonyabb, körülbelül legalább 4 sejt/cm 2 és legfeljebb 4 sejt/cm 2 koncentrációban vannak oltva a flaskában. A táplálósejtek körülbelül 4,2 4 sejt/cm 2 koncentrációban vannak jelen. A flaskában a táplálósejtek koncentrációját progresszíven csökkentjük. Gyakorlatilag, 2 4 passzálásra ugyanolyan koncentrációjú táplálósejteket alkalmazunk, majd további 2 4 passzálásra ennél alacsonyabb koncentrációjú táplálósejteket alkalmazunk, és így tovább. A flaskákat ekkor körülbelül 4,2 4 táplálósejt/cm 2, majd körülbelül 2,2 4 táplálósejt/cm 2, majd körülbelül 1,8 4 táplálósejt/cm 2, majd körülbelül 1,4 4 táplálósejt/cm 2, majd körülbelül 1,1 4 táplálósejt/cm 2, majd körülbelül 0,9 4 táplálósejt/cm 2, majd körülbelül 0, 4 táplálósejt/cm 2 koncentrációjú sejttel oltjuk. Ezután, a flaskát legalább 6, 4 madársejt/cm 2 és legfeljebb 7, 4 madársejt/cm 2 sejttel oltjuk (a táplálósejtek nélkül). Elméletileg, a madársejtek nem lesznek jó formában a flaskában a táplálósejtek koncentrációjának csökkentését követõen, majd a madársejteket ugyanazon táplálósejt-koncentrációnál további passzálások mellett tenyésztjük a táplálósejtek további elvonásának végrehajtása elõtt. A szérum elvonására a növekedési faktorok és a táplálósejtek eltávolítása után kerülhet sor. A bazális tápközeget a következõk közül választott tápközegre cseréljük: Szérummal kiegészített (i) és új szérummentes tápközeggel (ii) hígított bazális tápközeg. A madársejteket (i) tápközegben végzett egymást követõ passzálásokkal tenyésztjük, ahol az (i) tápközegben progresszívan addig növeljük a szérummentes tápközeg arányát, amíg a szérummal kiegészített bazális tápközeg teljesen el nem tûnik (progresszív hígítás). Szérummal kiegészített új, szérummentes tápközeg (ii). A madársejteket (ii) tápközegben végzett egymást követõ passzálásokkal tenyésztjük, ahol az (ii) tápközegben progresszívan addig csökkentjük a szérum arányát, amíg a szérummentes tápközeghez nem jutunk (progresszív elválasztás). Szérummal nem kiegészített új, szérummentes tápközeg (ii). A madársejteket közvetlenül a szérummentes tápközegben (ii) vannak (közvetlen elválasztás). A szérum elvonása progresszív elválasztással történhet. A leírás szerinti értelemben, a szérummentes tápközeg (SFM) tenyésztésre kész tápközeget jelent, azaz hogy a sejtek túléléséhez és szaporodásához nincs szükség szérum hozzáadására. E tápközeg nem feltétlenül van kémiailag meghatározva, és tartalmazhat különféle eredetû, például növényi, hidrolizátumokat. Elõnyös, ha az SFM nem állati eredetû -nek van besorolva, azaz nem tartalmaz állati vagy emberi eredetû összetevõket (FAO besorolása: free of animal origin). Az SFM-ben, a natív szérumfehérjéket rekombináns fehérjék helyettesítik. Esetleg, az találmány szerinti SFM tápközeg nem tartalmaz fehérjét (PF tápközeg: protein free medium, fehérjementes tápközeg) és/vagy kémiailag meghatározott összetételû (CDM tápközeg: chemically defined medium, kémiailag meghatározott tápközeg). Az SFM tápközegnek számos elõnye van: (i) mindenekelõtt az ilyen tápközegek megfelelõsége az elõírásoknak (a járulékos ágensek, például BSE, vírusok, okozta szennyezõdésnek valóban nincs kockázata); (ii) a tisztítási folyamat optimalizálása, (iii) a jobban meghatározott tápközeg miatt a folyamat jobb reprodukálhatósága. Kereskedelmi forgalomban beszerezhetõ tápközegek például a következõk: VP SFM (InVitrogen Katalógusszám: , 03. katalógus), Opti Pro (In- Vitrogen Katalógusszám: , 03. katalógus), Episerf (InVitrogen Katalógusszám: , 03. katalógus), Pro 293 S CDM (Cambrex katalógusszám: 1276Q, 03. katalógus), LC17 (Cambrex Katalógusszám: BESP302Q), Pro CHO CDM (Cambrex katalógusszám: Q, 03. katalógus), HyQ SFM4CHO (Hyclone Katalógusszám: SH301 02), HyQ SFM4CHO-Utility (Hyclone Katalógusszám: SH ), HyQ PF293 (Hyclone katalógusszám: SH ), HyQ PF Vero (Hyclone Katalógusszám: SH ), Excell 293 tápközeg (JRH Biosciences katalógusszám: M), Excell 32 PF CHO Fehérjementes tápközeg (JRH Biosciences katalógus-

6 szám: M), Excell VPRO tápközeg (JRH Biosciences katalógusszám: M), Excell 302 szérummentes tápközeg (JRH Biosciences katalógusszám: M). A találmány tárgyát madáreredetû sejtvonalak, szérummentes tápközegben szaporodni képes, elõnyösen nem transzformált, sejtvonalak létrehozására szolgáló eljárás is képezi, amely sejtvonalak adott esetben táplálósejteket tartalmazó teljes tápközegben vannak tenyésztve. Az eljárás a következõ lépéseket tartalmazza: a madársejt, elõnyösen nem transzformált madársejt, tenyésztése teljes tápközegben és adott esetben tápréteg jelenlétében. A madársejt lehet a fenti a) lépés madársejtje, a találmány szerinti eljárás létesített madársejt-vonal, például EBI, EB14 vagy S86N4 (másnéven EB4), vagy más madárembrió-eredetû sejtvonal, például DF1 (US számú és US számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi irat); a szérum progresszív vagy közvetlen elvonásával, a tápközeg módosításával vagy változtatásával végzett legalább egy passzálás a tenyészetben a szérum elválasztása céljából. szérummentes tápközegben szaporodni képes kitapadó vagy nem kitapadó madársejtvonalak létrehozása. A találmány szerinti megoldás azon a felismerésen alapul, hogy állati szérummal kiegészített bazális sejttenyésztõ tápközegbõl egy szérummentes tápközegbe való passzálás nem végezhetõ el egyszerûen csak úgy, hogy a bazális tápközegbõl egyszerûen csak eltávolítjuk a szérumot, hanem a tápközeg típusának megváltoztatására is szükség van [azaz hogy az szérummentes tápközeg (SFM) legyen]. Ezenfelül, amennyiben a madársejtvonalak megkövetelik a növekedési faktorokkal vagy táplálósejtekkel együtt végzett szaporítást, a szérum elkülönítésére elõnyösen csak a növekedési faktorok és/vagy táplálósejtek eltávolítása után kerüljön sor. A táplálósejtek elõnyösen besugárzással vagy mitomicinnel végzett kémiai kezeléssel inaktivált állati sejtek. A táplálósejt lehet genetikailag módosítva különbözõ növekedési faktorok, például SCF, expresszálására. Elõnyös, ha a táplálósejtek egéreredetû fibroblaszt sejtvonalak sejtjei, például STO sejtek (American Type Culture Collection ATCC száma: CRL-103). A fentiekben leírt eljárás tartalmazhat egy további lépést is, ahol a c) lépésben nyert sejtek szelekciónak vagy adaptációnak vannak alávetve nagyléptékû elõállításra alkalmazott tápközegben emberek vagy állatok kezelésére szánt vakcinák elõállítására alkalmas klónok létrehozása céljából. Ez az eljárás teszi lehetõvé az új, számottevõ ideig in vitro tenyészetben tartható, madárembrióból származó sejtvonalak létrehozását. Elõnyös, ha a c) lépésben kapott sejtvonalakból származó sejtek képesek legalább 600 napon át osztódni. A 600 nap nem valamiféle idõkorlát, mivel a kapott sejtvonalak ennél hosszabb ideig is képesek életben maradni. Emiatt tekintjük e sejtvonalakat exogén növekedési faktoroktól, szérumtól és/vagy inaktivált táprétegtõl mentes tápközegben korlátlan ideig szaporodóképesnek. A leírás szerinti értelemben, a vonal kifejezés bármilyen olyan sejtpopulációt jelent, amely képes in vitro tenyészetben korlátlanul osztódni, miközben többé-kevésbé megmaradnak a sejtek ugyanazon morfológiai és fenotípusos jellemzõi. Természetesen, a fentiekben említett eljárás lehetõvé teszi a már létesített vonalakból nyert sejtekbõl származó sejtklónok kinyerését. Ezek a klónok olyan sejtek, amelyek genetikailag azonosak azzal a sejttel, amelybõl osztódással származtak. A találmány részét képezi az is, hogy a létesített sejtvonalak és az azokból származó sejtek (c) vagy d) lépés) madáreredetû õssejtekbõl származó sejtek, pontosabban azok a sejtek madárembrióból származó pluripotens õssejtek. A találmány szerinti eljárással kinyerhetõ, madárembrióból származó õssejtek kisméretû, kerek, egyedi sejtek, amelyek megkettõzõdési ideje 39 C hõmérsékleten körülbelül 24 óra vagy annál kevesebb. A sejtek a találmány szerinti eljárással legalább a p60. passzálásnál, legalább a p70. passzálásnál, legalább a p80. passzálásnál, legalább a p90. passzálásnál, legalább a p0. passzálásnál, legalább a p1. passzálásnál, legalább a p1. passzálásnál, vagy legalább a p130. passzálásnál, vagy ennél is késõbb nyerhetõk ki. A találmány szerinti eljárással kinyerhetõ, madárembrióból származó õssejteket a következõk közül legalább egy jellemez: a sejtmag/citoplazma arány magas, endogén alkalikus foszfatáz aktivitás, endogén telomerázaktivitás, reaktivitás a következõ antitestcsoportból választott specifikus antitestekkel: SSEA¹1 (TEC01), SSEA-3, and EMA¹1. E sejtvonalak és az ezekbõl származó sejtek legalább 600 napig képesek osztódni bazális tápközegben, elõnyösen az olyan, szakember számára ismert különféle adalékokkal kiegészített tápközegekben, mint amilyen a DMEM, GMEM, HamF12 vagy McCoy. Az adalékok között megemlíthetõk a nem esszenciális aminosavak, a vitaminok és a nátriumpiruvát. Azonban, a találmány szerinti megoldásban a sejtek képesek glutamint nem tartalmazó bazális tápközegben is proliferálódni. A találmány szerint, e sejtvonalakra és az ezekbõl származó sejtekre jellemzõ, hogy kitapadó sejtekként és szuszpenziós sejtekként is képesek szaporodni. A találmány tárgyát képezik a leírás szerint létrehozott madáreredetû sejtvonalak és az azokból származó sejtek biológiai anyagok, például rekombináns peptidek és fehérjék (azaz, antitestek, hormonok, citokinek stb.), vírusok, vírusvektorok, víruszrészecskék és virális vakcinák elõállításra alkalmasak. Pontosabban, a leírás szerinti madáreredetû sejtvonalak és az azokból származó sejtek alkalmasak élõ vagy gyengített, rekombináns vagy nem rekombináns vírusok, himlõ, rákos megbetegedések és fertõzõ betegségek elleni vakcinák elõállítására. A leírás szerint, a vírusok, a kapcsolódó vírusvektorok, a vírusrészecs- 6

7 kék és virális vakcinák kiválasztása elõnyösen a következõ csoportok közül történik: adenovirusok, hepadnavirusok, herpeszvirusok, ortomixovirusok, papovavirusok, paramixovirusok, pikornavirusok, poxvirusok, reovirusok és retrovirusok. A vírusok, a kapcsolódó vírusvektorok, vírusrészecskék és virális vakcinák a poxvirusok családjába, elõnyösebben a Chordopoxviridae családba tartozhatnak. A vírusok, vagy a kapcsolódó vírusvektorok, vírusrészecskék és virális vakcinák lehetnek a következõ avipoxvírusok közül választottak: madárhimlõvírus, kanárihimlõvírus (azaz, ALVAC), juncopox vírus, mynahpoxvírus, galambhimlõvírus, papagájkórvírus, fogolyhimlõvírus, verébhimlõvírus, seregélyhimlõvírus, pulykahimlõvírus. A találmány szerint a vírus vakciniavírus. A találmány szerint a vírusok, a kapcsolódó vírusvektorok, vírusrészecskék és virális vakcinák az Orthomyxoviridae családba (elõnyösen influenzavírus) és a Paramyxovirusok családjába tartoznak (elõnyösen, kanyaró, mumpsz és rubeola vírusok). A találmány tárgyát a leírás szerint genetikailag, biológiailag vagy kémiailag módosítatlan, tenyészetben korlátlanul osztódni képes és a fenti jellemzõkkel bíró, az orthopoxírusok családjába tartozó élõ vagy gyengített vírusok, elõnyösebben élõ vagy gyengített vakciniavírus és rekombináns vakciniavírusok replikálására képes létrehozott kitapadó vagy nem kitapadó, madáreredetû sejtvonalak is képezik. A találmány tárgya a fentiekben leírt kitapadó vagy nem kitapadó sejtek alkalmazása élõ vagy gyengített vakcinák elõállítására, amely alkalmazás tartalmazza a c) lépésben létrehozott kitapadó vagy nem kitapadó sejtvonalak tenyésztését, a sejtek inokulálását vírusrészecskékkel és a sejtek bazális tápközegben való tenyésztését a fentiekben leírtak szerint addig, amíg be nem következik a sejtek lízise, és a tápközegbe kijutott újonnan elõállított vírusrészecskék kinyerése. A találmány elõnyösen alkalmas gyengített vakciniavírus, Lister Elstree-vakciniavírus-törzs, módosított vakciniavírus, például az ATCC-tõl beszerezhetõ Módosított Vakciniavírus Ankara (MVA) (ATCC száma: VR¹108), NYVAC [Tartaglia és munkatársai, Virology 188, (1992)], LC16m8 [Sugimoto és Yamanouchi, Vaccine 12, )], CVI78 (Kempe és munkatársai, Pediatrics 42, (1968)] és más rekombináns vakciniavírusok elõállítására. Elõnyösen, a létesített sejtvonalakból származó sejtek fertõzhetõk élõ vakciniavírus vagy gyengített módosított vakciniavírus és/vagy rekombináns vakciniavírus vakciniavírus elõállítása céljából. A sejtek a szakember számára elérhetõ bármilyen eljárással fertõzhetõk. Esetleg, a létesített sejtvonalakból származó sejtek transzfektálhatók vagy módosíthatók élõ vakciniavírus vagy gyengített módosított vakciniavírus és/vagy rekombináns vakciniavírus vakciniavírus elõállítása céljából. A sejtek a szakember számára elérhetõ bármilyen eljárással módosíthatók, elõnyösen nem homológ vagy homológ, irányított és/vagy feltételhez kötött rekombinációval (Cre-Lox vagy FLP-FRT rendszer), bármilyen vektorral, plazmiddal vírussal vagy rekombináns vírussal elõnyösen retrovírusok vagy rekombináns retrovírusok segítségével végzett transzformálással. A találmány egyik elõnyös megvalósítási módjában, a találmány tárgya eljárás himlõ elleni élõ vagy gyengített vakcinák elõállítására, amely eljárás tartalmazza a c) lépésben létrehozott kitapadó vagy nem kitapadó sejtvonalak fentiekben leírtak szerinti tenyésztését, a sejtek inokulálását vírusrészecskékkel és a sejtek bazális tápközegben való tenyésztését addig, amíg be nem következik a sejtek lízise, és a tápközegbe kijutott újonnan elõállított vírusrészecskék kinyerését. A találmány elõnyösen alkalmas gyengített vakciniavírus, Lister Elstree-vakciniavírus-törzs, módosított vakciniavírus, például az ATCC-tõl beszerezhetõ Ankara Módosított Vakcinia vírus (MVA) (ATCC száma: VR¹108), NYVAC [Tartaglia és munkatársai, Virology 188, (1992)], LC16m8 [Sugimoto és Yamanouchi, Vaccine 12, )], CVI78 (Kempe és munkatársai, Pediatrics 42, (1968)] és más rekombináns vakcíniavírusok elõállítására, például, az MVA alkalmazható például himlõ elleni vakcinaként. A találmány egy második elõnyös megvalósítási módjában, a találmány tárgya eljárás rák és fertõzõ betegségek elleni élõ vagy gyengített vakcinák elõállítására, amely eljárás tartalmazza a c) vagy d) lépésben létrehozott kitapadó vagy nem kitapadó sejtvonalak fentiekben leírtak szerinti tenyésztését, a sejtek inokulálását vírusrészecskékkel és a sejtek bazális tápközegben való tenyésztését addig, amíg be nem következik a sejtek lízise, és a tápközegbe kijutott újonnan elõállított vírusrészecskék kinyerését, például, rekombináns MVA alkalmazható a következõk elleni antigén expresszálására: szerzett betegségek, például minden korlátozás nélkül prosztatarák, hasnyálmirigyrák, vastagés végbélrák, tüdõrák, mellrák, melanóma; fertõzõ betegségek, például minden korlátozás nélkül AIDS (HIV vírus), hepatitis A, hepatitis B, hepatitis C, malária, veszettség, sárgaláz, japán enkefalitisz, mumpsz, kanyaró, rubeola. Az alábbiakban leírjuk a találmányhoz tartozó ábrákat. Ábrafeliratok 1. ábra: a találmány szerinti sejtvonalak egyikének szaporodási görbéje, amely a sejtek hosszú idõtartamú replikációját mutatja be. 2. ábra: Az S86N4 (EB4) (kitapadó) és EB14 (szuszpenziós) sejtek populációjának megkettõzõdési ideje. 3. ábra: A hõmérséklet hatása az S86N4 (EB4) sejtek szaporodási kinetikájára. 4. ábra: A találmány szerinti egyik sejtvonal szaporodási görbéje, amely a sejtek hosszú idõtartamú replikációját mutatja be a szérum elvonása esetén (maximum 2% szérum).. ábra: S86N4 (EB4) és EB14 sejtek adaptálódása a szérumtól mentes tápközegben (SFM) való szaporodáshoz. 7

8 6. ábra: EB14 szuszpenziós sejtek tenyészete szérumtól mentes tápközeget tartalmazó 2 literes bioreaktorban. 7. ábra: A találmány szerinti sejtvonalak egyikének (S86N16) szaporodási görbéje, amely a sejtek hosszú idõtartamú replikációját mutatja be a tápréteg elvonása esetén. 8. ábra: Madáreredetû õssejtek jellemzõ morfológiáját bemutató fénykép. N: sejtmag, n: nukleolusz és C: citoplazma (S86N99 számú izolátum, 40¹szeres nagyítás, a fénykép Sony Cyber-shot digitális fényképezõgéppel készült). 9. ábra: Kitapadó vagy szuszpenzióban lévõ, madáreredetû õssejtvonalak alkalikus foszfatáz aktivitását mutató fényképek. Fixálás (0,1% formaldehid/0,% glutáraldehid, 30 perc, 4 C) után, a sejteket 1 PBS-sel kétszer mostuk és NBT/BCIP oldattal (Nitro Blue Tetrazóliumkloride 0,37 mg/ml, ¹bróm-4-klór-3-indolilfoszfát 0,188 mg/ml, 0,1 M Tris, ph=9,, 0,0 M MgCl 2, 0,1 M NaCl) 30 percig inkubáltuk 37 C¹on. A reakciót 1 PBS-sel végzett kétszeri mosással állítottuk le és fényképeket készítettünk. A kitapadó S86N4 p87 sejtvonallal kapott endogén alkalikus foszfatáz aktivitás jellemzõ lila elszínezõdése, a sejtvonal táplálósejtek és faktorok nélkül volt tenyésztve (40-szeres nagyítás, a fénykép Sony Cyber-shot digitális fényképezõgéppel készült). B a 8 passzáláson át szuszpenzióban tenyésztett, S86N4 sejtekbõl származó EB 14 sejtvonallal kapott endogén alkalikus foszfatáz aktivitás jellemzõ lila elszínezõdése, a sejtvonal táplálósejtek és faktorok nélkül volt tenyésztve (40-szeres nagyítás, a fénykép Sony Cyber-shot digitális fényképezõgéppel készült). C S86N4 (EB4) sejtekre specifikus markerek.. ábra: CEF és kitapadó S86N4 (EB4) sejtek vírusokkal szembeni fogékonysága (a fertõzés után 72 órával, MOI=0,1). 11. ábra: CEF és kitapadó S86N4 (EB4) sejtek vírusokkal szembeni fogékonysága különbözõ fertõzési multiplicitás mellett (fertõzés után 48 órával). 12. ábra: MVA-GFP szaporítási kinetikája kitapadó S86N4 (EB4) sejteken. 13. ábra: MVA-GFP szaporítási kinetikája szuszpenziós EB14 sejteken. 14. ábra: MVA-GFP replikációja DMEM-F12 tápközegen szaporított S86N4 (EB4) sejteken. 1. ábra: Vad típusú MVA vírus replikációja DMEM-F12 tápközegen szaporított S86N4 (EB4) sejteken (MOI=0,1). 16. ábra: MVA replikációja szérumot tartalmazó tápközegen tenyésztett, szuszpenziós EB14 sejteken (MOI=0,2). 17. ábra: MVA replikációja szérumot nem tartalmazó tápközegen tenyésztett, szuszpenziós EB14 sejteken (MOI=0,01) ábra: MVA hozamok szérumot nem tartalmazó tápközegen tenyésztett, szuszpenziós EB14 sejteken (MOI=0,01). Példák 1. példa: A kitapadó sejtek elõállítása és létrehozása A tojásokat felnyitottuk, és nyitás közben elválasztottuk a fehérjét a sárgájától. A tojássárgájából közvetlenül vagy Pasteur-pipetta segítségével, vagy elõzõleg egy lyukasztó segítségével perforált gyûrûvé alakított kis abszorbens szûrõpapír (Whatmann 3M papír) segítségével eltávolítottuk az embriót. A perforáció átmérõje körülbelül mm volt. E kis gyûrûket egy sütõben szárazhõvel körülbelül 30 percig sterilizáltuk. E kis papírgyûrût a tojássárgája felszínére helyeztük és az embrió közepére helyeztük, amit így körülvett a papírgyûrû. A papírgyûrût egy kisollóval körbevágtuk és az egészet egy PBS-sel vagy fiziológiás sóoldattal töltött Petri-csészébe helyeztük. Az ily módon gyûrûvel eltávolított embriót a tápközegben megtisztítottuk a felesleges tojássárgájától és az embriókorongtól (eltávolítottuk a felesleges vitellint), és Pasteur pipettával begyûjtöttük. Az embriókat mindkét esetben fiziológiás közeget (1 PBS, Tris-Glükóz, tápközeg, és hasonlók) tartalmazó csõbe helyeztük. Ezután az embriókat mechanikusan disszociáltattuk és meghatározott tápközegben lévõ táprétegre inokuláltuk. A tenyésztésre alkalmazott elõnyös körülmények között, elõnyben részesítettük következõkkel kiegészített MacCoy vagy DF12 bazális tápközeget: 12 8% kezdeti koncentrációjú borjúszérum, 1% nem esszenciális aminosav, 1%, kereskedelmi forgalomban beszerezhetõ vitaminkeverék, 0,1 mm végkoncentrációjú nátriumpiruvát, 0,2 mm végkoncentrációjú ¹merkaptoetanol, 2,9 mm végkoncentrációjú glutamin, ng/ml végkoncentrációjú, gentamicint tartalmazó indító antibiotikum-keverék, 0 NE/ml végkoncentrációjú penicillin és 0 g/ml végkoncentrációjú sztreptomicin. A sejtek elsõ passzálásai után hamarosan már nem adtunk antibiotikumkeveréket a tápközeghez. Egyértelmû, hogy a hamarosan kifejezés általában a 3. passzálást követõ idõszakot jelenti. Nukleozidkeveréket adtunk a tápközeghez, és ezt a keveréket a fentiekben leírtak szerint készítettük [Pain és munkatársai, (1996)]. Hasonló körülmények között tesztelt és hasonló eredményeket adott bazális tápközegek közé tartozik a HamF12, Glasgow MEM és DMEM tápközeg, az utóbbit 8 mg/l végkoncentrációjú biotinnal egészítettük ki. Összehasonlításként, a biotin koncentrációja a MacCoy tápközegben 0,0 mg/l, a HamF12-ben 0,0073 mg/l volt, a kereskedelmi DMEM és GMEM tápoldat pedig nem tartalmazott biotint. A tápközeghez adandó növekedési faktorok és citokinek elõnyösen rekombináns faktorok és citokinek, és idetartoznak a következõk: egéreredetû SCF 1 ng/ml végkoncentrációban, ICF¹1 1 ng/ml végkoncentrációban, CNTF 1 ng/ml végkoncentrációban, IL 6 1 ng/ml végkoncentrációban, és az oldható IL 6 receptor 0, 1 ng/ml végkoncentrációban. Bizo- 8

9 nyos kísérletekben az elsõ passzálások során más faktorok is hozzáadhatók, például, a 3. vagy. passzálásig, lehet a tápközeghez adni 1 ng/ml végkoncentrációjú bfgf¹et és 1 ng/ml végkoncentrációjú IL 11¹et. Az inokulálást ebben a tápközegben végezzük az egéreredetû fibroblasztokból létrehozott STO sejtekbõl álló, inaktivált táprétegen. Bizonyos esetekben, a sejteket a növekedési faktorok, például madáreredetû SCF, expresszálását lehetõvé tevõ egyszerû expressziós vektorral voltak transzfektálva konstitutívan az STO sejteken, így, e tápréteg oldható és/vagy a sejtek plazmamembránjához tapadt formában állítja elõ a faktort. A sejtek e tápközegbe való kezdeti közvetlen inokulálása után, a következõ napon friss tápközeget lehet hozzáadni vagy a tápközeget részben le lehet cserélni, majd a primer sejteknél megfigyelt kitapadási aránytól függõen a rákövetkezõ napokon részben vagy teljesen le lehet cserélni. Az egyes esetektõl függõen körülbelül 4 7 nap után, az induló tenyészetet disszociáljuk és az inaktivált tápon lévõ ugyanolyan induló tápközeget tartalmazó új csészékbe transzferáljuk. Három öt passzálás után, a sejteket inaktivált, nem transzfektált vagy antibiotikum például, neomicin, higromicin, puromicin és hasonlók elleni rezisztenciagént kódoló expressziós vektorral transzfektált STOtáplálósejteken tenyésztjük. Nagyjából passzálás után, a sejtektõl fokozatosan elvonjuk a növekedési faktorokat és citokineket. A leírás szerinti értelemben egyértelmû, hogy a fokozatos elvonás kifejezés növekedési faktorok növekedési faktoronkénti, vagy növekedési faktorok csoportjának növekedési faktorcsoportonkénti eltávolítását jelenti a tápközegbõl. A találmány elsõ megvalósítási módjában, az egyik passzáláskor elõször az SCF¹et, majd két vagy három passzálással késõbb egy másik növekedési faktort, például az IGF- 1¹et, távolítjuk el. Amennyiben a sejtek nem mutatnak morfológiai elváltozást vagy átlagos osztódási arányuktól való eltérést, a további faktorokat, például CNTF¹t és IL¹6¹ot, is eltávolítjuk. A találmány egy második elõnyös megvalósítási módjában, a növekedési faktorok elvonása növekedési faktorok csoportjáról növekedési faktorok csoportjára történik. Elõször eltávolítjuk a növekedési faktorok SCF, IL6, IL6R és IL11 alkotta elsõ csoportját, majd ezt követõen az IGF1 és CNTF alkotta második csoportot. A találmány harmadik megvalósítási módjában, ez az eltávolítás is drasztikus lehet. Ebben az esetben egyszerre távolítunk el minden faktort. Ezt követõen a sejteket megfigyeljük és csak akkor passzáljuk át pár nappal késõbb, ha azok proliferációs aránya módosult. Ez utóbbi megoldást alkalmazzák a gyakorlatban. Különféle izolátumokhoz lehet így hozzájutni és nagyon hosszú idõn át fenntartani. Egyértelmû, hogy a nagyon hosszú ideig kifejezés néhány hét nagyságrendû, de minimálisan 0 napot jelentõ, elõnyösen napnál hosszabb, idõkorlátozás nélküli idõtartam. Hatszáz napnál hosszabb idõtartamokat figyeltünk meg. Az alkalmazott hordozótól (support) függetlenül, minden kitapadó sejt proteolitikus disszociációs enzimmel, például pronáz, kollagenáz, diszpáz, tripszin, és hasonlók, kezelve ledisszociálnak. Elõnyös, ha bármilyen lehetséges állati eredetû szennyezés elkerülése végett baktériumból származó proteolitikus enzimet alkalmazunk. E sejtek például a 8. ábrán bemutatott fényképen látható specifikus morfológiájú embrionális õssejtekre hasonlítanak. E specifikus morfológiára a kis méret, magas sejtmag/citoplazma arány, legalább egy világosan látható nukleoluszt tartalmazó sejtmag és igen kis citoplazma a jellemzõ. E sejteket a többé vagy kevésbé kompakt szilárd tömeg formájában való szaporodás jellemzi. A kitapadó és nem kitapadó sejtek számos antitesttel keresztreakciót adnak [lásd például Pain és munkatársai, (1996); és US számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi irat és EP számú európai szabadalmi irat]. Az endogén telomerázaktivitási komponens is jelen van is fontos faktor e sejtek õsként aposztrofált tulajdonságában. Különbözõ izolátumokból sejteket nyertünk és tartottunk fenn hosszú ideig. Az 1. táblázat bemutatja ezen izolátumok néhány jellemzõjét. 1. táblázat Név Faj Start Leállás Napok Passzálás Generáció S86N16 WL3 Valo4 S86N4 csirkeeredetû S86N csirkeeredetû WL csirkeeredetû Valo csirkeeredetû S86N Meg kell jegyeznünk, hogy a leállás kifejezés nem a sejtszaporodás végének idejével azonos, hanem a sejttenyésztésnek a vizsgálatot végzõ személy által szabadon választott leállása idõpontjának felel meg. A generációszám kiszámítása az X=2 n képlettel történt 60 vagy az X a sejtek elméleti kumulatív száma. E szám akkortól válik elérhetõvé, amikor a sejtek a passzálások és az egyes inokulálások során számlálásra kerülnek. A tenyészetek teljes története így elérhetõ. Az S86N4 sejteket EB4-nek is nevezzük. 9

10 2. példa: A sejtek passzálása Az õssejtek, különösen a szomatikus õssejtek és az embrionális õssejtek egyik jellemzõje azok jelentõs ideig tartó in vitro proliferációs kapacitása. A sejtek szaporítása és passzálása céljából, passzázsolás elõtt néhány órával a tápközeget megváltoztattuk és frissre cseréltük. Az 1. ábrán látható görbe a sejtszaporodási és létrehozási profilt mutatja be. 3. példa: Megkettõzõdési idõ és átlagos osztódási idõ 3.1. A megelõzõ példában bemutatott sejttenyészetbõl és sejtekbõl kiindulva az átlagos osztódási idõ kiszámításra került. Az összes, egymástól függetlenül elõállított izolátum esetében, a proliferációs arány enyhén emelkedett az egymás utáni passzálások során, ami az átlagos osztódási idõ változékonyságát okozta a sejtek létrehozása alatt. A kitapadt fázisban, eredetileg az inaktív táprétegre sejteket inokuláltunk és szabályos idõközönként, sejt/0 mm¹es csésze ( cm 2 ¹es csésze) állandó inoklulációs sûrûségnél passzáltuk. A 2. táblázat mutatja be három létrehozott sejttípusra a tenyésztési idõ függvényében megadott kettõzõdési idõt (d) és átlagos osztódási idõt (MDT, órákban). Megfigyeltük, hogy az átlagos kettõzõdési idõ a létrehozás során csökken. Sejtek/napok S86N16 (d) 0,30 0,63 1,00 0,86 1,13 1,1 1,47 1,70 1,94 1,0 1,9 S86N16 (MDT) ,9 21,2, ,1 12, ,6 S86N4 (d) 0,49 0,89 0,89 1,4 2,1 x x x x x x S86N4 (MDT) 49 26, , 11,1 x x x x x x Valo4 (d) 0,03 0,61 1,00 1,17 1,26 1,03* 1,08* 1,2* x x x Valo4 (MDT) >48 39,3 24, 19 23,3 22,2 19,2 x x x * A létrehozás során a Valo sejteket tápréteg jelenléte nélküli mûanyag hordozón passzáltuk. A megkettõzõdési idõ csökken, majd amikor a sejtek hozzászoknak az új környezethez, ismét emelkedik. Az átlagos megkettõzõdési idõt (d) a napokkal megadott idõszakra állapítottuk meg az alábbi képlet segítségével: d=[1/log2 (LogX2/X1)] 1/(T2 T1), ahol X2 és X1 a sejtek összes száma a T2 és T1 idõpontokban. A képlet az 1. példában megadott X=2 képlettel kiszámított a generációszám (N) kiszámításának közvetlen eredménye. Ezután, az átlagos osztódási idõt (MDT) a 24 óra d¹vel való elosztásával kapjuk meg órákban A csirkék testhõmérséklete 39 C. Az S86N4 (EB4) és EB14 sejtek szaporodási kinetikájának elemzése így kezdetben 39 C¹on történt. Ilyen körülmények mellett a sejteket igen gyors, általában 1 óra közötti létrehozási idõ jellemzi. 4. példa: Sejttenyésztési hõmérséklet 39 C¹on az S86N4 (EB4) és EB14 sejtek igen gyors sejtciklusa valószínûleg nem optimális az MVA vírus hatékony elõállításához. Ennélfogva, a 37 C és 3 C hõmérsékleteket is analizáltuk (3. ábra). A vártak szerint, 37 C¹on a sejtciklus lecsökkent. Az ilyen körülmények elvileg jobbak a vírusszaporításhoz és így ezt választottuk ki az alábbiakban leírt MVA kísérletekhez. Helytálló megemlíteni azt, hogy az S86N4 (EB4) és EB14 sejtek 3 C¹on is szaporíthatók, bár a kinetika lényegesen alacsonyabb. Az S86N4 (EB4) és EB14 sejtek alacsony hõmérséklethez (3 C, sõt akár 33 C) való adaptálása a hõérzékeny, élõ gyengített vírusvakcinák elõállítására különösen hasznos példa: A szérum szintjének szabályozása a sejtvonalak proliferációjához.1. Alacsony szérumkoncentrációjú tápközeg E vonalak elõállítása során, az alkalmazott tápközeg valamilyen, különféle adalékokkal például, nem esszenciális aminosavak, vitaminok és nátriumpiruvát kiegészített alaptápközeget (DMEM, GMEM, HamF12, McCoy stb.) tartalmazó hagyományos tápközeg volt. E komplex tápközeg borjúszérumot tartalmaz, ami a tenyészet központi összetevõje marad, még akkor is, ha fokozatosan, máshonnan származó összetevõk, így növényi komponensek, is alkalmazhatók. Bemutatunk egy olyan eljárást, amelyben a sejtek szabályozhatók és alacsony arányban jelen lévõ borjúszérumhoz szoktathatók. Így el lehet érni, hogy alacsony szérumtartalom (például a S86N16 sejtek esetében 2%) a sejtek magas proliferáció mellett (osztódási idõ >1) maradjanak fenn. A 4. ábrán bemutatott görbék illusztrálják a szérum relatív csökkentését az adott S86N16 sejtípusra. A megkettõzõdési idõ és az átlagos osztódási idõ is kiszámításra került (lásd 3. táblázat). Meg kell jegyeznünk, hogy az átlagos osztódási idõ a szérumtartalom relatív csökkentésének függvényében nõ. A tenyészetben eltöltött bizonyos idõ után, mindazonáltal megfigyeltünk egy bizonyos helyreállási idõt az említett körülmények között. Ez az idõ azonban kevesebb mint 24 óra (d>1), ami ipari tételben még (a viszonylag 2%¹os szérumkoncentrációnál is) már igen elõnyös proliferációnak felel meg. Ezen idõ növelése és a te-

11 nyésztés körülményeinek további optimalizálása céljából alkalmazandó különféle metabolitikumokkal kapcsolatos fejlesztéseket további célul tûzhetjük ki. 3. táblázat S86N16 sejtek kettõzõdési ideje és átlagos osztódási ideje Körülmény % 7,% 3,7% 2% d 2,02 1,1 1,47 1,08 MDT 11,9 1,8 16,3 22,2 A példák a %¹os körülményekre a p4. és p179 közötti, a 7,%¹ra a p198 és p176 közöttibõl, a 3,7%¹ra a p224 és a p1 közöttibõl, a 2%¹ra pedig a p216 és p199 közötti passzálásból származnak..2. Adaptálás szérummentes tápközeghez és bioreaktorban való szaporodáshoz Az egyik fõ elõrelépést az S86N4 (EB4) és EB14 sejtek szérummentes tápközeghez való adaptálásával sikerült elérni. Számos formulációt teszteltünk és számos szérummentes tápközeg-formulációt sikerült azonosítani, amely lehetõvé teszi az S86N4 (EB4) és EB14 sejtek hatékony szaporodását (. ábra). Ráadásul, az EB14 sejtek szérumot tartalmazó és szérummentes tápközegben való tenyésztésének léptéke tovább növelhetõ, mivel 2 literes bioreaktorokban hatékony szaporodást sikerült reprodukálhatóan kimutatni (6. ábra). Továbbá, EB14 sejtek 3 literes kevert tartályos bioreaktorokban is hatékonyan szaporíthatók és 2 millió sejt/ml-nél nagyobb sûrûség érhetõ el. 6. példa: A tápréteg megvonása a sejtektõl A tenyésztés kiindulási körülményei között, az inaktivált sejtek rétegének jelenléte a fentiekben leírtak szerint szükségesnek tûnt az embrionális õssejtek kinyerésére. Számos passzálást követõen e táprétegre tovább már nem tûnik szükségesnek. Csak a tenyészet által kezelt mûanyag tûnik fontosnak, valóban, bizonyos eukariótasejtek egyik jellemzõje a kitapadt formában történõ proliferáció. A sejtek kitapadásának elõsegítése céljából, különféle mûanyagfelületeket alkalmaztunk tenyészet által kezeltként. A gyártás során e mûanyagok olyan kezelésen esnek át, amely a felszínt olyan töltéssel látja el, amely töltések elõmozdítják a sejtek extracelluláris mátrixának kitapadását. Ezzel szemben, a sejttenyésztésben alkalmazott, gyakran bakteriológiai minõségûnek nevezett, nem kezelt mûanyag felülete specifikus táplálók (feeder) hozzáadásával nincs kezelve. A sejtek ehhez nagyon nehezen, vagy egyáltalán nem tudnak kitapadni, vagy a kitapadás gyakran drasztikus morfológiai és viselkedésbeli változásokkal jár. A két mûanyagminõség megkülönböztetése teszi lehetõvé az elvégzett inokulációktól függõen az eltérõ viselkedésû sejtek elõállítását. Néhány passzálás után, a tenyészetek inaktív táplálótól való fokozatos elvonása teszi lehetõvé, hogy tenyésztéssel kezelt mûanyagon közvetlenül inokulált õssejtek homogén tenyészeteihez jussunk. S86N16 sejtek esetében, az inaktivált tápláló jelenlétében és hiányában fenntartott sejtek összehasonlító szaporodási görbéit a 7. ábra mutatja be. A sejtek ilyen adaptálása progresszív azért, hogy a táplálón eredetileg fenntartott sejtek õssejtjellemzõjüket ne veszítsék el. Így készítünk progresszív származékokat. Az elvonási folyamat eredményeként jutottunk a mûanyagon proliferálódó sejtekhez. A 4. táblázatban, az osztódási idõk mutatják a sejtek érzékenységét a környezetükre. Akárcsak a szérum progresszív elvonása esetén, a meghatározott körülmények között végzett néhány passzálás után a sejtek adaptációját értük el, ami helyreállító hatású volt. 4. táblázat Körülmény 1,2 0, 0,3 Mûanyag d 1,9 1,84 1,39 1,42 MDT 12, ,3 16,9 A 2 6, 0, 6 és 0,3 6 táplálósejtre a p14 és p131 közötti passzálásból, önmagán a mûanyagon fennálló körülményre pedig a p161 és p139 passzálásból származnak a példák. 7. példa: Növekedési faktorok elvonása a sejtektõl A kezdeti tenyésztési körülmények között a növekedési faktorok jelenléte szükséges. Lehetséges nagy vonalakban megkülönböztetni az ilyen faktorok két családját: a cikotineket és a trófikus faktorokat. A citokinek elsõsorban olyan citokinek, amelyek a gp 130-fehérjével kapcsolt receptoron keresztül hatnak. Így a LIF, interleukin 11, interleukin 6, CNTF, onkosztatin és a kardiotrofin hatásának módja hasonló, és magában foglalja receptorszinten egy specifikus lánctípus összegyûjtését és annak gp 130-fehérjével történõ összekapcsolódását monomer vagy néha heterodimer formában. Néhány esetben a receptorok szolubilis formájának kombinálása amely formát többek között interleukin 6 és CNTF receptoraira írták le lehetõvé teszi a megfigyelt osztódást elõsegítõ (proliferatív) hatás fokozódását. Korábban kimutatták, hogy ezen citokinek legalább egyikének hozzáadása szükségesnek tûnt embrionális õssejtek kinyeréséhez. A trófikus faktorok fõleg a SCF, IGF¹1 és bfgf, amelyeket a tenyésztés kezdetén is alkalmazunk, mint fent leírtuk. Jelenlétük szükséges a sejtek kinyeréséhez és amplifikálásához is. Ezen növekedési faktorok mennyiségének progresszív csökkentésével lehetséges néhány passzázs után olyan tenyésztési körülményekhez jutni, amelyek lehetõvé teszik az embrionális vagy szomatikus õssejtek osztódását exogén növekedési faktor hozzáadása nélkül. Az ezen sejtek jellemzéséhez használt különbözõ markerek mindig pozitívak a faktorok nélkül fenntartott sejtekre. 11

12 8. példa: Az alkalmazott tápközegek összehasonlítása Az eltérõ tápközegekbe oltott sejteket nem ugyanolyan gyakorisággal tudjuk kinyerni. A tápközegek összetételének összehasonlítása különösen nehézzé teszi a komponensek egyikének azonosítását. Valószínûbbnek tûnik, hogy a teljes kombináció teszi lehetõvé a sejtek fiziológiás állapotának javítását. Az elõnyös tápközegek között szerepel a Ham F12 tápközeg, a MacCoy tápközeg, a DMEM tápközeg, a DMEM- F12 tápközeg és a biotinnal dúsított DMEM tápközeg. Adott izolátumból kiindulva, az adaptációs kísérleteket ezekben a különbözõ tápközegekben végezzük el. 9. példa: Nem kitapadó sejtek elõállítása Az õssejtek egymást követõ passzálása során, közvetlenül a bakteriológiai edénybe, magas sejtsûrûséggel történõ beoltás lehetõvé teszi, hogy néhány passzázs után olyan embrionális sejteket nyerjünk, amelyek mentesek szubsztrátjuktól, és amelyek szabályos kis aggregátumok formájában szuszpenzióban osztódnak. Ezt az osztódást néhány passzázs után elõsegíti a nagyobb hígítás, a mechanikai disszociáció és az, ha nem használunk proteolitikus enzimeket. Általában kevertetjük a tenyészetet, ez azonban nem jelent megkülönböztetõ tényezõt, miáltal nem kitapadó 1 2 sejteket nyerhetnénk. Éppúgy, mint a kitapadó sejteknek, ezeknek a sejteknek is õssejtekre jellemzõ morfológiája van, azaz kisméretûek, nagy a sejtmag/citoplazma arányuk, sejtmagjuk legalább egy sejtmagvacskát (nukleoluszt) tartalmaz, amely tisztán látható, és citoplazmájuk kisméretû. A sejtek kis aggregátumokban szaporodnak, amelyek többé-kevésbé kompaktak (8. ábra). Ezek a nem kitapadó sejtek számos antitesttel keresztreaktivitást mutatnak, amint azt Pain és munkatársai (1996) ismertetik. A sejtek pozitívak endogén telomerázaktivitásra is (amint azt EB1¹, EB4- és EB sejtekre a. példában bemutatjuk). A nem kitapadó fázisban a sejtek gyors osztódást mutatnak különbözõ tápközegekben. A kezdeti beoltási sûrûség és a friss tápközeg nagyon rendszeres pótlása magas sejtsûrûséget eredményez, amely meghaladhatja az 1 6 sejt per ml¹t is. Az. táblázat összefoglalja néhány izolátum fõbb jellemzõjét (szülõi sejtek, a szuszpenzióvá alakítás kezdeti passzázsa, a szuszpenziós tenyészetben történõ fenntartás napjainak száma, a passzázsok száma, és a tenyésztés önkéntes leállítása elõtt nyert generációk száma). Megjegyezhetjük, hogy a szuszpenzióvá alakításhoz szükséges passzázs folyamata egyik izolátumról a másikra változhat (lásd az EB1 és az EB14 izolátumot) és változhat az osztódás sebessége is (lásd EB3 és EB14).. táblázat Név Szülõi sejtek Kezdeti passzázs Start Napok Passzázsok Generációk EB 1 S86N16 p EB 3 S86N16 p EB 4 S86N4 p EB S86N4 p EB 14 S86N4 p Megjegyezzük, hogy a start kifejezés megfelel a nem kitapadásra bírt sejteknek. Azt tapasztaltuk továbbá, hogy a tápréteggel vagy anélkül osztódott, kitapadó sejtekbõl bármely pillanatban nyerhetünk nem kitapadó sejteket néhány passzázs után.. példa: A létrehozott sejtek jellemzése A hosszú tenyésztési ideig fenntartott õssejteket ugyanolyan kritériumok szerint jellemeztük, mint a fent leírtakat (Pain és munkatársai: 1996). Így tehát lehetséges rendszeresen detektálni az endogén alkáli-foszfatáz-aktivitást, amelyet a 9a 9b. ábrákon bemutatott fotók szemléltetnek, továbbá az endogén telomerázaktivitást (9c. ábra), továbbá specifikus antitestekkel való reaktivitást, így például az SSEA¹1 (TEC¹01) és az EMA¹1 antitestekkel való aktivitást. A sejtek létrehozása során az egyik fontos kritérium a telomeráz jelenléte. Különbözõ teszteket végeztünk a sejtek tenyészetben történõ fenntartása során a TRAP detektáló reagenskészlet alkalmazásával (Telomerase PCR Elisa, Roche). A sejteket pozitívnak detektáltuk különbözõ passzázsok után tenyészetben. Így tehát a telomerázaktivitás detektálható az S86N16 sejtek, az S86N4 (EB4) sejtek esetében, illetve az azokból nem kitapadó formában származtatott EB1¹, EB4- és EB¹ sejtek esetében is (lásd a 6. táblázatot). A CEFeket ( Chicken Embryonic Fibroblasts ), amelyeket primer tenyészetben tartottunk fent, negatívnak tekintettük. A reagenskészlet negatív küszöbértékként az OD<0,2 küszöbértéket javasolja. Minden analízist 00 sejttel ekvivalens mintán hajtottunk végre. S86N16 6. táblázat A telomerázaktivitás vizsgálata különbözõ sejtvonalban, különbözõ passzázsoknál Sejtek Passzázs Telomeráz OD p12 1,7 p29 2,8 p18 0,97 p4 0,9 12

13 Sejtek Passzázs Telomeráz OD S86N16 EBI p134 1,1 p0 0,87 S86N4 (EB4) p8 1,1 p66 0,96 p94 1,2 EB4 p112 1,4 EB p112 0,94 CEF* P4 0,07 * CEF: Csirkeembrió-fibroblaszt Különös jelentõsége van annak, hogy a találmány szerinti sejtek megõriztek bizonyos lényeges õssejti jellemzõt. A sejtek egy sor õssejt-specifikus markert expresszálnak, amelyekrõl ismert, hogy jelen vannak egéreredetû, csirkeeredetû és humán embrionális õssejtekben (ilyen például az alkáli-foszfatáz, SSEA-1, EMA-1, telomeráz) (9. ábra). Mint várható volt, ezen markerek expressziója megszûnik, ha a sejtek differenciálódását váltjuk ki retinsav (RA) vagy DMSO (7. táblázat és 9c ábra) hozzáadásával, kísérleti úton. A sejtek korlátlanul replikálódjak in vitro (1. ábra); néhány kiválasztott sejtvonalat több mint egy évig tenyésztettünk konkrét akadály, például differenciálódás nélkül. 7. táblázat: ES sejtspecifikus markerek: a markerek expressziója csökkent retinsavval kiváltott differenciálódás hatására Markerek 6. táblázat (folytatás) Retinsav nélkül Retinsavval Alkáli-foszfatáz ++++ SSEA-1 90 < EMA-1 90 Telomeráz aktivitás (OD) >1, <0,2 Az SSEA1- és az EMA1-markerek arányát a jelölt sejtek %¹ában fejeztük ki. 11. példa: A sejtek transzfektálása és indukálása A hosszútávon szaporodásban tartott sejteket különbözõ expressziós plazmidokkal transzfektáljuk. Kimutatták, hogy a madár õssejtek transzfektálhatók (Pain és munkatársai 1996). Különösen a nem kitapadó sejteket transzfektáljuk; a különbözõ válogatórendszerek lehetõvé teszik, hogy a stabilan transzfektált sejteket azonosítsuk (sejtek válogatása, határhígítás és hasonlók). Ezeket a genetikai módosításokat végrehajtottuk az õssejt differenciálatlan állapotában. Ha egyszer módosítást megvalósítottuk, a sejtet indukáljuk, miáltal differenciálódásra bírjuk, akár spontán módon, akár differenciálódást indukáló anyag hozzáadásával. Ebben az esetben használhatunk retinsavat, M koncentrációkban vagy dimetilszulfoxidot 1 2%¹os végsõ koncentrációban, vagy nátrium-butirátot 4 8 M koncentrációkban vagy forbol-észtert (TPA, PMA és hasonlók), vagy lipopoliszacharidokat (LPS) 1 g/ml végsõ koncentrációban. Egy további példában a sejtek embrioid testeket képezhetnek a szuszpenzióban, amely embrioid testek rábírhatók arra, hogy az õket alkotó sejtek disszociációja után vagy disszociációja nélkül mûanyaghoz tapadjanak ki. Ezek a differenciált sejtek azután osztódhatnak, de hosszútávon osztódási képességük korlátozottabb. Ha célbavesszük egy, a sejtek osztódását befolyásoló gén genetikai módosítását, ezeket a differenciálódott sejteket is hosszútávon osztódásra képessé tehetjük. 12. példa: Protokoll nem kitapadó madársejtvonal (EB1) vírussal történõ fertõzésére A sejtek amplifikálása Az EB1 vagy EB14 sejteket tápközegbe inokuláljuk, elõnyösen MacCoy-féle A tápközegbe, HAMF12 tápközegbe vagy DMEM tápközegbe, vagy bármely egyéb megfelelõ tápközegbe, amely % szérumot tartalmaz. Az inokulálást 0,2 6 sejt/ml koncentrációban végezzük 0 ml kezdeti térfogatra számítva, általában. A sejteket 39 C¹on 7,% CO 2 koncentráció mellett tartjuk fenn, kevertetés közben. Azon 3¹4 napon keresztül, amíg az amplifikáció eltart, minden nap friss tápközeget adunk a sejtekhez annak érdekében, hogy sejt/ml koncentrációt érjünk el ml végsõ tenyésztérfogatban. A szuszpenzióban levõ sejteket összegyûjtjük és percig centrifugáljuk, mintegy 00 rpm-mel. A sejteket újra felszuszpendáljuk 0 ml 1 PBS-ben (sós foszfátpuffer). A sejteket ezután megszámoljuk, centrifugáljuk és az ülepített sejteket 3 6 sejt/ml végsõ koncentrációban, szérummentes tápközegben felvesszük. Ezután több csövet készítünk el ilyen körülmények között, amelyek mindegyike 3 6 sejtet tartalmaz. A vírus elkészítése és fertõzés Az ismert titerû vírustörzs állományt gyorsan kiolvasztjuk 37 C¹on, és a végsõ fertõzéshez szükséges koncentráció 00-szeresének megfelelõ titerre hígítjuk szérummentes tápközeggel. A sejteket az adott vírussal fertõzzük, 0,01 0, m. o. i. értéknél ( multiplicity of infection ) a vírus típusának megfelelõen, ami 0,1 0 térfogat% vírusszuszpenzió hozzáadását jelenti a sejtüledékhez. Miután a szuszpenziót a vírus számára optimális hõmérsékleten tartjuk 1 órán keresztül (általában C¹on), a sejteket újracentrifugáljuk és a tápközeget gondosan eltávolítjuk. Ez a lépés gyakran szükségesnek bizonyul annak érdekében, hogy korlátozzuk a kiindulási vírus hatását az ezt követõ eljárási lépések során. Az egyik lehetõség az, hogy közvetlenül meghígítjuk a sejteket, anélkül, hogy újracentrifugálnánk õket, szérumtartalmú tápközeggel (% szérum) 0,2 1 6 sejt/ml végsõ koncentrációnál, majd újra adott körülmények között tartjuk azokat. 13

14 A felülúszó és a sejtek begyûjtése A víruskinetika és bizonyos vírusok lehetséges citopátiás hatásától függõen 2 4 napig inkubáljuk a szuszpenziót adott körülmények között, majd a sejteket vagy a sejttörmeléket tartalmazó tápközeget begyûjtjük. A vírusoktól függõen lehet, hogy csak az üledék vagy a felülúszó érdekes számunkra, illetve tartalmaz vírusrészecskéket. A sejteket begyûjtjük és centrifugáljuk. Az összegyûjtött felülúszót újracentrifugáljuk percig 0 rpm-nél és a részecskék tisztítása elõtt 80 C¹on tároljuk. A titrálás elvégzése érdekében begyûjtünk egy adott részt (aliquotot). A sejtüledéket ml szérummentes tápközegben vesszük fel, szonikáljuk és percig 0 rpm-nél centrifugáljuk. A kapott felülúszót 80 C¹on tároljuk a tisztításig és egy aliquot rész titrálásáig. A különbözõ körülmények között végrehajtott vírusfertõzés és ¹termelés hatékonyságát összehasonlítjuk. A citopátiás hatású vírusok esetében a titrálásokat általában lízissel kapott plakkok módszerével végezzük. 13. példa: Protokoll kitapadó madársejtvonal (S86N4) vírussal történõ fertõzése A sejtek elkészítése A sejteket 48 órával a fertõzés elõtt T10-flaskákba inokuláljuk 0,03 és 0,06 6 sejt/cm 2 koncentrációban, tápközegben, elõnyösen MacCoy-féle A, HAMF12 vagy DMEM tápközegben, vagy bármilyen más, megfelelõ tápközegben, amely % szérumot tartalmaz. A sejteket 39 C¹on 7,% CO 2 koncentráció mellett tartjuk fenn. Fertõzés Az ismert titerû vírustörzsállományt gyorsan kiolvasztjuk 37 C¹on és a végsõ fertõzéshez szükséges koncentráció 00-szeresének megfelelõ titerre hígítjuk szérummentes tápközeggel. A sejteket az adott vírussal fertõzzük, 0,01 0, m. o. i. értéknél ( multiplicity of infection ) a vírus típusának megfelelõen, ami 0,1 0 térfogat% vírusszuszpenzió hozzáadását jelenti a sejtmonoréteghez. A fertõzést általában a lehetõ legkisebb mennyiségû tápközegben ( ml, 7 cm 2 ¹es flaska esetében) hajtjuk végre 0% szérumot tartalmazó tápközegben. Miután a vírus számára optimális körülmények között inkubáljuk a sejteket, általában C¹on, ml %¹os tápközeget adunk a flaskákhoz. Bizonyos esetekben a sejteket PBS-sel moshatjuk, annak érdekében, hogy eltávolítsuk azon részecskéket, amelyek a sejtekhez tapadhattak. Citopátiás vírus esetében a sejteket naponta megfigyeljük a fertõzés után annak érdekében, hogy kövessük a sejtlízis megjelenését, amely a fertõzés jó elõrehaladását jelzi A felülúszó és a sejtek begyûjtése A víruskinetika és bizonyos vírusok lehetséges citopátiás hatásától függõen 2 4 napig inkubáljuk a szuszpenziót adott körülmények között, majd a felülúszót, a sejteket és a sejttörmeléket tartalmazó tápközeget begyûjtjük. A vírusoktól függõen lehet, hogy csak az üledék vagy a felülúszó érdekes számunkra, illetve tartalmaz vírurészecskéket. A sejteket begyûjtjük és centrifugáljuk. Az összegyûjtött felülúszót újracentrifugáljuk percig 0 rpm-nél és a részecskék tisztítása elõtt 80 C¹on tároljuk. A titrálás elvégzése érdekében begyûjtünk egy adott részt (aliquotot). A sejtüledéket ml szérummentes tápközegben vesszük fel, szonikáljuk és percig 0 rpm-nél centrifugáljuk. A kapott felülúszót 80 C¹on tároljuk a tisztításig és egy aliquot rész titrálásáig. A különbözõ körülmények között végrehajtott vírusfertõzés és ¹termelés hatékonyságát összehasonlítjuk. A citopátiás hatású vírusok esetében a titrálásokat általában lízissel kapott plakkok módszerével végezzük. 14. példa: Módosított Ankara vakciniavírus (MVA) replikációja EB4- és EB14 sejtvonal kitapadó és nem kitapadó madárõssejtjein Az EB4 (S86N4) és az EB14 sejteken kísérletsorozatot hajtottunk végre, hogy meghatározzuk az MVA-fertõzéssel szembeni érzékenységüket az MVA szaporodásának kinetikáját és a vírustermelés hozamát. Az ezen vizsgálatokban alkalmazott MVA vírus vagy GFP-riporter ferhérjét expresszáló, rekombináns MVA-vektor volt (MVA-GFP) vagy nem rekombináns MVA vírus. Kontrollsejtekként frissen készített csirkeembrió-fibroblasztokat (CEF) használtunk minden kísérletben Biztonságossági megfontolás Az MVA vírust (titere: 2, 7 TCID 0/ml 0, ml¹es edényekben) lefagyasztva kaptuk. Biztonsági okokból az MVA vírust és a fertõzött sejteket ellenõrzött körülmények között tartottuk ( 80 C¹on fagyasztóban), és a szennyezett mûanyag anyagot hipokloridoldatba helyeztük több mint 1 órára, majd alapos és teljes inaktiválást hajtottunk végre autoklávval, amihez zacskóba helyeztük el azt Vírustermelés Kitapadó S86N4 (EB4) sejtek 1 6 kitapadó sejttel oltunk be egy 0 mm¹es lemezt a fertõzés elõtti napon, ml tápközegben. 24 órával késõbb eltávolítjuk a tápközeget, a sejteket 37 C¹on inkubájuk az inokulummal (2 ml szérummentes tápközeg, 0,01 fertõzési multiplicitásnál vagy 0,1 TCID/sejt értéknél). 1 órával késõbb az inokulumot eltávolítjuk és ml elõmelegített tápközeget adunk a sejtekhez, majd azokat 37 C¹on % CO 2 mellett inkubáljuk. A víruskészítéshez a fertõzött sejteket kaparóval begyûjtjük, azokat 0 ml Falcon csövekbe visszük át és 10 RPM-nál lecentrifugáljuk szobahõmérsékleten. A felülúszót (extracelluláris vírusok, EV) begyûjtjük és a sejteket (intracelluláris vírusok, IV) 1 vagy 2 ml tápközeggel hígítjuk. Az EV és az IV minták három fagyasztási-kiolvasztási ciklusok mennek keresztül, majd szonikáljuk õket. A mintákat szobahõmérsékleten 0 rpm-mel percig centrifugáljuk, majd aliquot részeket veszünk belõlük és titrálásig 80 C¹on tartjuk õket. 14

15 EB14 sejtek szuszpenziója 0,4 6 /ml EB14 sejtet oltunk be 40 ml tápközegbe (16 6 sejt) 12 ml forgatásra alkalmas edényben a vírus inokulum hozzáadása elõtti napon 0,01 m. o. i. értéknél vagy 0,1 TCID/sejt értéknél a tápközegbe. Miután a vírussal 1 órán keresztül inkubáljuk a sejteket, 80 ml elõmelegített tápközeget adunk hozzájuk. Az inkubálást 37 C¹on fenntartjuk % CO 2 koncentráció mellett és a kívánt forgási körülmények között. A fertõzött sejteket ezután a fertõzés után különbözõ idõpontokban begyûjtjük, majd 0 ml Falcon csövekbe visszük át õket, és 10 rpm-mel szobahõmérsékleten centrifugáljuk. A felülúszót (extracelluláris vírusok, EV) begyûjtjük és a sejtüledéket (intracelluláris vírusok, IV) vagy ml tápközegben hígítjuk. Az EV és IV mintákat három kiolvasztási-fagyasztási ciklusnak vetjük alá, majd szonikáljuk azokat. Miután percig 0 rpm-mel centrifugáljuk õket, a mintákból aliquot részeket veszünk és az összes mintát 80 C¹on tartjuk titrálásig Vírustitrálás MVA titrálása a CI végpont hígítási módszerrel Az MVA vírusok titrálását a TCID 0 végpont hígítási módszerrel végezzük CEF vagy DF¹1 sejteken. A vizsgálati eljárás meghatározza, hogy a minta a fertõzés kiváltásához elegendõ dózisban tartalmazzon fertõzõ vírust. A TCID 0 értéket úgy határozzuk meg, mint azt a hígítási értéket, amely citopátiás hatást váltott ki (CPE) a sejttenyészetek kumulatív számának felében. Egyetlen 96 lyukú, lapos fenekû tálca szükséges egyetlen vírusminta titermeghatározáshoz. Röviden, CEF sejtet adunk minden egyes lyukhoz 0 l térfogatban. Nyolc sorban, soronként 11 lyukat oltunk be. A nyolc sor a vírusminta tízszeres hígításait tartalmazza sorozatban (azaz 2 9 ). Minden egyes sorozathígításhoz 1 ml¹es keveréket készítünk szérummentes tápközegben és a keverék 0 l¹ét osztjuk szét tíz megfelelõ hígítást tartalmazó kútban, a 11. sor pedig a kontrollként alkalmazott, nem fertõzött lyukak sora. A 96 lyukú tálcát 37 C¹on inkubáljuk % CO 2 mellett. nappal késõbb a vírustitert a Reed Muench-módszerrel számítjuk ki és feljegyezzük a pozitív CPE¹t adó lyukakat Az MVA fertõzéssel szembeni érzékenységre kapott eredmények és titrálás Az EB4 (S86N4) és EB14 sejtek MVA fertõzéssel szembeni belsõ érzékenységét elõször a rekombináns MVA-GFP vektor alkalmazásával vizsgáltuk meg. Ezt a konkrét vektort azért választottuk ki ezekhez a vizsgálatokhoz, hogy egyszerûsítsük a fertõzött sejtek követését és számszerû meghatározását. Az EBx és a CEF sejteket különbözõ fertõzésû multiplicitásokkal (m. o. i.) kezeltük, majd a sejteket fluoreszcensmikroszkópiával és fluorocitometriával analizáltuk néhány nappal a fertõzés után. Amint a. és 11. ábrán bemutatjuk, minden kitapadó EB4 sejt, amelyek még 48 órával a fertõzés után is életképesek, a GPF fehérje erõs expresszióját mutatják, míg igen alacsony, 0,1 TCID 0 /sejt m. o. i. értéknél is. Megjegyzendõ, hogy a. ábra azt is szemlélteti, hogy az EB4 és az EB14 sejtek sokkal kisebbek, mint a CEF sejtek. Összességében ezek az eredmények világosan bemutatják a kitapadó EB4 és EB14 sejtek nagyfokú érzékenységét MVA fertõzéssel szemben Az alábbi 8. táblázatban felsoroltuk az elvégzett, különbözõ MVA-GFP fertõzési kísérletekben kapott eredményeket. Minden mintát kétszer titráltunk. 8. táblázat A titráláseredmények Kísérleti körülmények A fertõzés multiplicitása (m. o. i.) A fertõzés után eltelt idõ (Pl) (óra) Titrálás (TCID 0 /ml-ben) S86N4 (EB4) sejtek DMEM-F12 tápközegben (0 mm átmérõjû edény) EB14 sejtek DMEM-F12 tápközegben (1 ml¹es forgatható flaskák) CEF sejtek HAM- F12 tápközegben (0 mm átmérõjû edény) 0, ,7 96 8,7 0,1 72 7, 72 7,63 0,2 48 7, 72 7,63 0, , 96 7,71 0,1 72 7, , MVA szaporítása EB14 és EB4 sejteken Az MVA szaporítását EB14 sejtszuszpenzión és kitapadó EB4 sejteken az MVA-GFP replikáció kinetikájának kvantitatív analízisével határoztuk meg. Az EB4 sejteket DMEM-F12 tápközegben szaporítottuk 60 lemezeken és 0,1 m. o. i. értékkel fertõztük, míg az EB14 sejteket 1 ml forgatható edényekben tenyésztettük DMEM-F12 tápközegben 24 órán keresztül a fertõzés elõtt 0,2 m. o. i. értékkel. A fertõzött sejtek %¹os arányát ezután FACS titeranalízissel kvantitatíve meg- 1

16 határoztuk a fertõzés után különbözõ idõpontokban. Amint a 12. és 13. ábrán bemutatjuk, minden még életképes sejt valóban expresszál GFP¹t 48 órával (EB4) vagy 72 órával (EB14) a fertõzés után A szérumtartalmú tápközegben szaporított, kitapadó EB4 sejtek vírushozama A kitapadó RB4 sejtek vírustermelékenységét DMEM-F12 tápközegen szaporított sejtek alkalmazásával vizsgáltuk. Azt tapasztaltuk, hogy az MVA nagyon hatásosan replikálódott EB4 sejtekben DMEM- F12 tápközegben és magasabb értékeket értünk el, mint a kontrollként alkalmazott CEF sejtek esetében (14. ábra) Egy további kísérletsorozatban az ATCC-tõl beszerzett, nem rekombináns MVA vírust alkalmaztunk összehasonlító replikációs vizsgálatokhoz CEF sejteken és EB4 sejteken: a korábbi, MVA-GFP vektorral kapott eredményeket megerõsítve ismét magasabb vírushozamokat kaptunk ezzel az MVA vírussal (1. ábra). Összességében ezek az eredmények mutatják a kitapadó EB4 sejtek MVA fertõzéssel szembeni magas érzékenységét és hatásos vírustermelõ képességüket, amelyre jellemzõ értékek magasabbak, mint ugyanezek a csirke embrionális fibroblasztjaiban. Továbbá, mindenezen kísérleteket standard körülmények között végeztük. Ésszerû tehát úgy érvelni, hogy még magas vírustitereket is elérhetünk a kísérleti körülmények optimalizálásával, különösen optimális sejttenyésztõ tápközeg alkalmazásával. 14. Szérumot tartalmazó tápközegen szaporított EB14 sejtek szuszpenzióján elért vírushozamok Az EB14 sejtek vírustermelékenységét forgatható flaskákban határozzuk meg DMEM-F12 tápközegen szaporított sejtek alkalmazásával. Egy elsõ kísérletsorozat eredményét, amely során 0,1 fertõzési multiplicitást alkalmaztunk, a 16. ábrán mutatjuk be. Ezek az adatok alátámasztják korábbi eredményeinket, amelyeket a kitapadó sejtekkel kaptunk, és megerõsítik a szuszpendált EB14 sejtek azon képességét, hogy hatékonyan képesek rekombináns MVA vírusokat termelni 0 TCID 0 /sejt értékhez közeli hozammal, ami kétszerese a csirkeembrió-fibroblasztokban mért értéknek Szérummentes tápközegen szaporított EB14 sejtek szuszpenzióján elért vírushozamok Ideális esetben a vírusvakcinák termelését bioreaktorokban, szérummentes tápközegekben szaporított, szuszpendált sejteken kell végrehajtani. Annak érdekében, hogy megvizsgáljuk az MVA termelését szérummentes tápközegen, beállítottunk egy kísérletsorozatot, amelyben szuszpendált EB14 sejteket fertõztünk MVA-GFP vektorral forgatható flaskákban, szérummentes tápközegben, két különbözõ fertõzési multiplicitással (0,01 és 0,1). A sejtek FACS analízise megerõsíti az EB14 sejtek hatásos fertõzését a két féle kísérleti körülmény között (17. ábra). Továbbá, amint vártuk, ezek a kísérletek azt mutatják, hogy a fertõzés gyorsabb, ha 0,1 m. o. i.¹t alkalmazunk, míg 0,01 m. o. i.¹nál a sejtek hosszabb ideig maradnak életképesek és hosszabb ideig képesek vírusutódok létrehozására (be nem mutatott adatok). A vírushozamok analízise megmutatja, hogy hatásos MVA termelést érünk el szérummentes és fehérjementes, szuszpenziós tápközegben szaporított szuszpendált EB14 sejtekkel (18. ábra). A CEF sejtekkel szokatlan módon kapott vírushozamnál magasabb vírushozamokat rutinszerûen elértük. Továbbá, a fertõzõ részecskék eloszlásának analízise jelzi, hogy a legtöbb virion a sejtekben marad és csupán egy kis töredékük szekretálódik a felülúszóban (18. ábra). Az EB14 és az S86N4 sejtek jól jellemzett, nem genetikailag átalakított madárembrió-õssejtek, amelyek hatásosan szaporodnak szérummentes tápközegen akár szuszpenzióban, akár kitapadt sejtekként. Bemutattuk, hogy a sejtek nagyon érzékenyek rekombináns és nem rekombináns, Ankara módosított vakcínavírus szaporítással és azzal végzett fertõzéssel szemben, és az eredmények jelzik, hogy a vírustermelés legalább 2 3-szor magasabb, mint a kontrollként alkalmazott CEF sejtekben. Összességében ezek a jellemvonások jellemzik a találmány szerinti sejteket, fõleg az EB14 és EB4 sejteket, amelyek nagyon ígéretes sejtes szubsztrátok arra a célra, hogy helyettesítsük a jelenlegi tojásalapú vagy CEF-alapú, MVA-alapú vektorok elõállítására alkalmas termelõrendszereket. Irodalmi hivatkozások Baba TW, Humphries EIL (198). Formation of a transformed follicle is necessary but not sufficient for development of an avian leukosis virus-induced lymphoma. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: Beug H, von Kirchbach A, Doderlein G, Conscience JF, Graf T. (1979). Chicken hematopoietic cells transformed by seven strains of defective avian leukemia viruses display three distinct phenotypes of differentiation. Cell 18: Guilhot C, Benchaibi M, Flechon JE, Samarut J. (1993). The 12S adenoviral E1A protein immortalizes avian cells and interacts with the avian RB product. Oncogene 8: Kawaguchi T, Nomura K, Hirayama Y, Kitagawa T. (1987). Establishment and characterization of a chicken hepatocellular carcinoma cell line, LMH. Cancer Res : Kim H, You S, Farris J. Foster LK, Foster DN. (01). Post-transcriptional inactivation of p3 in immortalized chicken embryo fibroblast cells. Oncogene : Kim H, You S, Kim IJ, Foster LK, Farris J, Ambady S, Ponce de Leon FA, Foster DN. (01). Alterations in p3 and E2F¹1 function common to immortalized chicken embryo fibroblasts. Oncogene : Liu JL, Klein PA, Moscovici MG, Moscovici C. (1992). Monoclonal antibodies recognizing normal and retrovirus-transformed chicken hematopoietic cells. Virology 189: Moscovici C, Moscovici MG, Jimenez H, Lai MM, Hayman MJ, Vogt PK. (1977). Continuous tissue cultu- 16

17 re cell lines derived from chemically induced tumors of Japanese quail. Cell 11: 9 3. Moss B. (1994) Replicating and host-restricted nonreplicating vaccinia virus vectors for vaccine development. Dev Biol Stand. 82: 63. Pain B., Clark M. E., Shen M, Nakazawa H., Sakurai M., Samarut L, Etches RJ. (1996). Long-term in vitro culture and characterisation of avian embryonic stem cells with multiple morphogenetic potentialities. Development 122: Pain B., Chenevier P., Samarut J. (1999). Chicken embryonic stem cells and transgenic strategies. Cells Tissues Organs 16: Samarut J, Gazzolo L. (1982). Target cells infected by avian erythroblastosis virus differentiate and become transformed. Cell 28: Smith JR and Pereira-Smith OM (1996). Replicative senescence: implications for in vivõ aging and tumor suppression. Science 273, SZABADALMI IGÉNYPONTOK 1. Eljárás natív vagy rekombináns vakcíniavírus replikálására, amely tartalmazza a következõ lépéseket: madárembrióból származó õssejtek inokulálása a vakciniavírus vírusrészecskéivel és a sejtek tenyésztése bazális tápközegben sejtlízis jelentkezéséig, és a vakciniavírus újonnan elõállított vírusrészecskéinek tápoldatba juttatása, ahol a madárembrióból származó õssejteket a következõ lépésekbõl álló eljárással nyerjük: a) madárembriósejtek tenyésztése szérummal kiegészített, komplett tenyésztõ tápközegben, amely tartalmaz: növekedési faktorokat, amelyek tartalmazzák az SFC, IGF¹1 és bfgf trófikus faktorokat és tartalmaznak a citokinek következõkbõl álló csoportjából választott citokineket: LIF, interleukin 11, interleukin 6, interleukin 6 receptor, CNTF, onkosztatin és kardiotrofin; és tápréteget, b) a tápközeg módosításával végzett passzálás, a faktorok, a szérum és/vagy a tápréteg progresszív vagy teljes elvonása céljából, c) exogén növekedési faktorok, a szérum és/vagy az inaktivált tápréteg hiányában bazális tápközegben osztódásra képes kitapadó vagy nem kitapadó sejtvonalak létrehozása. 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, ahol az a) lépésben a tenyésztett madárembriósejtek csirke- vagy kacsaembriósejtek. 3. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti eljárás, ahol a tápréteg inaktivált Az 1 3. igénypontok egyike szerinti eljárás, ahol a vakciniavírus az Ankara módosított vakciniavírus (MVA), a Lister Elstree-vakciniavírus, a NYVAC-vírus, az LC16m8-vírus vagy a CV178-vírus.. Az 1 4. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, ahol a c) lépésben kapott madársejtvonalak legalább 600 napig képesek osztódni. 6. Az 1. igénypontok egyike szerinti eljárás, ahol a c) lépésben kapott madársejtvonalak nem kitapadó õssejtek, amelyek exogén növekedési faktoroktól mentes tápközegben, szuszpenzióban osztódnak. 7. Az 1. igénypontok egyike szerinti eljárás, ahol a madársejtvonalak nem kitapadó õssejtek, amelyek szérumtól mentes tápközegben (szérummentes tápközegben), szuszpenzióban osztódnak. 8. Az 1. igénypontok egyike szerinti eljárás, ahol a madársejtvonalak nem kitapadó õssejtek, amelyek exogén növekedési faktoroktól és szérumtól mentes tápközegben, szuszpenzióban osztódnak. 9. Az 1. igénypontok egyike szerinti eljárás, ahol a c) lépésben kapott madársejtvonalak nem kitapadó õssejtek, amelyek exogén növekedési faktoroktól, szérumtól és tápsejtektõl mentes tápközegben, szuszpenzióban osztódnak.. Az 1 9. igénypontok egyike szerinti eljárás, ahol a c) lépésben kapott madársejtvonalak az alábbi jellemzõk legalább egyikével bírnak: magas sejtmag/citoplazma arány, endogén alkáli-foszfatáz-aktivitás, endogén telomerázaktivitás, reaktivitás az alábbi antitestcsoportból választott specifikus antitestekkel: SSEA¹1 (TEC01), SSEA¹3 és EMA¹ Az 1. igénypontok egyike szerinti eljárás, ahol a c) lépésben kapott madársejtvonalak tenyésztése bazális tápközegben történik. 12. A 11. igénypont szerinti eljárás, ahol a c) lépésben kapott madársejtvonalak tenyésztése a következõkbõl álló csoportból választott bazális tápközegben történik: nem esszenciális aminosavakból, vitaminokból és nátrium-piruvátból álló csoportból választott adalék anyaggal kiegészített DMEM¹, GMEM¹, HamF12- vagy McCoy-tápközeg. 13. Eljárás élõ vagy legyengített vakcina elõállítására, amely eljárás tartalmazza az igénypontok szerinti eljárás c) lépésében létrehozott, kitapadó vagy nem kitapadó sejtvonalak tenyésztését. 14. A 13. igénypont szerinti eljárás himlõ elleni élõ vagy legyengített vakcina elõállítására. 1. A 13. igénypont szerinti eljárás rák elleni élõ vagy legyengített vakcina elõállítására. 16. A 13. igénypont szerinti eljárás fertõzõ betegség elleni élõ vagy legyengített vakcina elõállítására. 17

18 HU T2 Int. Cl.: C12N 7/00 18

19 HU T2 Int. Cl.: C12N 7/00 19

20 HU T2 Int. Cl.: C12N 7/00