Molekulaspektroszkópiák

Átírás

1 Molekulaspektroszkópiák a molekula energianívói közötti átmenet létrehozása (gerjesztése) (Atomspektroszkópiák atomi energianívók gerjesztése)

2 Molekulaspektroszkópiai módszerek elektrongerjesztésű spektrofotometria (UV-Vis) fluoreszcenciás- és foszforeszcenciás analízis (molekuláris fotolumineszcencia) infravörös (IR-) spektrometria Raman spektrometria

3 Elektrongerjesztésű spektrofotometria (UV-Vis, UV-látható spektrofotometria)

4 Elektrongerjesztésű spektrofotometria (UV-Vis) molekulák létrejötte: atompályák molekulapályák molekulapályák típusai: kötő (E kötő < E atom ) lazító (E lazító > E atom ) nemkötő (n) a kötő- és lazítópályák egyaránt lehetnek σ és π pályák kötőpályák: σ és π lazítópályák: σ* és π* megengedett és tiltott átmenetek megengedett átmenetek: σ σ*, π π*, n σ*, n π*

5 Elektrongerjesztésű spektrofotometria (UV-Vis) A molekulapályák relatív energiaszintjei σ σ*: telített vegyületek, legnagyobb ΔE π π*: telítetlen vegyületek (UV- ill. látható fény) n σ*: heteroatomos, telített vegyületek n π*: heteroatomos, telítetlen v. aromás vegyületek

6 Elektrongerjesztésű spektrofotometria (UV-Vis) a vegyületek színével foglalkozik Kromoforok: az egyes elektronátmeneteknek megfelelő fényabszorpciót okozó csoportok ezek határozzák meg ill. okozzák a vegyületek színét A különböző szubsztituensek megváltoztatják a kromofor fényelnyelését, azaz a színét: Batokróm eltolódás: a kromofor elnyelése a szubsztituens hatására a nagyobb hullámhosszak felé tolódik el Hipszokróm eltolódás: a kromofor elnyelése a a szubsztituens hatására a kisebb hullámhosszak felé tolódik el Hiperkróm/hipokróm hatás: az elnyelés mértéke (a szín intenzitása) a szubsztituens hatására a növekszik/csökken

7 Az átmenetifém ionok fényelnyelése d-pályák (gázállapotban egyenértékűek, oldatban felhasadnak e g- és t 2g- pályákra) az ezek közötti átmenet az átmenetifém ionok ún. d d átmenete a d d átmenet energiája határozza meg az átmenetifém ionok színét Fémkomplexek fényelnyelése töltésátviteli (CT) sávok fényelnyeléskor a betöltött e-pályáról az elektron egy másik atom betöltetlen pályájára ugrik fém ligandum: pl. vas(ii)-o-fenantrolin ligandum fém: pl. FeSCN 2+, MnO - 4

8 A molekulák fényabszorpciója Gerjesztéskor az elektron a betöltött pályákról a szabad pályák valamelyikére ugrik át A gerjesztés kétféleképpen játszódhat le: az alap és gerjesztett állapotban az elektronspin megegyezik: S 0 S 1 átmenet (szingulett állapot) az alap és gerjesztett állapotban az elektronspin ellentétes: S 0 T 1 átmenet (triplett állapot)

9 Miért sávos a molekulák UV-spektruma? Az elektronok gerjesztése együtt jár a molekula rezgési és forgási állapotainak gerjesztésével is A különböző rezgési és forgási állapotokhoz különböző elektrongerjesztési állapotok tartoznak A megfelelő spektrumvonalak átfednek A spektrum burkológörbéje észlelhető sávos szerkezet (nem vonalas)

10 Mi történik az abszorbeált fotonnal? A molekula relaxál (visszatér az alapállapotba), energiát ad le; az E-leadás történhet vagy termikus úton vagy fénykisugárzás útján

11 Mi történik az abszorbeált fotonnal? I.forgatókönyv: A R 1 IC R 2 a gerjesztés során felvett energiát a molekula hő formájában (sugárzásmentesen) adja le IC = belső konverzió (S 1 S 0 átmenet)

12 Mi történik az abszorbeált fotonnal? II. forgatókönyv: A R 1 F S 1 legalacsonyabb energiaállapotából sugárzás útján jut az S 0 legalacsonyabb energiaállapotába F = floureszcencia (S 1 S 0 átmenet fényemisszióval járó relaxáció spinkvantumszám változás nélkül)

13 Mi történik az abszorbeált fotonnal? III. forgatókönyv: A R 1 ISC T1 R 3 P ISC T1 = külső konverzió (S 1 T 1 vagy T 1 S 0 átmenet) P = foszforeszcencia (T 1 S 0 átmenet fényemisszióval járó relaxáció spinkvantumszám változással)

14 Mi történik az abszorbeált fotonnal? IV. forgatókönyv: A R 1 ISC T1 R 3 ISC S0 R 4 Két külső konverzió közbeiktatásával csak hőátadással relaxál a rendszer

15 A fényabszorpció alkalmazása az analitikában [Fe(II)(1,10-fenantrolin) 3 ] komplex (piros színű, komplementer színe zöld λ max = 510 nm) Cr 2 O 7 2- ion (narancssárga színű, komplementer színe a kék, λ max = 440 nm) Mi határozza meg egy oldat színét?

16 A fényabszorpció alkalmazása az analitikában Abszorpciós spektrum X tengely: hullámhossz (λ) Y tengely: abszorbancia (A) Minőségi információ az elnyelés hullámhossza (a vegyület színe) a széles sávok miatt korlátozottan használható Mennyiségi információ az adott hullámhossznál mért abszorbancia (a vegyület fényelnyelésének a mértéke) koncentráció meghatározásra használjuk a Lambert-Beer törvény alapján

17 Koncentrációmérés a Lambert-Beer törvény alapján I λ λ εcl 0 = I 0 e lg = Aλ = εcl I I λ λ I λ 0 I λ A λ c l ε a beeső fény intenzitása (λ hullámhossznál) a transzmittált fény intenzitása (λ hullámhossznál) abszorbancia (λ hullámhossznál) a meghatározandó anyag koncentrációja optikai úthossz (rétegvastagság, küvettahossz) moláris abszorbancia (λ hullámhossznál) a legfontosabb: A = konst.. c

18 A moláris abszorbancia, ε megadja adott hullámhosszon az egységnyi koncentrációjú (1 M) oldat abszorbanciáját egységnyi optikai úthosszú (1 cm) küvettában anyagi minőségre jellemző állandó érték egy vegyület UV-Vis spektrumát gyakran ε = f(λ) alakban adják meg ε értékét az elektron energiaátmenetének a valószínűsége határozza meg nagy valószínűségű elektronátmenetek (intenzív színű anyagok, pl. szerves indikátorok) ε = M -1 cm -1 d d átmenetek: ε ~ 10 M -1 cm -1 CT sávok: ε = M -1 cm -1

19 Eltérések a Lambert-Beer törvénytől 1. Csak híg oldatokban érvényes (c < 10-3 M) törésmutató (n) változását figyelembe kell venni Kortüm-törvény: n ε ' = ε ( n 2 + 1) 2. A kromofor kémiai környezetének megváltozása (protonálódás, komplexképzés, asszociáció, disszociáció, stb.) Felhasználható a fenti folyamatok követésére (pl. asszociációs, disszociációs, stb. állandók meghatározására) 2

20 A 1,0 Di-I-tirozin UV-spektrumának ph-függése ph 12 ph 0,5 izobesztikus pontok λ (nm)

21 Eltérések a Lambert-Beer törvénytől 3. Az oldószer hatása (pl. I 2 színe vízben sárga, CCl 4 - ban lila) Az alap és gerjesztett állapot közötti ΔE változik a szolvatációval szolvatokróm hatás 4. A monokromatikus sugárzás félértékszélessége (2Δλ) minél kisebb, annál pontosabban érvényesül (célszerű az abszorpciós maximumon mérni) 5. Kolloid részecskék fényszórás, alapvonaleltolódás 6. Hőmérséklet az ε T-függő, a hőmérsékletet állandó értéken kell tartani

22 A spektrofotometriás mérés pontossága Ha A kicsi (<0,1), akkor I változása I 0 -hoz képest kicsi, emiatt pontatlan a mérés Ha A nagy (>1), akkor I 0 -nak túl kicsiny hányada jut a detektorra, emiatt pontatlan a mérés A méréseket mindig úgy tervezzük, hogy teljesüljön 0,1 < A < 1 Ezt c és l megfelelő megválasztásával érhetjük el Legpontosabb a mérés, ha 0,3 < A < 0,6

23 Többkomponensű rendszerek fényelnyelése Az abszorbanciák additivitása miatt I I II A1 = ε 1 lc + ε1 I I II A2 = ε 2lc + ε 2 A moláris abszorbanciák ismeretében c I és c II meghatározható lc lc II II

24 Az abszorpciós spektrofotometria gyakorlata Egyfényutas spektrofotométer I 0 mérése ún. vakoldat segítségével történik (a mérendő kivételével minden más összetevő benne van)

25 Az abszorpciós spektrofotometria gyakorlata Kétfényutas spektrofotométer A fénysugarat két egyforma részre bontjuk amik felváltva kerülnek a detektorba

26 Az abszorpciós spektrofotometria gyakorlata Mennyiségi elemzés fényt abszorbeáló anyagok mérésére alkalmas színtelen anyagoknál ez kémiai reakcióval is kialakítható (pl. Fe(III) + SCN - ) meghatározási módszerek 1. kalibrációs egyenes felvételével 2. standard addíciós módszerrel 3. többszörös standard addícióval titrálások végpontjelzésére is alkalmazható (feltétel, hogy az oldat színe változzék a titrálás során)

27 Az abszorpciós spektrofotometria gyakorlata Speciális alkalmazások diódasoros detektor nm között 2 nm-enként 1 s alatt a teljes spektrumot regisztrálja spektrum időfüggés (pl. HPLC detektor) Flow Injection Analysis (FIA) célmérések, sorozatanalízisek stopped flow analízis gyors reakciók időbeli lefolyásának követése száloptika alkalmazása

28 Fluoreszcenciás és foszforeszcenciás analízis

29 Fluoreszcenciás és foszforeszcenciás analízis floureszcencia: S 1 S 0 átmenet a molekulák fényemisszióval járó relaxációja, amely spinkvantumszám változás (spinátfordulás) nélkül játszódik le (τ = s) foszforeszcencia: T 1 S 0 átmenet a molekulák fényemisszióval járó relaxációja, amely spinkvantumszám változással (spinátfordulással) játszódik le (τ = s) fluoreszcencia + foszforeszcencia = (molekuláris) fotolumineszcencia

30 Fluoreszcenciás és foszforeszcenciás analízis

31 Az eredmény az emissziós spektrum (vagyis az emittált fény intenzitása (F) a hullámhossz (λ) függvényében) Ugyanazon vegyület abszorpciós és emissziós spektruma az emissziós spektrum az abszorpcióshoz képest a nagyobb hullámhosszak (kisebb E) felé van eltolódva az emissziós spektrum az abszorpciós spektrum tükörképe

32 Fluoreszkáló és foszforeszkáló vegyületek delokalizált π-elektronokat tartalmazó szerves vegyületek, amelyek merev vázzal rendelkeznek (pl. antracén, fenantrén) nukleofil szubsztituensek (-NH 2, -OH) növelik a fluoreszcenciát (növelik a p-elektronok delokalizációját) elektrofil szubsztituensek (-Cl, -COOH) csökkentik töltés kialakulása kioltja a fluoreszcenciát (pl. fenol fenolát) fluoroforok molekulák fluoreszcenssé tételére alkalmas szubsztituensek

33 Mennyiségi analízis az emissziós spektrum az abszorpcióshoz képest a nagyobb hullámhosszak (kisebb E) felé van eltolódva az emissziós spektrumnak lesznek olyan sávjai, amelyek nincsenek átfedésben az abszorpciós spektrummal ezeknek a sávoknak a háttere 0 (jel:zaj viszony optimális) az emittált fény intenzitása (I) I = KI0lc I 0 l K c besugárzó fény intenzitása rétegvastagság állandó (függ a kvantumhaszn. tényezőtől) koncentráció a legfontosabb: I = konst.. c

34 Mennyiségi analízis Spektrofluoriméter felépítése I 0 növelésével a kimutatási határ növelhető nagy érzékenység szelektív sokkal több vegyület mutat fényelnyelést, mint lumineszcenciát floureszkáló vegyületek (a gerjesztő λ alkalmas megválasztásával) egymás mellett is meghatározhatók kimutatási határ: <ppb (pl. LSD 1 ng/ml)

35 Infravörös (IR) spektrometria

36 Infravörös (IR) spektrometria IR sugárzás: λ = 700 nm 400 μm Molekulák rezgési és forgási (vibrációs és rotációs) átmeneteihez tartozó ΔE-k ebbe a tartományba esnek IR-sugárzás abszorpciójának feltételei: 1. E alap E gerjesztett = ΔE = hν gerjesztő 2. Csak azok a rezgések gerjeszthetők (azaz: IRaktívak), amelyek során a molekula dipóusmomentuma változik (emiatt szimmetrikus molekulák, pl. O 2, nem IR aktívak)

37 Molekulák rezgései Az atomok közötti rezgés (normálrezgés) frekvenciája függ az atomok tömegétől (m) a közöttük lévő kötés erősségétől (k) (modell: golyók + rugó) Gerjesztéskor a normálrezgés amplitúdója megnő Egy N atomos molekula 3N-6 normálrezgéssel (lineáris molekula esetében 3N-5 normálrezgéssel) rendelkezik Normálrezgések típusai: vegyértékrezgések a molekula egyes kötései mentén megnyúlás-összehúzódás deformációs rezgések a molekula kötésszögeinek megváltozásával járó rezgések

38 Vegyértékrezgések ν s ν as szimmetrikus vegyértékrezgés antiszimmetrikus vegyértékrezgés

39 Deformációs rezgések β β δ γ ollózó kaszáló torziós bólogató ΔE vegyért. > ΔE deform. > ΔE forgási

40 Az IR spektrum (1-oktén) X tengely Y tengely hullámhossz v. hullámszám transzmittancia v. abszorbancia

41 IR spektrum és molekulaszerkezet az egyes sávok funkciós csoportokhoz rendelhetőek ugyanaz a funkciós csoport mindig ugyanazon hullámhossznál jelenik meg az IR spektrumon csoportfrekvencia az adott csoportra jellemző adat, táblázatokból kikereshető σ = cm -1 tartomány ujjlenyomat IR spektrum alapján mind a funkciós csoport, mind a vegyület azonosítható elsősorban minőségi analízisre használható más molekulaspektroszkópiákkal (pl. NMR) teljes szerkezetfelderítést tesz lehetővé

42 IR spektrum és molekulaszerkezet Néhány jellemző csoportfrekvencia

43 Az IR spektrum használata mennyiségi analízisre Abszorpciós módszer A sávok szélesek és átfednek Lambert-Beer törvény használható Gyakorlati alkalmazás: kipufogógázok CO 2, H 2 O és NO tartalmának meghatározása (zöldkártya)

44 Az IR spektrometria gyakorlata Spektrométer: nagyon hasonlít az UV-Vis spektrométerhez Az összes optikai eszköz IR áteresztő kell, hogy legyen Pl. ablakok NaCl vagy AgCl-ből, újabban speciális műanyagokból Vizes oldatok mérésére gyakorlatilag nem alkalmas Üveg v. kvarcküvetta nem alkalmazható Minta előkészítés: KBr-dal eldörzsöljük a szilárd mintát (1:100), és pasztillát készítünk belőle Ha KBr nem alkalmazható: nujol (IR áteresztő paraffinolaj)

45 Raman spektroszkópia

46 Raman spektroszkópia Az IR spektroszkópia komplementere IR-aktív rezgések: dipólusmomentum változással járó rezgések Raman aktív rezgések: olyan rezgések, amelyek a polarizálhatóság megváltozásával járnak Pl. CH 4 szimmetrikus vegyértékrezgései dipólusmomentum-változással nem járnak IR-inaktívak Polarizálhatóság változással járnak - Raman-aktívak IR-inaktív rezgések Raman-aktívak lehetnek és fordítva

47 Az 1,4-dioxán IR (felső) és Raman (alsó) spektruma

48 A Raman effektus a mintát intenzív, monokromatikus fénnyel megvilágítjuk a fény a mintán szóródik a gerjesztő fény fotonjai ütköznek a minta molekuláival rugalmas ütközéskor a gerjesztő fény energiája nem változik Rayleigh szórás rugalmatlan ütközéskor a molekulák rezgési állapota megváltozik, és a szórt fény energiája eltér a gerjesztő fény energiájától ha a szórt fény energiája a gerjesztő fény energiájánál kisebb: Stokes vonalak nagyobb: anti-stokes vonalak az egyes Raman vonalak a molekula rezgési/forgási átmeneteihez tartoznak

49 Rayleigh vonal Stokes vonalak anti-stokes vonalak a Stokes vonalak intenzívebbek az anti- Stokes vonalaknál a kétféle vonalredszer a Rayleigh vonalra szimmetrikusan helyezkedik el

50 A Raman spektroszkópia gyakorlata I szórt ~ ν gerj4 nagy intenzitású és frekvenciájú gerjesztő sugárzást célszerű alkalmazni alkalmazott lézerek: He-Ne (632,8 nm); Ar (488,8nm vagy 514,6 nm) vizes oldatok vizsgálatára is alkalmas ( IR) Raman sáv intenzitása, I = konst. c (mennyiségi információ) fluoreszcencia erősen zavarja korlát: csak tömény oldatok vizsgálatára alkalmas a jövő molekulaspektroszkópiai technikája

51 A kémiai analízis termikus módszerei (termoanalitika)

52 A kémiai analízis termikus módszerei A hő és az anyag kölcsönhatásán alapuló módszerek Termoanalitikai módszerek alkalmasak fizikai-kémiai átalakulások reakcióhőjének a reakcióhő előjelének (endoterm exoterm) a reakció lejátszódási hőmérsékletének kémiai reakciók sztöchiometriájának meghatározására Pl. fűtőérték fázisátalakulások hőmérséklete és hőigénye (Op., Fp., L o, L f, stb.) bomlási hőmérséklet gyulladási hőmérséklet, stb.

53 A kémiai analízis termikus módszerei Két elvben eltérő típus 1. Dinamikus: hőmérsékletváltoztatás hatására az anyag valamely jól mérhető kémiai vagy fizikai tulajdonsága megváltozik (DTA, DSC, TG, DTG) közös elem: adott program szerint felfűtött kemence 2. Sztatikus: állandó hőmérsékleten a kémiai reakciók során termelt vagy elnyelt hő mérésén alapuló módszerek (kalorimetria) közös elem: hőszigetelt, adiabatikus kaloriméter

54 Differenciál termikus analízis (DTA) T-változás hatására bekövetkező fizikai- (pl. olvadás, kristályosodás, stb.) vagy kémiai (pl. bomlás, oxidáció, stb.) változás során képződő hőt (ΔH) mérjük a T fv-ében 1. tégely: minta 2. tégely: referencia (pl. Al 2 O 3 )

55 A DTA berendezés működése programozott, lassú fűtés az 1 és 2 tégely között ΔT-t 2 db termoelem méri ha nem történik semmi, ΔT=0, a termoelemek hallgatnak exoterm folyamat esetén: ΔT > 0 + feszültségjel endoterm folyamat: ΔT < 0 - feszültségjel

56 A DTA görbe X-tengely Y-tengely a kemence hőmérséklete minta T hőmérséklete vagy a minta és a referencia közötti ΔT hőmérsékletkülönbség

57 A DTA görbe exoterm csúcs endoterm csúcs A módszer alkalmas az átalakulás hőmérsékletének és a folyamatok exo- ill. endoterm voltának meghatározására

58 A DTA módszer o C között alkalmazható minden tömegváltozással járó folyamat követésére alkalmas sőt, olyan átalakulások követésére is alkalmas, ami tömegváltozással nem jár (pl. olvadás, stb.) kvantitatív információ: a görbe alatti terület arányos a reakcióhővel (tehát az anyagmennyiséggel) a DTA-ból származó ΔH értékek pontatlanok

59 Differenciál scanning kalorimetria (DSC) nagyon hasonlít a DTA-hoz szintén ΔH = f(t) függvényt határozunk meg vele a DTA korlátaival nem rendelkezik (ΔH pontos mérése)

60 A DSC működése a mintát tartalmazó tégelyek egymástól hőszigetelve helyezkednek el az egész berendezést fűtjük, plusz mindkét tégelynek még külön fűtőberendezése is van a mintában és a referens anyagban termolelemek ha a mintában endoterm folyamat játszódik le, jelzi a termoelem, bekapcsolja a mintatégely fűtését és mindaddig folytatja, amíg ismét ΔT = 0 (exoterm folyamat: referens tégelyt fűtjük) a fűtőáram teljesítményét mérjük, amiből pontosan megadható a reakcióhő értéke a termoelem nem mér, csak vezérel ( DTA)

61 A DSC görbe DSC csúcs helye (T): az átalakulás hőmérséklete (minőségi információ) DSC csúcs iránya ( ): endoterm exoterm (minőségi információ) Görbe alatti terület (ΔH): a reakcióhő pontos értéke (mennyiségi információ)

62 A DSC módszer sokkal pontosabb, mint a DTA hátránya, hogy csak o C között működik alkalmas pl. szennyezőanyagok jelenlétének kimutatására polimorfia vizsgálatára stb.

63 A termogravimetria (TG, DTG) fizikai-kémiai átalakulások során a minta tömege megváltozik a minta hőmérsékletváltozás hatására bekövetkező tömegváltozását TG módszerrel mérjük mérés a termomérleggel a kemencét felfűtjük, hőmérsékletét mérjük (X tengely) a minta tömegváltozását analitikai mérlegen mérjük (Y tengely) a minta tömegét a hőmérséklet függvényében ábrázolva kapjuk a TG görbét

64 A Ca(COO) 2. H 2 O TG görbéje

65 A TG görbe vízszintes szakaszai megadják, milyen hőmérséklettartományban tömegállandó a minta a tömegcsökkenésből kiszámítható az egyes folyamatok sztöchiometriája a tömegcsökkenésből kiszámítható a bomlástermékek összetétele A DTG görbe a TG hőmérséklet szerinti deriváltja a DTG görbe átfedő termikus folyamatok szétválasztására alkalmas közvetlen mérése derivatográffal történhet (közvetlenül a Δm/ΔT függvényt határozza meg)

66 Szimultán módszerek 1. TG, DTG, DTA

67 Szimultán módszerek 1. TG, DTG, DTA 2. TG-MS 3. DTA/DTG + EGA/EGD 4. TG-DTA-MS alkalmas módszerrel a folyamat során képződő gáz mennyiségét vagy minőségét mérjük MS = tömegspektrometria (mass spectrometry) EGA = képződött gáz analízise (evolved gas analysis) EGD = képződött gáz detektálása (evolved gas detection)

68 Kalorimetria (termometriás titrálások) reakció során felszabaduló/elnyelődő hőt mérjük a mérést hőszigetelt edényben hajtjuk végre (kaloriméter) a reakcióelegy hőmérsékletét mérjük a mérőoldat térfogatának függvényében nagy pontosságú hőmérsékletmérést igényel (±0,0001 K) zavaró egyéb hőeffektusokat figyelembe kell venni (mérőoldat hígításhője, keverési hő, stb.)

69 Kromatográfiás módszerek az analitikai kémiában

70 Elválasztó módszerek miért van rájuk szükség? a valós rendszerek mindig többkomponensűek az analízis egyszerűbb és megbízhatóbb, ha az analizálandó minta csak egyfajta komponenst tartalmaz az analízis előtt célszerű a minta komponenseit egymástól elválasztani elválasztás (szeparáció): az elválasztandó komponens másik fázisba (csapadék, gáz, nem elegyedő folyadék) való átmenete ill. átvitele

71 A kromatográfia Többfokozatú, nagyhatékonyságú, dinamikus elválasztási módszerek gyűjtőneve A kromatográfia olyan elválasztási módszerek gyűjtőneve, amelyek közös eleme, hogy az elválasztás során az az elválasztandó komponensek az egymással érintkező két fázis (az állófázis és a mozgófázis) között megoszlanak Állófázis (kolonna, oszlop) Mozgófázis (eluens)

72 A kromatográfiás módszerek felosztása 1. A szorpciós folyamat szerint:adszorpciós abszorpciós (megoszlásos) ioncsere gélen történő megkötődés 2. A fázisok halmazállapota szerint Állófázis Mozgófázis Gáz Folyadék Szilárd Gáz-szilárd kromatográfia v. adszorpciós gázkromatográfia Adszorpciós folyadékkromatográfia Ioncserés kromatográfia Gélkromatográfia Folyadék Gáz-folyadék kromatográfia v. abszorpciós gázkromatográfia Megoszlásos folyadékkromatográfia

73 A kromatográfiás módszerek felosztása 3. Technikai elrendezés szerint oszlopkromatográfia síkkromatográfia papírkromatográfia vékonyrétegkromatográfia 4. Detektálás módja szerint hagyományos műszeres

74 Oszlopkromatográfia Az oszlopkromatográfok felépítése Eluens tároló Eluens továbbító (pumpa) Minta adagoló Oszlop (kolonna) Detektor Jel feldolg. termosztált rész

75 A kromatográfia alapfogalmai A kromatogram (elúciós függvény) X tengelyen: idő (elúciós idő) Y tengelyen: a detektorjel intenzitása t R : retenciós idő (komponensenként eltér - minőségi információ) t M : holtidő t R = t R -t M : redukált retenciós idő

76

77 A kromatogramok értékelése Minőségi elemzés 1. Retenciós idők összehasonlítása előzetes információ szükséges a minta összetevőiről (pl. homológ sorok módszere: n ~ lg t R Kováts-féle retenciós index) 2. Szelektív detektorok on line detektálás tömegspektrométer (MS), IR spektrométer, ICP AES

78 Mennyiségi elemzés A kromatogramok értékelése a kromatográfiás csúcs alatti terület (jel, A) arányos a csúcshoz tartozó komponens koncentrációjával

79 A kromatogramok értékelése Mennyiségi elemzés módszerei 1. Belső normalizálás - a csúcsterületet az összes csúcs területének %-ában fejezzük ki csak akkor alkalmazható, ha a detektor mindegyik komponensre azonos érzékenységű 2. Kalibrációs módszer kalibrációs függvényt minden komponensre külön meg kell határozni időigényes, de pontos 3. Addíciós módszerek

80 Kromatográfiás módszerek 1. Gázkromatográfia (GC) 2. Folyadékkromatográfia (HPLC) 3. Ionkromatográfia (IC) 4. Kapilláris elektroforézis 5. Egyéb kromatográfiás módszerek a. Papírkromatográfia b. Vékonyréteg kromatográfia (TLC) c. Gélkromatográfia d. Affinitáskromatográfia

81 Gázkromatográfia (GC) állófázisa folyadék v. szilárd anyag mozgófázisa gáz (vivőgáz, eluens) minta gáz vagy folyadék (a kolonna hőmérsékletén gáz halmazállapotú) a GC tehát alkalmas bomlás nélkül gőzzé ill. gázzá alakítható vegyületek elválasztására

82 Vivőgáz kémiailag inert gáz megválasztása függ a detektortól (ld. később) N 2, Ar lángionizációs detektor H 2, He hővezetőképességi detektor áramlási sebesség ml/perc áramlási sebesség helyes megválasztása elválasztás optimalizálása (van Deemter egyenlet) Mintaadagolás pillanatszerűen (fecskendővel) hirtelen felmelegítés (gázzá alakítás) mintatérfogat néhány μl t ( o C): minta gőznyomása < telítési gőznyomás ha ez nem teljesül: származékképzés t változtatása

83 Mintaadagolók

84 Kolonna (a GC lelke), ebben található az állófázis vékony cső (2-6 mm, 1-5 m hosszú) vagy kapilláris (0,2-0,5 mm, m hosszú) hőmérséklete (4-500 o C) szabályozott (±0,1 o C) 1. a csőben adszorbens vagy 2. megosztófolyadék szilárd hordozón vagy 3. megosztófolyadék kapilláris belső felületén 1. Csőben adszorbens: aktív szén, Al 2 O 3, szilikagél (SiO 2 ) molekulaszűrők szerves polimerek mind nagy belső felülettel rendelkezik

85 Kolonna (a GC lelke), ebben található az állófázis vékony cső (2-6 mm, 1-5 m hosszú) vagy kapilláris (0,2-0,5 mm, m hosszú) hőmérséklete (4-500 o C) szabályozott (±0,1 o C), 1. a csőben abszorbens vagy 2. megosztófolyadék szilárd hordozón vagy 3. megosztófolyadék kapilláris belső felületén 2. Csőben megosztófolyadék szilárd hordozón hordozó (nagy felületű inert anyag, pl. diatomaföld, szerves polimerek) megosztófolyadék felvitele a hordozóra vékony film formájában a hordozó felszínén poláros megosztófolyadék (pl. Carbowax) - poláros komponensek elválasztása apoláros megosztófolyadék (pl. Squalan) - apoláros komponensek elválasztása

86 Kolonna (a GC lelke), ebben található az állófázis vékony cső (2-6 mm, 1-5 m hosszú) vagy kapilláris (0,2-0,5 mm, m hosszú) hőmérséklete (4-500 o C) szabályozott (±0,1 o C), 1. a csőben abszorbens vagy 2. megosztófolyadék szilárd hordozón vagy 3. megosztófolyadék kapilláris belső felületén 3. Kapilláris kromatográfia inhomogenitások (örvénydiffúzió) nincs éles csúcsok (elméleti tányérszám > 50000) kolonna elkészítése - vékony folyadékréteg kialakítása -kémiai megkötés (szilanizálás) splittelés

87 Detektorok a detektor jelzi, ha a vivőgázban az elválasztandó komponens megjelenik a detektor a meghatározandó komponens eluensbeli koncentrációjával arányos jelet ad a komponens olyan fiz.-kém. sajátságát érzékeli, amely a vivőgáz ugyanezen sajátságától eltér

88 GC detektorok 1. hővezetőképességi detektor (katarométer) hőelvezetés sebessége ~ molekulatömeg H 2, He nagyon jó hővezetők -vivőgáz a vivőgáz hűti a wolframszálat mintakomponens hatására a szál hőmérséklete megnő elektromos ellenállás ~ hőmérséklet lineáris tartomány 5 nagyságrend kimutatási határ 10-6 g

89 GC detektorok 2. elektronbefogási detektor vivőgáz Ar, β-sugárzás ionizálja amíg csak Ar van jelen, állandó áramerősség nagy EN-ú komponens (pl. Cl) e - -t befogja áramerősség lecsökken halogéntartalmú szerves vegyületek kimutatási határa g/s érzékenysége függ a komponens kémiai összetételétől

90 GC detektorok 3. lángionizációs detektor nem ionizálódó vivőgáz (N 2 vagy Ar) mikroégő (H 2 ), elektródpár a feszültség akkora, hogy még éppen ne üssön át (ne folyjon áram) szerves komponensek a lángban ionizálódnak ez áramot (válaszjelet) generál válaszjel ~ molekula szénatomszáma kimutatási határ g/s

91 GC detektorok 4. egyéb detektálási eljárások foto- és termikus ionizációs detektorok lángfotometriás detektorok (P, S-tartalmú minták) } IR spektroszkóp tömegspektrométer (GC-MS) kombinált módszerek

92 A GC előnyei és hátrányai Előnyök egyszerű és hatékony szelektív kicsiny a mintaigénye automatizálható (sorozatelemzések) roncsolásmentes Hátrányok csak illékony mintákra alkalmazható hőérzékeny anyagokra nem alkalmazható drága a berendezés

93 Folyadékkromatográfia (HPLC High Performance Liquid Chromatography) mozgófázisa folyadék állófázisa szilárd vagy folyadék Különbségek a GC-hez képest * eluens kölcsönhat a minta komponenseivel (pl. szolvatálja azokat) * eluens tulajdonságai széles körben változtathatók, ez hatással van a komponensek oldhatóságára és a megoszlási hányadosra * mindkét fázis (álló- és mozgó) változtatható * az eluens összetétele akár az elválasztás során is változtatható * folyadék összenyomhatatlansága miatt nagy nyomást kell alkalmazni (~ 10 7 Pa)

94 kisnyomású oldal nagynyomású oldal

95 Az eluens előkészítése és továbbítása Az eluens kétféleképpen kerülhet a kolonnára: izokratikus elúció az eluens összetétele állandó grádiens elúció az eluens összetétele meghatározott program szerint változik (az eluensek összekeverése a kisnyomású oldalon) állandó nyomást kell biztosítani a folyadék pulzálását el kell kerülni az eluens gázt nem tartalmazhat He-buborékoltatás, ultrahangos kezelés

96 Kolonnavédelem eluensben levő lebegő szennyeződések zavarnak idővel elszennyezik tönkreteszik az analitikai kolonnát előtétkolonnák (védőkolonnák) az analitikai kolonnához hasonló töltetű, de nagyobb szemcseméretű (kisebb áramlási ellenállású) kolonna megszűri az eluenst telíti az eluenst az állófázis anyagával (növeli az analitikai kolonna élettartamát)

97 Mintaadagolás a minta dugószerűen kerüljön az eluensbe (sávkiszélesedés csökkentése) mintatérfogat 1-20 μl nyomásálló 6 utas adagolószelep

98 Az analitikai kolonna (azaz: az oszlop) 1-4 mm, cm hosszú acél- vagy üvegcső nyomásálló holt terek minimálisak töltete aprószemcsés, 2 40 μm átmérőjű porózus, nagy fajlagos felületű (400 m 2 /g), szemcsés szilárd anyag folyadék szilárd (adszorpciós) HPLC a töltet szilárd, pl. SiO 2, Al 2 O 3, aktív C folyadék-folyadék (abszorpciós v. megoszlásos) HPLC a töltet megosztó folyadékkal vékonyan fedett szilárd, porózus hordozó

99 Folyadék-szilárd (adszorpciós) HPLC szilikagél töltet: felületén -Si-OH (szilanol) csoportok ( = a hordozó felülete) bázikus sajátságú ill. telítetlen csoportokat tartalmazó vegyületek jól megkötődnek rajta komponensek báziserősség alapján választhatóak el oldaterősség oldószerkeverék összetételével polaritás változik - (hexán víz) változtatható a komponensek elválasztása módosítók pl. kis mennyiségű víz blokkolja a poláros Si-OH csoportokat, csökkenti a töltet polaritását

100 Folyadék-folyadék (megoszlásos) HPLC az állófázis megosztó folyadékok az állófázison (mint a GC-ben) vagy: kémiai megkötés a hordozó felületén -Si-OH + RSiCl -Si-O-Si-R + HCl R megválasztásával a töltet polaritása szabályozható pl. R = oktil, dodecil -CH 2 -CH 2 -CN -CH 2 -CH 2 -NH 2 polaritás nő R = Si-C 6 H 5 π π kölcsönhatások ( stacking ) miatt aromás vegyületek elválasztása

101 Folyadék-folyadék (megoszlásos) HPLC az eluens az eluens összetételének megválasztásával azt szabályozzuk, hogy milyen karakterű (poláros vagy apoláros) komponensek elválasztására lesz az eluens alkalmas normálfázisú HPLC: poláris álló-, apoláris mozgófázis fordított fázisú HPLC: apoláris álló-, poláris mozgófázis az eluens változtatása adalékokkal: ph változtatás - töltésváltoztatás ionpárképzés (ellenion hozzáadás) R COO - + R 4 N + [R COONR 4 ] 0

102 A HPLC detektorai lehet eluensérzékeny vagy komponensérzékeny eluensérzékeny: törésmutatóváltozáson (RI) alapuló detektor (nem érzékeny, de univerzális, mert minden szerves komponensre ad jelet) komponensérzékeny: fényelnyelés változás mérésén alapuló detektor (UV-Vis) változtatható λ jú in-line spektrofotométer 10-2 ng kimutatási határ (érzékeny, de nem univerzális) a komponensnek fényelnyelőnek kell lennie a komponensnek megfelelő hullámhosszon kell mérni diódasoros detektálás spektrum 0,01 s-onként, a nm tartományban egyidejűleg méri

103 A diódasoros spektrofotométer elve

104 Három dimenziós HPLC kromatogram A diódasoros detektor mennyiségi és minőségi analízis egyidejű végrehajtását teszi lehetővé

105 A HPLC detektorai 2. további komponens érzékeny detektálási módok fluoreszcenciás detektálás elektrokémiai (voltammetriás) detektálás HPLC-IR HPLC-MS

106 A HPLC alkalmazásai kis gőznyomású (nem illékony) komponensek mérésére alkalmas (amikre a GC nem) a komponensnek megfelelő oldhatóságúnak kell lennie (M w < 2000 D) minőségi analízis retenciós idő alapján mennyiségi analízis kromatográfiás csúcs területe alapján preparatív HPLC keverékek szétválasztása komponenseire, majd az egyes frakciókból a tiszta komponens kinyerése (nagy méretű kolonna kell hozzá)

107 Az ionkromatográfia folyadék kromatográfia egy speciális ága az elválasztás alapja az álló és a mozgófázis közötti ioncsere egyensúly létrejötte állófázis : ioncserélő műgyanta műgyanták típusai (felületi csoport típusa szerint) anionos: -SO 3 H -SO 3- + H + (erős anionos) -COOH -COO - + H + (gyenge anionos) kationos -NR 3 OH -NR 3+ + OH - (erős kationos) -.NH 3 OH -NH OH - (gyenge kationos)

108 Az ionkromatográfia Az elválasztás alapja kationcserélő gyantákon kationokat (M + ) választunk el -SO 3 H + M + -SO 3 M + H + - anioncserélő gyantákon anionokat (A - ) választunk el -NR 3 OH + A - -NR 3 A + OH - A megkötődés erőssége függ az ionok méretétől (kis méretű jobban kötődik) az ionok töltésétől (nagyobb töltésű jobban kötődik) hőmérséklet, ph, ionerősség az eluensben fellépő egyéb kölcsönhatások (pl. ionpárképződés)

109 Az ionkromatográfia A mozgófázis kationok elválasztására híg erős sav oldatot anionok elválasztására híg erős bázis oldatot alkalmazunk A detektor (eluensérzéken az eluens vezetőképességét méri folyamatosan az eluens vezetőképessége eleve nagy vezetőképesség lecsökkentése (elnyomása) szükséges szupresszor oszlop ( pl. kationok elválasztásakor anioncserélő oszlop, semlegesíti az eluens H + ionjait) -NR 3 OH + A - + H + -NR 3 A + H 2 O -NR 3 OH + A - + M + -NR 3 A + M + + OH - a szupresszor után az oldat vezetőképességét már az OH - ionok határozzák meg

110 Az ionkromatográfia Az ionkromatográfia alkalmas kisméretű szerves és szervetlen ionok elválasztására és meghatározására könnyen automatizálható (sorozatmérések) pontossága nem túl jó (± 5%) mintaigénye kicsiny (néhány ml) kimutatási képessége jó (10-6 M)

111 Egyéb kromatográfiás módszerek

112 síkkromatográfiás módszer Papírkromatográfia állófázisa speciális papír (cellulóz, anhidro-glükóz) vagy a papíron megkötött folyadék (pl. víz) mozgófázisa vízzel elegyedő szerves oldószerek a papírkromatogram készítése: a mintát felcseppentjük a papírcsík végére futtatószerbe helyezzük az eluens a mintakomponenseket különböző sebességgel viszi előre (kifejlesztés) a komponensek foltokban, egymástól elválva jelennek meg a papíron előhívás: vegyszerekkel, UV-fénnyel minőségi analízis: retenciós faktor (r f ) mennyiségi analízis: foltterület ~ lg n olcsó és egyszerű, de pontatlan (félkvantitatív)

113 Vékonyréteg kromatográfia (TLC) papírkromatográfiához nagyon hasonlít állófázis üveg- vagy műanyaglemezen elterített vékony (0,25 mm) adszorbens vagy a rajta adszorbeált folyadék vékonyréteg lehet szilikagél, Al 2 O 3, diatomaföld, poliamid, stb. a réteg egyenletes szemcseméretű kell hogy legyen mintamennyiség néhány μl mintaelőhívás I 2 -oldat H 2 SO 4 cc félkvantitatív, emiatt főként tájékozódó mérésre alkalmazzák

114 Gélkromatográfia (gélszűrés, méretkizárásos vagy permeációs kromatográfia) az állófázis gélszerkezetű (lukacsos, pórusos, járatok )) a mozgófázis a gél duzzadását előidéző és a mintát oldó folyadék az állófázisban (pl. Sephadex) lévő pórusok mérete jól definiált, monodiszperz a pórusoknál nagyobb méretű molekulák a gélen akadálytalanul áthaladnak a kisebb mulekulákat a gél visszatartja a kicsöpögő eluensben csökkenő molekulatömeg szerint jelennek meg a komponensek biokémiában alkalmazzák (pl. sótalanítás, fehérjék molekulatömeg szerinti elválasztása, polimerek M w meghatározása)

115 Affinitás kromatográfia állófázishoz (agaróz, cellulóz, dextrán) kémiai kötéssel enziminhibítort vagy fehérjespecifikus antitestet kötnek meg a reagens az elválasztandó, sokkomponensű mintából csak azt az egy komponenst köti meg, amelyikre specifikus a többi komponens gyorsan eluálódik az eluens megváltoztatásával (ph, összetétel, stb.) a kölcsönhatás megszüntethető, és a specifikusan megkötött molekula eluálódik a legspecifikusabb kromatográfiás módszer

116 VÉGE