A személyre szabott orvoslás lehetőségei a lymphoproliferativ kórképek és az autoimmun betegségek kezelésében

Átírás

1 A személyre szabott orvoslás lehetőségei a lymphoproliferativ kórképek és az autoimmun betegségek kezelésében Váróczy László dr. Debreceni Egyetem OEC, Belgyógyászati Intézet, III. sz. Belgyógyászati Klinika Szodoray Lajos Ösztöndíj bemutatkozó előadás november 14.

2 Malignus lymphoproliferativ kórképek vagy lymphomák az immunrendszer heterogén, daganatos megbetegedései az összes malignitás 4-5 %-a WHO felosztás: - B-sejtes - T-sejtes - Hodgkin bővülő terápiás paletta, jobb gyógyulási feltételek - új generációs citosztatikumok: purin analógok, bendamustin, liposzomális készítmények - monoklonális antitestek: rituximab, ofatumumab, aletuzumab, elotuzumab - radio-immunoterápia: Zevalin, Bexxar - egyéb: proteasoma gátlók, angiogenezis gátlók, mtor inhibitorok, hiszton-deacetiláz gátlók, immunokonjugátumok

3 Rizikó stratifikáció kezelés előtt Hagyományos score rendszerek - NHL: International Prognostic Index életkor, stádium, ECOG, extranodalis érintettség, ECOG - myeloma: ISS albumin, béta-2-mikroglobulin Nem tisztázott, individuális tényezők genetika? Személyre szabott gyógyítás lehetősége?

4 Mecenatura projekt Az Fc-gamma- receptor IIIa polimorfizmus és a génexpressziós profil jelentőségének vizsgálata diffúz nagy B- sejtes lymphoma esetén

5 A CD20 antigén Pre-B sejt stádiumtól kezdve, a plasmasejtekről már eltűnik változó denzitásban expresszálódik 4 db membránt átivelő domain shedding nem jellemző, solubilis CD20 molekulát csak CLL esetén figyeltek meg ligandja nincs, funkciója kérdéses (Ca-influx?, sejtciklusszabályozás?, apoptosis?)

6 A Rituximab és hatásai az elmúlt 10 év legsikeresebb gyógyszere a B-sejtes lymphomák terápiájában IgG1 típusú anti-cd20 monoklonális ellenanyag humán konstans és egér variabilis régió ADCC reakció komplement mediált sejtlízis direkt apoptózis indukció (caspase-8, caspase-9, Cainflux, bcl-2) vakcinációs hatás (dendritikus sejtek

7 Az Fc gamma receptor (CD16) Az ADCC reakció effektor sejtjeinek felszínén (NK, macrophag) I, II és III típus Az 1. kromoszóma hosszú karján 8 gén kódolja allél polimorfizmusok lehetősége, mely a funkcióban is megmutatkozhat autoimmun kórképekre való hajlam?

8 Fc gamma receptor IIIa polimorfizmus és NK-sejt aktivitás A 158. pozicióban levő aminosav lehet Val és Phe In vitro körülmények között létrehozott ADCC reakció eltérő az NK-sejt aktivitás a V/V, V/F és F/F genotípusú emberek mintáiban Fekete: F/F genotípus Fehér: V/V genotípus Koene, H. R. et al. Blood 1997;90:

9 ADCC intenzitás és Rituximab kötődés az FCGR3A polimorfizmus tükrében Hatjiharissi, E. et al. Blood 2007;110:

10 Follicularis lymphoma és Rituximab monoterápia (2002) 49 beteg, korábban kezeletlen populáció FCGR3A polimorfizmus meghatározás 4 dózis Rituximab (375 mg/m 2 az 1.,8.,15.,22. napokon Bcl2-JH génátrendeződés vizsgálat 2 és 12 hónappal a terápia után Objektív terápiás válasz - 2 hónap: 100 % (V/V) vs 67 % (V/A és A/A) - 12 hónap: 90 % (V/V) vs 51 % (V/A és A/A) p=0,031 Cartron, G. et al. Blood 2002;99:

11 DLBCL és R-CHOP kezelés 113 beteg V/V genotípus esetén jobb terápiás válasz De nem jobbak a túlélési eredmények Kim, D. H. et al. Blood 2006;108:

12 CLL és Rituximab monoterápia Mindössze 30 vizsgált beteg 4 héten keresztül, heti 3x-i dózis Rituximab Nem volt különbség a V/V, V/F és V/A csoport között a PR-t elértek arányában Blood, Vol. 103, Issue 4, , February 15, 2004

13 Follicularis lymphoma és R-CHOP kezelés 94 újonnan diagnosztizált FL beteg 6 ciklus R CHOP kezelés Nincs szignifikáns különbség a remissziós ráta és a túlélési görbék tekintetében Carlotti, E et al: FcgRIIIa and FcgRIIA polymorphisms do not predict clinical outcome of follicular non-hodgkin s lymphoma patients treated with sequential CHOP and rituximab Haematologica 2007; 92:

14 A diffúz nagy B-sejtes lymphoma génexpressziós profil szerinti felosztása GCB + - Mum 1 CD Bcl-6 - ABC (non GC)

15 A génexpressziós profil hatása a DLBCL-es betegek túlélésére Nyman H et al. Blood 2007;109:

16 FCGR3A polimorfizmus és GEP vizsgálatok a DEOEC III. Belklinikán kezelt DLBCL-es betegek körében 51 beteg, 32 férfi, 19 nő, átlagéletkor 53,1 év között felismert és kezelt DLBCL R-CHOP-14 vagy R-CHOP-21 kezelés, 1-8 ciklus

17 Módszer I. I. NESTED PCR SNP: GC-TA 1. PCR Target szekvencia, 94bp 2. PCR 1,2 kb termék Target szekvencia, 94bp

18 Módszer II. II. RESTRIKCIÓS EMÉSZTÉS CATGTT GTACAA CATTTT GTAAAA NlaIII FCγRIIIA-158V/V FCγRIIIA-158F/F CATGTT GTACAA CATTTT GTAAAA CATTTT GTAAAA CATGTT GTACAA FCγRIIIA-158V/F 150bp 100bp 75bp 50bp 35bp 94bp 33bp 61bp

19 Eredmények I. FF VF VV p Betegek száma (%) 10 (19.6) 29 (56.8) 12 (23.5) - Nemi megoszlás, nő / férfi 7/3 16/13 7/5 NS Átlagéletkor 62.5 (37-70) (19-83) 53.5 (25-86) NS IPI átlag NS Terápiás válasz (%) CR 7 (70) 20 (69) 10 (83) NS PR 1 (10) 5 (17) 0 (0) NS SD/PD 2 (20) 4 (14) 2 (17) NS OR (PR+CR) 8 (80) 25 (86) 10 (83) NS Váróczy L et al. Pathol Oncol Res 2011; [Epub ahead of print]

20 Eredmények II. Váróczy L et al. Pathol Oncol Res 2011; [Epub ahead of print]

21 Eredmények III. GC Non-GC P Betegek száma (%) 20 (39) 31 (61) - Nő / férfi arány 14/6 16/15 NS Átlag életkor 51.6 (19-75) 54.5 (18-86) NS Átlag IPI score NS Terápiás válasz (%) CR 15 (75) 21 (68) NS PR 3 (15) 4 (13) NS SD/PD 2 (10) 6 (19) NS OR (PR+CR) 18 (90) 25 (81) NS Váróczy L et al. Pathol Oncol Res 2011; [Epub ahead of print]

22 Eredmények IV. Váróczy L et al. Pathol Oncol Res 2011; [Epub ahead of print]

23 Konklúzió Az FCGR3A polimorfizmus és a GEP hatása a lymphomás betegek kezelési és túlélési eredményeire még nem egyértelmű a nagyobb rizikójú betegek kezelése eltérhet a standard protokolltól

24 A Rituximab kezelés hatékonyságának fokozása Cartron, G. et al. Blood 2004;104:

25 Jelenlegi projekt I. Gyógyszermetabolizmusban résztvevő enzimek genetikai polimorfizmusainak lehetséges szerepe a lymphomás betegek prognózisában

26 Metabolic pathway enzimek környezeti carcinogének aktiválása vagy eliminációja gyógyszer metabolizmus befolyásolhatják a terápiára adott választ Képviselőik: - citokróm P 450 (CYP) - glutation S-transzferáz (GST) - N-acetil-transzferáz (NAT)

27 GSTT1 deléció jó prognózis follicularis lymphomában, gyermekkori ALL-ben gyakoribb kemoterápia-asszociált toxicitás és kedvezőtlenebb túlélés DLBCL-ben Han, X et al. Am J Hematol 2009; 88:51-56 Cho, HJ et al. Cancer Gen Cytogen 2010; 198: 40-46

28 CYP2E1 Az enzim fontos szerepet játszik számos gyógyszer metabolizmusában (cyclophosphamide, fludarabin, bendamustin, rituximab, alemtuzumab) Az A allél hordozói CLL/SLL-ben kedvező prognózissal bírnak Han, X et al. Am J Hematol 2009; 88:51-56

29 NAT 1 CLL-ben az AG vagy az AA genotípus rossz prognózist jelent Han, X et al. Am J Hematol 2009; 88:51-56

30 GSTP 1 CLL-ben az AG vagy a GG genotípus prognózisa rossz Han, X et al. Am J Hematol 2009; 88:51-56

31 Terv Vizsgálni a metabolic pathway gének szerepét lymphomás betegeink prognózisát illetően NHL, Hodgkin, CLL, myeloma Terápiára adott válasz, túlélési adatok

32 Módszerek a. A DNS izolálás perifériás vérből QIAamp Blood Mini kittel (QIAGEN GmbH, Germany). b. genotípus meghatározása a polimorfizmusokra specifikus PCR primerek és TaqMan próba kiválasztása az Applied Biosystems Assay-on-Demand kínálatából ( történt. PCR futtatása multiplex reakciókban történt Corbett Rotor-Gene 3000 készüléken két párhuzamos mintából. c. betegek genotípusának meghatározása a genotípus megállapítása pozitív és negatív kontroll bevonásával történt Corbett Rotor-Gene software segítségével alléldiszkriminációt alkalmazva. TaqMan próba elve Genotípusok meghatározása alléldiszkriminációval

33 Vizsgált polimorfizmusok Gén SNP száma SNP FCGR3A rs G T CYP2E1 rs A T NAT1 rs G A NAT2 rs1208 A G GSTP1 rs1695 A G

34 Jelenlegi projekt II. Genetikai eltérések myeloma multiplexben

35 Háttér Drámai fejlődés a myeloma multiplex kezelési, túlélési eredményeiben az elmúlt 10 év során Bizonyos genetikai eltérések kedvezőtlen prognózissal bírnak del (13), del (17p), t (4;14), t (14;16) Ezen betegcsoportban a hagyományos kezelési módszerek jórészt eredménytelenek, csak a bortezomib alapú kombinációs terápiákra vagy kísérleti szerekre reagálnak

36 Terv FISH módszerrel meghatározni újonnan diagnosztizált betegeink genetikai eltéréseit DEOEC Gyermekklinika Genetikai Laboratórium

37 Az immunrendszer regenerációjának vizsgálata autoimmun betegekben autológ őssejt-transzplantációt követően

38 A HSCT és az autoimmun betegségek krónikus gyulladás, szervkárosodás fulmináns lefolyás, életet veszélyeztető szövődmények szigorú kritériumrendszer a szakmai szervezetek ajánlásai alapján: fenyegető, de még nem végleges szervkárosodások (tüdő, vese, ízületek?) alapelv: lymphoablativ kezeléssel megszüntethető az immunregulációs zavar őssejtgyűjtés: manipulálatlan vs. CD34+ szelektált graft kondicionálás: myeloablativ vs. lymphoablativ kemoterápia

39 Sorrend: Engraftment az AHSCT után monocyták thrombocyták granulocyták NK-sejtek Klinikai engraftment: a granulocytaszám > 0,5 G/l három egymást követő napon Az innate immunitással ellentétben az adaptív immunrendszer csak hosszú idő elteltével regenerálódik

40 Lymphocyták regenerációja: NKsejtek számuk a tx utáni 1-3. hónapban szupranormális fenotípus: CD56 high CD16- IFN-gamma termelés IL-2, IL-12 és IL-15-ben gazdag millieu

41 T-sejtek A repopuláció forrásai: thymus (ha működik) és keringő érett T-sejtek A CD8+ sejtek hamarabb jelennek meg inverz CD4/CD8 hányados IL-7 és IL-15 szerepe EBV és CMV specifikus sejtek magas aránya Autoimmun betegekben a Foxp3+ Treg sejtek aránya fordítottan korrelál a betegségaktivitással

42 B-sejtek Igen alacsony szám az első 2-3 hónap során Legjellemzőbb az IgM termelő naiv B- sejt a VDJ gének szomatikus mutációja nélkül A fehérje természetű antigének elleni antitestek termelődése hamarabb normalizálódik, mint a polyszacharidok ellen termelt ellenanyagoké

43 Betegek és módszerek I augusztus november között 14 terápiarefrakter autoimmun beteg: 3 SLE, 4 rheumatoid arthritis, 4 scleroderma, 2 sclerosis multiplex, 1 overlap Graft: 10 esetben manipulálatlan, 4 esetben CD34-szelekció (SSc betegek) Kondicionálás: cyclophosphamide + ATG (12 eset), BEAM + ATG (2 SM-es beteg)

44 Betegek és módszerek II. Vérvétel a tx előtt, majd a +30., 60., 90.,150. napon Lymphocyta szubpopulációk: áramlási citometria + immunfluoreszcencia Citokinek: ELISA (R & D Systems)

45 Sejtpopulációk Markerek CD3+ CD19+ CD4+ CD8+ CD3-CD56+ CD4+25+bright CD4+CD62ligand+CD45RA+ CD4+CD62ligand+CD45RA- CD4+CD62ligand-CD45RA- CD8+CD62ligand+CD45RA+ CD8+CD62ligand+CD45RA- CD8+CD62ligand-CD45RA- CD8+CD62ligand-CD45RA+ Lymphoycta populáció T-sejt B-sejt T-helper sejt T-cytotoxicus sejt Natural killer sejt Regulatorikus T-sejt Naiv T-helper sejt Centralis memória T-helper sejt Effektor memória T-helper sejt Naiv T-cytotoxicus sejt Centralis memória T-cytotoxicus sejt Effektor memória T-cytotoxicus sejt Terminalisan differenciált effektor memória T-cytotoxicus sejt CD19+CD27-IgD- CD19+CD27+IgD+ CD19+CD27+IgD- Naiv B-sejt IgM memória B-sejt IgG memória B-sejt

46 IL-2 IL-3 IL-4 IL-6 IL-7 IL-10 IL-13 IL-15 IL-16 IFN-gamma TNF-alfa Citokinek

47 Lymphocyta szubpopulációk regenerációja I. % before TX day 30 day60 day 90 day yr CD3-CD56+ NK cells CD3+CD8+ T cells CD3+CD4+ T cells CD19+ B cells Szodoray P, Váróczy L et al. Scan J Rheumatol 2011; [Epub ahead of print]

48 Lymphocyta szubpopulációk regenerációja II. % before TX day 30 day60 day 90 day yr 2 yrs CD4 naive CD4 central memory CD4 effector memory Szodoray P, Váróczy L et al. Scan J Rheumatol 2011; [Epub ahead of print]

49 Lymphocyta szubpopulációk regenerációja III. % before TX day 30 day60 day 90 day yr 2 yrs CD8 naive CD8 central memory CD8 effector memory CD8 terminally differentiated effector memory Szodoray P, Váróczy L et al. Scan J Rheumatol 2011; [Epub ahead of print]

50 Lymphocyta szubpopulációk regenerációja IV. % before TX day 30 day60 day 90 day yr 2 yrs CD19 naive CD19+IgG memory CD19+IgM memory Szodoray P, Váróczy L et al. Scan J Rheumatol 2011; [Epub ahead of print]

51 Terv A vizsgálatok folytatása nagyobb beteganyagon A citokinek szerepének meghatározása a lymphocyták regenerációjában

52 Köszönöm a figyelmet!