(11) Lajstromszám: E (13) T2 EURÓPAI SZABADALOM SZÖVEGÉNEK FORDÍTÁSA

Átírás

1 !HU T2! (19) HU (11) Lajstromszám: E (13) T2 MAGYAR KÖZTÁRSASÁG Magyar Szabadalmi Hivatal EURÓPAI SZABADALOM SZÖVEGÉNEK FORDÍTÁSA (21) Magyar ügyszám: E (22) A bejelentés napja: (96) Az európai bejelentés bejelentési száma: EP (97) Az európai bejelentés közzétételi adatai: EP A (97) Az európai szabadalom megadásának meghirdetési adatai: EP B (51) Int. Cl.: C07K 14/44 ( ) A61K 39/018 ( ) C07K 16/20 ( ) C12N 15/30 ( ) (87) A nemzetközi közzétételi adatok: WO PCT/EP 04/ (30) Elsõbbségi adatok: EP (72) Feltalálók: DE VRIES, Erik, NL-3911 JJ Rhenen (NL); GAFFAR, Fasilla, Razzia, NL-1102 AG Amsterdam (NL); YATSUDA, Ana, Patricia, NL-3581 LK Utrecht (NL); SCHAAP, Theodorus, Cornelis, 5835 CP Beugen (NL) (73) Jogosult: Universiteit Utrecht Holding B. V., 3584 CM Utrecht (NL) (74) Képviselõ: dr. Svingor Ádám, DANUBIA Szabadalmi és Jogi Iroda Kft., Budapest (54) Piroplasmida elleni vakcina HU T2 A leírás terjedelme 54 oldal (ezen belül 9 lap ábra) Az európai szabadalom ellen, megadásának az Európai Szabadalmi Közlönyben való meghirdetésétõl számított kilenc hónapon belül, felszólalást lehet benyújtani az Európai Szabadalmi Hivatalnál. (Európai Szabadalmi Egyezmény 99. cikk (1)) A fordítást a szabadalmas az évi XXXIII. törvény 84/H. -a szerint nyújtotta be. A fordítás tartalmi helyességét a Magyar Szabadalmi Hivatal nem vizsgálta.

2 1 HU T A találmány tárgyát Piroplasmida-eredetû fehérje vagy e fehérje immunogén fragmentuma; a Piroplasmidaeredetû fehérjét vagy az immunogén fragmentumot kódoló nukleinsav; a nukleinsavat tartalmazó cdns-fragmentumok, rekombináns DNS-molekulák és élõ rekombináns hordozók; a cdns-fragmentumokat, rekombináns DNS-molekulákat és élõ rekombináns hordozókat tartalmazó gazdasejtek; Piroplasmida-eredetû fehérjét vagy a fehérje immunogén fragmentumát tartalmazó vakcinák; az ilyen vakcinák elõállítására szolgáló eljárások; az ilyen fehérjék vagy fragmentumok alkalmazása; és diagnosztikai tesztek képezik. A babesiosis földrajzilag elkülöníthetõ gócokban elõforduló betegség. Ennek az az oka, hogy a kórokozót egy adott gerincespopulációban jelen lévõ parazitakészletet alkotó kullancsok terjesztik. Csak ott fordulhat elõ babesiosis, ahol kullancsok vannak jelen. Mindent összevetve, különösen az õshonos állatok esetében igaz az, hogy a parazita a gazdaállattal együtt fordul elõ jelentõs megbetegedések okozása nélkül. Sok esetben a babesiosis az emberi tevékenység miatt a genetikai jellemvonásokra való nemesítés és/vagy állatok bevitele olyan ismeretlen környezetbe, ahol a babesiosis endemikus válik problémává [Callow és Dalgliesh, Immunology of Parasitic Infections, , szerk.: Cohen és Warren, kiad.: Blackwell Scientific (1982)]. A babesiosist embereket (és nem csak a legyengült immunrendszerû embereket) is veszélyeztetõ, állatról emberre terjedõ ágensként tartják számon [Gray és mtsai., Int. J. Med. Microbiol., 291, (2002)]. A természetes körülmények között elkapott babesiosis betegség tünetei általában 7 21 nappal jelentkeznek a fertõzés után. E tünetek közé a következõk tartoznak: láz, étvágytalanság, depresszió, vérszegénység, hemoglobinuria (hemoglobinvizelés) és gyorsan kifejlõdõ gyengeség. Fokozott könnyezés, nyáladzás és izomremegés rendszerint elõ szokott fordulni. Idegrendszeri tünetek idõszakos fertõzések során jelentkezhetnek, és a nem kezelt betegség elhalálozáshoz is vezethet. A véralvadásban bekövetkezõ zavarok a vörösvértestek (eritrociták) megnövekedett ragadósságához vezetnek. Ennek eredményeként a hajszálereken a vér nem tud áthaladni, emiatt a belsõ szervekben vérbõség jelentkezik és csökken a hematokrit [packed cell volumes (PCV)]. Továbbá, a fertõzött vörösvértestek szétesése miatt a vörösvértestek száma nagymértékben lecsökken. E hatások következtében sok szövet nem kap elegendõ oxigént és az így jelentkezõ oxigénhiány szövetkárosodást eredményez. A Babesiidae családba tartozó alábbi fajokról kimutatták, hogy a legtöbb, állatorvosi szempontból jelentõs gerinces fajt képesek megfertõzni [Kuttler és Risticed., Babesiosis of domestic animals and man. kiad.; CRC Press, Inc., Boca Raton (1988)]: Szarvasmarha (B. divergens, B. bovis, B. bigemina), sertés (B. trautmanni, B. perroncitoi), juh (B. ovis, B. motasi), ló (B. equi, B. caballi), kutya CB. canis, B. rossi, B. vogeli), és macska (B. felis, B. cati). Mindezen fajokban a Babesia okozta fertõzés közvetlenül vagy másodlagos fertõzések miatti pusztulást vagy többé-kevésbé súlyos gazdasági veszteségeket (a hús, tej, gyapjú vagy utódok minõségének vagy mennyiségének csökkenése) vagy a jó közérzet súlyos romlását eredményezi. A Babesia-fajok közvetlen rokonai a Theileria paraziták. Ezek szintén a Piroplasmida rendbe tartoznak, és biológiailag, illetve epidemiológiailag sok tekintetben hasonlítanak a Babesia családba sorolt fajokhoz. Állategészségügyi szempontból jól ismert Theileria-faj a T. parva, T. annulata, és T. sergenti. Már meglévõ Babesia- vagy Theileria-fertõzés gyógyítására léteznek gyógyszerek. Például kutyák, lovak és szarvasmarhák imidokarb-dipropionáttal kezelhetõk. Azonban egy ilyen injekció a szöveti irritáció miatt fájdalmas. Továbbá az imidokarb-dipropionátnál is számolni kell az ilyen parazitaellenes szerek esetében szokásos hátrányokkal: az immunológiai emlékezés kiépülésének megakadályozása, potenciális toxicitás és a rezisztencia kiépülésének lehetõsége. Kimutatták, hogy a Babesiosis és Theileriosis élõ vakcinákkal végzett vakcinálással szabályozható [ld.: Jenkins, Vet. Parasitol., 101: (2001)]. Ilyen vakcinákat fertõzött állatokból származó gyûjtött vörösvértestekbõl állítanak elõ. Babesiák esetében a paraziták számának növelésére néhány de nem az összes fajra in vitro vörösvértest-tenyészetet fejlesztettek ki. Az állatból vagy tenyészetekbõl származó fertõzött vörösvértesteket, más néven stabilátumokat (stabilates), alkalmazzák állatok vakcinálására. Theileria-fajokból hasonlóképpen állítanak elõ stabilizátumokat. Mivel a hatékony vakcinára oly nagy az igény, Theileria stabilátumokat fertõzött kullancsok nyálmirigyébõl is elõállítottak. Az élõ parazitákat tartalmazó vakcinák általános hátránya az, hogy az inokulációs anyag nagyrészt szabályozatlan, összetételét tekintve igen változékony, biológiailag nem biztonságos, és a nagyszámú kísérleti állat alkalmazása miatt az egész elõállítási folyamat nem etikus. Továbbá, a Piroplasmida paraziták igen labilisak, a szabad oxigéntõl távol kell õket tartani, mert különben gyorsan elpusztulnak. Esetleg vakcinálásra nem a parazitával fertõzött vörösvértesteket alkalmazzák önmagukban, hanem a fertõzött gazdából vett szérumot vagy valamilyen in vitro tenyészet felülúszóját. Az ilyen, fertõzött vörösvértesteket körülvevõ folyadékok úgynevezett oldható parazitaantigéneket [Soluble Parasite Antigens (SPA)] tartalmaznak. Az ilyen készítmények összetételérõl nem sokat tudunk. Felvetették már azt is, hogy a védõ aktivitás a szérumban vagy tápoldatban jelen lévõ, a merozoit fázisban lévõ kórokozó felszíni burkolatán ( coat ) ami a vörösvértest elözönlése (inváziója) során hátramaradó szerkezet jelen lévõ antigének immunizáló kapacitásának köszönhetõ [Ristic és Montenegro-James, Babesiosis of Domestic Animals and Man, , szerk.: Ristic, kiad.: CRC Press). Továbbá, in vitro tenyésztés során sok parazita elpusztul, ezáltal a tápoldatba a parazita belsõ (internális) antigénjei is bekerülnek. Az ilyen SPA-készítmény képes olyan a parazitát nem feltétlenül érintõ immunválaszt indukálni, ami lé- 2

3 1 HU T2 2 nyeges mértékben csökkenti a fertõzés klinikai manifesztálódását [Schetters és Montenegro-James, Parasitology Today, 11, (1995)]. Például, a Babesia canis parazitával fertõzött vörösvértestek in vitro tenyészetébõl származó SPA (Pirodog ), homológ immunpróba-fertõzéssel szemben immunitást indukál, de heterológgal szemben nem. Általában, az SPA¹n alapuló vakcináknak is ugyanazok a hátrányai, mint az élõ parazitákat tartalmazó vakcináknak, azaz nagyrészt nincsenek jellemezve, igen változékonyak és rengeteg óvintézkedésre van szükség ahhoz, hogy biológiailag biztonságosak legyenek. Továbbá az ilyen vakcinák elõállítását igen nehéz nagyléptékben megvalósítani, mivel a paraziták, vörösvértestek, és/vagy szérum biztosításához a kísérleti állatok fertõzésére, elhelyezésére és mintagyûjtésre van szükség. A WO 90/11776 sz. nemzetközi közzétételi irat a Babesia bovis merozoit felszínén expresszálódó, Babesia bovis-eredetû fehérjéket ismertet. A leírás szerint, ezeket a találmány tárgyát képezõ fehérjéktõl eltérõ fehérjéket vakcinálásra és diagnosztizálásra alkalmazták. A találmány egyik tárgya Piroplasmida-szervezet által okozott fertõzés megelõzésére vagy enyhítésére hatékony vakcinaként alkalmazható, jól meghatározott, biztonságos, stabil fehérjék és azok fragmentumai, amelyek elõállításának léptéknövelése könnyen kivitelezhetõ. Váratlanul felismertük, hogy az egyik új, Piroplasmida-eredetû fehérjét vagy annak immunogén fragmentumát tartalmazó vakcina magában foglalja mindezen elõnyös jellemzõket. Élõ parazita- vagy SPA-vakcinák számos hátránya kiküszöbölhetõ, ha ilyen Piroplasmida-eredetû fehérjét vagy a fehérje immunogén fragmentumát vakcinákban alkalmazzuk. Ilyen fehérje rendkívül meghatározott, biológiailag biztonságos, a termék sokkal jobban stabilizálható, mint az élõ paraziták, és ennek elõállításának léptéknövelése könnyen megvalósítható. Váratlanul felismertük, hogy Piroplasmida-eredetû fehérjék ellen vagy a fehérjék immunogén fragmentumai ellen termelt antitestek hatékonyan gátolják a paraziták behatolását a gazdasejtekbe, és ezáltal megzavarják a parazita fertõzési ciklusát. Ennélfogva a fehérje elnevezése: elterjedést gátló antigén (invasion inhibiting antigen) (IIA). A Piroplasmida parazita elterjedése gazdasejtjében a parazitafertõzés egyik kritikus lépése. Amennyiben az e lépéssel interferáló antitestek indukálásával sikerül megzavarni ezt a szintet, a paraziták eleve nem tudnak bejutni a gazda sejtjeibe. Ez egy adott gazdában megelõzi vagy legalábbis csökkenti a fertõzés szintjét vagy a betegség klinikai jeleit, és ennek eredményeként a betegség súlyosságát. Emellett a környezetben a betegség további elterjedése megáll vagy csökken, mivel kevesebb számú kullancs válik hordozóvá, amikor vakcinált gazdákon táplálkozik, ennélfogva a fertõzés környezetre gyakorolt nyomása lecsökken. Piroplasmida parazita okozta fertõzést gátló antitestekhez vezetõ védõ immunválaszt indukálni képes Piroplazmid IIA¹k specifikus antiszérumokkal kimutathatók a Piroplasmida parazitákban, proliferálódó paraziták tenyészeteiben és fertõzött sejtekben. Fertõzött sejtek, paraziták vagy ezek tenyészetei lizátumainak 1¹D vagy 2¹D (2¹dimenziós) Western-blotjában e specifikus antiszérumok felismerik ezeket a IIA-kat. A Piroplazmid IIA¹k expressziós rendszerben expresszálhatók. Az ilyen módon expresszált fehérjék vagy azok fragmentumai alkalmazhatók olyan vakcina elõállítására, amely Piroplasmida-szervezet okozta fertõzés esetén, specifikus antitestek vagy antigénspecifikus limfociták indukálása révén védi az emlõsöket a betegségtõl vagy annak klinikai jeleitõl. Ennélfogva, a találmány tárgya Piroplasmida-eredetû fehérje, azzal jellemezve, hogy a SEQ ID NO: 2 aminosavszekvenciával legalább 70%-ban, elõnyösebben 75%-ban, elõnyösebben 80, 85, 90, 92, 94, 95, 96, 97, 98, 99 vagy 100%-ban (elõnyösségi sorrend szerint sorrendbe állítva) hasonló aminosavszekvenciát tartalmazó fehérje, vagy a fehérjeepitópot tartalmazó, antigéntulajdonságú fragmentuma. A találmány szerinti Piroplasmida-fehérje jellemzõ példája a: Babesia bovis 1. sz. Piroplazmid IIA (BIIA1), amelynek aminosavszekvenciáját a SEQ ID NO: 2 mutatja be. A fehérje kifejezés aminosavak molekuláris láncát foglalja magában. A fehérje kifejezés nem egy specifikus hosszúságú, szerkezetû vagy alakú fehérjét jelent, és szükség esetén in vitro vagy in vivo módosítható, például glikozilálással, amidálással, karboxilezéssel, foszforilációval vagy a térbeli feltekeredés megváltoztatásával. A fehérje meghatározása többek között peptideket, oligopeptideket és polipeptideket foglal magában. Egy adott fehérje lehet biológiai és/vagy szintetikus eredetû. A találmány szerinti Piroplasmida-fehérje a Piroplazmidák közé sorolt szervezetbõl elõállítható fehérje. Elõnyös, ha a Piroplasmida-fehérje a következõk közül választott szervezetbõl származik: Babesia divergens, B. bovis, B. motasi, B. caballi, B. equi, B. canis, B. rossi, B. vogeli, B. felis, B. cati, B. ovis, B. trautmanni, B. bigemina, B. microti és B. gibsoni. Elõnyösebb, ha a Piroplasmida-fehérje a következõk közül választott szervezetbõl származik: Babesia bovis, B. caballi, B. equi, B. canis, B. rossi és B. bigemina. Legelõnyösebb, ha a Piroplasmida-fehérje a Babesia bovis-ból származik. Az aktuális rendszertani besorolás figyelembevételével, a szakember számára egyértelmû, hogy a rendszertani besorolás az újabb szempontok felismerése miatt idõrõl idõre változik, és ennek következtében a kérdéses fajok új vagy más rendszertani csoportokba kerülhetnek. Azonban ettõl a kérdéses szervezet fehérjekészlete nem, csak annak besorolása változik meg, így az ismételten besorolt szervezetek is a találmány oltalmi körébe tartoznak. Ez különösen releváns az olyan közeli rokonságban álló családok esetében, mint a Babesiidae és Theilerildae. Például: a Babesia equi¹t nemrég Theileria equi-ként sorolták át. 3

4 1 HU T2 2 Ahhoz, hogy egy adott fehérje fragmentuma antigén legyen, a fragmentumnak bizonyos hosszúságúnak kell lennie; a túlságosan kisméretû fragmentumokat az antigénbemutató sejtek nem dolgozzák fel olyan fragmentumokká, amelyek mint olyanok képesek MHC-molekuIákhoz kapcsolódni a limfociták számára megfelelõ antigénbemutatás céljából. Ahhoz, hogy egy adott fragmentum MHC I receptorhoz kötõdjön, legalább 8 11 aminosavból álló epitópot kell tartalmaznia, az MHC II receptorhoz való kötõdéshez pedig legalább aminosavat kell tartalmaznia [ld. például: Germain és Margulies, Annu. Rev. Immunol., 11, (1993)]. Az ennél rövidebb fehérjefragmentumok önmagukban nem lesznek antigéntulajdonságúak, ezeket a technikában ismert eljárások alkalmazásával valamilyen hordozóhoz, például KLH, BSA vagy hasonlók, kell kapcsolni. A találmány oltalmi körébe tartoznak azok az ilyen rövid fragmentumok, amelyek kapcsolás esetén képesek lehetnek immunválaszt indukálni. A leírás szerinti értelemben, az epitóp kifejezés egy T¹ és/vagy B¹limfocita antigénreceptorával reagáló antigénmolekula-részt jelent. Ennélfogva, a találmány szerinti epitóp specifikus T¹ és/vagy B¹sejteket indukál és/vagy aktivál oly módon, hogy e sejtek a fertõzés vagy betegség lefolyását megzavaró immunreakciót indít el. Eszerint, ilyen epitópok révén, egy adott fehérje antitesteket indukálhat és/vagy immunválaszt válthat ki. A leírás szerinti értelemben, az immunogén fragmentum kifejezés egy adott Piroplasmida-fehérje olyan, epitópot tartalmazó antigénfragmentumát jelenti, amely képes immunválaszt indukálni az ilyen Piroplasmida-fehérjék ellen, azzal a megkötéssel, hogy az ilyen antitestek képesek megzavarni az elterjedési folyamatot. Az alábbiakban megmagyarázzuk, hogy miként lehet ilyen immunogén fragmentumokat felismerni. A találmány szerinti Piroplasmida-fehérje immunogén fragmentuma a Piroplasmida-fehérje találmány szerinti aminosavszekvenciájából legalább 10 aminosavat tartalmaz. Az ilyen fragmentum elõnyösen 12, 15, 20, 30, 40, 50, 75, 100, 150, 200, vagy 300 aminosavat tartalmaz (az elõnyösség sorrendjében) a Piroplasmida-fehérje találmány szerinti aminosavszekvenciájából. Például, a találmány szerinti Piroplasmida-fehérje immunogén fragmentumát a fehérje azon része képezi, amelybõl hiányzik az N¹terminális szignálszekvencia és/vagy a C¹terminális szekvencia. Más fragmentumok, például azok, amelyek egy adott Piroplazmid IIA fehérje specifikus epitópját tartalmazzák. Ilyen epitópok az alábbiakban körvonalazott eljárásokkal határozhatók meg. Minden ilyen fragmentum a találmány oltalmi körébe tartozik. A találmány szerinti Piroplasmida-fehérje immunogén fragmentumai és/vagy epitópjai azonosítása az erre kifejlesztett különféle eljárásokkal például a PEPSCAN-nak nevezett eljárással, vagy ismert fragmentumok és/vagy epitópok közötti összehasonlításokat végzõ algoritmusokkal könnyen elvégezhetõ. A PEPSCAN eljárás [WO 84/03564 sz. és WO 86/06487 sz. nemzetközi közzétételi iratok; J. of Immunol, meth. 102, (1987)] egy könnyen elvégezhetõ, gyors és jól megalapozott eljárás egy adott fehérje immunológiai determinánsai meghatározására. Az eljárásban a kérdéses fehérjét progresszíven átfedõ peptidfragmentumok sorozatának szintetizálására kerül sor, majd e polipeptideket a fehérje elleni specifikus antitestekkel tesztelik annak azonosítására, hogy közülük melyik képes kötõdni a T¹ és/vagy B¹limfociták antigénreceptorához. A találmány szerinti fehérjék elleni ilyen antitestek, a technikában jól ismert eljárások alkalmazásával elõállított poliklonális vagy monoklonális antitestekként elérhetõk. Számítógépes algoritmusok alkalmazása specifikus fehérjefragmentumok, a már ismert epitópokkal való szekvenciális és/vagy szerkezeti egyezésük alapján immunológiailag fontos epitópokként való meghatározására is egy jól ismert eljárás. Az e régiók meghatározása alapulhat a Hopp- és Woods-féle hidrofilicitási kritériumon [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78, (1981)], és a Chou- és Fasman-féle másodlagos szerkezeti szempontokon [Advances in Enzymology, 47, (1987), és US sz. amerikai egyesült államokbeli szabadalmi irat]. Immunogén epitópok feltehetõen elõrejelezhetõk a fehérje aminosavszekvenciájának Berzofsky-féle amficilitási kritériumának segítségével végzett számítógépes elemzéssel [Science, 235, (1987) és NTIS US 07/ sz. amerikai egyesült államokbeli szabadalmi irat]. Ezen eljárások alkalmazásának összegzése az alábbi közleményekben található: Lu (általános alapelvek: Tibtech, 9, (1991), Lu (áttekintés: Vaccine, 10, 3 7(1992), és Berzofsky (HIV-epitópok; The FASEB Journal, 5, (1991). Ezen eljárások hatékonyságát Margalit és mtsai. mutatták be [Margalit és mtsai., J. of Immunol. 138, (1987)], akik szerint T¹sejt-eredetû epitópok ilyen eljárással végzett elõrejelzése terén 75%¹os eredményességi arányokat adtak meg. További bizonyíték a BIIA1 3 antigén fehérjéjének sikeres elõrejelzése, ami az 1. példa fejezetében van körvonalazva. Ezt követõen azt kell meghatározni, hogy a fenti eljárások alkalmazásával talált epitóp valóban képes¹e megzavarni a fertõzési folyamatot. Azonban ezt egy egyszerû in vitro fertõzésgátló vizsgálatban igen gyorsan és könnyen el lehet végezni. Ilyen kísérlet van leírva az 1. példa, fejezetében. Egy adott aminosavszekvencia és a találmány szerinti fehérje közötti százalékos hasonlóságot a SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, vagy 10 sz. teljes hosszúságú aminosavszekvenciával való egyeztetéssel kell meghatározni. A találmány szerinti fehérjével való százalékos hasonlóságot a BLAST2 SEQUENCES számítógépes program, honlapon található BlastP alprogramjának [Tatusova és Madden, FEMS Microbiol. Letters, 174, (1999)] kiválasztásával kell meghatározni. Az alkalmazandó összehasonlítási mátrix a: Blosum62, a következõ alapbeállítási paraméterekkel: open gap penalty: 11; extension gap penalty: 1; és gap x_dropoff: 50. 4

5 1 HU T Ez a program Azonosság (Identities) -ként százalékban megadja az azonos aminosavakat, és Pozitív (Positives) -ként pedig százalékos értékben felsorolja a hasonló aminosavakat. Hasonló aminosavak az azonos és az azonos értékû aminosavak. Az azonos értékû aminosavak az alábbiakban vannak leírva. Egy adott Piroplasmida-fehérje esetében egyértelmû, hogy az egyes Piroplasmida-törzsekhez vagy ¹fajokhoz tartozó fehérjék között természetes változékonyság áll fenn. E változatok a teljes szekvenciát érintõen fennálló aminosavkülönbségek, vagy a szekvenciában létezõ aminosavdeléciók, ¹szubsztitúciók, ¹inzerciók, ¹inverziók vagy ¹addíciók révén mutathatók be. Biológiai és immunológiai mûködés megváltoztatásához nem elengedhetetlenül szükséges aminosavszubsztitúciók már ismertek az irodalomban [ld. például, Neurath és mtsai., The Proteins. kiad.: Academic Press, New York (1979). Rokon aminosavak közötti aminosavhelyettesítés vagy az evolúció során gyakran elõfordult aminosavhelyettesítés, például a Ser/Ala, Ser/Gly. Asp/Gly, Asp/Asn, és Ile/Val [Dayhof, Atlas of protein sequence and structure. Nat. Biomed. Res. Found., Washington D.C., 5, suppl. 3 (1978)] További közönséges aminosavszubsztitúciók közé tartozik az Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, AlaA/al, Thr/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Leu/Ile, Leu/Val és Ala/Glu. Az ilyen rokon és általában szubsztituált aminosavakat nevezzük azonos értékûnek. Ezen információ alapján Lipman és Pearson kifejlesztett egy, a fehérjék gyors és érzékeny összehasonlítására [Science, 227, (1985)] és a fehérjék közötti funkcionális hasonlóság meghatározására szolgáló eljárást. A találmány példaként szolgáló megvalósítási módjaiban megadott ilyen aminosavszubsztitúciók és deléciókat és/vagy inzerciókat tartalmazó variációk a találmány oltalmi körébe tartoznak, amennyiben az ennek eredményeként kapott fehérjének megvan az a képessége, hogy egy adott Piroplasmida parazita proliferációját gátló immunválaszt, például Piroplasmida parazita elterjedését gátló antitesteket indukáljon. A találmány szerinti valamelyik Piroplasmida-fehérje aminosavszekvenciájában fennálló ilyen variációkat biológiai vagy funkcionális homológoknak tekintjük, és ezek mindegyike a találmány oltalmi körébe esik. Ez megmagyarázza azt, hogy a különféle Piroplasmida-fajokból izolált, találmány szerinti Piroplasmidafehérjék és például a SEQ ID NO: 2 sz. aminosavszekvencia közötti hasonlóság mértéke lecsökkenhet akár 70%¹ra is, bár ugyanazon tulajdonságokat mutató a bemutatott példa szerint: Piroplasmida parazita elterjedését megakadályozó antitestek indukálására képes ugyanazon fehérjékrõl van szó. Ha egymással összehasonlítjuk a találmány szerinti, különféle Piroplasmida-szervezetekbõl nyert Piroplasmida-fehérjéket, akkor kiderül, hogy köztük jellemzõen több mint 50%¹os aminosavhasonlóság áll fenn; a különféle Babesia-fajokból nyert Piroplasmida-fehérjék között jellemzõen több mint 85%¹os, és a B. bovis különféle izolátumaiból nyert Piroplasmida-fehérjék között jellemzõen több mint 95%¹os aminosavhasonlóság áll fenn. A találmány szerinti Piroplasmida-fehérjét elõnyösen génsebészeti eljárások és rekombináns expressziós rendszerek alkalmazásával állítjuk elõ. Ezek közé tartozik a nukleinsavak, cdns-fragmentumok, rekombináns DNS-molekulák, élõ rekombináns hordozók, és/vagy gazdasejtek alkalmazása. Ennélfogva, a találmány egy másik szempontja szerint, a találmány tárgya nukleinsav, azzal jellemezve, hogy a nukleinsav a találmány szerinti Piroplasmida-fehérjét vagy a fehérje epitópot tartalmazó, antigéntulajdonságú fragmentumát kódolja. A találmány szerinti nukleinsav egyik megvalósítási módja a SEQ ID NO: 1 sz. alatt megadott nukleinsavszekvenciát tartalmazza. A nukleinsav kifejezés dezoxi- vagy ribonukleinsavak molekuláris láncát foglalja magában. A nukleinsav kifejezés nem egy specifikus hosszúságú nukleinsavat jelent, ennélfogva e kifejezésbe tartoznak DNSbõl és/vagy RNS-bõl álló polinukleotidok, gének, nyitott leolvasási keretek [open reading frames (ORF s)], próbák, láncindítók, spacerek és adaptorok. Egy adott nukleinsav lehet biológiai és/vagy szintetikus eredetû. A nukleinsav lehet egyes szálú vagy kettõs szálú formában. Az egyes szál lehet szensz vagy antiszensz orientációban. A kifejezés továbbá módosított RNSeket vagy DNS-eket is jelent. A nukleinsav bázisaiban módosítások végezhetõk, és olyan bázisok, mint például az inozin, is beépíthetõk. Más módosítások közé tartozhatnak például a vázon végzett módosítások. A kódol kifejezés az alábbiakat foglalja magában: a fehérjeexpresszió lehetõségének biztosítása, többek között transzkripció és/vagy transzláció révén, amennyiben a megfelelõ körülmények közé kerül. A találmány szerinti nukleinsav a találmány szerinti Piroplasmida-fehérjét vagy a fehérje immunogén fragmentumát kódolja. A találmány szerinti nukleinsav minimális hossza 30 nukleotid. Elõnyös, ha a találmány szerinti nukleinsav 40, 50, 100, 250, 500, 1000, vagy 1500 nukleotidot tartalmaz (az elõnyösség sorrendjében). A találmány szerinti nukleinsav például a találmány szerinti Piroplasmida-fehérjét kódoló olyan nukleinsav, amelybõl hiányzik az N¹terminális szignálszekvencia és/vagy a C¹terminális szekvencia. Más nukleinsavak tartalmazhatnak olyan szekvenciát, amely egy adott Piroplasmida-fehérje valamelyik specifikus epitópját kódolja. Minden ilyen nukleinsav a találmány oltalmi körébe tartozik. A találmány szerinti nukleinsavak között nem szerepelnek az alábbi szekvenciák: a BIIA1 vonatkozásában (SEQ ID NO: 1), az alábbi EST szekvenciák: B_bovis-11e05.plc B_bovis-344e09.qlc B_bovis-384f06.qlc B_bovis-261d05.qlc B_bovis-5e5.plc B_bovis-373g01.qlc 5

6 1 HU T2 2 B_bovis-418b06.qlc B_bovis-375d02.qlc B_bovis-407d03.qlc B_bovis-284-f07.qlc a BUM vonatkozásában (SEQ ID NO: 1), az alábbi összeszerelt ismert szekvenciájú DNS-blokkok (contig): Bbovis.CONTlG.1029 Bbovis.CONTIG.227 A BIIA1¹ra vonatkozó EST és contig szekvenciák az alábbi internethonlapon elérhetõk: A találmány szerinti nukleinsavak közötti százalékos hasonlóság a BLAST2 SEQUENCES számítógépes program, honlapon található BlastN alprogramjának [Tatusova és Madden, FEMS Microbiol. Letters, 174, (1999)] kiválasztásával van meghatározva. Az alkalmazott paraméterek az alapbeállítási paraméterek: reward for a match: +1; penalty for a mismatch: 2; open gap penalty: 5; extension gap penalty: 2; and gap x_dropoff: 50. A fentiekben leírt BlastP programmal szemben, a BlastN csak az azonosságokat sorolja fel, a hasonlóságokat viszont nem adja meg: az azonos nukleotidok százalékát azonosságok -ként jelzi ki. A technikában jól ismert, hogy egy vagy ugyanazon fehérjét több különbözõ nukleinsav kódolhat. Ez a molekuláris biológiában lötyögésként vagy a genetikai kód degeneráltságaként ismert jelenség eredménye, ami szerint a transzláció során az mrns számos kodonja vagy tripletje ugyanazon aminosav hozzácsatlakozását okozza az aminosavlánc növekedése során a riboszómán. Ez leginkább egy adott aminosavat kódoló tripletek második és harmadik bázisára érvényes. E jelenség azt eredményezheti, hogy két, egymástól körülbelül 30%-ban különbözõ nukleinsav még mindig ugyanazt a fehérjét kódolja. Ennélfogva, két, körülbelül 70%¹os nukleinsavazonosságot mutató nukleinsav még mindig egyetlen és ugyanazon fehérjét kódolhatja. Annak eldöntésére, hogy egy adott nukleinsavszekvencia a találmány szerinti nukleinsavszekvencia vagy sem, abba a kérdéskörbe tartozik, hogy sztringens körülmények között egy bizonyos nukleinsavszekvencia hibridizál¹e a szekvencialistában 1. azonosító számon megadott nukleotidszekvenciával. Amennyiben sztringens körülmények között egy adott nukleinsav hibridizál a szekvencialistában 1. azonosító számon megadott nukleotidszekvenciával, akkor a kérdéses nukleinsavszekvenciát a találmány szerinti nukleinsavszekvenciának tekintjük. A Meinkoth- és Wahl-féle Tm olvadási pontra [Anal. Biochem., 138, (1984)] a sztringens körülményeket alábbi képlet határozza meg: Tm=[81,5 C+16:6(log M)+0,41(%GC) 0,61(%formamid) 500/L] 1 C/1% mismatch Ebben a képletben, M=egyértékû kationok molalitása; %GC=a DNS-ben lévõ guanozin és citozin nukleotidok százalékos aránya; L=a hibrid bázispárok hossza; és a mismatch=az azonos egyezések hiánya. A sztringens körülmények olyan körülmények, amelyek mellett nukleinsavszekvenciák vagy azok fragmentumai a szekvencialistában 1. azonosító számon megadott nukleinsavszekvenciával még mindig hibridizálnak, amennyiben az azonos egyezések hiánya 30% (azaz, amennyiben mindössze 70%-ban azonosak). A találmány szerinti Piroplasmida-fehérjéket kódoló nukleinsavakat a Piroplasmida rendbe tartozó fajokból lehet kinyerni. Azonban, a találmány egy elõnyösebb megvalósítási módjában, a Piroplasmida-fehérjét vagy a fehérje immunogén fragmentumait az jellemzi, hogy azok a következõk közül választott szervezetbõl nyerhetõk ki: Babesia divergens, B. bovis, B. motasi, B. caballi, B. equi, B. canis, B. rossi, B. vogeli, B. felis, B. cati, B. ovis, B. trautmanni, B. bigemina, B. microti és B. gibsoni. Elõnyösebben, a nukleinsavak a következõk közül választott szervezetbõl nyerhetõk ki: Babesia bovis, B. caballi, B. equi, B. canis, B. rossi és B. bigemina. Annak lehetõségét, hogy a kérdéses fajokat taxonómiailag máshová sorolják vagy új fajként írják le, a fentiekben már tárgyaltuk. Mivel ez nem változtatja meg a szervezet genomját, az ilyen ismételten besorolt szervezetek is a találmány oltalmi körébe tartoznak. A találmány szerinti Piroplasmida-fehérjék génjeinek és fehérjéinek nagyfokú konzervációja miatt, a találmány oltalmi körébe tartoznak nem emlõseredetû Piroplasmidákból származó Piroplasmida-fehérjék, a fehérjék immunogén fragmentumai és ilyen Piroplasmida-fehérjéket vagy azok fragmentumait kódoló nukleinsavak. Ilyen rokon fehérjéket vagy azok génjeit paralógoknak vagy ortológoknak lehet nevezni. A találmány szerinti fehérjét kódoló nukleinsavak a szakember számára jól ismert és standard szövegkönyvekben mint például Sambrook és Russell, Molecular cloning: a laboratory manual kiad.: Cold Spring Harbour Laboratory Press (2001) részletesen leírt standard molekuláris biológiai eljárásokkal kinyerhetõk, manipulálhatók és expresszálhatók. Az ilyen manipulációk egyike a cdns-fragmentum szintézise RNS-bõl, elõnyösen parazitákból vagy parazitával fertõzött sejtekbõl vagy szervezetekbõl a technikában ismert eljárásokkal izolálható mrns-bõl. Ennélfogva, a találmány egy másik szempontja szerint a találmány tárgyát a találmány szerinti cdnsfragmentum képezi. A cdns-fragmentum reverz transzkripcióval történõ kinyerésének elõnyös módja a polimeráz-láncreakció (PCR) eljárás révén történik. PCR-reakciók kivitelezésére szolgáló standard eljárások és protokollok részletesen le vannak írva a Dieffenbach és Dveksler, PCRprimers: a laboratory manual címû kiadványban [kiad.: CSHL Press (1995)]. A találmány egyik elõnyös megvalósítási módjában, a találmány tárgya a találmány szerinti nukleinsavat tartalmazó rekombináns DNS-molekula, vagy a találmány szerinti cdns-fragmentum, amely nukleinsav vagy cdns, mûködõképesen kapcsolt promoter szabályozása alatt áll. A találmány szerinti rekombináns DNS-molekula elõállítására elõnyösen DNS-plazmidokat alkalmazunk. 6

7 1 HU T2 2 Ilyen plazmidok például a DNS-inzert mennyiségének növelésére, próbaként és további manipulációkra szolgáló eszközként alkalmazhatók. Klónozáshoz az ilyen plazmidok közé tartoznak például a pbr, puc, és pgem sorozat plazmidjai, amelyek mindegyike számos kereskedelmi forrásból beszerezhetõ. A találmány szerinti fehérjét vagy a fehérje immunogén fragmentumát kódoló nukleinsav a technikában jól ismert eljárások alkalmazásával külön plazmidokba klónozható és módosítható a kívánt konformáció elõállítása céljából. Azonban javított klónozási vagy expressziós célokból ezek akár egy konstrukcióba is kombinálhatók. A találmány szerinti Piroplasmida-fehérjét vagy annak immunogén fragmentumát kódoló kódolószekvencián restrikciós enzimekkel végzett emésztéssel, irányított mutagenezissel vagy polimeráz-láncreakciós (PCR) eljárásokkal lehet módosításokat végezni. Fehérjetisztításhoz vagy ¹kimutatáshoz, illetve az expressziós szint növelése céljából további nukleinsavak adhatók a szekvenciához. Ennek eredményeként a cdns-fragmentumban vagy a rekombináns DNS-molekulában lévõ végsõ nukleinsav nagyobb lehet, mint a Piroplasmida-fehérje kódolásához szükséges szekvenciák. Amennyiben ilyen további elemek leolvasási keretben történnek beillesztésre, akkor ezek az expresszálandó Piroplasmida-fehérje integrális részeivé válnak. Az ilyen fúziós fehérjék is a találmány oltalmi körébe tartoznak. Egy adott nukleinsav, cdns-fragmentum vagy rekombináns DNS-molekula expresszálásának elengedhetetlen feltétele az, hogy e molekulák olyan transzkripciós szabályozószekvenciához legyenek mûködõképesen kapcsolva, amely képes a nukleinsav, cdns vagy rekombináns DNS transzkripcióját szabályozni. A transzkripciós szabályozószekvenciák a technikában jól ismertek és többek között ide tartoznak a promoterek és enhancerek. A szakember számára egyértelmû, hogy a promoter kiválasztása kiterjed bármilyen, géntranszkripció irányítására képes, eukarióta, prokarióta vagy virális promoterre, amennyiben a promoter mûködõképes az alkalmazott expressziós rendszerben. A találmány egyik elõnyösebb megvalósítási módjában, a találmány tárgya a találmány szerinti nukleinsavat, vagy a találmány szerinti cdns-fragmentumot tartalmazó élõ rekombináns hordozó mikroorganizmus (ahol a nukleinsav vagy a cdns-fragmentum mûködõképesen kapcsolt promoter szabályozása alatt áll), vagy a találmány szerinti rekombináns DNS-molekula. Ilyen élõ rekombináns hordozók (LRC¹k) például a mikroorganizmusok, például baktériumok, paraziták és vírusok, amelyekbe további genetikai információ ebben az esetben a találmány szerinti Piroplasmida-fehérjét vagy annak immunogén fragmentumát kódoló nukleinsav, cdns, vagy rekombináns DNS-molekula lett kódolva. Ilyen LCR-ekkel oltott célemlõsök olyan immunogén választ hoznak létre, amely nemcsak a hordozó immunogénjei ellen, hanem az LCR¹be ráadásul klónozott genetikai kód például a találmány szerinti Piroplasmida-fehérjét vagy annak immunogén fragmentumát kódoló szekvencia által kódolt heterológ fehérje(ék) vagy immunogén fragmentumok ellen irányul. Bakteriális LRC-ként például a technikában ismert gyengített Salmonella-törzsek is elõnyösen alkalmazhatók. Esetleg élõ rekombináns hordozó paraziták többek között Vermeulen közleményében is le vannak írva [Int. Journ. Parasitol., 28, (1998)]. Nukleinsavak célsejtekbe való bejuttatására LRCvírusok is alkalmazhatók. Az élõ rekombináns hordozó vírusokat más néven vektorvírusoknak is nevezzük. Vektorként gyakran alkalmazott vírusok a vacciniavírusok [Panicali és mtsai., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79, 4927 (1982)], Herpesvírusok [EP A2 sz. európai közzétételi irat], és Retrovírusok [Valerio, és mtsai., in: Experimental Haematology today, 92 99, szerk.: Baum, Dicke, Lotzova, és Pluznik, kiad.: Springer Verlag, New York]. A technikában jól ismert in vivo homológ rekombinációs eljárás alkalmazható a találmány szerinti rekombináns nukleinsav bevitelére a beillesztett, találmány szerinti nukleinsav, cdns vagy rekombináns DNS expresszióját a gazdaállatban indukálni képes és a célra kiválasztott LRC baktérium, parazita vagy vírus genomjába. Expressziós célokra, bakteriális, élesztõ¹, gomba¹, rovar- és gerinceseredetû sejten alapuló expressziós rendszereket gyakorta alkalmaznak gazdasejtekként. Ilyen expressziós rendszerek a technikában jól ismertek és általában beszerezhetõk például kereskedelmi forgalomban az InVitrogen¹en (Hollandia) keresztül. Ennélfogva a találmány egy még elõnyösebb megvalósítási módjában, a találmány tárgya a találmány szerinti nukleinsavat vagy a találmány szerinti cdnsfragmentumot tartalmazó gazdasejt (amelyben a nukleinsav vagy a cdns-fragmentum mûködõképesen kapcsolt promoter szabályozása alatt áll), vagy a találmány szerinti élõ rekombináns hordozó mikroorganizmus. A találmány szerinti Piroplasmida-fehérje expresszálására alkalmazandó gazdasejt lehet bakteriális eredetû, például származhat Escherichia coli, Bacillus subtilis, Lactobacillus sp. vagy Caulobacter crescentus-fajokból, és az ilyen sejteket baktériumból származó plazmidokkal vagy bakteriofágokkal kombinálva alkalmazzuk a Piroplasmida-fehérjét kódoló szekvencia expresszálására. A gazdasejt eukariótaeredetû is lehet, például élesztõsejt élesztõre specifikus vektormolekulákkal kombinálva, vagy magasabb eukarióta sejt, például rovarsejt [Luckow és mtsai., Bio-technology, 6, (1988)] vektorokkal vagy rekombináns bakulovírusokkal kombinálva; növényi sejt, például Ti¹plazmidon alapuló vektorokkal vagy növényi vírusvektorokkal kombinálva [Barton és mtsai., Cell, 32, 1033 (1983)]; vagy emlõssejt, például HeLa sejtek, kínai aranyhörcsög ováriumából származó sejtek vagy Crandell Rees macska veséjébõl származó sejtek a megfelelõ vektorokkal vagy rekombináns vírusokkal kombinálva. 7

8 1 HU T2 2 Ezen expressziós rendszerek mellett, növényi sejtek vagy parazitán alapuló expressziós rendszerek is vonzó expressziós rendszerek. Parazitaexpressziós rendszerek például azok, amelyek a sz. francia szabadalmi iratban és az US 08/ sz. US NTIS publikációban [Hoffman és Rogers (1993)] vannak leírva. Biológiai alkalmazásra szánt polipeptidek növényi expressziós rendszerei például azok, amelyek Fischer és mtsai. [Eur. J. of Biochem., 262, (1999)] és Larrick és mtsai. [Biomol. Engin., 18, (2001)] közleményében vannak leírva. Expresszió az úgynevezett sejtmentes expressziós rendszerekben is végezhetõ. Ilyen rendszerek a kérdéses rendszerben mûködõ promoterhez mûködõképesen kapcsolt megfelelõ rekombináns nukleinsav expresszálásához szükséges minden lényeges faktort tartalmaznak. Ilyen rendszer például az E. coli-lizátumon alapuló rendszer (Roche, Basel, Svájc), vagy a nyúleredetû retikulocita lizátumán alapuló rendszer (Promega, Madison, USA). A találmány szerinti Piroplasmida-fehérje vagy a fehérje immunogén fragmentumai igen alkalmasak a vakcina elõállítására. Ilyen fehérjék vagy fragmentumok kinyerhetõk parazitákból, vagy Piroplasmida parazitákkal fertõzött állatokból vagy sejtekbõl. Azonban sokkal kényelmesebb a találmány szerinti Piroplasmida-fehérjét vagy a fehérje immunogén fragmentumát kódoló nukleinsav alkalmazása valamilyen expressziós rendszerben. Az elõállított fehérjék vagy fragmentumok összegyûjtését követõen ezeket fehérjealegységvakcinává formulázzuk, például a találmány szerinti Piroplasmida-fehérje vagy a fehérje immunogén fragmentumának gyógyászatilag elfogadható hordozóval való összekeverésével. Ennélfogva a találmány egy másik szempontja szerint, a találmány tárgyát a találmány szerinti fehérjét vagy a fehérjeepitópot tartalmazó, antigéntulajdonságú fragmentumát, a találmány szerinti nukleinsavat, cdns-fragmentumot, rekombináns DNS-molekulát, élõ rekombináns hordozó mikroorganizmust vagy gazdasejtet, vagy ezek kombinációját és gyógyászatilag elfogadható hordozót tartalmazó vakcina képezi. A fentiekben leírtak szerint egy adott Piroplasmidafehérje vagy a fehérje immunogén fragmentuma elõnyösen alkalmazható vakcinálásra. A Piroplasmida-fehérje vagy a fehérje immunogén fragmentuma vagy megzavarja a Piroplasmida parazita proliferációját (például meggátolja a gazdasejt elözönlését), vagy pedig olyan védõ immunválaszt (például specifikus antitesteket vagy aktivált limfocitákat) indukál, amely megzavarja a parazita proliferációját vagy a parazita miatt jelentkezõ klinikai jeleket. Amennyiben az ilyen fehérjék vagy fragmentumok önmagukban nem váltják ki a kívánt választ, akkor ezeket valamilyen hordozóhoz, például KLH, BSA vagy hasonlók, lehet kapcsolni a technikában ismert eljárások alkalmazásával. Fehérjéknek vagy azok fragmentumainak kapcsolása az indukált immunválasz fokozása vagy módosítása céljából is történhet. Például általános gyakorlat az, hogy fehérjét (¹fragmentumot) kapcsolnak Tetanus toxoidhoz a T¹sejtválasz fokozása céljából. Emellett, specifikus effektormolekulák például toxinok is hozzáadhatók a célsejtek pusztításának fokozása céljából. Ilyen kapcsolás végezhetõ az aminosavszekvenciák közvetlen vagy intermedier szerkezeten át történõ kémiai úton végzett kapcsolásával, konjugációjával vagy keresztkötésével, dehidratálásával, észterezésével stb.; fizikai úton, valamilyen makromolekulában vagy azon történõ befogással végzett kapcsolással; vagy pedig elõnyösen molekuláris biológiai fúzióval, mindkettõ kódolására képes nukleinsavfragmentumokat tartalmazó rekombináns nukleinsavmolekulák olyan kombinálásával, hogy végül egyetlen folyamatos expressziós termék jöjjön létre. Elõnyösek az ilyen génsebészeti eljárások. A vakcinálás alternatív és hatékony módja közvetlenül a releváns antigént vagy epitópot kódoló DNS-sel végzett vakcinálás. Fehérjét kódoló DNS-sel végzett közvetlen vakcinálás sok fehérje esetében sikeresnek bizonyult [ld. például, Donnelly és mtsai., The Immunologist, 2, (1993)]. Például a parazitaellenes vakcinák terén, például a Plasmodium yoelii ellen védelmet értek el a P. yoelii-eredetû circumsporozoit génnel [Hoffman, és mtsai., Vaccine, 12, (1994)], és a Leishmania major ellen pedig az L. major-eredetû felszíni gp63 glikoproteinjének génjével végzett DNSvakcinálással [Xu és Liew, Vaccine, 12, (1994)]. Ilyen DNS-vakcinálás végezhetõ nukleinsavval, cdns-fragmentummal vagy elõnyösen a találmány szerinti rekombináns DNS-molekulával. Ennélfogva egyik elõnyös megvalósítási módja a találmány szerinti vakcina, amit az jellemez, hogy az nukleinsavat, cdns¹t vagy a találmány szerinti rekombináns DNS-molekulát tartalmaz. Esetleg, a találmány szerinti vakcina tartalmazhat olyan, a fentiekben leírtak szerinti élõ rekombináns hordozókat, amelyek képesek a találmány szerinti Piroplasmida-fehérjét vagy a fehérje immunogén fragmentumait expresszálni. Az ilyen, például bakteriális, parazitaeredetû vagy virális hordozón vagy vektoron alapuló vakcinák az alegységvakcináknál elõnyösebbek, mivel jobban utánozzák a Piroplasmida-fertõzés természetes lezajlását. Továbbá a hordozókkal fertõzött sejtek általi antigénbemutatás hasonlít arra a módra, ahogyan természetes fertõzés esetén a találmány szerinti Piroplasmida-fehérje vagy a fehérje immunogén fragmentumai az immunrendszernek bemutatásra kerülnek. Ezenfelül a saját maguktól történõ szaporodás (self-propagation) is elõny, mivel így az immunizáláshoz kevesebb rekombináns hordozóra van szükség. Eszerint a találmány egy másik elõnyös megvalósítási módja a találmány szerinti vakcina, amely élõ rekombináns hordozó mikroorganizmust és gyógyászatilag elfogadható hordozót tartalmaz. A fentiekben leírt gazdasejtek expressziós rendszerként alkalmazhatók a találmány szerinti Piroplasmida-fehérje vagy a fehérje immunogén fragmentuma expresszálására. Expresszálás után a fehérjetermé- 8

9 1 HU T2 2 szetû termék összegyûjthetõ, de esetleg a tápoldat vagy önmagában a teljes gazdasejt is alkalmazható egy adott vakcinában. Ennek megvan az az elõnye, hogy elmarad a tisztítási lépés, de természetesen a célba vett emlõsnek bizonyos mértékben toleránsnak kell lennie a tápoldat összetevõivel szemben. A találmány oltalmi körébe tartozik továbbá a találmány szerinti vakcina, amely a találmány szerinti Piroplasmida-fehérje vagy a fehérje immunogén fragmentuma molekulái egy vagy több típusának vagy a találmány szerinti nukleinsavnak, cdns-nek, rekombináns molekulának, élõ rekombináns hordozónak vagy gazdasejteknek kombinációját tartalmazza. A találmány szerinti ilyen vakcinához a komponensek egyetlen dózisban vagy külön ugyanabban az idõben vagy egymás után beadható dózisokban kombinálhatók. Például elõször beadjuk a Piroplasmida-fehérje kódolószekvenciáját hordozó rekombináns DNS-plazmidot, majd bizonyos idõ elteltével, elõnyösen Piroplasmida-fehérjével erõsítõ vakcinálást végezhetünk. A találmány szerinti vakcinák beadhatók olyan mennyiségekben, amelyek a találmány szerinti Piroplasmida-fehérjébõl vagy a fehérje immunogén fragmentumából 0,1 és 1000 g közötti mennyiséget tartalmaznak (célemlõsönként). Elvben kisebb vagy nagyobb dózisok is alkalmazhatók, elõnyösen 50 és 200 g közötti Piroplasmida-fehérjét vagy annak immunogén fragmentumát alkalmazzuk. Élõ vírusvektor-vakcinák esetében, az állatonként a legalább 1 pfu és a legfeljebb pfu közötti dózist, elõnyösen pfu dózist alkalmazunk. Egyértelmû, hogy egy adott, gyógyászatilag elfogadható hordozó olyan vegyület, amelynek nincs káros hatása a vakcinálandó állat egészségére, vagy a káros hatás legalábbis nem rosszabb, mint a nem vakcinált állat esetében tapasztalt hatások. Gyógyászatilag elfogadható hordozó lehet például steril víz vagy steril fiziológiai sóoldat. Összetettebb formában a hordozó lehet például puffer. Gyakran elõfordul, hogy a vakcinát stabilizálókkal keverik össze, például a degradációra hajlamos komponensek lebomlás elleni védelme céljából, a vakcina féléletidejének növelésére vagy a fagyasztva szárítás hatékonyságának javítására. Alkalmas stabilizálók közé tartozik például az SPGA [Bovarnik és mtsai., J. Bacteriology, 59, 509 (1950)], fölözött tej, zselatin, borjúszérum-albumin, szénhidrátok például szorbitol, mannitol, trehalóz, keményítõ, szacharóz, dextrán avagy glükóz, fehérjék például, albumin vagy kazein, vagy ezek degradációs termékei és pufferek, például alkálifém-foszfátok. A találmány szerinti vakcina tartalmazhat továbbá úgynevezett vivõanyagot is. Vivõanyag az olyan vegyület, amelyhez a találmány szerinti fehérjék, fehérjefragmentumok, nukleinsavak vagy azok részei, cdns¹ek, rekombináns molekulák, élõ rekombináns hordozók, és/vagy gazdasejtek kovalens kötõdés nélkül tapadnak hozzá. Ilyen vivõanyagok, többek között, a technikában ismert biomikrokapszulák, mikroalginátok, liposzómák, makroszolok, alumínium-hidroxid, ¹foszfát, szulfát vagy ¹oxid, szilika, Kaolin és Bentonite. Ilyen vivõanyag például az úgynevezett ISCOM (EP sz., EP sz., és EP sz. európai közzétételi iratok), ami egy olyan immunserkentõ komplex, amelybe az antigént részlegesen beágyazódik. Ezenfelül, a találmány szerinti vakcina tartalmazhat egy vagy több alkalmas felületaktív vegyületet vagy emulgeálót, például Span ¹t vagy Tween ¹t. A találmány szerinti vakcina célalanyai elõnyösen emlõsök, például emberek vagy állatgyógyászati szempontból fontos emlõs állatok. A cél lehet egészséges vagy már beteg, és lehet a Piroplasmida parazitára vagy a Piroplasmida parazita elleni antitesteken szeropozitív vagy ¹negatív. A célba vett alany lehet bármilyen, a vakcinálásra fogékony korú. A találmány szerinti vakcina esetében az elõnyösebb célemlõsök a szarvasmarhák, lovak, kutyák és macskák. A találmány szerinti vakcina megelõzõ és terápiás kezelésre egyaránt alkalmazható, és megzavarja a fertõzés beindulását és/vagy elõrehaladását, vagy a betegség klinikai jeleit. Ennélfogva a találmány egyik szempontja szerint, a találmány tárgya a találmány szerinti nukleinsavszekvencia, a találmány szerinti cdns-fragmentum, a találmány szerinti rekombináns DNS-molekula, a találmány szerinti élõ rekombináns hordozó mikroorganizmus, vagy a találmány szerinti gazdasejt alkalmazása Piroplasmida-szervezet okozta fertõzés vagy annak klinikai jelei megelõzésére vagy terápiás kezelésére szolgáló vakcina gyártására. A találmány szerinti vakcina megakadályozza vagy csökkenti a Piroplasmida-fertõzés elterjedését a populációban vagy a környezetben. A találmány szerinti vakcina számos formában létezhet. Így, a célnak való beadásra kiválasztott módszertõl függõen lehet például: folyadék, gél, kenõcs, por, tabletta vagy kapszula. Elõnyös, ha a kapszula injektálható folyadék formájában van. A találmány szerinti vakcina a technikában ismert módon adható be a célemlõsnek. Így például beadható parenterálisan, mint például a bõrbe vagy a bõrön át beadott bármilyen injekcióval: például intramuszkulárisan, intravénásan, intraperitoneálisan, intradermálisan, nyálkahártya alá vagy bõr alá. A beadás más ésszerû, alternatív módja a cseppként, sprayként, gélként vagy kenõcsként történõ topikális beadás a szem, orr, száj, végbél vagy vagina nyálkahártyájának epitéliumára, vagy a test bármely részét borító külsõ bõr epidermiszére felvitt spray (aeroszol vagy por) formájában. Esetleg a beadás történhet a tápcsatornán keresztül, például az étellel, élelemmel vagy ivóvízzel kombinált porral, folyadékkal vagy tablettával, vagy a szájba közvetlenül beadott folyadékként, gélként, kapszulaként, illetve a végbélbe beadott kúpként. Az elõnyös beadási mód az intramuszkuláris vagy szubkután injekció. Anélkül, hogy bármihez ragaszkod- 9

10 1 HU T2 2 nánk, a beadás optimális módja a megakadályozni vagy enyhíteni kívánt parazitafertõzés vagy klinikai betegség specifikus részleteitõl, az alkalmazandó vakcinakészítmény jellemzõitõl és a célba vett faj konkrét tulajdonságaitól függ. A találmány szerinti vakcinát a célemlõsnek beadhatjuk a dozírozással és a készítménnyel kompatibilis módon, egyetlen vagy több, ugyanazon idõben vagy egymás utáni dózisban, és olyan mennyiségben, amely immunológiailag hatékony lesz. A találmány szerinti vakcinák elõnyösen alkalmazhatók évi egyszeri dózisban. A találmány egyik elõnyös megvalósítási módjában a találmány szerinti vakcinát az jellemzi, hogy adjuvánst tartalmaz. Általában az adjuváns olyan anyag, amely a cél immunválaszát nem specifikus módon erõsíti fel. A technikában sokféle adjuváns ismert. Adjuvánsok például a következõk: Freund-féle komplett és inkomplett adjuváns, E¹vitamin, nemionos blokkpolimerek és poliaminok, például dextránszulfát, karbopol és pirán. Nagyon alkalmasak a szaponinok, amelyek elõnyös adjuvánsok. Szaponinokat elõnyösen 10 és g/ml koncentrációban adjuk a vakcinához. A szaponinok csoportján belül elõnyösebb adjuváns a Quil A szaponin. Szaponin és vakcina-összetevõk lscom -ben (EP sz., EP sz., és EP sz. európai közzétételi iratok) is kombinálhatók. Továbbá peptideket például muramil-dipeptideket, dimetil-glicint, tuftszint gyakran alkalmaznak adjuvánsként, és ásványi olaj például Bayol vagy Markol, növényi olajok vagy azok emulziói is elõnyösen alkalmazhatók. Egyértelmû, hogy az adjuválás más módjai, vivõanyagok vagy diluensek hozzáadása, a vakcina emulgeálása vagy stabilizálása is a találmány oltalmi körébe tartozik. Ilyen kiegészítések le vannak írva például a következõ jól ismert kézikönyvekben: Remington: the science and practice of pharmacy, kiad.: Lippincot, USA (2000) és a Veterinary vaccinology. szerk.: Pastoret és mtsai., kiad.: Elsevier, Amsterdam (1997). A találmány szerinti vakcina elõnyösen kombinálható más antigénnel vagy immunológiailag aktív összetevõvel. Ez az azt kódoló nukleinsav formájában is hozzáadható. Ennélfogva a találmány egy elõnyösebb megvalósítási módjában a találmány szerinti vakcinát az jellemzi, hogy további, immunológiailag aktív összetevõt vagy a további, immunológiailag aktív összetevõt kódoló nukleinsavat tartalmaz. A további, immunológiailag aktív összetevõ(k) lehet(nek) antigén(ek), immunfokozó anyag(ok), és/vagy vakcina(ák), amelyek egyike adjuvánst tartalmazhat. Amennyiben a további, immunológiailag aktív összetevõ(k) antigén formájában van(nak), tartalmazhat(nak) bármilyen emberi vagy állatorvosi szempontból fontos antigénkomponenst. Például tartalmazhat biológiai vagy szintetikus molekulát, például fehérjét, szénhidrátot, lipopoliszacharidot, fehérjetermészetû antigént kódoló nukleinsavat, vagy ilyen nukleinsavat transzkripcionális szabályozószekvenciához kapcsoltan tartalmazó rekombináns nukleinsavmolekulát. Továbbá, ilyen nukleinsavat, rekombináns nukleinsavmolekulát, vagy ilyen nukleinsavat tartalmazó LCR¹t tartalmazó gazdasejt lehet a módja a nukleinsav vagy a további, immunológiailag aktív összetevõ bevitelének. Esetleg tartalmazhat frakcionált vagy elpusztított mikroorganizmust, például parazitát, baktériumot vagy vírust. A további, immunológiailag aktív összetevõ(k) lehet(nek) immunfokozó anyag formájában, mint amilyen például kemokin vagy immunserkentõ nukleinsav formájában, például CpG motívum. Esetleg a találmány szerinti vakcina önmagában is hozzáadható egy adott vakcinához. Például a találmány szerinti vakcina kombinálható Babesia alegységvakcina-fehérje preparátumával (amely egyébként nem a találmány szerinti Piroplasmida-fehérje vagy a fehérje immunogén fragmentuma) Piroplasmida-fertõzés vagy a betegséggel járó klinikai tünetek elleni alegységvakcina-kombináció elõállítása céljából. Esetleg a találmány szerinti vakcina elõnyösen kombinálható gyógyászati összetevõvel, például antibiotikummal, hormonnal vagy gyulladásgátló gyógyszerrel. A találmány egy még elõnyösebb megvalósítási módjában a találmány szerinti vakcinát az jellemzi, hogy a további, immunológiailag aktív összetevõ vagy a további, immunológiailag aktív összetevõt kódoló nukleinsavat az alábbiakat fertõzõ szervezetbõl állítjuk elõ: kutyafélék: Ehrlichia canis, Babesia gibsoni, B. vogeli, B. rossi, Leishmania donovani-complex, kutyaparvovírus, kutyaszopornyica-vírus, Leptospira interrogans serovars canicola, icterohaemorrhagiae, pomona, grippotyphosa, bratislava, kutyahepatitis-vírus, kutyaparainfluenzavírus, veszettségvírus, Hepatozoon canis és Borrelia burgdorferi; szarvasmarhákra: szarvasmarhaherpes-vírus, szarvasmarha vírusos hasmenését okozó vírus, 3¹as típusú parainfluenzavírus, szarvasmarha-paramixovírus, száj- és körömfájás betegség vírusa, Pasteurella haemolytica, szarvasmarha légúti óriássejtes vírusa, Theileria sp., Babesia sp., Trypanosoma sp., Anaplasma sp., Neospora caninum, Staphylococcus aureus, Streptococcus aga-lacliae, Mycoplasma, E. coli, Enterobacter, Klebsiella, Citrobacter, Cryptosporidium, Salmonella és Streptococcus dysga/actiae; és lófélék: Streptococcus equi, Streptococcus zooepidemicus, Rhodococcus equi, Corynebacterium pseudotubercidosis, Pseudomonas mallei, Actinobacillus equili és Pasteurella multocida, potomac¹i láz ágense. Clostridium tetanii, Mycobacterium pseudomallei, vesicular stomatitis vírusa, borna-betegség vírusa, lóinfluenza-vírus, afrikai lóbetegség vírusa, lóarteritis vírusa, lóherpeszvírus 1 4, fertõzõ vérszegénység vírusa, Equine encephalomyelitis vírusa és japán B encephalitis vírusa. A találmány szerinti Piroplasmida-fehérje vagy a fehérje immunogén fragmentuma, a nukleinsav, cdns, rekombináns molekula, élõ rekombináns hordozó, 10

11 1 HU T2 2 és/vagy a találmány szerinti gazdasejtek elõször teszik lehetõvé Piroplasmida-fehérje vagy a fehérje immunogén fragmentuma elleni specifikus antitestek hatékony létrehozását. Ez teszi a találmány szerinti vakcinát alkalmasnak markervakcinaként, mivel ez lehetõvé teszi a parazitával fertõzött és vakcinált célemlõsök megkülönböztetését a technikában ismert eljárások alkalmazásával. Esetleg e specifikus antitestek úgynevezett passzív vakcinálás -hoz önmagukban is alkalmazhatók vakcinaként. Ennélfogva a találmány egy másik szempontja szerint a találmány tárgya olyan vakcina, amelyet az jellemez, hogy a találmány szerinti fehérje elleni antitestet, a fehérje epitóptartalmú, antigéntulajdonságú fragmentuma elleni antitestet vagy ezek kombinációját és gyógyászatilag elfogadható hordozót tartalmaz. Az antitest lehet természetes vagy szintetikus eredetû. Az antitest lehet antiszérum formájában vagy lehet tisztított antitest. Ilyen tisztított antitestek elõnyösen elõállíthatók valamilyen expressziós rendszerbõl. A találmány szerinti antitestek nagyléptékû elõállítására szolgáló eljárások is ismertek a technikában. Az ilyen eljárások a találmány szerinti fehérjét kódoló genetikai információ (vagy annak fragmentumai) fonalas fágokba való klónozásán alapulnak fágbemutatás céljából. Ilyen eljárások vannak többek között leírva a következõkben: Antibody Engineering Page a filamentous phage display opciónál a honlapon, és a következõ közleményekben: Cortese, és mtsai., Trends in Biotechn., 12, (1994); Clarckson és Wells, Trends in Biotechn., 12, (1994); Marks, és mtsai., J. Biol. Chem., 267, (1992); Winter, és mtsai., Annu. Rev. Immunol., 12, (1994), és Little, és mtsai., Biotechn. Adv., 12, (1994). Ezt követõen a fágokat tevefélékbõl származó nehézláncantitesteket expresszáló, tevefélékbõl készített expressziós könyvtárak szûrésére alkalmazzák. [Muyldermans és Lauwereys, Journ. Molec. Recogn., 12, (1999); és Ghahroudi, és mtsai., FEBS Letters, 414, (1997)]. A kívánt antitesteket expresszáló könyvtárból származó sejtek replikálhatók és ezt követõen alkalmazhatók antitestek nagyléptékû expresszálására. A kérdéses antigén elleni antitesteket tartalmazó antigénvakcinában kialakított kombináció komplex vakcinaként ismert a technikában. A találmány szerinti ilyen vakcinák elõnyösen alkalmazhatók. Bizonyos okokból, például stabilitás vagy gazdaságosság, a találmány szerinti Piroplasmida-fehérje vagy a fehérje immunogén fragmentuma, nukleinsavak, cdns¹ek, rekombináns molekulák, élõ rekombináns hordozók, gazdasejtek vagy a találmány szerinti vakcinák fagyasztva száríthatók. Általában, ez a nulla C feletti, például 4 C¹on történõ hosszabb idejû tárolást teszi lehetõvé. A fagyasztva szárítási eljárásokat a szakember jól ismeri, és a különbözõ léptékû fagyasztva szárításra szolgáló berendezések kereskedelmi forgalomban elérhetõk. Ennélfogva a találmány legelõnyösebb megvalósítási módjában a találmány szerinti vakcinákat az jellemzi, hogy a vakcinák fagyasztva szárított formában vannak. Fagyasztva szárított vakcina helyreállításához, a vakcinát felszuszpendálhatjuk fiziológiailag elfogadható diluensben. Ilyen diluens lehet például annyira egyszerû, mint a steril víz vagy fiziológiai sóoldat. Komplexebb formában, a fagyasztva szárított vakcina a PCT/EP99/10178 sz. nemzetközi bejelentésben leírt emulzióban szuszpendálható fel. A találmány egy másik szempontja szerint a találmány tárgya eljárás a találmány szerinti vakcina elõállítására, az eljárás tartalmazza a találmány szerinti fehérje vagy a fehérje epitóptartalmú, antigéntulajdonságú fragmentuma, nukleinsav, cdns-fragmentum, rekombináns DNS-molekula, élõ rekombináns hordozó mikroorganizmus vagy a találmány szerinti gazdasejt, vagy ezek kombinációja gyógyászatilag elfogadható hordozóval való összekeverését. A találmány egy másik szempontja szerint a találmány tárgya eljárás a találmány szerinti vakcina elõállítására, amely eljárás tartalmazza a találmány szerinti fehérje elleni antitest vagy a fehérje antigéntartalmú fragmentuma elleni antitest, vagy ezek kombinációja gyógyászatilag elfogadható hordozóval való összekeverését. A fentiekben körvonalazottak szerint a találmány szerinti eljárásokkal elõállítható vakcina megelõzõ és terápiás kezelésre egyaránt alkalmazható, és megzavarja a fertõzés beindulását és/vagy elõrehaladását vagy a betegség klinikai jeleit. Ennélfogva a találmány egy további szempontja szerint a találmány tárgya a találmány szerinti fehérje vagy a fehérje epitóptartalmú fragmentuma alkalmazása a Piroplasmida-szervezet okozta fertõzés vagy annak klinikai jelei megelõzõ vagy terápiás kezelésére szolgáló vakcina gyártására. A találmány egy további szempontja szerint a találmány tárgya diagnosztikai teszt Piroplasmida-szervezettel kapcsolatos nukleinsav kimutatására, azzal jellemezve, hogy a teszt nukleinsavat tartalmaz, amely nukleinsav legalább 70%-ban, elõnyösen 75%-ban, elõnyösebben 80, , 92, 94, 95, 96, 97, 98, 99, vagy 100%- ban (az elõnyösség sorrendjében) hasonló a szekvencialistában 1. azonosító számon megadott szekvenciával, vagy a kérdéses nukleinsavval komplementer nukleinsav, amely legalább 15 nukleotid, elõnyösen 17 nukleotid, elõnyösebben 18, 19, 20, 24, 28, 32, 35 vagy 40 nukleotid hosszúságú (az elõnyösség sorrendjében). A találmány egy további szempontja szerint, a találmány tárgya diagnosztikai teszt Piroplasmida-szervezet elleni antitestek kimutatására, azzal jellemezve, hogy a teszt a találmány szerinti fehérjét vagy a fehérje epitóptartalmú, antigéntulajdonságú fragmentumát vagy ezek keverékét tartalmazza. Például BIIA1¹et vagy annak immunogén fragmentumát szilárd fázisú hordozóhoz kapcsoljuk, ezt a tesz- 11

12 1 HU T2 2 telendõ mintával inkubáljuk, mossuk, és kimutatjuk a kötõdött antitestek jelenlétét. Elõnyös diagnosztikai eljárás ELISA-val történik. A találmány egy további szempontja szerint a találmány tárgya diagnosztikai teszt Piroplasmida-szervezetbõl származó antigéntermészetû anyag kimutatására, azzal jellemezve, hogy a teszt a találmány szerinti fehérje elleni antitestet vagy a fehérje epitóptartalmú, antigéntulajdonságú fragmentuma elleni antitestet vagy ezek keverékét tartalmazza. Például BIIA1¹et vagy annak immunogén fragmentuma elleni antitestet szilárd fázisú hordozóhoz kapcsoljuk, ezt a tesztelendõ mintával inkubáljuk, mossuk, és kimutatjuk a kötõdött fehérje jelenlétét. Egy elõnyös diagnosztikai eljárás ELISA-val történik. Példák 1. példa Alkalmazott eljárások B. bovis in vitro tenyészet B. bovis Israel izolátumát (C61411 sz. klónvonal) in vitro tenyésztettük a korábbiakban leírtak szerint [Levy és Ristic. Science, 207, (1980)]. Röviden, B. bovis-tenyészeteket tartottunk fenn 40% borjúszérummal (felnõtt donor tehéntõl), 50 g/ml gentamicinnel (Gibco BRL), 25 mm nátrium-bikarbonáttal és borjúeredetû vörösvértestekkel [5% csomagolt sejttérfogat (PCV)] kiegészített M199 tápoldatot tartalmazó 24 lyukú lemezeken (1,2 ml össztérfogat) vagy 25 cm 2 ¹es üvegekben (15 ml össztérfogat). Tenyészeteket 37 C¹on, 5% CO 2 -tartalom mellett inkubáltuk, és napi hígítással a parazitáltságot 1% és 12% között tartottuk. B. bovis Mexico izolátumot (C9.1 klónvonal) tenyésztettünk a C61411 sz. klónvonalnál (Israel izolátum) alkalmazott protokoll szerint, azzal a kivétellel, hogy a tenyészeteket 5% CO 2 ¹t tartalmazó levegõ helyett, 90% N 2 ¹, 5% CO 2 ¹, 5% O 2 -tartalmú légkörben tartottuk B. bovis genomi és cdns-könyvtár elõállítása CDNS-könyvtárat állítottunk elõ 5 g B. bovis mrns-bõl az XZAP-cDNA Synthesis Kit (Stratagene) készlet alkalmazásával (a gyártó utasításai szerint). Sepharose CL¹4B oszlopon végzett gélszûréssel 0,5 4 kb cdns-fragmentumokat gyûjtöttünk és az unizap¹xr Express vektor 1. EcoRI/XhoI helyére ligáltuk. Fágrészecskékbe csomagoláshoz Giga pack III Gold¹ot alkalmaztuk, majd Escherichia coli XL¹1 Blue MRF sejteket transzformáltunk. 1, telepet kaptunk, amelyekbõl amplifikált könyvtárat készítettünk. EST adatkészlet elõállításához, a kilemezelt cdnskönyvtárból véletlenszerûen, automatikusan felszúrt 1500 cdns-klónon single-pass szekvenálást (rövid ( bp) DNS-szálak (csak az egyik szál) gyors szekvenálása) végeztünk. Ebbõl az EST adatkészletbõl jó minõségû (átlagosan 476 bp hosszúságú) szekvenciából álló adatbázist állítottunk elõ A genomi könyvtár elõállításához, 600 g B. bovis DNS¹t EcoRI¹el (150 egység vagy 250 egység) részlegesen emésztettünk 1 órán át 37 C¹on. Az emésztett DNS¹t Sepharose CL¹4B oszlopon méret szerint frakcionáltuk. 0,5 8 kb fragmentumokat ligáltunk az 1¹ZA- PII-Express EcoRI helyére, Gigapack III Gold Packaging kivonat alkalmazásával becsomagoltuk és E. colixl1-blue MRF kompetens sejtekbe transzformáltuk. 2, telepet kaptunk, amelyekbõl amplifikált könyvtárat készítettünk. A cdns-könyvtárakat BIIA1¹re vagy BIIA2¹re specifikus láncindítókkal végzett PCR-rel elõállított próbával szûrtük B. bovis genomikus és cdns-könyvtár szûrése BIIA1 és BIIA2 génekre A B. bovis genomi és cdns-könyvtárakat PCR-rel készített specifikus próbákkal szûrtük a BIIA1 és BIIA2 gének klónjainak izolálása céljából. Az alkalmazott specifikus láncindítók a következõk voltak: a BIIA1 génre: 1. láncindító: 5 ¹CCACGGCTCTGGAATC- TATGTC¹3 (SEQ ID NO: 11) 2. láncindító: 5 ¹CAAAAGGATACCTATATTTGG- TAC¹3 (SEQ ID NO: 12), és a BIIA2 génre: 3. láncindító: 5 ¹TGTGGTAGATGAATCTGCTAG- TATATC¹3 (SEQ ID NO: 13) 4. láncindító: 5 ¹CTATGCCACGGCATTCAGCAA- CATTTA¹3 (SEQ ID NO: 14) Mindkét láncindító párt a B. bovis EST-adatbázisából származó klón fragmentumának PCR-amplifikálására alkalmaztuk [50 l térfogat, 0,2 mm dntp, mindegyik láncindítóból 20 pmol. 100 ng B. bovis teljes genomi DNS és 0.5 E Taq DNS-polimeráz, standard pufferben (Promega)]. A BIIA1 próba amplifikációja 30 ciklusból állt, amelyek körülményei az alábbiak voltak: 92 C 30 s, 58 C 30 s, és 72 C 30 s; a BIIA2 próbánál: 95 C 1 min, 58 C 1 min, és 72 C 10 min. E ciklusokat megelõzte egy kezdeti denaturáció (3 perc 95 C) és egy záró meghosszabbítás (72 C, 10 min). Mindkét próbát agarózgélen tisztítottuk és Random Primer labelling kit (Roche) készlet alkalmazásával 50 Ci 32 P-dATP-vel (3000 Ci/mmol) jeleztük. A BIIA1 cdns-klónozásához a cdns-könyvtárból összesen telepet, a genomi DNS-könyvtárból pedig telepet szûrtünk standard eljárásokkal [Sambrook és Russel, mint fenn); míg a BIIA2 cdns-klónozásához a cdns-könyvtárból és a genomikus DNS-könyvtárból egyaránt telepet szûrtünk. Két kör teleptisztítás után mindegyik klónt in vivo kivágtuk a fagemid inzertek izolálására, a gyártó (Stratagene) utasításai szerint, és festékterminátor eljárással (ABI PRISM dye terminator kit, Pharmacia) végzett automata ciklusszekvenáló alkalmazásával mindkét szálon megszekvenáltuk. A teljes hosszúságú BIIA1 és BIIA2 cdns¹ek elõállítása céljából, a nem kódoló 5 ¹végeket 5 ¹RACE-vel azonosítottuk (Gen-eRacer kit, Invitrogen; L , a gyártó utasításai szerint). Az elõállított teljes hosszúságú klónokat pcr2.1 klónozó plazmidba illesztettük és mindkét szálon megszekvenáltuk, a fen- 12

13 1 HU T2 2 tiekben leírtak szerint. Az eredményül kapott szekvenciákat a SEQ ID NO: 1 (BIIA1) és SEQ ID NO: 5 (BIIA2) mutatja be Rekombináns BIIA1 expresszálása E. coli-ban A pcr2.1 klónozó plazmidokból a BIIA1 és BIIA2 klónokat PCR-rel szubklónoztuk. A BIIA1 szubklónozásra alkalmazott láncindítók az alábbiak voltak: 5. láncindító: 5 ¹CCCGGATCCATGCAGTTACA- TAACAAA¹3 (SEQ ID NO: 15) 6. láncindító: 5 ¹GGGAAGCTTCTGAGCAAAG- GAAATAGG¹3 (SEQ ID NO: 16) A BIIA1¹re tervezett láncindítók (az iniciációs kodon elsõ bázisától számított) 1. bázis elé egy BamHI, a bázis után pedig egy HindIII helyet vittek be. A BIIA2 szubklónozására alkalmazott láncindítók a következõk voltak: 7. láncindító: 5 ¹CCCGAATTCGTGGTAGAT- GAATCTGCT¹3 (SEQ ID NO: 17) 8. láncindító: 5 ¹CCCGTCGACTGCCTCGCCC- CAAATGTTGT¹3 (SEQ ID NO: 18) A BIIA2¹re tervezett láncindítók egy EcoRI és egy Sall helyet vittek be. A PCR¹t követõen (30 ciklus: 1 perc 94 C, 1 perc 55 C, 1 perc 72 C), a fragmentumokat gélen tisztítottuk, hõntartásos hibridizáltatással ( annealing ) pet- 32a vektorba juttattuk és E. coli NovaBlue törzs transzformációjára alkalmaztuk. A megfelelõ inzertet tartalmazó plazmidokat alkalmaztuk a gazdatörzs, BL21 (DE3), transzformálására. Tioredoxinnal képzett fúziósfehérjéket állítottunk elõ maximális kitermeléssel 1 mm izopropil- ¹D tiogalaktozidázzal (IPTG) 4 órán át, 37 C¹on végzett indukálás után (az inkubálás után 0 és 4 órával végzett teljes sejtminta-analízis szerint). Bakteriális üledékeket forraltunk 95 C¹on, 2% (v/v) ¹merkaptoetanolt tartalmazó SDS-poliakrilamid (SDS-PAGE) mintapufferben, 10%¹os SDS-PAGE minigéleken megfuttattuk, és az expresszió igazolására a géleket Coomassie Brilliant Blue festékkel festettük (1. és 2. ábra) Peptidszelekció és monospecifikus antiszérum elõállítása A BIIA1 és BIIA2 gének teljes szekvenálása után, számítógéppel lefordított szekvenciákból peptideket szelektáltunk abból a célból, hogy tesztállatok immunizálásával specifikus poliklonális antitesteket indukáljunk. Jó felszíni valószínûségû és töltött amfipatikus régiókat tartalmazó peptidrégiók kiválasztására Protean of DNA Star szekvenciaanalízis-programot alkalmaztunk. A BIIA1-bõl (SEQ ID NO:2) kiválasztott peptidek a következõk voltak: 1. peptid: aminosavak: 2. peptid: aminosavak: 3. peptid: aminosavak: cisztein-afhkepnnrrltkrs, cisztein-rgvgmnwatydkdsg, cisztein-yveprakntnkyldv A BIlA2-bõl (SEQ ID NO:6) kiválasztott peptidek a következõk voltak: 4. peptid: aminosavak, 5. peptid: aminosavak, 6. peptid: aminosavak: cisztein-pgkrtralldlrmie, cisztein-rvgntdeehnhrkdmd, cisztein-vyddhpeesentgin. Szintetizálás után a peptideket hordozófehérjéhez, a kürtõscsiga (kulcslyukcsiga, óriás lyukas csiga, keyhole limpet ) maleimiddel aktivált hemocianinjához (KLH) (Pierce; 77605) kapcsoltuk a gyártó utasításai szerint. A peptidhordozó konjugátumot alkalmaztuk nyúleredetû poliklonális antiszérum elõállítására. Erre a célra három csoport új¹zélandi fehér nyulat (csoportonként 2¹2 nyúl) immunizáltunk öt alkalommal, háromhetenként, szubkután. Az immunizálás elõtt minden nyúltól vérmintát vettünk, amelyeket negatív kontrollként alkalmaztunk. Minden nyulat azonos térfogatú Stimune (ID DLO, Lelystad, Hollandia) adjuvánsban felvett 250 g, KLH-hoz kapcsolt peptiddel injektáltunk. Nyulanként beinjektált összes térfogat 1000 l volt. A szérumokat reaktivitásra nézve rendszeresen teszteltük ELISA-val. Az utolsó immunizálás után 1 héttel plazmaforézist végeztünk és összegyûjtöttük a szérumot ELISA Az antitestválaszt ELISA-val értékeltük. Kilencvenhat lyukú mikrotiterlemezeket vontunk be lyukanként 150 ng 1. peptiddel vagy 2. peptiddel, 30 percig 37 C¹on inkubáltuk, majd 1 órán át PBS/BSA-val blokkoltuk. Az egyedi nyúlszérumokból készült egymást követõ hígításokat (1:50 1:50 000) 1 órán át 37 C¹on inkubáltuk. A lemezeket mostuk, és 1:2000 sertésben készült, HRP-vel konjugált, nyúl elleni másodlagos antitesttel (1:2000 hígításban) inkubáltuk 1 órán át. A lemezeket mostuk és 45 percig ABTS [2,2 -azinobisz(3¹etil-benztiazolinszulfonsav)]-peroxidáz-szubsztrátummal (Roche Biochemicals) elõhívást végeztünk. Az OD 405 értékeket feljegyeztük, és összehasonlító ELISA-titereket számítottunk Immunofluoreszcencia vizsgálat A B. bovis merozoitok BIIA1-bõl és BIIA2-bõl származó peptidek elleni antitestek általi felismerését közvetett immunfluoreszcencia vizsgálattal (IFA) teszteltük. Vékony vérkenetet fixáltunk hideg metanollal. BIIA1 elleni, nyúleredetû poliklonális antiszérummal (1:40) vagy BIIA1 elleni, egéreredetû poliklonális antiszérummal (1:5 1:160) végzett primer inkubálás után három, egyenként ötperces mosási lépés következett. A lemezeket kecskében készült, nyúleredetû immunglobulin G (IgG) elleni, fluoreszcein-izotiocianáttal jelzett antitestekkel (Nordic) inkubáltuk 30 percig. A lemezeket ismét mostuk, és Vectashield oldatot (Vector Laboratories) vittünk fel rá, majd a lemezt fedõlemezzel fedtük le és FITC-szûrõvel ( / nm) felszerelt UV fluoreszcencia mikroszkópon tettük láthatóvá. IFA titerként azt az utolsó szérumhígítást adtuk 13

14 1 HU T2 2 meg, amely a parazita felismerésében az 1:5 arányban hígított, negatív, immunizálás elõtti szérummal összehasonlítva pozitív jelet adott Merozoiteredetû teljes fehérjekivonatok elõkészítése és elözönlés esetén oldhatóvá tett fehérjék Merozoitokból a fentiekben az in vitro elterjedésnél leírtak szerint készített mintákat (800 l) 1,2 M¹es polipropilén elõszûrõkön (Millipore, AN ) végzett szûréssel részlegesen elválasztottuk a hamis eritrocitáktól ( erythrocyte ghosts ). A szûrt merozoitokat összeöntöttük és 20 térfogat, 25 mm nátrium-bikarbonátot tartalmazó PBS-sel (ph=8,0) kétszer mostuk, majd 2000 g¹vel 20 percig centrifugáltuk 4 C¹on. A második mosás után a csapadékot azonos térfogat PBS-ben)pH=8,0) felszuszpendáltuk és 200 l¹es adagokra osztottuk, amelyeket centrifugáltunk ( g, 5 perc, 4 C) és a felülúszó eltávolítása után 100 l¹es sejtüledékként ( merozoit) 20 C¹on tároltunk. Közvetlenül felhasználás elõtt, fagyasztott merozoitüledékeket olvasztottunk ki és lizáltunk, redukáltuk, Proteoprep membránextrakciós készlet (Sigma), gyártó utasításai szerinti alkalmazásával alkiláltuk, végül 1,7 ml, SDS-poliakrilamidgélre vagy izoelektrofókuszáló (IEF) csíkokra való felvitellel kompatibilis pufferben felvettük. A nem oldódó anyagot centrifugálással ( g, 3 perc, 4 C) eltávolítottuk. Fehérjekoncentrációt mértünk a Bradford-féle eljárással [Anal. Biochem., 72, (1976)]. Mivel a kivonatok tetemes mennyiségû eritrocitaeredetû fehérjét tartalmaztak, ugyanolyan módon, de nem fertõzött eritrocitatenyészetbõl kiindulva kontrollkivonatokat készítettünk. Elözönlés esetén feloldódott fehérjékhez úgy jutottunk, hogy az in vitro elözönlés után 1 órával a fentiekben leírtak szerint óvatosan eltávolítottuk a fedõpuffert. A mintákat centrifugáltuk (2000 g, 10 perc, 4 C), majd a (láthatatlan) üledéket kiöntöttük és a membránfragmentumok eltávolítása céljából a felülúszót nagy sebességgel ismét lecentrifugáltuk (20 perc, , 4 C). A kapott felülúszót 10 mm KHPO 4,pH=7,5, ellen 12 órán át dializáltuk (Pierce; Snakeskin redõs dialíziscsõ, 68035) A maradék hemoglobint batch eljárásban távolítottuk el oly módon, hogy egy rotációs berendezésen (rotating platform) 50 ml dializált felülúszót dialízispufferrel eqvilibrált, 6,5 ml DEAE sepharose fast flow (Amersham Biosciences) gyantával inkubáltunk 4 C¹on, 90 percig. A szuszpenziót 4 C¹on 5 percig 3000 g-vel centrifugáltuk, ezután a DEAE sepharose¹t 4 50 ml dialízispufferrel mostuk, majd 4 C¹on 5 percig 3000 g-vel centrifugáltuk. A kötõdött fehérjéket 6 ml elúciós puffer (350 mm KCl, 10 mm KHPO 4,pH=7,5) hozzáadásával és 5 perces inkubálással, majd 4 C¹on 5 percig 3000 g-vel végzett centrifugálással eluáltuk. A felülúszót töményítettük és 10 kda szûrõn (YM 10, Millipore) sótalanítottuk SDS-poliakrilamid-elektroforézis és Westernblotolás A ¹merkaptoetanol jelenlétében vagy hiányában feloldott fehérjéket 10%¹os SDS-PAGE¹n elválasztottuk és elektroforézissel Immobilon ¹P membránra (Millipore) transzferáltuk. A blotot 5% fölözött tejjel és 0,5% Tween 20¹al kiegészített, foszfáttal pufferelt sóoldattal (PBST) blokkoltuk 1 órán át 37 C¹on. A blotot a primer antitest, 2% fölözött tejet tartalmazó PBST-vel készült megfelelõ hígításával (1:500) inkubáltuk 1 órán át éjszaka. A blotot PBST-vel mostuk és 1: arányban hígított, tormaperoxidázzal (HRP) konjugált, nyúl elleni másodlagos antitesttel (DAKO) inkubáltuk 1 órán át 37 C¹on. PBST-vel végzett mosás után, a blotot TMB MB szubsztrátumkészlettel (Lucron Bioproducts BV; KPL ) vagy fokozott kemolumineszcenciával (ECL)+ (Amersham; RPN2132) hívtuk elõ Izoelektromos fókuszálás Teljes merozoitkivonatot, elözönléses felülúszót, és BIIA1 fehérjemintákat rehidratáló oldatban (7 M urea, 2 M tiourea, 4% CHAPS, 2% hordozó amfolitkeverékph=4 7NL (IPG puffer és 20 mm DTT) felszuszpendáltunk. Hordozó amfolitkeverék (ph=3 10NL) alkalmazásával BIIA2 fehérjemintákat választottunk el az elsõ dimenzióban. Hacsak másként nem jeleztük, az IEF-hez szükséges berendezések, IPG-gélek és reagensek az Amersham Biosciences-tõl származtak. Hét centiméteres csíkokra (ph=4 7NL) proteázgátlóval kiegészített (Complete, Roche) 35 g teljes merozoitfehérjét vagy 35 g elözönléses felülúszót vittünk fel. A 13 cm¹es csíkok esetében, 150 g teljes merozoitfehérjét vagy 150 g elözönléses felülúszót vittünk fel. A csíkokat rehidráltuk (10 14 h) és automata üzemmódban (1 perc 300 V, 90 perc addig, amíg a feszültség el nem éri a 3500 V¹ot, majd folyamatos fókuszálás 3500 V¹on, összesen KVh, IPGPhor készüléken) órán át fókuszáltuk. Izoelektromos fókuszálás után, a fehérjéket redukáltuk és SDS-hez kötöttük oly módon, hogy a csíkokat 15 percig, 10 ml, 30 mm frissen hozzáadott DTT¹t tartalmazó SDS-eqvilibrációs pufferben (50 mm Tris, 6 M urea, 2% SDS, 30% glicerin,ph=8,8) ekvilibráltuk. A fehérjereoxidáció elkerülése és a cisztein aminosavak reakcióinak minimalizálása céljából egy második ekvilibrációs lépést is végeztünk a ditiotreitol helyett frissen hozzáadott 2,5% jód-acetamidot tartalmazó SDS-ekvilibrációs pufferben. A második dimenziós SDS-gélelektroforézist Hoefer SE600 rendszeren végeztük. A 2¹D elektroforézis után a fehérjéket ezüstfestéssel tettük láthatóvá. A géleket Umax flatbed szkenneren, LabScan v3.0 szoftverrel képeztük le, és ImageMaster 2D v 3.01 szoftver (Amersham Biotech) alkalmazásával analizáltuk. Immunblotoláshoz 7 cm¹es csíkokon lévõ fehérjéket 10%¹os SDS-PAGE gélen, 13 cm¹es csíkokon lévõ fehérjéket pedig 2¹D fehérjegélen választottunk el, majd lmmobilon ¹P membránra (Millipore; IPVH00010) transzferáltuk. A kétdimenziós blotokra ugyanazt az eljárást alkalmaztuk, mint az I¹D blotok esetében B. bovis in vitro elözönlési vizsgálat Elözönlést a korábban leírtak szerint [Fransen és mtsai., Microbes Infect, 5, (2003)] végeztünk, 14

15 1 HU T2 2 kisebb módosításokkal. B. bovis-al 6 8%¹os parazitáltságig fertõzött vörösvértesteket centrifugáltunk (2000 g, 10 perc, 15 C), majd azonos térfogat VyMs pufferben [Vega és Martinez, Id. Fransen, mint fenn] felszuszpendáltuk. 800 l¹es mintákat öt szaggatott (impulzusok között 10 mp¹es szünet, 0 C¹on) nagyfeszültségû impulzusnak (2,5 kv, 200, 25 F) tettünk ki 4 mm¹es BioRad küvettákban ( ) pulzusszabályozóval ellátott BioRad Gene Pulser alkalmazásával. Nyolc milliliter, 25 mm nátrium-bikarbonátot tartalmazó PBS¹t (ph=8,0, 20 C) adtunk minden 800 l¹es mintához, majd a mintákat lecentrifugáltuk (1800 g, 10 perc, 15 C). Egy második, azonos mosást végeztünk, azzal a különbséggel, hogy a centrifugálást 1300 g-vel végeztük, és ezután a merozoitcsapadékot 800 l, 25 mm nátrium-bikarbonátot tartalmazó PBS-ben (ph=8,0, 20 C) felszuszpendáltuk. Egy térfogat felszuszpendált merozoitot 9 térfogat szuszpendált, borjúeredetû eritrocitához (5,5% PCV, 25 mm nátrium-bikarbonátot tartalmazó PBS-ben,pH=8,0, 30 perc elõinkubálás 37 C¹on, CO 2 -tartalmú levegõben) adva szétterjedését indítottunk be 24 lyukú lemezeken (1,2 ml végtérfogat), 25 cm 2 ¹es flaskákban (15 ml) vagy 80 cm 2 ¹es flaskákban (50 ml) 37 C¹on, CO 2 -tartalmú levegõben. Egy óra elteltével Giemsa-val festett lemezeket készítettünk összesen 5000 eritrocitából megszámoltuk a parazitált eritrocitákat Az elözönlés in vitro gátlása nyúleredetû poliklonális antiszérumokkal A fentiekben leírtak szerint, magasfeszültségû impulzusokkal felszabadított és 25 mm nátrium-bikarbonátot tartalmazó PBS-ben (ph=8,0) felszuszpendált 200 l B. bovis merozoitokat 40 l nyúleredetû antiszérummal inkubáltuk 1 órán át 20 C¹on. Ehhez 1 óra elteltével, 960 l szuszpendált borjúeritrocitát (6,25% PCV, 25 mm nátrium-bikarbonátot tartalmazó PBS-ben,pH=8,0, 30 perc elõinkubálás 37 C¹on, CO 2 -tartalmú levegõben) adtunk, majd 1 órán át inkubáltuk, végül Giemsa-val festett lemezeket készítettünk és számolást végeztünk az elözönlés szintjének meghatározása végett. Az alkalmazott antiszérum a BIIA1- és BIA2-aminosavszekvenciából származó szintetikus peptidek ellen és egy nem rokon kontrollpeptid (YAGRLFSKRTAATAYKLQ) elleni kontrollszérum ellen elõállított, nyúleredetû antiszérum volt. Immunizálás elõtt a peptideket az óriás lyukas csiga (keyhole limpet) hemocianinjához (KLH) kapcsoltuk. A tesztben immunizálás elõtti szérumot is futtattunk Az 1. példa eredményei BIlA1¹et és BIIA2¹t kódoló teljes hosszúságú cdns azonosítása és klónozása A B. bovis cdns-könyvtár PCR-próbákkal (350 bp a BlIAl¹re és 450 bp a BIIA2¹re) való szûrése eredményeként BlIA1¹re egy 2181 bp cdns¹t, a BIlA2¹re pedig egy 2385 bp cdns¹t sikerült klónozni és szekvenálni. Mindkettõ tartalmazott nyitott leolvasási keretet és polia-farokban végzõdõ, 3 nem kódoló régiót. A teljes hosszúságú mrns¹ek 5 kupakolt (capped) végének meghatározásához, teljes mrns defoszforilációjára kerítettünk sort, amely után az érintetlenül maradt 5 kupakokat dohánysav-pirofoszfatázzal eltávolítottuk, majd specifikus RNS-oligonukleotidba ligáltuk. Ezt követõen, az elsõ szálú cdns¹en végzett beágyazott PCR lehetõvé tette a BlIA1¹et és for BIIA2¹t kódoló, B. bovis-eredetû mrns 5 végét reprezentáló fragmentum klónozását és szekvenálását. A BIIA bp ORF-jének számítógépes transzlációja egy 67,2 kda méretû, a BIIA bp ORF-jének transzlációja pedig egy 65,6 kda méretû fehérje elõrejelzését eredményezte Rekombináns BIIA1 és BIIA2 felismerése a származtatott peptidek ellen elõállított antiszérumokkal A BIIA fehérjék további tanulmányozása céljából nyulakat immunizáltunk KLH-hoz kapcsolt szintetikus 1 6. peptidekkel (mint fenn). Mindegyik antiszérum specifikusan felismerte a tioredoxin rekombináns fúziós termékét és az E. coli/bl21 sejtekben expresszált BIIA fehérjék egy részét (1. és 2. ábra). lptg-vel való indukció elõtt és után elõállított teljes sejtlizátumok poliakrilamid-gélelektroforézisével azonosítottuk a BIIA1 és BIIA2 rekombináns fúzióstermékét. A rekombináns BIlAl¹et és BIIA2¹t mindhárom immunszérum azonosította (5., 8., 11. sávok), míg az immunizálás elõtt gyûjtött szérum nem ismerte fel ezeket az immunblotokon (6., 9., 12. sávok). Az immunfelismerés specifikus volt a fúziós fehérje BIIA részére, míg e szérumok nem ismerték fel a kontrollfehérjeként alkalmazott, PET32a-ban expresszált B. bovis rab5 (3. sáv, Asp-5-Lys-208, Gen- Bank Ace. Sz.: ) rekombináns fúziós termékeit (7., 10., 13. sávok). Továbbá az immunválasz peptidspecifikus volt és nem az immunizálásra alkalmazott KLH hordozófehérje által indukált antitesteknek volt köszönhetõ, miként a KLH-hoz kapcsolt, a BIIA1¹el vagy BIIA2-vel nem rokon szintetikus peptidek elleni antitest sem ismerte fel a BIIA1 rekombináns fúziós terméket (13. sáv) Immunfluoreszcens mikroszkópia A BIIA1 és BIIA2 hat, KLH-val kapcsolt peptidje elleni, nyúleredetû antiszérum alkalmazásával immunfluoreszcenciavizsgálatokat végeztünk a parazitában a BIIA fehérje lokalizálásra üveg tárgylemezekre metanollal fixált B. bovis in vitro tenyészeteken (3. és 4. ábra). Immunizálás elõtt vett szérummal végzett inkubálás (A, C, E panelek) a paraziták semmilyen, a fertõzött és nem fertõzött eritrociták enyhe háttérfluoreszcenciája feletti specifikus festõdését sem eredményezte. Ezzel szemben az immunszérumok bármelyik vizsgált mikroszkópmezõn a paraziták specifikus festõdését eredményezték (B, D, F panelek). Fluoreszcens paraziták voltak kimutathatók mindhárom peptidek elleni 15

16 1 HU T2 2 antiszérumokkal 1:5 arányú hígításnál. Bár az eritrocitákon belüli B. bovis paraziták és szabad merozoitok kisméretûek (±1 v. 2 m), a maximális nagyítással a festési mintázat egyértelmûen látható In vitro elözönlés gátlása peptidspecifikus antiszérumokkal Az eritrociták szabad merozoitok általi, 1 órán át tartó elözönlésének fehérjementes pufferben való vizsgálatát lehetõvé tevõ, B. bovis in vitro elözönlési vizsgálatát alkalmaztuk a BIIA1 és BIIA2 különbözõ doménjeiból származó 6 peptid elleni antiszérum hatásainak becslésére. Szabad merozoitokat 1 órán át 20 C¹on elõinkubáltunk a peptid elleni antiszérumokkal és egy nem rokon peptid elleni kontrollszérummal, majd eritrociták hozzáadásával elözönlést indítottunk el. A BIIA peptidek elleni összes antiszérum jelentõs mértékben gátolta az elözönlést, míg az immunizálás elõtt vett szérum és a kontrollantiszérum nem gyakorolt jelentõs hatást az elözönlés hatékonyságára (5. és 6. ábra). BIIA1 esetében a legerõsebb, 65±10% gátlás hatását az I. peptid elleni antiszérumnál figyeltük meg; míg BIIA2-nél a legerõsebb, 70±10% gátlás hatását az 4. peptid elleni antiszérumnál találtuk BIIA fehérjék térképezése 2¹D-géleken Annak meghatározására, hogy az eritrociták elözönlése során kerül¹e BIIA 1 és BIIA2 a tápoldatba és így részét képezi a fentiekben említett SPA-nak, elözönléses felülúszókon immunblotolást végeztünk. BIIA1¹et és BIIA2¹t lokalizáltunk kétdimenziós immunblotokon. 50 g koncentrált elözönléses felülúszót választottunk el izoelektromos fókuszálással, majd SDS-poliakrilamid-géleken végzett elektroforézissel. PVDF membránokon fehérjéket blotoltunk. A membránokból kivágott darabokat (45 90 kda) inkubáltunk a BIIA1 peptid 1. vagy 3. peptidje elleni antiszérummal (7. ábra, A és C panelek, megfelelõen) és a BIIA2 peptid 4. és 6. peptidje elleni antiszérummal (8. ábra, A és C panelek, megfelelõen). Mindkét fehérje esetében az 1. és 4. peptid elleni antitestek ugyanahhoz a specifikus folthoz (nyíllal jelezve) kötõdtek, a kontrollblotokban is jelen lévõ, nem specifikusan festõdõ fehérjék mellett. Ezeket a nem fertõzött, ugyanazon körülmények között, de merozoitok hiányában tenyésztett vörösvértestek (RBC) felülúszóiból állítottuk elõ (7. és 8. ábra, B és D panelek). Az immunblotolással lokalizált foltokat ezt követõen egyeztettük egy párhuzamos kísérletben kapott hasonló mintából készült, ezüsttel festett 2D¹fehérjegéllel, amely utóbbi kísérletben olyan parazitákat alkalmaztunk, amelyeket az elözönlést megelõzõen 35 S-Metioninnal metabolikusan jeleztünk. A 9. ábra mutatja be a film expozíciója után kapott mintázatot, amely kizárólag a B. bovis fehérjéit mutatja be, mivel az eritrocitafehérjék nem építettek be jelzést. Leképezõ szoftver alkalmazásával, a BIIA 1 peptid elleni antiszérummal végzett immunblotolással kimutatott foltok egyeztethetõk az autoradiográfon és az ezüsttel festett gélen lévõ ±70 kda foltok sorával. A BIIA2¹t kisebb intenzitású foltok reprezentálják, ami jelzi, hogy a natív fehérje alacsonyabb mennyiségben van jelen. II. példa: A BIIA3 klónozása, expressziója és jellemzése Az fejezetben leírt B bovis cdns-könyvtárból származó teljes amplifikált DNS¹t BIIA3 génre szûrtünk az alábbi láncindítókkal: 9. láncindító: 5 ¹CCCGAATTCCATGATGGT- GAAGTTCCACAC¹3 (SEQ ID NO: 19) 10. láncindító: 5 ¹CCCGTCGACGTTGGCCCC- CTTTCGGTGAT¹3 (SEQ ID NO: 20) A PCR¹t az fejezetben leírtak szerint végeztük. Közvetlenül a PCR-fragmentumot szekvenáltuk meg, és a kapott szekvenciát a EQ ID NO:9 (BIIA3) mutatja be. A BIIA3 cdns PCR-fragmentumát pet-32a vektorba klónoztuk az fejezetben leírtak szerint. A 9. és 10. láncindító EcoRl és SalI restrikciós helyeket biztosított. A BIIA3 fehérje számítógéppel transzlált szekvenciáját a SEQ ID NO: 10 mutatja be. A BIIA3 cdns-ben lévõ, 1635 nukleotid méretû ORF egy 61,0 kda fehérjét kódol. E fehérjébõl peptideket jósoltunk specifikus antitestek indukálására tesztállatokban (lásd fejezetben leírtak). A BIIA3 fehérjébõl kiválasztott peptidek az alábbiak: 7. peptid: aminosavak cisztein GELKKLSDNIPTKMP, 8. peptid: aminosavak cisztein SGSARVETSLESSVP. A peptideket KLH-hoz kapcsoltuk, és nyúlban, poliklonális antitestek elõállítására alkalmaztuk az fejezetben leírtak szerint. Nyúlszérumokat ELISA-val értékeltünk az fejezetben leírtak szerint. A peptid elleni, nyúleredetû, poliklonális antiszérumokat recbiia3 (E. coliban expresszált, tioredoxinnal fuzionált BIIA3 fehérje) kimutatására alkalmaztuk I¹D Western-blotban. Az eredményeket a 10. ábra A paneljében mutatjuk be: A Rec BIIA3¹at mind a 7. és mind pedig a 8. peptid elleni antiszérum felismerte, míg az immunizálás elõtt vett szérum nem ismerte fel a Rec BIIA3¹at. BIIA3 (és BIIA1, illetve BIIA2) elleni poliklonális antiszérumot szarvasmarhában is elõállítottunk a III. példában leírtak szerint. Ezt a borjúeredetû antiszérumot is alkalmaztuk I¹D Western-blotban a recbiia3¹on. Az eredményeket a 10. ábra, B paneljében mutatjuk be: két állatból származó szérum felismerte a recbiia3¹t, míg az immunizálás elõtt gyûjtött szérum nem. A recbiia3 elleni, borjúeredetû antiszérumot natív B. bovis fehérjék 2¹D géljén is alkalmaztuk az és fejezetben leírtak szerint. Az eredményeket a 11. ábra mutatja be. Az immunizálás elõtti borjúszérum a vörösvértestekbõl származó számos folttal reagált (A panel). A B panelnál sepharose-oszlopon tisztított recbiia3-immun IgG¹t alkalmaztunk. Ez specifikusan felismerte a 16

17 1 HU T2 2 ~95 kda, ~75 kda és ~30 kda foltok (csoportjait) (lásd nyilak). Kétségtelen, hogy a natív BIIA3 feldolgozott és multimer formái is felismerésre kerültek. A 7. peptid elleni, nyúleredetû poliklonális antiszérumról kimutattuk, hogy elözönlést gátló tulajdonságai vannak (lásd 12. ábra). Sepharose G¹vel tisztított IgG¹t alkalmaztunk három különbözõ koncentrációban, melynek eredményeként 65%¹os maximális gátlást értünk el. Nem immun IgG-nek és PBS-nek nem volt gátló hatása (kontrolloszlop). A 7. peptid elleni, nyúleredetû poliklonális antiszérumot a BIIA3 sejten belüli lokalizációjának közvetett immunfluoreszcenciás meghatározására is alkalmaztuk a fertõzött eritrocitákban lévõ B. bowis merozoitokban. A kimutatás multifoton mikroszkópiával történt. Vékony vérkeneteket 10 percig fixáltunk acetonban, majd megszárítottuk. A 7. peptid elleni, nyúleredetû szérummal (1:20) végzett primer 30 perces inkubálás után, három, PBS-sel végzett 5 perces mosási lépés következett. A lemezeket nyúl elleni, kecskében készült, Alexa 488-cal (20 g/ml, Molecular Probes Inc., Eugene, USA) konjugált IgG-vel inkubáltuk 30 percig, majd PBS¹el mostuk. Ezt követõen kettõs jelzéshez a lemezeket DAPI-val (0,5 M, Molecular Probes Inc.) inkubáltuk 20 percig, majd mostuk. A lemezekre FluorSave oldatot vittünk fel és 12 órán át szobahõmérsékleten, lefedve, vízszintes helyzetben inkubáltuk. Fluoreszcens jeleket Nikon TE300 inverziós mikroszkóppal felszerelt Bio-Rad Radiance 2100MP konfokális és multifoton rendszer alkalmazásával tettük láthatóvá. A DAPI próbák excitációját egy 10 W¹os szilárd fázisú lézerrel (Milennia Xs, Spectra-Physics) pumpált rögzített üzemmódú titán-zafír lézer (Tsunami, Spectra-Physics) alkalmazásával elõállított 780 nm¹es multifoton excitációjával, míg az Alexa 488 próbáét egy 488 nm¹es argonlézer alkalmazásával értük el. A multifoton IFT eredmények BIIA3 festés jelenlétét mutatták ki a Babesia parazita apikális régiójában. III. példa: Rekombináns BIIA1, BIIA2. és BIIA3 elleni borjúeredetû antiszérum elõállítása és alkalmazása E. coliban elõállítottuk a BIIA1, BIIA2, és BIIA3 rekombináns expressziós termékeit, az fejezetben leírtak szerint. A baktériumokat ülepítettük és 6 M guanidiniumhcl-ben feloldottuk. A teljes sejtlizátumot 9000 rpm-mel 10 percig centrifugáltuk, és az oldható lizátumot Ni¹NTA agaróz szuszpenziójához kötöttük. A gyöngyöket 8 M ureában háromszor mostuk, majd specifikus antigént eluáltunk 3 M, 250 mm imidazolt tartalmazó ureával. Minden dózis vakcina 100 g tisztított recbiia antigént tartalmazott, és szaponin adjuvánssal 2 ml végsõ dózisba lett formulázva. A vakcinákat intramuszkulárisan beoltottuk az immunológiailag kompetens, 5¹5 állatból álló csoportba sorolt szarvasmarhák nyakába. Az indító oltás után 5 héttel ugyanilyen készítménnyel erõsítõvakcinálást végeztünk. Az erõsítõvakcinálás után héttel vért vettünk, amelybõl analízis céljából szérumot állítottunk elõ. Szarvasmarha-specifikus IgG¹t tisztítottunk oly módon, hogy 5 ml antiszérumot 2 ml, kötõpufferben (0,01 M nátriumfoszfát,ph=7,4, 0,15 M NAD M EDTA) oldott GammaBind Plus Sepharose-zal (Amersham-biosciences) 1 órán át 20 C¹on inkubáltuk. Az oszlopot kötõpufferrel mostuk és IgG¹t eluáltunk 5 ml 0,5 M NaAc-val (ph=3,0), majd azonnal TrisHCllel (ph=9,0) semlegesítettük. Az IgG¹t betöményítettük és PBS (ph=7,4) ellen dializáltuk. In vitro elözönlést gátoltunk rekombináns (Israeltörzsbõl klónozott) BIIA1, BIIA2 és BIIA3 ellen készült borjúeredetû antiszérumból tisztított teljes IgG-vel a poliklonális nyúleredetû antiszérumnál leírtak szerint (lásd és fejezet), 0,15 g/ l vagy 0,75 g/ l végsõ borjúeredetû IgG-koncentrációkkal végzett elõinkubáció alkalmazásával. Minden tesztet kétszer végeztünk, minden antigén esetében két különbözõ állatból származó antitestek alkalmazásával. A 13. ábrán bemutatott eredmények az egyedi antiszérumok kombinált adatait ábrázolják az egyes antigénekre vonatkoztatva. Feltüntettük a standard eltéréseket is. Annak kimutatására, hogy a gátlás heterológ Babesia-törzs elözönlés általi elterjedésének gátlásában is hatékony, a B. bovis egy mexikói izolátumából (M07) származó klonális vonalat (C9.1) teszteltünk Az eritrociták mindkét Babesia-törzs általi elözönlését gátló hatékonyság összevethetõ. A BIIA1 és BIIA2 hatékonysága (3 és 12% közötti) még magasabbnak is tûnt, mint a BIIA3¹é (23 25%). Ábramagyarázatok 1. ábra: 1. sáv: pet-biia1 az IPTG-vel való indukció elõtt. 2. sáv: pet-biia1 az IPTG-vel való indukció után 4 órával. 3. sáv: pet-rab5 az indukció után 4 órával. 4., 5., 6. sáv: 1. antipeptiddel inkubálva; 7., 8., 9. sáv: 2. antipeptiddel inkubálva; 10., 11., 12. sáv: 3. antipeptiddel inkubálva; 4., 7., 10. sáv: pet-biia1¹et tartalmaz, 4 órával az indukció után, immunizálás elõtti szérummal inkubálva. 5., 8., 11. sávok: mint a 4., 7., 10. sáv, de immunszérummal inkubálva. 6., 9., 12. sáv: pet-rab5¹öt tartalmaz, 4 órával az indukció után, immunszérummal inkubálva. 13. sáv: pet-biia1, 4 órával az indukció után, KHLval kapcsolt, B. bovis-sal nem rokon peptid elleni antiszérummal inkubálva. 2. ábra: 1. sáv: pet-biia2 az IPTG-vel való indukció elõtt. 2. sáv: pet-biia2 az IPTG-vel való indukció után 4 órával. 3. sáv: pet-rab5 az indukció után 4 órával. 4., 5., 6. sáv: 4. antipeptiddel inkubálva; 7., 8., 9. sáv: 5. antipeptiddel inkubálva; 17

18 1 HU T , 11., 12. sáv: 6. antipeptiddel inkubálva; 4., 7., 10. sáv: pet-biia2¹et tartalmaz, 4 órával az indukció után, immunizálás elõtti nyúleredetû szérummal inkubálva. 5., 8., 11. sávok: mint a 4., 7., 10. sáv, de immunszérummal inkubálva. 6., 9,. 12. sáv: pet-rab5¹öt tartalmaz, 4 órával az indukció után, immunszérummal inkubálva. 13. sáv: pet-biia2¹t tartalmaz, 4 órával az indukció után, KHL-val kapcsolt, B. bovis-sal nem rokon peptid elleni antiszérummal inkubálva. 3. ábra: A, C és E panelek: metanollal fixált, BIIA1 1., 2. és 3. peptidje elleni, immunizálás elõtti nyúleredetû antiszérummal inkubált in vitro B. bovis-tenyészetek (megfelelõen). A B, D, F panelek az A, C, és E panelekhez hasonlóak, de a megfelelõ immunszérummal voltak inkubálva. Reprodukciós célokból megfordítottuk a színeket. 4. ábra: A, C és E panelek: metanollal fixált, BIIA2 4., 5. és 6. peptidje elleni, immunizálás elõtti nyúleredetû antiszérummal inkubált in vitro B. bovis-tenyészetek (megfelelõen). A B, D, F panelek az A, C. és E panelekhez hasonlóak, de a megfelelõ immunszérummal voltak inkubálva. Reprodukciós célokból megfordítottuk a színeket. 5. ábra: A kontrolloszlopok egy nem rokon peptid elleni antiszérummal végzett elõinkubálásnak felelnek meg, amely antiszérumnak nem volt gátló hatása. Antiszérumokat (üres oszlopok) és a BIIA1 1., 2. és 3. peptidje elleni, immunizálás elõtti nyúlból származó antiszérumokat (fekete oszlopok) háromszoros ismétlésben kétszer teszteltük. 6. ábra: A kontrolloszlopok egy nem rokon peptid elleni antiszérummal végzett elõinkubálásnak felelnek meg, amely antiszérumnak nem volt gátló hatása. Antiszérumokat (üres oszlopok) és a BIIA2 4., 5. és 6. peptidje elleni, immunizálás elõtti nyúlból származó antiszérumokat (fekete oszlopok) háromszoros ismétlésben kétszer teszteltük. 7. ábra: A és C panelek: A BIIA1 1. és 3. peptidje elleni immunszérummal készített 2D¹immunblotok (megfelelõen). B és D panelek: A BIIA1 1. és 3. peptidje elleni, nyúleredetû, immunizálás elõtti szérummal készített 2D¹immunblotok (megfelelõen). Nyilak jelzik az 1. peptid és a 3. peptid elleni antiszérumra specifikus foltokat ábra: A és C panelek: A BIIA2 4. és 6. peptidje elleni immunszérummal végzett 2D¹immunblotok (megfelelõen). B és D panelek: A BIIA2 4. és 6. peptidje elleni, nyúleredetû, immunizálás elõtti szérummal készített 2D¹immunblotok (megfelelõen). Nyilak jelzik az 4. peptid és a 6. peptid elleni antiszérumra specifikus foltokat. 9. ábra: A 7. és 8. ábrán bemutatott immunblotokra alkalmazott 2D¹gél autoradiogamja, amelyen csak az elözönlést megelõzõen metabolikusan 35 S-Metioninnal jelzett, B. bovis-eredetû fehérjék látszanak. Nyíl jelzi azokat a foltokat, amelyeket a 7. ábrán bemutatott immunblotokkal való, leképezõ szoftverrel végzett egyeztetéssel BllA1-ként azonosítottunk. 10. ábra: E. coli által expresszált recbiia3 1D¹Western-blotja, amelyen a recbiia3¹at a 7. és 8. peptidek ellen termelt, nyúleredetû poliklonális antiszérumok ismerték fel. A panel: nyúleredetû, peptid elleni antiszérum: 1. sáv: 7. peptid elleni; 3. sáv: 8. peptid elleni; mindkét szérum 1:2000 arányban volt hígítva. 2. és 4. sávok: mindkét peptidantiszérum elõállítására alkalmazott nyulakból származó, immunizálás elõtt vett szérum. B panel: recbiia3 elleni, borjúeredetû antiszérum: 1. sáv és 2. sáv: két állatból származó, tisztított immun lgg 1: hígításban; 3. sáv: immunizálás elõtti, borjúeredetû szérum. 11. ábra: recbiia3 elleni, borjúeredetû poliklonális antiszérum által felismert natív B. bovis-fehérjék 2D¹Western blotja. A panel: immunizálás elõtti borjúszérum. B panel: Sepharose G¹vel tisztított immun IgG (0,8 g/ml). Nyilak jelzik a BIIA3¹re specifikus antitestfelismerést. 12. ábra: 7. peptid elleni, nyúleredetû, poliklonális immun IgG-vel végzett elözönlést gátló vizsgálat, amelyben gátlódik a B. bovis Israel izolátumának borjúeritrocitákba történõ, elözönlés általi elterjedése. A kontroll (immunizálás elõtti szérum) általi gátlást 100%-nak tekintettük. Vízszintes tengely: a tisztított immun IgG koncentrációja; függõleges tengely: elözönlést gátló hatékonyság relatív %¹ban, a standard hibával (n=3). 13. ábra: E. coliban expresszált recbiia1, recbiia2, és rec- BIIA3 elleni, borjúeredetû poliklonális immun IgG-vel végzett elözönlésgátló-vizsgálat, amelyben gátlódott a B. bovis izraeli és mexikói izolátumainak borjúeritrocitákba való, elözönlés általi elterjedése. A kontroll (immunizálás elõtti szérum) általi gátlást 100%-nak tekintettük. Vízszintes tengely: végsõ IgG-koncentráció ( g/ l); függõleges tengely: elözönlést gátló hatékonyság relatív %¹ban, a standard hibával (n=2 2). 18

19 Szekvencialista <110> Universiteit Utrecht Holding B.V. <120> Babesia vaccine <130> <160> 18 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 1818 <212> DNA <213> Babesia bovis <220> <221> CDS <222> (1)..(1818) <400> 1 atg cag tta cat aac aaa atg cag tca act tct ctc aaa tat aac tac 48 Met Gln Leu His Asn Lys Met Gln Ser Thr Ser Leu Lys Tyr Asn Tyr aag cgc atg ctt tgt atg gct ctt gta cca gtt atc tta tcc tca ttt 36 Lys Arg Met Leu Cys Met Ala Leu Val Pro Val Ile Leu Ser Ser Phe ttt gcg gaa gat gct tta gct tcc aac tcc acg ctt ttc gct tcc cac 144 Phe Ala Glu Asp Ala Leu Ala Ser Asn Ser Thr Leu Phe Ala Phe His aag gaa cca aac aat cgt agg ctt acc aaa agg tct cca aga gga cag 192 Lys Glu Pro Asn Asn Arg Arg Leu Thr Lys Arg Ser Ser Arg Gly Gln ttg ctc aac tca agg agg ggt tcg gat gat gcg tcc gaa tct tcc gat 240 Leu Leu Asn Ser Arg Arg Gly Ser Asp Asp Ala Ser Glu Ser Ser Asp aga tac cca ggt agg tcg ggt ggc tct aag aat tcg agc caa tcc ccc 238 Arg Tyr Pro Gly Arg Ser Gly Gly Ser Lys Asn Ser Ser Gln Ser Pro tgg atc aag tat atg caa aag ttc gac att ccc cgt aac cac ggc tct 336 Trp Ile Lys Tyr Met Gln Lys Phe Asp Ile Pro Arg Asn His Gly Ser gga atc tat gtc gat ctt gga gga tat gaa tcc gtt ggt tca aaa agt 384 Gly Ile Tyr Val Asp Leu Gly Gly Tyr Glu Ser Val Gly Ser Lys Ser tat cgt atg ccc gtt ggt aag tgc cca gta gtc ggt aaa att ata gac 432 Tyr Arg Met Pro Val Gly Lys Cys Pro Val Val Gly Lys Ile Ile Asp

20 ctt gga aat ggt gcc gac ttc ctc gat ccc att tca tca gac gac cca 480 Leu Gly Asn Gly Ala Asp Phe Leu Asp Pro Ile Ser Ser Asp Asp Pro agt tac cgt ggt ttg gca ttc ccc gag act gct gtg gac tct aat att 528 Ser Tyr Arg Gly Leu Ala Phe Pro Glu Thr Ala Val Asp Ser Asn Ile ccc aca caa cca aag aca cgt ggt tct tca tca gca tct gcg gcc aaa 576 Pro Thr Gln Pro Lys Thr Arg Gly Ser Ser Ser Ala Ser Ala Ala Lys tta tct cct gtt tcg gcg aaa gat ctg aga cgt tgg gga tat gaa ggt 624 Leu Ser Pro Val Ser Ala Lys Asp Leu Arg Arg Trp Gly Tyr Glu Gly aat gat gta gcg aat tgc tca gaa tat gct agt aac ctc att ccc gca 672 Asn Asp Val Ala Asn Cys Ser Glu Tyr Ala Ser Asn Leu Ile Pro Ala tca gac agg agt acc aaa tat agg tat cct ttt gtt ttt gac agt gat 720 Ser Asp Arg Ser Thr Lys Tyr Arg Tyr Pro Phe Val Phe Asp Ser Asp aac cag atg tgt tac ata ctg tac tct gcc ata caa tac aac caa gga 768 Asn Gln Met Cys Tyr Ile Leu Tyr Ser Ala Ile Gln Tyr Asn Gln Gly aat agg tat tgt gac aac gat ggt agc tcc gaa gat ggt aca agc tct 816 Asn Arg Tyr Cys Asp Asn Asp Gly Ser Ser Glu Asp Gly Thr Ser Ser ctg ctt tgc atg aaa cct tac aag agc gct gag cat gca cac tta tac 864 Leu Leu Cys Met Lys Pro Tyr Lys Ser Ala Glu Asp Ala His Leu Tyr tac ggt tct gcg aaa gtt gac ccc gat tgg gaa gaa aat tgt ccc atg 912 Tyr Gly Ser Ala Lys Val Asp Pro Asp Trp Glu Glu Asn Cys Pro Met cac ccg gta agg gat gcc att ttt ggt aaa tgg tct ggt ggc tct tgt 960 His Pro Val Arg Asp Ala Ile Phe Gly Lys Trp Ser Gly Gly Ser Cys gtt gcc att gct cct gca ttc caa gaa tat gcc aac agc act gaa gac 1008 Val Ala Ile Ala Pro Ala Phe Gln Glu Tyr Ala Asn Ser Thr Glu Asp tgt gca gcc att tta ttc gat aac tct gca act gac ttg aat atc gaa 1056 Cys Ala Ala Ile Leu Phe Asp Asn Ser Ala Thr Asp Leu Asn Ile Glu gct gtt aac gaa gat ttt aat gaa ctt aaa gaa ttg acc gat ggg ctt 1104 Ala Val Asn Glu Asp Phe Asn Glu Leu Lys Glu Leu Thr Asp Gly Leu aaa aga ttg aac atg tcg aag gtt gca aac gct att ttt tct ccc ctc 1152 Lys Arg Leu Asn Met Ser Lys Val A.la Asn Ala Ile Phe Ser Pro Leu