Az orvosi biotechnológiai mesterképzés megfeleltetése az Európai Unió új társadalmi kihívásainak a Pécsi Tudományegyetemen és a Debreceni Egyetemen

Átírás

1 Az orvosi biotechnológiai mesterképzés megfeleltetése az Európai Unió új társadalmi kihívásainak a Pécsi Tudományegyetemen és a Debreceni Egyetemen Azonosító szám: TÁMOP /1/A

2 Az orvosi biotechnológiai mesterképzés megfeleltetése az Európai Unió új társadalmi kihívásainak a Pécsi Tudományegyetemen és a Debreceni Egyetemen Azonosító szám: TÁMOP /1/A Dr. Pongrácz Judit Háromdimenziós szövettenyésztés és tissue engineering 3. Előadás ŐSSEJTEK (2)

3 Köldökzsinórvér-őssejtek (CBE) Kb. 130 millió gyermek születik évente a regeneratív gyógyászat számára a köldökzsinórvér jelenti a legnagyobb potenciális őssejt-forrást Az elmúlt 36 évben több, mint beteget kezeltek köldökzsinórvér-őssejtekkel Több, mint 80 különböző betegség kezelésére alkalmaztak köldökzsinórvér eredetű őssejteket

4 Köldökzsinórvér-őssejtek és magzati őssejtek Köldökzsinórvér gyűjtése (Születés után) Köldökzsinórvér hozzáadása A köldökzsinórvér sejteket speciális zsákban vagy kapszulában fagyasztják le A vér vizsgálata Sejt szeparáció Keverés és ülepítés Sejtek koncentrálása 35 perc 10 perc Sejtek fagyasztása Folyékony nitrogén tartály (-150 )

5 Krioprezerváció (Mélyfagyasztás) A primer sejtek krioprezervációja hosszú távon lehetséges (akár 20 évig) Az alacsony hőmérsékletet ( o C) folyékony nitrogén biztosítja

6 Köldökzsinórvér feldolgozása 1. Vörösvértestek eltávolítása (Ficoll, Hetastarch, Lymphoprep, Prepacyte) 2. A kisebb tárolási méret érdekében a plazma eltávolítása 3. A kinyert sejtek tesztelése (fertőzés, térfogat, cellularitás, őssejt-szám, CD34 + )

7 Köldökzsinórvér feldolgozása és krioprezerváció A köldökzsinórvér elsősorban hematológiai betegségek kezelésében hasznos A köldökzsinórvért születéskor gyűjtik Azonnal feldolgozzák vagy tisztítás nélkül DMSO hozzáadásával folyékony nitrogénben lefagyasztják

8 Köldökzsinórvér bank Ideális esetben valamennyi nagyvárosban rendelkezésre áll, egy nemzetközi adatbázishálózathoz csatlakozik, ahol valamennyi tárolt sejt HLA-tipizálásának adatai hozzáférhetőek. A köldökzsinórvér hosszú távú tárolása költséges

9 A köldökzsinórvér-őssejtek pluripotenciája Köldökzsinórvér Tisztítás Őssejtek CBE MSC Endodermális Mezodermális Ektodermális Hepatobiliáris Vér Neurális

10 Őssejtpopuláció a köldökzsinórvérben Adherens Pre-MSC MSC CBE Nem adherens Lin - CD133 + CD34 + Köldökzsinórvér Csontvelő Perifériás vér

11 Köldökzsinórvér-őssejtekkel gyógyítható betegségek I. TÁMOP /1/A Onkológiai betegségek Akut limfoid leukémia Akut mieloid leukémia Autoimmun limfoproliferatív betegségek Burkitt limfóma Krónikus mieloid leukémia Monoszómia okozta citopénia Familiáris hisztiocitózis Hodgkin-kór Juvenilis mielomonocitás leukémia Langerhans sejtes hisztiocitózis Mielodiszpláziás szindrómák Non-Hodgkin limfóma Immundeficienciák Ataxia telangiektázia Porc-haj hipoplázia Krónikus granulomatózus betegség DiGeorge szindróma Hipogammaglobulinémia IKK gamma deficiencia Autoimmun poliendokrin szindróma II-es típusú mukolipidózis Myelokathexis Súlyos kombinált immunhiányos betegség Wiscott-Aldrich szindróma X-hez kötött agammaglobulinémia, immunhiány, limfoproliferatív szindróma

12 Köldökzsinórvér-őssejtekkel gyógyítható betegségek II. TÁMOP /1/A Hematológiai betegségek Autoimmun neutropénia Ciklikus neutropénia Diamond Blackfran anémia Evan szindróma Vörösvértest aplázia Refrakter anémia Súlyos aplasztikus anémia Sarlósejtes anémia Thalasszémia Fanconi anémia Glanzmann-kór Kongenitális szideroblasztos anémia Juvenilis dermatomiozitisz és xanthogranulomák, stb. Anyagcsere betegségek Adrenoleukodisztrófia Alfa mannozidózis I-es típusú diabétesz Gaucher-kór Gunther -kór Hermansky-Pudlak szindróma Hurler szindróma Hurler-Scheie szindróma Krabbe-kór Maroteau-lamy szindróma Metakromatikus leukodisztrófia II-es és III-as típusú mukolipidózis A és B típusú Neimann Pick szindróma Sandoff szindróma Sanfilippo szindróma Tay Sachs betegség

13 Zsírszövet-eredetű őssejtek (ASC) Zsírszövet-eredetű őssejtek (ASC): Könnyen izolálható Állandó immunfenotípus jellemzi A csontvelői őssejtekhez (BMSC) hasonló Multipotens Genetikailag módosítható

14 A zsírszövetek típusai Típus 1 Csontvelői zsírszövet Funkció Azon terek kitöltése, amelyek a hemopoézisben már nem vesznek részt 2 Barna zsírszövet (BAT) Az újszülöttek létfontosságú szerveinek védelme 3 Ektópiás zsírszövet Abnormális zsír felhalmozódás a májban, a szív- és vázizomzatban (pl.: metabolikus szindrómában) 4 Emlő zsírszövete Szoptatás energia és tápanyagforrás 5 Mechanikai zsírszövet Mechanikai traumától való védelem 6 Fehér zsírszövet (WAT) Hőszigetelés, energia raktározás, rezervoár, endokrin szerv

15 Zsírszöveti őssejtek izolálása Mosás PBS-ben 300g, 5 perc Zsírsejtek leszívása Emésztés kollagenázzal 37 o C-on, 1 óra Stróma-vaszkuláris frakció (SVF)

16 A zsír eredetű őssejtek immunfenotípusa Pozitív markerek Marker Név Marker Név CD9 Tetraspan CD55 Decay accelerating factor CD10 Közös akut limfoid leukémia antigén CD59 Protektin CD13 Aminopeptidáz CD71 Transzferrin CD29 b1-integrin CD73 5 -ektonukleotidáz CD34 Szialomucin CD90 Thy1 CD44 Hialuronsav receptor CD105 Endoglin CD49d a4-integrin CD146 Muc-18 CD54 HLA-ABC Intracelluláris adhéziós molekula Hisztokompatibilitási lókusz antigén-abc CD166 a-sma Aktivált leukocita sejtadhéziós molekula a-simaizom aktin

17 A zsír eredetű őssejtek immunfenotípusa Negatív markerek TÁMOP /1/A Marker Név Marker Név CD11b ab-integrin CD50 Intracelluláris adhéziós molekula-3 CD14 LPS receptor CD56 Idegsejt adhéziós molekula CD16 Fc receptor CD62 E-szelektin CD18 b2-integrin CD104 B4-integrin CD45 Közös leukocita antigén HLA-DR Hisztokompatibilitási lókusz antigén-dr

18 A zsírszövet eredetű őssejtek citokinprofilja TÁMOP /1/A CITOKIN Adiponektin Leptin Plazminogén aktivált inhibitor-1 Hepatocita növekedési faktor Pigment epitél eredetű faktor Vaszkuláris endoteliális növekedési faktor Flt-3 ligand GCSF Leukémia inhibitor faktor IL-7 MCSF IL-6, IL-8, IL-11 Leukémia inhibitor faktor TNFa FUNKCIÓ Adipokinek Angiogén Hemopoetikus Pro-inflammatorikus

19 A zsírszövet eredetű őssejtek immunogenitása TÁMOP /1/A Az immunogenitás hiánya annak köszönhető, hogy a felszínükről hiányoznak a II-es típusú fő hisztokompatibilitási antigének (HLA-DR). Immunszuppresszív tulajdonságuk a prosztaglandin E2 termeléshez kapcsolódik.

20 A zsírszövet eredetű őssejtek differenciáciálódási potenciálja Zsírsejt Szívizomsejtek Porcsejtek Endodermális és ektodermális sejtvonalak Endotél és simaizom sejtek Hemopoetikus sejtek Neuronális sejtvonal Oszteoblasztok Harántcsíkolt izomsejtek TÁMOP /1/A

21 Zsírsejtekké történő differenciáció A SEJTEK EREDETE INDUKÁLÓSZER INDUKÁLT MARKEREK FELHASZNÁLÁS Fehér zsírszövet Forskolin (AMP agonista) Neutrális zsírok Funkcionális zsírpárnák Methylisobutylxanthine (AMP agonista) Glükokortikoid receptor ligandok (dexamethasone) PPAR-g2 ligandok (thiazolidinedione) Inzulin bfgf Adiponektin CAAT/enhancer kötő protein-a zsírsav-kötő fehérje (ap2) Leptin Lipoprotein lipáz PPAR-g2 Plasztikai sebészet Kozmetikai és helyreállító sebészet

22 Szívizomsejtekké történő differenciáció A SEJTEK EREDETE INDUKÁLÓSZER INDUKÁLT MARKEREK FELHASZNÁLÁS Barna zsírszövet 5-azacytadine Szarkomer aktinin Ischaemiás károsodás után a sérült szívizomszövet helyreállítása Fehér zsírszövet Szívizomsejt kivonat Konnexin-43 Dezmin troponin-i

23 Porcsejtekké történő differenciáció A SEJTEK EREDETE INDUKÁLÓSZER INDUKÁLT MARKEREK FELHASZNÁLÁS Csontvelői zsírszövet Aszkorbinsav Aggrecan Térd, csípő porcszövet Barna zsírszövet Dexamethasone Kondroitin-szulfát Fehér zsírszövet TGF-b II-es típusú kollagén 3D struktúra BMP-6 IV-es típusú kollagén Porcsejt-specifikus proteoglikánok FGF

24 Oszteocitákká történő differenciáció A SEJTEK EREDETE INDUKÁLÓSZER INDUKÁLT MARKEREK FELHASZNÁLÁS Fehér zsírszövet Aszkorbinsav Oszteokalcin Csont implantáció Csontvelői zsírszövet Dexamethasone DMP-1 Csonttörés helyreállítása 1,25-dihidroxikolekalciferol Oszteoadherin B-glicerolfoszfát BMP-2 BMP-7 Runx2

25 Harántcsíkolt izomsejtekké történő differentáció A SEJTEK EREDETE INDUKÁLÓSZER INDUKÁLT MARKEREK FELHASZNÁLÁS FBS alacsony koncentrációja Ló szérum myod Miogenin Miozin könnyűlánc kináz

26 Idegsejtekké történő diferenciáció A SEJTEK EREDETE INDUKÁLÓSZER INDUKÁLT MARKEREK FELHASZNÁLÁS Indomethacin Inzulin Metlizobutilxantin Gliális fibrilláris savas fehérje (GFAP) Nestin Intermedier filamentum Glutamát receptor alegységek S-100 B-III tubulin Központi idegrendszer sérülései

27 Differenciáció endodermális és ektodermális sejtvonalakká A SEJTEK EREDETE INDUKÁLÓSZER INDUKÁLT MARKEREK FELHASZNÁLÁS Csontvelői zsírszövet Hepatocita növekedési faktor Albumin Máj Oncostatin M A-fetoprotein DMSO és HGF, bfgf, nicotinamid együtt Urea ATRA Citokeratin-18 Epitél szövet helyreállítás (Crohn-betegség)

28 Endotél és simaizom sejtekké történő differenciáció TÁMOP /1/A A SEJTEK EREDETE INDUKÁLÓSZER INDUKÁLT MARKEREK FELHASZNÁLÁS Fehér zsírszövet CD31 Vaszkuláris trauma kalponin Urogenitális trauma a-simaizom aktin

29 Hemopoetikus utánpótlás A SEJTEK EREDETE INDUKÁLÓSZER INDUKÁLT MARKEREK FELHASZNÁLÁS ASC-k szekretálják: IL6,IL7, IL8, IL11, SCF, TNFa, MCSF, GMCSF CD34 + a T, NK sejteken, B- sejt markerek Nagydózisú kemoterápiát követő hemopoetikus őssejt-helyreállítás

30 Az orvosi biotechnológiai mesterképzés megfeleltetése az Európai Unió új társadalmi kihívásainak a Pécsi Tudományegyetemen és a Debreceni Egyetemen Azonosító szám: TÁMOP /1/A Dr. Pongrácz Judit Háromdimenziós szövettenyésztés és tissue engineering 4. Előadás ŐSSEJTEK (3)

31 ESC-k és ASC-k felhasználása Endoderma Tüdő Embrionális fejlődés Blasztociszta Belső sejttömeg ESC Ektoderma Agy Neuron Asztrocita Oligodendrocita BASCs BADJ niche Endodermális őssejt Pluripotens ESC Mezodermális őssejt Ektodermális őssejt NSCs Szubventrikuláris zóna niche Hippokampusz niche (gyrus dentalis ) Tüdőbetegségek Hasnyálmirigy Inzulin-termelő b-sejtek Mesoderma Hemangioblaszt Agyi és gerincvelői rendellenességek Szem RSCs Csillós epitél niche Exockrin acinusok Cukorbetegség Máj Májsejtek Májbetegségek Endokrin Langerhans szigetek PSCs Hasnyálmirigyvezeték feltételezett niche HDCs Epevezeték (Hering csatorna) Szív Szívizomsejtek Csont Érlumen Vaszkulogén zóna CSCs Pitvar niche Szívcsúcs niche Szívbetegségek HSCs Endoszteum felszín niche Hajszálér hálózat niche MSCs Perivaszkuláris felszín niche Hemopoetikus és Immunrendszeri megbetegedések Media Vérlemezke Eritrocita Bazofil HSC EPC EPC Új endotélsejt Keringési betegségek Közös mieloid prekurzor Neutrofil Eozinofil HSC Vérlemezkék Eritrociták Granulociták Monociták Közös limfoid prekurzor Makrofágok NK-sejtek T-limfociták B-limfociták Dendritikus sejtek NK-sejt Érfalban található őssejtek EPCs and MSCs MSC Oszteoblasztok Porcsejtek Zsírsejtek Mioblasztok Véráram Makrofág T-limfocita Monocita Dendritikus sejt B-limfocita Szembetegségek Bőr Génterápiák Intravénás injekción Retina Bőrbetegségek Cornea CESCs Limbus niche KSCs Alapréteg niche bescs encscs Bulge régió niche SKPs Tüsző papilla Genetikailag módosított őssejtek

32 Génsebészet és génátvitel ASC-k felhasználásával ASC sejtek transzdukciója lentivirális vektorokkal Egyéb rekombináns virális vektorok Nukleofekció

33 Az őssejt-szaporodás és differenciáció irányítására alkalmazott módszerek Sejtvonal-specifikus génekkel történő transzdukció segítheti a differenciáció irányítását. Riporterek (pl.: GFP) alkalmazása megkönnyíti a sejtek szelekcióját (pl.: FACS) illetve a génaktiváció helyének és idejének ellenőrzését. Sejt-szortoló technikák alkalmazásával (MACS vagy FACS) a kívánt sejtek kiválogathatóak (vagy a nem kívánt sejtek eltávolíthatóak) sejtfelszíni antigéneket kötő antitestek felhasználásával vagy fluoreszcens markerek, például GFP expresszió alapján. FACS Gén Riporter (pl. GFP) MACS A tenyésztőmédiumhoz adott különböző biokémiai faktorok (szérumot beleértve) stimulálják a differenciációt. Ehhez szükséges azon faktorok ismerete, amelyek valószínűleg elősegítik a differenciációt, ugyanakkor ritka a 100%-os hatékonyság. A többféle méretben és típusban kapható bioreaktorok növelik a tápanyagok illetve bomlástermékek cseréjének hatékonyságát, elősegítik a növekedési faktorok transzportját, lehetővé téve a sejtkultúrák hosszú távú fenntartását, és így nagyobb sejtszám vagy nagyobb szövetméret elérését. Egyes specifikus sejttípusok szelekciója adhéziós assay-el specifikus ECM fehérjék vagy receptor ligandok felhasználásával a sejtszubsztrát interakciók affinitása és kinetikája alapján. Ide tartozik a kolónia formáló egység (CFU) assay is. A kívánt sejtekkel vagy szövetekkel (pl.: szövetregeneráció céljára) létrehozott ko-kultúrák a közvetlen fizikai kontaktus és/vagy közvetett biokémiai jelek útján elősegíthetik a differenciációt. A scaffold -ok fizikai (pl.: felszíni érdesség, porozitás, stb.) és biokémiai (pl.: beágyazott növekedési faktorok szabályozott felszabadulása) sajátságai elősegítik a sejtek tapadását, toborzását, differenciálódását, illetve megkönnyíti a sejtek szállítását.

34 Újraprogramozás Vírus szállítja az újraprogramozáshoz szükséges faktorokat a szomatikus sejt magjába Pluripotens ipsc sejtvonal Szomatikus sejt újraprogramozása Tenyésztés hesc-ként

35 Sejtek differenciálódása I. Prekurzor sejt Szabályozó fehérje 1 Sejtosztódás Szabályozó fehérje 2 Szabályozó fehérje 2 Szabályozó fehérje 3 Szabályozó fehérje 3 Szabályozó fehérje 3 Szabályozó fehérje 3 Sejt A Sejt B Sejt C Sejt D Sejt E Sejt F Sejt G Sejt H

36 Sejtek differenciálódása II. Ivarsejtek Blasztociszta Gasztrula Spermium Petesejt Ektoderma (Külső réteg) Zigóta Epidermisz bőrsejtjei Agy neuronjai Pigmentsejt Mezoderma (Középső réteg) Szívizom Harántcsíkolt izomsejtek Vörösvértestek Simaizom Vesetubulus sejtek Endoderma (Belső réteg) Tüdősejt (Alveroláris sejt) Pajzsmirigy sejt Hasnyálmirigy sejt

37 Érett, szervspecifikus primer sejtek I. Sejtkultúra Biopszia Tisztítás TE-ben használható sejtek

38 Érett, szervspecifikus primer sejtek II. Tisztítás Biopszia Szövetspecifikus rezidens őssejtek Sejtkultúrák TE-ben használható sejtek Differenciálódott szöveti sejtek

39 Epidermális differenciáció TÁMOP /1/A Az epidermisz differenciálódása Elszarusodó envelope Lipid envelope Lipidek felszabadulása a lamelláris granulumokból Stratum corneum Szemcsés réteg Filaggrin, loricin, trichohyalin, involucrin, SPRRs, S100 fehérjék Keratin-2e Stratum spinosum Keratin-1, -10 Alapréteg Keratin-5, -14 Alapmbrán

40 Érett szövetspecifikus sejtek tissue engineering -ben Biopszia vagy reszekció Tisztítás A proliferációs képesség visszaállítása sejtkultúrában Re-differenciáció

41 Szabályozási kérdések I. Sejtek TÁMOP /1/A GLP GMP Engedély embrionális őssejtekkel történő munkához

42 Szabályozási kérdések II. Állatok TÁMOP /1/A Engedély állatokkal végzett kísérletekhez UK: Home Office Licence 1986 EC 1394/2007

43 Szabályozási kérdések III. Humán embrionális őssejtek TÁMOP /1/A A humán embriók őssejt-forrásként való felhasználása körüli etikai viták (etikai kérdések)

44 Regeneratív medicina Szervek regenerációja saját regeneratív biokémiai és celluláris folyamataik révén Szervregeneráció in vitro létrehozott egész szervek vagy egy szerv specifikus szöveteinek hozzáadásával

45 Szervelégtelenség Betegség, baleset vagy öregedés miatt fellépő szervműködési elégtelenség esetén a teljes szerv pótlására vagy regenerációjára van szükség Ideális esetben a beteg számára a saját (autológ) szövetei szolgálnak bioalapanyagként e szervek létrehozásához