Ovuláció diagnosztika szukában. 1. A szuka szaporodás endokrinológiája. A menü. Ivarérés (Pubertás) Endokrin különbség

Átírás

1 A menü Ovuláció diagnosztika szukában DR. Szász Ferenc PhD. Dipl ECAR ANI-REP Állatorvosi Rendelő Budapest VET-MED-LABOR Webinar előadások 15 A szuka szaporodás endokrinológiája röviden Vaginoszkópia és a hüvelycitológia diagnosztikai jelentősége Kiegészítő vizsgálatok: progeszteron quantitatív és semi-quantitatív (P) tesztek és LH teszt Klinikai alkalmazás lehetőségei Ivarérés (Pubertás) 1. A szuka szaporodás endokrinológiája Reproduktív képesség kialakulásának folyamata Kezdete: hypothalamikus neuronok képesek elegendő GnRH-t termelni a gametogenezis beinditásához. (GnRH neuronok fejlődését meghatározza: testméret,-tömeg küszöbérték, környezeti hatás, genetikai háttér) Nőstény reprodukciós ciklikusság hím folyamatos nemi aktivitás Nő(stény) vagy Hím? Defeminizáció Alfa-foetoprot. GnRH surge E centrum Hypothalamus Oestradiol (E) ovarium GnRH tonic centrum Alfa-foetoprotein GnRH surge centre Hypothalamus T E GnRH tonic centrum T testis Testosteron (T) Endokrin különbség Hímben nincs LH csúcs, (GnRH surge center hiány!) - órás állandó apró hullámok (GnRH tonic centrum) (GnRH LH T állandó pulzáló ritmus) Nőstény: GnRH LH és oestradiol csúcsok kb. naponta (fajtól függ!!) 1

2 Reprodukciós hormonok 1. Amino-sav eredetűek; dopamine, catecholamin, thyroid hormonok. Kis molekulájú neuropeptidek; GnRH, TRH, somatostatin, vasopression 3. Nagy molekulájú fehérjék; LH, FSH, insulin, parathyroid hormon. Szteroid hormonok; oestrogen, progesterone, testosterone, cortisol 5. Vitamin derivátumok; retinoidok Hormonok funkciói -GnRH: gonadotrop hormon leadás serkentése -FSH: folliculogenezis (emelkedő frequencia -3 héttel előtte) -LH: ovuláció (indukció) -Ösztrogén: nemi szervek ivarzási tünetei, tűrési reflex (P-együtt), LH csúcs indukció, (ellés) -Progeszteron (CL): preovulációs P, méh előkészítése a vemhességre (proliferativ secretios, myometrium immotilitás, leukocyta migráció gátlása), cervix zárás, vemhesség fenntartása, emlőtelep fejlődése End krin szabályozás A szuka szaporodásbiológiája Hypothalamus GnRH + Hypophysis Elülső lebeny P - FSH+LH + E F F ovariumok CL CL E PGf Méh+endometrium P Cervix Vagina Mono-oestrusos faj, mérsékelt szezonalitás Ivarérés 7-1 hónap -1 (1) havonta ivari ciklusok Tüzelés 1-1 nap (9 nap prooe, 9 nap oe) Preovulációs P Spontán leváló petesejt(ovuláció)! Vemhes- nem vemhes szinte nincs hormonális különbség Oestrus Anoestrus Metoestrus Metoestrus Anoestrus Oestrus Tüzelés eleje (proestrus) FSH szint LH fokozott pulzáció Folliculogenezis E Oestrus tünetek: E + P poz. Feedback HT+HP FSH+LH P. Concannon nyomán Véres ivarzási nyák Tüszőérés hatás(péra, hüvely, méh) Vaginal cytológia (3- % cornificatio) Türési reflex indul az LH csúcs körüli időben (átlag: 1 nap post LH) (3 nap pre-lh vagy 5 nap post-lh) P. Concannon nyomán

3 Proestrus Oestrus eleje LH csúcs a nap Ösztrogén szint csúcson, majd csökken napon LHcsúcs (h át) LH-teszt P-szint emelkedés, mérés P~ ng/ml ng/ml Hormonszintek alakulása prooestrus és oestrus idején OVULÁCIÓ P LH Ovuláció Fertilizációs periódus napon P~5ng/ml Ovuláció: LH csúcs után (3- h) Éretlen, primer petesejtek válnak le Érés 3- óra ng/ml Hormonszintek alakulása prooestrus és oestrus idején OVULÁCIÓ P LH Érett petesejtek vannak napos tüzelés P: 7-ng/ml (1ng/ml) Post LH:.-7. nap csúcs fertilitás) (post ov. Élettart. 7-9 nap) Gyors fertilitás csökkenés (cervixzár, ova degeneráció) Spermium élettartam -7 nap Uterinális mirigyekben tárolódnak (reservoar) Alomszám spermium szám (5-5M) ng/ml Hormonszintek alakulása prooestrus és oestrus idején OVULÁCIÓ P LH Megtermékenyülésbarázdálódás Zigóta barázdálódása petevezetőben 3- sejtes blastocysták a méhbe érkeznek (~1. nap az LH csúcs után) P~-5ng/ml Cervix záródik (spermium nem juthat be) Metoestrus Cytológiai oestrus vége Kevés sejt (parabasalis, basalis, nyálkáskenet, fvs) Vemhes-nem vemhes: nincs jelentős endokrin különbség Vemhesség: CL dependens P-szint magas ( ng/ml) P átmeneti csökken (5nap) Prolactin emelkedik Vemhesség: Relaxin naptól 3

4 Metoestrus Két szakasz (szövettani): progresszív (LHcsúcs- nap)és regresszív (P.- 7nap) Teljes hossza:9nap!! Endometrium desquamatio kezdődik 9. napon és 1 napig tart. Teljes endometrium regeneráció 15nap!!! ( rövid- interoestrus periodus infertilitás). Ovuláció diagnosztika Miért ajánlott a ciklus diagnosztika? Ovuláció diagnosztika Meddőségi ok lehet a rossz időpont (75%) A fogamzó képes periódus eltérhet - Egyedenként - Fajtánként - Egyednél is a ciklusok között - Hormonális változásra (pajzsmirigy, fogamzásgátlás) - AI: Hűtött-mélyhűtött spermával - Vemhesség-ellés ideje kiszámítható - Elektív császármetszés - Ellés indukció - ( Hypoluteoid vemhesség) Az első vizsgálat időpontját a kórelőzmény adja meg. 1. -kórelőzmény. -viselkedés megfigyelése 3. -hüvelykenet vizsgálata (cytológia). -hüvelytükrözés (vaginoszkopia) 5. -hormonszint mérés (progesteron, LH) (hüvelyellenállás mérés) Sorozatvizsgálat!!! -3 naponta ismételni! A tünetek, adatok szintézise vezet a diagnózishoz! Első vizit a tüzelés -5.napján! Kórelőzmény Viselkedési változások? Napja tüzel (hol fedeztet?) Utolsó tüzelés ideje, hossza, fedeztetés? Korábbi diagnosztika? Fedeztetés? AI? Vemhesség? Álvemhesség? UH a vemhesség alatt? Magzatfelszívódás vetélés? Ellési problémák? Gyakori, kevés vizeletürítés Kanok keresése (szökős) Farok, péra mozgatása Hüvelyvizsgálat tűrése (oestrus kezdete) Pozitív tűrés Kanok elutasítása (oestrus vége) (Ösztrogén, és P hatások)

5 Vaginoszkópia Vaginoscopia: proestrus Hüvelytükörrel (endoszkóp) a szuka hüvelynyálkahártya jellemzőinek vizsgálata 1. Tapadósság. Váladékkal fedettség(váladék minősége) 3. Redőzöttség Csúszós, könnyű bevezetni a tükröt Duzzadt, csillogó, ödémás nyálkahártya Sima, (nincs ránc) véres váladékkal fedett Jelentős mennyiségű véres ivarzási váladék (Ha nem engedi: nagyon korai stádium) (VIDEO) Proestrus Vaginoscopia: oestrus Engedi a tükrözést Tapadós, száraz, fénytelen nyálkahártya Kevés vizezett véres (vagy színtelen) ivarzási váladék Haránt irányú ráncok a nyh.-án. (video) Oestrus Vaginoscopia: metoestrus-anoestrus Ellenkezik a tükrözésnél Csúszós hüvely Hosszanti, jellegtelen redők Nem duzzadt, fénytelen, kevés víztiszta nyák (Video) 5

6 Metoestrus-anoestrus KÉP Hüvelycitológia Vizsgálni (3-x nagyítás): Sejtek száma Sejttípusok aránya Elrendeződésük Kornifikáció foka (3-%) Nyálkával való fedettség Natív, Harris-Shorr-, Diff-Quick-festés Hüvelycitológia A nyálkahártya felületéről leváló sejtek összetételének vizsgálata (ösztrogén hatás proliferátio) Sejttípusok: Basalis,(ritka) Parabasalis sejtek (proe, metoe) Intermedialis sejtek Részlegesen elszarusodott sejtek Teljesen elszarusodott Vörösvértestek (fehérvérsejtek) (baktériumok) Cytológiai proestrus Gyakran nyálkás-véres, vizes fényű kenet(makroszkópos) Kevés sejt, zömében parabasalis és intermediális sejtek, sok vvt, néhány részlegesen kornifikálódott sejt. Kornifikáció 3-5% Cytológiai oestrus Tapadós, grízes felületű kenet (makroszkópos) Sok sejt, gyakran csoportokban, rögökben, -9%-ban teljesen kornifikált sejtek, felpöndörödve, halpikkelyszerűen Száraz, nyálka nélküli kenet, vvt. kevés v. nincs

7 Metoestrus (cytologiai oestrus vége) Sejtszegény kenet, parabasalis és intermedialis sejtek arányának újbóli növekedése Kornifikálódott sejtek eltűnnek Metoestrális nyák a sejtcsoportok között Fehérvérsejtek előfordulása Metoestrus Natív-kenetek KÉP Harris-Shorr-festés menete Fixálás Fixálóspray (Merck) 7% alk. x be 5% alk. x be Desztvíz x be 1. Festés Harris-f hematoxilin min. Desztvíz x be Ammónia-alkohol (97 rész 7%alk+3 rész 5%ammonia oldat)1 perc Desztvíz 1x 7% alk. 1x 95% alk. 1x. Festés Shorr-festék oldat min. 95% alk. 1x be Abszolút alk (%) 1x be Xilol néhány perc Harris-Shorr-festés értékelése Differenciáló festés! Basofil-kék: nem kornifikálódott sejtek Acidofil-basofil (barna-kék) szegéllyel: részlegesen kornif. Acidofil (barna): teljesen kornifikálódott sejt 7

8 Harris-Shorr-féle festés Diff-Quick-festés Láng alatti kenet fixálás Diff-quick fixáló oldat (5sec.) Diff.quick eosinofil componens (5sec) Diff-quick basofil componens (3-5sec) Dest víz öblítés Kenet szárítása levegőn Diff-quick festés Hormonszintek alakulása prooestrus és oestrus idején ng/ml 1 P LH OVULÁCIÓ Hormon vizsgálatok Quantitatív és semi-quantitatív progeszteron (P) tesztek és LH teszt Hormonszintek alakulása prooestrus és oestrus idején ng/ml Kiegészítő hormonvizsgálatok Vérszérum Pszintjének vizsgálata (BVT-teszt VIRBAC, Quanticheck SZIEÁOTK) LH-szint vizsgálata szérumból (Witness LH-teszt, PFIZER) P LH OVULÁCIÓ

9 Quanticheck P teszt (SZIE-ÁOTK) Kompetitív ELISA-teszt Mindig felrakunk standard P-oldatot is (, 1,, 5,, és ng/ml) ul/ minta sorban P-antibody-val jelölt ELISA mikroplate Standard P-ek és minta P-ek versengése az ismert, jelölt P- vel (komplement) az inkubáció alatt ( ) szobahőn. Nem kötődött P lemosása Torma-peroxidáz enzim reakciója (komplement hasítása) kék szín ( ) Fordított arányosság a minta P-szintje és a kék szín intenzítása között (Leolvasás javasolt ha szemmel bíráljuk) Kénsavval leállítás ELISA reader-rel (fotométer) vizsgált 5nM-en. Extinkciokból (OD) PC- kalibrálja a P-szintet ng/ml-ben. Quanticheck értékelése (korr:,99) Progeszteron OD kutya, 3,5 3,,5, 1,5 1, ts rs,5 ms, rt t 5 15 Quantichek: előnyök-hátrányok BVT- teszt (VIRBAC) Előnyök Pontos adat (- ng/ml) Mindig aktuális standard sorhoz hasonlít Két párhuzamos sor átlagát számítjuk Gazdaságos (ha -3 minta/ teszt)huf - ng/ml között is használható (kórképek, gravid) Semiquantitativ tesztnek is jó Kevés mennyiségű vér is elég (1ml xul) Hátrányok Komolyabb beruházás (ELISA-reader, autom. Pipetta, hegy, softwear) Labortechnikai háttér és gyakorlat (pipettázás) Munka és időigényes Hőmérsékletre érzékeny Kevés mintánál nem gazdaságos Semiquantitatív teszt Vérplazmából és szérumból is lehet Szendvics-ELISA teszt Szobahőn, inkubációs idő kb. 15 Kék szín intenzítás elbírálása mellékelt színskála alapján (-1.5, ,.5-, <) 9

10 BVT-teszt:előnyök-hátrányok Előnyök Egyszerű és gyors teszt Kevés mintánál jól használható Nem igényel műszeres beruházást Átlagos praxis számára kielégítő LH-teszthez jól kombinálható (alacsony tartományban pontos) Hátrányok Az ovuláció időpontja nem prognosztizálható pontosan (.5-ng/ml!) Napi több minta esetén nem gazdaságos (75/teszt/minta) Magas P szintnél nem pontos (AI, gravidhypoluteoid, Meddőség, abnormális ciklusoknál nem elég pontos Nagyobb mennyiségű minta kell (3-ml vér) Witness LH-teszt (PFIZER) LH szint általában alacsony (1 ng/ml alatt) LH csúcs (7-5ng/ml) csak h át ovuláció nap múlva Fertilis periódus -7nap Ovuláció diagnosztikával együtt Szérumból (friss, a fagyasztott kétes) P: -.9ng/ml amikor várható Napi 1- minta 3 napon át Pozitiv és kétes vagy negatív WITNESS LH Eredmény értékelése Witness LH: semi-quantitative és tesztvonal színét kell hasonlítani a kontrollhoz NEGATIV ( LH < 1 ng/ml) POSITIV (LH 1 ng/ml) WITNESS LH Interpretation WITNESS LH használata ovuláció diagnosztikára ( túl a -5 proestrus napon vagy több mint 5% cornificatio kenet) Különösen jól használható, ha fogamzási zavar áll fenn Alapszint feletti LH LH és P teszt az első napon Ha LH teszt pozitív (i.e. LH 1 ng/ml) + - LH szint = alapszint + LH-teszt: előnyök és hátrányok Előnyök Kulcsfontosságú info Nagyon pontos ovulációdiagnosztika Egyszerű, gyors teszt Könnyű értékelés Meddőségi, mélyhűtőtt AI-nál extra jó lehet Hátrányok Gyakori mintavétel kell nem gyakorlatias Ovuláció diagnosztika is kell (P, cytológia) Sok mérés-drága Ovuláció diagnosztika haladóknak LH positív =LH surge (D) előkészíteni a fedeztetést kontroll P 7h múlva Folytatni az LH & P tesztet a positiv LH-ig

11 Mintavételi hibák és rossz módszerek Kenetvétel, : tűfogó+vatta, dorsalis hüvelyfal Kenetkészítés: hengergetése a tamponnak Ugyanolyan napszakban vegyünk vért Haemolízist kerüljük Éhgyomor,ha lehet (lipaémia nem jó) Egy ciklus-egy labor Csak vér-nem ér diagnózist Nem jó az üvegcső v. zselés alvadássegítő PP cső /fecsi, eppendorf, golyócskás alvadásserkentő cső Centrifugálj ha később vizsgálsz!! Hőhatás fontos (ELISA P eredmények nem korrelálnak a ciklussal!?) Klinikai alkalmazás lehetőségei Fedeztetés időpontjának meghatározása Tüzelés 1-1 nap (9 nap pro-oe, 9 nap oe) napon LH-csúcs (h át) P~ ng/ml napon Ovuláció: LH csúcs után (3-h) P~5ng/ml Éretlen, primer petesejtek válnak le 1-1. naposan: érett petesejtek (post ov. Élettart. 7-9 nap) P: 7-ng/ml (1ng/ml) 1 1 Spermium élettartam -7 nap 1 Hormonszintek alakulása prooestrus és oestrus idején Fedeztetés/AI optimális időpontja (P-szintek) P érték AI időpontja (>1 ng/ml(7. nap) azonnal (korán ovuláló) <5 ng/ml további minták 5- ng/ml nap belül -1 ng/ml másnap >1 ng/ml azonnal ng/ml 1 P LH Termékenyítésre optimális időszak jellemzői Fertilitás csökkenés Tüzelés napjai Friss/ hűtött sperma (vagin) 11-1 nap Mélyhűtött sperma (uterinalis) 1-17 nap Fogamzás csökken: Ha vaginai/fedeztetés: Pre-LH -3 nap vagy Post-LH -9-.nap Hüvelytükrözés oestrus oestrus-oestrus vége Intrauterin AI!! Hüvelykenet vizsgálata Progeszteron-szint (ng/ml) Ultrahang vizsgálat oestrus elejeoestrus (cornif. 75-9%),5-9,-(1) Tüszők eltűnése után -5 nap Oestrus (cornif. 95%) 1-ng/ml Tüszők után - nap Spermium élettartam -7 nap Uterinális mirigyekben tárolódnak (reservoar) Alomszám spermium szám (5-5M) 11

12 Fertilizációs periódus határai Diagnosztikai hibák ng/ml Hormonszintek alakulása prooestrus és oestrus idején P LH OVULÁCIÓ Spermium élettartam Petesejt élettartam,cervix Csak vérvizsgálatot kérni! 9- nap körül az első vizsgálat Egy vizsgálat - nem vizsgálat Cikluson belül minden alkalommal más klinika/labor Mértékegység: ng/ml (nmol/ml=3.xng/ml) Legjobb minősítés a vemhesülés! Klinikai alkalmazás lehetőségei II. Abnormális ciklusok, meddőségi vizsgálatok Abnormális ciklusok, meddőségi vizsgálatok Pro-oestrus (BVT, LH) 1. Infertilitás: split / elhúzódó ciklusok 1.- Genitáliák vizsg. (vaginoszkópia, citológia) - intenzív véres váladék, vvt sok, gyenge kornifikáció, nincs ciklusdinamika.- P-szint (LH is) -ciklusbeli aszinkron (P~kenet) - késői ovulációs típus, anovulációs ciklus (ovulált:p>,5ng/ml) Abnormális ciklusok, meddőségi vizsgálatok, Oestrus (BVT,LH) Korai és késői ovulációs típus Különböző ovulációs típusú szukák progeszteron-szintjének alakulása a tüzelés alatt P (ng/ml) P/korai P/standard P/késői 1

13 Abnormális ciklusok, meddőségi vizsgálatok, Anoestrus (BVT) Hosszú interoestrus periódus vagy split tüzelések Vizsgálatok 1.-Genitáliák vizsg. (vaginoszkópia, citológia)?.-p: magas P-szint (> ng/ml) ovarium (lutein) cysták, neoplasma (granulosa thecasejt) luteolizis/ sebészi, hyperthyreosis? - P< ng/ml T vizsg. (TRH stimuláció) (+) Hypothyreoid (-)? Ivarzás indukció Meddőségi vizsgálatok Metoestrus (BVT) Hypoluteoidismus Alacsony vemhességi P szint, (reszorpció, abortusz) Ok: primer ovarialis probléma (CL-insuff.) Német juhász, rottweiler, Újfunlandi, berni pásztor Minimum P nem ismert (abortusz P<ng/ml h) Progeszteron adagolás,(mg/ttkg) ha P<ng/ml Abnormális ciklusok, meddőségi vizsgálatok Metoestrus 1. Vemhesség. hetétől gyakran alacsony P-szint véres hüvelyváladék abortusz (Ovarid tbl). Infertilis szukáknál: P mérés metoestrus. napján ( P<ng/ml, resorpció veszély) P adagolás, (Utrogestan tbl, Provera vagy Ovarid tbl.) UH vemhesség vizsgálat 1. napon 55. napig a fedeztetéstől folytatni a P kiegészítést Hypoluteoidismus (resorptio fetus) P: 7,7ng/ml gr:5 nap P:,31ng/ml gr:3 nap Klinikai alkalmazás lehetőségei III. Diagnosztika, indukciók Ivaros státusz vizsgálata nőstényben (LH-teszt) Hypothalamus GnRH Hypohysis FSH & LH Progesteron Növekvő LH koncentráció a vérben Ovaries Progesteron 13

14 Ellés indukció (BVT,LH,ALIZIN) Ellés indukció Indikációk: Elhúzódó vemhesség (>5nap) Fájásgyengeség kockázata (év<primipara) Óriás fajták single puppy syndrome Önmagában az aglepristone nem alkalmas, uterotonikum is kell! (PGF v. Oxytocin, % v. %) Ovuláció utáni 5-. nap (ovuláció diagnosztika kell!) Aglepristone 15mg/ttkg (egy kezelés SC.), majd óra múlva oxytocin inj. (,15IU/ttkg kétóránként) Magzatszám ismerete (Rtg vizsgálat!) Progeszteron-szint mérés (BVT), P ng/ml nem érdemes elkezdeni (spontán ellés indul) Kórházi körülmények, az indukció előtt pár nappal hospitalizálni a beteget (no stress) Közép és nagytestű egyedeknél ellés óra múlva, kistestű fajtáknál órán belül 1