Balogh Zoltán TOXI-COOP Zrt 2013.

Átírás

1 Balogh Zoltán TOXI-COOP Zrt 2013.

2 A nagy eleink Dr. Cholnoky Eszter Dr. Kállai László

3 Dr. Cholnoky Eszter

4 Dr. Kállai László

5 Prof.Dr.Anderlik Piroska, Dr.Kállai László

6 Laboratóriumi állatok történelme röviden Kr.e évvel Rattus norvegicus vagy Oryzomys spp. (O. paluistris) Sigmodon spp. (S. hispidus) Kr.u. XVIII. sz. : Háziállatok kutya, ló, baromfik XIX. sz. : Egér, patkány fajták, törzsek Thalidomid-botrány: nyúl, beagle Dr. Kállai László -Gödöllő LATI Napjaink: gyorstesztek, kb egér, több ezer patkány fajta

7

8

9

10 1968-tól LATI folyamatosan növeli kapacitását Veszprém NEVIKI már több száz beagle-t használ évente LATI meghaladta az évi 1 millió állat előállítását Rendszerváltás állat felhasználás/év A felhasználás visszaáll az szintre Soha nem lesz 1 millió db/év, de mindig lesz állatfelhasználás

11

12 A Laboratóriumi állatok tenyésztése

13

14 Beszélünk: állat tartásról: etetünk, itatunk, gondozunk szaporításról: sokszorosítjuk az állományt tenyésztésről: genetikai alapot használjuk

15 A laborállatok genetikája Fenotípus - külső, megjelenési forma Genotípus + környezeti hatás= Fenotípus változása a modifikáció 1. rendszertelenül ható : magaslati vvt szám növekedés 2. rendszeresen ismétlődő: a szőrzet évszakonként szín és tömöttség változása, 3. maradandó változás: fiatalkori alultápláltság, öregedés Genotípus gén készlet határozza meg, belső tulajdonságokat meghatározó tényező

16 A genotípus az állandóságra, az ismétlődésre törekszik az öröklődési szabályok szerint A változás történhet: Spontán Tenyésztés során Biotechnológiai módszerekkel

17 Genetikai alapfogalmak, emlékeztető Ivar jelölése : hím - Mars pajzsa és dárdája nőstény - Vénusz tükre Mitózis: testi sejtosztódás fázisok: pro-,meta-,ana-, telofázis Meiozis: ivarsejtek keletkezése, fél kromoszóma garnitúra. A profázis további öt fázisra bontható. Gén: L. Johansen ( ) 1906-ban nevezi el (egy tulajdonság DNS szakasz) Lókusz: A gén effektív helye a kromoszómán. Allél:Ugyan azon a lókuszon helyeződő gének csoportja. egy jellemzőért felelős gén különböző változatai(génváltozatok) Alél pár: anyai és apai allélok Fixáció: populáció összes egyede egy jellemzőre ugyanazon allélt hordoz

18 (TTAGGG x 50 = telomer) (transpozonok=ugrálógének) stb. Sejttől a tripletekig

19 Egy gén intronjai és exonjai (intron:fehérjét nem határoz meg, exon: kivágódik még a magban: m RNS)

20

21

22 Jean-Baptiste Lamarck biológus Született: augusztus 1. Párizs Meghalt : december 18. Párizs Charles Robert Darwin Született: február 12. Anglia Meghalt: április 19. Conrad Hal Weddington Született: 1905 Anglia Meghalt: *Arthur Wallace: Genetikai asszimiláció úgy néz ki de nem lamarckki

23

24 Korai anafázis: A centroszómák a pólusokhoz rendeződtek. A világoskék kromoszómák szétváltak.

25 Prometafázis Metafázis Korai anafázis Telofázis

26 Evolúció Mikro evolúció Makro evolúció: drift (sodródás) flow (migráció) mutáció szelekció

27 Meiozis főbb szakaszai

28 Thomas Hunt Morgan Born: 25 September 1866, Lexington, KY, USA Died: 4 December 1945, Pasadena, CA, USA 1910.A gének meghatározott helyen vannak a kromoszómákon Columbia Drosophila melanogaszter Nobel-díj

29 Wilhelm Ludvig Johannsen Born 3 February 1857 ( ) Elsinore, Denmark Died 11 November 1927 ( ) (aged 70) Copenhagen, Denmark Nationality Danish

30

31

32 Homológ kromoszóma: Azon kromoszómák, amik azonos lókuszon, azonos génpárokat tartalmaznak Mutáció: Genetikai változás - gén - kedvező - kedvezőtlen - közömbös - kromoszóma: Down-kór, Crossing ower - genom: poliploidia Homozigóta: minden allélpár azonos információt Heterozigóta: eltérő információt tartalmaz

33 Öröklés menetek Johann Gregor Mendel : Ágoston rendi szerzetes. Szudétanémet. Csak a képességek örökléséről beszélhetünk: A tulajdonságok kialakulásához a környezeti hatás is szükséges. (genotípus + környezeti hatás = Fenotípus)

34 Gregor Johann Mendel (born 22nd July 1822, died 6th January 1884)

35 Mendeli alaptörvények 1. Uniformitás az F1 nemzedék egyforma 2. Gaméták tisztasága egy allélpár csupán egyik tagja lehet jelen egy gamétában 3. Hasadás az öröklődési tényezők párosával öröklődnek, de szétválnak a gamétákban 4. Tulajdonságok független öröklődése a szétvált tulajdonságok az utódokban szabadon újrakombinálódnak

36

37 Mendeli törvények kiegészítése, finomítása Domináns Intermedier Reciprok keresztezés mitokondriális öröklés Különleges vagy kriptointermedier ua. mint a domináns, de jel utal a keresztezésre Feltételes dominancia intermedier, de pl. hőmérséklet függő Mozaik megjelenés Változó dominancia Poliméria poligén tulajdonságok Pleiotropia egy gén több irányban hat Episztázis hiposztázis hatás egyik gén egyáltalán nem enged érvényre jutni, tiltó gének

38 A tenyésztés alapjai Ismerni szükséges - A populáció és az egyedek genetikai hátterét - A célt amit el kívánunk érni - A tulajdonságok átöröklődő képességét : h² - A módszereket - Az összefüggéseket

39 Átörökítő képesség= h² Öröklődhetőségi együttható = h² érték. hereditabilitas A populáció egy tulajdonságának egyik generációról a másikra átörökítésének valószínűsége genetikai variancia h² = fenotipusos variancia lehet 0 1 vagy %

40 Néhány tulajdonság átöröklődési képessége Rosszul öröklődő: 0-0,3 Közepesen öröklődő: 0,3-0,6 Jól öröklődő: 0,6-1 Ember testmagassága 0,65 Egér farok hossz 0,40 Egér alom nagyság 0,20 Drosophila hasi szőr száma 0,50 Seregély fészekalj méret 0,20

41 A szelekció a tenyésztés alapja Szelekció = kiválogatás 1. Természetes 2. Mesterséges Továbbtenyésztési hányad = csak azok a tenyészállatok, amik részt vesznek a következő generáció létrehozásában. Meghatározza: A tulajdonság h² értéke A populáció fenotipusos varianciája (mennyire változatos)

42 Szelekciós nyomás: célirányos és folyamatos tevékenység Fenotipusos ~ Genotípusos ~ Direkt ~ Indirekt ~ Tandem ~ Kontra ~ stb. Minél több szempont szerint szelektálunk: fordítottan arányos az előrehaladás

43 Rendszerint hatnak a tulajdonságok egymásra: Genetikai korrelációk Fenotipikus korrelációk Pl. genetikai: poliméria, pleiotropia, episztázis,- hiposztázis hatások fenotipusos: testtömeg - szaporaság

44 Hardy Weinberg szabály Két allél előfordulási gyakorisága egy populációban panmixia esetén - egyensúlyban van. p 2 + pq + q 2 = 1 Ideális populáció: Végtelenül nagy Nincsen mutáció Nincsen szelekció Nincsen migráció Panmixia (azonos eséllyel végtelen számú egyed)

45

46

47 Punett- tábla a géngyakoriság számításához Apa frekvencia frekvencia pa qa gén A a Anya pa A AA Aa p 2 A paqa qa a Aa aa paqa q 2 a

48 A háromféle genotípus frekvenciája tehát: Genotípus: AA Aa aa Génfrekvencia: p 2 A 2pAqa q 2 a

49 Genetikai sodródás= drift Egy zárt populációban a heterozigóta genotípus csökken a homozigóta allélok gyakorisága pedig nő. Pl.: egyensúly esetén 25% AA, 50% Aa és 25% aa a gyakoriság míg a rokonpárosodás hatására az AA és az aa genotípus akár % is lehet.

50 Egy genetikai egyensúlyban lévő egyedszámú rókapopuláció öröklődő szőrszínét egy A domináns allél alakítja ki. Hiányában az a allél fehér színt kialakító recesszív jellege érvényesül. A populáció egyedei közül a normális vörös színt mutatja (vad fenotípus), míg 9 róka albínó. Határozzuk meg a fenotípus arány ismeretében az allélok gyakoriságát, valamint a homozigóták és a heterozigóták arányát! q 2 aa = 9/10 000= 0,0009 ; q = 0,0009 q= 0,03 azaz a recesszív allélok relatív gyakorisága 3 % gyakorisága 97 % p+q=1» p=1-0,03 = 0,97 azaz a domináns allélok relatív a homozigóta domináns egyedek relatív gyakorisága: p²aa = 0,97²= 0,9409 a homozigóta recesszív egyedek relatív gyakorisága: 2pq Aa = 2 0,97 0,03 = 0,0582

51 F-érték, beltenyésztési hányados Wright-féle képlet (1921.) Apai vagy anyai gaméták homozigozitását fejezi ki. F x = 0,5 n+n +1 x (1 + F a ) F x =beltenyésztési együttható n és n = anya és apa közös ősök közötti generációk száma F a a közös ősök beltenyésztési együtthatója = összeg jel, a többszöri rokonság kiszámításakor

52 Egyszerűsített képlet F = 1/(8m) + 1/(8f) m = hím egyedek száma (nem rokon) f = nőivarú egyedek száma (nem rokon)

53 A beltenyésztési hányados alakulása eltérő tenyésztési eljárások esetén

54 Kis laboratóriumi emlősök felosztása genetikai alapjuk, előállításuk szerint (egér, patkány, hörcsög, tengerimalac) A felhasznált állatok genetikailag és a környezetükben csak a vizsgálat céljául kijelölt beavatkozás tekintetében van eltérés (Issekutz ). Ceteris paribus = egyébként egyformák Legyen a kísérlet, vizsgálat ismételhető, tehát olyan, amit nem érdemes megismételni (Kállai )

55 Erzsébetvárosi Issekutz Béla (Kőhalom, január 31. Budapest, július 31.) Kossuth-díjas farmakológus, gyógyszervegyész, tudománytörténész, az orvostudomány doktora (1952). A korszerű magyarországi kísérletes farmakológia úttörő egyénisége, a gyógyszervegyészeti kutatások iskolateremtő alakja től a Magyar Tudományos Akadémia levelező, 1945-től rendes tagja volt.

56 A beltenyésztett törzs (Inbred strain) A nevezés szigorúan kötött: beltenyésztett törzs = strain nem beltenyésztett állomány fajta populáció = stock

57 Beltenyésztés - rokontenyésztés 1) Beltenyésztés zárt populáción belüli párosítás Az angol inbreeding szó a laborállat tudomány terminus technikusává vált pedig a helyesebb szó a 2) Rokontenyésztés egymással rokon egyedeket párosítunk igen szoros : 4-6 generáción belül azonos ősök többször szerepelnek. Vagy : édestestvérek, szülőutódok szoros : nagybácsi-unokahúg, unokatestvérek mérsékelt: távoli, 5.,6. rendű rokon párosodik

58 Inbred törzs a laborállatoknál Legalább 20 generáción keresztül édestestvér vagy szülő ivadék párosításával létrehozott törzs Egy vonalas tenyésztési rendszerben Törzskönyvezve Monitorozva Szelektálva

59 Tulajdonságai, jellemzői Az F-érték (beltenyésztési együttható) min.98,4 % A populáció izogén A populáció homozigóta Mutációra hajlamos Környezetre változékonyabb

60

61 Inbred törzs nevezéktana 1 4 betűből álló szimbólum: T, CBA, Balb Törzs neve után egy / jel: CBA/Ca, Balb/c A törtvonal után a tenyésztő intézet nevének rövid jele C3H/He, C57Bl/6J, amit megelőz a törzs alvonalának száma DBA/2, DBA/1, CBA/CaOlaHsd (Ca = Carter, Institute of Animal Genetics, Edinburgh; Ola=Olac, Office of Laboratory Animals; Hsd= Harlan) Rövidített név: jellemző betűk a névből Ha dajkaságban nevelkedett: a fostered=dajkált jelét f használjuk. C57BL/6J f C3H/He

62 F₁ hibridek Két inbred törzs keresztezése 1. Minden egyede izogén 2. Sok gén tekintetében homozigóta 3. Heterozigóta minden olyan lókuszon, ahol a szülők eltérő géneket hordoztak Az F₁ hibrid egyedeket tovább párosítani tilos! (Mendel 3, 4. törvénye)

63 F₁ hibridek elnevezése Szigorúan kötött Előre írjuk a törzs rövid nevét Utána közvetlenül a törzs rövid nevét Pl.: Balb/c (=C) X CBA hibrid utód neve = CCBA F1 C57BL/6 (B6) X DBA/2 (D2) hibrid utód neve = B6D2 F1

64 Csak inbred törzseket használunk F₁ hibrid előállításra Hibrid vigor kihasználása Heterozigóta, de izogén a populáció A hibrid mindkét létrehozójának szövetét befogadja Outbred fajtával tilos de DBA/ 2 keresztezése outbred fajtával : színgének alapján genetikai vizsgálat

65 Inbred törzs kódja Korrekt rövidítés AKR Balb/c C3H C57BL C57BL/6 C57BL/10 C57BR DBA/1 DBA/2 R III T Stock AK C C3 B B6 B10 BR D1 D2 R3 T Egyes beltenyésztett törzs szimbólumának rövidítése (Kállai nyomán)

66 Koizogén kongén törzsek 1. Koizogén: ha az izogén alvonal csak egyetlen allél egyetlen gén tekintetében tér el. 2. Kongén: ha az izogén alvonal egyetlen allél egyetlen gén eltérése nem mutáció, hanem tenyésztés során bejuttatott gén Nevezéktana: a törzs neve (pl. Balb/c) kötőjel és kisbetűvel a bevitt gén neve (Balb/c-nu =szőrtelen) 3. Transgén:biotechnológiai eljárással DNS szakaszok genomba juttatása

67

68 Outbred stock Genetically undifined Nevezik: Nem beltenyésztett Kültenyésztett Fajta, populáció Szakszerűbb: Anizogén Heterozigóta (bár sokszor sok allélon homozigóta!)

69 Több allél tekintetében heterozigóta Hardy-Weinberg egyensúly minél nagyobb mértékben fennmaradjon Genetikai drift minél kisebb. A beltenyésztési koefficiens növekedés maximum 0,01 vagy 1 % generációnként

70 Leggyakrabban alkalmazott tenyésztési módszerek 1. Random (találomra) tenyésztés nem szabatos rendszer a panmixia csak elméleti - az utódok eredete nem követhető 2. Rotációs rendszer egyedi jelölés, szisztematikus, folytonos, törzskönyvezés. Egy-egy állat elhullása nagy probléma lehet. 3. Csoportos rotációs rendszer több állat egy csoportban. Úgy járunk el mint a rotációs rendszernél

71 Samuel Poiley (1960) Rotációs tenyésztési rendszer Female (Dam) (Anya) Male (Sire) (Apja) Offspring Utódok

72 Falconer Robertson féle Maximum Avoidance of Inbreeding (MAI) azaz a beltenyésztés maximális elkerülésének rendszere Hím x nőstény Nőstény x hím 1 x 2 = 1 2 x 1 = 5 3 x 4 = 2 4 x 3 = 6 5 x 6 = 3 6 x 5 = 7 7 x 8 = 4 8 x 7 = 8 A csoportok száma 2 vagy annak hatványa

73

74 Zárt tenyészet closed breeding Az induló állomány nem bővül új egyeddel - Beltenyésztés folyik de törekszünk az F-érték minimalizálására (beltenyésztési koefficiens):max Wright - képlettel számoljuk az F-étéket - Figyelemmel kísérjük a drift-et - 4. generáció után új névvel is elláthatjuk a fajtát(iclas regisztáció)

75 Nyitott tenyésztési rendszer - opened breeding Rendszeresen új egyedekkel bővítjük a populációt A genetikai ellenőrzés (F-érték, drift) szükséges. Célja : eredeti állományhoz történő minél nagyobb mértékű megfelelés.

76 Outbred állomány elnevezése A fajta neve 2 4 nagy betű (6 is lehet): CD, NMRI, WISTAR Megelőzi a tenyésztő nevének rövid jele: Hsd=Harlan He=Heston, Orl=Orleans, stb. A fajta nevét követheti a higiénés státuszra : BR, A fajta nevét a tenyésztő nevétől mindig kettőspont(:) választja el. Hsd Brl Han: WIST, Crl:WI BR stb.

77 Laboratóriumi állatok tartása - Állatház

78 Állatházak felosztása 1) Funkció szerint tenyésztő - kísérleti - vegyes 2) Higiénia szerint nyitott konvencionális - MD minimal disease - SPF specifid pathogen free - VAF virus antibadi free - GF germ free 3) Légnyomás szerint kompressziós - depressziós - kiegyenlített 4) Technológi szerint - egy folyosós - két folyosós, több folyosós 5) Építészetileg - hagyományos -könnyűszerkezetű - konténeres

79 Állatkísérleti laboratóriumok

80 Zsilip - barier 1. Személy zsilip átöltözés - átöltözés + tusolás - átöltözés,tusolás+ hajmosás - átöltözés,tusolás, hajmosás+sebészi fertőtlenítés láb,kéz, aszeptikus öltözet, stb. lehet kényszerzuhanyzó bizalmon nyugvó

81 2) Anyag zsilip - Áthatoló fertőtlenítés : ionizáló sugárkezelés hőkezelés száraz 170 C,60 p - nedves 2,5 bár,125 C, 35 p mikrohullám 2 perc etilén-oxid - Felület fertőtlenítés - formaldehid 4 g/m³ - buktató-fürdő - hidrogénperoxid

82

83

84 sterilezés száraz hővel Sterilezés és annak mikrobiológiai indikátorai Hőmérséklet ( o C) légmozgással idő (perc) légmozgás nélkül nem ajánlott 180 sterilezés nedves hővel (autoklávozás) hőmérséklet (ºC) légnyomás (kpa: kg/cm2) idő (perc) 134±2 205,9 ; 2, ±3 107,8; 1,1 20 Mikrobiológiai indikátorokban alkalmazott baktériumtörzsek módszer mikroorganizmus gőz száraz hő gáz sugár B.stearothermophilus B.subtilis var.niger B.subtilis var.niger B.pumilus Dr. Aigner Zoltán nyomán

85 3) Víz csírátlanítása - UV fénnyel - Hővel : Arnoldozás-Tyndalozás, autoklávozás, - Szűréssel pasztőrözés stb. 4) Levegő csírátlanítása-rendszerint szűréssel: (EU- 4, EU- 7, EU- 9 vagy G1, G2 F1, F2 )minőségű szűrők

86 Légszűrők osztályozása Osztály Tartomány Jellemző részecskék D U G1 <65% rovarok,textil szálak E R G % haj, szőr, L V G % füst, hamu, cement por Ő A G4 90% pollenek F F % spórák, pollenek, K I F % baktériumok, gombák Ö N F % cement por Z O M F % olaj köd, korom, cigi füst V F9 95% fémoxid füst É JACK filter nyomán G

87

88 Klímatizálás Légszűrés: elő,- közép,- hepaszűrő Légnyomás: jó, ha Pa (2,5 5,0 vízmm 1 vízmm = 1 m² 1 kg nyomóerő) Légáramlás: 0,2 m/sec Max. befújó felület függvénye Hőmérséklet: viszonylagos (17-27 C) Páratartalom: relatív, általában adott (5 C harmat pont) Légcsere: kb. 10-szeres

89 Világítás, zaj Fény hullámhossza : nem érzékenyek a rágcsálók Fény ciklus: igen fontos! 12 óra világos, 12 óra sötét Fény intenzitása: 1 m-re a padozattól 300 lux (USA szabvány 325 lux). Precíz munkához 500 lux. Zaj frekvencia: magas, akár ultrahangra is érzékenyek Zaj szint: 36 db csend db klímazaj, 120 db fájdalom küszöb (1000 Hz)

90 Indirekt alom Direkt alom Alom Rács (ujjon járó állatnál ellenjavallt: tengerimalac) A direkt alom ne legyen: fertőzött vegyszeres poros legyen: száraz, nedvességmegkötő, gázmegkötő, pormentes, csíra és vegyszer mentes, olcsó, környezetbarát

91 Szagok, feromonok Ivari feromonok hiánya a nőstény ivarzását 2-3 nappal is eltolhatja

92 Férőhely, populáció denzitás A meghatározás dilemmái: m³ vagy m²? Egy állat több állat arányos? Kis testű-nagytestű állat arányos? Fajok közti eltérés? Ketrec felépítése, anyaga?

93 Több kutató : Lane-Petter Meeh Kállai Metabolic Body Size A = S 0,75 = MBS Kállai által módosított Meeh-féle képlet: A = n 0,85 x S 0,75 x 10 A= szükséges minimális terület: dm 2 n = ketrec populációjának egyedszáma: db S = az elhelyezni kívánt állatok súlya: kg

94 Termék rendelés Faj: táp, alom, egér patkány Fajta/törzs, típus: Crl:WI BR, ssniff R/M-Z+H Súly vagy kor: g vagy 5-6 hetes, kg Ivar: hím vagy nőstény Mikori szállításra kéri: dátum Hova: cím Megrendelő cég: cím Fizető cég: számla cím Elérhetőség: telefon Rendelő neve

95

96

97

98

99