Tartalomjegyzék FOCUS MEDICINAE. /Connection between human and bacteria in the age of antibiotics Friend or enemy?/ Dr.

Átírás

1 FOCUS MEDICINAE Felelős szerkesztő: Dr. Szolnoky Miklós Főszerkesztő: Dr. Karabélyos Csaba Szerkesztőbizottság: Dr. Bencsik Krisztina Prof. Czirják László Prof. Horváth Örs Péter Dr. Kalmár Ágnes Dr. Mátrai Zoltán Dr. Nemes László Dr. Paál Mária Dr. Pál Katalin Prof. Zeher Margit Szerkesztőbizottság tanácsadó testülete: Prof. Fekete György Prof. Kiss Attila Prof. Kiss István Prof. Komoly Sámuel Prof. Lipták József Prof. Mándi Yvette Prof. Maródi László Prof. Medgyesi György Dr. Mészner Zsófia Dr. M. Tóth Antal Dr. Nagy Kálmán Prof. Pálóczi Katalin Prof. Perner Ferenc Prof. Pénzes István Prof. Péter Ferenc Prof. Romics Imre Prof. Rozgonyi Ferenc Prof. Sas Géza Prof. Schuler Dezső Dr. Siklós Pál Dr. Szita János Prof. Tekeres Miklós Prof. Tímár László Dr. Trestyánszky Zoltán Prof. Tulassay Tivadar Tartalomjegyzék Focus Medicinae Bevezetés...2 /Introduction/ Dr. Karabélyos Csaba ELISA módszerek a mikrobiológiai diagnosztika szolgálatában /ELISA methods in the microbiological diagnostics/...3 Prof. Deák Judit Az ember és a baktériumok kapcsolata az antibiotikumok korában Barát vagy ellenség?...11 /Connection between human and bacteria in the age of antibiotics Friend or enemy?/ Dr. Juhász Ágnes Táptalajok a gyógyszeriparban a gyógyszerkönyvi harmonizáció után...15 /Ready for use cultures in the pharma-industry after the Pharmacopoeial harmonisation/ Dr. Nagy Katalin Az egységes élelmiszerlánc-felügyelet, hatósági kontroll az élelmiszerláncban Magyarországon...25 /Uniform food chain supervision, authority control of the food chain in Hungary/ Nagy Tünde, Bors Edina, Bartyik Tünde, Dr. Wyszoczky Gábor Higiénés feltételek megteremtése a vérellátásban...30 /Initiation of hygienic circumstances in the Blood Service/ Dr. Baróti-Tóth Klára KÖNYVISMERTETÉS Vezendi Klára (szerkesztő): Transzfúzió. Medicina, Dr. M. Tóth Antal Alapító: Biotest Hungaria Kft. Kiadja és a nyomdai munkáért felelős: Dursusz Bt. Szerkesztőség és levelezési cím: 2045 Törökbálint, Torbágy u. 15/A ISSN: Megjelenik: évente négyszer Előfizetési díj: évre 2015,- Ft + 5% áfa 1

2 FOCUS MEDICINAE Interdiszciplináris tudományos folyóirat Focus Medicinae Tisztelt Olvasó! Kis szünettel, de megérkezett 3. jubileumi kiadványunk is. Ennek témája bizony messze áll az előző kettőtől, de a dolgot jobban átgondolva gyorsan megtalálhatóak az orvostudomány multidiszciplinaritásából adódó határterületek. A mikrobiológiai számban arra törekedtünk, hogy annak minden főbb tudomány- és alkalmazási területét elemezzünk. Az első publikáció a téma egyik legelismertebb szakemberének tollából az ELISA technológia feltalálását, megvalósítását, alkalmazási területeit és a továbbfejlesztési szükségleteit mutatja be. Ezen cikkben leírtak komoly diagnosztikai segítséget nyújthatnak a korábbi jubileumi kiadásban tárgyalt hyperimmunglobulinok és immunglobulinok tekintetében. A második cikk, a népegészségügy laboratóriumi eredményei terápiába való beültetését taglalja egy olyan szerző tolmácsolásában, aki mind a klinikai, mind a diagnosztikai területnek nagyon jó ismerője. A közlemény végére is megmarad az a súlyos kérdés, hogy barátunk vagy ellenségünk-e az antibiotikum. Ezzel a kérdéssel szintén kapcsolódunk egy korábbi, az intenzív terápiával foglalkozó kiadványunkhoz. A harmadik publikációra egy kisebb gyógyszergyár minőségügyi szakemberét kértük fel, aki tankönyvi precizitással tárja elénk a konvencionális mikrobiológiai kórokozó-azonosítások naprakész adatait. Megismerhetjük az alap és ráépített táptalajok általános és speciális alkalmazásait, amelyet szerző a jellegzetes kórokozó-mintázatokkal is színesített volna, ha annak folyóiratunk fekete-fehér alapszerkezete nem szabott volna határt. A következő összefoglaló a magyarországi legfőbb Élelmiszerügyi kontroll-laboratórium szakemberei segítségével azt mutatja be nekünk, hogy milyen a Hatósági Élelmiszerlánc-felügyelet munkája a talajvédelemtől, a növénytermesztésen és az állattenyésztésen keresztül a vendéglátásig. A jelenlegi kiadvány ötödik dolgozatával pedig visszakanyarodunk a kettővel ezelőtti jubileumi témánkhoz, a transzfuziológiához, azon belül is a preparatív folyamatok minőségbiztosításához, amelyek egyik legfontosabb momentuma a higiénia kontrollvizsgálatok elvégzése azon munkaterületeken, amelyek a gyógyszernek tekintendő vérkészítmények előállításában részt vállalnak. Minden kedves Olvasónak hasznos időtöltést kívánok ehhez a sokszínű kiadványhoz. Dr. Karabélyos Csaba ÚTMUTATÓ SZERZŐINKNEK: A folyóiratban eredeti áttekintő jellegű közleményeket, valamint folyóiratreferátumokat jelentetünk meg. A kézirattal kapcsolatos formai követelmények (eredeti és áttekintő /review/ jellegű közlemények) a következők: A kézirat sorrendje: magyar nyelvű cím, szerzővel, intézettel együtt magyar nyelvű absztrakt magyar kulcsszavak angol nyelvű absztrakt angol kulcsszavak szöveg (csak magyarul) irodalomjegyzék (max. 30) táblázat(ok) ábrá(k), ábrajegyzék Cím: a szerzők a munkahelyük megjelölésével szerepeljenek a közlemény címét követően. Absztrakt: maximálisan 1 oldal terjedelmű legyen, az absztraktok esetén bekezdéseket ne használjunk, folyamatosan történjen a gépelés. Kulcsszavak: 5-10 jellemző kulcsszót emeljünk ki a szöveg elé, mindkét nyelven. Szöveg: (az itt felsorolt követelmények természetesen az absztraktra is vonatkoznak) 1 oldal: sor 1 sor: 70 leütés Betűtípus: Arial, normál 12-es méretű, (a szöveg, amennyiben lehetséges Windows XP vagy újabb változatban készüljön). Maximális oldalszám: 10 (esetenként ettől eltérés lehet a szerkesz tőbizottság döntése alapján), kívánt oldalszám: 6-8 oldal (A/4). Helyesírás: ahol lehet, magyar kifejezéseket és magyaros írásmódot használjunk. Irodalomjegyzék: a hivatkozások száma ne haladja meg a 30-at, a szövegben az adott bekezdés végén levő, dőlt, zárójelbe tett szám jelezze a citált publikációt, az irodalomjegyzék első szerző szerinti ABC-rendben készüljön. Formai kérések: 1. Szerzők megjelölése dőlt betűvel (elől családnév, utána keresztnév első betűje ponttal zárva). 3-nál több szerző esetén az első három szerző után et al.: álljon. 2. A cikk teljes címe 3. A folyóirat hivatalos rövidítése (pl. N.Engl.J.Med.), kötetszáma és oldalszáma, majd legvégül az évszám (pl. 73(1), , 1986) Táblázat(ok): a táblázatok Windows XP vagy újabb verzióval készüljenek, és legyenek címmel ellátva. Ábrá(k): színes ábrákat és fotókat nem áll módunkban leközölni, az esetleges színes ábrák fekete-fehér kópiában jelennek meg. Folyóiratreferátumok: Ezek esetében csak a referáló nevét és a forrást kell feltüntetni, (felül magyarra fordított cím, alatta a forrás pontos adatai, alul a referáló neve). A folyóirat-referátum a két gépelt oldal ter jedelmet ne haladja meg, az előbbiekben valamint az eredeti közleményeknél említett követelmények megtartása mellett. Kérjük a szerzőket, hogy a cikkeket -en adják le szer kesztőségünknek, és amennyiben mód van rá, kinyomtatott formában is juttassák el azt a Biotest Hungaria Kft. irodájába. Cím: 2045 Törökbálint, Torbágy u. 15/A biotest@biotest.hu vagy karabelyos.csaba@biotest.hu 2

3 ELISA módszerek a mikrobiológiai diagnosztika szolgálatában Prof. Deák Judit Szegedi Tudományegyetem, Általános Orvostudományi Kar, Klinikai Mikrobiológiai Diagnosztikai Intézet, Szeged ELISA módszerek a mikrobiológiai diagnosztika szolgálatában Összefoglalás: Az első ELISA vizsgálattal kapcsolatos eredményekről az 1970-es években publikáltak. Az alapelv az antigén és/vagy az antitest kimutatása. A növekvő számú vizsgálati minták miatt egyszerű, majd bonyolult automata rendszereket dolgoztak ki. Előtérbe került a szenzitivitás és specificitás növelésének igénye, melyet a capture, szendvics, kompetitív ELISA-k és a biotin avidin jelölések bevezetésével lehetett elérni. A kvalitatív mellett a kvantitatív ELISA-k is bővítették a diagnosztika lehetőségeit. A diagnosztika biztonságát jelentő aviditási módszer lehetővé tette az egyetlen mintából történő megbízható antitest kimutatást, mellyel a fertőzés időpontja behatárolható. Mára megjelentek az antigén és antitest egyidejűleg történő kimutatását szolgáló ELISA-k is. Harmadik és negyedik generációs kiteket vezettek be, melyeknél több esetben rekombináns proteinnel borították a plasztik mélyedések felszínét. A minőségbiztosítás jegyében új és újabb lehetőségek nyíltak a szerológiai eredményt befolyásoló faktorok csökkentése érdekében. A takarékosság jegyében a kézi és automata vizsgálatokhoz is törhető műanyag ELISA csíkokat gyártanak. Full automata rendszerekre fejlesztettek új típusú módszereket, ilyenek a CMIA és ECLIA módszerek. Summary: The results of the first ELISA examinations were published at the beginning of the 1970s. The basic principle of these tests is the detection of the antigen by a known antibody, or MoAb, and the detection of the antibody by known antigens with the use of a HRPO-labeled secondary antibody. To facilitate the determination of the growing numbers of clinical samples, automated equipment was introduced. New methods were introduced for better sensitivity and specificity: capture, sandwich competitive ELISAs, and biotin avidin labeling. The qualitative laboratory diagnoses were completed by quantitative determinations. For the determination of the antibody on a single clinical sample, the avidity test proved safe and gave the added advantage of defining the date of infection. There are ELISA tests which are suitable for the determination of antigen and antibody simultaneously. Third- and fourthgene ration ELISA kits can be used, where the plastic wells are covered with recombinant proteins. For quality assurance, new methods are available for decreasing those factors which influence the results. For economy, break strips can be applied for manual and automated systems. New methods have been developed for full automated systems: CMIA and ECLIA. Kulcsszavak: direkt, indirekt, kompetitív, capture, szendvics, kvalitatív, kvantitatív, aviditás, rekombináns ELISA Rövidítések EIA enzim immunassay ELISA enzim-kapcsolt immunszorbens assay OD optikai denzitás ELFA enzimjelölt fluoreszcens assay MoAb monoklonális antitest CMIA kemilumineszcens micropartikulum immunassay ECLIA elektrokemilumineszcens immunassay CLSI Clinical and Laboratory Standards Institute CMV cytomegalovírus EBV Epstein-Barr vírus HRPO torma-peroxidáz HSV herpes simplex vírus VZV varicella zoster vírus Bevezetés Az ELISA módszert Peter Perlmann (1. kép) írta le elsőként akkori PhD hallgatójával, Eva Engvall-al (2. kép). A kvalitatív és kvantitatív antigén és/vagy antitest meghatározására alkalmas módszert ben jelentették meg három közleményükben. A PUBMED Keywords: direct, indirect, competitive, capture, sandwich, qualitative, quantitative, avidity, recombinant ELISA adatai szerint az elmúlt 43 évben közel közleményben foglalkoztak az ELISA módszerrel. A Google Tudós adatbázisában több mint 2 millió találatot kaphatunk, és a szerzők citációi erre a három alap közleményre ma már minden bizonnyal több tízezer lehet (7,8,9,11). Az ELISA/EIA az alap- és alkalmazott kutatásban és diagnosztikában, többek között az orvosi-, állatorvosi- és növény diagnosztikában naponta alkalmazott módszerré vált. Forradalmasította az immunológiai és szerológiai diagnosztikát, és az új és újabb automaták bevezetésével nagyszámú minta egyidejűleg történő meghatározását tette lehetővé. Először a parazitológusok, majd a virológusok érdeklődtek az egyszerűen kivitelezhető, megbízható gyorsdiagnosztikai módszer iránt. A módszer megbízhatóságát és elismertségét mi sem bizonyítja jobban, mint az a tény, hogy várandós asszonyok rubeola szűrésére vezették be. Az ELISA módszer a hemagglutináció gátlási módszert váltotta fel. A humán diagnosztikában a cytomegalovírus, kanyaró, adenovírus, coxsackievírusok és herpesvírus ELISA-kat, az állatorvosi diagnosztikában a respiratory syncytial vírus és Newcastle disease vírus ELISA-kat alkalmazták a legkorábban. 3

4 Év Szerzők Módszer 1966 Nakane PK et al. (20) Enzimjelölt antitestek preparálása, alkalmazása antigén kimutatására 1969 Avrameas S. (1) Enzimek proteinekhez kapcsolása glutáraldehiddel 1971 van Weemen B.K. et al. (28) 1971 Engvall E. et al. (8) Heterogén enzim immunassay, EIA Enzym jelölt immunassay, ELISA 1972 Rubinstein K.E. et al. (24) Homogén enzim immunassay 1974 Voller A. et al. (33) Eldobható mikrotitráló lemez ELISA-hoz 1976 Yorde D.E. et al. (39) Kompetitív ELISA (CELIA) 1976 Wolters G. et al. (37) HBsAg kimutatása ELISA-val 1977 Saunders G.C. et al. (25) Indirekt ELISA ELISA vírusfertőzések 1977 Voller A. et al. (32) kimutatására 1. táblázat: Mérföldkövek az ELISA diagnosztika kialakításában A növénydiagnosztikai alkalmazás is rövidesen bevezetésre került. Az 1. táblázatban az ELISA módszerekkel kapcsolatos legfontosabb momentumok összefoglalása látható (5,29,30,31,32). Magyarországon az első ELISA módszerrel végzett diagnosztikai közlemény 1982-ben jelent meg. E módszerek alkalmasak a humán fertőzéses eredetű kórképek diagnosztizálására a virális/bakteriális/parazitológiai antigének és a kórokozó ellen termelődött antitestek kimutatására, valamint egyidejűleg az antigén és kórokozó-specifikus antitest kimutatására is. Az ELISA szerológiai módszerek között a leggyakrabban említett előnyök és hátrányok a 2. táblázatban olvashatóak (15,16). Előnyök Korábban lezajlott infekció jó indikátora a specifikus IgG A capture IgM jó indikátora a jelenlegi fertőzésnek Lehetővé tesz retrospektív diagnózist, ha nincs akut klinikai minta Gyors Automatizálható Az antigén és nukleinsav kimu tatási eljárások bevezetése előtt nem tenyészthető, vagy lassan növekvő kórokozók diagnosztikájára kiváló módszer volt Non-invazív klinikai minták esetén (nyál, vizelet minták) is használhatóak Hátrányok Lezajlott betegségnél a diagnózis retrospektív Keresztreaktivitás, interferencia Nem érzékeny pl. kongenitális CMV fertőzés kimutatására Immunkomprimáltak diagnosztizálására nem megfelelő 2. táblázat: Az ELISA módszerek előnyei és hátrányai Vér-, vérkészítmény adásakor álpozitív, álnegatív eredmények lehetségesek ELISA módszerek a mikrobiológiai diagnosztika szolgálatában ELISA MÓDSZEREK Antigén és antitest kimutatásán alapuló ELISA módszereket használunk. Mindkét immunológiai komponens kimutatására alkalmazhatunk direkt, indirekt és kompetitív ELISA módszereket (1. ábra), (12). 1. ábra: ELISA módszerek sematikus ábrázolása A: Y = IgG, = vírus, YE = IgG-enzim konjugátum B: V = F (ab )2, = vírus, Y = IgG, EA = Protein A-enzim konjugátum C: Y = IgG, = vírus, Y = IgG, A-E = anti-igg-enzim konjugátum D: A = Protein A, Y = IgG, = vírus, EA = Protein A-enzim konjugátum E: = vírus, YE = IgG-enzim konjugátum F: = vírus, Y = IgG, A-E = anti-igg-enzim konjugátum 1. Antigén kimutatása ELISA módszerrel A humán diagnosztikában és surveillance módszerként is széles körben elterjedt vizsgáló eljárás. Alkalmas légúti és enterális vírusok, központi idegrendszeri megbetegedések és szexuálisan átvihető kórokozók, valamint kórházi fertőzések tárgykörébe tartozó patogének kimutatására. A klasszikus ELISA módszerekkel többek között hepatitis B antigént, adenovírus-, rotavírus-, Chlamydia trachomatis-, Clostridium difficile antigént, valamint A/B toxint, továbbá gomba és parazita antigéneket is kimutathatunk Direkt ELISA antigén kimutatására (capture, szendvics) Szilárd felszínhez, a keresett antigénre specifikus antitestet kötünk, melyhez a mintában jelen lévő antigén kikötődik. A vizualizáció érdekében enzimjelölt antihumán IgG-t, majd a következő lépésben szubsztrátot 4

5 mérünk az ELISA lemez mélyedéseibe, ekkor színreakciót észlelünk. Az antigén-ellenanyag kapcsolódás kimutatásához olyan kromogén szubsztrát szükséges, amely az enzimreakció következtében színváltozáson megy át. Az enzim által átalakított kromogén szubsztrát mennyisége az abszorpciós (fényelnyelési) maximumnál mért optikai denzitás (extinkció) mérésével követhető és arányos az enzimaktivitással, amely a megkötött antigén, vagy ellenanyag mennyiségének függvénye. E vagy OD = I 0 / I Indirekt ELISA antigén kimutatására (capture, szendvics) Az indirekt ELISA antigén kimutatása annyiban különbözik a direkt módszertől, hogy az antigén tartalmú minta hozzáadása után egy nem jelölt, majd egy enzim jelölt, második antitestet adunk a rendszerhez, és ezután mérünk szubsztrátot az ELISA lemez mélyedésébe. A színváltozás mértéke arányos az antigénhez kötődött és tesztelni kívánt primer antitest mennyiségével. Spektrofotométerrel kvantitatív értéket mérünk és az eredményt, sztenderdek alkalmazásával nemzetközi egységben adhatjuk meg. A módszer előnye az, hogy a két antitest alkalmazásával a mérés érzékenyebb lesz. Hátránya, hogy az antigén immobilizációja nem specifikus. Amikor szérumból mutatjuk ki az antigént, a mintában lévő proteinek kikötődhetnek a mikrotitráló lemez mélyedéseihez és versenyeznek a kötőhelyekért. Ezért a sandwich, vagy direkt ELISA az, mely kiküszöböli ezt a problémát capture antitest használatával, mely specifikus a tesztelni kívánt antigénre, és mintegy kiemeli a szérumban fellelhető molekulák keverékéből. Az ELISA-t kivitelezhetjük qualitatíve és quantitatíve. A qualitatív eredmény pozitív, vagy negatív eredménnyel zárul. A cutoff érték a pozitív és negatív érték közötti pont, vagy tartomány, a standard deviáció kétszerese, vagy háromszorosa. A quantitatív ELISA alkalmazásakor, a minta OD értékét hasonlítjuk a standard görbéhez, melyet ismert koncentrációjú oldatokkal állítottunk be. A görbéről pontosan leolvasható az adott antigén, vagy antitest OD értéke. Capture és sandwich lényege A mikrotitráló lemezt ún. capture antitesttel boríthatjuk. A szérum mintát bemérve, az abban lévő antigén kikötődik a befogó (capture) antitesthez. A detektáló antitest bemérésekor, hozzákötődik az antigénhez. Ezután az enzimjelölt szekunder antitest kötődik a detektáló antitesthez. A szubsztrát bemérésével, melyet az enzim bont, mérhető lesz a sandwich -ben jelenlévő antigén mennyisége. A capture antitest használatával növelhető a mintában lévő antigének mennyiségének megkötése, ezzel a módszer érzékenysége növelhető. Ráadásul, ha a capture antitest tisztítva volt, nem szükséges az antigént tartalmazó minta tisztítása a vizsgálat előtt. Ezzel egyszerűbbé, specifikusabbá és szenzitívebbé tehető a módszer. ELISA módszerek a mikrobiológiai diagnosztika szolgálatában 1.3. Kompetitív ELISA antigén kimutatására Az ELISA harmadik típusa a kompetitív kötés. Érzékenysége miatt szolubilis fázisban található kis menynyiségű antigén kimutatására is alkalmas. Elve: a mintában jelenlevő ismeretlen mennyiségű, oldatban lévő antigén hozzákötődik az ellenanyagokhoz, és így gátolja azok kötődését a szilárd fázishoz kötött tisztított antigénhez. Részletesen: jelöletlen antitestet inkubálunk antigén tartalmú mintával. Az antitest/antigén komplexet ezután bemérjük az antigénnel borított mélyedésbe. A nem kötött antitestet mosással eltávolítjuk. Ezután mérjük be a szekunder, enzimmel jelölt antitestet, mely specifikus az első antitestre. A maradék enzim a szubsztrátot elbontja, az enzimaktivitás mérhető. A kompetitív ELISA kiteket gyártók előnyben részesítik az enzim-jelölt antigént az enzim-jelölt antitesttel szemben. Az enzim-jelölt antigén versenyez az elsődleges antitest kötőhelyekért a mintában lévő és nem jelölt antigénnel. A szubsztrát bontás intenzitása fordítottan arányos a mintában lévő antigén mennyiségével. Mindhárom típusú ELISA kivitelezése történhet kézi, félautomata vagy teljes automata rendszerekkel. Az antigén kimutatását végezhetjük 96 mélyedést tartalmazó műanyag mikrotitráló lemezben. Újabb lehetséges hordozó felületek lehetnek a mágneses mikropartikulumok, vagy gyöngyök felszínei. Biotin és streptavidin használata A biotin-avidin rendszer növeli a reakciók érzékenységét. Az IgG-t biotinálják, a sztreptavidint pedig enzimmel konjugálják. A mélyedéseket előzetesen IgGvel érzékenyítették, majd a vizsgálandó mintát mérjük a lemez mélyedéseibe. A biotinnal kapcsolt antitesttel inkubálunk, mely után az avidin-enzim konjugátum hozzáadása következik, melyet a szubsztrát bemérése követ. 2. Antitest kimutatása ELISA / EIA módszerrel Az ELISA sokoldalú diagnosztikai módszerré vált az elmúlt 43 évben, és a felhasználói igényeknek megfelelően változott is. Jelenleg a világon a legelterjedtebb szerológiai módszer mikrobiális antitestek kimutatására. Ma már szintetikus peptideket, vagy rekombináns antigéneket használnak a virális, bakteriológiai, gomba, vagy parazitológiai lizátumok helyett, mellyel szenzitívebbé és specifikusabbá tették a kórokozó specfikus antitest értékeket. A fejlesztések kiszorították az izotóp használatát, és olykor az enzim reagens helyett is kemilumineszcens és fluoreszcens jelöléseket alkalmaznak. Ezzel a módszer érzékennyé, gyorsabbá és megbízhatóbbá vált automata rendszerek alkalmazására is Indirekt ELISA antitest kimutatására Az antitest kimutatását szolgáló ELISA-k esetén a reagensek egyikét rögzítik a műanyag lemez felszínéhez, jelen esetben vírus antigént. A páciens mintában lévő vírus specifikus antitest kötődik az antigénhez. A harmadik reagens az enzimmel jelölt anti-humán immunglobulin, 5

6 mely lehet IgM, IgG, vagy IgA típusú. Ha a mintában nagy mennyiségű IgG vagy rheumatoid faktor van jelen, fals eredményt kaphatunk. Előbbi esetben a nagy mennyiségű IgG redukálhatja az IgM assay érzékenységét, utóbbi esetben, a rheumatoid faktor álpozitív reakciót eredményez Sandwich ELISA antitest kimutatására A műanyag mikrotitráló lemez felszínére antihumán IgM-et, vagy antihumán IgG-t rögzítenek, melyhez a klinikai mintában jelen lévő vírus specifikus immunglobulin G vagy immunglobulin M kikötődik. A következő lépésben az ismert antigén, majd enzimmel jelölt antitest hozzáadása történik. Ez a rendszer javasolt IgM assayokhoz, mert redukálja a rheumatoid faktor potenciális interferenciáját Kompetitív ELISA antitest kimutatására Ebben az esetben ismert antigént rögzítettek a lemezek mélyedéseihez, melyért a jelölt (monoklonális) antitest a klinikai mintában lévő antitesttel vetélkedik az antigén kötő helyekért. A szubsztrát bontás intenzitása fordítottan arányos a klinikai mintában jelen lévő antitest mennyiségével Hagyományos, rövid időtartamú vizsgálati eljárással kivitelezhető ELISA Dél-Amerikában a Bunyaviridae családba tartozó hantavírusok Andes vírus speciese fordul elő és okoz súlyos kimenetelű cardiopulmonaris szindrómát. Hasznos a rövid idő alatt kivitelezhető ELISA (3) Egyidejűleg történő antigén és antitest kimutatása ELISA módszerrel A negyedik generációs ELISA kitek egyidejűleg HCV antigén és antitest, HIV 1-2 antigén és antitestek kimutatására alkalmasak egyetlen mintából Tradicionális módszerektől eltérő, különböző alapelven működő ELISA módszerek Az ELFA elven működő automata egyszer használatos, előre gyártott beszárított és folyadéktartalmú komponenseket tartalmazó tesztcsíkot használ. Minimum 1-6 minta vizsgálható egyidejűleg. Rendkívül rövid idő szükséges a különböző antigének, antitestek kimutatására. A módszer nagy előnye a diagnosztikára fordított rövid idő (2). Liu és munkatársai négy különböző alapelven működő ELISA módszert, a kemilumineszcens micropartikulum immunassay-t (CMIA), az elektrokemilumineszcens immunassay-t (ECLIA), az enzim jelölt immunszorbens assay-t (ELISA) és az arany immunkromatográfiás eszszét (GICA) hasonlították össze a HBsAg kimutatására. Az ismert antigén tartalmú szérum mintákat a CLSI-tól szerezték be (17). ELISA módszerek a mikrobiológiai diagnosztika szolgálatában 3. Aviditás A fehérjékkel kapcsolatban az aviditás írja le a több kötés együttes erősségét. Az aviditás különbözik az affinitástól, amely egyetlen kötés erősségét írja le. Így tulajdonképpen az aviditás a kötések affinitásának összege. Gyakran az ellenanyagok kölcsönhatásainak jellemzésére használják, amikor több gyenge kovalens kötés alakul ki az antigén és az ellenanyag között. Az egyes kötések önmagukban elég könnyen felbomlanak, amikor azonban több van jelen egyszerre, akkor az együttes hatásuk következtében kölcsönösen egymást erősítő kötődés jön létre az antigén és az ellenanyag között, Wikipédia (23). Aviditási teszteket a várandósság és transzplantáció során elszenvedett fertőzések: CMV, parvovírus, rubeola, toxoplasma konfirmálására/kizárására vezették be. A módszer képes megkülönböztetni a friss és régebben történt fertőzéseket egyetlen szérum mintából. Alacsony aviditású antitestek jelenléte többnyire friss fertőzésre utal. Magas aviditású IgG antitestek jelenléte esetén kizárhatjuk annak lehetőségét, hogy a fertőzés nemrégiben kezdődött (3. táblázat) (13). Előnyök Zárt rendszerek Hátrányok Kidolgozott hardware és software Költségesebb Limitált módszer alkalmazható Rendszeresen update és ellenőrzés szükséges Nyitott rendszerek Hardware kidolgozott Software-t minden újabb típusú ELISA esetén be kell állítani Kevésbé költséges Adaptálható bármely antigén és antitest ELISA 3. táblázat: Nyitott és zárt rendszerű automatákban kivitelezett ELISA-k Vizsgálható minták típusai antigén kimutatására: bármely humán (vér, liquor, anyatej, nyál, ejakulátum, széklet, stb) állati és növényi eredetű minta. 4. Szerológiai módszerek eredményének interpretációja 4.1. Szerokonverzió Primer vírusinfekció esetén az addig negatív vírus specifikus IgG mérhetővé, pozitívvá válik, és ezzel egyidejűleg még a vírus specifikus IgM is kimutatható Primer infekció Az akut és konvaleszcens klinikai minta IgG titerében bekövetkezett négyszeres titeremelkedés a komplementkötési reakcióban, mely ELISA eredményre konvertálható. 6

7 4.3. Múltban lezajlott infekció Vírus specifikus IgG jelenléte IgM nélkül, vagy változatlan mennyiségű IgG akut és konvaleszcens klinikai mintában Szerológiai eredményt befolyásoló faktorok A páciens kora (a szérum IgG vagy IgM antitestek hiányozhatnak, vagy termelődésük gyengült immunkomprimált, újszülött és idős korban), vérkészítmény adása, mely egyúttal passzív antitest átvitelt jelent, az újszülöttben kimutatható IgG lehet anyai transzfer eredménye. Nem specifikus antitest szintemelkedés bekövetkezhet más vírussal történt fertőzés miatt herpes simplex infekció esetén, csoport specifikus keresztreagáló epitópok miatt. Hosszadalmasan perzisztálhatnak IgM típusú antitestek primer infekció után, vagy reaktiváció, vagy látens fertőzés esetén (CMV, EBV). Vírus specifikus intrathecalis antitest termelődése konfirmálható (érintetlen vér-agy gát esetén) a központi idegrendszer subacut sclerotisalo panencephalitis fertőzése miatt. Az ELISA eredmények konfirmálhatóak PCR vizsgálattal és fordítva Fals pozitív, fals negatív ELISA eredmények: A leggyakoribb fals pozitív, vagy fals negatív ELISA eredményeket adó tényező a pufferoldat, mely nem képes megakadályozni a plasztik felszínhez kötődő fehérjék nagy kötődési affinitását. Autoimmun betegségben szenvedő betegek autológ antigénjeinek vizsgálatára új puffer rendszert fejlesztettek ki, ChonBlock elnevezéssel. Ez hatékonyan redukálja a nagyfokú fals pozitív reakciót, melyet a mintákban lévő IG hidrofób kötés okozott (26). Xu L és mtsai modell kísérleteket végeztek rheuma faktort (RF) tartalmazó szérum minták hepatitis B antigén meghatározásakor. Ismereteink szerint a RF általában álpozitív reakciót okoz. Közleményükben bizonyították, hogy közepes és nagy mennyiségben jelen lévő RF interferálhat az immunassay-vel és alacsonyabb, vagy álnegatív HBsAg értéket eredményezhet (38). A Dengue vírusfertőzés több mint 100 országban jelent komoly egészségügyi problémát. A dengue vírus NS1 protein ELISA új lehetőséget jelent a dengue vírus diagnózisában. A járványmentes időszakban 100%-os egyezést találtak az NS1 antigén-capture-elisa és PCR vizsgálattal a negatív minták között. 85%-os egyezés volt a pozitív minták között. A járvány folyamán azonban 15%-ban fals negatív eredményt kaptak a dengue negatív mintákban (6) Keresztreakciók által előidézett fals pozitív eredmény megoldás: új ELISA módszer A kéz láb száj betegséget a Coxsackie A 16 vírus és az enterovírus 71 okozhatja, utóbbival történő fertőzés ELISA módszerek a mikrobiológiai diagnosztika szolgálatában sokkal súlyosabb kimenetelű lehet. A neurológiai betegségek között aszeptikus meningitis, akut petyhüdt bénulás és fatális pulmonalis ödéma ismert. A keresztreakció elkerülésére és az enterovírus 71 törzzsel történt vírus specifikus IgM kimutatása érdekében Wang és mtsai új IgM-μ-capture ELISA módszert dolgoztak ki. Az enterovírus 71 VP1 gént találták alkalmasnak a két enterovírus szerológiai megkülönböztetésére. A VP1 DNS fragmenst amplifikálták, klónozták PET 32a vektorba. Az Escherichia coli BL 21 által expresszált és tisztított VP1-et torma peroxidáz enzimmel jelölték. Az EV 71 VP1 monoclonalis ellenanyagot tisztítás után HRPO enzimmel jelölték. Ez utóbbit használták az EV 71 VP1 ELISA-ban az akut enterovírus fertőzés kimutatására (35). Naesens és mtsai neuroborrelosis gyanú miatt végeztek szérumból Borrelia burgdorferi ELISA vizsgálatot. Bár a teszt eredménye pozitív volt, a szérumból, és liquorból végzett konfirmációs vizsgálatok sem szérumból, sem liquorból nem erősítették meg a laboratóriumi diagnózist, fals pozitívnak validálták az eredményt. A lehetséges Treponema pallidum fertőzés miatt VDRL és TPPA és további vizsgálatokat végeztek és a definitív diagnózis neuroszifilisz volt. Saját adatbázisukat megvizsgálva, további öt hasonló esetet találtak (19). 5. A szerológiai diagnosztika korlátai A szerológiai diagnosztika korlátai adódhatnak a kórokozó tulajdonságai miatt. A rubeola és hepatitis A vírusfertőzés klinikai tünetei az antitestek kialakulásával egyidejűleg jelennek meg. A vírusspecifikus IgM és az emelkedő IgG a szérumban aktív megbetegedésre utal. Más vírusfertőzések esetén az antitestek a tünetek megjelenése után jelentkeznek (légúti és enterális vírusfertőzések), a szerológiai diagnózis retrospektív lesz. Fel nem ismert HIV, vagy lyssa fertőzés esetén a vírus hónapokkal, évekkel a szerokonverzió után okoz betegséget. Az antitest jelenléte elegendő a diagnózishoz. További problémák adódhatnak a nem korrekt mintavételből, a megfelelő időben vett akut és rekonvaleszcens savópár hiányából. Genitalis HSV esetén nem termelődik (elegendő) humoralis immunválasz, ebben az esetben a nukleinsav kimutatás, a PCR vizsgálat a megoldás. Előfordulhatnak antigén keresztreakciók: HSV és VZV között, enterovírusok és hepatitis A vírus között, EBV vagy CMV és rinovírusok között, valamint Japán B encephalitis vírus és Dengue vírus fertőzések között. Az eredmények fals pozitívak lehetnek. Immunkomprimált betegeknél gyakori az alacsony, vagy a hiányzó humorális immunválasz, ilyen esetekben az antigén, vagy a nukleinsav kimutatás jöhet szóba. Az EBV/CMV okozta mononukleosis és SLE esetén nem specifikus fals pozitív eredményeket kaphatunk. A szerológiai eredmények károsodott immunrendszerű betegeknél óvatosan értékelendők. Vér, vérkészítmény donáció után a recipiens mintáiban fals pozitív eredményt okozhatnak a transzfer antitest(ek) (27). 7

8 6. Egyéb hibaforrások Egyéb hibaforrások lehetnek a minták bakteriális kontaminációja és azok ismételt fagyasztása-olvasztása. A hővel történő inaktiváció befolyásolhatja a minták abszorbancia értékeit, ami a mért ellenanyagszintek fals eredményéhez vezethet. Egyetlen fertőző betegség diagnózisát sem szabad egyetlen teszt eredményre alapozva felállítani. Az EBV-vel társult betegségek esetében a normális felnőtt populációnak mintegy 20%-a esetében mérsékelten magas vagy magas EBV EA(D) elleni IgG található. A pontos diagnózis felállításánál figyelembe kell vennünk a beteg anamnézisét, tüneteit, valamint a szerológiai vizsgálatok eredményeit. A szerológiai eredmények károsodott immunrendszerű betegeknél óvatosan értékelendőek. 7. Minőségügyi kiegészítések 7.1. Diagnosztikus specificitás és szenzitivitás A kitek beszerzésekor figyelembe kell vennünk azok specificitását és szenzitivitását. Az RF szorbens ma már a legtöbb ELISA kit tartozéka. Magas IgG titer és rheuma faktor jelenléte esetén a kórokozó specifikus IgM meghatározás pontatlan lehet, fals negatív vagy fals pozitív eredményt kaphatunk. Ha a szérumot RF-szorbenssel (anti-igg szérummal) előkezeljük, adszorbeáljuk a nagy mennyiségben jelen lévő IgG-t. A MEP-sepharose a RF, anti-dsdna antitestek és az ANA eltávolítására alkalmas (22) Kontrollok A kitek általában egy negatív, és egy vagy több pozitív kontrollt tartalmaznak Validálás A kalibrátor átlagértékeket minden egyes ELISA lemezre, meg kell határoznunk, még akkor is, ha egyszerre több, azonos sorozathoz tartozó lemezt használtunk. A vak abszorbancia értékének általában 0,000 és 0,150 közé kell esnie. Az 1. kalibrátor átlagos abszorbancia értéke legyen azonos a kitleírásban szereplő értékkel. A 4. kalibrátor és a 2. kalibrátor esetében mért abszorbancia értékek átlagértékeinek aránya általában 5 vagy nagyobb. Ha a feltételek nem teljesülnek, az eredmények nem értékelhetők, a vizsgálatot meg kell ismételni. ELISA módszerek a mikrobiológiai diagnosztika szolgálatában 9. A jövő lehetőségei Folytatódik a kutatás a szimultán antigén/antitest meghatározásra alkalmas ELISA kitek kifejlesztésére. 1. kép: Peter Perlman ( ) Svédországban talált új otthonra a II. Világháború kezdetekor. Az akkori Csehszlovákia Szudétavidékén született és zsidó származása miatt hagyta el az országot. Lundban biológiát, Stockholmban kémiát tanult. Számos kutatási témában ért el sikereket, nevét az ELISA módszer megalkotása tette világhírűvé. Hat évtizeden át volt aktív kutató. Négyszáz közleménye közül az első ban, az utolsó 2005-ben jelent meg. 50 hallgatója kapott PhD fokozatot. Tiszteletbeli doktori fokozatot kapott a Karolinska Intézetben. Egy ciklusban az Élettani és Orvostudományi Nobel Bizottság tagja volt. Az Európium-kelát kutatások során új, stabil erősen fluoreszkáló derivátumot írtak le, mely alkalmas lehet érzékeny és specifikus immunassay-k kifejlesztésére. Nanopartikulumokkal végzett gyorsdiagnosztikai módszer alkalmazásával új lehetőség nyílt a súlyos láz és thrombocytopenia szindróma diagnosztizálására. A peptid ELISA kifejlesztésével megoldódni látszik a lovak arteritisének diagnosztikája. A chikungunya vírus fertőzések diagnosztizálására új, rekombináns kapszid protein alapú ELISA-t vezettek be. A dengue vírus fertőzések diagnosztikájához NS1 antigén kimutatásán alapuló tesztet alkottak. Új monoklonális antitest kifejlesztésének köszönhetően lehetővé tették a lyssa vírus antigén és antitest kimutatását. Magas hozamú rekombináns influenza vírus antigén expressziót mértek Escherichia coli-ban, mely az influenza diagnosztikában rendkívül fontos lehet (4,10,14,18,21,34,36). 8. Szerológiai eredmények szinkronizálása Hosszú idő óta elvárás a klinikai és laboratóriumi diagnosztikai oldalról annak megoldása, hogy a különböző laboratóriumokban különböző gyártóktól származó kitekkel végzett vizsgálatok eredményei összehasonlíthatóak legyenek. Ennek érdekében nemzetközi egységekben történő számolás (IU) valósulhatna meg. A WHO standardok néhány kórokozóra nézve elérhetőek (HBsAg, HIV, HCV antigén/antitest tartalmú savók, szérumok), vagy CLSI eredetű minták, de még távol vagyunk az egységes kontrollok használatát illetően. 2. kép: Eva Engvall egyike volt azoknak a kutatóknak, akik részt vettek az ELISA test kidolgozásában, majd publikálásában 1971-ben. Ph.D. téziseit a Stockholmi Egyetemen 1975-ben védte meg ELISA témakörben. A későbbi években Engvall a Burnham Intézetben (La Jolla, California) tevékenyen részt vett az ott folyó kutatómunkában, 186 közleményéből 30-ban első, 56-ban utolsó szerző volt. Utolsó közleménye 2010-ben jelent meg. Jelenleg a kaliforniai Santa Barbarában él. 8

9 Irodalomjegyzék 1. Avrameas S.: Coupling of enzymes to proteins with glutaraldehyde. Immunochemistry, 6(1), 43-52, Berth M., Grangeot-Keros L., Heskia F. et al.: Analytical issues possibly affecting the performance of commercial human cytomegalovirus IgG avidity assays. Eur. J. Clin. Microbiol. Infect..Dis., Apr 30, PMID , Cautivo K., Schountz T., Acuña-Retamar M. et al.: Rapid Enzyme-Linked Immunosorbent Assay for the Detection of Hantavirus-Specific Antibodies in Divergent Small Mammals. Viruses, 6, , Chander V., Singh R.P., Verma P.C.: Development of monoclonal antibodies suitable for rabies virus antibody and antigen detection. Ind. J. Virol., 23(3), , Clark M.F., Adams A.N.: Characteristics of the microplate method of enzyme-linked immunosorbent assay for the detection of plant viruses. J. Gen. Virol., 34(3), , Colombo T.E., Vedovello D., Araki C.S. et al.: Dengue-4 false negative results by Panbio Dengue Early ELI- SA assay in Brazil. J. Clin. Virol., 58(4), , Engvall E., Jonsson K., Perlmann P.: Enzyme-linked immunosorbent assay. II. Quantitative assay of protein antigen, immunoglobulin G, by means of enzyme-labelled antigen and antibody-coated tubes. Biochim. Biophys. Acta, 251(3), , Engvall E., Perlmann P.: Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Quantitative assay of immunoglobulin G. Immunochemistry, 8(9), , Engvall E., Perlmann P.: Enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA. 3. Quantitation of specific antibodies by enzyme-labeled anti-immunoglobulin in antigen-coated tubes. J. Immunol., 109(1), , Fuchs I., Bin H., Schlezinger S. et al.: NS1 antigen testing for the diagnosis of dengue in returned Israeli travelers. J. Med. Virol., doi: /jmv Hammarström M.L., Holm G., Troye-Blomberg M. et al.: Peter Perlmann Scand. J. Immunol., 63(6), , Hampton J.R.: ELISA eljárások sematikus ábrázolása. A szerológiai reakciók alaptípusai. In: Növényvírusok és virológiai vizsgálati módszerek. Szerk: Horváth J., Gáborjányi R., Mezőgazda Kiadó, Budapest, ISBN: , Horváth K., Szénási Zs., Danka J. et al.: Az IgG aviditás jelentősége a friss Toxoplasma fertőzések diagnosztikájában; Infektol. Klin. Mikrobiol., 11(2), 64-70, Jang Y.H., Cho S.H., Son A. et al.: High-yield soluble expression of recombinant influenza virus antigens from Escherichia coli and their potential uses in diagnosis. J. Virol. Methods, 196, 56-64, Jeffery K., Aarons E.: Diagnostic Approaches In: Principles and practice of clinical virology, 6th edition, Ed: Zuckerman A.J., Banatvala J.E., Schoub B.D. et al., Wiley-Blackwell, Oxford, ISBN: , 1-25, 2008 ELISA módszerek a mikrobiológiai diagnosztika szolgálatában 16. Kóbor J., Pejtsik B., Pácsa S.: Screening model of studying alpha-foetoprotein of maternal serum (S-AFP) organized within central dispensary follow-up of pregnant women in Baranya region. Sante Publique, (Bucur), 25(3), , Liu C., Chen T., Lin J. et al.: Evaluation of the performance of four methods for detection of hepatitis B surface antigen and their appli cation for testing 116,455 specimens. J. Virol. Methods, 196, , Metz G.E., Lorenzón E.N., Serena M.S. et al.: Development of a peptide ELISA for the diagnosis of Equine arteritis virus. J. Virol. Methods, pii: S (14) doi: /j.jviromet Naesens R., Vermeiren S., Van Schaeren J. et al.: False positive Lyme serology due to syphilis: report of 6 cases and review of the literature. Acta Clin. Belg., 66(1), 58-59, Nakane P.K, Pierce G.B.: Enzyme-labelled antibodies: preparation and application for localization of antigens. J.Histochem.Cytochem., 14, , Priya R., Khan M., Rao M.K. et al.: Cloning, expression and evaluation of diagnostic potential of recombinant capsid protein based IgM ELISA for chikungunya virus. J.Virol.Methods., 203, 15-22, Ren J., Jia L., Xu L., et al.: Removal of autoantibodies by 4-mercaptoethylpyridine-based adsorbent, J. Chromatogr. B., 877, , Roitt I.M.: Immunology, 6th edn, Mosby Publishers, page 72, Rubinstein K.E., Roit I.M.: Homogeneous enzyme immunoassay Saunders G.C.: Development and evaluation of an enzyme-labeled antibody test for the rapid detection of hog cholera antibodies. Am. J. Vet. Res., 38(1), 21-25, Terato K., Do C.T., Cutler D. et al: Preventing intense false positive and negative reactions attributed to the principle of ELISA to re-investigate antibody studies in autoimmune diseases. J.Immunol.Meth., , Tyagi S., Tyagi A.: Possible Correlation of Transfusion Transmitted Diseases with Rh type and ABO Blood Group System. J. Clin. Diagn. Res., 7(9), , van Weemen B.K., Schuurs A.H.V.M.: Immunoassay using antigen-enzyme conjugates, FEBS Letters, 15, , Voller, A., Bartlett A., Bidwell D.E.: Enzyme immunoassays for parasitic diseases. Trans.R.Soc.Trop.Med. Hyg., 70, , Voller A., Bidwell D.E: Enzyme immunoassays for antibodies in measles, cytomegalovirus infections and after rubella vaccination. Br. J. Exp. Pathol., 57, , Voller, A., Bidwell D.E.: Simple method for detecting antibodies to rubella. Br. J. Exp. Pathol., 56, ,

10 32. Voller A., Bidwell D.E., Bartlett A.: The enzyme immuno assays (ELISA) for viral diseases. J. Infect. Dis., 136, Suppl, S , Voller A., Bidwell D.E., Huldt G. et al.: A microplate method of enzyme-linked immunosorbent assay and its application to malaria. Bull. World Health Organ., 51(2), , Wang Q., Nchimi Nono K., Syrjänpää M., et al.: Stable and highly fluorescent europium(iii) chelates for time-resolved immunoassays. Inorg. Chem. 52(15), , Wang C., You A., Tian X. et al.: Analysis and solution of false-positives when testing CVA16 sera using an antibody assay against the EV71 virus. Virus Res., 176(1-2), 33-36, 2013 ELISA módszerek a mikrobiológiai diagnosztika szolgálatában 36. Wang X., Zhang Q., Hao F. et al.: Development of a colloidal gold kit for the diagnosis of severe Fever with thrombocytopenia syndrome virus infection. Biomed. Res. Int., doi: /2014/530621, Epub, Wolters G., Thal P., Kacaki J. et al.: Screening for HBsAg by hepanosticon in microplates. Biomedicine, 25(2), 72, Xu L., Yu Z., Fan W. et al.: Negative interference in serum HBsAg ELISA from rheumatoid factors. PLoS One., 8(11), e80620, ecollection, Yorde D.E., Sasse E.A., Wang T.Y. et al.: Competitive enzyme-liked immunoassay with use of soluble enzyme/antibody immune complexes for labeling. I. Measurement of human choriogonadotropin. Clin. Chem., 22(8), , 1976 Megrendelő lap (Focus Medicinae) Alulírott, postai úton megrendelem a Focus Medicinae című kiadványt évre,... példányban. A folyóirat éves előfizetési díja: 2015,- Ft + 5% Áfa. Megrendelő neve: Címe: Megrendelését az alábbi címre kérjük elküldeni: Dursusz Bt Budapest, Szepesi u. 24. Telefon/Fax: (1) Mobil: (06-30) dursusz@mail.datanet.hu 10

11 Az ember és a baktériumok kapcsolata az antibiotikumok korában Az ember és a baktériumok kapcsolata az antibiotikumok korában. Barát vagy ellenség? Dr. Juhász Ágnes Synlab Hungary Kft., Debreceni Mikrobiológiai Laboratórium, Debrecen Összefoglalás: Amikor a mikrobiológus egy humán mintából olyan kórokozót izolál, ami ellen egyetlen hatásos antibiotikummal sem rendelkezünk, felmerül a kérdés, hogyan tovább? A válasz igen nehéz, egy olyan világban, ahol az emberekben az a hamis képzet él, hogy a fertőző betegségek gyógyítása egy megoldott probléma, ahol gátlástalanul használják az antibiotikumokat mind a humán, mind az állatgyógyászatban és ahol 1987 óta gyakorlatilag nem látott napvilágot új antibiotikum. A baktériumok pedig nagyon gyorsan képesek alkalmazkodni. Számukra az antibiotikum egy környezeti tényező a sok közül, amelyet le kell küzdeni a túlélés érdekében, és amelyiknek ez sikerül az gyorsan átveszi a helyét az elpusztult társainak. Kulcsszavak: antibiotikum túlfogyasztás, multirezisztencia, humán/állat gyógyászat, sáfárkodás az antibiotikumokkal Summary: When a microbiologist isolate a pathogen from a human sample, against which no effective antibiotic exists, we raise the question of How to proceed? The question is truly difficult to answer in a world where people have the false view that curing contagions is already a solved problem, where antibiotics are excessively used in human as well as in veterinary medicine, and where no new antibiotic has been invented since However, bacteria are capable of adapting very easily. For them, antibiotics are only one external factor among others, which can be defeated to survive, and whichever manages to do that replaces the dead ones easily. Keywords: antibiotic overuse, multiresistant, human/animal medicine, antibiotikum stewardship A rettegett múlt Az emberiségnek történelme során számos világjárvánnyal kellett megküzdenie, amelyek olykor a Föld lakosságának 30-50%-át is elpusztították. Gondoljunk csak az 1300-as években a világon végigsöprő Yersinia pestis által okozott fekete halálra amely a század fordulóján, mint modern pestis ütötte fel újra a fejét. Megemlíthetjük a rossz higiénés viszonyok között élő országok lakossága körében a még napjainkban is kialakuló, Vibrio cholerae által kiváltott kolera járványokat, amelyet időnként a civilizált országokba ma is behurcolnak. A középkor és újkor háborúi során a Rickettsia prowazekii okozta kiütéses tífuszjárványok több áldozatot szedtek, mint a harci cselekmények. Staphylococcus aureus például a penicillin bevezetésekor 80%-ban érzékeny volt a szerre, míg napjainkban ez az arány kevesebb, mint 5% (5). Az antibiotikum rezisztencia kialakulásának folyamatában a kórokozók az antibiotikum hatástalanításának széles fegyvertárát vetették be: az általuk termelt β-laktamáz enzim hasítja a penicillinek β-laktám gyűrűjét, hatástalanítva a molekulát a penicillinkötő fehérje módosításával a baktérium lehetetlenné teszi az antibakteriális szer kötődését megváltoztatják sejtfaluk permeabilitását, amely megakadályozza az antibakteriális szer behatolását sejtjeik belsejébe. A rezisztencia viszonylag gyors kialakulása arra sarkallta a kutatókat, hogy újabb és újabb különböző Az antibiotikumok felfedezése A β-laktám antibiotikumok története Sir Alexander Fleming jól ismert felfedezésével, a penicillinnel kezdődött. Közös jellemzőjük a négytagú β-laktám gyűrű jelenléte. Az egyes penicillinek és cephalosporinok oldalláncukban különböznek, ez döntően befolyásolja a vegyületek antibakteriális hatásának erősségét és spektrumát. A penicillineken túlmenően ide tartoznak még a cephalosporinok, karbapenemek, a monociklusos monobaktámok stb. (1. ábra). A penicillin 1928-as felfedezése, és a terápiába való bevetését követően pár évvel kiderült, hogy a baktériumok képesek ellenállóvá válni az antibiotikumokkal szemben. Az egyik legismertebb gennykeltő baktérium a 1. ábra: A penicillin alapváza 11

12 vegyületcsoportba tartozó antibakteriális hatású szereket keressenek, és vessenek be a terápiába. A folyamat felgyorsult, szélesebb spektrumú, több kórokozó csoport ellen hatásos készítmények jelentek meg. A fertőző betegségek kórokozóinak megismerése, a hatásos antibakteriális szerek felfedezése azt a téves képzetet keltették, hogy az emberiség a baktérium okozta megbetegedéseken végleg felül tud kerekedni. A 80-as évek végén azonban az új antibiotikumok megjelenésének áradata leállt óta nem látott napvilágot olyan új, hatékony vegyületcsoport, amely a rezisztencia problémákra megoldást jelentene (1,14,15). Az érzékeny baktériumtörzsek számának csökkenése miatt, új hatóanyagokra volt szükség. Az aranykorban amikor sorra láttak napvilágot a különböző vegyületcsoportba tartozó antibakteriális hatással bíró készítmények (2. ábra) a baktériumok által okozott megbetegedések jórészt gyógyíthatók voltak. A mai helyzet Napjainkban a helyzet megváltozott..az orvostudomány fejlődése, az átlagéletkor emelkedése azt eredményezte, hogy egyre több, intenzív osztályokon kezelt, lélegeztetett, immunkompromittált beteget kell kezelnünk. Az antibiotikumok azonban nemcsak az infekciós kórképek gyógyítására használatosak, de elképzelhetetlen, effektív antibiotikumok nélkül az eredményes szívsebészeti, transzplantációs, autoimmun betegségek, mint a rheumatoid artritis, a vérképzőszervi rákok kezelése. A demográfiai változások, a várható élettartam kitolódása, a krónikus betegségekkel élők számának növekedése mind-mind szükségessé teszik az antibiotikumok használatát. A helyzet a Gram pozitív coccusok tekintetében némileg kedvezőbb, mivel rendelkezünk néhány, még hatásos készítménnyel a methicillin rezisztens Staphylococcus aureusok (MRSA) és a vancomycin rezisztens enterococcusok ellen és a kutatási eredmények is azt sugallják, hogy várható újabb vegyületek bevetése a terápiás rezsimbe (15,17). A Gram negatív bélbaktériumok körében, amelyek egyébként a normál bélflóránknak is tagjai, olyan mértékű rezisztencia növekedés következett be az elmúlt néhány év során, ami ahhoz vezetett, hogy napjainkban a terápiás lehetőségek köre 2-3 hatásos készítményre Az ember és a baktériumok kapcsolata az antibiotikumok korában korlátozódik. Gondoljunk csak az extendált spektrumú β-laktamáz (ESBL) termelő Klebsiella pneumoniae és E. coli világméretű elterjedésére, melyekkel szemben a harmadik generációs cephalosporinok elvesztették hatékonyságukat. Az utolsó vonalbeli készítmény a karbapenemek csoportja maradt, mellyel a súlyos kórképek, a nosocomialis infekciók még kezelhetőek voltak. Napjainkra kialakult a karbapenemekkel szembeni rezisztencia, és különböző mechanizmusok révén (KPC, MBL, VIM, NDM-I, OXA 48) rohamosan terjed világszerte, köszönhetően a migrációnak és különösképpen az egészségügyi turizmusnak. Nem maradt más a terápiás lehetőségeink közül, mint visszanyúlni a már csaknem feledésbe merült régi antibiotikumainkhoz, mint a colistin, a co-trimoxazole és a fosfomycin (2,3,4,9,16). Az antibiotikumok használata A fejlett civilizációkban alig találunk embertársaink között olyat, aki élete folyamán ne szedett volna antibiotikumot valamilyen, olykor banális megbetegedésre. Minden adag beszedett antibiotikum előnyt jelent annak a kisszámú baktérium populációnak, amely túléli a kezelést. Az antibiotikumok minél szélesebb körű használata sokszor indokolatlanul növeli a kiszelektálódott, túlélni képes rezisztens egyedek számát (1,5). Retrospektív felmérések bizonyítják, hogy az életünk során elszenvedett fertőzések szignifikánsan emelik a védelmet a rosszindulatú megbetegedésekkel szemben, hiszen az immunrendszerünk évtizedek múlva is emlékszik a sikeresen megvívott harcra (13). A mértéktelen és indokolatlan antibiotikum fogyasztás azt eredményezte, hogy világméretekben drámaian elszaporodtak, és kisebb nagyobb járványokat okoznak olyan baktériumok, amelyek ellen nem rendelkezünk egyetlen hatásos szerrel sem. Az okok Számos ok vezetett a rezisztens baktériumok világméretű elterjedéséhez, de azt megállapíthatjuk, hogy a fő szerepet az antibiotikumok túlzott használata játssza, úgy a humán, mint az állatgyógyászat, állattenyésztés területén. Ezek a baktériumok jelen vannak mind a közösségekben, mind a kórházakban, sőt az élelmiszer lánc, a kontaminált kéz segítségével az egészséges emberek és 2. ábra: Az antibiotikumok felfedezése időrendben (Forrás:Silver L.L.: Challenges of Antibacterial Discovery, Clin. Micr. Rev., 24, , 2011) 12

13 az állatok körében is. Keveredve az érzékeny társaikkal, potenciális veszélyt jelentenek egy esetleges betegség, csökkent immunvédekezési állapot esetén (1,8) (3. ábra). 3. ábra: 19 európai ország állatgyógyászati vonatkozású antibiotikum felhasználása (Forrás: Sales of Veterinary Antimicrobial Agents in 19 EU/ EEA Countries in European Agency) A baktériumok számára az antibiotikum egy külső szelekciós tényező, azok az egyedek tudnak túlélni, szaporodni, amelyek képesek adaptálódni az új környezethez. Olyan antibiotikumot kell választanunk a betegségek leküzdéséhez, amely a saját immunrendszerünkkel karöltve elpusztítja a kórokozókat és a szervezetünk ismét egészséges lesz. Az antibiotikumok szedésével azonban nemcsak a kórokozók pusztulnak el, hanem azok az úgynevezett jó baktériumok is, amelyek a normál flóránk tagjai. Ezek védik a bőrünket, tápcsatornánkat, segítik a szervezetünk normál működését, a szervezet számára szükséges anyagok lebontását, felszívódását. A jó baktériumok anyagcsere termékeikkel olyan miliőt teremtenek, amely a pathogén baktériumok számára kedvezőtlen, és ezzel védik szervezetünket (5,11). Fontos szociológiai kérdés annak megválaszolása, hogy az emberek miért nem félnek a drámaian növekvő antibiotikum rezisztenciától, ami a legnagyobb pandémiával világjárvánnyal fenyeget. Nem világos, hogy miért kapott oly nagy nyilvánosságot például a H1-N1 micro-pandemia és miért olyan nehéz az egészségügyi hatóságokat és a kormányokat motiválttá tenni, hogy szigorú intézkedéseket, szabályokat állítsanak fel a már ma is nagyságrendekkel pusztítóbb és fenyegetőbb multirezisztencia terjedésével szemben. Európában az ECDC adatai szerint évente ember közvetlen halálát okozza valamilyen multirezisztens baktérium által kiváltott fertőzés (1,7). Megoldások Hogyan óvhatjuk meg antibiotikumainkat a jövő számára? A legfontosabb eszköz ma a kezünkben a szél- Az ember és a baktériumok kapcsolata az antibiotikumok korában eskörű felvilágosítás, az infekciókontroll hatékonyságának emelése, a fertőző betegek izolálása, a kézhigiéné teljes körű kiterjesztése. Azokban az országokban, ahol sikeres infekciókontrollt vezettek be a multirezisztens baktériumok rapid terjedésével szemben, például a methicillin rezisztens Staphylococcus aureus (MRSA) előfordulása stagnált vagy csökkent. Meg kell tanulnunk az antibiotikumokkal való sáfárkodást (stewardship), ezzel aktívan védhetjük meglévő hatóanyagaink alkalmazhatóságát (3,4,6,10). Használni és fejleszteni kell a diagnosztikát, ami segít az oki terápia alkalmazásában, akkor és olyan dózisban adjunk antibiotikumot, ahol és amilyen dózisban szükséges. Bízhatunk abban, hogy a felgyorsított kutatás-fejlesztések egy sikeres, új vegyület felfedezésével járnak majd. A vakcináció bizonyára a legígéretesebb megelőzési mód, de relatív kevés számú baktérium ellen alkalmazható. Előrehaladott vizsgálati fázisban van a Staphylococcus aureus és a Clostridium difficile elleni vakcina kifejlesztése (18). Befejezésül álljon itt egy példa az orvosától egy banális vírus infekcióra antibiotikumot követelő beteg, az influenzaszerű tüneteket antibiotikummal kezelő kolléga számára tanulságul: A Clostridium difficile napjaink rettegett kórokozója. Bár a normál bélflórában is előfordul, jelentősége akkor növekszik meg, ha a védő szerepet betöltő baktériumflóra egy antibiotikum szedését követően sérül. Ekkor ez a baktérium elszaporodva súlyos, olykor fatális kimenetelű tüneteket vált ki. Bár rendelkezünk hatásos antibiotikummal ellene, de a terápiát követően nagyon gyakori a recidíva. A gyógyítás ma alkalmazott leghatásosabb eszköze az egészséges normál flóra viszszatelepítése széklet transzplantációval (12). Irodalomjegyzék 1. Carlet, J., Jarlier, V., Harbarth, S. et al.: Ready for a World Without Antibiotics? The Pensieres Antibiotic Resistance Call to Action. Antimicr. Resist. Inf. Cont., 1, 11, Carlet J., Mainardi J.L: Antibacterial agents: back to the future. Can we live with only colistin, co-trimoxazole, and fosfomycin. Clin. Microbiol. Infect., 18(1), 1-3, Chan M.: Antimicrobial Resistance in the European Union and the World. World Health Organization, amr_ /en/index.html, Davos Economical Forum Global Risks Eighth Edition Section 2. The Dangers of Hubris on Human Health 5. ECDC Antimicrobial resistance surveillance in Europe 2012 ( 6. European Centre for Disease Prevention and Control: EARS-Net database 7. Fahey T., Stocks N., Thomas T.: Systematic review of the treatment of upper respiratory tract infection. Arch. Dis. Child., 79(3), ,

14 8. Grave K., Torren-Edo J., Mackay D.: Comparison of the sales of veterinary antibacterial agents between 10 European countries. J. Antimicrob. Chemother., 65, , Gupta N., Limbago B.M., Patel J.B. et al.: Carbapenem-resistant Enterobacteriaceae: epidemiology and prevention. Clin. Infect. Dis., 53, 60-67, Huttner B., Harbarth S.: Antibiotics are not automatic anymore - The French national campaign to cut antibiotic overuse. PLoS Med, 6, e London N., Nijsten R., Mertens P. et al.: Effect of antibiotic therapy on the antibiotic resistance of faecal Escherichia coli in patients attending general practitioners. J. Antimicrob. Chemother., 34(2), , Nagy G. Gy., Várvölgyi Cs., Paragh Gy.: Életet veszélyeztető, terápia refrakter Clostridium difficile fertőzés okozta pseudomembranosus colitis sikeres kezelése széklettranszplantációval Orv. Hetil., 153, , 2012 Az ember és a baktériumok kapcsolata az antibiotikumok korában 13. Pechére J.C.: The intelligent microbe. Publisher, Piddock, L.J.V.: The Crisis of No New Antibiotics - What is the Way Forward? Lancet Infect. Dis., 12, , Powers J.H.: Antimicrobial drug development - the past, the present, the future. Clin Microbiol Infect, 10(Suppl 4), 23-31, Read R.C., Cornaglia G., Kahlmeter G.: European Society of Clinical Microbiology and Infectious Diseases Professional Affairs Workshop Group: Professional challenges and opportunities in clinical microbiology and infectious diseases in Europe. Lancet Infect. Dis., 11, , Shai A.: Beginning and possibly the end of the antibiotic era. J. Paed. Child Health, 49(3), E179-E182, Spellberg B., Daum R.: Development of a vaccine against Staphylococcus aureus. Semin. Immunopathol., 34(2), , 2012 Megrendelő lap (Focus Medicinae) Alulírott, postai úton megrendelem a Focus Medicinae című kiadvány számát,... példányban 990,- Ft + 5% Áfa/pld. áron. Megrendelő neve: Címe: Megrendelését az alábbi címre kérjük elküldeni: Dursusz Bt Budapest, Szepesi u. 24. Telefon/Fax: dursusz@mail.datanet.hu 14

15 Táptalajok a gyógyszeriparban a gyógyszerkönyvi harmonizáció után Táptalajok a gyógyszeriparban a gyógyszerkönyvi harmonizáció után Dr. Nagy Katalin PannonPharma Kft., Pécsvárad Összefoglalás: A gyógyszerkönyvi harmonizációt követően a gyógyszeriparban azonos táptalajokat használunk a mikrobiológiai vizsgálatok elvégzéséhez. Jelen cikk foglalkozik a táptalajok csoportosításával, készítésével, sterilezésével, tárolásával, és a felhasználás előtti teendőkkel. A gyógyszerkönyv meghatározza a mikrobiológiai vizsgálatok körét, a szükséges táptalajokat. A közlemény rávilágít néhány táptalaj szelektivitásának okára. Rövid telepmorfológiai jellemzés ad, bemutat néhány, biokémiai vizsgálathoz használt táptalajt. A bemutatott ábrák saját vizsgálatok dokumentációjából származnak. Kulcsszavak: táptalaj, sterilezés, Tripton szója- Sabouraud dextróz-, Mannit só-, Cetrimid-, XLD-, VRBLD-, MacConkey agar A táptalajok összetétele A táptalajoknak tartalmazniuk kell mindazokat az anyagokat, amelyekre a mikroorganizmusoknak szükségük van, és amelyeket maguk szintetizálni nem tudnak. A táptalajok tartalmaznak feltétlenül szükséges komponenseket: Víz: A víz az élő szervezet alapvető komponense, szerepet játszik minden élőlény anyagcsere folyamataiban. A táptalajokban lévő víz a mikroorganizmusok számára, mint környezeti tényező is nélkülözhetetlen. A táptalajok készítéséhez egyszer-desztillált vizet kell használni. Szén és energiaforrás: A táptalajokban a redukált széntartalmú vegyületek kettős célt szolgálnak: egyrészt asszimilatív oxidációs folyamatainak révén energiát nyernek belőle, másrészt ezekből építik fel a mikroorganizmusok saját széntartalmú anyagaikat. Az autotróf mikroorganizmusok képesek a levegő széndioxid tartamát is hasznosítani, a mikrobák döntő többsége azonban kemoheterotróf csoportba tartozik. A számukra hasznosítható szénforrás igen széles skálája mikrobafajonként eltér, és ennek a tulajdonságnak a vizsgálata a mikroorganizmusok azonosításának fontos lépése. A leggyakrabban használt szén és energiaforrások az egyszerű cukrok (glükóz, laktóz, szacharóz stb), a pepton és a húskivonat. (a két utóbbi egyben nitrogénforrás is) Nitrogénforrás: Az élő anyag bioszintéziséhez szükséges szerves vagy szervetlen nitrogén vegyületek. A levegő molekuláris nitrogéntartalmát csak néhány baktériumfaj képes hasznosítani (Rhizobium, Azotobacter fajok). A különböző nitrogénforrások eltérő hasznosíthatósága hasonlóan a szénforrásokhoz diagnosztikai célra használható. A leggyakrabban használt szervetlen nitrogénforrások az ammónium, nitrit és Summary: As a result of the pharmacopoeial harmonization, the same culture media are used for microbiological tests in the pharmaceutical industry. Here, this article concerns with the types, preparing, sterilizing, storing and prior to use handling of the culture media. The pharmacopoeia describes the microbiological test and the culture media needed for them. It describes the cause of selectivity of certain media. It shortly describes colony morphology characterization and introduce some media used for biochemical assays. Figures presented are from documentation of own studies. Keywords: culture media, sterilizing, Tryptone soy-, Sabouraud dextrose-, Mannitol salt-, Cetrimide-, XLD-, VR- BLD-, MacConkey agar nitrátsók, szervesek pedig a hús-kivonat, természetes fehérjék, peptonok, triptonok, aminosavak. Ásványi anyagok: Fontos szerepet játszanak egyrészt a sejtek ozmotikus nyomásának kialakításában a sejthártya aktív transzportfolyamatai révén, valamint kofaktorként az enzimaktivitás szabályozásában. A feltétlenül szükséges komponensek mellett, a táptalajok tartalmaznak feltételesen szükséges táptalajkomponenseket is, ilyenek: Vitaminok, biosz anyagok: A különböző anyagcsere folyamatokban igen kis mennyiségben szükséges anyagok, amelyeket a mikroorganizmusok nem képesek előállítani. Ezek az anyagok elsősorban koenzimként játszanak szerepet az anyagcserében. A baktériumoknak zsírban oldódó vitaminokra és C-vitaminra nincs szükségük. A legtöbb baktérium képes a B-vitamint is szintetizálni, azonban amelyek nem, azoknak ezeket készen kell kapniuk. A laboratóriumi gyakorlatban legáltalánosabban használt komplex vitaminforrás az élesztőkivonat. Szervetlen és szerves hidrogén-donorok és akceptorok: A baktériumok légzési láncában képződő hidrogénionokat felvevő terminális anyagok. Csak akkor szükséges a táptalajhoz adni, ha a táptalajban lévő többi komponens egyike sem képes ezt a funkciót ellátni. Táptalajok csoportosítása összetétel szerint Természetes táptalajok: természetes anyagok felhasználásával készülnek, ezért összetételük pontosan nem definiálható. Ebbe a csoportba tartozik a húsleves, melasz vagy maláta. Félszintetikus tápközeg: összetevőinek egy része olyan természetes anyag, amelynek összetétele nem is- 15

16 Táptalajok a gyógyszeriparban a gyógyszerkönyvi harmonizáció után mert, vagy alkotóinak aránya változó. Ebbe a csoportba tartozik minden olyan táptalaj, amely agart tartalmaz. Szintetikus táptalajok: Minden összetevőjét kvantitatíve és kvalitatíve ismerjük. Hátrányuk, hogy drágák. Táptalajok csoportosítása halmazállapot szerint Folyékony táptalajok: ezekre a táptalajokra jellemző, hogy a különböző tápanyagokat szuszpenzióban, valódi vagy kolloid oldat formájában tartalmazzák. A folyékony halmazállapotú tápközegek közül a természetes vagy fél szintetikus táptalajokat leveseknek nevezzük, a szintetikus táptalajokat pedig tápoldatoknak. Félfolyékony táptalajok is tartalmaznak szilárdító anyagot, de lényegesen kevesebbet, mint a szilárd táptalajok. Szilárd táptalajok: a folyékony táptalajokból származtathatók szilárdító anyagok (agar-agar, zselatin, szilikagél) hozzáadásával. Régebben a zselatin volt a legelterjedtebb szilárdító anyag, ma egyre inkább háttérbe szorul, ami egyrészt igen alacsony olvadáspontjával (35 C) magyarázható, másrészt azzal a ténnyel, hogy a zselatint számos baktériumfaj elfolyósítja zselatin enzime révén. Éppen ezért ma már inkább csak diagnosztikai céllal használjuk. Az agar kétkomponensű gélképző poliszacharid keverék, amelyet egyes tengeri vörösalgákból vonnak ki. Az agar nagy előnye, hogy C-on megdermed, olvadáspontja 98 C. Az agar természetes anyag, összetétele nem definiálható pontosan, csak természetes és félszintetikus táptalajokhoz használható. A szintetikus táptalajokban szilárdító anyagként szilikagélt használnak. A szilárd táptalaj megjelenési formája szerint lehet kémcsőben elkészítve magas vagy ferde agar, Petri-csészébe öntve pedig agar lemez. Táptalajok csoportosítása felhasználás célja szerint Alap táptalaj: Olyan médiumok, amelyek összetételüknél fogva általánosan (de nem univerzálisan) használhatók, a szaporodáshoz szükséges tápanyagokon kívül más speciális anyagot nem tartalmaznak. Elektív táptalajok: Olyan táptalajok, amelyek összetételüknél fogva csak bizonyos mikrobacsoportok minimális tápanyagigényét elégítik ki, így azok a környezetükben élő kísérő mikrobaflórából kiemelhetők. Szelektív táptalaj: Olyan kiegészítő komponenseket tartalmaznak, amelyek egyes mikrobacsoportok szaporodását gátolják (pl. antibiotikumok, festékek, szulfonamidok). Természetesen ezek a táptalajok gyakran tartalmaznak olyan alkotókat is, amelyek a keresett mikrobacsoport szaporodását segítik. A szelektív táptalajok közé tartoznak a módosított ph-jú (erősen savas vagy lúgos) médiumok is. Differenciáló táptalaj: a mikroorganizmusok differenciálására, azonosítására szolgáló táptalajok, amelyek kémiai indikátort, vagy egyéb jelzőrendszert (pl. Durham-féle fermentációs cső) tartalmaznak, amely speciális reakciókat (pl. savtermelést) jelez. Jellemzőjük, hogy egyes komponenseik szabad szemmel is látható reakciót adnak a mikroorganizmusok bizonyos anyagcseretermékeivel vagy enzimjeivel. Speciális táptalajok: különböző vizsgálati céllal öszszeállított, különleges vizsgálatokat szolgáló tápközegek. MF-táptalaj: olyan táptalaj, melyet szűrési technikákhoz fejlesztettek ki. Táptalajok, hígító folyadékok készítése és tárolása: Táptalajok és hígító folyadékok készítéséhez csak kifogástalan minőségű és tisztaságú, bakteriológiai célokra alkalmas alapanyagok használhatók fel. A hőkezelés nélkül felhasználásra kerülő alapanyagokat aszeptikusan kell kezelni. Az alapanyagokat tisztán tartott, száraz, rovaroktól és rágcsálóktól mentes helyiségben kell raktározni. A higroszkópos anyagokat légmentesen zárható edényben kell tárolni. A beméréseket tiszta eszközökkel, analitikai körülmények között kell végezni. A táptalajokat és a hígító folyadékokat csak tiszta, hőálló üvegedényben, rozsdamentes acélból készült vagy hibátlan tűzzománcos edényben szabad elkészíteni. A készítés során az alábbi műveleti sorrendet célszerű követni: az alapanyagok előkészítése, bemérése. Az alapanyagok oldása a receptekben megadott sorrend szerint, állandó keverés közben, ph ellenőrzés, szükség szerint beállítás, kiegészítés végső térfogatra. Táptalajok kiszerelése, sterilezése. A táptalaj, illetve a hígító folyadék ph-mérése hőmérséklet-kompenzációs ph mérővel történjen, a ph beállítását 1 N NaOH-, illetve HCl-oldattal kell elvégezni. Táptalajkészítés (Dehidrált táptalaj) Mérjük be a csomagoláson feltüntetett anyagmenynyiséget, majd adjuk a megfelelő mennyiségű, előzetesen C közé felmelegített víz feléhez. Alaposan keverjük össze, amíg a por fel nem oldódik. A maradék vízzel mossuk le az edény falát, folyamatos keverés közben. A folyamatos keverés megakadályozza az öszszetevőknek az edény falára rakódását. Olyan edényt használjunk, melynek térfogata 2-3-szor nagyobb, mint a táptalaj térfogata. Amennyiben szükséges, a megfelelő oldódás érdekében melegítsük a szuszpenziót. A melegítést közvetlenül, de óvatosan végezzük. Az agart vagy más szilárdító anyagot nem tartalmazó táptalajok (táplevesek és tápoldatok) könnyebben oldódnak előmelegített vízben, de néha forralás szükséges a teljes oldódás eléréséhez. Ezek a készítmények koncentrált szirupot hozhatnak létre, amely leülepszik az edény aljára. Ez a sűrű szirup az edény alján marad, és a melegítés során fennáll a károsodás lehetősége, hidrolízis, karamellizálódás és a ph eltolódás következtében. A zselésítő anyagokat tartalmazó táptalajokat (agarok és lágyagarok) elő kell melegíteni sterilezés előtt. Az agart tartalmazó táptalajokat fel kell forralni, mivel az agar nem oldódik vízben C alatt. Hasznos az agart 5-10-percig előmelegített vízben ázni hagyni, hogy megduzzadhasson és biztosított legyen a teljes oldódás és a megfelelő homogenitás. Célszerű a táptalajokat eltávolítani a hőforrásról, majd amikor a keverék forrni kezd, 16

17 Táptalajok a gyógyszeriparban a gyógyszerkönyvi harmonizáció után állni hagyni és gyorsan újra felforralni. Ezt a műveletet kétszer vagy háromszor meg lehet ismételni folyamatos keverés mellett. Az agar teljes feloldódását a csomók hiánya jelzi az edényben. Helytelen eljárás a táptalajok közvetlen oldása az autoklávban, megváltoztatja a táptalaj tulajdonságait, és gyakran okozza az agar egyenetlen rétegekbe rendeződését, ph csúszást és barnulást. Fordítsunk gondot az elkészítet táptalajok ellenőrzésére, mivel egyes tulajdonságok enyhén megváltozhatnak az elkészítési feltételektől és a felhasznált víz minőségétől függően (pl. szín, ph). Az ellenőrzés nagyon fontos a félfolyékony táptalajok esetében, mivel ezek kis menynyiségű szilárdító anyagot tartalmaznak és az elkészítés módjára is igen érzékenyek. Az ilyen készítményeknél a hűtés módja hasonlóan fontos, mint a melegítés, mivel a túl gyors hűtés, pelyhesedést és zavarosodást okozhat. Ajánlott a lassú és óvatos hűtés. Különösen figyeljünk azoknak a táptalajoknak a készítésénél, melyeknek a ph-ja 5 alatt van, mivel hidrolízis léphet fel, és elveszítheti a gélképző tulajdonságait. Ezekben az esetekben a szükségtelen hevítést el kell kerülni. Sterilizálás A dehidrált táptalajok dobozán feltüntetésre kerülnek a sterilizálásra vonatkozó előírások, melyek 1 liter táptalajra vonatkoznak. Nagyobb térfogatok esetében az autoklávozás módját és idejét módosítani kell. Az auto kláv helyes működésének ellenőrzéséhez szükséges alkalmazni a kémiai vagy biológiai indikátorokat. A táptalajok megváltozásának egyik fő oka a túlhevülés, kerülni kell a nagy térfogatokban és hosszú ideig végzett hőkezelést. Ügyeljünk arra, hogy a sterilezési idő leteltével hagyjuk a hőmérsékletet C-ra hűlni a táptalaj kivétele előtt, ezzel elkerülve a nagy hőmérséklet-ingadozást. A hideg vizes hűtés széles körben elterjedt, ez a módszer nem megfelelő, agart tartalmazó táptalajok esetében, mivel pelyhesedést és zavarosodást okozhat. A sterilezéshez használt edényekben viszonylag nagy légteret kell hagyni, hogy felhabzásra lehetőség legyen. Ha csavaros kupakos edényeket használunk, akkor a zárókupakokat félig rácsavart állapotban kell hagyni, hogy a külső és a belső nyomás kiegyenlítődhessen. Az edényeknek kémiailag inaktívnak kell lennie, hogy ph változás ne következzen be. Ilyen szempontból legalkalmasabb a boroszilikát üveg használata. Ügyeljünk a szénhidrátokat tartalmazó táptalajok sterilezésére, 115 C 20 perc alkalmas a sterilezésre, így elkerüljük a táptalajok színének besötétedését. Forgalomba kerültek, olyan táptalajok, melyek szelektív anyagokat tartalmaznak. Ezek sterilezése nem szükséges. Ezek elkészítése gyorsabb, mivel felhasználásra készen állnak közvetlen oldódás után. Ezek a készítmények nem túl stabilak, ugyanakkor elkészítésük gyors és könnyű, így mindig csak a közvetlen felhasználásra kerülő mennyiséget készítsük el belőlük. A már steril táptalajokhoz történő adagolásnál ügyelni kell arra, hogy az adalékokat előzőleg sterilezni kell. Az adalékanyagok nem hőstabilak ellenkező esetben már hozzá lennének adva a dehidrált készítményhez, így hozzáadásuk előtt a táptalajt C-ra le kell hűteni. Ezen a hőmérsékleten az adalékanyagok nem károsodnak, és még biztosított a megfelelő keveredés. Az adalékolás után a táptalajokat mérjük szét végső kiszerelési egységeibe, hiszen ezeket az anyagokat újramelegíteni nem szabad! Kész táptalajok tárolása A tárolást végezzük 4-8 C hőmérsékleten, hűtőszekrényben. Tárolás időtartama 4-6 hét. Ettől eltérni csak abban az esetben lehet, ha validáljuk a tárolási időtartamot. Tárolás módja: végső kiszerelési egységekben tároljuk a táptalajokat és tápoldatokat (Petri-csésze, kémcső rugós kupakkal lezárva, csavaros kupakos laboratóriumi üvegek) A hűtőszekrények monitorozása napi rendszerességgel szükséges, a mért adatokat erre a célra rendszeresített formanyomtatványon kell rögzíteni. Mérsékelt hűtéssel általában meghosszabbíthatjuk a tárolás időtartamát, de felhívom a figyelmet arra, hogy a hűtéssel csökken a környezet páratartalma és ezzel egyidejűleg megnő a kiszáradás veszélye. Petri-csészékben történő tárolás esetében az alábbiakat vegyük figyelembe: Hűtsük le a táptalajt azonnal a megszilárdulás után, miközben kontroll inkubálást végzünk a táptalaj sterilitásának vizsgálatához. Ha a táptalajt hosszú időn keresztül kell tárolni, akkor a Petri-csészéket szigeteljük le vízálló fóliával. Amennyiben lehetőség van rá, tegyük az anyagot zárható dobozba. Pl. Petri-csésze-tartó dobozba. Amennyiben csak néhány napig van szükség a tárolásra, elegendő a Petri-csészéket nejlon zacskóba csomagolni, ezzel segítjük elő a kiszáradás megelőzését, a csomagba tegyünk szilikagélt. Ügyeljünk arra, hogy a Petri-csészéket mindig lefelé fordítva tároljuk. A kondenzálódó vízzel fellépő fertőződés minimalizálható a táptalajnak a lehető leghidegebb állapotában történő Petri-csészébe adagolásával. Táptalajok kivétele, kezelése feldolgozás előtt Feldolgozás előtt pár órán keresztül hagyjuk állni a Petri-csészéket szobahőmérsékleten, ezzel lehetővé válik a bepárásodott edények kitisztulása, felmelegedése, és így elkerüljük a növekedés késői megindulását vagy a teljes sikertelenséget. A kész tárolt táptalajok, melyek a kiszáradás jeleit mutatják, nem használhatóak fel. A kiszáradást nagy mennyiségű kicsapódott víz vagy a folyékony táptalajok esetében jelentős térfogatcsökkenés, besűrűsödés, illetve csapadékképződés jelzi. Szilárd táptalajok esetében összehúzódás vagy csapadékképződés tapasztalható. Nagyon száraz felületű Petri-csészék vagy azok, melyek színe megváltozott, nem használhatóak fel. Szilárd táptalajok megolvasztása Amennyiben nincs arra lehetőség, hogy a végső kiszerelési egységben tároljuk a táptalajokat, lehetséges 17

18 Táptalajok a gyógyszeriparban a gyógyszerkönyvi harmonizáció után azoknak az újra olvasztása. Kivételt képeznek azok a táptalajok, melyeknek ph-ja 5 vagy ennél kevesebb. Táptalajok megolvasztásánál vegyük figyelembe, hogy az újraolvasztást végezzük vízfürdőben vagy autoklávban, időtartama ne haladja meg a 30 percet, ne alkalmazzunk közvetlen hőforrást. Az újraolvasztott táp-talajokban csapadékképződés, sötétedés léphet fel, ha folyékony állapotban tartjuk 1 óránál hosszabb időn keresztül C között. Helytelen regenerálás következményei Változás, jelenség ph csúszás Elégtelen feloldódás Elégtelen zselésedés Puha gél Sötétedés A növekedési vagy a differenciálási képességek elvesztése Lehetséges okok Túlmelegítés, melynek okai: - nem megfelelő víz - kémiailag szennyezett edények - túlzott sterilezés - nem megfelelő tárolás - ismételt újraolvasztás - nem megfelelő víz - elégtelen keverés, ázás - túl kicsi edény - nincs agar az oldatban - nem megfelelő homogenizálás - ismételt újraolvasztás, túlmelegítés - kevés anyag bemérése a víz térfogatához képest - túlmelegítés - ismételt újraolvasztás - túlmelegítés - elégtelen keverés - receptúra megváltoztatása az oltóanyag miatt Táptalajok a gyógyszeriparban Neutralizáló folyadék alkalmas az antimikrobiális anyag semlegesítéséhez. Amennyiben a szaporodás gátolt, az eredmények érvényességének biztosítása céljából módosítjuk az adott mikroorganizmus szám meghatározó eljárást. Az eljárást módosíthatjuk: A hígító folyadék vagy a táptalaj térfogatának növelésével, specifikus vagy általános semlegesítő szerek elegyítésével a hígító folyadékban, membránszűréssel vagy a fenti eljárások kombinálásával. A Ph. Eur. a Neutralizáló folyadékot ajánlja nem steril termékek mikrobiológiai vizsgálatához. Összetétele megfelel a biológiai Zavaró anyagok semlegesítéséhez ajánlott semlegesítőszerek (4) Zavaró anyag Glutáraldehid, higanyvegyületek Fenolok, alkoholok Aldehidek, szorbátok Aldehidek Kvaterner ammónium vegyületek (KAV), para-hidroxi-benzoátok, bisz-biguanidok KAV, Jód, parabének Higanyvegyületek Higanyvegyületek, halogének, aldehidek EDTA (edetátok) Lehetséges semlegesítő Na-hidrogénszulfit (nátrium-biszulfit) Hígítás Glicin Lecitin Poliszorbátok Tioglikolátok Tioszulfátok Mg 2+ vagy Ca 2+ ionok Gyógyszerkönyvi vizsgálatok és táptalajok (3) Termékek csoportosítása Előírt vizsgálat A vizsgálathoz szükséges táptalajok és levesek Orális alkalmazásra szánt nem vizes és vizes készítmények Szájnyálkahártyán-, fogínyen-, bőrön-, nasalisan-, fülészetben való alkalmazás Inhalációs alkalmazásra TAMC CFU, TYMC CFU Escherichia Coli TAMC CFU, TYMC CFU Staphylococcus aureus Pseudomonas aeruginosa TAMC CFU, TYMC CFU Escherichia Coli Epeálló Gram-negatív baktériumok Tripton szója agar, Sabouraud dextróz agar TSB, MacConkey tápleves, MacConkey agar Tripton szója agar, Sabouraud dextróz agar TSB, Mannit só agar TSB, Cetrimid agar Tripton szója agar, Sabouraud dextróz agar TSB, MacConkey tápleves, MacConkey agar Mossel tápleves, Kristályibolya agar Ph. Eur. külön rendelkezése olyan természetes (állati, növényi vagy ásványi) eredetű kiindulási anyagokat tartalmazó orális gyógyszerformákra, amelyeknek mikrobiológiai előkezelése nem lehetséges, és amelyekre az illetékes hatóság elfogadja, hogy a kiindulási anyag TAMC CFU értéke meghaladja a 10 3 CFU/g vagy CFU/ml értéket. TAMC CFU, TYMC CFU Escherichia Coli Epeálló Gram-negatív baktériumok Salmonella Staphylococcus aureus Tripton szója agar, Sabouraud dextróz agar TSB, MacConkey tápleves, MacConkey agar TSB, Mossel tápleves, Kristályibolya agar TSB, Rappaport Vasiliadis tápleves, XLD agar TSB, Mannit só agar 18

19 Táptalajok a gyógyszeriparban a gyógyszerkönyvi harmonizáció után vizsgálatok általános hígítójának, poliszorbát és lecitin hozzáadásával neutralizáló anyagként. Semlegesítőszerek szükségesek a zavaró anyagok kiküszöbölésére, melyek közül az alábbiakat ajánlja a gyógyszerkönyv. A semlegesítőszereket aszeptikus körülmények között adjuk a sterilizált és 50 C-ra hűtött folyadékhoz. Ha nem találunk megfelelő semlegesítő módszert, akkor feltételezhető, hogy a beoltott mikroorganizmus izolálása azért nem sikerült, mert maga a termék mikrobaölő aktivitással rendelkezik. Ilyen esetben a vizsgálatot azzal a legnagyobb hígítással végezzük, amely a mikroorganizmus növekedésének és a specifikus elfogadási követelményeknek megfelel. Tripton szója tápleves Mint általános célú készítmény, a legtöbb aerob és fakultatív aneaerob baktérium növekedését segíti, még az igényesebb fajokét is (1. ábra). 2. ábra: Candida albicans Tripton szója agaron könnyen felismerhető. Kiegyensúlyozott, jó tápértékű, fermentáló szénhidrátok nélkül, így kiválóan alkalmas törzsfenntartásra. 1. ábra: Tripton szója tápleves (jobboldal) negatív kontroll. Vizsgálati minta (baloldal), a táptalaj zavarosodása a mikroorganizmusok elszaporodását jelzi Sabouraud dextróz agar (SDA) A táptalajt gombák számlálására és tenyésztésére használjuk. A szelektivitás az alacsony ph-nak és a magas glukóz (40 g/l) koncentrációnak köszönhető, amely a viszonylag alacsony hőmérsékletű inkubálással együtt (20-25 C) kedvez a gombák növekedésének, és gátolja a baktériumok szaporodását. Pepton összetételét úgy dolgozták ki, hogy a gombákat el tudja látni minden szükséges nitrogénezett tápanyaggal. Mivel a Sabouraud táptalaj erős sav reakciója részlegesen hidrolizálja az agart, csak a szükséges mennyiséget érdemes elkészíteni, és kerüljük az újraolvasztását (3. ábra). Tripton szója agar (TSA) A vizsgált mintában az összes életképes mikrobaszám számlálásához valamint tenyésztéséhez használjuk. A táptalaj növényi és állati eredetű peptonokat tartalmaz, melynek használata széles körben elterjedt. Összetételénél fogva sokféle mikroorganizmus kimutatására alkalmas. Még az igényesebb fajok, mint a Neisseria, Listeria, vagy a Brucella is növekszik rajta (2. ábra). A TSA felhasználásának egyéb területei Vér hozzáadásával a táptalaj tökéletesen meghatározható hemolízis zónákat eredményez, míg a nátrium-klorid tartalomnak köszönhetően megakadályozza az erytrocyták lízisét. A legtöbb, a Staphylococcusok megkülönböztetésére és azonosítására szolgáló tesztet el lehet végezni ezen a táptalajon, megfelelő adalékanyagok hozzáadásával. Az élesztők, különösen a Candida fajok, karakterisztikus telepeket képeznek. A kromogén Pseudomonas gyakran pigmenteket termel, ezért 3. ábra: Vegyes flóra Sabouraud dextróz agaron (fonalas és tömlős gombák) 19

20 Táptalajok a gyógyszeriparban a gyógyszerkönyvi harmonizáció után Amennyiben nagyobb szelektivitásra vagy differenciálásra van szükség, inhibitort, illetve indikátort lehet sterilizálás után hozzáadni. Penicillin IU/liter: megnöveli a táptalaj szelektivitását a legtöbb baktérium növekedésének gátlásával. Penicillin IU/liter és Streptomycin U/l: élesztőgombák izolálására használható. Kolisztin 8 mg/l, Novobiocin 0, 1 mg/l és Ciklohexemid 30 mg/l: Candida izolálására szolgál. Réz-szulfát 500 mg/l, Kristályibolya 2 mg/l és Brillantzöld 5 mg/l: jelentős baktériumgátlás érhető el. Trifenil-tetrazolium-klorid (TTC) 100 mg/l: a Pagano-Levin táptalaj alapja a nem pigmentált Candida albicans izolálásához, más patogén élesztőgombák mellett, melyek rózsaszín telepeket képeznek. (16) A gyógyszeriparban a TSA és a SDA felhasználása széleskörű. Alkalmazzuk a higiénés vizsgálatoknál, felületek, személyek, levegő ellenőrzésénél, a beérkező primer csomagolóanyagok, alapanyagok, granulátumok, lose és végtermékek vizsgálatánál. Mossel tápleves és Kristályibolya neutrálvörös epe laktóz dextróz agar A táptalajokat Epeálló Gram-negatív baktériumok vizsgálatatához használjuk. Az epesók és a kristályibolya biztosítják a szelektivitást, mert gátolják a Gram-pozitív mikroorganizmusok növekedését. A minták dúsításához Mossel táplevest (EE tápleves) használunk. A tápleves glükóz tartalma alkalmassá teszi az Enterobaktériumok dúsítására, kimutatására, legyenek azok gáztermelő vagy nem gáztermelő változatok. Megfelelő inkubációs idő (18-20 óra) és hőmérséklet (35-37 C) után oltsuk tovább szilárd táptalajra, Kristályibolya neutrálvörös epe laktóz dextróz agarra. A telepek megjelenési formái: A telepek átmérője sűrűségétől függően 2-5 mm között változhat. Az Enterococcusok megjelenhetnek kis rózsaszín telepek formájában. A laktóz fermentáló Enterobaktériumok sötétvörös színt vesznek fel, tiszta zónával a telepeik körül, míg a laktózt nem fermentáló baktériumok színtelen telepeket képeznek (4. ábra). 4. ábra: Epeálló Gram-negatív baktérium Kristályibolya agaron MacConkey G tápleves Tápleves Coliformok dúsítására. Ez a tápleves a Mac- Conkey tápleves módosítása, melyben a neutrálvörös indikátort kicserélték, brómkrezol bíbor indikátorral, a Ph. Eur. nak megfelelően. MacConkey agar Szelektív és differenciáló táptalaj Coliformok kimutatására, izolálására és számlálására. Az epesók és a kristályibolya biztosítja a szelektivitást. Gátolja a Gram-pozitívok növekedését és a Proteusok rajzását, a nem tápanyag igényes Gram-negatívok növekedését támogatja, laktóz tatalmánál fogva (8) (5. ábra). 5. ábra: E. coli MacConkey agaron Rappaport Vasiliadis tápleves Folyékony táptalaj, mely a Salmonella dúsítására szolgál. A táptalaj alacsony ph-ja (5,2) növeli a szelektivitást. XLD agar A xilóz-lizin-dezoxikolát táptalaj enyhén szelektív, nagyon alkalmas patogén Enterobaktériumok kimutatására. A xilóz, laktóz vagy a szacharóz fermentálása a táptalaj savasodását okozza és ezt az indikátor színének sárga változása jelzi a telepek körül. Ez a szín eltűnik 24 óra után, tehát a leolvasást az inkubálás megkezdése után óra között el kell végezni. A tioszulfátból történő kénhidrogén termelést könnyen ki lehet mutatni, mivel a telepek sötétre színeződnek a vasszulfid csapadék miatt. A lizin dekarboxileződését szintén meg lehet figyelni a táptalajon, mivel lúgosodást okoz, mely az indikátor színét pirosra változtatja. A Salmonella fajok fermentálják a xilózt, de az gyorsan elfogy és ekkor a táptalaj lúgosodása a lizin dekarboxilezése miatt gyorsan elfedheti a reakciót. A Shigella és a Salmonella közötti különbség az, hogy utóbbi telepei sötétek lesznek a vasszulfid csapadék következtében. Más típusú Enterobaktériumok nem mutatják ezt a jelenséget, mivel a laktóz és a szacharóz fermentálása miatt létrejött savfelhalmozás akkora, hogy megakadályozza dekarboxilezés 20