IDEGRENDSZERI TOXICITÁS KIMUTATÁSÁRA ALKALMAS VIZSGÁLATI MÓDSZEREK

Átírás

1 IDEGRENDSZERI TOXICITÁS KIMUTATÁSÁRA ALKALMAS VIZSGÁLATI MÓDSZEREK Világi Ildikó, Varró Petra, ELTE, Élettani és Neurobiológiai Tanszék, Budapest

2 Neurotoxikológiai vizsgálatok A neurotoxikológiai vizsgálatok során különböző technikákat alkalmazhatunk a természetes és az ember által előállított toxikus anyagok (mérgek) idegrendszeri hatásának elemzésére. Az expozíció -akut vagy krónikus A hatás -reverzibilis vagy irreverzibilis A változások -működési vagy morfológiai változások Alkalmazott vizsgálati technikák csoportjai: - biokémiai, molekuláris biológiai vizsgálatok - morfológiai vizsgálatok - elektrofiziológiai vizsgálatok - képanalízises vizsgálatok - viselkedési vizsgálatok

3 Vizsgálati szintek, modellek magas - in vivo - szerű komplexitás -emberi idegrendszerre vonatkoztathatóság mértéke alacsony teljes agy agyszelet aggregátum primer tenyészet egyedi sejtek

4 Hatásnak kitett sejtkomponensek Szinaptikus- és egyéb membrán területek Másodlagos hírvivők, intracelluláris enzimek

5 Hatásnak kitett sejtkomponensek toxikus hatás toxikus hatás toxikus hatás toxikus hatás toxikus hatás toxikus hatás

6 Molekuláris biológiai technikák Transzmitter és receptormennyiség vizsgálatok -HPLC mérések -receptorkötési tesztek -szinaptoszóma aktivitás mérés Gén expressziós vizsgálatok - Korai gének aktiválódása, géntermék megjelenése (fos-, jun gének) nukleinsav és fehérje kimutatás - Stressz-fehérjék kimutatása (HSP-72 hősokkfehérjék, ubiquitin) - Gliális fehérjék meghatározása (gliális aktiváció sérüléskor GFAP, laminin)

7 Neurotoxicitás meghatározása MTT festés fluoro JadeB jelölés MTT tetrazólium só, élő sejtekben színtelen anyag színes termékké alakítása mutatható ki zöld degenerálódó neuronok fluoro JadeB-vel festve

8 Strukturális változások kimutatása makroszkópikus: -súlymérés -térfogatmérés Súly- és méret meghatározás Morfometriai vizsgálat

9 Strukturális változások kimutatása Különböző mikroszkópos technikák alkalmazásával -fénymikroszkópos (immunhisztokémia, autoradiográfia) -elektronmikroszkópos vizsgálatok Hisztopatológia ANissl-festés az idegszövet festésére elterjedten alkalmazott eljárás (krezil ibolya vagy gallocianin) Golgi festés ezüst impregnációval az idegsejtek jelölődnek Weil-festés a myelinizált axonok alapfestésére Toluidin kék festés az axonburok kimutatására

10 Immunhisztokémiai és citokémiai festések immuncitokémiai vagy immunhisztokémiai vizsgálatokban ellenanyagok segítségével határozhatók meg bizonyos fehérjék mennyiségi vátozásai (enzimek, receptorok) Színes csapadék vagy fluoreszcencia kimutatásán alapul a vizsgálat immunhisztokémia c-fos protein immuncitokémia kettős vagy többes fluor jelölések

11 Elektronmikroszkópos vizsgálatok Szinapszisok elváltozásának kimutatása Axonok degenerációjának kimutatása üres vagy abnormális myelinburkok

12 Működő sejtek tanulmányozása, in vitro modellek Modellek: primer neuronális, idegi őssejt-, esetleg gliasejt tenyészetek kokultúrák (többféle sejttípus) túlélő agyszeletek Mért paraméterek: szövettenyészet elektrofiziológiai vizsgálata elektromos aktivitás sejtpusztulás neurotranszmitter-leadás nyúlványnövekedés túlélő agyszelet preparátum

13 Elektrofiziológiai vizsgálatok Szinte minden elektrofiziológiai módszer használható neurotoxikus hatás kimutatására, molekuláris szinttől a teljes idegrendszer szintjéig. Patch clamp technikák Áramok alapján a csatorna nyitott vagy zárt állapotát lehet megkülönböztetni. Csatorna nyitvatartási idejét, nyitási valószínűségét, frekvenciáját változtathatják bizonyos anyagok.

14 Elektrofiziológiai vizsgálatok Kiváltott potenciálok, szinaptikus átvitel, spontán aktivitás vizsgálata túlélő agyszeleteken Extracelluláris regisztrálás (mezőpotenciálok) -legjobban jellemzett agyterület: hippocampus -plaszticitás, görcskészség vizsgálata pl. ólom LTP, MeHg, EPSP Intracelluláris regisztrálás -egyetlen sejt aktivitásának jellemzése

15 Elektrofiziológiai vizsgálatok In vivo elektrofiziológiai regisztrálás, spontán EEG Akut preparátum (altatott állat) Krónikus elektródok beépítése -Mezőpotenciál mérés pl. LTP -Spontán EEG mérése Piretroid rovarirtószer ismételt adásával kiváltott görcsaktivitás

16 Elektrofiziológiai vizsgálatok In vivo elektrofiziológiai regisztrálás, kiváltott potenciálok Komplex idegi hálózat vizsgálata Sok neurotoxin okoz szenzoros diszfunkciót A jel alakjának, latenciaidejének elemzése Vizuális KP (fényfelvillanás hatására) Hallókérgi KP

17 Elektrofiziológiai vizsgálatok Ingerületvezetési sebesség mérése patkány, nyúl n. ischiadicus pl. organofoszfát rovarirtók csökkentik a vezetési sebességet (demielinizáció)

18 Optikai technikák Feszültségérzékeny festékek festék abszorpciója/fluoreszcenciája a membránpotenciállal változik Ionszenzitív festékek pl. Ca 2+ Sejten belüli Ca 2+ -koncentrációtól függően a festék fluoreszcenciája változik Képalkotó eljárások Pályák, agyterületek morfológiai és funkcionális vizsgálata

19 Viselkedési vizsgálatok Viselkedésvizsgálatok, Irwin-teszt aktivitásvizsgálat főként KIR-en ható szerek gyors tesztelésére reakció kézbevételkor, testtónus, testtartás, járás, éberség, bőr, szőrzet spontán viselkedés (pl. önápolás, hangadás) kóros jelenségek (remegés, görcsök, abnormális járás) reflexek (szemhéj, pupilla, kapaszkodás ferde lemezen, ráhelyezés)

20 Viselkedési, mozgáskoordinációs vizsgálatok Open field (explorációs motilitás, viselkedéselemek) Mozgáskoordináció, egyensúlyozás vizsgálata az útvonal a szorongási szintről is informál

21 Tanulási és memória vizsgálatok klasszikus kondicionálás operáns kondicionálás csillag labirintus Morris vízi labirintus

22 Köszönöm a figyelmet!