APÁTI Á., BRÓZIK A. és MAGÓCSI M. OHII Membrán és Izotópdiagnosztikai Osztály Budapest

Átírás

1 APÁTI Á., BRÓZIK A. és MAGÓCSI M. OHII Membrán és Izotópdiagnosztikai Osztály Budapest Ca 2+ AKTIVÁLTA Raf-1/MEK/ERK1/2 SEJTFIZIOLÓGIAI HATÁSAI A MAPK útvonal aktiválódása fontos szerepet játszik a hematopoetikus sejtek proliferációjában, túlélésében és differenciációjában. Jelen munkánkban egy humán, növekedési hormon függő hemopoetikus sejtet vizsgáltunk (TF-1). Ezekben a korai mielo-eritroleukémia sejtekben a [Ca 2+ ] i megemelkedése a sejtek hormon-független növekedését és túlélését okozta. A sejteket ionomicinnel kezelve a [Ca 2+ ] i mikromoláris nagyságrendbe emelkedett, amely azonban rövid időn belül az alapszintre állt vissza. Ez a magas, lecsengő Ca 2+ jel a Raf-1, MEK és ERK1/2 kináz aktiválódását valamint az Elk-1, transzkripciós faktor gyors foszforilációját és ezáltal a c-fos és egr-1 azonnali korai gének átíródását eredményezte. Az ERK1/2 kináz Ca 2+ indukálta foszforilációja kísérleteink szerint kulcsszerepet játszik a hormon-független növekedésben és túlélésben. Szelektív MEK kináz inhibitorok jelenlétében mind az ERK1/2, Elk-1 foszforiláció, mind a c-fos, Egr-1 expresszió elmarad, és a sejtek rövid időn belül elpusztulnak. A MAPK tartós aktiválódása, amelyet TF-1 sejtben forbol-észterrel, illetve a megemelkedett [Ca 2+ ] i folyamatos fenntartása révén érhetünk el, a sejtek apoptózisához vezet. Fiziológiás sejtválaszok kialakulásában nemcsak a jel megjelenésének, de annak negatív szabályozásának is döntő szerepe lehet. TF-1 sejtekben két olyan Ca 2+ függő folyamatot azonosítottunk, amelyek negatívan regulálják a növekedéshez és túléléshez vezető folyamatokat. A [Ca 2+ ] i átmeneti megemelkedése révén aktivált ERK1/2 foszforilációt a PKC inhibitor BIM megemelte, jelezve, hogy a Ca 2+ indukálta ERK foszforiláció nem PKC aktiváláson keresztül történik, sőt azt bizonyos PKC izoformák gátolhatják is. Hasonlóképpen, a kalcineurin gátlása ciklosporin A val az Elk-1 defoszforilációján keresztül regulálja a transzkripciós faktor aktivitását és ezen keresztül a c-fos és Egr-1 expresszióját. A sejtek hormon-független túlélése egy átmeneti, a fiziológiás stimulusokhoz hasonló [Ca 2+ ] i emelkedés révén is kialakulhat, amely a Raf- 1/MEK/ERK1/2 útvonal gyenge, időben késleltetett aktivációjával jár együtt. Így ezen útvonal szabályozásának tanulmányozása közelebb vezethet a malignus transzformációk megismeréséhez. 30

2 BALAJTHY ZOLTÁN, SZÁNTÓ ATTILA ÉS FÉSÜS LÁSZLÓ DEBRECENI EGYETEM, ORVOS- ÉS EGESZSÉGTUDOMÁNYI CENTRUM, Biokémiai és Molekuláris Biológiai Intézet A SZÖVETI TRANSZGLUTAMINÁZ TRANSZLOKÁCIÓJÁNAK VIZSGÁLATA KÜLÖNBÖZŐ SEJTALKOTÓKBA RETINOIDDAL INDUKÁLT DIFFERENCIÁCIÓ FOLYAMATÁBAN. A szöveti transzglutamináz (ttg) egy olyan multifunkcionális enzim, amely szerepet játszik a sejtproliferáció, differenciáció és sejthalál folyamatában. Az utóbbi időben néhány cikk arról számolt be, hogy a ttg a sejtmagban is lokalizálódhat, ami felvetette a ttg fehérje szerepének és a keresztkötő aktivitás meghatározásának kérdését egy olyan akut promielocitás leukémia sejtvonalban (NB4), amelyik all-transz RA (RA) jelenlétében differenciálódik. Ebben a munkában bemutatjuk, hogy a RA-val indukált differenciáció folyamatában a ttg először a citoszólban, majd a sejtmagban és végül a mitokomdriumban lokalizálódik. A különböző sejtalkotókba transzlokálódó ttg jelenlétét bizonyítottuk aktivitásméréssel, immunbottal és ε(γglutamil)lizin keresztkötés tartalom meghatározással. 5-(biotinamido)-pentilamint felhazsnálva, aminek az aminocsoportjával a ttg γ-karboxamid kötést hoz létre egyes szubsztrátfehérjék glutamil oldallancán, számos fehérjét jelöltünk meg a citoszólban és sejtmagban, amelyek potenciálisan ttg szubsztrátként lehetnek jelen a diffenciálódási folyamatban. Végül bizonyítani kívánjuk, hogy in vivo körülmények között a szöveti transzglutamináz nemcsak a citoszól, de a sejtmag remodellezésében is szerepet játszhat a diffenciáció és az ezt követő sejthalál folyamatában is. 31

3 BELECZ ISTVÁN 1, CAYETANO GONZALEZ 2, JAAKKO PURO 3 és SZABAD JÁNOS 1 1 SZEGEDI TUDOMÁNYEGYETEM, Orvosi Biológiai Intézet 2 EUROPEAN MOLECULAR BIOLOGY LABORATORY, Department of Cell Biology, Heidelberg, Germany 3 UNIVERSITY OF TURKU, Department of Biology, Turku, Finland DOMINÁNS NEGATÍV CITOPLAZMATIKUS DINEIN SZÉTKAPCSOLJA A CENTROSZÓMA ÉS A KROMOSZÓMA CIKLUST, ÉS CENTROSZÓMA KÉPZŐDÉST OKOZ MEG NEM TERMÉKENYÍTETT PETÉKBEN Laborc D a citoplazmatikus dinein nehézlánc gént azonosító domináns negatív nőstény steril mutáció Drosophila melanogasterben. Megtermékenyített Laborc D petékben az első mitótikus osztódási orsó pólusain sok centroszóma alakul ki. Tehát a Laborc D mutáció olyan új citoplazmatikus dinein funkciót azonosít, mely meggátolja az idő előtti centroszóma replikációt a korai embrionális sejtosztódások során. A centroszómák az első és a második mitótikus osztódást követően leválnak a sejtmaghártyákról, és miközben a kromoszóma ciklus leáll, a centroszómák replikációja zavartalanul folytatódik, mint vad típusban. A Laborc D mutáció tehát szétkapcsolja a centroszóma és a kromoszóma ciklust. Meg nem termékenyített Laborc D petékben sok száz centroszóma áll össze egyszerre a petesejt aktivációját követően, bizonyitva a citolazmatikus dinein komplex szerepét egy olyan eddig ismeretlen mechanizmusban, amely meggátolja centroszómák összeszerelődését meg nem termékenyített petékben. 32

4 BENKŐ ZSIGMOND, MISKEI MÁRTON, FENYVESVÖLGYI CSABA, BENESÓCZKI VANDA, SIPICZKI MÁTYÁS DEBRECENI EGYETEM, Genetikai és Molekuláris Biológiai Tsz. PLEIOTRÓP HATÁSÚ GÉNEK SZEREPE A MULTIDROG- REZISZTENCIA KIALAKULÁSÁBAN A napjainkban egyre gyakrabban felbukkanó veszélyes fertőző betegségek, a mezőgazdasági kertevők elleni harc egyik leghatékonyabb eszköze a drogok. A drogokkal szemben azonban könnyen rezisztensé válnak a mikroorganizmusok. Ebben az egyre nehezebbé váló harcban nagy segítséget jelenthet a drogokkal szembeni rezisztencia kialakulásának megismerése. A multidrog-rezisztencia kialakulásának tanulmányozásához egy könnyen kezelhető, genetikailag széles körben vizsgált egysejtű hasadó élesztőt a Schizosaccharomyces pombe t és egy sokak által fogyasztott, széles hatásspektrumú drogot, a koffeint választottuk. A drogokkal szembeni rezisztencia kialakulásának megértését koffeinrezisztens mutánsok vizsgálatán keresztül közelítettük meg. Négy, különböző (caf) génben sérült mutáns részletes genetikai vizsgálata mindenekelőtt rámutatott arra, hogy e gének valóban szerepet játszanak a multidrog-rezisztencia kialakulásába. A klasszikus genetika, élettani vizsgálatok azt igazolták, hogy e gének számos, távolinak tűnő sejtfolyamokban vesznek részt (megnyúlt sejtciklus idő és sejtalak, UVérzékenység, γ-rezisztencia, ph-érzékeny növekedés, sérült meiózis, az éhezés rossz tűrése stb.). E jelenségek a gének pleiotróp hatását bizonyítják, azonban elméleti megfontolások a géntermékek szoros kapcsolatára utaltak. Molekuláris genetikai vizsgálatok feltárták a gének valós funkcióinak egy részét (kiderült, hogy egy tioredoxin reduktázt, AP1- típusú transzkripciós faktort, exportint és egy a magban lokalizált foszfoproteint kódolnak a gének) és igazolták a vélt kapcsolatot. További vizsgálatok megerősítették e gének szerepét a sejtciklus S-M fázisátmenetében és rámutattak az oxidatív stresszben játszott igen fontos funkciójukra. Újabb koffein-rezisztens mutánsok izolálásával szeretnénk a koffein támadási pontjául szolgáló fehérjéket kódoló géneket klónozni. Az adaptív-rezisztencia kialakulásának vizsgálatát e folyamatban sérült mutánsok segítségével nemrégiben kezdtük el. 33

5 BERKI TIMEA, PÁLINKÁS LÁSZLÓ, BOLDIZSÁR FERENC, NÉMETH PÉTER PÉCSI TUDOMÁNYEGYETEM, ÁOK, Immunológiai és Biotechnológiai Intézet GLUKOKORTIKOID INDUKÁLTA THYMOCITA APOPTÓZIS: GENOMIKUS VAGY MEMBRÁNHATÁS? A glukokortikoid hormonok (GC) fiziológiás és farmakológiai dózisban tapasztalható hatásai igen eltérőek. A thymociták érése során is a thymus epithel sejtek által termelt GC nélkülözhetetlen a sejtek túléléséhez a pozitív szelekcióban, ugyanakkor nagydózisú szteroid kezelés az éretlen sejtek apoptózisát okozza. Munkánkban a kétfajta GC hatás molekuláris mechanizmusának elkülönítését tűztük ki célul. Hármas jelöléssel áramlási citometriás módszerrel mértük a különféle thymocita alcsoportok (kettős-, kettős+, CD4+, CD8+) glukokortikoid receptor (GCR) expresszióját és annak változását GC kezelés és a receptor antagonista RU486 és RU43044 kezelés hatására Balb/c egerekben. Ezzel párhuzamosan vizsgáltuk az egyes sejtcsoportok apoptózitát Annexin-V/PI jelöléssel és szabad citoszolikus Ca ++ tartalmát és annak változását GC kezelés hatására. Kezeletlen állatokban az egyes thymocita alcsoportokban eltérő GCR expresziót és citoszolikus Ca ++ szintet mértünk. A kettős+ sejtek alacsonyabb GCR expressziót és citoszolikus szabad Ca ++ szintet mutattak. Egyszeri, nagydózisú GC kezelés hatására az éretlen sejtcsoportok apoptózissal elpusztulnak, egy kis GC rezisztens, kettős+ és CD4+, CD8+ érett sejtcsoport érintetlenül hagyásával. A rezisztens, kettős+ sejtekben magasabb a GCR expresszió, míg az érett sejtekben lecsökken. 15 nap elteltével a beáramló éretlen sejtek kiérésével visszaáll az eredeti sejtösszetétel és a GCR expresszió is. GCR antagonista kezelés nem befolyásolta lényegesen a thymus sejtes összetételét és a sejtek differenciálódását, szelekcióját. Vizsgálati eredményeink alapján úgy tűnik, hogy a thymusban nagydózisú szteroid kezelésre rezisztens sejtcsoportok maradnak, melyek eltérő GCR expressziót mutatnak és aktiválhatóságuk is eltér. 34

6 BOLDIZSÁR FERENC, BERKI TÍMEA PÉCSI TUDOMÁNYEGYETEM, ÁLTALÁNOS ORVOSTUDOMÁNYI KAR, Immunológiai és Biotechnológiai Intézet HYPERGLYKAEMIA HATÁSÁNAK VIZSGÁLATA HUMÁN T- SEJT ÉS MAKROFÁG SEJTVONALAKON Régóta ismert a diabetes mellitusos betegek fokozott fogékonysága különböző fertőzésekre. Ennek hátterében feltételezhető az immunrendszer különböző elemeinek csökkent illetve megváltozott működése, de a pontos ok egyelőre tisztázatlan. Célunk volt in vitro kísérletben bizonyítani, hogy az immunrendszer sejtes elemei megváltozott működéssel reagálnak a környezetben megemelt glükóz koncentrációra. Ehhez Jurkat (humán T-sejtes lymphoma) és THP-1 (humán monocytás leukaemia) sejteket tenyészettünk különböző cukortartalmú tápfolyadékokban egy hétig. Ezután Jurkat sejtekben ionomycinnel illetve monoklonális anti-cd3 antitesttel kiváltott aktivációt vizsgáltuk ionszelektív fluoreszcens indikátor (Fluo-3AM) segítségével áramlási citométeren. A THP-1 sejtekben bakteriális lipopoliszacharid stimulációt követően interleukin-8 termelést mértünk ELISA módszerrel. Eredményeink szerint magasabb glükóz tartalmú tápfolyadékokban tartott Jurkat sejtekben nő a citoszolikus Ca 2+ szint alapállapotban, az aktiválhatóság viszont csökken mind ionomycinnel (nem specifikus sejt aktivátor) mind pedig anti-cd3 monoklonális ellenanyaggal (specifikus T- sejt aktivátor) kontrollokhoz viszonyítva. A megnövelt extracelluláris glükóz koncentráció mellett tenyésztett THP-1 sejtek lipopoliszacharid stimulációt követően csökkent interleukin-8 termelést mutattak a kontrollokhoz képest. Kísérleteink azt mutatják, hogy az in vitro létrehozott hyperglykaemia károsítja mind a T-sejtek, mind pedig a monocyták működését. A pontos biokémiai részletek még nem tisztázottak, az azonban valószínű, hogy az utóbbi években leírt nem specifikus glikáció folyamatának szerepe lehet a sejtek funkciójának romlásában. A megnövelt extracelluláris glükóz koncentráció fokozott glikációhoz vezethet mind a sejtmembránban, mind pedig a jelátviteli fehérjékben, amely magyarázatot adhat a kísérleteinkben megfigyelt eltérésekre. Eredményeink alapján úgy gondoljuk, hogy a diabetes mellitusban fennálló csökkent immunfunkciók hátterében részben a sejten kívüli tér glükóz koncentrációjának megnövekedése állhat. 35

7 BOZSIK ANIKÓ, ENCZI KLÁRA, SIPICZKI MÁTYÁS DEBRECENI EGYETEM, Genetikai és Molekuláris biológiai Tanszék A SCHIZOSACCHAROMYCES JAPONICUS DIMORFIZMUSÁNAK MIKROSZKÓPOS ÉS GENETIKAI VIZSGÁLATA A S. japonicus var. japonicus egysejtű, haploid hasadóélesztőgomba. Életciklusára dimorfizmus jellemző: fiatal telepei hosszúkás, hengeres sejtekből állnak, majd 8-10 nap után szilárd táptalajon a valódi gombákra jellemző, többsejtű hifafonalakat fejlesztenek. Ez az átalakulás érdeklődésre számot tartó jelenség, hiszen a patogén gombák jelentős része is mutat dimorfizmust, ahol gyakran a fonalas alak invazív, azaz a roncsoló hatású forma. Ezért kutatásunk célja a két megjelenési alak tanulmányozása, a közöttük levő különbségek, hasonlóságok felderítése volt. Citológia: Specifikus fluoreszcens festésekkel láthatóvá tettem az egyes sejtalkotókat (nukleinsavat, szeptumot, vakuolumokat) és ezek elrendeződését u.v. mikroszkóp alatt vizsgáltam. Számos apró különbséget fedeztem fel ezen struktúrákban a két alak között. Továbbá a mitotikus sejtmagvak megfigyelésekor három jól látható kromoszómát azonosítottam be ennél a fajnál ezt a feltevést pulzáló erőterű gélelektroforézissel (CHEF)is bebizonyítottam. Klasszikus genetika: Genetikai markerekként az auxotróf (anyagcserehibás) mutánsokat alkalmaztam, melyeket a vad típusú törzsből mutagenézissel hoztam létre. Az egyes mutánsokat komplementációs csoportokba rendeztem, anyagcsere-köztitermékek segítségével számos csoport helyét megleltem a szintézisútban. További olyan mutánsokat izoláltam, melyek hifaképzési tulajdonságai a vad típustól eltérőek (gyengébbek vagy jobbak) ezen mutánsokat vizsgáltam, azonos, vagy különböző lókuszban sérültek-e. Kerestem továbbá egyes, a metamorfózist befolyásoló toxinokkal szemben rezisztens és hiperszenzitív mutánsokat is. Molekuláris genetika: A S. Japonicus nem képes felhasználni a S. pombe autonóm replikációs szekvenciáját (ARS) így előbb genomiális génkönyvtárat készítettünk és azzal kerestünk fajazonos ARS-t. E transzformációs rendszer birtokában megleltük már klónozott S. pombe gének homológjait e fajban és a számos, metamorfózisban hibás mutáns transzformálására is lehetőség nyílt. Ezidáig hat, egymástól topológiailaig is független, a hifaképzéshez szükséges információkat kódoló lokuszt találtam. 36

8 CZIRÓK ANDRÁS, KOVÁCS JÁNOS EÖTVÖS LÓRÁNT TUDOMÁNYEGYETEM, Biológiai Fizika Tanszék AUTOMATIKUS SEJTFELISMERŐ RENDSZER NAGY SŰRŰSÉGŰ FÁZISKONTRASZT VIDEOMIKROSZKÓP KÉPEKRE A sejtbiológia hatékony eszköze a sejtek hosszú távú videomikroszkópos megfigyelése. Ezért alapvető követelmény a videomikroszkóppal készült képek gyors és hatékony elemzése. A szokásos szegmentáló algoritmusok gyenge hatékonyságúak élő, festetlen sejtek követése esetén, főleg nagysűrűségű tenyészetek vizsgálatakor. Az előadás egy többlépéses, hatékony sejtfelismerő rendszert mutat be, az algoritmust nagysűrűségű sejtkultúrák vizsgálatához optimalizáltuk. A program alkalmas a sejtek sebességének, osztódási gyakoriságának, aggregációjának kvalitatív jellemzésére. Az eljárást fáziskontraszt videomikroszkóp rendszerrel teszteltük humán glioblastoma sejtek felvételein. 37

9 CSUTORA PÉTER, MISETA ATTILA, RICHARD B. MARCHASE PÉCSI TUDOMÁNYEGYETEM, ÁLTALÁNOS ORVOSTUDOMÁ-NYI KAR, Klinikai Kémiai Intézet; UNIVERSITY OF ALABAMA AT BIRMINGHAM (USA), Department of Cell Biology KAPCSOLAT AZ ENDOPLAZMATIKUS HÁLÓZAT ÉS A PLAZMA MEMBRÁN KÁLCIUM CSATORNÁI KÖZÖTT: KÁLCIUM INFLUX FAKTOR Régóta tudjuk, hogy az endoplazmatikus hálózat kálcium raktárainak kiürülése után beindul egy másodlagos folyamat, a plazma membránon keresztüli nagy mértékű kálcium beáramlás. A két folyamat közti molekuláris szignál kapcsolat mibenléte azonban még ma sem ismert. Több elmélet is született, melyek közül a két legnépszerűbb az inozitol-trifoszfát receptorok közvetlen kapcsolódása a membrán csatornáihoz, illetve egy másodlagos jelátvivő molekula (kálcium influx faktor = CIF) keletkezése az endoplazmatikus hálózat kiürülésekor. Korábbi tanulmányainkban leírtuk, hogy az általunk különféle sejtekből izolált CIF extraktumok hogyan hatnak emlős és Xenopus laevis oocita sejtek és izolált kálcium csatornák kálcium permeabilitására. Jelen munkánkban arra kerestük a választ, hogy a CIF vajon az endoplazmatikus hálózatban szintetizálódik-e, illetve hogy milyen sejtalkotók jelenléte szükséges a szintéziséhez. Fura-2-vel feltöltött albínó Xenopus oocitákat centrifugáltunk, hogy az endoplazmatikus hálózatot in vivo elkülönítsük a többi sejtalkotótól. Ezt követően az oocitákat thapsigargin-nal kezeltük az endoplazmatikus hálózat kiürítése céljából, majd a membránon keresztüli kálcium beáramlást fluoreszcens mikroszkópiával detektáltuk. A kálcium ionok térbeli eloszlása és a kísérletet szimuláló számítógépes modell analízise azt mutatta, hogy a kálcium beáramlást kiváltó molekula (CIF) diffúziója az endoplazmatikus hálózatból kellett, hogy induljon. Azt is megvizsgáltuk, hogy humán trombocitákból és patkány májsejtből izolált endoplazmatikus hálózat frakció képes-e önálló CIF szintézisre. Eredményeink szerint thapsigargin-nal kezelt endoplazmatikus hálózat vezikulákból az intakt sejtekből izolálható CIF-el megegyező hatású CIF aktivitást lehet izolálni, amely igazolja, hogy az endoplazmatikus hálózaton kívül semmi más sejtalkotó nem kell a CIF szintéziséhez. 38

10 DÁVID CSABA, MAGYAR ATTILA, VÍGH BÉLA SEMMELWEIS EGYETEM, Humánmorfológiai és Fejlődésbiológiai Intézet KRIPTOKRÓMOK LOKALIZÁCIÓJA CORPUS PINEALEBAN Régóta ismert, hogy az állatok viselkedése igazodik a napi és az évszakos fényciklushoz. Általánosan elterjedt nézet, hogy a retina végzi a genetikailag kódolt biológiai óra beállítását a fényviszonyok érzékelésén keresztül. Újabb vizsgálatok alapján hasonló szerepet tulajdonítanak a praeoptikus és septális régióban található liquorkontakt neuronoknak, valamint a corpus pineale pinealocitáinak, mivel kimutatható bennük imuncitokémiai módszerekkel a fényérzékeléshez szükséges fehérjék (opsinok, G-fehérjék). A retina mellett a tobozszerv is képes közvetlen fényingerek alapján beállítani a szervezet napi ritmusát a külső fényciklusnak megfelelő frekvenciára. Mindez submammaliakban bizonyított, de egyre több jel mutat arra, hogy emlősökben is lehetséges a közvetlen fényérzékelés, legalábbis fiatal egyedekben. Jelen munkánkban az opszinok mellett szintén jelenlévő fotoreceptor molekulacsalád, a kriptokrómok lokalizációját vizsgáltuk. A kriptokrómok hatásait növényekben több, mint 100 éve ismerik, de magát a fehérjecsaládot csak néhány éve sikerült először kimutatni. Miután állatokban és emberben is megtalálták ezen gének homológjait, megállapították, hogy legalább két gén: cry1 és cry2 található a legtöbb állati szervezetben. Ezek közül a CRY2 a sejtmagban lokalizálódik és szerepe van a biológiai óra beállításában. Igazolták továbbá fényérzékelő tulajdonságát is. Eddigi kutatások főleg a retinára vonatkoztak. Saját fényés elektronmikroszkópos vizsgálatainkban kimutattuk különböző grincesek retinájában a pálcikák és a ganglionsejtek sejtmagjában, valamint a pinealociták sejtmagjában a CRY2 jelenlétét. Mivel a kriptokrómok abszorpciós maximuma jelentős átfedést mutat a melatonin felszabadulást leginkább befolyásoló kék fénytartománnyal, ezért a kimutatott CRY2-ről feltételezzük, hogy lehetővé teszi ezen sejtek számára a külső fényciklusnak megfelelő belső ritmus beállítását. 39

11 DOMBRÁDI VIKTOR 1, RENA GOROVITS 3, EINAT YATZKAN 3, SZÖŐR BALÁZS 1, FEHÉR ZSIGMOND 2, ODED YARDEN 3 DEBRECENI EGYETEM Orvos- és Egészségtudományi Centrum Orvosi Vegytani Intézete 1, és Humángenetikai Intézete 2 ; THE HEBREW UNIVERSITY OF JERUSALEM, Department of Plant Pathology and Microbiology 3 FEHÉRJE FOSZFORILÁCIÓ SZEREPE EGY FONALAS GOMBA MORFOGENÉZISÉBEN A Neurospora crassa egyedfejlődése során bekövetkező morfológiai változások mikroszkóposan jól követhetők. A klasszikus és molekuláris genetika eszköztárát felhasználva bizonyítottuk, hogy a fonalas gomba növekedésének szabályozásában mind a protein kinázok mind a protein foszfatázok fontos szerepet játszanak. A cot-1 protein kináz mutációja magas hőmérsékleten (37 C o ) lassítja a gomba növekedését, miközben a hífa elágazások száma jelentősen növekszik. Igazoltuk, hogy ilyen körülmények között a cot-1 génben bekövetkező pont-mutáció a fehérje egyik posztszintetikusan módosított formájának eltűnéséhez, a protein kináz aktivitás csökkenéséhez és a protein foszfatázok aktivitásának módosításához vezet. A pph-1 gén terméke, a PP2A protein foszfatáz katalitikus alegysége, esszenciális a N. crassa növekedéséhez. Kimutattuk, hogy a PP2A aktivitás sejt-permeábilis gátlószerekkel, illetve genetikai manipulációkkal kiváltott csökkentése a hifa növekedést gátolja. Munkánkat az OTKA T számú pályázata támogatta. 40

12 ERDŐDI FERENC 1, TÓTH ATTILA 1, KISS ENIKŐ 1*, LONTAY BEÁTA 1, SERFŐZŐ ZOLTÁN 2, GERGELY PÁL 1 DEBRECENI EGYETEM, 1 OEC Orvosi Vegytani Intézet, * MTA Jelátvitel és Apoptózis Kutatócsoport, 2 TTK Állatanatómiai és Élettani Tanszék MIOZIN FOSZFATÁZ: SZERKEZET, SZABÁLYOZÁS ÉS LOKALIZÁCIÓ A miozin foszfatáz (MP) holoenzimet protein foszfatáz 1 (PP1) katalitikus alegység (PP1c), valamint 130/133 kda (MYPT) és 20 kda regulator alegységek alkotják. Az MP a miozin foszforilált 20 kda könnyűláncának defoszforilációjával a sejtek alakváltozását és kontraktilitását szabályozza. Az MP aktivitásának és szubsztrátspecificitásának szabályozásában a PP1c és MYPT alegységkölcsönhatásai, valamint a MYPT Rho-kináz által katalizált foszforilációval történő gátlása játszik szerepet. Az MP szerkezetét, szabályozását és lokalizációját biokémiaibiofizikai, immunológiai és immunhisztokémiai módszerekkel tanulmányoztuk. Eredményeink szerint a MYPT N-terminális peptidszakaszai stabilizálják a PP1c és a MYPT alegység-kölcsönhatását és szerepük van a szubsztrát (P-MLC20) célra írányításában is. A MYPT N- terminális peptidszakaszainak foszforilációja PKC-vel gyengíti a PP1c-vel és a P-MLC20-al való kölcsönhatást is. Trombocitában az MP a citoszkeleton és a membrán frakciókban lokalizálódik. A citoszkeletonnal olyan Rho-kináztól eltérő kinázok asszociálódnak, amelyek képesek a MYPT N-terminális peptidszakaszait, ill. az enzim gátlását okozó Thr-695 oldalláncot foszforilálni. Kezdeti vizsgálatok arra utaltak, hogy az MP hepatocitákban nincs jelen. MYPT-re és PP1c-re specifikus antitestekkel kimutattuk az MP jelenlétét hepatocitákban. Immunhisztokémiai vizsgálatok, valamint Western blot analízis alapján hepatocitákban a MYPT tulnyomórészt a citoplazmában és a sejtmagban lokalizálódik. A citoszolban és a sejtmagban kimutattuk a Rho-kináz jelenlétét is. Eredményeinkből arra következtetünk, hogy az MP a kontraktilitáson túl más sejtfolyamatok szabályozásában is részt vehet, amire az enzim változatos lokalizációja és eltérő típusú szabályozó kinázokkal való asszociációja is utal. A kutatásokat az OTKA T030458, T026541, ETT 40/2000 és MKM FKFP 0616/2000 pályázatok támogatták. 41

13 FÁBIÁN ZSOLT, SZEBERÉNYI JÓZSEF PÉCSI TUDOMÁNYEGYETEM, ÁLTALÁNOS ORVOSTUDOMÁNYI KAR, Orvosi Biológiai Intézet APOPTÓZIS NEWCASTLE-BETEGSÉG VÍRUSSAL FERTŐZÖTT PC12 SEJTEKBEN Az apoptózis, vagy más néven programozott sejthalál a többsejtű szervezetek egyik legfontosabb sajátossága. Általa válik lehetővé a fajra jellemző normális egyedfejlődés, az egyes szervek fiziológiás működése, az öregedés és sok esetben a szervezetre veszélyt jelentő sejtek eltávolítása. A folyamat kiváltói között ma már több tucat külső hatást tartunk számon, a környezeti ingerektől kezdve a belső stimulusokon át a kórokozókig. A vírusok által okozott apoptózis szervezetre hátrányos hatása könnyen belátható, mint ahogy az is, hogy a vírusfertőzött sejtek mielőbbi elpusztítása alapvető érdeke egy többsejtű szervezetnek. Klinikai és experimentális megfigyelések hívták fel a figyelmet egyes vírusfertőzések onkolítikus tulajdonságaira, de ezen hatások hátterére, mechanizmusára vonatkozóan nagyon kevés adat áll rendelkezésünkre. A neoplasztikus folyamatok regresszióját előidéző vírusok között az egyik legígéretesebb a Newcastle-betegség vírus. Ilyen vírus-vonalakkal folytatott klinikai vizsgálatok számos végstádiumú, a hagyományos kezelésekre rezisztens daganatos betegben - gyakorta részleges, vagy komplett remisszió formájában megjelenő - pozitív hatásokat írtak le. Az onkolítikus folyamat mechanizmusának tisztázására munkacsoportunk PC12 patkány phaeochromocytoma sejttenyészeteken kezdett vizsgálatokat a Newcastlebetegség vírus egyik attenuált formája felhasználásával. Kísérletes megfigyeléseink szerint az alkalmazott vakcina PC12 sejtekben apoptózist okoz, mely hatás nem modulálható a PC12 sejtekben antiapoptotikus idegi növekedési faktorral (NGF), Ca és protein kináz C által közvetített jelátviteli utak aktiválásával, illetve a reaktív oxigén szabadgyökök gátlásával sem. Ugyanakkor eredményeink alapján összefüggést találtunk az NGF-receptorok jelenléte és működése valamint a fertőzést követő apoptotikus válasz között. Hasonlóan az NGF-receptor hiányához, a protein kináz A által mediált jelátviteli út és az aktivált Ras protein is apoptózist gátló hatásúnak bizonyult, míg transzkripcionális szinten NFκB aktivációt tapasztaltunk. 42

14 FELSZEGHY, SZ. 1, HYTTINEN, M. 2, TAMMI, M 2, TAMMI, R. 2, MÓDIS, L 1. 1 DEOEC, Anatómia, Szövet- és Fejlődéstani Intézet, 2 UNIVERSITY OF KUOPIO, Department of Anatomy A HIALURONSAV ÉS RECEPTORÁNAK, A CD44-NEK VIZSGÁLATA HUMÁN FOGCSÍRÁKBAN Vizsgálatainkat különböző fejlődési stádiumból származó humán fogcsírákon végeztük. A hialuronsavat (HA) biotinilált aggrekán G1- doménnel (bhabc) mutattuk ki, mely specifikusan kötődik a HA dekaszacharidnyi részéhez. A kötődött bhabc-hez avidin-biotin peroxidáz (ABC) komplex-et kötöttünk a rendszerben lévő szubsztrátot pedig H 2 O 2 valamint diaminobenzidin (DAB) kromogén segítségével tettük láthatóvá. A HA-reakció intenzitását számítógépes képanalízissel értékeltük. A CD44-et monoklonális, az összes izoformát felismerő ellenanyaggal (H3) mutattuk ki. A H3-at, második biotinilált anti-egér antitesttel reagáltattuk. A kötődött reagenst, hasonlóan a hialuronsav reakcióhoz, ABC komplex-el, valamint H 2 O 2 -vel és DAB-al detektáltuk. Eredményeink: (1) A HA-t expresszálják a fogcsíra sejtjei. Új eredmény az a megfigyelés, hogy a HA tranziens módon megjelenik a zománcmátrixban is, legnagyobb mennyiségben a 31 hetes foetusban, idősebb korú fogcsíra zománcában azonban nem detektáltuk. (2) Humán fogcsírák esetében a CD44 expressziója szoros összefüggést mutatott az adott sejtek hialuronsav termelésével. Eredményeink alapján feltételezzük: I. A HA a fogfejlődés során szerepet játszhat több folyamatban: (a) Szerepe lehet a fogléc sejtjeinek osztódásának és vándorlásának elősegítésében. (b) A dentális papillában jelenlévő, a fejlődés előrehaladásával fokozatosan csökkenő mennyiségben jelenlévő HA nemcsak strukturális komponense lehet a fogpapillának, hanem ezen szövet sejtjeinek anyagcseretranszportját is elősegítheti. (c) A HA feltehetően térkitöltő szerepet játszhat a zománckristályok kialakulásakor, stabilizáló hatása lehet a kristálykötegek írányított lerakódásában. (d) A Tomes-rostok körül kialakuló, HA-gazdag extracelluláris térségnek fontos szerepe lehet ezen struktúrák fejlődésében. II. Mivel a CD44 expresszió hasonló volt a fogcsíráknál tapasztalt hialuronsav mintázattal, feltételezhetjük, hogy a hialuronsav által mediált effektusok közvetítésében a CD44-nek központi szerepe lehet a humán fogfejlődés során. 43

15 ifj. GALLYAS FERENC, VÁRBIRÓ GÁBOR, VERES BALÁZS, TAPODI ANTAL és SÜMEGI BALÁZS PTE, ÁOK, Biokémia Intézet A TAXOL KÖZVETLEN MÓDON GYAKOROL HATÁST EGYES MITOKONDRIÁLIS FUNKCIÓKRA A Taxol-indukálta citotoxicitás mechanizmusának felderítése érdekében tanulmányoztuk a vegyület direkt mitokondriális hatásait izolált, Percollgradienssel tisztított patkány máj mitokondriumban. A vegyület a µm-os koncentráció tartományban koncentráció-függő módon váltotta ki a mitokondrium duzzadását, membránpotenciáljának összeomlását, és az intermembrán térből a citokróm c kiáramlását. Mindezek a hatások gátolhatóak voltak 2.5 µm Ciklosporin A-val. Ezek a jelenségek az u.n. "permeability transition" jellemző következményei. A "permeability pore" megnyílását enzimatikus módszerrel is bizonyítottuk felhasználva azt a tényt, hogy koenzim A nem képes átjutni az ép mitokondrium membránon. Ennek megfelelően, Taxol távollétében nem, míg hozzáadására mérhetővé vált a citrát szintáz illetve a karnitin acil transzferáz enzimek aktivitása. Ez a hatás is gátolható volt Ciklosporin A-val. A vegyület koncentráció-függő módon indukálta az endogén szabad-gyökök képződését mind a vizes, mind a lipid fázisban. Ezt a hatást a citokróm oxidáz-gátló CN - eltörölte, míg Ciklosporin A nem befolyásolta. Meggyőződtünk arról, hogy a vegyület élő sejteken is kiváltja a membránpotenciál összeomlását, illetve a szabad-gyök képződés indukálását. Összefoglalva, Taxol az adenin nukleotid transzlokáz-ciklofillin komplexen keresztül a mitokondriális "permeability transition"-t, míg a citokróm oxidázra hatva a szabad-gyök képződést indukálja. Mivel mind a citokróm c kiáramlás, mind a szabadgyök képződés "öngyilkos" mechanizmusokat indukál, a Taxol direkt mitokondriális hatásai közrejátszhatnak a vegyület citotoxicitásában. 44

16 GIDÁLI JÚLIA, BARTA ANIKÓ, BÁNYAI ANIKÓ, FEHÉR IMRE Országos Hematológiai és Immunológiai Intézet ŐSSEJTEK KORSTRUKTÚRÁJÁNAK VIZSGÁLATA ALLOGÉN ILL AUTOLÓG ÁTÜLTETÉSRE NYERT CSONTVELŐMINTÁKBÓL A csontvelőátültetés (=őssejt-átültetés) sikerét biztosító lymphohaemopoietikus őssejtek heterogén sejtpopulációt reprezentálnak. A legprimitívebb őssejtek felelősek a vérképzés hosszú távú helyreállításáért, az érettebb őssejtek biztosítják a korai regenerációt (progenitor-sejt képzést és a belőlük származó funkcionáló vérsejtek képződését). Az őssejtek korstruktúrájára az u.n. Cobblestone Area Forming Cell (CAFC) meghatározásával következtethetünk. A CAFC frekvenciája a besugárzott stromasejt rétegen a kiültetés után különböző időpontokban képződött primitív vérképző kolóniák előfordulási arányából, limiting dilution technikával számítható. A kiültetés utáni korai időpontokban (7-14 nap) megjelenő telepek megjelenéséből az érett, a progenitorokhoz közelálló őssejtek, a kiültetés utáni későbbi időpontban (5-6 hét) a fiatal, keveset osztódott, tartós repopuláció fenntartására alkalmas őssejtek előfordulási frekvenciája számítható. Munkánkban allogén csontvelőátültetésre nyert normál csontvelőből és a leukaemiás ill. lymphomás betegekből remisszióban, autológ átültetés céljára nyert csontvelőből határoztuk meg a CAFC frekvenciát 6 héten át. A kapott értékeket csontvelők progenitor szintjével hasonlítottuk össze. A remisszióban nyert csontvelők korai CAFC előfordulási frekvenciája a normál csontvelőből nyert értékek átlaga felett volt, a késői, fiatal CAFC aránya a két acut myeloid leukaemiás csontvelőnél a normál csontvelő álag-értékének alsó határa alatt volt. A Hodkin kóros betegnél ezek az értékek a normállal megegyeztek. A kis mintaszám ellenére a 2 hetes CAFC előfordulási arány és a csontvelői legfiatalabb progenitor (CFU-GEMM) szintje között a normál csontvelőnél öszefüggést találtunk, az AML-es betegekben CFU-GEMM nem volt kimutatható, tehát korreláció nem volt számítható. 45

17 GODA KATALIN, NAGY HENRIETTA, EUGENE MECHETNER, MAURIZIO CIANFRIGLIA ÉS SZABÓ GÁBOR DEBRECENI EGYETEM, MTA-DE Sejtbiofizikai Kutatócsoport, Biofizikai és Sejtbiológiai Intézet A P-GLIKOPROTEIN DROG-TRANSZPORT FÜGGŐ KONFORMÁCIÓ VÁLTOZÁSAI A P-glikoprotein (Pgp) egy széles szubsztrát spektrumú drog efflux fehérje, mely gyakran kifejeződik a daganatos sejteken és egyéb transzporter molekulákkal együtt felelőssé tehető a gyógyszer rezisztencia kialakulásáért. A Pgp általi drog transzport folyamatának lépéseiről és az azokat kísérő feltételezett konformáció változásokról még kevés információ áll rendelkezésünkre. Irodalmi adatok alapján a telítő koncentrációban alkalmazott UIC2 anti- Pgp monoklonális antitest kötődésének mértéke jelentősen megnő Pgp szubsztrátok és modulátorok jelenlétében (Mechetner és mtsai., PNAS 94, 12908, 1997). Valószínűsíthető, hogy az UIC2 antitest megnövekedett reaktivitását a Pgp szubsztrát transzporttal kapcsolatos konformáció változásai okozzák. Ezért megvizsgáltuk, hogy a katalitikus folyamat különböző lépései során a fehérje milyen UIC2-kötő képességgel rendelkezik. Kísérleti adataink alapján a Na-orthovanadát, az aluminiumfluorid és berillium-fluorid élő sejteken is gátolja a drog transzportot, feltételezhetően az ATP bontást követően a katalitikus átalakulási stádiumban rögzítve a fehérjét. Megvizsgáltuk különböző szubsztrátok, modulátorok, ATP depletáló szerek és katalitikus átalakulási stádium analógok hatását az UIC2 antitest kötődésére. Eredményeink arra utalnak, hogy az UIC2 antitest egyaránt jól kötődik a fehérje drogot és ATP-t kötő konformációs állapotaiban, azonban az ATP bontását követően a Pgp UIC2-vel szembeni affinitása drasztikusan lecsökken. Hasonló eredményeket kaptunk fluoreszcensen jelölt UIC2 Fab fragmentumok kötődésének vizsgálatával is. Eredményeink alapján valószínűsíthető, hogy az ATP hasítás olyan komplex konformáció változásokat idéz elő, mely egyaránt befolyásolja a molekula extracelluláris hurkainak antitestekkel való jelölhetőségét és átviszi a molekulát egy olyan állapotba, melyben lecsökken a drog-kötőhely szubsztrátok iránti affinitása is (Ramachandra M. és mtsai., Biochemistry 37,5010, 1998.). A kísérleti munkát az alábbi támogatások segítségével végeztük: OTKA T , AKP ,3, T01/103/2000/ETT. 46

18 GORJÁNÁCZ MÁTYÁS 1, ÁDÁM GÉZA 1, TÖRÖK ISTVÁN 2, BERNARD M. MECHLER 2 ÉS KISS ISTVÁN 1 1 MTA SZBK Genetikai Intézet, Szeged, 2 DKFZ, Heidelberg AZ IMPORTIN ALPHA 2 FEHÉRJE SZEREPE A DROSOPHILA OOGENEZISÉBEN Az Importin alpha (Impα) fehérjék adapter szerepet töltenek be a nukleáris lokalizációs szignált (NLS) tartalmazó fehérjék sejtmagi transzportjában. Ezen Importin fehérjék homológiájuk szerint három alcsaládba sorolhatóak, melyek mindegyikének van Drosophila képviselője is. Számos megfigyelés azt jelzi, hogy a Drosophila importin alpha 2 (dimpα2) gén által kódolt fehérje a hagyományos Impα funkciótól eltérő szerepet tölt be. E géntermék hiánya nem befolyásolja az életképességet, funkcióvesztéses mutációja csak sterilitást okoz. Az egyedfejlődés során az osztódó szövetekben, valamint az ováriumban expresszálódik. Az ovárium petekamráiban a dajkasejtek egy korai szelektív és egy kései masszív anyagtranszporton keresztűl képesek fehérjékkel és RNS-ekkel ellátni a transzkripcionálisan szinte teljesen inaktít petesejtet. Kisérleteink szerint a Dimpα2 fehérje mindkét részfolyamatban szerepet játszik. A korai transzportot NLS-green fluorescent protein (NLS-GFP) segítségével, míg a kései transzportot NLS-β-galaktozidáz (NLS-β-Gal) riportermolekula nyomonkövetésével vizsgáltuk. Petesejten belül a Dimpα2 fehérje szubkortikálisan lokalizálódik az aktin sejtvázhoz, amiről kimutattuk, hogy NLS megkötését igényli. Így vele együtt az NLS tartalmú riportermolekulák (NLS-GFP) kolokalizáltak az aktin sejtvázhoz, míg az NLS hiányosak (GFP) nem. Immunoprecipitációval igazoltuk, hogy az NLS-ß-Gal és az NLS-GFP képes komplexet alkotni a Dimpα2-vel. Eredményeink arra engednek következtettni, hogy a Dimpα2 fehérje nem a sejtmagba irányuló transzportban, hanem a dajkasejtekből a petesejtbe irányuló anyagtranszportban játszik szerepet. 47

19 HEGEDŰS TAMÁS, SESSLER TAMÁS, SHARON MILGRAM #, SARKADI BALÁZS OHII, Membrán és Izotópdiagnosztikai Osztály, MTA Membránbiológiai Kutatócsoport, # UNIVERSITY OF NORTH CAROLINA AT CHAPEL HILL, Department of Molecular Physiology ABC-TRANSZPORTEREK ÉS PDZ FEHÉRJÉK KÖLCSÖNHATÁSÁNAK VIZSGÁLATA Az ABC-transzporter (ATP Binding Cassette) család az egyik legnagyobb fehérjecsalád, tagjai minden eddig vizsgált élőlényben megtalálhatók. A legtöbb ABC-fehérje olyan membrán alkotó, amely a legkülönfélébb kémiai szerkezetű és funckciójú anyagok transzportját segíti elő. A CFTR (Cisztikus Fibrózis Transzmembrán Regulátor) ABC-transzporter, amelynek mutációja okozza a cisztikus fibrózis nevű öröklödő, halálos betegséget, klorid csatornaként működik. A CFTR-hez kapcsolódó kloridtranszport hiánya azonban nem magyarázza meg ezt a rendkívül összetett betegséget: a nátrium, a bikarbonát, a kálium ionok és a víz transzportjának megváltozását, a kialakuló bakteriális fertőzések kezelhetetlenségét. Nemrégiben kimutatták, hogy a CFTR fehérje az utóbbi folyamatokban szerepet játszó fehérjék működését is szabályozza [Kunzelman (1999) J. Membr. Biol. 168, 1]. Ismert, hogy a CFTR a C- terminálisán található PDZ kötő motívum segítségével egy PDZ fehérjén keresztül más fehérjékhez kapcsolódhat [Short (1998) J. Biol. Chem. 273, 19797]. A PDZ fehérjék általános feladatának tűnik funkcionálisan összetartozó fehérjék lokális összekapcsolása [Fanning (1999) J. Clin. Invest. 103, 767]. Az MRP2 (vagy cmoat) ABC fehérje a sejtekből, elsősorban a vesében választ ki különféle mérgező anyagokat, antibiotikumokat. Az MRP2 C-terminális végén szintén található egy PDZ kötő motívum. Kísérleteinkben arra keressük a választ, hogy az MRP2 PDZ kötő motívumában található foszforilációs helynek milyen szerepe lehet a PDZ fehérjékhez történő kötődés szabályozásában, a CFTR fehérje hatással van-e az MRP2 transzporter működésére. 48

20 HOMOLYA LÁSZLÓ 1, EDUARDO R. LAZAROWSKI 2, RICHARD C. BOUCHER 2 1 MTA/SEB/OHII, Membránbiológiai és Immunkórtani Kutatócsoport 2 UNC AT CHAPEL HILL, Cystic Fibrosis Center INTERCELLULÁRIS KALCIUM-HULLÁM MECHANIZMUSA LÉGUTI HÁMSEJTEKBEN. Az ATP számos sejt felszínén jelen van mérhető koncentrációban, amelyet a sejtekből történő tónusos kiáramlás és a sejtfelszíni metabolizmus dinamikus egyensúlya tart fenn. Ez a nyugalmi koncentráció sok esetben jelentős mértékben fokozódik, ha a sejtet mechanikai inger éri. Egy vitatott elképzelés szerint az ATP-kiáramlásban közvetlenül vagy közvetett módon szerepet játszik a CFTR (cisztikus fibrózis transzmembrán regulátor) fehérje, amelynek mutációja tehető felelőssé a cisztikus fibrózis nevű, elsősorban a légutakat érintő, halálos kimenetelű, öröklődő betegségért. Mivel az ATP aktiváló hatása legtöbbször a citoplazmatikus Ca 2+ -koncentráció emelkedésével jár, a fenti szabályozó mechanizmus jól modellezhető az ún. intercelluláris Ca 2+ -hullám jelenségével. Számos sejttípusnál tapasztalták, hogy egy sejtkultúrában növő sejt membránjának kismértékű deformációja a stimulus helyéről elinduló, sejtről sejtre radiálisan terjedő Ca 2+ -hullámot indít el. Jelen munkánkban léguti hámsejtekben mutatjuk be az intercelluláris Ca 2+ -hullám jelenségét, és vizsgáljuk annak mechanizmusát. Szelektív receptorok és specifikus enzimek segítségével kimutattuk, hogy ezekben a sejtekben - a korábbi elképzelésekkel szemben - a Ca 2+ -hullám tovaterjedéséért a sejtekből kiáramló, extracelluláris nukleotidok tehetők felelőssé. Meglepő módon ezekben a polarizált sejtekben a nukleotidok kiáramlása nem korlátozódik a luminális oldalra, hanem a bazolaterális oldal felé is bekövetkezik, kommunikációs utat teremtve a hám alatti rétegekben lévő más sejttípusok (ideg- és immunsejtek) felé. Molekuláris biológiai és sejtbiológiai módszerek kombinálásával megmutattuk, hogy nemcsak az extracelluláris ATP, hanem az UTP is részt vesz a jel közvetítésében, és sikeresen cáfoltuk azt az elképzelést, hogy a CFTR szerepet játszik a nukleotidok kiáramlásában. 49

21 KISPÁL GYULA 1, SIPOS KATALIN 1, FEKETE ZSUZSA 1, ROLAND LILL 2 1 PTE, ÁOK, Biokémia Intézet, 2 UNIVERSITY MARBURG, Inst. of cytobiology AZ RN-ÁZ L INHIBITOR, EGY CITOSZÓLBAN ELHELYEZKEDŐ VAS-KÉN FEHÉRJE, AKTIVÁLÁSA A MITOCHONDRIUM ESSZENCIÁLIS FUNKCIÓJA A vas-kén komplex egy többfunkciójú prosztetikus csoport, komponense a legtöbb elektron transzport láncnak, továbbá részt vesz izomerizációs reakciókban, avagy szenzorként működik. Vas-kén fehérjék, azaz a vas-kén komplexet tartalmazó fehérjék legnagyobb mennyisége a mitochondriumban található, de előfordulnak a citoplazmában és a sejtmagban is. Eukariótában a vas-kén komplex bioszintézise a mitochondrium mátrixterében indul. A szintézisben résztvevő fehérjék, enzimek közeli homológjai a bakteriális isc operonon kódolt fehérjéknek. Az isc homológok szükségesek és elegendőek a mitochondriális vas-kén fehérjék aktiválásához. Ezt az univerzális reakcióutat eukariótában további komponensek egészítik ki, amelyek kizárólag az extramitochondriális vaskén fehérjék aktiválásához szükségesek. Ezek közül eddig az Atm1p-t az egyik mitochondriális ABC transzportert és a Cia1p-t azonosítottuk. A vas-kén komplex bioszintézis esszenciális folyamat, hiányában a sejtek elveszítik életképességüket. A kizáróan extramitochondriális vas-kén fehérjék aktiválását végző komponensek is esszenciálisak, ezért feltételezhetően esszenciális extramitochondriális vas-kén fehérje is létezik. Vizsgálataink során eddig egy ilyen fehérjét találtunk, az RN-áz L inhibitort (Rli1p). Az Rli1p egy ferredoxin és egy ABC domaint tartalmazó fehérje, amely a citoplazmában szolubilisen, kisebb részben membránhoz kötötten fordul elő. Az Rli1p élesztőben esszenciális, funkciójához a ferredoxin domainben található vas-kén komplex jelenléte szükséges. Ezek alapján kijelenthetjük, hogy a mitochondrium esszenciális, azaz a sejtek életét a legalapvetőbben befolyásoló funkciója az extramitochondriálisan elhelyezkedő Rli1p prosztetikus csoporttal, vas-kén komplexszel történő ellátása, aktiválása. 50

22 KISS CSONGOR, BENKŐ ILONA*, SZEGEDI ISTVÁN, KOVÁCS PÉTER* DE OEC Gyermekklinika és *Gyógyszertani Intézet LEUKAEMIA SEJTEK ÉS A CYTOKIN PATCHWORK Az egészséges vérképző progenitor sejtek expanzióját és maturációját alapvetően befolyásolják a haemopoietikus cytokinek. Noha az egymással kölcsönhatások hálózatában álló szabályozó glikopeptid molekulák hatásában pleiotropia és redundancia egyaránt érvényesül, a különböző érettségű normál progenitorok mellé egy vagy több meghatározott szabályozó cytokin rendelhető. A neoplasztikusan transzformált vérképző sejtek cytokin érzékenységi spektruma lényegesen kevésbé ismert. Munkánk során rosszindulatú vérképzőszervi betegségben szenvedő gyermekek csontvelői mononukleáris (MN) sejtjeinek kolónia képzését vizsgáltuk metilcellulóz kultúrában. A módszerrel vizsgáltuk a sejtek spontán, valamint indukált kolónia képzését. Stimuláló ágensként rekombináns humán cytokineket, a myelopoietikus granulocyta (G)- kolónia stimuláló faktort (CSF) és granulocyta/makrofág (GM)-CSF-t, valamint a pleiotrop őssejt faktort (SCF) és a hagyományos cytokin forrásként használt phytohaemagglutinin-stimulált leukocyta kondicionált médiumot (PHA-LCM) alkalmaztuk önállóan, illetőleg kombinációban. 13 acut lymphoblastos leukaemiában (ALL; 9 common ALL, 2 myeloid antigén-pozitív ALL, 2 korai T-sejtes ALL) szenvedő gyermek MN sejtjei közül 3/13 esetben észleltünk spontán kolónia képzést. Az alkalmazott ágensek közül a G-CSF, az SCF és a PHA-LCM hatása nem tért el lényegesen míg a GM-CSF kevésbé volt effektív. A G-CSF és a GM-CSF, valamint a G-CSF és az SCF kettős kombinációban potencírozta egymás hatását. A legeredményesebb növekedési stimulust a három cytokin együttes alkalmazása képviselte. 7 myelodysplasiás syndromás (MDS; 1 RA, 5 RAEB, 1 JMML) betegünk myeloid kolónia képző sejtjeinek szaporodási spektruma lényegesen változatosabb volt mint amit a normál csontvelői myeloid progenitok (CFU-GM) esetében észleltünk. A betegek mintái között hypo- és hyperreaktív esetek egyaránt előfordultak. Az alpha-interferon valamennyi esetben dózis-függő módon gátolta a PHA-LCM-indukálta kolónia képzést. Megfigyeléseink új terápiás stratégia kifejlesztéséhez járulhatnak hozzá gyermekkori ALL-ben és MDS-ben. 51

23 KOVÁCS ATTILA LAJOS*, FEHÉR JUDIT, PÁLFIA ZSOLT, VELLAI TIBOR x, KOVÁCS JÁNOS EÖTVÖS LORÁND TUDOMÁNYEGYETEM, Állatszervezettani Tanszék, x Genetikai Tanszék AUTOFÁG VAKUÓLÁK MEGJELENÉSE A CAENORHABDITIS ELEGANS NORMÁLIS LÁRVÁLIS FEJLŐDÉSE SORÁN Az autofágia az eukarióta sejtek intracelluláris lebontó folyamatainak egyik fontos de máig kevéssé ismert mechanizmusa. Vizsgálatában hagyományosan az emlős májsejtek játszották a fő szerepet. A folyamatnak Saccharomyces cerevisiae-ben való felfedezésével a 90-es években új fejezet kezdődött amelyben már a legújabb genetikai módszereket is felhasználják. Az új eredmények felkínálják a lehetőséget a soksejtűekben zajló autofágia genetikai vizsgálatára. Erre a célra a genetikai módszerekkel jól megközelíthető soksejtűek közül az autofágia szemponjából eddig ismeretlen Caenorhabditis elegans-t választottuk. Eddigi munkánk során kidolgoztuk az autofág folyamat kvalitatív és kvantitatív leírására alkalmas elektronmikroszkópos morfológiai és morfometriai eljárást és ennek segítségével megvizsgáltuk, hogy a normálisan fejlődő C. elgans lárvákban találhatók-e autofág vakuólák. Megállapítottuk, hogy a lárvastádiumok végén jelentkező lethargus állapotból kikerült aktivizálódó egyedek különböző sejtjei tartalmaznak elektronmikroszkóppal azonosítható, citoplazma alkotókat tartalmazó, sima membránnal körülhatárolt testeket. Sorozatmetszeteken történő megfigyeléssel és membrán vastagság méréssel igazoltuk, hogy ezek nem a plazmamembrán betüremkedései hanem vékony kettős membránnal határolt zárt testek, tehát autofág vakuólák amelyek az összes nagyobb tömegben előforduló sejttípusban megtalálhatók az idegsejteknek és a gonád reproduktív sejtjeinek kivételével. Elektronmikroszkópos morfometriai méréseink szerint mennyiségük a citoplazma térfogatának 0,01-0,1%-os tartományában mozog. Eredményeink kétségtelenné teszik, hogy autofagocitózis jelentős szerepet játszik a C. elegans normális fejlődésében. A folyamat elektronmikroszkópos morfometriával kvantitatívan detektálható ami megalapozza a jelenség további genetikai módszerekkel történő vizsgálatát. * alkova@cerberus.elte.hu 52

24 KVELL KRISZTIÁN, BALOGH PÉTER, NÉMETH PÉTER PTE, ÁOK, Immunológiai és Biotechnológiai Intézet HUMÁN LIMFOPROLIFERÁCIÓ IMMUNDEFICIENS EGÉRBEN Célunk egy reprodukálható xenogén kiméra modell létrehozása volt, melyben az ismert humán poszttranszplantációs limfoproliferatív betegséghez (LPD) hasonló tumoros folyamat vizsgálható. Először az eredeti protokollt követve Epstein-Barr vírus pozitív (EBV+) humán perifériás limfocitákat oltottunk intraperitoneálisan immundeficiens (SCID) egerekbe. Egy héttel a sejtátvitel után a humán sejtek többsége T-sejt fenotípusú, másfél hónappal később azonban már egyértelmű volt a B- sejtek dominanciája áramlási citometria analízis és immunhisztokémia alapján. A LPD ezen stádiumában a humán sejtek egy intraperitoneális, esetünkben periportális masszát alkottak. Immunhisztokémiai vizsgálatok szerint a poliklonális sejtszaporulat kifejezett proliferációs hajlamot mutatott, egyes limfociták EBV asszociált fehérjéket is expresszáltak. Biológiailag malignus viselkedést tanúsítva a humán B limfociták infiltrálták a gazdaszervezet máját és lépét. A mikroszkópos kép más rosszindulatú humán limfómáktól eltérően az egér nyirokszervekben a normális homing szabályait követő humán infiltrációt mutatott. In vitro tenyésztés során sem fejlődött ki domináns klón, az osztódás másfél hónap után leállt. A LPD nap alatt bizonyult letálisnak a kimérára nézve. Az eredmények érett, humán limfociták kontroll nélküli proliferációjára utaltak SCID egérben. További kísérleteink során a hatékonyabb, reprodukálhatóbb humán limfoproliferáció érdekében módosítottuk a kiméra kialakítás protokollját, csökkentve a bizonytalan tényezők számát. Kisebb számú humán sejtek intraperitoneális transzfere után tizenegy nappal in vivo EBV szuperinfekciót hajtottunk végre egy ismert EBV szubtípussal, a B95-8 jelzésű sejtvonal szupernatánsával. A jól ismert LPD fejlődött ki, néhány értékes különbséggel. Az átvitt humán sejtek lényegesen kisebb, korábban elégtelen mennyisége ellenére a módosított protokoll esetében minden kimérában kialakult a betegség, mely valamelyest rövidebb idő alatt (41-43 nap) és sokkal szűkebb időintervallumban bizonyult letálisnak. Ezért a módosított, standardizált protokoll egy kiszámíthatóbb és reprodukálhatóbb xenogén kiméra modelt eredményezett, mely a LPD és lehetséges terápiájának finomabb részleteit is felfedheti. 53

25 LÁZÁR-MOLNÁR E, HEGYESI H, DARVAS ZS, TÓTH S, FALUS A SEMMELWEIS EGYETEM, Genetikai, Sejt- és Immunbiológiai Intézet, BUDAPEST AZ ENDOGÉN HISZTAMIN ÉS AZ AUTOKRIN INTERLEUKIN-6 BIOSZINTÉZIS KÖLCSÖNHATÁSA MELANOMA SEJTEKBEN Az interleukin-6 (IL-6) autokrin növekedési faktor metasztatikus melanomában és ugyanakkor ismert, hogy különböző eredetű sejtvonalakban (glioblastoma, B lymphoma) a hisztamin fokozza az IL-6 bioszintézisét és fontos, részben még ismeretlen szerepet játszik a tumorsejtek proliferációjában. Kísérleteinkben vizsgáltuk az endogén hisztamin és az IL-6 szintézis közötti kölcsönhatást négy humán melanoma sejtvonalban, az M1/15 és HT168/91 metasztatizáló valamint a WM35 és WM983 primer tumorokban. RT-PCR módszerrel kimutattuk az IL-6, IL-6 receptor és a gp130 jelátvivő elem jelenlétét mindegyik melanoma vonalban. Habár az IL-6 mrns mindegyik melanoma vonalban jelen van, csak a metasztatikus melanoma vonalak felülúszójában van mérhető mennyiségű IL-6 peptid. Mivel mindegyik melanoma vonalban kimutatható a hisztamint egyedül előállító hisztidin dekarboxiláz (HDC) enzim és intracelluláris hisztamin tartalom, megvizsgáltuk az endogén hisztamin hatását az IL-6 termelésre specifikus hisztamin receptor antagonisták alkalmazásával. Azt találtuk, hogy a H1 receptor antagonista triprolidin szignifikánsan csökkentette az IL-6 termelést metasztatizáló melanoma sejtekben, míg más antihisztaminok hatása nem volt szignifikáns. A HDC enzim irreverzibilis gátlása α-fluoro-metil-hisztidinnel szintén az IL-6 termelés csökkenéséhez vezetett ezekben a sejtekben. A primer melanoma sejtekben a külső IL-6 kezelés a HDC fehérje szint növekedéséhez vezetett. Ezek az eredmények arra utalnak, hogy az endogén hisztaminnak fontos szerepe van a lokális IL-6 termelésben előrehaladott metasztatikus melanoma sejtekben és úgy a hisztamin mint az IL-6 részét képezi a tumor növekedését biztosító autokrin szabályozási mechanizmusnak. 54