(11) Lajstromszám: E (13) T2 EURÓPAI SZABADALOM SZÖVEGÉNEK FORDÍTÁSA

Átírás

1 !HU T2! (19) HU (11) Lajstromszám: E (13) T2 MAGYAR KÖZTÁRSASÁG Magyar Szabadalmi Hivatal EURÓPAI SZABADALOM SZÖVEGÉNEK FORDÍTÁSA (21) Magyar ügyszám: E (22) A bejelentés napja: (96) Az európai bejelentés bejelentési száma: EP 080 (97) Az európai bejelentés közzétételi adatai: EP 1680 A (97) Az európai szabadalom megadásának meghirdetési adatai: EP 1680 B (1) Int. Cl.: A61K 31/44 (06.01) A61P 11/00 (06.01) (87) A nemzetközi közzétételi adatok: WO PCT/FR 04/00288 () Elsõbbségi adatok: FR (72) Feltalálók: BECQ, Frédéric, F Poitiers (FR); NOREZ, Caroline, Poitiers (FR) (73) Jogosultak: CENTRE NATIONAL DE LA RECHERCHE SCIENTIFIQUE (CNRS), 7794 Paris Cedex 16 (FR); UNIVERSITE DE POITIERS, Poitiers Cedex (FR) (74) Képviselõ: Kmethy Boglárka, DANUBIA Szabadalmi és Jogi Iroda Kft., Budapest (4) Glükozidázinhibitorok alkalmazása mukoviszcidózis kezelésére (7) Kivonat A találmány glükozidázinhibitorok alkalmazására vonatkozik mukoviszcidózis kezelésére történõ gyógyszer elõállítására. A cisztás fibrózis transzmembrán konduktancia regulátor (CFTR) fehérje delf08 mutánsának reaktivátora. Az N¹butil-dezoxinojirimicin EC 0 -értéke 123 M a jodidkiáramlás helyreállításában CF1 humán tüdõepiteliális sejtekben (amelyek a delf08 mutáció homozigótái) forskolinnal és genisteinnel való stimuláció után. HU T2 A leírás terjedelme 16 oldal (ezen belül lap ábra) Az európai szabadalom ellen, megadásának az Európai Szabadalmi Közlönyben való meghirdetésétõl számított kilenc hónapon belül, felszólalást lehet benyújtani az Európai Szabadalmi Hivatalnál. (Európai Szabadalmi Egyezmény 99. cikk (1)) A fordítást a szabadalmas az 199. évi XXXIII. törvény 84/H. -a szerint nyújtotta be. A fordítás tartalmi helyességét a Magyar Szabadalmi Hivatal nem vizsgálta.

2 1 HU T A találmány tárgya az 1. igénypontban meghatározott glükozidázinhibitorok alkalmazása mukoviszcidózis kezelésére szánt gyógyszerek elõállítására. A mukoviszcidózis (vagy CF: cisztás fibrózis) az európai és az észak-amerikai népesség körében a leggyakoribb halálos kimenetelû autoszóm recesszív genetikai betegség. A CF gén (helye a kromoszómán: 7q31) a CFTR (cisztás fibrózis transzmembrán konduktancia regulátor) nevû transzmembrán fehérjét kódolja [Tsui és munkatársai (198); Riordan és munkatársai (1989)]. A CF gén mutációi abnormális víz és elektrolit transzportot váltanak ki különféle szervek, például tüdõ, verejtékmirigyek, bél és exokrin hasnyálmirigy sejtmembránjain keresztül. Bár a CFTR fehérjének több mint 00 mutációja van, a leggyakoribb mutáció (a betegek 70%-ánál) egy fenil-alanin törlõdése az NBF1 doménbõl az 08¹as pozícióban (delf08). A CF betegek halálozásának fõ oka ehhez a törlõdéshez kapcsolódik és tüdõfertõzésekhez vagy tüdõelégtelenséghez vezet, amit a nyálka viszkozitásának növekedése vált ki. Ez a viszkozitás a légutak elzáródását vonja maga után és kedvez az opportunista bakteriális fertõzéseknek. Egy másik tünet is megállapítható az emésztõszervek, különösen a hasnyálmirigy szintjén (hasnyálmirigy-elégtelenségben szenvedõ beteg). A CFTR fehérje egy 1480 aminosavból álló glikoprotein, amely az ABC membrántranszporterek szupercsaládjába tartozik. A CFTR egy kloridcsatorna, amely egészséges egyéneknél a tüdõ epiteliális sejtjeinek apikális plazmamembránjában található. A CFTR felelõs a víz és az elektrolitok transzepiteliális transzportjáért és egészséges egyénnél lehetõvé teszi a tüdõ légutainak hidratációját. A CF betegeknél ez a fehérje nincs jelen a plazmamembránokban, mivel a fehérje egy rossz címzés miatt az endoplazmás retikulumban (ER) marad. Ebben az esetben a tüdõk légútjainak hidratáltsága nem funkcionális. A delf08-törlõdés zavarja az NBF1 domén hajtogatását és megakadályozza a fehérje teljes érését, amely így nagyon korán degradálódik a bioszintézise során. Ugyanakkor, ha a delf08 fehérje eléri a membránt, kloridcsatornaként mûködik. Ennek a betegségnek a kezeléséhez az egyik kulcs tehát a delf08 sejtmembránok felé történõ újracímzésében áll. Ha már eljutott a membránba, a delf08-transzport aktivitását stimulálhatjuk endogén vagy exogén fiziológiai agonistákkal. A CFTR fehérje címzésének mechanizmusa az alábbi módon történik. A neoszintézise után a CFTR fehérje az ER lumenjében található, ahol különféle glikolizációkon megy keresztül glikozil-transzferázoknak köszönhetõen. A fehérje többek között 3 N¹kapcsolt glükózzal és 1 N¹kapcsolt mannózzal található. A glükózok közül kettõt eltávolít a glükozidáz I és II. A kalnexin vagy a kalretikulin, amelyek kalciumfüggõ dajkafehérjék, felismerik a monoglikozilezett fehérjét és az N¹kapcsolt glükózon keresztül hozzákapcsolódnak. Ezek a dajkafehérjék megakadályozzák, hogy az ER¹ben levõ különbözõ CFTR fehérjék aggregálódjanak és lehetõvé teszik más dajkafehérjék, például az ERp7 kötõdését. Az így kialakult CFTR/kalnexin/ERp7 komplex lehetõvé teszi a CFTR hajtogatódását. Ezután a glükozidáz II eltávolítja a megmaradt glükózt és így felszabadítja a CFTR¹t a dajkaferhéjéktõl. Ha a hajtogatódás nem megfelelõ, egy glükoziltranszferáz hozzáad egy glükózt a CFTR-hez, amely újra keresztülmehet egy vagy több cikluson, amíg jól nem hajtogatódik. Ha a hajtogatódás még mindig nem megfelelõ, akkor egy mannozidáz eltávolítja az N¹kapcsolt mannózt és a fehérje ekkor a citoszolba transzportálódik a transzlokon komplex csatornán keresztül, ahol degradálódhat [Ellgard & Helenius, (03)]. Ez a jelenség a CFTR¹WT 80%-ánál és a delf08-cftr 99%-ánál megfigyelhetõ. Ha már a citoszolban van, akkor a fehérjét különféle dajkafehérjék, például a Hsp70, Hsp90 vagy Hdj¹2 veszik kezelésbe. Ezek a dajkafehérjék lehetõvé teszik, hogy az ubikitin hozzákötõdjön a CFTR-hez. Így megjelölve a CFTR¹t az ATP-függõ 26S proteaszóma komplex felismeri és lebontja [Gelman és munkatársai, (02)]. Ha a CFTR hajtogatódását a retikulum szabályozómechanizmusa helyesnek találja, akkor a fehérje eljuthat a Golgi-készülékbe. Itt az ERGIC¹3 cargo fehérje (amely a lektinek családjába tartozik) veszi kezelésbe, amely a mannózon keresztül kötõdik a CFTR-hez. Az ERGIC áthaladása a GOP I faktor által képzett vezikulumok közremûködésével történik [Ellgard & Helenius, (03)]. Úgy tûnik, hogy ha a fehérje rosszul hajtogatódott, akkor érzékeny a Golgi-készülék endoglikozidáz H¹jára [Cheng és munkatársai (1990)] és akkor visszakerül a retikulumba, ahol lebontódik. Viszont a helyesen hajtogatódott fehérjét, amely rezisztens az endoglikozidáz H¹ra, kezelésbe veszi a VIP 36 faktor (az ERGIC¹3 homológja) és az apikális membránba továbbítódik [Fiedler & Simons, (199)]. Bár már megfigyelték, hogy egy glükozidázinhibitor a kasztanospermin hatást gyakorol a delf08 jelenlétének megújítására a tüdõ epiteliális sejtjeinek felszínén [Wei és munkatársai, (1996)], viszont soha sem írták le, hogy ez a vegyület nemcsak a delf08 membrán címzésének helyreállítására képes, hanem lehetõvé teszi azt is, hogy a delf08 iontranszporterként mûködjön. Ezért ennek a cikknek a szerzõi semmiféle feltételezést nem fogalmaztak meg a vegyület mukoviszcidózis kezelésének keretében történõ alkalmazását illetõen. A feltalálók éppen azért vizsgálták a glükozidázinhibitorokat, hogy meghatározzák, hogy képesek¹ e a delf08 korrekt és specifikus címzésének biztosítására anélkül, hogy befolyásolják az iontranszportáló aktivitását vagy a sejt életképességét. Az N¹butil-dezoxinojirimicin (NB-DNJ) az endoplazmás retikulum glükozidáz I és II egy inhibitora, amelyet elõször antivirális molekulaként fejlesztettek ki emberek számára. Ezeknek az enzimeknek a gátlása módosítja a HIV-vírus (humán immundeficiencia vírus) burka egyik glükoproteinjének hajtogatódását és következésképpen a vírus ciklusa blokkolódik [Platt és munkatársai, (01)]. Egy NB¹DNJ¹t alkalmazó terápiát vizsgáltak szerzett immunhiányos tünetegyüttesben szenvedõ betegeken: ezt a molekulát jól tolerálják és szövette- 2

3 1 HU T2 2 nyészetekben még nagy koncentrációban (2 mm) sem citotoxikus. Ezenkívül ezek a klinikai vizsgálatok azt is bemutatták, hogy az NB¹DNJ gátló hatást gyakorolt a glükoziltranszferázokra is. Ezért vizsgálták ezt a molekulát, amelyet OGT 918-nak is neveznek Gaucher-betegség kezelésében is [Dwek és munkatársai, (00), Cox és munkatársai, (00)]. Ez a genetikai betegség egy lizoszomális enzim, a ¹glükocerebrozidáz hiányából adódik, ami glükocerebrozidok (az enzim szubsztrátja) felgyülemlését eredményezi. Az NB¹DNJ, a glükocerebrozidok bioszintézisében szerepet játszó glükozil transzferáz inhibitora tehát megakadályozza a szintézisüket és a felgyülemlésüket [Dwek és munkatársai, 00, Cox és munkatársai, (00)]. Az NB¹DNJ forgalomba hozatali engedélyt kapott Gaucher-betegség gyógyszereként Zavesca néven 02-ben. A WO 01/02862 dokumentumban fehérjék továbbítási zavarai, különösen mukoviszcidózis kezelését írják le, melynek értelmében az ERp7 kalnexinnal vagy calretikulinnal való együttmûködését nyomják el egy glikozilációs inhibitor adásával, például dezoximannojirmicinnel (DMJ) vagy dezoxinojirimicinnel (DNJ). A WO 01/0286 dokumentumban genetikai betegségek, különösen mukoviszcidózis kezelési eljárását ismertetik egy 1,2-mannozidáz enzim antagonista, így például 1¹dezoximannojirimicin (DMJ) beadásával. Az US 02/0072 dokumentumban iminocukorszármazékok alkalmazását ismertetik lizoszomális betegségek kezelésének keretében és utalást tesznek arra is, hogy ezek az iminocukorszármazékok használhatók fehérjék hajtogatódási rendellenességével kapcsolatos betegségek kezelésében is, anélkül azonban, hogy konkrétan megemlítenék a mukoviszcidózist. A találmány a feltalálóknak azon a felismerésén alapul, hogy az NB¹DNJ és általában véve a glükozidáz más inhibitorai képesek a delf08 membrán címzését helyreállítani anélkül, hogy megváltoztatnák a többi kloridcsatornát és lehetõvé teszik, hogy a delf08 iontranszporterként mûködjön. A glükozidázinhibitor kifejezés alatt értünk minden glükozidáz I és/vagy II inhibitort, ahol ezeknek a glükozidázoknak a gátlását különösen a Platt és munkatársai (1994) szakirodalmi helyen ismertetett módszerrel mérjük. A glükozidázinhibitor-vegyületek között megemlíthetjük azokat, amelyek képesek a delf08 membrán címzését helyreállítani, anélkül, hogy megváltoztatnák a többi kloridcsatornát és lehetõvé termék, hogy a delf08 iontranszporterként mûködjön, különösen az alábbiakban ismertetett kísérletek keretén belül, amelyeket humán homozigóta tüdõ epiteliális CF1 sejteken végeztünk a delf08 törlésére. A glükozidázinhibitor-vegyületeket az alábbi (I) általános képletû vegyületek közül választhatjuk: (I) amelyben R 1 jelentése CH 3 vagy CH 2 OH csoport, R 2 jelentése H vagy 1 szénatomos alkilcsoport, vagy R 1 és R 2 az (I) általános képlet (a)-helyzetû szénatomjával és a nitrogénatommal együtt egy alábbi csoportot képez: Az (I) általános képletû vegyületek között megemlíthetjük az alábbiakat: DNJ (dezoxinojirimicin) DFJ (dezoxifukonojirimicin) DMJ (dezoximannojirimicin) DGJ (dezoxigalaktonojirimicin) 60 NB¹DNJ (N¹butil-dezoxinojirimicin) 3

4 1 HU T2 2 NB-DGJ (N¹butil-dezoxigalaktonojirimicin) 1 (II.2) amelyben R 2 jelentése a fentiekben megadott. A találmány közelebbrõl az alábbi képletû vegyületek fent említett alkalmazására vonatkozik: kasztanospermin vagy pedig az alábbi (II) általános képletû vegyületeket NB-DNJ (N¹butil-dezoxinojirimicin) (II) 2 amelyben R 2 jelentése H vagy 1 szénatomos alkilcsoport. A találmány egy glükozidázinhibitor alkalmazására vonatkozik mukoviszcidózis kezelésére szánt gyógyszer elõállítására, mely glükozidázinhibitort az alábbi (IIbisz) általános képletû vegyületek közül választjuk amelyben R 2 jelentése butilcsoport. (IIbisz) A találmány tárgyát képezi az alábbi (II.1) vagy (II.2) általános képletû vegyületek közül választott 1 4. igénypontok bármelyike szerinti glükozidázinhibitorok fent említett alkalmazása: NB¹DMJ (N¹butil-dezoximannojirimicin) Elõnyösen a találmány keretében használt vegyületek az NB¹DNJ és az NB¹DMJ. Szintén elõnyösen a találmány keretében használt vegyület az NB¹DNJ. A találmány tárgya továbbá a fentiekben definiált glükozidázinhibitor-vegyületek fent említett alkalmazása olyan gyógyszer elõállítására, amely beadható orális úton (szirup, szuszpenzió, gél, tabletta, por vagy granulátum), rektális úton (kúp), nazális úton (inhalációs aeroszol vagy csepp), különösen mintegy 1 mg 2 g hatóanyag/nap mennyiségben felnõttek vagy 1 mg 1 g/nap mennyiségben gyerekek és csecsemõk esetén egy vagy több adagban. A fent definiált glükozidázinhibitor-vegyületek használhatók egy CFTR csatorna aktivátor vegyülettel társítva, amelyet az alábbiak közül választunk: az alábbi képletû genistein: (II.1) 60 4

5 1 HU T2 2 vagy az alábbi (II) általános képletû benzol[c] kinolizinium származékok: 14. számú vegyület (MPB¹02) (II) 1. számú vegyület (MPB¹03) amelyben: R 1 és R 2 jelentése hidrogénatom vagy a C 1 -gyel és a C 2 -vel együtt egy 6 szénatomos aromás gyûrût képeznek, R jelentése hidrogénatom vagy 1 szénatomos lineáris vagy szubsztituált alkilcsoport, különösen butilcsoport vagy COOR képletû észter, amelyben R jelentése lineáris vagy szubsztituált 1 szénatomos alkilcsoport, különösen etilcsoport, Y jelentése OH, SH, NH 2 vagy NHCOCH 3 csoport, R 7, R 8, R 9 és R jelentése hidrogénatom vagy R 7,R 8 R 9 vagy R közül legalább az egyik jelentése halogénatom, különösen klór¹, bróm- vagy fluoratom, jelentése halogénatom anionos formában, különösen brómatom Br, vagy klóratom Cl formában vagy egy anionos formában levõ atomcsoport. A fent definiált glükozidázinhibitor-vegyületek használhatók társítva az alábbi vegyületek közül választott (II) általános képletû benzo[c]kinolizinium származékokkal: 13. számú vegyület (MPB¹01) számú vegyület 17. számú vegyület 22. vegyület számú vegyület (MPB¹26) vegyület 60

6 1 HU T vegyület 2. vegyület (MPB¹) 12. vegyület (MPB¹0) 26. vegyület (MPB¹29) vegyület (MPB¹06) 27. vegyület (MPB¹32) vegyület (MPB¹07) 3 MPB-91 vegyület. vegyület (MPB¹08) 4 MPB 73 vegyület 21. vegyület (MPB¹27) 0 MPB 7 vegyület 60 6

7 1 HU T2 2 MPB 86 vegyület MPB 77 vegyület MPB 87 vegyület MPB 88 vegyület MPB 2 vegyület MPB 3 vegyület Megemlíthetjük azokat a termékeket is, amelyek legalább egy glükozidázinhibitor-vegyületet, különösen egy fenti definíció szerinti (I) vagy (II) általános képletû vegyületet és legalább egy fentiekben definiált CFTR csatorna aktivátor vegyületet tartalmaznak kombinációs termékekként egyidejû, külön-külön vagy idõben elosztott alkalmazásra mukoviszcidózis kezelésére. A találmányt tovább szemléltetjük az alábbi részletes leírással, amelyben a delf08 MB¹DNJ általi helyes és specifikus címzõ hatásának kísérleti bemutatását ismertetjük és azt, hogy ez nem befolyásolja az iontranszporter aktivitását vagy a sejt életképességét. I) Anyagok és módszerek M1. Sejttenyészet CHO-WT-sejtek: A CHO sejtek (Chinese Hamster Ovary) fibroblasztok, amelyek a vad típusú CFTR génnel (CFTR¹WT) vannak transzfektálva. Ezek a sejtek ezért a CFTR fehérjét túlzott mértékben fogják expresszálni. Tenyésztõközeg: MEM alfa közeg (GIBCO)+7% magzati borjúszérum+0,0% penicillin/sztreptomicin+0 M metotrexát (Améthoptérine, Sigma). CF1 sejtek: A CF1 sejtek nazális eredetû humán epiteliális sejtek, amelyek a F08-CFTR gént expresszálják. Tenyésztõközeg: DMEM közeg+ham F12+% FCS+0,6% penicillin/sztreptomicin+növekedési faktorok ( g/ml inzulin, g/ml transzferrin,, M epinefrin, 0,18 mm adenin, ng/ml EGF, 2 nm T3, 1,1 M hidrokortizon). Calu¹3 sejtek: A Calu¹3 sejtek pulmonális eredetû humán epiteliális sejtek, amelyek a vad típusú CFTR gént expresszálják. Tenyésztõközeg: DMEM közeg/f12 glutamaxszal+7% magzati borjúszérum+1% penicillin/sztreptomicin. M2. Immunjelölés Az immunjelölés lehetõvé teszi, hogy vizualizáljuk a CFT fehérje sejtbeli lokalizációját egy CFTR elleni primer antitesttel (Ac), majd ezt követõen egy primer antitest elleni szekunder antitesttel, amely Cy3 fluorofórral van jelölve. A sejteket elõzetesen lamellákra oltjuk be, megfelelõ tenyésztõközegben. Három, egyenként percig tartó TBS¹es (NaCl: 17 mm, Tris bázis: M, ph=7,4) mosást hajtunk végre. A sejteket ekkor TBS-paraformaldehid (3%) hozzáadásával percig fixáljuk. Három TBS¹es mosás ( perc) után a sejteket TBS-0,1% tritonnal inkubáljuk ( perc), ami lehetõvé teszi lyukak képzõdését a sejtmembránban, majd ismét három TBS¹es mosást hajtunk végre, mielõtt a sejteket 0,% TBS-BSA-0,0% szaponinnal hozzuk érintkezésbe 1 órán át. A sejteket ezután a CFTR C terminális elleni primer antitesttel (2 g/ml) inkubáljuk 1 órán át. Három, egyenként percig tartó TBS-BSA-szaponinos mosást hajtunk végre, mielõtt a GAM-cy3 szekunder antitesttel (1/0) inkubáljuk 1 órán át. Két perces TBS¹es mosást követõen a magokat Topro3-mal (1/00) történõ perces inkubálással jelöljük. Végül a lamellákat három utolsó perces TBS¹es mosás után lemezekre visszük fel. A lemezeket konfokális mikroszkóppal (Bio-Rad) vizsgáljuk, megfelelõ hullámhosszú lézeres gerjesztéssel. Abból a célból, hogy különbsé- 7

8 1 HU T2 2 get tegyünk a Cy3-mal és a Topro3-mal történõ jelzés között, a Tpro3 fluoreszcenciájának színét kékre cseréltük (a magok színe) M2. Radioaktív nyomjelzõk kiáramlása A sejtekben a kloridion transzport méréseket radioaktív jód kiáramlási technika segítségével hajtottuk végre [Becq és munkatársai, (1999); Dormer és munkatársai, (01)]. A nyomjelzõt ( 12 I) az intracelluláris közegbe foglaltuk. Ezután a sejtbõl kilépõ radioaktív nyomjelzõ mennyiségét számláljuk különféle farmakológiai anyagok hozzáadása után. A jódot a kloridioncsatorna transzportjának nyomjelzõjeként alkalmazzuk. Bemutatták, hogy a 12 Iésa 36 Cl radioaktív nyomjelzõk ekvivalensnek tekinthetõk egy kloridion-csatorna aktivitásának mérésekor [Venglarick és munkatársai, (1990)]. A 12 I-nek ezenkívül az az elõnye, hogy a 3 Clhez képest rövid felezési ideje van (a felezési idõk rendre: nap és év). A sejteket 24 lyukú lemezeken tenyésztjük megfelelõ tenyésztõközegben. Két öblítést hajtunk végre a kiáramlási közeggel (NaCl: 136,6 mm, KCl:,4 mm, KH 2 PO 4 : 0,3 mm, NaH 2 PO 4 : 0,3 mm, NaHCO 3 : 4,2 mm, CaCl 2 : 1,3 mm, MgCl 2 : 0, mm, MgSO 4 : 0,4 mm, HEPES: mm, D¹glükóz:,6 mm) abból a célból, hogy eltávolítsuk az elpusztult sejteket, amelyek rendezetlen módon bocsájtják ki a radioaktivitást. Ezután a sejteket 00 l terheléssel (1 Ci/ml 12 INa) inkubáljuk percig a CHO¹WT esetén vagy 1 óráig a CF1 és a Calu¹3 esetén. A jód egyensúlyba jut a sejtmembrán mindkét oldalán. A robot (MultiPROBE, Packard) az alábbi lépéseket hajtja végre: a terhelõközeget kiáramlási közeggel öblíti az extracelluláris radioaktivitás eltávolítása céljából. A felülúszót minden percben hemolíziscsövekbe gyûjti és a közeget egy ekvivalens térfogattal helyettesíti (00 l). Az elsõ három percben vett mintáknál nem kerül sor hatóanyag hozzáadására, ezek lehetõvé teszik egy stabil alapvonal létrehozását, amely jellemzi az I ionok passzív kiáramlását. A következõ hét mintát a vizsgálandó vegyület jelenlétében vesszük. A vizsgálat végén a sejteket 00 l NaOH (0,1 N)/0,1% SDS ( perc) hozzáadásával lizáljuk, így a sejt belsejében maradt radioaktivitás meghatározható. A hemolíziscsövekben levõ radioaktivitást egy gamma-számláló (Cobra II, Packard) segítségével számláljuk beütésszám/percben (cpm). A cpm-ben kapott eredményeket a radioaktív jód kilépési sebességének formájában (R) fejezzük ki az alábbi képlet szerint: R (min 1 )=[ln( 12 It 1 ) ln( 12 It 2 )]/(t 1 t 2 ) ahol 12 It 1 :cpmat 1 idõpontban; 12 It 2 :cpmat 2 idõpontban. Ezt a jodidfluxust egy görbe formájában ábrázoljuk. A jód vizsgálandó molekula beadása miatti kilépésének mennyiségi meghatározásához az alábbi relatív áramlást számoljuk ki, amely lehetõvé teszi, hogy kiküszöböljük az alapfluxust: relatív sebesség (perc 1 )- R csúcs R alap. Végül ezeket az eredményeket normalizáljuk, hogy összehasonlíthassuk a különbözõ hatóanyagokat egymás között. Az eredményeket átlag±sem formában adjuk meg. A hatóanyagok kontrollokhoz képesti hatásának összehasonlítására a Student-féle statisztikai próbát használjuk (a p<0,01-nek megfelelõ értékeket tekintjük statisztikailag szignifikánsnak). M4. Citotoxicitási vizsgálat Az MTT toxicitási vizsgálat egy kolorimetriás vizsgálat, ami a mitokondriális dehidrogenázok azon képességén alapul, hogy az MTT¹t (sárga színû tetrazólium só) formazánná (lila) képesek metabolizálni. Az átalakult színezék koncentrációjával arányos abszorbancia ezután spetkrofotometriásan mérhetõ. A sejteket 96 lyukú lemezeken inkubáljuk a vizsgálandó vegyület jelenlétében 2 órán át. Három kontrollt készítünk: 0% élõ sejtek: hatóanyag nélküli sejtek; 0% élõ sejt: a szabad levegõn hagyott sejtek; vak: közeg sejt nélkül. A sejteket fenolvörös nélküli RPMI közeggel öblítjük, hogy a közeg színe ne zavarja az abszorbanciaméréseket. Ezután 4 órán át 0 l MTT-vel (0, mg/ml) kiegészített RPMI oldattal inkubáljuk 4 órán át. A közeget ezután eltávolítjuk, és 0 l DMSO hozzáadása lehetõvé teszi az átalakult festék (formazán) oldását. Az abszorbanciát spektrofotometriával mérjük: 70 nm¹en (lila); 6 nm¹en (háttérzaj). A háttérzaj kiküszöbölése céljából az alábbi számítást hajtjuk végre: DO valós =DO 70 nm DO 6 nm. Ezután az eredményeket normalizáljuk a kontrollokra (0% és 0% élõsejt), és átlagérték±sem formájában adjuk meg. II) Eredmények R1. Az NB¹DNJ hatása a delf08-címzésre CF1 sejtekben A delf08-cftr fehérje címzésének vizsgálatát laboratóriumban végezzük a farmakológia, a sejtes képalkotás, a biokémiai és elektrofiziológiai vizsgálatok megközelítésének kombinációjával, humán homozigóta tüdõ epiteliális CF1 sejteken a delf08 törlése tekintetében. Különféle molekulák léteznek, amelyek képesek a FTR címzésében részt vevõ bizonyos faktorokkal kölcsönhatásba lépni. Ez figyelhetõ meg az N¹butil-dezoxinojirimicin (NB-DNJ) esetén is, amely egy glükozidáz I és II inhibitor, és amelyet vizsgáltunk. Minden vizsgálatnál egy koktél (Forskoline M, Genistein M) hozzáadása lehetõvé teszi a CFTR aktiválását, ha ez utóbbi a membránon van. Tehát egy jodidkiáramlás figyelhetõ meg, ha a delf08 címzése helyreállt. A hisztogram formájában bemutatott eredményeket standardizáltuk egy referenciakezelés tekintetében (a sejtek kezelése M MPB-91-gyel 2 órán át), amelynél úgy vesszük, hogy 0%¹os CFTR aktivitás van. Itt bemutatjuk, hogy a CF1 sejtek egy N¹glükozidázzal, az N¹butil-dezoxinojirimicinnel (NB-DNJ) (szerkezete a fent bemutatott) 2 órán át 37 C hõmérsékleten végzett kezelése helyreállítja a delf08 fehérje címzését és lehetõvé teszi, hogy iontranszporterként mûködjön (1. ábra). A sejtek kezelésének hiányában a delf08 fehérje nem membránbeli és nincs a koktél (Forskoline M, Geinstein M) által stimulált jodidkiáramlás. Az NB¹DNJ E 0 -értékét (a maximális hatás 0%¹át adó molekulakoncentráció) 123 mol-nál határoztuk meg (2. ábra). Sejtképalkotással a plazmamembrán kom- 8

9 1 HU T2 2 partmentekben lokalizáltuk a delf08 fehérjét az NB¹DNJ-vel történõ kezelés után. R2. Az NB¹DNJ hatása a CFTR aktivitására Calu¹3 sejtekben Abból a célból, hogy bemutassuk, hogy az NB¹DNJ hatása specifikus a delf08 címzése tekintetében és nem változtatja meg a többi kloridcsatornát, az NB¹DNJ¹t a Calu¹3 sejtek potenciális aktivátoraként vizsgáltuk. A 3. ábrán bemutatott eredményeket a Calu¹3 sejteken jodidkiáramlásban kaptuk. Kontrolljaink a forskolin ( M, n=8) és az MPB- 91 ( M, n=8) voltak. Az NB¹DNJ (n=8) nem aktivátora sem a vad típusú CFTR-nek, sem a sejt más anionos transzportjainak, mivel nincs szignifikáns különbség az NB¹DNJ-vel vagy anélkül (alap) kapott értékek között. R3. Az NB¹DNJ hatása a CFTR címzésére Calu¹3 sejtekben Abból a célból, hogy bemutassuk, hogy az NB¹DNJ hatása specifikus a delf08 címzésére, az NB¹DNJ¹t a vad típusú CFTR címzésének modulátoraként vizsgáltuk Calu¹3 sejtekben. A 4. ábrán bemutatott eredményeket 2 órán át NB¹DNJ-vel (00 M) kezelt Calu¹3 sejteken jodidkiáramlásban kaptuk. A 4. ábrán az alapérték megfelel a nem kezelt és MPB¹91 stimuláció nélküli sejteknek. Semelyik jodidkiáramlást nem stimuláljuk. A második kontroll megfelel a kezelés nélküli, de M MPB-91-gyel stimulált sejteknek. Ebben az esetben a CFTR¹t aktiváljuk és egy jodidkiáramlást mérünk. A harmadik kontroll megfelel 2 órán át 37 C hõmérsékleten MPB-91-gyel kezelt, majd M MPB- 91-gyel stimulált sejteknek. A CFTR aktivitása ebben a kísérleti esetben nem különbözik szignifikánsan a két másik kísérlethez képest. Végül, ha a Calu¹3 sejteket 2 órán át 37 C hõmérsékleten 00 M NB¹DNJ-vel kezeljük és M MPB-91-gyel stimuláljuk, a CFTR aktivitása nem változik. Ezek az eredmények azt mutatják, hogy az NB¹DNJ nem befolyásolja a vad típusú CFTR vagy más kloridcsatornák címzésének útját és nem változtatja meg a CFTR aktivitását humán, nem CF pulmonáris epiteliális sejtekben. R4. A címzési út különbözõ inhibitorainak citotoxicitása Abból a célból, hogy vizsgáljuk az NB¹DNJ citotoxicitását, CHO-WT-sejteket inkubáltunk 2 órán át inhibitorok különbözõ koncentrációival, mielõtt az MTT-sejtéletképességi tesztet elvégeztük. Az. ábra az eredmények összefoglalását mutatja be. Az eredmények azt mutatják, hogy a sejtek életképesek az NB¹DNJ minden koncentrációjánál. Ez a molekula tehát nem mutat sejtes citotoxicitást R. NB¹DNJ analógok hatása a delf08 címzésére CF1 sejtekben Összehasonlítottuk az N¹butil-dezoxinojirimicin család (NB-DNJ vagy nb¹dnj) különbözõ vegyületeinek hatásait. A termékeket a 6. ábrán mutatjuk be. Minden kísérlethez egy koktél (Forskoline M, Génistéine M) hozzáadása lehetõvé teszi a CFTR aktiválását, ha az a membránban van. A 7. ábrán bemutatott eredmények azt mutatják, hogy a CF1 sejtek 0 M DNJ-vel, nb¹dmj-vel vagy DMJ-vel 37 C hõmérsékleten 2 órán át történõ kezelése helyreállítja a delf08 fehérje címzését és lehetõvé teszi, hogy az iontranszporterként mûködjön (7. ábra). Ezzel szemben, a DGJ, nb¹dgj, DFJ és nb¹dfj vegyületeknek nincs szignifikáns hatásuk a delf08 címzésére (7. ábra). Minden vegyületre (DNJ, DMJ és nb¹dmj) meghatároztuk az EC 0 -értéket (a maximális hatékonyság 0%¹át adó molekulakoncentráció) > M, 134 M, illetve 113 M koncentrációban. A DFJ, a DMJ, a DNJ, a DGJ, a nb¹dfj és a nb¹dgj nem tartozik bele az igényelt oltalmi körbe. III) Következtetések A kiáramlási vizsgálatok azt mutatták, hogy az NB¹DNJ a delf08 felgyülemlését váltja ki az endoplazmatikus retikulumban és lehetõvé teszi ennek a fehérjének a membránbeli újbóli lokalizációját és így fontos farmakológiai eszközt jelent a delf08 újracímzésében humán pulmonális epiteliális sejtben. Az NB¹DNJ lehetõvé teszi a delf08 specifikus membránbeli címzését anélkül, hogy befolyásolná ennek a fehérjének az iontranszporter-aktivitását és nincs hatással sem a többi kloridcsatornára, sem a sejtek életképességére. Szakirodalom BECQ és munkatársai: (1999) Journal of Biological Chemistry 274, CHENG és munkatársai: (1990) Cell 63, COX és munkatársai: (00) The Lancet 3, DORMER és munkatársai: (01) Journal of Cell Science 114, DWEK és munkatársai: (00) WO 00/62779 számú szabadalmi bejelentés ELLGAARD & HELENIUS (03) Molecular Cell Biology, 4, FIEDLER & SIMONS K. (199) Journal of Cell Science 9, GELMAN és munkatársai: (02) The Journal of Biological Chemistry 277, PLATT és munkatársai: (1994) The Journal of Biological Chemistry 269, PLATT és munkatársai: (01) J. Inherit. Metab. Dis. 24, RIORDAN és munkatársai: (1989) Science 24, TSUI és munkatársai: (198) Science 2, 4 7. WEI és munkatársai: (1996) Journal of cellular Physioly, 168, Az ábrák feliratai 1. ábra: az NB¹DNJ hatása a delf08 címzésére A CF1 sejteket elõzetesen 2 órán át kezeltük az NB¹DNJ-vel (00 M). Az MPB- 91 ( M) hatását 9

10 1 HU T2 2 0%-osnak tekintettük ebben a vizsgálatban. A CFTR aktivitását jodidkiáramlásként mértük (n=8 minden körülményre), fsk M+Gst M stimuláció után. Ns: a különbség nem szignifikáns. ***: szignifikáns különbség P<0, ábra: az NB¹DNJ delf08 címzésére gyakorolt hatásának görbéje A CF1 sejteket elõzetesen 2 órán át kezeltük az NB¹DNJ-vel különbözõ koncentrációkban. A CFTR aktivitását jodidkiáramlásként mértük (n=4 minden koncentráióra), fsk M+Gst M stimulálás után. 3. ábra: az NB¹DNJ anionos transzportra gyakorolt hatása Calu¹3 sejtekben A CFTR aktivitását jodidkiáramlásként mértük (n=8 minden kísérleti körülményben) forskolinnal (fsk) M, MPB¹91 M, NB¹DNJ 00 M stimulálás után. Megjegyezzük, hogy az fsk és az MPB¹91 egy jodidkiáramlást aktivál ebben a sejtben, de az NB¹DNJnek nincs hatása. Ns: a különbség nem szignifikáns. ***: a különbség szignifikáns P<0, ábra: NB-DNJ kezelés hatása Calu¹3 sejtekben A Calu¹3 sejteket elõzetesen inkubáljuk 2 órán át 37 C hõmérsékleten 00 M NB¹DNJ-vel, M MPB-91-gyel. Nem kezelt sejtek: nincs kezelés. Az alap azt jelenti, hogy a sejteket sem nem kezeltük, sem nem stimuláltuk. A CFTR aktivitását jodidkiáramlásként mértük (n=8 minden kísérleti körülményre) M MPB-91-gyel végzett stimulálás után. Megjegyezzük, hogy az NB¹DNJ-vel végzett kezelésnek semmilyen hatása nincs, mivel a kiáramlás stimulálásának szintje ugyanakkora mindhárom kísérleti körülménynél. Ns: nem szignifikáns a különbség.. ábra: NB-DNJ CHO sejtek citotoxicitására gyakorolt hatása Megjegyezzük, hogy az és 0 M nem mutat mérhetõ citotoxicitást. Egy kismértékû citotoxicitás megjelenik 00 M-nél. A sejteket 2 órán át kezeltük. Ns: a különbség nem szignifikáns. ***: a különbség szignifikáns P<0, ábra: az N¹butil-dezoxinojirimicin (NB-DNJ vagy nb¹dnj) és az NB¹DNJ család különbözõ vegyületeinek szerkezete A DFJ, DMJ, DNJ, DGJ, nb¹dfj és a nb¹dgj nem tartozik az igényelt oltalmi körbe. 7. ábra: Az NB¹DNJ és az NB¹DNJ analógok delf08 címzésére gyakorolt hatása CF1 sejtekben A DNJ, DMJ, nb¹dgj, DGJ, nb¹dfj és a DFJ nem tartozik az igényelt oltalmi körbe SZABADALMI IGÉNYPONTOK 1. Egy az alábbi (IIbisz) általános képletû vegyületek közül választott glükozidázinhibitor alkalmazása mukoviszcidózis kezelésére szánt gyógyszer elõállítására: (IIbisz) amelyben R 2 jelentése butilcsoport. 2. Az alábbi képletû vegyületek közül választott vegyület 1. igénypont szerinti alkalmazása vagy NB-DNJ (N¹butil-dezoxinojirimicin) NB¹DMJ (N¹butil-dezoximannojirimicin) 3. Az NB¹DNJ vegyület 1. vagy 2. igénypont szerinti alkalmazása. 4. Az 1 3. igénypontok bármelyikében definiált vegyületek alkalmazása olyan gyógyszer elõállítására, amely beadható orális úton (szirup, szuszpenzió, kapszula, tabletták, por vagy granulátum), rektális úton (kúpok), nazális úton (inhalációs aeroszol vagy cseppek), különösen 1 mg 2 g aktív vegyület/nap mennyiségben felnõttek vagy 1 mg 1 g/nap mennyiségben gyermekek és csecsemõk esetén, egy vagy több adagban.

11 HU T2 Int. Cl.: A61K 31/44 11

12 HU T2 Int. Cl.: A61K 31/44 12

13 HU T2 Int. Cl.: A61K 31/44 13

14 HU T2 Int. Cl.: A61K 31/44 14

15 HU T2 Int. Cl.: A61K 31/44 1

16 Kiadja a Magyar Szabadalmi Hivatal, Budapest Felelõs vezetõ: Törõcsik Zsuzsanna Windor Bt., Budapest