A ferrilhemoglobin szerepe az LDL oxidációjában

Méret: px

Mutatás kezdődik a ... oldaltól:

Download "A ferrilhemoglobin szerepe az LDL oxidációjában"

Irma Juhászné
7 évvel ezelőtt
Látták:

1 A ferrilhemoglobin szerepe az LDL oxidációjában MTA-DEOEC Hemosztázis,Trombózis és Vaszkuláris Biológiai Kutató Csoport Belgyógyászati, Gyermekgyógyászati Intézet Vaszkuláris Biológiai Kutató Laboratórium Potor László

2 Bevezetés Az LDL szubendotheliális térben történő oxidatív modifikációja az egyik első lépés az atheroszklerózis kialakulásában. In vitro LDL oxidation: 1.átmeneti fémek- vas;réz 2.hemproteinek- hemoglobin;cöruloplazmin;mioglobin 3.enzimeket-lipoxigenáz;mieloperoxidáz;tormaperoxidáz. Kutatócsoportunk korábban megállapította,hogy in vivo körülmények között a hem előidézi az LDL oxidációját. A reakció során a hem gyűrű (protoporfirin IX) felnyílik és vas szabadul fel,mely katalizálja az LDL oxidációját. Az oxidált LDL toxikus a legtöbb vaszkuláris sejtre nézve,így fokozza az endothelium károsodását is. LDL oxidációs termékek -konjugált diének -lipid-hidroperoxidok - tiobarbitursav reaktív anyagok

3 AZ LDL oxidatív modifikációja: Lipid peroxidáció mechanizmusa: 1.Iniciációs szakasz: hidrogén elvonás alkil gyök képződése átrendeződés mezoméria stabilizált konjugált dién 2.Propagáció: (szabadgyök képződés láncreakciószerű kiteljesedése) oxigén jelenlétében peroxil gyök hidrogén elvonás lipid-hidroperoxid Fe 2+ alkoxil gyök 3.Termináció: hidrogén elvonás gyökök stabilizálódnak zsírsav fragmentáció dialdehidek keletkeznek

4 Anyagok és módszerek LDL szeparálása: Felnőtt egészséges donortól származó vénás vér Plazma inkubálása1 órán át 37oC-on: 1. Natív LDL 2. 80uM Hemmel 3. 80uM Ferrylhemoglobin uM Ferrylhemoglobin Egy lépéses gradiens ultracentrifugálás LDL frakció begyűjtése. Ferrylhemoglobin előállítása: Felnőtt egészséges donortól származó vénás vér hemoglobin preparálás tisztítás ioncserés kromatográfiával és dializálással ferrylhemoglobin preparálása 10* moláris mennyiségű H2O2-al dializálás Vizsgálati módszerek: 1.LDL oxidatív rezisztenciájának mérése hem eltűnés,lag-time mérés 2.LDL oxidatív módosulásának mérése konjugált dién keletkezés 3.LOOH tartalom mérés 4.Tiobarbitursav reaktív anyagok mérése malondialdehid keletkezés

5 t at Max V Az LDL hem/h2o2-al történő oxidációjának és t at Max V t at Max V t at Max V konjugált diének keletkezésének kinetikája B4 C4 0,260 1,500 0,240 1,400 0,220 1,300 0,200 1,200-5,324 mod/m OD 0,180 0,160 0,140 OD at Max V OD 1,100 1,000 0,900 OD at Max V 24,713 mod/m 0,120 0,800 0,100 0:00:00 0:20:00 0:40:00 1:00:00 1:20:00 1:40:00 2:00:00 0,210 0,200 0,190 0,180 Time B11 0,700 0:00:00 0:20:00 0:40:00 1:00:00 1:20:00 1:40:00 2:00:00 1,250 1,200 1,150 Time D11 OD 0,170 OD at Max V 0,160 0,150 0,140-2,909 mod/m OD 1,100 1,050 OD at Max V 1,000 13,476 mod/m 0,130 0,120 0,950 0,110 0:00:00 0:10:00 0:20:00 0:30:00 0:40:00 0:50:00 1:00:00 1:10:00 1:20:00 1:30:00 1:40:00 Time 0,900 0:00:00 0:10:00 0:20:00 0:30:00 0:40:00 0:50:00 1:00:00 1:10:00 1:20:00 1:30:00 1:40:00 Time

6 A hem és a konjugált dién (lipidperoxidációs termék) koncentrációjának változása spektrofotometriásan követve: LDL oxidatív rezisztenciájának változása (405nm) ΔT at Vmax natív LDL 80uM Hem 80uM Ferrylhb. 160uM Ferrylhb. 0 1.nap 2.nap 3.nap 5.nap 6.nap 7.nap 8.nap 9.nap 14.nap 19.nap LDL oxidatív módosulása (konjugált dién keletkezés;uv-234nm) ΔT at Vmax nap 2.nap 3.nap 5.nap 6.nap 7.nap 8.nap 9.nap 14.nap 19.nap natív LDL 80uM Hem 80uM Ferrylhb. 160uM Ferrylhb.

7 Lipid-hidroperoxid és malondialdehid tartalom mérése LOOH tartalom Concentration (um/mg protein) natív LDL 80uM Hem 80uM Ferrylhb. 160uM Ferrylhb. 1.nap 2.nap 3.nap 5.nap 6.nap 7.nap 8.nap 9.nap 14.nap 15.nap 16.nap Malondialdehid mérés tiobarbitursavas módszerrel Concentration (um/mg protein) natív LDL 80uM Hem 80uM Ferrylhb. 160uM Ferrylhb. 1.nap 2.nap 3.nap 5.nap 6.nap 7.nap 8.nap 9.nap 14.nap 15.nap

8 LDL szeparálása: Na 2 EDTA-val alvadásgátolt vénás vér (50ml) Plazmát (23ml) 1 órán át inkubáltam 37 o C-on: 1. Natív LDL 2. 80uM Hemmel 3. 80uM Ferrylhb uM Ferrylhb. A plazma sűrűségét KBr-dal beállítottam (1,3g/ml) Quick-Seal csőben kétrétegű grádiens fiz.só-val. LDL szeparálás: egy lépéses gradiens ultracentrifugálással (302000G ;4 o C; 2hour; VTi 50.2 rotor,beckman Instrument) Fehérje tartalom mérés: BCA protein módszerrel (mg fehérje/ml) hemoglobin preparálás: Önkéntestől származó alvadás gátolt vérből tisztítás ioncserés kromatográfiával (DEAE- Sepharose CL-6B oszlopon. Oxidált hemoglobin: 1,5* moláris mennyiségű káliumferricianiddal inkubálás 30percig dializálás. Oxidált hemoglobin inkubálás H2O2-al amíg a methemoglobin 70%-a át nem alakul ferrylhemoglobinná (spektrofotometriás nyomonkövetés). LDL oxidatív rezisztenciájának és módosulásának detektálás: Biotek Synergy4 Microplate readeren végeztem. LDL oxidatív rezisztenciáját:405nm-en detektáltam.(hemeltűnés), LDL oxidatív módosulását:uv- 234nm en detektáltam. Anyagok és módszerek 1.

9 Anyagok és módszerek 2. LDL lipid-hidroperoxid tartalma: Ferrous Oxidation in Xilenol Orange (FOX) módszerrel. A mintákat ELISA plate readeren 580nm-en fotometráltam. Tiobarbitursav reaktív anyagok meghatározása: (malondialdehid) Tiobarbitursav reagenssel(2-tiobarbitursav;hcl;tca) Extrahálás után a minták felűlúszóját 532nm-en fotometráltam. MTT-assay on HUVEC cells: Köldökzsinórból szeparált endotél sejteket toxicitási tesztnek vetettem alá. Toxicitási teszt:1 órás hemes vagy ferrilhemoglobinos előkezelés kezelés h2o2-al. LDL oxidatív rezisztenciájának (hem eltűnés) és módosulásának (konjugált dién keletkezés) kinetikája: El nem oxidált LDL kinetikája: Hem eltűnés Hem eltűnés Oxidált LDL kinetikája: Konj.dién keletkezés Konj.dién keletkezés

Hasonló dokumentumok

ACIDUM ASCORBICUM. Aszkorbinsav

ACIDUM ASCORBICUM. Aszkorbinsav 01/2009:0253 javított 7.0 ACIDUM ASCORBICUM Aszkorbinsav C 6 H 8 O 6 M r 176,1 [50-81-7] DEFINÍCIÓ (5R)-5-[(1S)-1,2-Dihidroxietil]-3,4-dihidroxifurán-2(5H)-on. Tartalom: 99,0 100,5%. SAJÁTSÁGOK Küllem: