Gyógyszerhatóanyag hordozó szilika nanorészecskék előállítása és jellemzése

Átírás

1 Gyógyszerhatóanyag hordozó szilika nanorészecskék előállítása és jellemzése Söptei Balázs Témavezető: Dr. Hórvölgyi Zoltán BME-VBK Fizikai Kémia és Anyagtudományi Tanszék 211. január

2 Tartalomjegyzék 1 Bevezetés Irodalmi áttekintés Célkitűzés 1 2 Kísérleti rész Felhasznált anyagok Felhasznált eszközök Jelölések Kísérleti módszerek UV-Vis spektroszkópiai kalibrációk A metilnarancs UV-Vis spektroszkópiai vizsgálata vizes közegben A meloxicam UV-Vis spektroszkópiai vizsgálata etanolos közegben A meloxicam UV-Vis spektroszkópiai vizsgálata benzil-alkoholos közegben A fluoreszcein UV-Vis spektroszkópiai vizsgálata etanolos közegben Mezopórusos és nagyporozitású szilika nanorészecskék szintézise Mezopórusos szilika nanorészecskék előállítása Nagyporozitású szilika nanorészecskék előállítása Stöber-szilika nanorészecskék szintézise Nagyporozitású és mezopórusos szilika nanorészecskék tisztítása; a tisztítás optimalizálása Fluoreszcens nagyporozitású szilika nanorészecskék szintézise Polimer bevonat kialakítása nagyporozitású szilika nanorészecskéken Nagyporozitású és mezopórusos szilika nanorészecskék jellemzése Nagyporozitású és mezopórusos részecskék morfológiai és méreteloszlásvizsgálata 21 2

3 Nagyporozitású és mezopórusos szilika részecskék pórusméreteloszlásának és fajlagos felületének meghatározása nitrogéngőz adszorpciósdeszorpciós módszer segítségével Nagyporozitású szilika nanorészecskék vizsgálata kisszögű röntgenszórás (SAXS) módszerével Mezopórusos és nagyporozitású szilika nanorészecskék szoljainak stabilitás-vizsgálata Mezopórusos és nagyporozitású szilika nanorészecskék Zeta potenciáljának mérése Mezopórusos és nagyporozitású szilika nanorészecskék infravörös spektroszkópiai vizsgálata Adszorpciós kísérletek Metilnarancs adszorpciója nagyporozitású és mezopórusos szilika nanorészecskéken Meloxicam adszorpciója mezopórusos és nagyporozitású szilika nanorészecskéken Fluoreszceinnel jelölt nagyporozitású szilika nanorészecskék jellemzése Fluoreszceinnel jelölt nagyporozitású szilika nanorészecskék UV-Vis spektrofotometriai jellemzése Fluoreszceinnel jelölt nagyporozitású szilika nanorészecskék fluorimetriás jellemzése Fluoreszceinnel jelölt nagyporozitású szilika nanorészecskék stabilitásának és Zeta potenciáljának vizsgálata A részecskékre kapcsolt fluoreszcein mennyiségi becslése Nagyporozitású és mezopórusos szilika nanorészecskék citotoxicitásának vizsgálata 33 3 Eredmények UV-Vis spektroszkópiai kalibrációk 35 3

4 3.1.1 A metilnarancs UV-Vis spektroszkópiai vizsgálata vizes közegben A meloxicam UV-Vis spektroszkópiai vizsgálata etanolos közegben A meloxicam UV-Vis spektroszkópiai vizsgálata benzil-alkoholos közegben A fluoreszcein UV-Vis spektroszkópiai vizsgálata etanolos közegben Nagyporozitású és mezopórusos szilika nanorészecskék tisztítása; a tisztítás optimalizálása Nagyporozitású és mezopórusos szilika részecskék jellemzése Nagyporozitású és mezopórusos részecskék morfológiai és méreteloszlásvizsgálata Nagyporozitású és mezopórusos szilika részecskék pórusméret-eloszlásának és fajlagos felületének meghatározása nitrogéngőz adszorpciós-deszorpciós módszer segítségével Nagyporozitású szilika nanorészecskék vizsgálata kisszögű röntgenszórás (SAXS) módszerével Szilika nanorészecskék szoljainak stabilitás-vizsgálata Szilika nanorészecskék Zeta potenciáljának mérése Adszorpciós kísérletek Metilnarancs adszorpciója nagyporozitású és mezopórusos nanorészecskéken A metilnarancs adszorpció sebességének meghatározása A metilnarancs adszorpciós izotermáinak meghatározása mezopórusos szilika nanorészecskék esetén Meloxicam adszorpciója nagyporozitású és mezopórusos szilika nanorészecskéken A meloxicam adszorpciójának vizsgálata benzil-alkoholos oldatok esetén A meloxicam adszorpciójának kvalitatív elemzése vizes szuszpenziókban A meloxicam adszorpciójának mennyiségi becslése vizes szuszpenziókban 58 4

5 3.4.3 Fluoreszceinnel jelölt nagyporozitású szilika nanorészecskék jellemzése Fluoreszceinnel jelölt nagyporozitású szilika nanorészecskék UV-Vis spektrofotometriai jellemzése Fluoreszceinnel jelölt nagyporozitású szilika nanorészecskék fluorimetriás jellemzése A részecskékre kapcsolt fluoreszcein mennyiségi becslése Szilika nanorészecskék infravörös spektroszkópiai vizsgálata Nagyporozitású és mezopórusos szilika nanorészecskék citotoxicitásának vizsgálata 64 4 Összefoglalás 7 5 Köszönetnyilvánítás 71 6 Függelék 72 7 Hivatkozások 8 5

6 1 Bevezetés 1.1 Irodalmi áttekintés Napjaink legdinamikusabban fejlődő és legszélesebb körben alkalmazott tudományágainak egyike a nanotechnológia. A 1-9 és 1-6 m közötti mérettartományba eső anyagi rendszerek számos olyan előnyös tulajdonsággal rendelkeznek, melyek kiaknázhatók különféle anyagi felületek módosításával, víztisztítási műveletekben, de ugyanilyen fontosnak mondható az elektronikai felhasználás is [1]. Az említett területek mellett jelentős fejlődési irány a nanoanyagok biológiai rendszerekben (biológiai modellek, élő organizmusok) való felhasználása. Az ilyen témájú fejlesztések rendkívüli hatást gyakoroltak (és továbbra is gyakorolnak) a modern orvostudományra, ez a hatás pedig egyre erősödni látszik. Az egymástól távoli diszciplínák összehangolásával számos alkalmazási lehetőség nyílt meg: nanorészecskéket alkalmaznak különféle ígéretes területeken, mint például a DNS technológia, a molekuláris biológia, a molekuláris diagnosztika, vagy az enzimológia [2]. A nanotechnológia biológiai vonatkozásai magukkal hozták a humán felhasználás koncepcióját, mely a nanobiotechnológia egyik legfontosabbnak tartott, ennélfogva nagy vonzerővel bíró célkitűzése. Egyre szélesebb körben terjed a nanorészecskék alkalmazása olyan gyógyszerhordozó rendszerként, melynek feladata adott hatóanyag felvétele, tárolása, szállítása és leadása [3]. Ez a modern gyógyászatnak egy dinamikusan fejlődő és szerteágazóan vizsgált területe, valamint a nanotechnológia segítségével létrehozott termékek egyik legtöbb lehetőséget biztosító alkalmazási formája is. A nanotechnológiai fejlesztések arra irányulnak, hogy a hatóanyagok leadása célzott és kézben tartható legyen. Ezzel lehetséges célszerv-, célszövet-, vagy célsejt-specifikus hatás elérése és a mellékhatások előfordulásának kiküszöbölése, aminek leginkább a rák gyógyításában [4-7] van nagy jelentősége, de újabban a HIV fertőzések kezelésében [8] is szerepet kap. A rendszerek viselkedése a hatóanyag-leadás tekintetében megfelelő modellszámításokkal tervezhető [9]. Egy gyógyszerhordozó fejlesztésekor többféle anyagi rendszerből lehet kiindulni. Széles körben elterjedtek a poliszacharid [1,11], vagy lipid alapú hordozók (melyeket liposzómák [12,13], vagy gélesített struktúrák [14] formájában hoznak létre), de a szervetlen 6

7 nanorészecskéknek is nagy szerep jut az ilyen jellegű fejlesztések során. Egy szervetlen hordozórendszer kialakítható szén nanocsövekből [4], ásványi eredetű vegyületekből (ún. layered double hydroxide részecskék) [15-18], Al 2 O 3 és TiO 2 keverékekből [19], hidroxiapatitból [2], vagy szilícium-dioxidból [21]. Az anyagi variabilitásban rejlő lehetőségek számát csupán a modellanyagok formálhatósága és biokompatibilitása határozza meg (a részecskék töltése egyébként nagyban szerepet játszik az élő sejtekre gyakorolt hatás minőségében [22]). A rendszerek toxicitása in vitro módszerek segítségével vizsgálható [23]. Megfelelő eljárásokkal különböző morfológiájú, megnövelt porozitású és fajlagos felületű szervetlen nanorészecskéket lehet előállítani [24]. Ez a tulajdonság alkalmassá teszi a részecskét arra, hogy gyógyszerhatóanyagokat hatékonyan, nagy affinitással vegyenek fel és raktározzanak. A szilika esetében is többféle jellegzetes struktúra előállítására van lehetőség, mivel az irodalomban számos eljárást publikáltak ezekkel kapcsolatban. Több részecskecsalád létezik, ezek közül legelterjedtebben a mezopórusos szerkezetű [21] és az üreges nanorészecskéket alkalmazzák [25] (habár léteznek ezek kombinálásával létrehozott hibrid részecskék is [26]), ezek a különböző módszerek segítségével széles mérettartományban szintetizálhatók. Kisszögű röntgenszórás és vezetőképesség mérésekkel vizsgálták a mezopórusok kialakulásának mechanizmusát [27]; a szilika-tenzid rendszerek viselkedésének tanulmányozására tehát létezik kivitelezhető technika és kidolgozott mérési módszer, ez azt jelenti, hogy a jövőben valószínűsíthetően tervezhetővé válik a különböző struktúrák hangolása. A porózus szerkezet kialakítása különféle templátok segítségével történhet. Felületaktív anyagokat, például C n TAB-t [7, 27] (kationos), SDBS-t [7] (anionos), P123-t [28, 29] (nemionos), Triton X-1-at [7] (szintén nem-ionos), illetve egyéb amfipatikus vegyületeket lehet ilyen célra alkalmazni. Szerves polimer magok, például polisztirol [3], poliakrilamid [31], vagy metil-metilakrilát (MMA) illetve 2-dimetil-aminoetil-metilakrilát (DMA) [32] felhasználása is elterjedt. Emellett előfordul szervetlen mag használata is, többek között magnetit [32], kalcium-karbonát [34], arany [35], vagy hidroxi-apatit [36]. Kalcium-karbonát templát segítségével nemcsak gömb, de tű alakú nanorészecskéket [37] is sikerült már létrehozni. Bizonyos esetekben a szintézis során segédanyagokat is alkalmaznak, például 7

8 etilén-glikolt és 1,3,5-trimetilbenzolt [38], vagy piperazin-származékot [29], ezzel is befolyásolva a részecskék tulajdonságait és viselkedését. Mindezek mellett alternatív útvonalon is állítottak már elő üreges szilika nanorészecskéket SiH 4 lézeres pirolízisével [39]. Ez egy ígéretes irányvonal nanokapszulák fejlesztésére, mivel az így kapott nanokristályok megfelelő kezelés hatására jelölőágensek nélkül is mutatnak fotolumineszcenciát. Ez a tulajdonság lehetővé teszi a részecskék kimutatását és nyomon követését, emellett szükségtelenné teszi fluoreszcens molekulák alkalmazását a hordozó kialakításakor. A részecskék finomszerkezete tehát a templátoláshoz használt anyagoktól, valamint az előállítás és az utókezelés körülményeitől függ. Ezek változtatásával a legkülönbözőbb struktúrák létrehozására adódik lehetőség. Egy fontos iránya a fejlesztéseknek a stimulus-érzékenység tervezése és kialakítása. Ez a stimulus lehet fizikai (fény [4], mágneses tér [41]), vagy kémiai (különböző molekulák, például glükóz jelenléte [42] a célközegben). Mindezek mellett a részecskéket különböző polimer bevonatokkal kombinálják, melyek a nanorendszereknek új tulajdonságokat kölcsönöznek (például növelhetik a részecskék biokompatibilitását), illetve megakadályozzák a hatóanyagok azonnali felszabadulását, vagy késleltetik, szabályozzák azt (a bevonat nélküli hordozó hatóanyag-leadásának kinetikáját megváltoztatják). Ezek között gyakori a polietilén-glikol (PEG) [33], mely javítja a biokompatibilitást, de használtak már polietilénimint natív [43] és mannózzal funkcionalizált [44] formában, mely a részecskék diszperziófokát volt hivatott javítani. Előfordult már oligomerek, pl. trietilén-glikol (TEG)[45] alkalmazása is. A korábban vizsgált modell-hatóanyagok köre meglehetősen széles. Adszorpciós vizsgálatokhoz alkalmaznak könnyen detektálható és UV-Vis spektrofotometriával meghatározható vegyületeket, például brillantkéket [34], brómkrezolzöldet [26], vagy fluoreszcein izotiocianátot (FITC) [35]. Emellett komplett gyógyszerhordozó rendszereket is előállítottak, ahol a célba juttatandó hatóanyag, például inzulin [42], doxorubicin [33], hidralazin [46], ibuprofen [47], ösztradiol [45], vagy akár plazmid DNS [45] felvételét és leadását vizsgálták. Az egyes hordozókat különböző hatóanyagokra specifikusan optimalizálni lehet. Az inzulin és a nukleinsavak mellett végeztek kísérleteket egyéb makromolekulákkal is, melyek során vizsgálták azok kölcsönhatását különböző nanorészecskékkel. Jelentettek már 8

9 olyan eljárást, melynek segítségével torma peroxidáz enzimet immobilizáltak szilika nanorészecskék belső üregében [48], egy másik publikáció [49] pedig ugyanezen enzim szilika részecskék mezopórusaiban való immobilizálásáról tudósít. Vizsgálták továbbá egyéb, nem enzim jellegű fehérjék adszorpcióját is, például humán szérum albumin [5] esetében. Elmondhatjuk tehát, hogy a speciális szerkezettel rendelkező szilícium-dioxid nanorészecskék felhasználási köre igen széles. A 3 és 4 Å közötti átmérőjű pórusokban lejátszódó folyamatok tanulmányozása nagyprecizitású gravimetriás analizátor segítségével megoldható (a mérés során viszont nem szabad figyelmen kívül hagyni az alkalmazott fázisok jellegét). Az alkalmazott módszer lehetőséget teremt arra, hogy az adszorpció paramétereit meghatározzák [51]. Ezzel olyan információkat nyerhetünk a hordozók viselkedéséről, melyeket a tervezés folyamatában hasznosítani lehet. A hordozók tényleges működését különféle technikákkal in situ vizsgálni lehet. Például ha fluoreszcens jelölést alkalmaznak, az endocitózis folyamata fluoreszcens konfokális mikroszkópiával [52] vizsgálható. A jelölés megvalósítható fluorofór molekulák segítségével (például cianin molekulacsalád [53]), vagy quantum dot jellegű fluoreszcens ágensek (például CdTe nanokristályok [54]) beépítésével. Alkalmaznak sejt-nanorészecske kölcsönhatások megfigyelésére atomi erő mikroszkópiás (AFM) technikát is, melynek segítségével a kölcsönhatásban szerepet játszó hatóerők nagysága kvantitatíve jellemezhető [55]. Különböző módszerek egyéb vizsgálatokat is lehetővé tesznek, ilyenek például mágneses rezonancia képalkotás (MRI) [56], vagy a magnetomotív optikai koherencia tomográfia (MM- OCT) [57]. Ezek az eljárások alkalmasak a részecskék in vivo nyomon követésére és a lejátszódó folyamatok monitorozására, fejlődésük pedig igen dinamikus, emiatt számos lehetőséget rejtenek magukban. Az 1. ábra bemutat egy lehetséges útvonalat egy egyszerű hordozórendszer megalkotására (természetesen egyéb stratégiák is szóba jöhetnek, az egyes lépések sorrendjét és a kivitelezés módját az eljárások paraméterei és alkalmazott körülményei befolyásolhatják). 9

10 1. ábra Nanohordozó kialakításának lehetséges útvonala Az ábrán látható stratégia lehetőséget teremt egy hordozórendszer létrehozásának kidolgozására. A nanohordozók a célba juttatandó hatóanyagnak megfelelően tervezhetők és finomhangolhatók. Mind a hatóanyag, mind a bevonat rögzítése kivitelezhető fizikai (szorpciós folyamatok, másodlagos kölcsönhatások) és kémiai módszerekkel (kovalens kötés kapcsolóágenssel vagy anélkül). A kialakításhoz használt módszereket és technikákat a célmolekula/célmolekulák jellege és a hordozó működése során elérni kívánt farmakológiai viselkedés szabja meg. 1.2 Célkitűzés Munkám során a feladatom olyan szilika nanorészecskék előállítása volt, melyek továbbfejleszthetők gyógyszerhordozó rendszerré. Emellett célom volt olyan porózus szerkezet kialakítása is, mely megnövelt fajlagos felületet, ezzel nagyobb kapacitást biztosít. 1

11 Két részecsketípust (hagyományos mezopórusos és nagyporozitású nanorészecskék) szintetizáltam és hasonlítottam össze különböző szempontok szerint. Az általam szintetizált részecskerendszerek tulajdonságait a Stöber szilika [58] nanorészecskék jellemzőivel is összevetettem 1. Az előállított részecskéknek az alábbi követelményeknek kellett megfelelnie: kolloidális stabilitás különböző vizes közegekben; szűk méreteloszlás; biokompatibilitás (az alkalmazási körülmények mellett nem kimutatható citotoxicitás); potenciál hatóanyagok felvételére; potenciál reszponzív tulajdonságok kialakítására. Ezen kritériumok figyelembe vételével vizsgáltam és jellemeztem az előállított nanorészecskéket. 1 A Stöber módszerrel előállított szilika részecskék a legjobban ismert szilika nanorendszerek. A gyakorlati alkalmazhatóság szempontjából érdemesnek tartottam megvizsgálni, hogy az új típusú részecskék tulajdonságai jobbak, vagy rosszabbak, mint ezeké. 11

12 2 Kísérleti rész 2.1 Felhasznált anyagok Nanorészecskék szintéziséhez és felületmódosításához használt vegyszerek: Aminopropil-dietoxi-metilszilán (APDEMS), 97%, Aldrich; Ammónia oldat, 25%, a. r., Reanal; Ammónium-karbonát, a. r., Lachner; Benzil-alkohol, SZTE Gyógyszertechnológiai Intézet; Cetil-trimetilammónium bromid (CTAB), 99+%, Acrôs; Citromsav, puriss. p. a., Sigma-Aldrich; Dimetil-szulfoxid (DMSO), vízmentes, 99,7+%, Acrôs; Etanol, absz., Reanal; 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimid (EDC), tisztaság ismeretlen, GL Biochem (Shanghai) Ltd; Fluoreszcein, 98,5-1,5%, Fluka; Folsav, 97%, Sigma. Szervesanyag-mentes víz, Millipore; Tetraetil-ortoszilikát (TEOS), puriss., Aldrich; Trietilamin (TEA), puriss., Reanal. Modellhatóanyagok: Meloxicam, SZTE Gyógyszertechnológiai Intézet; Metilnarancs, Reag. Ph. Eur., Fluka. Egyéb célokra használt anyagok: Dinátrium-hidrogén-foszfát, a. r., Reanal; 4-(2-hidroxietil)-1-piperazinetánszulfonsav (HEPES), BioUltra, Sigma; Kalcium-klorid dihidrát, a. r., Reanal; Kálium-klorid, a. r., Reanal; Kloroform, Ultra Resi-Analyzed, J. T. Baker; Magnézium-klorid hexahidrát, a. r., Reanal; Módosított Eagle-féle sejtmédium, SZTE Gyógyszertechnológiai Intézet; Nátrium-citrát, a. r., Reanal; 12

13 Nátrium-hidroxid, szemcsés, a. r., Reanal; Nátrium-klorid, a. r., Reanal; 2.2 Felhasznált eszközök Részecskék előállításához és tisztításához használt eszközök: Dialízis membrán, 1 KDa, Millipore D942; Fűthető keverő; Oldószerálló keverőcella, Millipore; Ultraszűrő membrán, 1 KDa, Millipore; Izzítókemence, Nabertherm. Részecskék jellemzéséhez használt és egyéb eszközök: Fecskendőszűrő, Minisart SRP 25; Sartorius Stedim; Fluoriméter, Perkin-Elmer; FTIR spektrométer, Varian FTS-2 FTIR; Kisszögű röntgen-fényszórás (SAXS) készülék, HASYLAB DESY, DORIS III B1 mérőhely, detektor Pilatus 1M, Dectris; Kombinált ph- és vezetőképesség-mérő, Jenway 354; Nitrogéngőz adszorpciós berendezés, Quantachrome Nova 2; ph mérő, Eutech ph 51; Transzmissziós elektronmikroszkóp (TEM), JEOL JEM-1 CXII, Morgagni 268D; Ultrahangfürdő, S1 Elmasonic; UV-Vis spektrofotométer, Agilent 8453; Zetasizer, Malvern NANO-ZS. 2.3 Jelölések A mezopórusos részecskék esetén az alábbi jelölést használtam: M_[szintézis hőmérséklete C-ban]_[az adott hőmérsékleten készült sarzs sorszáma] Például a 95 C-on készült első mezopórusos sarzs jelölése: M_95_1. Nagyporozitású szilika nanorészecskék szintézise során a paramétereket nem változtattam, így azok esetében a jelölés egyszerűsödött: H_[sarzs sorszáma] 13

14 Például a hetedik szintézis során előállított részecskék jelzése: H_7. A Stöber szilika részecskék esetében a jelölés az alábbi séma alapján történt: S_[névleges részecskeméret]_[az adott névleges átmérőjű sarzs sorszáma] Például a 3 nm névleges átmérőjű, első sarzs jele: S_3_1. További feldolgozás esetén a részecskék jelzését logikus séma alapján bővítettem. 2.4 Kísérleti módszerek UV-Vis spektroszkópiai kalibrációk A modellhatóanyagok és a fluoreszcens jelölőágens (fluoreszcein) kimutatásához és mennyiségi becsléséhez UV-Vis spektrofotometriát használtam, ehhez szükség volt megfelelő kalibrációkra A metilnarancs UV-Vis spektroszkópiai vizsgálata vizes közegben A metilnarancsból 6*1-2 mg koncentrációjú vizes törzsoldatot készítettem, melyből ml különböző töménységű oldatokat állítottam elő. Ezek koncentrációját az 1. táblázat mutatja. 1. táblázat UV-Vis kalibrációhoz használt vizes metilnarancs oldatok töménysége mg Koncentráció ( ) ml mmol Koncentráció ( ) ml 4,5*1-2 1,38*1-4 2,25*1-2 6,87*1-5 1,13*1-2 3,44*1-5 5,63*1-3 1,72*1-5 2,81*1-3 8,59*1-6 1,41*1-3 4,3*1-6 7,3*1-4 2,15*1-6 3,52*1-4 1,7*1-6 Az oldatok abszorbancia spektrumát Agilent 8453 UV-Vis spektrofotométerrel vettem fel. 14

15 A meloxicam UV-Vis spektroszkópiai vizsgálata etanolos közegben Az kalibrációhoz a meloxicamból 5,1*1-2 mg -es etanolos törzsoldatot állítottam elő, ml ebből kiindulva készítettem hígítási sort. Az egyes oldatok koncentráció adatait a 2. táblázat foglalja össze. 2. táblázat UV-Vis kalibrációhoz használt etanolos meloxicam oldatok töménysége mg mmol Koncentráció ( ) Koncentráció ( ) ml ml 1,2*1-2 2,9*1-2 2,4*1-3 5,81*1-3 4,8*1-4 1,16*1-3 8,15*1-5 2,32*1-4 1,63*1-5 4,64*1-5 Az oldatok abszorbancia spektrumát Agilent 8453 UV-Vis spektrofotométerrel vettem fel A meloxicam UV-Vis spektroszkópiai vizsgálata benzil-alkoholos közegben mg A kalibráció során 1 koncentrációjú törzsoldatból indultam ki. Ebből készítettem el a ml kalibráló oldatokat, melyek összetétele a 3. táblázatban található. 3. táblázat UV-Vis kalibrációhoz használt benzil-alkoholos meloxicam oldatok töménysége mg mmol Koncentráció ( ) Koncentráció ( ) ml ml 4,*1-2 1,14*1-1 2,*1-2 5,69*1-2 1,*1-2 2,84*1-2 5,*1-3 1,42*1-2 2,5*1-3 7,11*1-3 1,25*1-3 3,55*1-3 6,25*1-4 1,78*1-3 3,13*1-4 8,89*1-4 Az oldatok abszorbancia spektrumát Agilent 8453 UV-Vis spektrofotométerrel vettem fel A fluoreszcein UV-Vis spektroszkópiai vizsgálata etanolos közegben A fluoreszceinből,2 mg ml koncentrációjú etanolos törzsoldatot készítettem. Ezt továbbhígítottam a 4. táblázatban összefoglaltaknak megfelelő módon. 15

16 4. táblázat UV-Vis kalibrációhoz használt etanolos meloxicam oldatok töménysége mg mmol Koncentráció ( ) Koncentráció ( ) ml ml 2,*1-1 6,2*1-4 4,*1-2 1,2*1-4 8,*1-3 2,41*1-5 1,6*1-3 4,82*1-6 Az oldatok abszorbancia spektrumát Agilent 8453 UV-Vis spektrofotométerrel vettem fel Mezopórusos és nagyporozitású szilika nanorészecskék szintézise A szintézisek ismételhetőségének tanulmányozásához az egyes rendszerekből három független, azonos körülmények között végzett szintézist hajtottam végre. Az így létrehozott rendszereket méret- 2 és pórusméret-eloszlás szempontjából hasonlítottam össze Mezopórusos szilika nanorészecskék előállítása A mezopórusos részecskéket egy irodalmi eljárás [59] módosításával állítottam elő. 24 ml Millipore vízben,5 g CTAB-t és,14 g NaOH-t feloldottam. Az oldatot háromnyakú gömblombikban intenzíven (6 rpm) kevertettem, felfűtöttem a kívánt reakcióhőmérsékletre (a részecskéket 75 C és 95 C közötti hőmérséklet-tartományban állítottam elő, az egyes minták neve tartalmazza a szintézis során alkalmazott hőmérsékletet), majd csepegtetve 3 ml TEOS-t adtam hozzá. A reakcióelegyet hat órán keresztül kevertettem. Ezután a lombikot hideg víz segítségével lehűtöttem. Azért, hogy esetlegesen el nem reagált TEOS és a nátrium-hidroxidot az elegyből eltávolítsam, a részecskéket,1 μm pórusátmérőjű üvegszűrő segítségével szűrtem, és háromszoros mennyiségű vízzel, majd a reakció-térfogattal ekvivalens mennyiségű etanollal mostam. Végül a részecskéket 6 ml etanolban feldiszpergáltam, majd a szuszpenziót ultrahangfürdőben 15 percig homogenizáltam Nagyporozitású szilika nanorészecskék előállítása A nagyporozitású szilika nanorészecskék szintézise során egy irodalmi eljárásból [6] indultam ki. 25,47 ml Millipore víz és 15,3 ml etanol elegyében,16 g CTAB-t feloldottam. Intenzív kevertetés (6 rpm) mellett 5 μl TEOS-t fecskendeztem bele. Végül hozzáadtam 5 μl 25%-os ammónia oldatot. Az elegyet 24 órán keresztül hagytam keveredni. 2 A méreteloszlás ismételhetőségét nagyporozitású részecskék esetében nem vizsgáltam. Ennek tanulmányozása a jövőben végrehajtandó. 16

17 A reakcióidő letelte után a részecskéket,1 μm pórusátmérőjű üvegszűrőn szűrtem, az eredeti reakció-térfogat háromszorosának megfelelő desztillált vízzel mostam. A részecskéket 15 perces ultrahangozással 6 ml etanolban szuszpendáltam fel Stöber-szilika nanorészecskék szintézise Ahhoz, hogy a mezopórusos és nagyporozitású részecskék hatóanyag-felvevő hatékonyságát jellemezhessem, valamint hogy a klasszikus szilika nanorészecskékkel egyéb szempontok alapján is összehasonlíthassam, a Stöber-módszerrel [58] is előállítottam szilika nanorészecskéket. A tervezett mérethez megfelelő mennyiségű vizes NH 3 oldatot (l. 5. táblázat) és 25 ml etanolt összemértem, főzőpohárban kevertettem 15 percig. 1 ml TEOS-t adtam az elegyhez, és 24 órán keresztül szobahőmérsékleten reagáltattam. 5. táblázat Különböző névleges átmérőjű Stöber szilika részecskék szintézise során alkalmazott NH 3 mennyisége (25 ml etanol és 1 ml TEOS esetén) Tervezett részecskeátmérő (nm) 25 ml etanolhoz adott NH 3 - oldat mennyisége (ml) A rendszerből az ammóniát vákuumbepárlással távolítottam el (5 mbar vákuum és 5 C fürdőhőmérséklet alkalmazásával). A kiűzés sikerességét a szol fölé tartott, megnedvesített ph papír segítségével ellenőriztem Nagyporozitású és mezopórusos szilika nanorészecskék tisztítása; a tisztítás optimalizálása Bizonyított, hogy a CTAB a sejtfolyamatokra negatív hatást fejt ki [61], ezért a szilika nanorészecskékből a későbbi, biológiai alkalmazhatóság szempontjából fontos eltávolítani. A CTAB amellett, hogy vízben jól oldódik [62], azzal a tulajdonsággal rendelkezik, hogy adott hőmérséklet felett bomlik [63]. Ennélfogva négy lehetséges módszer jöhet számításba, ha a részecskéket meg akarjuk tisztítani a felületaktív anyagtól: centrifugálás, hőkezelés, dialízis, illetve ultraszűrés. Előkísérletek alapján a centrifugálás nagy veszteséggel jár, ezenkívül hatékonysága is megkérdőjelezhető, ezért a hőkezelést, a dialízist, illetve az ultraszűrést vizsgáltam és hasonlítottam össze. A CTAB eltávolításának sikerességét és hatékonyságát a részecskék infravörös spektrumának elemzésével vizsgáltam. 17

18 A tisztítás után kapott részecskék össztömegét lemértem (hőkezeléssel kezelt részecskék), illetve szárazanyagtartalom-mérés után számoltam, hogy a szintézis véghatásfokát megállapítsam, és ebből a szempontból is összehasonlíthassam a különböző módszereket. Ahhoz, hogy az ismételhetőséget vizsgálni lehessen, a legmegfelelőbbnek talált tisztítási eljárást több, egymás után szintetizált rendszeren is elvégeztem; a termékeket a szennyezőanyagok jelenléte alapján vetettem össze. A legalkalmasabb tisztítási módszer kiválasztásakor a művelet idő-, munka- és oldószerigényét is figyelembe vettem. Hőkezelés: a szintézis és előtisztítás után frissen feldiszpergált részecskékből kapott szuszpenzió 15 ml-ét 6 C hőmérsékleten beszárítottam. Az irodalmi eljárásokban [21, 6] leírt 5 C-os, vagy ennél magasabb hőmérsékletű kezelés az előkísértetek során tapasztaltak alapján azzal a hátránnyal jár, hogy az anyag jelentős része (körülbelül 4%-a) fel nem szuszpendálható, makroszkopikus méretű szemcséket képez. Az így kapott száraz porokat ezért 2 C-on hőkezeltem. A művelethez szükséges minimum idő megállapításához szabályos időközönként mintát vettem az anyagból és IR spektroszkópia segítségével mértem a részecskékben a CTAB jelenlétét. A hőkezelés végén a részecskéket a további felhasználás előtt exszikkátorszekrényben kiszárítottam. Dialízis: az előtisztítás utáni szuszpenzióból 15 ml-t közepes erősségű (kb. 42 rpm) kevertetés mellett 3 ml desztillált vízzel szemben dializáltam. A művelethez 1 KDa áteresztőképességű cellulóz membránt használtam. A vizet naponta háromszor cseréltem. A művelethez szükséges időt a dialízisvízből vett minta alapján állapítottam meg, a CTAB jelenlétét konduktometriás mérés segítségével vizsgáltam. Ultraszűrés: az előtisztított részecskék szoljának 15 ml-ét oldószerálló keverőcella és 1 KDa-os ultraszűrő membrán segítségével 4 bar túlnyomáson szűrtem. Egy irodalmi eljárás [7] során mosófolyadéknak etanol és füstölgő sósav 75:1 térfogatarányú elegyét alkalmazzák, de a HCl az ultraszűrő membránt károsítja, ezért egy hasonló, de ennél kíméletesebb megoldást választottam. A CTAB extrakciójához,1 M töménységű vizes KCl oldatot, majd a későbbi lépésekben desztillált vizet használtam. A mosófolyadék 1 ml-ével felhígítottam a szuszpenziót, ezután a szűrést addig végeztem, míg a szűrlet térfogata a 1 ml-t el nem érte. Ezt a műveletet többször ismételtem. A szükséges lépések számának megállapításához az 18

19 egyes szűrletekből mintát vettem, és a vezetőképesség mérésével vizsgáltam, hogy tartalmazzák-e CTAB-t. A hatásfok becsléséhez az alábbi reakciósémából indultam ki: Si( OC2H 5 ) 4 + 2H 2O SiO2 + 4C 2H 5OH (1) Az összefüggés alapján adott mennyiségű TEOS-ból ekvivalens anyagmennyiségű szilika keletkezik. Az elméleti, 1%-os kitermelésre vonatkozó becsléseket a 6. táblázat tartalmazza. 6. táblázat Nagyporozitású és mezopórusos szilika nanorészecskék szintézisének kitermelésére vonatkozó becslések Részecske típusa TEOS mennyisége (ml) TEOS mennyisége (g) TEOS mennyisége (mol) SiO 2 móltömege (g/mol) Elméletileg keletkező SiO 2 tömege (g) Mezopórusos 3, 2,82 1,3536*1-2,8133 6,843 Nagyporozitású,5,47 2,256*1-3,1356 Mivel a kísérletek során az egyes tisztítási módszerek vizsgálatához az eredeti mennyiség negyedét használtam, a hatásfok számításához a nagyporozitású részecskék esetén,339 g- ot, mezopórusos részecskék esetén pedig,233 mg-ot tekintettem elméleti értéknek Fluoreszcens nagyporozitású szilika nanorészecskék szintézise A nagyporozitású részecskéket egy továbbfejlesztési kísérlet során fluoreszceinnel jelöltem. Célom az volt, hogy fluorimetriás módszerrel kimutatható nanorészecskéket hozzak létre. A módosítást két lépésben hajtottam végre: I. Az APDEMS szililezőszerből és a fluoreszceinből egy amidálási reakcióban fluoreszcens jelőlőágenst állítottam elő (2. ábra). II. Az így létrejött vegyület oldatához hozzáadtam a szilika nanorészecskék etanolos szuszpenzióját, ezt az elegyet szobahőmérséklet fölötti hőmérsékleten kevertettem tovább, hogy a szililezés lejátszódjon. 19

20 2. ábra APDEMS és fluoreszcein reakciója és a keletkező jelölőágens szerkezete (a rajz az ACD/ChemSketch 11.2-es verziójával készült) A fluoreszcens felületmódosítást a továbbiakban leírtaknak megfelelően végeztem. 5 ml vízmentes DMSO-ban 116 mg fluoreszceint feloldottam. Az oldatot argon atmoszféra alatt gömblombikban kevertettem. 5 μl APDEMS-t fecskendeztem bele. A reakciót szobahőmérsékleten egy órán keresztül hagytam folyni. A nagyporozitású szilika nanorészecskékből 15 mg-ot 1 ml etanolban felszuszpendáltam, az így létrejött szolt ultrahangozással 1 percig homogenizáltam, majd a lombikba fecskendeztem. Az elegyet egy kidolgozott eljárás [64] alapján 6 C-on 2 percen keresztül kevertettem. A lombikot vízcsap alatt lehűtöttem. A részecskéket etanol és víz 1:1 térfogatarányú, ismert térfogatú elegyével mostam. A részecskéket végül 3 ml etanolban szuszpendáltam fel. További vizsgálatokhoz a fluoreszceinnel jelölt nagyporozitású részecskék közegét etanolról desztillált vízre cseréltem. Az etanolos szuszpenziót lecentrifugáltam (5 perc, 12 rpm), majd desztillált vízben felszuszpendáltam. A műveletet háromszor ismételtem. 2

21 2.4.6 Polimer bevonat kialakítása nagyporozitású szilika nanorészecskéken A bevonatképzés gyógyszerhordozó részecskék esetében azért fontos, mert egy jól kialakított bevonat segítségével befolyásolható a gyógyszerleadás [4-45]. A kísérlet során azt vizsgáltam, hogy megvalósítható-e a burkolat szintézise a részecskék felületén. A bevonat kialakítását egy mikrogyöngyök módosításához használt eljárás [65] alapján végeztem. 25 ml DMSO-ban feloldottam 27 mg citromsavat és 63 mg folsavat. Hozzáadtam 23 mg EDCt, majd belefecskendeztem 2 μl trietilamint és 2 μl APDEMS-t. 1 perc után további 2 ml DMSO-t adtam az oldathoz. A reakcióelegyet lombikban egy órán keresztül szobahőmérsékleten kevertettem. Ezután nagyporozitású szilika nanorészecskék DMSO közegű, 1 mg ml szárazanyag-tartalmú szuszpenziójából 25 ml-t adtam hozzá. 2 percen keresztül 6 C-on reagáltattam [64]. Ezután a lombikot lehűtöttem, a reakcióelegyet,1 μm pórusátmérőjű üvegszűrőn átszűrtem, majd három lépésben mostam, lépésenként 5 ml etanollal. A szűrőn át nem ment részecskéket végül 2 ml etanolban szuszpendáltam fel Nagyporozitású és mezopórusos szilika nanorészecskék jellemzése Nagyporozitású és mezopórusos részecskék morfológiai és méreteloszlásvizsgálata Az előállított részecskék alakját transzmissziós elektronmikroszkópia (TEM) segítségével vizsgáltam. Mintavételhez a szilika részecskékből spatulányi mennyiséget etanolban felszuszpendáltam. Az etanolos szolt 1:1 arányban kloroformmal elegyítettem. Az így elkészített terítőszolt Petri csészébe töltött Millipore víz felszínére terítettem Hamilton fecskendő segítségével. A vízfelszínen létrejött filmből a részecskéket Formvar réteggel bevont griddel, kanalazó mozdulattal emeltem ki, ezután a gridet szobahőmérsékleten száradni hagytam. Egy másik előkészítési módszer során autopipettával a vizsgálandó szuszpenzióból 2 μl-t a gridre cseppentettek, ezután a csepp kb. felét visszaszívták, a maradék anyagot pedig a gridre rászárították. 21

22 Az elektronmikroszkópos felvételeket Dr. Kovács Attila Lajos készítette az ELTE-TTK Sejt- és Fejlődésbiológia Tanszékén, valamint Dr. Németh Péter és Drotár Eszter az MTA-KK Elektronmikroszkópia Laboratóriumában. A felvételek alapján meghatároztam az egyes rendszerek méreteloszlását Nagyporozitású és mezopórusos szilika részecskék pórusméreteloszlásának és fajlagos felületének meghatározása nitrogéngőz adszorpciós-deszorpciós módszer segítségével A nitrogéngőz adszorpciós-deszorpciós módszer alkalmas mezopórusos rendszerek jellemzésére [66], ezért ezt alkalmaztam a részecskék felületének és porozitásának vizsgálata során. Az előkészítés két fázisból állt. Először a mintákat izzítókemencében vízmentesítettem. Második lépésben 24 órás, hőkezelés következett vákuum alatt, 473 K-en. A mérést 77 K hőmérsékleten végezték statikus volumetrikus elven működő berendezés segítségével. A fajlagos felületet meghatározása a Brunauer-Emmett-Teller (BET) modell alapján, a pórusméret-eloszlás számítása pedig a Non-Local Density Functional Theory (NLDFT) alapján történt. Ez utóbbi illesztés során az izotermák adszorpciós ágát kellett figyelembe venni, emellett azzal a feltételezéssel kellett élni, hogy a pórusok henger alakúak. A rendszereket jellemző változók az alábbi paraméterek figyelembe vételével számíthatók: az adszorpciós egyensúlyhoz tartozó nyomás (p eq ); a N 2 telítési gőznyomása (p ); az adszorpciós egyensúlyi nyomás és a telítési gőznyomás hányadosa ( p eq ). p A teljes pórustérfogat (V TOT ) meghatározása a 1 p p eq ponthoz tartozó adszorbeált térfogat alapján történt. A fenti paraméterekből kiindulva számítható a 3,2 nm-nél, illetve az 5 nm-nél kisebb pórusok össztérfogata (V,4 és V,95 ). Ezek alapján becsülhető a mezo-, illetve makropórusok térfogata. 3 A nagyporozitású részecskék esetében a TEM felvételeken a méreteloszlás meghatározásához nem állt rendelkezésre statisztikai szempontból elegendő részecske, ezért azok méreteloszlásáról közelítő adatokat közlök. 22

23 A mezopórusokra vonatkozó becslés a (2) egyenlet, a makropórusok térfogatának becslése pedig a (3) egyenlet alapján végezhető. V mezo V macro = V V = V,95 TOT,4 V,95 A nanorészecskék pórusméret-eloszlás görbéit az alábbi szempontok alapján hasonlítottam össze: a görbe maximumhelye; a csúcs félérték-szélessége; a görbe alatti terület. A minta-előkészítés második fázisát és a méréseket Bosznai György, az illesztéseket és a számításokat László Krisztina végezte, a BME Fizikai Kémia és Anyagtudományi Tanszék Felületkémia Csoportjánál Nagyporozitású szilika nanorészecskék vizsgálata kisszögű röntgenszórás (SAXS) módszerével A méréseket a HASYLAB (Hamburger Synchrotronstrahlungslabor) DESY (Deutsches Elektronen-synchrotron) mérőállomásán Wacha András és Pósfay Péter végezte, a DORIS III tárológyűrű B1-es mérőhelyénél 4,,8,6 mm méretű röntgennyalábbal. A fotonenergia 1 kev volt, a fehér nyalábból Si (311) kettős kristály monokromátorral vágták ki. A szórt intenzitást a Dectris cég Pilatus 1M detektorával 5 mérték, 885 és 3585 mm minta-detektor távolsággal. A különböző távolságoknál mért görbéket utólagosan összeskálázták Mezopórusos és nagyporozitású szilika nanorészecskék szoljainak stabilitás-vizsgálata A szilika nanorészecskék szoljainak stabilitását dinamikus fényszórás (DLS) segítségével jellemeztem. A stabilitást különféle közegekben vizsgáltam: módosított Eagle-féle sejtmédium 6 ; (2) (3) Komplex tápközeg, mely tartalmaz ásványi sókat (CaCl 2 ; Fe(NO 3 ) 3.9H 2 O; MgSO 4.7H 2 O; KCl; NaHCO 3 ; NaCl; NaH 2 PO 4.H 2 O), D-glükózt, aminosavakat (L-arginin.HCl; L-cisztein; L-glutamin; glicin; L-hisztidin.HCl.H 2 O; L- izoleucin; L-leucin; L-lizin.HCl; L-metionin; L-fenilalanin; L-szerin; L-treonin; L-triptofán; L-tirozin; L-valin) és 23

24 1-2 M KCl oldat; PBS (ph = 7,4); HEPES puffer (ph = 7,4) 7. A PBS, illetve HEPES pufferek összetételét a 7. táblázat foglalja össze 7. táblázat PBS és HEPES pufferek összetétele NaCl KCl Na 2 HPO 4 KH 2 PO 4 MgCl 2.6H 2 O HEPES CaCl 2.2H 2 O Puffer Koncentráció (mm) PBS 137, 2,7 1, 1,76 HEPES 144,93 4,96,98 2,1,95 Sejtmédiumos stabilitás-vizsgálatra azért volt szükség, mert a részecskék toxicitásának mérését meghamisítja, ha azok aggregátumok, vagy üledék formájában vannak jelen. Mivel a közeg komplex és sejttenyésztésre optimalizált, stabilizáló ágensek használata nem megengedett; az egyetlen változtatható paraméter, mellyel a stabilitást befolyásolni lehet, a szuszpenzió szárazanyag-tartalma. A kiindulási szárazanyag-tartalom ezekben az esetekben 1-1 mg volt, ezt hígítottam tovább 1-2, illetve 1-3 mg -re, abból kiindulva, hogy korábbi, in ml ml mg vitro vizsgálatokat [67, 68] 1 -nél alacsonyabb szilika tartalom mellett hajtottak végre. ml Az egyéb közegek esetében 1 méréseket. mg ml szárazanyag-tartalmú rendszereken végeztem a A stabilitás-mérésekhez Zetasizer készüléket használtam. A besugárzó lézer fényének hullámhossza 622 nm. A méreteloszlást a műszerhez tartozó szoftver a detektor különböző pontjaiba beérkező fotonok száma alapján, modellillesztéssel határozza meg. Az illesztéshez használt konstansok értékét a 8. táblázat tartalmazza. vitaminokat (kolin-klorid; D-kalcium pantotenát; folsav; mio-inozitol; nikotinsav; piridoxin.hcl; riboflavin; tiamin.hcl). 7 A HEPES puffer ph-ját,1m NaOH oldattal állítottam be. 24

25 SiO 2 törésmutatója 8 SiO 2 abszorpciója 8. táblázat Szilika nanorészecskék DLS vizsgálata során alkalmazott illesztési paraméterek Diszperziós közeg Diszperziós közeg törésmutatója Diszperziós közeg viszkozitása (mpa*s) Mark- Houwink konstans: A (cm 2 /s) Mark- Houwink konstans: K Etanol 1,359 1,2 1,44,1 3,428*1 38 3,4428*1 38 Víz 1,33 1,31 A mintákból 8 μl-t a műszerrel kompatibilis, eldobható műanyag küvettába töltöttem. A méréseket 2 perces 2 C-os termosztálás előzte meg. Az egyes illesztésekhez 3, egyenként 1 másodperces fotonszámlálásra volt szükség. Rossz stabilitásúnak azt a rendszert tekintettem, melyben mikronos nagyságrendű aggregátumok mutathatók ki a mérés ideje alatt. Másrészt az elektronmikroszkópos felvételek alapján meghatározott részecskemérettel összevetettem a DLS-sel mért átmérőt, ebből szintén következtettem arra, hogy vannak-e jelen aggregátumok. A rendszerek stabilitásának összehasonlításához 1 mg ml szárazanyag-tartalmú, vizes szuszpenziók 9 esetében vizsgáltam a teljes ülepedési időt is (t sed ), melyet a homogenizálás és az egyensúlyi üledék kialakulása között eltelt időként definiáltam Mezopórusos és nagyporozitású szilika nanorészecskék Zeta potenciáljának mérése A mérésekhez KCl-t használtam inert elektrolitnak, melynek vizes közegbeli koncentrációját 1-2 M-ra állítottam be. A mérés Zetasizer készülékkel végeztem. Az alkalmazott lézer hullámhossza 622 nm. A Zeta potenciál számítása a 9. táblázatban összefoglalt paraméterek alapján történt. 8 Az általam előállított szilika nanorészecskék törésmutatója valószínűleg eltér a megadott értéktől. Pontosabb DLS eredményekhez meg kell határozni ezt az új törésmutatót. A DLS vizsgálatok ennek ellenére szolgálnak információval a kolloidstabilitásról. 9 Az említett szuszpenziók KCl-ot is tartalmaztak, 1-2 M koncentrációban. 25

26 9. táblázat Szilika nanorészecskék Zeta potenciál mérése során alkalmazott illesztési paraméterek SiO 2 törésmutatója 1,22 SiO 2 abszorpciója,1 Víz viszkozitása (mpa*s),8872 Víz törésmutatója 1,33 Víz dielektromos állandója 78,5 Illesztési modell Smoluchowski F (K a ) érték 1, Mezopórusos és nagyporozitású szilika nanorészecskék infravörös spektroszkópiai vizsgálata A szilika nanorészecskéket szilárd fázisú ATR módszerrel vizsgáltam. A mérésekhez Golden Gate feltétet használtam. Az IR spektrumokat 4-4 cm -1 hullámszám-intervallumban vettem fel Adszorpciós kísérletek Az adszorpciós vizsgálatok során azt tanulmányoztam, hogy a nanorészecskék képesek-e felvenni különböző hatóanyagokat, pozitív effektus esetén pedig ezzel kapcsolatban mennyiségi becsléseket is végeztem. Ezután azt vizsgáltam, hogy a vizsgált molekulák milyen mennyiségben adszorbeálódhatnának pusztán a részecskék külső felületére, ebből következtettem arra, hogy van-e adszorpció a pórusokban is. Ennek érdekében becsültem a modellanyagok teljes felületi molekuláris borítottsághoz szükséges mennyiségét egyetlen részecske esetén. Az ACD/3D Viewer nevű programmal (verziószáma 11.1) becsléseket végeztem az adszorbeáltatni kívánt molekulák méretével kapcsolatban. A metilnarancs és a meloxicam szerkezetét és becsült méreteit tartalmazza a 3. ábra. 26

27 3. ábra A metilnarancs és a meloxicam szerkezete és becsült molekulamérete (a rajz az ACD/ChemSketch 11.2-es verziójával készült) A két vizsgált modellanyag a metilnarancs és a meloxicam volt. Az előbbinek,7 Å 2 -ös, az utóbbinak pedig 1,4 Å 2 -ös molekuláris felületet becsültem. Az adszorpció jellegének (csak felületi, vagy felületi és pórusos) tanulmányozásához a következő, egyszerűsített feltételekből indultam ki: az adszorpciós egyensúly beálltakor a felületi borítottság teljes, a molekulák a teljes becsült molekuláris felületükkel, kétdimenziósan illeszkednek; az adszorbeált molekulák monomolekuláris réteget alkotnak. Ezek alapján becsültem mezopórusos részecskék esetében a metilnarancsból 1,2*1-19 molt, meloxicamból pedig 5,46*1-2 molt tekintettem telítési mennyiségnek. Nagyporozitású részecskék esetében a metilnarancs telítési mennyiségét 8,68*1-19 molra, a meloxicamét 4,65*1-19 molra becsültem Metilnarancs adszorpciója nagyporozitású és mezopórusos szilika nanorészecskéken A metilnarancs adszorpció sebességének meghatározása Műanyag mintatartókba egyenként 5 mg száraz mezopórusos részecskét mértem ki. A minták mindegyikéhez hozzáadtam 4-4 ml vizes közegű metilnarancs oldatot, melynek kiindulási koncentrációja 6*1-2 mg volt. A részecskéket felszuszpendáltam, a keverékeket ml 15 perces ultrahangozással homogenizáltam. A kísérlet ideje alatt az így összemért rendszereket szobahőmérsékleten inkubáltam. 27

28 Különböző időpontokban meghatároztam a felülúszóban a metilnarancs koncentrációját a következő módon: a szolokat lecentrifugáltam (43 rpm, 15 perc), majd mértem a felülúszó UV-Vis spektrumát. A mérések az elegyek elkészítése után közvetlenül, illetve minden 24 óra elteltével történtek. A felülúszóban mért koncentrációk alapján, indirekt módszerrel becsültem a részecskék által felvett mennyiséget. Minden mérés után a felülúszót visszaöntöttem a részecskékre, majd a szuszpenziót ultrahangfürdőn 5 percig homogenizáltam A metilnarancs adszorpciós izotermáinak meghatározása mezopórusos szilika nanorészecskék esetén A részecskékből 1-1 mg-ot kis mintatartókba kimértem. Ezekhez hozzáadtam különböző töménységű (1. táblázat) vizes metilnarancs oldatokból 5-5 ml-t. Az elegyeket 15 perces ultrahangozással homogenizáltam, ezután egy hétig szobahőmérsékleten inkubáltam. Az egy hét letelte után a mintákat lecentrifugáltam (43 rpm, 15 perc), majd a felülúszókban UV- Vis spektrofotometriával mértem a metilnarancs koncentrációját. 1. táblázat Szobahőmérsékleten végzett adszorpciós kísérletekhez használt metilnarancs-oldatok koncentráció értékei Minta mg µmol c ( ) c ( ) sorszáma ml ml 1 6,*1-2 1,833* ,2*1-2 3,667* ,4*1-3 7,332* ,8*1-4 1,466* ,6*1-5 2,933* ,9*1-5 5,866* Meloxicam adszorpciója mezopórusos és nagyporozitású szilika nanorészecskéken A meloxicam adszorbeáltatása szilika nanorészecskékre azért problémás feladat, mert a hatóanyag vízben csak kis koncentrációban oldódik [69] (1,2*1-2 mg ), nagyobb ml töménységben pedig olyan ph-n (9,5-1,9), mely a szilika részecskék szempontjából kedvezőtlen [7]. Feltételezhető, hogy a meloxicam adszorpciója az alábbi séma szerint játszódik le: k1 k2 Mlx( s) Mlx( aq) Mlx( Si) Ahol Mlx(s) a szilárd fázisban jelenlévő meloxicam mennyisége; Mlx(aq) a vízoldott meloxicam mennyisége; 28

29 Mlx(Si) a szilika felületén adszorbeált meloxicam mennyisége; k 1 a szilárd fázis oldat átmenet sebességi állandója; k 2 az adszorpció sebességi állandója. Az adszorpciós kísérletek során végeztem vizsgálatokat szerves oldószerben (benzil-alkohol), valamint különböző ph-jú vizes közegekben. Ez utóbbiak során szükségesnek találtam az adszorpció és az analitikai feladatok elkülönítését A meloxicam adszorpciójának vizsgálata benzil-alkoholos oldatok esetén Benzil-alkoholos közegben azért vizsgáltam a meloxicam adszorpcióját, mert ebben az oldószerben a gyógyszer jól oldódik. Előkísérletek alapján benzil-alkoholban volt kimutatható effektus, ezért az adszorpció tanulmányozását kvantitatív vizsgálatokkal egészítettem ki. A meloxicamból benzil-alkoholban különböző töménységű oldatokat készítettem, melyek koncentrációi a 11. táblázatban láthatók. 11. táblázat Adszorpciós kísérletek során felhasznált benzil-alkoholos meloxicam oldatok összetétele Minta mg µmol c ( ) c ( ) sorszáma ml ml 1 2, 5, , 2,846 3,5 1, ,5*1-1, ,3*1-1, ,3*1-1,178 A nagyporozitású részecskékből (H_4) 1-1 mg-ot Eppendorf csőbe kimértem, majd hozzáadtam a megfelelő oldatokból,5-,5 ml-t. Az elegyeket 15 percig ultrahangoztam, és egy hétig szobahőmérsékleten inkubáltam. Ezután a szolokat lecentrifugáltam (5 rpm, 1 perc), a felülúszókat pipettázással eltávolítottam, és UV-Vis spektrofotometria segítségével mértem bennük a meloxicam koncentrációját A meloxicam adszorpciójának kvalitatív elemzése vizes szuszpenziókban 15 mg meloxicamot 2 ml vízben elkevertem. A diszperziót 3 percen keresztül ultrahangoztam. Nagyporozitású szilika nanorészecskékből 1 mg szárazanyag-tartalmú, ml desztillált vizes közegű szuszpenziót állítottam elő, melyet ultrahangfürdő segítségével homogenizáltam. A szilika szol 1-1 ml-ét elegyítettem a meloxicam vizes szuszpenziójával a 12. táblázatban leírtaknak megfelelően. 29

30 12. táblázat Vizes közegben végzett kvalitatív adszorpciós kísérletekhez felhasznált meoxicam-víz ( 75 mg ) keverékek 1ml mennyisége 1 ml szilika szolhoz Minta hozzáadott meloxicam sorszáma diszperzió térfogata (ml) 1,5 2,75 3 1, 4 1,25 5 1,5 Az így kapott keverékeket főzőpohárban négy napon keresztül kevertettem. Ezután a részecskék és a gyógyszer elválasztásához az öt elegyből egyenként 5 μl mintát vettem, ezeket 5 rpm-es fordulatszámon 1 percig centrifugáltam. A felülúszókat pipettázással eltávolítottam, ezután a kiülepített részecskéket tartalmazó Eppendorf csöveket egy éjszakán keresztül exszikkátorszekrényben tároltam, hogy a víznyomokat eltávolítsam. A száraz nanorészecskék egy részét (kb. 5%) infravörös spektroszkópiai módszerrel vizsgáltam, a fennmaradó hányadukat pedig 1-1 ml desztillált vízben felszuszpendáltam, ez utóbbi szolokat UV-Vis spektroszkópiai módszerrel tanulmányoztam A meloxicam adszorpciójának mennyiségi becslése vizes szuszpenziókban Vizes rendszerek esetén három különböző ph-n végeztem adszorpciós kísérleteket. Semleges ph-jú közegnek desztillált vizet használtam. Savas ph (4,5) beállításához gyenge savat (citromsav) használtam, mivel a meloxicam erős savak hatására bomlik [71]. A bázikus ph-t (8,5) ammónium-karbonát segítségével állítottam be. mg Nagyporozitású, illetve mezopórusos szilika nanorészecskékből 1 szárazanyag-tartalmú ml szuszpenziót készítettem desztillált vízben, valamint citromsav (ph = 4,5) és (NH 4 ) 2 CO 3 (ph = 8,5) oldatban. A szolokat ultrahangfürdő segítségével homogenizáltam 15 percen keresztül. A meloxicamból adott mennyiségeket mértem ki por formájában (l. 13. táblázat), az egyes mennyiségekből 3-3, azonos tömegnek megfelelő kimérést végeztem a három sorozat (semleges, savas, lúgos) elkészítéséhez. 3

31 13. táblázat Vizes közegben végrehajtott adszorpciós mennyiségi becslésekhez felhasznált meloxicam mennyisége Minta sorszáma Kiindulási meloxicam mennyiség (mg) Kiindulási meloxicam mennyiség (mmol) 1,1 2,85*1-4 2,2 5,69*1-4 3,3 8,54*1-4 4,4 1,14*1-3 5,5 1,42*1-3 6,6 1,71*1-3 7,7 1,99*1-3 8,8 2,27*1-3 9,9 2,56* , 2,85* , 1,42*1-2 A különböző gyógyszermennyiségekhez a megfelelő szuszpenziókból 1-1 ml-t pipettáztam. Az így kapott elegyeket 15 percig homogenizáltam. Az elegyeket egy héten keresztül szobahőmérsékleten inkubáltam. A felvett meloxicam meghatározására egy direkt és egy indirekt módszert alkalmaztam. Direkt módszer: a keverékekből 1 μl mintát vettem. Ezeket lecentrifugáltam (1 rpm, 1 perc), a felülúszót eltávolítottam. A részecskékhez 5 μl etanolt adtam, majd az elegyeket 15 percig ultrahangoztam. 18 óra után az elegyeket lecentrifugáltam (1 rpm, 2 perc), a felülúszót eltávolítottam. A részecskéket két további lépésben újabb 5-5 μl etanollal mostam, a felülúszó eltávolítása a második lépésben 6, a harmadikban 1 óra elteltével történt. Végül az egyes mintákhoz tartozó extraktoldatokat elegyítettem, szárítószekrényben 6 C-on beszárítottam, majd egyenként 1,5 ml etanolban a szárazanyag-tartalmakat újra feloldottam. Az etanolos oldatokban a meloxicam koncentrációját UV-Vis spektrofotometriás módszerrel mértem. Indirekt módszer: a szuszpenziókból az inkubálási idő lejárta után megfelelő térfogatú mintát vettem:,1-1, mg kezdeti meloxicam mennyiség esetén 1-1 μl-t, 5, mg kezdeti mennyiség esetén 2 μl-t. A kivett részleteket,2 μm pórusátmérőjű PTFE fecskendőszűrőn átszűrtem, az esetlegesen a szűrőn adszorbeált gyógyszerhatóanyagot 1, ml etanol segítségével eluáltam 1. Az így kapott oldatokat szárítószekrényben 6 C-on beszárítottam, a meloxicam-tartalmat,1-1, mg kezdeti meloxicam mennyiség 1,5 ml, 5, mg kezdeti mennyiség esetén 2, ml etanolban 1 Azt feltételeztem, hogy a részecskékből a meloxicam az eljárás során nem mosódik ki, és hogy a nem adszorbeálódott gyógyszermolekulák elhanyagolható mennyiségben maradnak a szűrőn. 31

32 oldottam fel. A gyógyszer koncentrációját az UV-Vis spektrumok alapján határoztam meg Fluoreszceinnel jelölt nagyporozitású szilika nanorészecskék jellemzése Fluoreszceinnel jelölt nagyporozitású szilika nanorészecskék UV-Vis spektrofotometriai jellemzése A fluoreszceinnel jelölt nagyporozitású szilika nanorészecskék UV-Vis spektrumát etanolos mg közegben vettem fel. A vizsgált szol szárazanyag-tartalma,5 volt. ml Referenciának azoknak a natív részecskéknek az etanolos szuszpenzióját választottam, melyekkel a kapcsolási reakciót végeztem (H_4). Ahhoz, hogy a spektrumok összevethetőek mg legyenek, ez utóbbi rendszer szárazanyag-tartalmát is,5 re állítottam be. ml Fluoreszceinnel jelölt nagyporozitású szilika nanorészecskék fluorimetriás jellemzése A fluoreszcens kimutatáshoz a fluoreszceinnel jelölt nagyporozitású részecskék (H_4_F2),5 mg szárazanyag-tartalmú etanolos szolját vizsgáltam. A mennyiségi jellemzéshez ebből ml kiindulva különböző szárazanyag-tartalmú hígításokat készítettem, melyek adatait a 14. táblázat tartalmazza. 14. táblázat Fluoreszceinnel jelölt nagyporozitású szilika nanorészecskék fluorimetriás mérésekhez felhasznált, etanolos szuszpenzióinak szárazanyag-tartalom értékei Szárazanyag-tartalom Minta mg sorszáma ( ) ml 5,* ,* ,* ,5* ,3* ,3* ,1*1-3 A szuszpenziókat 494 nm-en gerjesztettem. Az emissziós spektrumokat 51 és 8 nm közötti hullámhossz-tartományban vettem fel, a gerjesztési és az emissziós rés egyaránt 5, nm volt. A gerjesztési spektrumot 4 és 6 nm közötti hullámhossz-tartományban vettem fel, az emissziót 525 nm-es hullámhosszon vizsgáltam. Az emissziós és a gerjesztési rést ebben az esetben is 5, nm-nek választottam. 32

33 A fluoreszcencia-vizsgálathoz referenciának a jelöletlen (H_4) részecskék,5 szárazanyag-tartalmú szolját használtam. mg ml Fluoreszceinnel jelölt nagyporozitású szilika nanorészecskék stabilitásának és Zeta potenciáljának vizsgálata A mérésekhez a jelölt részecskék (H_4_F2) vizes közegű szuszpenzióját használtam. KCl mg oldatot adtam hozzá úgy, hogy a szol szárazanyag tartalma 1, a KCl koncentrációja pedig ml 1-2 M legyen A részecskékre kapcsolt fluoreszcein mennyiségi becslése A részecskék tisztítása során melléktermékként keletkezett etanol-víz közegű fluoreszcein oldatból indirekt módon határoztam meg a részecskékre kötött festékmennyiséget. Az oldatból 1 μl mintát vettem. Ezt szárítószekrényben 65 C-on egy éjszakán keresztül beszárítottam. A szárazanyag-tartalmat 4 ml etanolban oldottam fel. A fluoreszcein koncentrációját UV-Vis spektrofotometria segítségével mértem Nagyporozitású és mezopórusos szilika nanorészecskék citotoxicitásának vizsgálata A mezopórusos és nagyporozitású szilika nanorészecskék sejtes vizsgálataihoz steril mintákra volt szükség, hogy a kísérletekhez használt sejtvonalak ne fertőződjenek be. Ehhez biztosítani kellett a részecskék, a szuszpenziós közeg, illetve a tárolóedények sterilitását. A szuszpenziós közeg desztillált víz volt. Ennek mikroba-mentesítését 6 perces forralással oldottam meg. Az edényeket szárítószekrényben 15 C-on, 4 órás hőntartással sterilizáltam. A nanorészecskék mikroba-mentessége megoldott, mivel a 2 C-os hőkezelés teljes sterilitást biztosít. A részecskéket hőkezelés után közvetlenül betöltöttem a steril tárolóedénybe, hozzáadtam a kiforralt desztillált vízből annyit, hogy a szárazanyag-tartalom 1 mg legyen, majd a szuszpenziót 3 perces ultrahangozással homogenizáltam. A ml tárolóedényt a felhasználásig légmentesen lezártam. A méréseket Dr. Csányi Erzsébet és munkatársai végezték a SZTE Gyógyszertechnológiai Intézetében. 33

34 A szilika nanorészecskék toxicitását LDH [72] és MTT [73] tesztekkel tanulmányozták, a kísérleteket humán CaCo-2 sejtvonalon végezték. A részecskék sejtekre gyakorolt hatását különböző beállított szárazanyag-tartalom értékek (3,1; 6,25; 12,5; 25; 5; 1; 15; 2; µ g 3 illetve 5 ) mellett 1, 4 és 24 órás érintkezési időkkel vizsgálták. ml 34

35 3 Eredmények 3.1 UV-Vis spektroszkópiai kalibrációk A metilnarancs UV-Vis spektroszkópiai vizsgálata vizes közegben A kalibrációs spektrumok és a lineáris regresszió (l. Függelék F 1.1 és F 1.2 ábra) alapján a koncentráció és az abszorbancia közötti kapcsolatot az alábbi összefüggés írja le: A = 73, 121 c mn 464 (4) Ahol A 464 a 464 nm-nél mérhető abszorbancia; c mn a vizes metilnarancs oldat koncentrációja. A regressziós koefficiens (R 2 ) értéke 1,. Ez azt jelenti, hogy a kalibrációs összefüggés vizes metilnarancs oldatok esetében alkalmazható A meloxicam UV-Vis spektroszkópiai vizsgálata etanolos közegben A spektrumok és a regresszió (l. Függelék F 1.3 és F 1.4 ábra) alapján az alábbi kalibrációs összefüggés érvényes: A = 46, 256 c mlx 36 (5) Ahol A 36 a 36 nm-nél mérhető abszorbancia; c mlx az etanolos meloxicam oldat koncentrációja. A regressziós együttható (R 2 ) értéke 1,. Az illesztés tehát megfelelőnek mondható, a kalibrációs összefüggés etanolos meloxicam oldatok vizsgálata során alkalmazható A meloxicam UV-Vis spektroszkópiai vizsgálata benzil-alkoholos közegben A benzil-alkoholos meloxicam oldatokban az abszorbancia maximuma a spektrumok alapján 357 nm-nél található, Ebből kiindulva összepárosítva a koncentráció és abszorbancia értékeket (l. Függelék F 1.5 és F 1.6) meghatározható a kalibrációs összefüggés: A = 2, 363 c mlxb 357 (6) Ahol A 357 a 357 nm-nél mérhető abszorbancia; c mlxb a benzil-alkoholos meloxicam oldat koncentrációja. Az R 2 értéke,9966, ez alapján az illesztés alkalmazható a vizsgált koncentrációtartományban. 35

36 3.1.4 A fluoreszcein UV-Vis spektroszkópiai vizsgálata etanolos közegben A spektrumokon (l. Függelék F 1.7 és F 1.8) több abszorbancia csúcs is megfigyelhető, ezek közül a 456 nm-nél, illetve a 486 nm-nél található maximumokat elemeztem. Az illesztést mindkét adatsorra (456, ill. 486 nm-hez tartozó adatpárok) elvégeztem, az egyenesek egyenletei a következő összefüggésekkel adhatók meg: A456 = 1,468 c fl +,313 (7) Ahol A 456 a 456 nm-nél mérhető abszorbancia; c fl az etanolos fluoreszcein oldat koncentrációja. A486 = 1,245 c fl +,31 (8) Ahol A 486 a 486 nm-nél mérhető abszorbancia; c fl az etanolos fluoreszcein oldat koncentrációja. Az R 2 értéke a 456 nm-es regresszió esetén,9998, 486 nm-nél pedig,9996. Amennyiben azt az opciót választjuk, hogy az egyenes haladjon át az origón, a regressziós koefficiensek értékei,99 alá csökkennek, ezért a mennyiségi vizsgálatokhoz a (7) és (8) egyenletet fogom használni. 3.2 Nagyporozitású és mezopórusos szilika nanorészecskék tisztítása; a tisztítás optimalizálása A hőkezelés idejét IR mérések alapján állapítottam meg. A spektrumokban azt vizsgáltam, hogy a szennyezők kimutathatók-e (l. Függelék F 2.1 és F 2.2 ábra). 32 óra után a spektrumok alapján a CTAB és bomlástermékei eltávoztak. Megemlítendő az is, hogy a hőkezelés hatására a CH 3 -CH 2 -O-(etoxi) csoportok mennyisége lecsökken. A különböző módon tisztított nagyporozitású részecskék IR-spektruma a 4. ábrán, a mezopórusos részecskéké pedig az 5. ábrán látható. 36

37 ,1,8,6,4, ,45,4,35,3,25,2,15,1,5 4 Abszorbancia (AU) CTAB referencia Ultraszűréssel tisztított nagyporozitású részecskék Dialízissel tisztított nagyporozitású részecskék Hőkezeléssel tisztított nagyporozitású részecskék Hullámszám (cm -1 ) 4. ábra Különböző módszerekkel tisztított (ultraszűrés, dialízis, hőkezelés 2 C-on) nagyporozitású szilika nanorészecskék IR-spektruma Hullámszám (cm -1 ),15,1,5 11 6,5,45,4,35,3,25,2,15,1,5 Abszorbancia (arb. unit) CTAB referencia Ultraszűréssel tisztított mezopórusos részecskék Dialízissel tisztított mezopórusos részecskék Hőkezeléssel tisztított mezopórusos részecskék 5. ábra Különböző módszerekkel tisztított (ultraszűrés, dialízis, hőkezelés 2 C-on) mezopórusos szilika nanorészecskék IR-spektruma A spektrumok alapján elmondható, hogy a CTAB jellegzetes sávjai 1462, 1473 és 1487 cm -1 - nél a hőkezeléssel tisztított részecskék esetében eltűnnek. A dialízissel, illetve ultraszűréssel tisztított részecskék esetében ezek a csúcsok megfigyelhetők a spektrumban. Ez alapján a hőkezelés jobb módszernek bizonyul, mint az alkalmazott körülmények mellett végzett dialízis, vagy ultraszűrés. Az ismételhetőségi vizsgálatok (l. Függelék F 2.3 és F 2.4 ábra) alapján a tisztítás jól ismételhető. Az infravörös spektroszkópiai mérések eredményei azt mutatták, hogy a hőkezeléses tisztítás során az egyes rendszerek IR spektrumában a CTAB bomlástermékek és a szilika sávjainak intenzitásaránya közel állandó. 37

38 A 15. táblázat tartalmazza a különböző eljárásokkal kinyert összes részecske-mennyiséget és az egyes módszerekhez tartozó hatásfok-értékeket. Ugyancsak a tisztítási módszerek mennyiségi paramétereit szemlélteti a 6. ábra. 15. táblázat Nagyporozitású és mezopórusos szilika nanorészecskék tisztításához alkalmazott módszerek kitermelése Módszer Hőkezelés Dialízis Ultraszűrés Hőkezelés Dialízis Ultraszűrés η(kísérleti/elméleti mennyiség) (%) Részecsketípus Nagyporozitású Mezopórusos Száraz részecskék tömege (g),317,296,224,14,12,16,199,391,176,1375,151,916,568,1449,947,1367,1161,123 Kísérleti átlagtömeg (g),279 Elméleti részecskemennyiség (g) η (Kísérleti/ elméleti mennyiség) (%) 82,3,44,339 12,79,255 75,22,1264 Hőkezelés Dialízis Ultraszűrés Tisztítási módszer 62,17,988,233 48,6, ,19 Mezopórusos szilika nanorészecskék Nagyporozitású szilika nanorészecskék 6. ábra Nagyporozitású és mezopórusos szilika nanorészecskék tisztításához alkalmazott módszerek kitermelése A mérési eredmények alapján mind a nagyporozitású, mind a mezopórusos részecskék esetében elmondható, hogy η hőkezelés > η ultraszűrés > η dialízis, tehát a hőkezelés mind a CTAB eltávolítás hatékonysága, mind a kitermelés szempontjából optimális módszernek bizonyul. Itt fontos megemlíteni, hogy a hőkezelés során oxidatív folyamatok játszódnak le a 38

39 részecskék felületén (ezt a száraz részecskék színéből lehet megállapítani), emiatt az előállított rendszerek felületi tulajdonságai eltérőek lehetnek attól, amit az ismert szilika nanorészecskék esetében tapasztalhatunk. Az oxidatív folyamatok kézben tartása érdekében célszerű a hőkezelést ismert összetételű, vagy inert gáz-, esetleg ózonatmoszféra alatt végezni. Összefoglalva, a hőkezelést találtam a legalkalmasabb módszernek. Figyelembe véve a kis vegyszer- és munkaigényt, a művelet magas időigényétől eltekinthetünk, másrészt a hatékonyság és a magas kitermelés is egyértelműen a hőkezeléses tisztítás. 3.3 Nagyporozitású és mezopórusos szilika részecskék jellemzése Nagyporozitású és mezopórusos részecskék morfológiai és méreteloszlásvizsgálata A különböző hőmérsékleten szintetizált mezopórusos részecskék jellemző elektronmikroszkópos felvételei a 7. ábrán láthatók. 7. ábra Különböző hőmérsékleten előállított mezopórusos szilika nanorészecskék TEM-felvételei: a) 75 C b) 85 C c) 95 C Az elektronmikroszkópos felvételek alapján két következtetést lehet levonni: az egyik az, hogy a szintézis hőmérsékletének növelésével érzékelhetően megnő a részecskék átlagos mérete, a másik pedig, hogy a nanorészecskék nem kompaktak, hanem megfigyelhető pórusokkal rendelkeznek. A 8. ábra a részecskék TEM-képeit kinagyítva mutatja be. 39

40 8. ábra Különböző hőmérsékleten előállított mezopórusos szilika nanorészecskék pórusszerkezete: a) 75 C b) 85 C c) 95 C A nagyított képek alapján a részecskékben kétfajta mezopórusos szerkezet figyelhető meg: nyílt (átmenő) és zárt (sugaras) pórusok; ez utóbbiak inkább a magasabb hőmérsékleten szintetizált nanorészecskék esetében jelentkeznek. Egy másik megközelítésben az mondható el, hogy alacsonyabb hőmérsékleteken inkább rendezettebb pórusok jönnek létre, míg magasabb hőmérsékleten rendezetlenebbek. Bizonyos rendszerekben megfigyelhető a pórusok hatszöges rendezettsége. A nagyporozitású szilika nanorészecskék TEM-felvételeit a 9. ábra szemlélteti. 9. ábra Nagyporozitású szilika nanorészecskék elektronmikroszkópos felvételei Az elektronmikroszkópos felvételek azt mutatják, hogy a részecskék nagy méretük ellenére kisebb elektronárnyékot képeznek, mint a Stöber szilika nanorészecskék, vagyis egy kevésbé kompakt szerkezettel rendelkeznek. Különbséget tapasztaltam a morfológiában az irodalmi [6] részecskékhez képest: a részecskék nem egy üres héjat alkotnak, hanem egy porózus testet. Ennek oka feltételezhetően az 5 C-nál alacsonyabb hőkezelési hőmérsékletben rejlik 11 (melyet azért alkalmaztam, hogy elkerüljem az irreverzibilis aggregációt). Az is megállapítható, hogy a részecskék porózusak. A pórusok zártak és sugárirányba mutatnak, akárcsak a 95 C-on szintetizált mezopórusos részecskék esetében (az alacsonyabb hőmérsékleten szintetizált mezopórusos részecskékétől viszont alapvetően 11 Ez alapján levonható a következtetés, miszerint az üres gömbök nem a templátolás, hanem a hőkezelés következtében nyerik el végleges szerkezetüket. 4

41 különböző szerkezetet mutatnak a képek). Hatszöges pórusrendezettség a felvételek alapján nem megfigyelhető. A folsavat és citromsavat tartalmazó polimerrel bevont nagyporozitású szilika nanorészecskék (H_1_P1) TEM-képei a 1. ábrán láthatók. 1. ábra Polimerrel bevont nagyporozitású szilika nanorészecskék elektronmikroszkópos felvételei Megállapítható a TEM képek alapján, hogy a részecskék mérete a polimer kapcsolás során körülbelül egyharmadára (!) csökkent. Feltételezhető, hogy a héjban található pórusok összeroppantak. Ez a jelenség további vizsgálatokat igényel. Sötét zóna figyelhető meg a részecskék körül, mely arról árulkodik, hogy a bevonat kialakítása sikeres volt. Megfigyelhető emellett az is, hogy a módosítás során a részecskék nem képeztek aggregátumokat. A továbbiakban áttérek a mezopórusos nanorészecskék méreteloszlás-vizsgálata során kapott eredmények ismertetésére. A részecskék TEM-felvételek alapján meghatározott méreteloszlását szemlélteti a 11. (75 Con szintetizált részecskék), 12. (85 C-on szintetizált részecskék) és 13. (95 C-on szintetizált részecskék) ábra. 41

42 35 3 Részecskearány (%) Részecskeátmérő (nm) Részecskearány (%) 11. ábra 75 C-on szintetizált mezopórusos szilika nanorészecskék méreteloszlása Részecskeátmérő (nm) 12. ábra 85 C-on szintetizált mezopórusos szilika nanorészecskék méreteloszlása 42

43 4 35 Részecskearány (%) Részecskeátmérő (nm) 13. ábra 95 C-on szintetizált mezopórusos szilika nanorészecskék méreteloszlása Az előállított rendszerek szűk méreteloszlásúak. Az adatsorok összehasonlításához a Statistica 9 programmal t-próbákat végeztem, az adatokat pedig Box-Whisker plotok segítségével összehasonlítottam (l. Függelék F 3.1-F 3.3 ábra). Ez alapján az mondható el, hogy a hőmérséklet hatása a részecskeméretre szignifikáns. Másrészt megemlítendő, hogy a számolt méreteloszlás (l. Függelék F 3. 4 és F 3.5 ábra) alapján a részecskeméret ismételhetősége nem elégséges. Az egyes rendszerek részecskeméretre vonatkozó adatait foglalja össze a 16. táblázat. 16. táblázat Mezopórusos szilika nanorészecskék méreteloszlásának jellemző paraméterei Minta Részecskeátmérő Relatív szórás (nm) (%) M_75_1 18 ± 13 12,1 M_85_1 119 ± 14 11,81 M_95_1 127 ± 17 13,23 M_85_2 19 ± 15 13,83 M_85_3 113 ± 15 13, Nagyporozitású és mezopórusos szilika részecskék pórusméreteloszlásának és fajlagos felületének meghatározása nitrogéngőz adszorpciós-deszorpciós módszer segítségével A nagyporozitású és mezopórusos szilika nanorészecskék nitrogéngőz adszorpciósdeszorpciós mérések alapján számított paramétereit a 17. táblázat foglalja össze. 43

44 17. táblázat Nagyporozitású és mezopórusos szilika nanorészecskék fajlagos felülete és pórustérfogata S BET V TOT V,4 V,95 V wide,mezo V macro Minta m 2 cm 3 g g H_4 835,72,575,641,66,79 M_75_1 696,846,468,547,79,299 M_85_1 594,715,386,591,25,124 M_95_1 456,585,288,46,172,125 A táblázatban foglaltak alapján levonható négy fontos következtetés: 1) az alkalmazott eljárás segítségével a nagyporozitású szilika részecskék esetében nagyobb fajlagos felületet sikerült elérni, mint a mezopórusos részecskék esetén; 2) ez a megállapítás a teljes pórustérfogat értékekre nem teljesen igaz: a 75 C-on szintetizált mezopórusos részecskék esetében a nagyporozitású részecskékéhez képest nagyobb maximális V TOT értéket mértek; 3) a mezopórusos részecskék fajlagos felülete és teljes pórustérfogata a szintézishőmérséklet növelésével csökken; 4) a nagyporozitású részecskék belseje is feltételezhetően porózus. Irodalmi adatok [74] szerint 27 nm átmérőjű Stöber szilika részecskék esetében a BET modell alapján a fajlagos felület értéke 18 m 2, a Bond-Spencer modell alapján ez az érték g 67 m 2. A mezopórusos szilika nanorészecskék fajlagos felülete ezt megközelíti, vagy g meghaladja, a nagyporozitású részecskéké pedig egyértelműen meghaladja. Ez utóbbi részecskék magas fajlagos felület értéke feltételezésem szerint a minták V,4 értékei alapján abból származik, hogy a 3,2 nm-nél kisebb átmérőjű pórusok relatíve nagy térfogatot képviselnek, ez sok apró pórust jelent, melyek térfogatukhoz viszonyítva nagyobb felületet képviselnek, mint a nagyobb pórusok 12. Feltételezhető továbbá, hogy a részecskék belső szerkezete is üreges. A 14., 15. és 16. ábrán a különböző részecskerendszerek pórusméret-eloszlásgörbéi láthatók. 12 A felület és a térfogat aránya henger alakú kapilláris esetében a sugárral fordítottan arányos. 44

45 dv(d) (cc/nm/g),9,8,7,6,5,4,3,2, Pórusátémrő (nm) M_75_1 M_85_1 M_95_1 14. ábra Különböző hőmérsékleten szintetizált mezopórusos szilika nanorészecskék pórusméret-eloszlása: 75 C (M_75_1), 85 C (M_85_1), ill. 95 C (M_95_1),4,3 dv(d) (cc/nm/g),2,1 M_85_1 M_85_2 M_85_ Pórusátémrő (nm) 15. ábra Egymástól függetlenül előállított mezopórusos szilika nanorészecskék pórusméret-eloszlása 45

46 dv(d)(cc/mm/g),8,7,6,5,4,3,2,1 H_4 H_3 H_2, Pórusátmérő (nm) 16. ábra Egymástól függetlenül előállított nagyporozitású szilika nanorészecskék pórusméret-eloszlása A diagramok alapján a nagyporozitású és a mezopórusos rendszerekről egyaránt megállapítható, hogy a pórusméret-eloszlás maximumhelye 35 és 4 Å között található. A mezopórusos részecskék esetében az eloszlásgörbe csúcsának kiszélesedése figyelhető meg, ahogy a szintézis hőmérsékletét növeljük. A pórusméret-eloszlásgörbék jellemző adatait tartalmazza a 18. táblázat. 18. táblázat Nagyporozitású és mezopórusos szilika nanorészecskék pórusméret-eloszlása Minta Csúcs maximumhely (nm) Csúcs félértékszélesség (nm) Görbe alatti terület M_75_1 3,8,5,267 M_85_1 3,7 1,,116 M_85_2 3,4 1,,135 M_85_3 3,5 1,1,129 M_95_1 3,8,6,87 H_4 3,5 1,,27 H_3 3,5,8,215 H_2 3,5,9,187 Megállapításokat tehetünk tehát a részecskék pórussokaságát illetően. A részecskék túlnyomó többségben 35 Å átmérőjű pórusokat tartalmaznak, ez az érték nagy biztonsággal ismételhető. Ez az átmérő a kolloidális kölcsönhatásokból kiindulva [27] a hengeres, illetve gömb alakú CTAB micellák méretével összevethető [75]. Amennyiben a modellanyagok molekuláris méretére vonatkozó közelítéseket (a meloxicam két kétdimenziós paramétere 11,5Å*12 Å, a metilnarancsé 4,8 Å *15,4 Å) elfogadjuk, a 35 Å átmérőjű pórusok képesek az adszorbeáltatni kívánt molekulák befogadására. A molekulákat körbevevő és a pórusokat kezdetben kitöltő hidrátburok szerkezetéről és az adszorpciós 46

47 folyamatok mechanizmusáról további, bonyolultabb számítások segítségével nyerhetünk információt. Feltételezésem alapján a vízmolekulák nem képeznek sztérikus akadályt Nagyporozitású szilika nanorészecskék vizsgálata kisszögű röntgenszórás (SAXS) módszerével A 17. ábra mutatja a vizsgált részecskerendszerek SAXS felvételeit. 1, 1, Intenzitás (cm -1 ) 1, 1, 1,,1 H_4 H_6 H_8,1,1 1, q (Å -1 ) 17. ábra Nagyporozitású szilika nanorészecskék SAXS felvételei A SAXS mérések alapján több megállapítást tehetünk. Ezek közül az első az, hogy a,18 Å -1 - nél található csúcsok körülbelül 35 Å nagyságú periodicitásra utalnak. Ez az érték a nitrogéngőz adszorpciós-deszorpciós vizsgálatok alapján meghatározott átlagos pórusméretnek felel meg, tehát azt lehet feltételezni, hogy a SAXS módszerrel mért érték a mezopórusok képviselte periodicitásnak felel meg. Levonhatjuk azt a következtetést is, hogy a pórusok nem mutatnak jellegzetes kétdimenziós rendezettséget (ebben az esetben első- (,18 Å -1 ) és a másodrendű (,36 Å -1 ) csúcsok közötti tartományban is jelentkezne csúcs), hatszöges elrendezkedésről tehát nem beszélhetünk, a mért periodicitás az egymás mellett elhelyezkedő pórusok egymásutániságából fakad (18. ábra). 47

48 18. ábra Pórusok kétdimenziós elhelyezkedése egymáshoz képest: a) Kétdimenziósan rendezett pórusrendszer b) Kétdimenziósan nem rendezett pórusrendszer Az előállított nagyporozitású részecskék pórusai feltételezhetően a 18. b) ábrán bemutatott módon, kétdimenziósan nem rendezetten helyezkednek el egymáshoz képest. Ez a TEM felvételeken megfigyelhető szerkezetet alátámasztja. Harmadrészt megállapítható, hogy a pórusok rendezetlensége az egyes minták esetében eltérő. Ez a csúcsok intenzitásának és szélességének változatossága mutatja: elméletileg a kisebb rendezettségtől a nagyobb felé haladva kisebb félérték-szélességű és nagyobb intenzitású csúcsokat kell, hogy mérjünk Szilika nanorészecskék szoljainak stabilitás-vizsgálata A módosított Eagle-féle sejtmédiumban különböző szárazanyag-tartalmak mellett mért méreteloszlás-görbéket a 19. (nagyporozitású részecskék) és a 2. (mezopórusos részecskék) ábra tartalmazza. 48

49 45 Relatív gyakoriság (arb. unit) nm 369 nm,1 mg/ml,1 mg/ml,1 mg/ml Részecskeátmérő (nm) 19. ábra Nagyporozitású szilika nanorészecskék DLS görbéi módosított Eagle médiumban különböző szárazanyagtartalom értékek esetén Relatív gyakoriság (arb. unit) nm Részecskeátmérő (nm) 396 nm,1 mg/ml,1 mg/ml,1 mg/ml 2. ábra Mezopórusos (95 C-on szintetizált) szilika nanorészecskék DLS görbéi módosított Eagle médiumban különböző szárazanyag-tartalom értékek esetén A méreteloszlás-görbék alapján arra lehet következtetni, hogy a sejtmédiumban a nagyporozitású részecskék 1 nm-nél nagyobb aggregátumok nincsenek jelen. Mezopórusos részecskék esetében megfigyelhető enyhe aggregáció, melynek mértéke a szuszpenzió hígulásával enyhül. A 21. és a 22. ábra mutatja be a nagyporozitású és a mezopórusos részecskék DLS alapján mért méreteloszlását PBS és HEPES pufferekben, valamint 1-2 M koncentrációjú KCl oldatban. 49

50 Relatív gykoriság (arb. unit) nm 342 nm 455 nm PBS HEPES,1 M KCl Részecskeátmérő (nm) 21. ábra Nagyporozitású szilika nanorészecskék DLS görbéi különféle vizes közegekben: PBS és HEPES puffer (ph = 7,4), ill. 1-2 M KCl oldatban Relatív gykoriság (arb. unit) nm 396 nm 712 nm PBS HEPES,1 M KCl Részecskeátmérő (nm) 22. ábra Mezopórusos (8 C-on szintetizált) szilika nanorészecskék DLS görbéi különféle vizes közegekben: PBS és HEPES puffer (ph = 7,4), ill. 1-2 M KCl oldatban A görbék alapján a nagyporozitású részecskék stabilitása mindhárom közegben kielégítő. A mezopórusos részecskék esetében a helyzet kevésbé bíztató: 1-2 M KCl oldatban ugyan túlnyomórészt 1 nm körüli részecskék formájában vannak jelen, azonban aggregátumok is megjelennek. PBS és HEPES pufferben a mérések alapján a részecskék aggregálnak. A 19. táblázat tartalmazza az egyes rendszerek esetében tapasztalt teljes ülepedési idő (t sed ) értékeket. 5

51 19. táblázat Szilika nanorészecskék teljes ülepedési ideje Részecsketípus Részecskeátmérő (nm) t sed (nap) Nagyporozitású 33 5 Stöber 3 7 Mezopórusos 1 5 Stöber 1 >1 Az előállított részecskék tehát ülepednek, a natív Stöber szilika nanorészecskék képest a t sed érték kisebb (vagyis az ülepedés gyorsabb). Meg kell itt említeni azt a megfigyelést, miszerint a Stöber szilika nanorészecskék a diszperziós közeg eltávolítása (szárítás, hevítés, desztilláció) után a vizes közegbeli újraszuszpendálás során makroszkopikus méretű aggregátumokat is képeznek, tehát a kiszáradás hatására romlik a diszperzitásfok, irreverzibilis változások mennek végbe. A mezopórusos és nagyporozitású nanorészecskék esetében ez nem igaz, szabad szemmel megfigyelhető irreverzibilis aggregátumok nem képződnek a diszperziós közeg eltávolítása során, a részecskék könnyen felszuszpendálhatók különböző közegekben (vizes oldatok, etanol, DMSO). A 23. ábra a fluoreszceinnel jelölt nagyporozitású nanorészecskék méreteloszlását mutatja. A diagramon referenciaként megtalálható a kiindulási rendszer méreteloszlás-görbéje is. 45 Relatív gyakoriság (arb. unit) nm H_4 H_4_F Részecskeátmérő (nm) 23. ábra Fluoreszceinnel jelölt (H_4_F2) és jelöletlen (H_4) nagyporozitású szilika nanorészecskék DLS görbéi vizes közegben A DLS alapján a fluoreszcens felületmódosítás vizes közegben nem okoz kimutatható aggregációt, ugyanis a két méreteloszlás-görbe azonos maximumhellyel rendelkezik. Ezenkívül elmondható az is, hogy a felületmódosítás következtében nem nőtt a részecskék hidrodinamikai átmérője. 51

52 A meloxicam adszorpció (1 mg kezdeti meloxicam mennyiség/1 mg szilika nanorészecske) után nyert nagyporozitású nanorészecskék méreteloszlását, valamint a kísérlethez felhasznált részecskék eredeti DLS görbéjét szemlélteti a 24. ábra. 35 Relatív gyakoriság (arb. unit) nm 466 nm Nagyporozitású részecskék meloxicam nélkül Nagyporozitású részecskék meloxicam adszorpciója után Részecskeátmérő (nm) 24. ábra Nagyporozitású szilika nanorészecskék DLS görbéi meloxicam adszorpció előtt és után A mérés alapján a meloxicam adszorpciója nem okoz aggregációt, a részecskék megőrzik önállóságukat. A 25. ábra a polimer bevonattal ellátott nagyporozitású nanorészecskék, valamint azok kiindulási részecskéinek DLS görbéit szemlélteti nm 486 nm Relatív gyakoriság (arb. unit) H_1 H_1_P Részecskeátmérő (nm) 25. ábra Polimerrel bevont (H_1_P1) és prekurzor (H_1) nagyporozitású szilika nanorészecskék DLS görbéi A DLS alapján a részecskék mérete a polimer-kapcsolás során lecsökkent. Az elektronmikroszkópos felvételek ezt alátámasztják. A jelenség okát és mechanizmusát érdemes további módszerekkel vizsgálni. 52

53 3.3.5 Szilika nanorészecskék Zeta potenciáljának mérése A nagyporozitású szilika nanorészecskék Zeta potenciál görbéi a 26. ábrán, a mezopórusos részecskéké a 27. ábrán láthatók.,1 Össz. fotonszám (arb. unit) x 1,9,8,7,6,5,4,3,2 H_4 H_7 H_8, Zeta potenciál (mv) 26. ábra Nagyporozitású szilika nanorészecskék Zeta potenciál görbéi,7 Össz. fotonszám (arb. unit) x 1,6,5,4,3,2,1 M_8_2 M_8_3 M_8_ Zeta potenciál (mv) 27. ábra Mezopórusos szilika nanorészecskék Zeta potenciál görbéi A mérések alapján a nagyporozitású részecskék Zeta potenciál-görbéinek maximuma a natív Stöber szilika részecskékéhez hasonlóan nagy abszolút értékű, negatív érték. Az is elmondható, hogy a rendszerek Zeta-potenciálja kevésbé ismételhető. Két következtetést lehet levonni a Zeta potenciál mérések alapján. Az egyik, hogy a nagyporozitású nanorészecskék szuszpenziói megfelelő kolloidstabilitással rendelkeznek, a mezopórusos részecskék rendszerei azonban kevésbé stabilak. A másik, hogy a Zeta potenciál értékek relatíve széles intervallumban mozognak (szélesebb határok között, mint 53

54 amit a mérés pontatlansága indokolna), de az esetek többségében megközelítik a Stöber szilika nanorészecskék esetében [76] mért értéket (-43,1 ± 1,9 mv). A fluoreszceinnel jelölt nagyporozitású szilika nanorészecskék, valamint azok szintéziséhez használt, jelöletlen részecskék Zeta potenciál görbéit mutatja a 28. ábra.,7 Össz. fotonszám (arb. unit) x 1,6,5,4,3,2,1 H_4 H_4_F Zeta potenciál (mv) 28. ábra Fluoreszceinnel jelölt (H_4_F2) és jelöletlen (H_4) nagyporozitású szilika nanorészecskék Zeta-potenciál görbéi A görbék alapján két dolog mondható el: (1) a felületmódosítási lépés sikeres volt, a pozitív irányba való eltolódást valószínűleg a fluoreszcein és a lefedetlen amino-csoportok okozzák; (2) a részecskék a módosítás után kevésbé stabilak, mint előtte. A 29. ábrán látható a meloxicam adszorpciója után vizsgált nagyporozitású nanorészecskék Zeta potenciál görbéje (referenciának az adszorpciós kísérlet előtt vizsgált rendszer Zeta potenciál görbéjét ábrázoltam).,9 Össz. fotonszám (arb. unit) x 1,8,7,6,5,4,3,2,1 Nagyporozitású részecskék meloxicam nélkül Nagyporozitású részecskék meloxicam adszorpciója után Zeta potenciál (mv) 29. ábra Nagyporozitású szilika nanorészecskék Zeta potenciálja meloxicam adszorpció előtt és után 54

55 Jól látható, hogy a meloxicam adszorpciója után a részecskék eltérő módon viselkednek, mind azelőtt. A Zeta potenciál görbe két csúcsot tartalmaz, a maximumhelyek -2,9 és -61,4 mv-nál találhatók. Ez alátámasztani látszik a DLS vizsgálatok eredményét, miszerint a meloxicam adszorpciója nem rontja a kolloidstabilitást. A további értelmezéshez egyéb vizsgálatok szükségesek. 3.4 Adszorpciós kísérletek Metilnarancs adszorpciója nagyporozitású és mezopórusos nanorészecskéken A metilnarancs adszorpció sebességének meghatározása A 3. ábra szemlélteti a különböző részecskerendszerek esetében mért mennyiség-idő görbéket. Felvett mennyiség (mg hozzáadott/mg felvett) (%) Idő (nap) M_75_1 M_85_1 M_95_1 3. ábra Mezopórusos szilika nanorészecskék metilnarancs-felvétele az idő függvényében A görbék alapján elmondható, hogy a metilnarancs adszorpciója a mezopórusos részecskék esetében lassú folyamat, az egyensúly egy hét alatt áll be A metilnarancs adszorpciós izotermáinak meghatározása mezopórusos szilika nanorészecskék esetén A metilnarancs adszorpciós izotermájának felvétele Stöber szilika nanorészecskék esetében nem volt sikeres. Ezt okozhatta az, hogy a Stöber részecskéken az adszorpció sebessége alacsony, vagyis hosszabb inkubálási időre van szükség a vizsgálatok elvégzéséhez, 55

56 ugyanakkor az is lehetséges, hogy a felület kisebb adszorptívum mennyiségeknél már telítődik. A mezopórusos részecskék adszorpciós izotermái a 31. ábrán láthatók.,45,4,35 c a (μmol/mg),3,25,2,15,1,5,5,1,15,2 c (μmol/ml) M_75_1 M_85_1 M_95_1 31. ábra Mezopórusos szilika nanorészecskék adszorpciós izotermája (az inkubálás szobahőmérsékleten zajlott egy héten keresztül) A diagram alapján az izotermák telítésbe hajlanak, a telítési metilnarancs-koncentráció azonban a vizsgált koncentráció-tartományon kívül esik. Mellesleg a görbék lefutása látszólag nincs összefüggésben a mért fajlagos felület és pórustérfogat adatokkal. Elmondható, hogy a maximálisan adszorbeált metilnarancs-mennyiség két (M_85_1), illetve három (M_75_1 és M_95_1) nagyságrenddel meghaladja a becsült felületi telítési anyagmennyiséget (melynél azt feltételezzük, hogy az adszorptívum kizárólag a gömbök külső felületén kötődik). Ebből arra lehet következtetni, hogy az adszorpció a pórusokban is lejátszódik Meloxicam adszorpciója nagyporozitású és mezopórusos szilika nanorészecskéken A meloxicam adszorpciójának vizsgálata benzil-alkoholos oldatok esetén Benzil-alkoholos közegben a Stöber szilika nanorészecskék vizsgálata során nem mutattam ki adszorpciós effektust. A mérések alapján az eredmények ellentmondásosak voltak, elemzésük nem lehetséges. Ennek oka feltehetően mérési hiba, mely abból származhat, hogy a benzil-alkoholos oldatok nehézkesen homogenizálhatók. 56

57 A meloxicam adszorpciójának kvalitatív elemzése vizes szuszpenziókban Az adszorpciós kísérlet végén vizsgált szilika nanorészecskék UV-Vis spektrumát mutatja a 32. ábra.,5 Abszorbancia (AU),4,3,2,1 H_4 + meloxicam meloxicam (etanolban) λ(nm) 32. ábra Nagyporozitású szilika nanorészecskék (H_4) UV-Vis spektruma meloxicam adszorpció után Mindkét görbén látható 36 nm-es hullámhossz környékén egy-egy abszorbancia csúcs, melyek az etanolos és benzil-alkoholos közegű kalibrációs mérések alapján a meloxicamra jellemzőek. Ez azt jelenti, hogy az UV-Vis spektrofotometriás méréssel az adszorpciós effektus kimutatása megtörtént. További információt szolgáltat az adszorpciós effektusról a 33. ábra, mely a meloxicam adszorbeáltatása után vizsgált részecskék, valamint referenciaként a kiindulási részecskék, illetve a meloxicam IR spektrumát mutatja.,2,15,1,5 Abszorbancia (arb. unit) H_4 meloxicam H_4 + meloxicam Hullámszám (cm -1 ) 33. ábra Nagyporozitású szilika nanorészecskék (H_4) infravörös spektruma meloxicam adszorpció előtt és után 57

58 Jól látható, hogy a meloxicam jellegzetes sávjai megjelennek az adszorpciós kísérlet végén vizsgált részecskék IR spektrumában. Az IR vizsgálatok tehát megerősítik azt, amit az UV-Vis mérések eredményei alapján láthattunk, vagyis hogy a meloxicam adszorbeálódott a nagyporozitású szilika részecskékre. Feltételeztem ezek alapján, hogy a mezopórusos részecskék esetében is lesz adszorpciós effektus A meloxicam adszorpciójának mennyiségi becslése vizes szuszpenziókban A direkt módszer kivitelezése során problémák merültek fel a részecskék által felvett meloxicam mennyiségének mérésével kapcsolatban. Az UV-Vis vizsgálatok alapján a részecskék és a felülúszók elválasztása nem volt teljes, ezt a spektrumokon megfigyelhető fényszórási effektus mutatta. A matematikai spektrum-transzformációk elvégzése után az abszorbancia értékekből becsült felvett hatóanyag-mennyiségeket a 34. ábra mutatja.,8 Felvett meloxicam mennyiség (mg),7,6,5,4,3,2,1 Lúgos közeg Savas közeg Semleges közeg,1,2,3,4,5,6,7,8,9 1, Kezdeti meloxicam mennyiség (mg) 34. ábra Nagyporozitású szilika nanorészecskék meloxicam felvételének direkt módszeres becslése Ez a módszer nem alkalmas a felvett meloxicam mennyiségi becslésére, ugyanis nem állapítható meg koherens összefüggés a hozzáadott és a felvett hatóanyag mennyisége között. Ennek okai az alábbiak lehetnek: a felülúszók és a részecskék elválasztásának tökéletlensége miatt a nem adszorbeálódott meloxicam is bekerülhetett a mérendő oldatokba; az elválasztás ennél a módszernél nem standardizálható; a meloxicamot nem lehet az alkalmazott előkészítési műveletekkel megfelelően kinyerni a nanorészecskékből; az el nem választott részecskék a rájuk adszorbeált hatóanyag és saját fényszórásuk miatt ismeretlen mértékben járulnak hozzá az abszorbancia növekedéséhez; 58

59 az előkészítés során bizonyos minták esetében veszteség keletkezhetett, azaz részecskék is kimosódhattak a felülúszó eltávolításakor, ennek következtében a kinyerhető gyógyszermennyiség lecsökkent. Mindezek mellett az is megemlítendő, hogy savas közegben az UV-Vis spektrumokon az alacsonyabb hullámhossz-tartományba eső csúcsok is megfigyelhetők voltak. Ez azt engedi feltételezni, hogy a meloxicam gyenge sav hatására is bomlik, ezért a 4,5-ös ph-jú mintasereg nem használható. Ezt figyelembe véve savas közegben nem végeztem további vizsgálatokat. Semleges és lúgos közegben a felvett hatóanyag becslését az indirekt módszerrel is elvégeztem. Ennek eredményét mutatja a 35. (nagyporozitású részecskék) és a 36. mezopórusos részecskék) ábra. 3 2,5 c a (μmol/mg) 2 1,5 1,5 Semleges közeg Lúgos közeg c (μmol/l) 35. ábra Nagyporozitású szilika nanorészecskék meloxicam felvételének indirekt módszeres becslése semleges és lúgos (ph = 8,5) közegben (c : kiindulási meloxicam koncentráció a szuszpenzióban, c a : adszorbeált meloxicam mennyisége a részecskék tömegére vonatkoztatva) 59

60 3 2,5 c a (μmol/mg) 2 1,5 1,5 Semleges közeg Lúgos közeg c (μmol/l) 36. ábra Mezopórusos szilika nanorészecskék meloxicam felvételének indirekt módszeres becslése semleges és lúgos (ph = 8,5) közegben (c : kiindulási meloxicam koncentráció a szuszpenzióban, c a : adszorbeált meloxicam mennyisége a részecskék tömegére vonatkoztatva) Két következtetést lehet az ábrák alapján levonni: egyrészt azt, hogy az adszorpció mértéke a vizsgált tartományban nem függ a vizes közeg ph-jától (amennyiben 8,5-ös ph-t alkalmazunk), mivel az adatpárokra illeszthető egyenesek közel azonos paraméterekkel jellemezhetők; másrészt pedig azt, hogy a nagyporozitású és a mezopórusos részecskék az adott anyagmennyiség intervallumban hasonlóan viselkednek. Több információt nyújt az adszorpció mértékéről a 37. ábra, mely szélesebb kezdeti meloxicam mennyiség tartományban végzett kísérletek eredményeit mutatja nagyporozitású és mezopórusos nanorészecskék esetében c a (μmol/mg) Nagyporozitású részecskék Mezopórusos részecskék c (μmol/l) 37. ábra Nagyporozitású és mezopórusos szilika nanorészecskék meloxicam felvételének indirekt módszeres becslése semleges közegben (c : kiindulási meloxicam koncentráció a szuszpenzióban, c a : adszorbeált meloxicam mennyisége a részecskék tömegére vonatkoztatva) 6

61 A két adszorpciós izoterma közötti különbségek a kétféle rendszer eltérő szerkezeti tulajdonságaiból adódhatnak. Fontos megemlíteni azt a tényt, miszerint az alkalmazott indirekt módszer egyik nagy hátránya, hogy a visszamért, nem adszorbeált meloxicam mennyisége nem feltétlenül csak az adszorpciós effektus miatt kevesebb az eredeti mennyiségnél (látszólagos adszorpciót mérünk), elképzelhető ugyanis például, hogy a gyógyszermolekulák elbomlanak. Emiatt a meloxicam adszorpcióval kapcsolatos mennyiségi eredmények nem teljesek, vagyis egy független mérési módszer eredményeivel kiegészítendők Fluoreszceinnel jelölt nagyporozitású szilika nanorészecskék jellemzése Fluoreszceinnel jelölt nagyporozitású szilika nanorészecskék UV-Vis spektrofotometriai jellemzése UV-Vis spektroszkópiai mérések alapján a fluoreszcein jelenléte nem mutatható ki egyértelműen a nanorészecskékben Fluoreszceinnel jelölt nagyporozitású szilika nanorészecskék fluorimetriás jellemzése A 38. ábrán látható a jelöletlen (H_4) és jelölt (H_4_F2) nagyporozitású szilika részecskék fluoreszcencia emissziós spektruma Intenztiás (arb. unit) H_4 H_4_F λ em (nm) 38. ábra Fluoreszceinnel jelölt (H_4_F2) és jelöletlen (H_4) nagyporozitású szilika nanorészecskék fluoreszcens emissziós spektruma 61

62 A fluoreszcencia spektrum igazolja a sikeres felületmódosítást, az 52 nm-nél megjelenő csúcs ugyanis a fluoreszceinre jellemző. A gerjesztési spektrum (l. Függelék 4.1 ábra) ezt alátámasztja. A fluoreszcensen jelölt részecskék különböző szárazanyag-tartalmú szuszpenzióinak fluoreszcens spektrumait a 39. ábra mutatja be, a szárazanyag-tartalom intenzitásmaximum adatpontok pedig a 4. ábrán láthatók. 25 Intenzitás (arb. unit) λ (nm) 1,*1-1 mg/ml 5,*1-2 mg/ml 2,5*1-2 mg/ml 1,25*1-2 mg/ml 6,25*1-3 mg/ml 39. ábra Fluoreszceinnel jelölt (H_4_F2) nagyporozitású szilika nanorészecskék fluoreszcens emissziós spektrumai különböző szárazanyag-tartalmú etanolos szuszpenziókban 12 Emissziós maximum (arb. unit) ,1,2,3,4,5,6 Szárazanyag-tartalom (mg/ml) 4. ábra Fluoreszceinnel jelölt (H_4_F2) nagyporozitású szilika nanorészecskék emissziós maximum szárazanyagtartalom értékpárjai etanolos szuszpenzióban A mérési eredmények alapján az adatpontokra egyenest illesztettem (9). I max = 193,2 cs,68 Ahol I max a maximális fluoreszcencia-intenzitás, (9) 62

63 c s a szuszpenzió szárazanyag-tartalma. A regressziós koefficiens értéke 1,. Ez alapján elmondható, hogy a szárazanyag-tartalom és a fluoreszcencia-intenzitás közötti összefüggés jó közelítéssel lineáris a vizsgált koncentráció-tartományban. A 4 ábra alapján az is megfigyelhető, hogy 6,25*1-3 mg szárazanyag-tartalom mellett még ml mérhető a részecskék fluoreszcenciája etanolos közegben. A jel-zaj arány ebben az esetben még éppen meghaladja a 3:1 arányt, tehát ez tekinthető kimutatási határnak A részecskékre kapcsolt fluoreszcein mennyiségi becslése A 41. ábra mutatja a fluoreszceinnel jelölt részecskék (H_4_F2) felülúszójából felvett UV-Vis spektrumot és két ismert koncentrációjú fluoreszcein oldat spektrumát. Abszorbancia (arb. unit),5,45,4,35,3,25,2,15,1, λ(nm) Fluoreszecinnel jelölt nagyporozitású részecskék (H_4_F2) felülúszója 2,*1-1 mg/ml etanolos fluoreszcein oldat 8,*1-3 mg/ml etanolos fluoreszcein oldat 41. ábra Fluoreszceinnel jelölt nagyporozitású szilika nanorészecskék felülúszójának UV-Vis spektroszkópiai vizsgálata Mivel a 47 nm feletti hullámhossz-tartományban a felülúszó spektrumának csúcsa torzult, a kapcsolt fluoreszcein becsléséhez a 456 nm-nél található csúcs abszorbanciáját vettem figyelembe. A számítások alapján a fel nem kapcsolt fluoreszcein mennyisége 11 mg, a festékből tehát 15 mg-ot, sikerült a részecskékhez kapcsolni. Ez az érték azt jelenti, hogy egyetlen nanorészecskén 3,7*1-13 mol fluoreszcein molekula található. Ez azt engedi feltételezni, hogy a festékmolekulák nemcsak a felületen, hanem a pórusokban is megtalálhatók (ebben az esetben valószínűleg a natív, és az APDEMS-hez kapcsolt forma egyaránt jelen van). 13 Mivel a vizsgált minta a mi esetünkben nem egy optimalizált rendszer, a kimutatási határ nagyobb mennyiségű fluoreszcein kapcsolásával lecsökkenthető. 63

64 3.4.4 Szilika nanorészecskék infravörös spektroszkópiai vizsgálata A folsav-citromsav polimerrel bevont nagyporozitású szilika nanorészecskék IR spektruma a 42. ábrán látható.,2,2, ,1 27,16,14,12,1,8,6,4 Abszorbancia (arb. unit) Bevonatképzés előtti (H_1) részecskék Bevontatképzés utáni (H_1_P1) részecskék, Hullámszám (cm -1 ) 42. ábra Nagyporozitású nanorészecskék IR spektruma folsav- és citromsavtartalmú polimeres bevonatképzés előtt és után Összevetve a két rendszer spektrumát, több megállapítást tehetünk. A legszembetűnőbb, hogy a bevonatképzés után a -(Si-O)- sávok a magasabb hullámszámok irányába tolódtak el ( cm -1 ). Ez a nagymértékű változás azt jelenti, hogy a szilícium-oxigén kötések jellege megváltozott (feltehetően kompaktabb lett az anyag szerkezete, emiatt figyelhető meg az eltolódás). Ez alátámasztja az elektronmikroszkópos felvételeken megfigyelt zsugorodást. Másrészt megfigyelhető 285, 292 és 2974 cm -1 -nél határozott sávok jelennek meg, melyek -(CH 2 )-, illetve -(CH 3 ) csoportokra utalnak. Ezenkívül 1417 és 1436 cm -1 -nél szintén új sávok jelennek meg. Tehát a bevonat jelenlétét a két IR spektrum különbségei alapján sikerült kimutatni Nagyporozitású és mezopórusos szilika nanorészecskék citotoxicitásának vizsgálata Az egyórás LDH tesztek eredményeit a 43. (nagyporozitású részecskék) és a 44. ábra (mezopórusos részecskék) foglalja össze. 64

65 43. ábra Nagyporozitású szilika nanorészecskék citotoxicitás-vizsgálata (LDH) CaCo-2 sejteken, 1 órás érintkezés esetén 44. ábra Mezopórusos szilika nanorészecskék citotoxicitás-vizsgálata (LDH) CaCo-2 sejteken, 1 órás érintkezés esetén Szembetűnő, hogy az elpusztult sejtek aránya a kontroll értékekhez közel található (az összes vizsgált szárazanyag-tartalomnál). Ebből azt a következtetést lehet levonni, hogy egyórás expozíció esetén sem a nagyporozitású, sem a mezopórusos részecskék nem toxikusak. 65

66 Magasabb érintkezési idő (4 óra) mellett végzett MTT tesztek eredményeit szemlélteti a 45. (nagyporozitású részecskék) és 46. (mezopórusos részecskék) ábra. 45. ábra Nagyporozitású szilika nanorészecskék citotoxicitás-vizsgálata (MTT) CaCo-2 sejteken, 4 órás érintkezés esetén 46. ábra Mezopórusos szilika nanorészecskék citotoxicitás-vizsgálata (MTT) CaCo-2 sejteken, 4 órás érintkezés esetén 66

67 Leolvasható az ábrákról, hogy az életben maradt sejtek aránya közelíti a kontroll értékeket (a µ g 46. ábrán megfigyelhető, 6,25 -es kiugró eredmény nagy valószínűséggel pipettázási hiba ml következménye). Toxicitásról tehát 4 órás expozíció mellett sem beszélhetünk. A 24 órás LDH vizsgálatok eredményei a 47. és a 48. ábrán, az azonos idejű MTT tesztek eredményei pedig a 49. és az 5. ábrán láthatók. 47. ábra Nagyporozitású szilika nanorészecskék citotoxicitás-vizsgálata (LDH) CaCo-2 sejteken, 24 órás érintkezés esetén 67

68 48. ábra Mezopórusos szilika nanorészecskék citotoxicitás-vizsgálata (LDH) CaCo-2 sejteken, 24 órás érintkezés esetén 49. ábra Nagyporozitású szilika nanorészecskék citotoxicitás-vizsgálata (MTT) CaCo-2 sejteken, 24 órás érintkezés esetén 68

69 5. ábra Mezopórusos szilika nanorészecskék citotoxicitás-vizsgálata (MTT) CaCo-2 sejteken, 24 órás érintkezés esetén Az LDH tesztek 24 órás érintkezés esetén sem mutattak ki jelentős citotoxicitást, a pusztulási µ g arány csak a legtöményebb szuszpenziók (5 ) esetében emelkedett 1% fölé. ml A 61. és 62. ábrán mennyiségi összefüggés figyelhető meg, vagyis az, hogy az életben maradt µ g sejtek aránya a szárazanyag-tartalom növelésével csökken. A 3,1 -es szárazanyag- ml tartalomnál tapasztalható kiugró érték mindkét részecsketípusnál megfigyelhető. Ez a jelenség további vizsgálatokat igényel. Összességében tehát az mondható el, hogy az általam előállított nanorészecskék nem toxikusak. 69