Állatkísérletek az Orvostudományban

Átírás

1 Állatkísérletek az Orvostudományban Életjelenségek speciális vizsgáló módszerei Dr. Kaszaki József Sebészeti Műtéttani Intézet SZTE ÁOK graduális oktatás / 1

2 Mitől függ a perctérfogat? Szívfrekvencia Előterhelés (Preload) Utóterhelés (Afterload) CVP Kontraktilitás dp/dtmax Perifériás érellenállás SVR

3 1. A perctérfogatból számolható további paraméterek Oxigén szállítás (DO 2 ) Oxigén fogyasztás (VO 2 ) Feltétel: Az artériás és vénás oxigén szaturáció meghatározása

4 Oxigénnel telített hemoglobin százalékos aránya a vérben % % Periféria

5 Oxygen szállítás (DO 2 ) DO 2 : a keringés által szállított oxygén mennyiség Összetevői: Oxygén tartalom a. Hemoglobin (Hb) b. Szaturáció (SO 2 ); a teljesen szaturált hemoglobin 1.38 ml oxygént szállít (per gram) Perctérfogat (C.O.) DO 2 [ml/min] = CO x [(1,38 x Hb x SaO 2 ) + (0,003 x pao 2 )]

6 Oxigén fogyasztás = perctérfogat x (artériás vénás oxigén tartalom) Oxigén szállítás (delivery; DO 2 ) Oxigén fogyasztás (consumption; VO 2 ) Body/Organs VO 2 [ml/min] = CO x 1,38 x Hb x (SaO2-SvO2) Ha a Hgb, CO és az A/V szaturáció ismert, a VO2 kiszámítható anélkül, hogy a PO2 értéket ismernénk (oldott O2 = általában a teljes O2 tartalom < 0.3 Vol%-a):

7 2. Kis vérköri nyomás monitorozás Pulmonális artéria nyomás Pulmonary artery

8 Pulmonális artéria katéterezés Swan Ganz katéterrel Sárga: PA nyomás Kék: CVP és injektálás Fehér: termisztor kábel Piros: katétervég ballon felfújás

9 A Swan Ganz katéter pozíciója a jobb szívfélben

10 Artéria pulmonális nyomás és az ék (wedge) nyomás görbéje

11 Pulmonalis kapilláris éknyomás: Hemodinamikailag a bal kamra preloadjára utal, de a mérése körüli bizonytalanságok és a számos befolyásoló tényező miatt a volumenstátus megítélésére csak fenntartásokkal alkalmazható

12 3. A véráramlás mérése Elektromágneses áramlásmérés Ultrahangos flowmérés Laser-Doppler flowmérés

13 Lokális véráramlás mérés Transonic ultrahangos véráramlás mérő készülék és perivaszkuláris áramlás érzékelő szenzorok.

14 Lokális véráramlás mérés

15 4. A gasztrointesztinális (GI) traktus vizsgáló módszerei

16 A bélidegrendszer szerveződése Myentericus plexus Körkörös izomréteg Submucosus plexus Hosszanti izomréteg Nyálkahártya Muscularis mucosae Az GI traktus szekretoros, abszorpciós és motilitási funkcióinak szabályozásáért és összehangolásáért felelős struktúra a bélidegrendszer. A bélidegrendszert több kisebb, nem ganglionált, és két nagyobb, ganglionált plexus építi fel. Ezek a nyálkahártya és a körkörös izomréteg között elhelyezkedő submucosus plexus (Meissner-plexus), valamint a körkörös és hosszanti izomrétegek között található myentericus plexus (Auerbach-plexus). A bélidegrendszer önálló reflexívekkel rendelkezik, s a központi idegrendszertől való nagyfokú függetlenség jellemzi. Furness, The Enteric Nervous System, nyomán

17 4.1. A tápcsatorna simaizomzat elektromos aktivitása Lassú hullám Spikes A GI kontrakciók ritmusát a simaizom membránban képződő potenciál változás, a lassú hullámok (slow waves) frekvenciája határozza meg, amelyek nem tekinthetők akciós potenciálnak.

18

19 A GI SIMAIZOM MOTOROS AKTIVITÁSA 1. Izom kontrakció csak akciós potenciál (AP) megjelenésekor történik 2. Az AP (sorozat) gyakoriságát a lassú hullámok frekvenciája szabja meg 3. A kontrakciók ereje az AP sorozat frekvenciájától függ

20 GI motilitás monitorozás I. A bélizomzat kontrakciók mérése nyúlásmérő bélyeg (strain gauge) szenzorral V. jugularis Infúzió Strain gauge szenzor Computer

21 GI motilitás monitorozás I. A bélizomzat kontrakciók mérése nyúlásmérő bélyeg (strain gauge) szenzorral FSG-02 Force/displacement transducer for implantable

22 Original recording of colon motility in rat V sec

23 GI motilitás monitorozás II. Elektro-Miográfia (EMG) A bélizomzat elektromos aktivitásának mérése extracellularis szenzorral V. jugularis Infúzió Extracellular sensor Computer

24 Ag/AgCl extracellularis szenzor

25 Szenzor típusok testfelszíni miográfiás szenzor bélfalba implantált szenzor

26 Kísérleti elrendezés bélfalba implantált szenzor (1 vagy 2 pár elektródával) testfelszíni miográfiás szenzor

27 Elektrointesztinográfia

28 Mérés éber állaton. A szenzort a nyakon ejtett nyíláson át vezetjük ki, melyet az állat nem tud lerágni.

29 A jel: Felvétel: 0,01 0,5 Hz esemény

30 Gyomor Vastagbél Vékonybél PS: power spectrum, MA 2 MA: a PS-hez tarozó legnagyobb magasság érték

31 Vékonybél spektrumok egy bélischaemia-reperfúziós állatból

32 Görbe alatti területek összehasonlítása AUC - bevarrt Sham-op IR IR+Met baseline Ischemia1 Ischemia2 Reperfuzio1 Reperfuzio2

33 4.2. Az intesztinális permeábilitás vizsgáló módszerei Gravimetriás analízis Kapilláris permeabilitás Epitheliális permeabilitás Gravimetria szövet mintavétel; Nedves-súly mérése Szárítás súlyállandóságig, majd száraz-súly mérés Nedves / Száraz súly = ödéma becslése

34 Vasculáris/kapilláris permeabilitás Meghatározása: Evans kék (EB) festékkel, amely a plazma fehérjékhez kötődik Intravénás befecskendezés Permeábilitás fokozódás esetén, a festék-fehérje komplex a szövetekbe jut; A komplex kimosása az erekből; A festék extrahálása a szövetből, formamid-dal; Evans kék spektrofotometriás meghatározása a vérből és a szövetből; Permeabilitási index = EB szövet EB plazma Vascular permeability index Saline Bile HCl+bile HCl Intact region of the esophagus * P<0.05 Fig. 2 * x * * x Treated region of the esophagus

35 Epitheliális permeabilitás lumen - plazma irányú permeábilitás változás mérése Na-fluoreszcein (NaFL) clearence módszerrel 5 mg/ml NaFL beadása a vizsgálandó GI lumenbe; Vénás vérminta vétel 10 percenként (a minta tárolása sötétben); A NaFL koncentráció meghatározása spektroflurométerrel (ex: 455 nm, em: 515 nm); lumen - plazma NaFl clearence = plazma NaFL / lumen NaFL Plasma-Na fluorescein/lumen-na fluorescein kg -1 x * x x * * x x * * x x Time (min) Fig. 3 * x * * x x * * x HCl+bile Bile x x * * * x x * * x HCl Saline x

36 5. Képalkotó vizsgáló módszerek a mikrokeringés in vivo monitorozására

37 A mikrokeringés fiziológiája Arteriolák, kapillárisok, venulák hálózata (érátmérő <100 μm) Legfőbb szerepe az oxigén átadása a szöveteknek Struktúrája, funkciója nem egységes szervenként eltérő Központi szerepet játszik a véralvadási, immunológiai folyamatokban A mikrokeringést meghatározó tényezők: Beáramlási nyomás (driving pressure) Az arteriolák tónusa és átmérője Hemorheológiai paraméterek (viszkozitás) Együttvéve: kapillárisok nyitottsága (patency) A mikroperfúzió szabályozása: Miogén (erő-mechanikai hatások) Metabolikus (O 2, CO 2, laktát, H + ) Neurohumorális (NO, endothelin, katekolaminok, stb.)

38 KERINGÉSI SHOCK HIPOXIA ISCHAEMIA NO-REFLOW jelenség MIKROKERINGÉSI ELÉGTEENSÉG REOXIGENIZÁCIÓ REPERFÚZIÓ

39 Mikro rokeringés diszfun funkció Endothel Diszfunkció Barrier, Koaguláció, Regulációs zavar Vörösvértestek Deformabilitás, Aggregáció O 2 transport zavar Koaguláció Endogén antikoagulánsok Mikrovaszkuláris trombózis Leukocita aktiváció Adhézió, Cytokinek, ROS Autoregulácios diszfunkció Mikrocirkulációs shunt Oxigén ellátás-igény mismatch Hypoxia Celluláris Distress Mitochondrium diszfunkció Apoptózis Szervi elégtelenség

40 A mikroperfúzió monitorozásának eszközei és jellegzetességei

41 A mikrocirkuláci ció monitorozása Áramlás Lézer Doppler áramlásmérő NIRS Oxigenizáció, Áramlás Perfúzió, Áramlási sebesség OPS/SDF képalkotás Fluorescence quencing microscopy Oxigén tenzió Áramlás Mikrogyöngy technikák MRI Oxigenizáció, Perfúzió

42 Orthogonális Polarizáci ciós Spectrális képalkotás OPS Sidestream Dark Field SDF : az OPS továbbfejlesztett verziója Groner W. Nature Med (1999) 5: Ince C (2005) Crit Care 9:S13-S19

43 Hol alkalmazható? Csak vékony, epithel réteggel fedett struktúrák esetén alkalmazható, amelyek átvilágításához elegendő a szövet mélyéről visszaérkező depolarizált fény - amely hátulról világítja meg a felszín alatti struktúrákat. 1. Ideális, nem invazív alkalmazási terület: a sublinguális régió

44 A szublingualisis mikrocir rocirkuláció klinikai jelentősége

45 Sublinguális vs intesztinális tonometria Sublinguális tonometria vs OPS videomikroszkópia Pentobarbital anaesthesia OPS mikrokeringés vizsgálat Sublingualis tonométer Artériás kanül Intestinalis tonométer CVP katéter Transzpulmonális perctérfogat mérés Vérnyomás szenzor

46 A nyelv alatti mucosa mikrokeringése kontroll állapotban

47 A nyelv alatti mucosa mikrokeringése shockos állapotban

48 A szublingualisis mikrocir rocirkuláció klinikai jelentősége Azok a szeptikus páciensek, akiknél a szublinguális mikroperfúzió csökkenése kismértékű (22 %-os) volt, felépültek a súlyos kórállapotból, ellentétben azokkal, akiknél ez a csökkenés jelentős (44 %-os) volt. Sakr et al. Crit Care Med (2004) 32: A mikrocirkulációs dysfunkció volt az egyetlen és szenzitiv tényező a végkimenetel előrejelzésében.

49 Mikrocirkulációs paraméterek változása a tüdő alveolusaiban Vietnámi törpesertések (átlagos testtömeg: 23±3 kg) Altatás: ketamin-xilazin indukció im., propofol fenntartó iv. Mesterséges lélegeztetés Centrális vénás nyomás Endotracheális tubus Pulzoximéte r Jobb felső lebeny OPS mikrokeringés vizsgálat Artériás vérnyomás szenzor

50 PEEP hatása az oxigenizációra Atelektázia megszűnése - intrapulm. shunt Parciális oxigén nyomás (PaO 2 ) Artériás oxigén szaturáció (SaO 2 ) N=6 Thoracotomia PEEP = 5 PEEP = 10 PEEP = 15 PEEP = 5 0.perc 15. perc 30. perc 45. perc = mikrokeringés felvétel Kevés adat ismert a PEEP okozta mikrocirkulációs változásokról a tüdőben

51 Artériás oxigén szaturáció és parciális nyomás Artériás oxigén szaturáció (%) * * * Artériás oxigén parciális nyomása (Hgmm) * * PEEP= 15 PEEP= 10 PEEP= 5 PEEP= Idő (perc) PEEP= 15 PEEP= 10 PEEP= 5 PEEP= Idő (perc) Az ábrán a medián, a 25. és a 75. percentilist tüntettük fel; * p<0.05 Friedman és Dunn próbával

52 TÜDŐ MIKROKERINGÉS (OPS) PEEP 5 vízcm

53 Tüdő mikrokeringés PEEP 15 vízcm

54 Tüdő mikrokeringés PEEP 5 vízcm

55 Alveolus terület Alveoláris terület (μm 2 ) 1100 * PEEP= PEEP= 5 PEEP= 10 PEEP= Idő (perc) Az ábrán a medián, a 25. és a 75. percentilist tüntettük fel; * p<0.05 Friedman és Dunn próbával

56 Alveolus kapillárisok perfúziós rátája Alveolus perfúziós ráta 0,7 0,6 * * 0,5 0,4 0,3 PEEP= 5 PEEP= Idő (perc) PEEP= 15 PEEP= 5 Az ábrán a medián, a 25. és a 75. percentilist tüntettük fel; * p<0.05 Friedman és Dunn próbával

57 Áramlási sebesség az alveoláris és perialveoláris kapillárisokban Alveolus vvt sebesség (μm s -1 ) Perialveoláris vvt sebesség (μm s -1 ) * * * PEEP= 15 PEEP= 10 PEEP= 5 PEEP= Idő (perc) PEEP= 15 PEEP= 10 PEEP= 5 PEEP= Idő (perc) A PEEP emelése után az alveoláris és perialveoláris perfúzió eltérő dinamikájú növekedése eredményezi az artériás oxigén tenzió és szaturáció fokozódását.

58 A mikrokeringés és a makrokeringés kapcsolata Normál állapotban a mikrokeringés relatíve független a globális hemodinamikai változásoktól. DE mikrocirkulációs elváltozások mutathatók ki elfogadhatónak tekintett szisztémás hemodinamikai célértékek esetén is; A keringési elégtelenség megszüntetését célzó terápiás beavatkozás esetén, a mikrokeringés reakciója gyakran eltér annak globális hatásától jellemző példája az un. no-reflow jelenség

59 Gasztrointesztinális mikrokeringés a keringés redisztributio áldozata keringési shockban

60 Hgmm Artériás Középnyomás zselatin hidroxietil-keményítő dextrán 30 Vérzéses shock Volumen resuscitatio Idő (perc) * P<0.05 vs kontroll érték (0 perc) A volumen reszuszcitáció végpontja: a kontroll MAP 75%-ának elérése, max. 50 ml/kg kolloid infúzió;

61 Vörösvértest Áramlási Sebesség a Villusokban μm/s Vérzéses shock * * * * Volumen resuscitatio Zselatin Hidroxietil-keményítő (Voluven) Dexrán (Rheomacrodex) * * # # * idő (perc) P<0.05 vs konroll érték (0 perc) # P<0.05 vs Voluven csoport Kaszaki J, Wolfárd A, Szalay L, Boros M: Pathophysiology of ischemia-reperfusion injury. Transplant Proc 38: , 2006.

62 OPS

63 A mikrokeringés speciális sajátossága: a heterogenitás Károsodott mikrocirkuláció esetén a mikrokeringési reakciók NEM egységes természetüek, és mértékük, kiterjedésük sem hasonló. A károsodás gyakori megnyilvánulása, a perfúzió heterogenitásának fokozódása. Az oszcilláló mikroperfúzió (flowmotion) a lokális oxigenizáció változást indukál (Tsai AG and Intaglietta M, Int J Microcirc Clin Exp (1991) 12:75-88).

64 Térben változó heterogenitás A funkcionális kapilláris denzitás meghatározása perfundált nem-perfundált Perfundált kapillárisok hossza terület Mikrocirkulációs shunt: amikor a µpo 2 kevesebb lesz, de a vénás po 2 változatlan marad Sinaasappel et al. J Appl Physiol (1996) 81:

65 Időbeli heterogenitás Az áramlási mintázat változv ltozása a villusban Kiindulási állapot: folyamatos áramlás Vérzéses shock: oszcilláció Újraélesztés: folyamatos áramlás / oszcilláció 700 RBCV (µm/sec) 100 v 1 v 1 v 2 v 2 v 3 v 3 v n v n Gyors áramlás Lassú áramlás t 1 T 1 t 2 T 2 t 3 T 3 t n Súlyozó faktor = az áramlási periódusok relatív időtartama T n idő A vörösvértest áramlási sebességének (RBCV) súlyozott számtani átlaga: A-RBCV = v 1 t 1 + V 1 T 1 + v 2 t 2 + V 2 T 2 + v n t n + V n T n t 1 + T 1 + t 2 + T 2 + t n + T n Szabó et al. Shock 21: , 2004.

66 Térbeli heterogenitás A vörösvértest áramlási sebesség (RBCV) terület arányosan súlyozott átlaga hypoperfundált terület (a: relative area 40%) (lower average RBCV) Normál perfúzió, magasabb RBCV értékek (A: relative area 60%) (higher average RBCV) RBCV = A(RBCV) + a (RBCV) A + a (A + a = 1) RBCV = 0.6 RBCV RBCV

67 Heterogenitás s normál l körülmk lmények között, k Lézer Doppler flow mérésm Vasomotio (flowmotion) monitorozás a tesztiszben Termoregulációval összefüggő periodicitás Vasomotio (flowmotion) monitorozás a bőrben

68 A leukocyta-endothelsejt interakció monitorozásának eszközei és jellegzetességei

69 Leukocyta-endothel sejt interakció kapilláris lumen interstitium Rolling Adhézió Transzmigráció érendothel E-selectin P-selectin (+vérlemezke) VCAM-1 ICAM-1 (intercellularis adhéziós molekula 1) endothelialis PECAM-1 leukocyta L-selectin CD11a/CD18 CD11b/CD18 leukocyta PECAM-1

70 Fluoreszcens Intravitális Videomikroszkópia Videó-felvev felvevő CCD-kamera Fényforrás Tibia Objektív MONITOR - gördülő leukocita - kitapadó leukocita -funkcionális kapilláris denzitás -Vvt áramlási sebesség Kontraszt erősítés (fluoreszcens transz- és epi-illumináció) Fluoreszcens markerek: Leukocyták Vörösvértestek Permeabilitás Rhodamin 6G FITC jelölés Na-fluorescein

71 IVM video: Periosteális perfúzió és leukocyta adhézió végtag ischaemiában

72 Mikrocirkulációs paraméterek változása máj ischaemia-reperfúzió során, patkány modellben

73 Kontroll mikroperfúzió a májban (NaFl) Fluoreszcens Intravitális Videomikroszkópia (IVM)

74 Máj mikroperfúzió reperfúzió alatt (Na Fl) Fluoreszcens Intravitális Videomikroszkópia (IVM)

75 Leukocyta-endothel sejt interakció normál májban (IVM)

76 Leukocyta-endothel sejt interakció reperfúzió alatt (IVM)

77 Mikrocirkuláció összegzés Az első, ami sérül, és az utolsó ami felépül. A mikrocirkuláció károsodásának jele, a perfúzió heterogenitása, amely oxigén extrakciós deficitet eredményez; A mikroperfúzió állapota meghatározhatja a végkimenetelt; A mikrocirkuláció helyreállítása terápiás végpont. Microcirculation Recruitment Manoeuvres Ince C (2005) Critical Care 9:S13-S19 Rendezni kell a kóros áramlási heterogenitást Az a cél, hogy a nyissuk ki és tartsuk is nyitva a mikrokeringést a pumpafunkció támogatásával, vazopresszorok korlátozott használatával és megfelelő folyadék adásával

78 Köszönöm a figyelmet!