Gyógyszermolekulák és UV-fény hatásának vizsgálata biológiai- és modellmembránokon

Átírás

1 Gyógyszermolekulák és UV-fény hatásának vizsgálata biológiai- és modellmembránokon BUDAI MARIANNA Témavezetõ: Dr. Gróf Pál Készült: Semmelweis Egyetem Biofizikai és Sugárbiológiai Intézet SEMMELWEIS EGYETEM DOKTORI ISKOLA Elméleti Orvostudományok Program: I/3. Ionizáló és nemionizáló sugárzások biológiai hatásai 2005.

2

3 TARTALOMJEGYZÉK 1. BEVEZETÉS A SEJTMEMBRÁN A sejtmembránok szerkezete és funkciói A MODELLMEMBRÁNOK TULAJDONSÁGAI A LIPOSZÓMÁK ORVOSI/GYÓGYSZERÉSZI ALKALMAZÁSA Morfinszármazékok liposzómába zárása A fluorokinolon antibiotikumok és liposzómába zárásuk A LIPOSZÓMÁT FELÉPÍTÕ LIPIDEK ÉS A HATÓANYAGOK KÖZÖTTI MOLEKULÁRIS SZINTÛ KÖLCSÖNHATÁSOK VIZSGÁLATA A LIPOSZÓMA PREPARÁTUMOK STABILITÁSÁNAK JELENTÕSÉGE ÉS VIZSGÁLATA AZ ULTRAIBOLYA FÉNY ÉS HATÁSAI A nalidixsav és a fluorokinolonok fototoxicitása Az UVA-sugárzás hatása sejtmembránokon CÉLKITÛZÉSEK ANYAGOK ÉS MÓDSZEREK ANYAGOK MÓDSZEREK Unilamelláris és multilamelláris liposzómák elõállítása ESR és DSC mérésekhez Bezárási hatásfok meghatározása ESR spektroszkópiai vizsgálatok DSC mérések Dinamikus fényszórásmérés, stabilitásvizsgálat és a felületi potenciál meghatározása Sejtmembránok UV-érzékenységének vizsgálata 35 1

4 4. EREDMÉNYEK MORFINSZÁRMAZÉKOK LIPOSZÓMÁBA ZÁRÁSA ÉS VIZSGÁLATA NALIDIXSAV LIPOSZÓMÁBA ZÁRÁSA ÉS VIZSGÁLATA A liposzómák méreteloszlása és stabilitása A NANA LOKALIZÁCIÓJA A MEMBRÁNBAN TELÍTETLEN ZSÍRSAVAT TARTALMAZÓ LIPIDEK SZEREPE A NANA LIPID KÖLCSÖNHATÁSBAN AZ UVB-FÉNY HATÁSA A (FLUORO)KINOLON LIPID KÖLCSÖNHATÁSRA A LOMEFLOXACIN MEMBRÁN KÖLCSÖNHATÁS VIZSGÁLATA Az LMFX lipid kölcsönhatás koncentrációfüggése Az LMFX lipid kölcsönhatás ph-függése AZ UVA-SUGÁRZÁS HATÁSA HUMÁN FIBROBLASZT SEJTVONALON Redukálóképesség a sejtmembrán különbözõ mélységében Relatív redukálóképesség UVA-dózis Membránfluiditás változása UVA-sugárzás hatására MEGBESZÉLÉS A BEZÁRÁSI HATÁSFOKOT BEFOLYÁSOLÓ TÉNYEZÕK HATÓANYAGOK LIPIDMEMBRÁNNAL KIALAKULÓ KÖLCSÖNHATÁSÁNAK VIZSGÁLATA ESR SPEKTROSZKÓPIA SEGíTSÉGÉVEL AZ ESR ÉS DSC MÓDSZERREL NYERT EREDMÉNYEK ÖSSZEVETÉSE MAKROSZKÓPOS VÁLTOZÁSOK MÉRÉSE VS. LOKÁLIS KÖLCSÖNHATÁSOK DETEKTÁLÁSA MAKROSZKÓPOS TULAJDONSÁGOK VIZSGÁLATÁTÓL A TERÁPIÁS ALKALMAZÁSIG UVA-SUGÁRZÁS HATÁSA HUMÁN FIBROBLASZT SEJTVONALRA 75 2

5 6. KÖVETKEZTETÉSEK KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS IRODALOMJEGYZÉK SAJÁT KÖZLEMÉNYEK JEGYZÉKE AZ ÉRTEKEZÉS TÉMÁJÁBAN MEGJELENT SAJÁT KÖZLEMÉNYEK Publikációk Elõadások Poszterek Egyéb saját közlemények ÖSSZEFOGLALÓ SUMMARY 95 3

6 Rövidítések 12-DOX 12-doxil-sztearinsav 16-DOX 16-doxil-sztearinsav 5-DMS 5-doxil-metil-sztearát 5-DOX 5-doxil-sztearinsav 7-DOX 7-doxil-sztearinsav DOPC Dioleoil-foszfatidilkolin DPPC Dipalmitoil-foszfatidilkolin DSC Differenciál szkenning kalorimetria EDTA Etilén-diamin-tetraacetát ESR, EPR Elektron-spin rezonancia FCS Magzati borjúszérum LMFX Lomefloxacin LUV Nagy unilamelláris vezikula MIC Minimális inhibitor-koncentráció MLV Multilamelláris vezikula MTT MTT formazán: 1-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-3,5-difenilformazán NA Nalidixsav NANa Nalidixsav nátriumsója NR Neutrálvörös OFLX Ofloxacin PBS Foszfátpufferolt sóoldat PCA Páciens kontrollált analgézia PDI Polidiszperzitás index PEG Polietilén-glikol ROI Reaktív oxigén intermedierek RRK Relatív redukálóképesség SUV Kis unilamelláris vezikula TB Tripánkék T m és T pre fõ és elõ-fázisátalakulási hõmérséklet UH Ultrahang 4

7 UV UVA UVB UVC Ultraibolya nm UV sugárzás nm UV sugárzás nm UV sugárzás 5

8 1. BEVEZETÉS 1.1. A sejtmembrán Ha az élet megnyilvánulásának egyik egyszerû példáját, egy egysejtû élõlényt vizsgálunk, akkor megállapíthatjuk, hogy egyidejûleg kell megfelelnie két, a túléléshez szükséges, de egymással lényegében ellentétes feladatnak. Egyrészt az õt körülvevõ élettelen tértõl el kell magát határolnia, másrészt viszont rá van utalva arra, hogy környezetével hõ-, oxigén-, tápanyag-, salakanyag- valamint információcserét folytasson. Mindezen feladatok ellátásáért a sejt kiterjedt membránrendszere nagymértékben felelõs. A prokarióta és eukarióta sejteket egyaránt határoló sejtmembrán tehát egy olyan dinamikus struktúra, amely korlátozott és szelektív permeabilitásának köszönhetõen részben megakadályozza az ionok és molekulák szabad diffúzióját. Csatornáik és pumpáik révén azonban a membránok olyan transzportfolyamatokat tesznek lehetõvé, amelyek a sejt számára biztosítják a szükséges anyagokhoz való hozzájutást és elõsegítik mások eltávolítását, így biztosítva az inter- és intracelluláris kompartmentek sajátos összetételét. A specifikus receptorokkal rendelkezõ membránok képesek a külsõ környezeti ingerek felfogására és az azokra adott válasz továbbítására, ami többek közt lehetõvé teszi azt, hogy több gyógyszermolekula is membrán receptorokon fejthesse ki farmakológiai hatását. A sejtmembránok komplex funkciója sajátos kémiai összetételükbõl és szerkezetükbõl adódik. Minden sejtfunkció feltétele az, hogy szerkezetileg és funkcionálisan ép membránok biztosítsák a megfelelõ intracelluláris környezetet A sejtmembránok szerkezete és funkciói A membránok felépítésének leírására szolgáló ma legelfogadottabb modell az 1972-ben született, Singer és Nicolson által leírt folyékony mozaik membrán modell, ami egyesíti a membránokra vonatkozó morfológiai és funkcionális jellemzõket (1. ábra) [1]. A modell szerint a membrán foszfolipidjei 4,5 5,5 nm vastagságú lipid kettõs réteget képeznek, úgy, hogy a hidrofil fejcsoportok a vizes közeg felé, a hidrofób szénhidrogén oldalláncok egymás felé néznek. A kettõs réteg oldószerül szolgál a membránon egyszer vagy többször áthatoló integráns membránfehérjék számára, ill. a perifériás 6

9 fehérjék számára, amelyek különbözõ mértékben süllyednek bele a kettõs membránba. A membránfehérjék oldalirányban viszonylag szabadon diffundálhatnak a membránban, s annak mindkét oldalán egy-egy 2,5 3,5 nm vastagságú réteget képeznek. A membránok alapszerkezetét a sejtmembránban körülbelül azonos arányban jelenlévõ lipidek és fehérjék mellett, a kis mennyiségben (2-7 %) megtalálható szénhidrátok alkotják [1-6]. Elõbbi megállapítás a speciális funkciókat ellátó membránokra nem helytálló, ahol az összetételben jelentõs eltérések tapasztalhatók (1. táblázat). A sejtmembrán funkciói közül kiemelendõ:? anyagtranszport a sejtmembránon keresztül, amely passzív vagy aktív transzporttal valósul meg? sejtek közötti kapcsolatok kialakítása, a sejtalak szabályozása? hormonális és idegi hatások közvetítése receptorokon keresztül? nyugalmi potenciál fenntartása, akciós potenciál kialakítása és információtovábbítás extracelluláris tér oligoszacharid glikoprotein glikolipid perifériális fehérje hidrofob zóna integrális fehérje koleszterin egyes rétegek foszfolipid kettõsréteg citoszol integrális fehérje hidrofil fehérje perifériális fehérje zsírsavlánc hidrofil poláros fejcsoport 1. ábra. A Singer-Nicolson-féle folyékony mozaik membrán modell (az ábrát a /1401ch5celtransnot1.htm file-ból szerkesztettem be) foszfolipid 7

10 1. táblázat. Néhány membrán kémiai összetétele a teljes tömeg százalékában Lipid (%) Fehérje (%) Szénhidrát (%) Mielin Hepatocita plazmamembrán Szarkoplazmás retikulum Mitokondrium külsõ membrán Mitokondrium belsõ membrán A membrán szénhidrátjai kizárólag a kettõs réteg külsõ felszínén találhatók meg, fokozván a membrán külsõ-belsõ aszimmetriát (1. ábra). A fehérjék segítségével a membránhoz kapcsolt szénhidrátok által alkotott glikokalix szerepet játszik az adhézió, az agglutináció, a töltés, a kontaktgátlás és az antigénjelleg meghatározásában [1-5]. Membránlipidek Az eritrociták kivételével valamennyi sejttípus képes a szükséges foszfolipidek szintézisére. A különféle lipidek az endoplazmatikus retikulumban keletkeznek, és a Golgi-apparátuson keresztül jutnak el ahhoz a membránhoz, amelynek a felépítésében részt vesznek. A membrán felépítésében alapvetõ szerepet játszanak a foszfolipidek, azaz a glicerinszármazék foszfogliceridek és a szfingozint (hosszú szénláncú aminodialkoholt) tartalmazó szfingomielin [2]. A foszfogliceridek közös jellemzõje, hogy a glicerin 1. és 2. hidroxil-csoportját hosszú szénláncú zsírsavak észteresítik, a 3. szénatomhoz valamilyen alkohol kapcsolódik foszforsavon keresztül. A kapcsolódó alkoholok közötti különbség alapján a foszfogliceridek közül kiemelendõ a leggyakoribb származék, a foszfatidilkolin (lecitin), amit a legtöbb membrán tartalmaz; a májban, az agyszövetben és a vér alakos elemeiben elõforduló foszfatidiletanolamin (kefalin) és foszfatidilszerin; valamint a vérlemezkékben és az idegszövetben jelenlévõ foszfatidilinozitol és kardiolipin. Fiziológiás ph-n (ph = 7,4) a foszfatidilszerin egy nettó negatív töltéssel rendelkezik, ami miatt savanyú foszfolipidnek tekintendõ; a lecitin és a kefalin ellenben ikerionként viselkednek. A zsírsavak kapcsolódása számos variációs lehetõséget hordoz magában: a természetben legelterjedtebben mégis az elsõ szénatomon általában telített, a másodikon pedig telítetlen zsírsav észteresíti a glicerint. A lecitin leginkább palmitinsavban és linolsavban gazdag, míg a foszfatidiletanolamin és foszfatidilszerin arachidonsavat tartalmaz jelentõsebb mértékben. 8

11 A biológiai membránok esetén a lipidmolekulák közötti kis energiájú, másodlagos kötõerõk lehetõvé teszik a lipidek saját tengely körüli forgását, azok adott membránrétegben való laterális elmozdulását, sõt a kettõs rétegen keresztüli ún. flip-flop mozgását is. Ez utóbbi transzmembrán mozgás nagyobb energiát igényel, emiatt lassabban valósul meg, mint a laterális diffúzió. Valamennyi molekuláris szintû mozgás együttesen eredményezi a membrán fluiditását, aminek megfelelõ mértéke az optimális mûködés elengedhetetlen feltétele. A membrán fluiditását jelentõsen befolyásolja a hõmérséklet. A fõ fázisátalakulási hõmérséklet (T m ) alatt a membrán általában rigid, gél állapotú, e felett azonban fluiditás- és permeabilitás növekedést tapasztalunk, amely során folyadékkristályos állapot alakul ki, ami a molekulák közti erõk nagyságát vizsgálva a folyadékokkal, a meglévõ rendezettség, valamint az optikai és mechanikai anizotrópia miatt a szilárd testekével rokon állapot. A fázisátalakulást kísérõ fluiditásbeli változás a lipidek egyre intenzívebb, nagyobb sebességû mozgásának, az addig kompaktabb szerkezet rendezetlenebbé válásának tudható be [7], ami a zsírsavláncok közötti távolság növekedésével, a kettõs réteg felszíni és térfogati növekedésével jár együtt. Különbözõ lipid-összetételû membránokat vizsgálva megállapították hogy: a.) a nagy mennyiségben telített zsírsavat tartalmazó lipidek a membrán fluiditását, és következésképp permeabilitását csökkentik; b.) a kettõs kötéssel/kötésekkel rendelkezõ zsírsavak membránokban való jelenléte a zsírsavat megtöri, hajlottá teszi (különösen igaz ez a cisz kettõs kötésekre) és a zsírsav oldalláncok közötti kapcsolat kialakítását gátolja, a membránt fellazítja, annak permeabilitását fokozza [2-5]. Megfigyelték, hogy a membránok fázisátalakulási hõmérséklete szoros kapcsolatban áll a membránon keresztül történõ transzport folyamatok intenzitásával: így például az intenzív anyagcserét folytató mitokondrium membránjának fázisátalakulási hõmérséklete jóval a fiziológiás hõmérséklet alatt található. Ezzel összhangban áll az, hogy foszfolipid molekulánként átlagosan több mint két kettõs kötést tartalmaz az idegi szinapszisok membránja, míg átlagosan egyet tartalmaz például az eritrocita membrán [6]. A membránokra jellemzõ az aszimmetria, amit a foszfolipidek és a fehérjék külsõ és belsõ membránban történõ aránytalan eloszlása okoz. Megfigyelték, hogy a plazmamembránokban a szfingomielin és a foszfatidilkolin általában a külsõ, míg a foszfatidiletanolamin és a foszfatidilszerin általában a belsõ membránban található in- 9

12 kább; ezzel szemben a membránt kompaktabbá tevõ koleszterin eloszlása egyenletes [5]. Membránfehérjék A különbözõ funkciókat ellátó membránok eltérõ számban tartalmaznak fehérjéket; a szarkoplazmás retikulum például 6 8-féle, a plazmamembrán mintegy féle fehérjét tartalmaz. Az integrálódni képes fehérjék egy-egy szakaszon apoláros aminosavakat tartalmaznak, így képesek kölcsönhatásba lépni a hidrofób zsírsavakkal. Az apoláros régióban a fehérjék?-hélix vagy szabálytalan (random coil) struktúrával rendelkeznek. A perifériás membránfehérjék kisebb arányban tartalmaznak apoláros aminosavakat, mint az integráns fehérjék, és döntõen elektrosztatikus kölcsönhatások révén horgonyzódnak ki lipidekhez ill. integráns membránfehérjékhez, vagy egy hidrofób végük segítségével beépülnek a membránba. A fehérjemolekulák membránokban való jelenléte általában a membránfluiditást növeli, számos fehérje járul hozzá a fázisátalakulási hõmérséklet csökkenéséhez. Bár a fehérjék laterális mozgása korlátozottabb, mint a foszfolipideké, mégis jelentõs szerepe lehet a receptorfunkciónál, amikor a sejtet érõ inger hatására a receptorok (transzmembrán fehérjék) a sejt egy részére csoportosulnak [4]. A fehérjemolekulák a membránban különféle szerepeket töltenek be (transzport, sejtek közötti kapcsolatok kialakítása, sejtmûködés szabályozása), így a funkcióbeli eltérések miatti változatos elhelyezkedésük hozzájárul a membránok aszimmetriájának a fokozásához. A fehérjemolekulák optimális mûködéséhez megfelelõ lipidkörnyezetre van szükség. Ennek a környezetnek a változása a fehérjék mûködésbeli sajátosságainak megváltozásához vezethet A modellmembránok tulajdonságai A biológiai membrán rendkívül komplex struktúra, ami alkalmassá teszi azt a legkülönfélébb életfunkciók ellátására. Összetett funkciójukból eredõen a biológiai membránok inhomogének és domén-struktúrával rendelkeznek, ami megnehezíti a különféle tényezõk (UV-fény, gyógyszermolekulák stb.) membránra kifejtett hatásának tanulmányozását. Ahhoz, hogy a különféle ágensek által okozott változásokat követni tudjuk, és a membránra ható szerek hatásmechanizmusát megismerhessük, célszerû a biológiai membránokat egyszerûbb felépítésû membránokkal modellezni. A modelle- 10

13 zésre kínálnak lehetõséget a liposzómák. Elsõként A. D. Bangham és munkatársai írták le 1965-ben, hogy: Az egyértékû kationok és anionok spontán kialakuló lecitin folyadékkristályon keresztüli diffúziója figyelemre méltóan hasonlít az ilyen ionok biológiai membránokon keresztüli diffúziójára [8]. A liposzómák spontán szervezõdõ kolloidális részecskék, amelyekben a lipid kettõsréteg a szuszpendáló vizes fázis egy részét magába zárja. Ebben a modellrendszerben, a citoplazmának a bezárt vizes fázis, a sejtmembránnak a liposzóma-membrán felel meg (2. ábra). 2. ábra. Unilamelláris liposzóma és felépítése: liposzóma, lipid-kettõsréteg és lipidmolekula ( ges.jpg alapján) A liposzómákat számos jellemzõ alapján csoportosíthatjuk [9, 10]:? a liposzómák mérete és a lamellák száma? a liposzómát alkotó lipidek minõsége és a lipidek aránya? a kettõsréteg fluiditása? a liposzómák felszíni töltése? a liposzómák felszínének hidrofilitása A liposzómák mérete és a kettõs rétegek száma alapján történõ csoportosítás szerint, az úgy nevezett kis unilamelláris- (SUV), nagy unilamelláris- (LUV) és multilamelláris (MLV) vezikulák a legismertebbek. A SUV-ok hidrodinamikai átmérõje nm közötti, az utóbbiak (LUV és MLV) 100 nm-nél nagyobbak, akár a µm-es 11

14 nagyságot is elérhetik. A liposzómáknál tetszõlegesen változtatható a lipidösszetevõk fajtája és azok mennyiségi arányai. Anionos illetve kationos lipidek alkalmazásával lehetõség nyílik a felületi töltésnek a liposzómák stabilitását, valamint a liposzómák és különféle hatóanyagok közötti kölcsönhatást befolyásoló szerepét tanulmányozni. Orvosi, gyógyszerészeti szempontból fontos a membránszerkezetet módosító anyagok hatásmechanizmusának pontos tanulmányozása és megismerése: erre a liposzómák in vitro körülmények között nyújtanak lehetõséget. A liposzómák amellett, hogy a sejtmembránok biofizikai, strukturális és funkcionális tanulmányozásának eszközei a gyógyszertechnológia legmodernebb vívmányai közé is tartoznak. Az 1970-es évek elején a liposzómákat mint gyógyszerszállító rendszereket írták le, s kitartó kutatómunka eredményeként váltak alkalmassá enzimek, antibiotikumok, rák- és gombaellenes hatóanyagok, örökítõanyag szállítására, bezárt antigének révén immunválasz kiváltására [8-15]. A liposzomális gyógyszerforma sikere nagyrészt annak köszönhetõ, hogy: a.) komponensei a biológiai membránt alkotó (nem toxikus, nem immunogén, biológiailag lebomló) lipidek; b.) a bezárható hatóanyagokra nagyfokú változatosság jellemzõ A liposzómák orvosi/gyógyszerészi alkalmazása A gyógyszerformulálás számára a jelen kor nagy kihívása a meglévõknél kedvezõbb farmakokinetikai paraméterekkel rendelkezõ gyógyszerkészítmények kifejlesztése, elõállítása. A biztonságosabb gyógyszeralkalmazás érdekében törekszünk a terápiás- és mellékhatás arányát kifejezõ terápiás index növelésére, a hatóanyagok szelektív célba juttatására. A liposzómába zárt hatóanyagok terápiás alkalmazása számos elõnnyel rendelkezik a hagyományos gyógyszerformákhoz képest [8-15]. Liposzómába zárt hatóanyagok segítségével:? irányított célbajuttatással a gyógyszer az érzékeny szövetekben halmozódik fel, így toxicitása csökkenthetõ, pl. a liposzómába zárt doxorubicin kardiotoxikus mellékhatása kisebb a szabad formájú hatóanyagénál [13];? a hatóanyagok szabaddá válása a liposzómából szabályozható, ezáltal egyenletesebb terápiás gyógyszerszint biztosítható; 12

15 ? gyorsan bomló hatóanyagok liposzómába zárásával biztosítani lehet a lebomlástól való védelmet pl. citozin arabinozid;? sikerrel alkalmazhatók a liposzómák vízben rosszul oldódó hatóanyagok pl. a taxol vagy a ciszplatin lipofil származékai szolubilizálására;? a liposzómák felszínéhez különféle ligandumok köthetõk, így a célsejtekhez szelektíven eljuttatható a hatóanyag, mivel a ligandum szelektíven kötõdik a célsejt felszínén található receptorhoz [11];? fiziológiás és patológiás faktorok is hozzájárulhatnak ahhoz, hogy a vezikulákba zárt hatóanyagok a kívánt szövetben halmozódjanak fel: 1., a tumorokban a kapillárisok permeabilitása nagyobb, mint a fiziológiás mûködésû szövetekben, így a liposzómák passzív transzport révén ott jelentõsebben felhalmozódnak 2., a fertõzött, gyulladt szövetek hõmérséklete magasabb, mint az egészségeseké, ami a termoszenzitív liposzómák lokális alkalmazására nyújt kiváló lehetõséget. Doktori munkámhoz kapcsolódóan konkrét példákat a major analgetikumok és a (fluoro)kinolon antibiotikumok területérõl szeretnék bemutatni annak szemléltetésére, hogy mennyiben járul hozzá e hatóanyagok liposzómába zárása a kedvezõbb hatásés mellékhatás-profil kialakulásához, a kívánt farmakokinetika megvalósításához Morfinszármazékok liposzómába zárása A posztoperatív és terminális állapotú betegek gyógyszeres kezelésében nagy szerepet játszanak a major analgetikumok, a morfin és származékai [16]. A tökéletes analgetikus terápia azonban nem valósítható meg a jelenleg leggyakrabban alkalmazott intermittáló, intramuszkuláris opiát adagolással. A hosszabb hatástartam érdekében folyamatosan alkalmazott morfint tartalmazó infúzióra vagy nagyobb gyógyszeradagokra lenne szükség. A nagyobb dózisok azonban egyre kifejezettebb extraspinális mellékha- 13

16 tással rendelkeznek. A morfin spinális alkalmazása dózisdependens módon motoros zavarokhoz vezet, annak csökkenését okozza: a reflexfunkciók zavart szenvednek, és légzésdepresszió következik be [17]. Az optimális megoldáshoz közelít az ú.n. pationcontrolled analgesia (PCA), amikor a beteg saját szükségletének megfelelõen adagolja a fájdalomcsillapító szert egy infúziós pumpa segítségével. Az adekvát terápia megvalósítására ígéretes eszköz a liposzómába zárt opioidok alkalmazása. Állatkísérletek segítségével igazolták, hogy a liposzómába zárt morfin használatakor a biztonsággal beadható maximális egyszeri dózis szorosa a szabad formájú morfin egyszeri maximálisan beadható dózisának. A liposzomális morfin alkalmazásakor az egyszeri adással elõidézett analgézia idõtartama 6-szor hosszabb, mint a hagyományos gyógyszerformákban alkalmazott morfin által biztosított fájdalommentes periódus. A lipidvezikulákba zárt analgetikum további elõnye, hogy a hatóanyag féléletideje a kívánt helyen (például a lumbális cerebrospinális folyadékban) nagy. Ugyanezek a kísérletek a szisztémás toxicitás csökkenésérõl is beszámoltak [18, 20]. Nishiyama és mtsai [21] szintén a morfin által elõidézett mellékhatások csökkenésérõl számoltak be, amikor azt dipalmitoil-foszfatidilkolinból (DPPC) készült liposzómába zártan alkalmazták. A kísérletekben tapasztalt kedvezõ hatások annak tudhatók be, hogy a liposzomális gyógyszerformának köszönhetõen depo képzõdik a morfinból, amelybõl folyamatosan, egyenletesen szabadul fel a hatóanyag [22, 23]. Az elõbbi vizsgálatok során állatkísérletekben tanulmányozták a liposzómába zárt morfin farmakokinetikai és farmakodinámiás tulajdonságait; a jövõben megoldásra váró feladat a liposzómába zárt opioidok egyszeri dózisával elõidézett, hosszú ideig tartó analgézia megvalósítása a humán klinikai gyakorlatban A fluorokinolon antibiotikumok és liposzómába zárásuk Ennek a kemoterápiás vegyület-csoportnak a története a nalidixsav (NA) szintetizálásával 1962-ben kezdõdött, majd hamarosan bõvítette az antibiotikumok palettáját a rokon szerkezetû oxolinsav. Néhány évvel késõbb születtek meg az elsõ fluorokinolonok, amelyek az alapvázon 6-os pozícióban fluoratomot tartalmaznak [24, 25]. A hatóanyagok a baktériumok DNS-ének speciális szerkezetéért felelõs bakteriális DNS-giráz enzimet gátolják, így fejtik ki baktericid-hatásukat. A fluorokinolon gyógy- 14

17 szermolekulák hatása függ a koncentrációtól és az idõtõl: magas antibiotikumszint szükséges ahhoz, hogy a baktericidhatás teljes legyen, ugyanakkor a baktériumok MIC- (minimális inhibitor-koncentráció) értékét tartósan meghaladó koncentrációra van szükség a rezisztens mutánsok kiválogatódásának megelõzéséhez. Napjainkban a fluorokinolon antibiotikumok szerepe egyre jelentõsebb a különféle légúti-, gasztrointesztinális-, bõr- és húgyúti fertõzések kezelésében. A (fluoro)kinolonok esetében a generációkra való felosztás segít a tájékozódásban [26, 27]. A (fluoro)kinolon antibiotikumoknak már a negyedik generációja is megjelent, ami egyre szélesebb hatásspekrummal (Gram pozitív és negatív baktériumok ellen egyaránt hatásos) és a fotoszenzibilizáló mellékhatás minimalizálásával igyekszik a hatékony gyógyszeres terápia szolgálatába lépni. Az elsõ generációs kinolonok (nalidixsav, oxolinsav) gyorsan és nagymértékben metabolizálódnak, csak a vizeletben érnek el terápiás koncentrációt, így eredménnyel csak húgyúti infekciók kezelésére használhatóak. A második generációba tartozó szerek (norfloxacin, ofloxacin, pefloxacin, ciprofloxacin) hatékonysága jobb, spektruma szélesebb, és mivel elsõsorban Gram-negatív ellenes hatással rendelkeznek, a húgyúti- ill. gasztrointesztinális infekciók kezelésére megfelelõek. A fluorokinolonok harmadik és negyedik generációjánál (levofloxacin ill. moxifloxacin) az alapvetõ gyógyszerfejlesztési irány a Gram-negatív mellett a Gram-pozitív ellenes hatás létrehozása. Az eddigi adatok alapján e származékok alkalmasak Streptococcus pneumoniae infekciók kezelésére is, és a 4. generációs moxifloxacin a vegyes aerob anaerob infekciók monoterápiájában is kiválónak bizonyul. Antibiotikumok esetén éppúgy, mint egyéb hatóanyagoknál, a gyógyszermolekulák liposzómába zárása lehetõséget kínál a hatékonyabb gyógyszerformulációra [28]. Irodalmi adatok bizonyítják, hogy a humán monocitákban és a makrofágokban a liposzómába zártan a szervezetbe juttatott ciprofloxacin vagy ofloxacin a szabad formájú antibiotikumhoz képest legalább ötvenszeres antimikobakteriális aktivitással rendelkezik M. avium complex fertõzés esetén [29, 30]. A liposzómába zárt fluorokinolonok szabad formájú gyógyszermolekulákkal szembeni megemelkedett intracelluláris penetrációs aktivitását számos kísérlet bizonyítja [29, 30]. A Fresta és mtsai által végzett kísérletek alapján a DPPC-koleszterin-di-hexadecil-foszfát (4:3:4) összetételû liposzómákba zárt ofloxacin 2,6-szer nagyobb mennyiségben jut be az egyébként anti- 15

18 biotikumot nehezen felhalmozó humán szinoviális fibroblasztokba (McCoy-sejtek), mint a szabad formájú hatóanyag [31]. Hasonlóképpen szignifikánsan magasabb antibiotikum koncentráció érhetõ el E. coli és P. aeruginosa baktériumok esetén a liposzómába zárt ofloxacinnal, mint a szabad formájú hatóanyaggal [32]. A fluorokinolonok liposzómába zárása tehát a beadandó antibiotikum mennyiségének csökkentését teszi lehetõvé, az esetlegesen polietilénglikollal (PEG) borított liposzómákba történõ bezárás pedig, ezen túlmenõen, a prolongált keringési idõt is biztosítja, ami lehetõvé teszi a napi egyszeri alkalmazást A liposzómát felépítõ lipidek és a hatóanyagok közötti molekuláris szintû kölcsönhatások vizsgálata A liposzómák gyógyszerszállító rendszerként víz- és zsíroldékony hatóanyagok szállítására egyaránt alkalmasak, a racionális membrán-és liposzóma-tervezés azonban minden esetben elengedhetetlen fontosságú. A különféle hatóanyagok képesek adszorbeálódni, kötõdni a lipid membránokhoz energetikai (elsõdleges kémiai kötések), entrópiai (hidrofób kölcsönhatások) okokból [33]. Ily módon a legtöbb hatóanyag szervezetbeli eloszlását befolyásolják a (biológiai) membránok. A redisztribúcióért felelõs kölcsönhatások nagyon gyakran specifikusnak tûnnek, például érzékenyek a gazdamembrán (host membrán) lipidösszetételére. Amennyiben erõsen hidrofób hatóanyagokat szeretnénk nagy hatásfokkal liposzómákba zárni, akkor a legelõnyösebb olyan lipidek alkalmazása, amelyek a szénhidrogénláncuk középsõ és terminális részén tartalmaznak kettõs kötést. Ezzel ellentétben, amfifil jellegû gyógyszermolekuláknál, amelyek döntõen a fejcsoportok közelében halmozódnak fel, a szénhidrogénlánc fej közeli végénél telítetlen kötést tartalmazó lipidek a legmegfelelõbbek, hiszen így alakíthatunk ki egy megfelelõen fluid fejcsoport környéki régiót és egy rigidebb membránmagot. In vivo és in vitro kísérletek sora igazolja, hogy a gyógyszer- és lipid molekulák közötti kölcsönhatások egyaránt befolyásolják a hatóanyag liposzómába való bezárásának hatásfokát, a liposzómák szervezeten belüli eloszlását és a bezárt hatóanyag kiszabadulását [34, 36]. A hatóanyagot tartalmazó liposzóma egy olyan funkcionális és strukturális egységnek tekintendõ, amelyen bármilyen kis változás (ph, ionerõsség stb.) a teljes rendszer tulajdonságainak megváltozását okozhatja. Az ideális és racionális 16

19 gyógyszertervezés megkívánja, hogy megismerjük a gyógyszermolekulák és a lipidek közötti kölcsönhatásokat, illetve azoknak a liposzóma tulajdonságait befolyásoló szerepét (elõ- és fõ fázisátalakulási hõmérséklet megváltozása stb.), hiszen ezek befolyással vannak a liposzomális gyógyszerkészítmény farmakokinetikai paramétereire. Példaként a morfinszármazékok és a membránlipidek közötti kölcsönhatások vizsgálatát mutatom be. A liposzómába zárt morfin valamennyi farmakokinetikai és farmakodinámiás elõnye a szabad formában alkalmazott morfinnal összehasonlítva a késleltetett hatóanyag felszabadulásban rejlik, amelyet jelentõsen befolyásolnak a morfin- és a lipid molekulák között kialakuló molekuláris szintû kölcsönhatások. Az elmúlt évtizedekben számos eredmény bizonyította az opioid- lipid kölcsönhatások vizsgálatának szükségességét. A morfint tartalmazó liposzómák növekvõ lipidtartalma állatkísérletes modellben növelte az intratekális teret elérõ morfin mennyiségét [36]. Epidurálisan alkalmazott liposzómába zárt opioidok esetén a lipid-kettõsréteg és a morfinszármazék molekulák közötti kölcsönhatás meghatározza azt a hányadost, aminek megfelelõen a hatóanyag a vérben és az intratekális térben eloszlik. Reig és mtsai megállapították, hogy a major analgetikumok hidrofób tulajdonsága jelentõsen befolyásolja e hatóanyagoknak a membrán permeabilitását növelõ képességét [37]. Az opioid molekulák kémiai szerkezete és az általuk a mesterséges membránokon elõidézett hatás (membránrigiditás változása stb.) összefüggésének vizsgálata további információkat nyújt(hat), amelyek fontosak ahhoz, hogy ugyanezen hatóanyagokból hatékony liposzomális gyógyszerek születhessenek. Bezárási hatásfoknak nevezzük az összes hatóanyagnak azt a részét, ami a liposzómába záródott. Ez a hányad tartalmazza mind a vezikulákon belüli, mind pedig a liposzómák apoláros falába záródott hatóanyagot. A hatóanyag és a lipidek közötti kölcsönhatások jelentõs befolyással vannak a bezárási hatásfokra. A bezárási hatásfokot befolyásoló tényezõk közül elsõsorban a következõket kell figyelembe venni: i.) a hatóanyag és a lipidek minõsége; ii.) ezek aránya; iii.) a molekulák protonáltsági állapota, azaz a közeg ph-értéke. 17

20 1.5. A liposzóma preparátumok stabilitásának jelentõsége és vizsgálata A liposzomális készítmények kedvezõbb hatás-, mellékhatás- és farmakokinetikai profillal rendelkeznek, mint a szabad formában hatóanyagot tartalmazó hagyományos gyógyszerek. A gyógyszerforma ipari méretû termelésénél meg kell felelni az elõállítási folyamatra vonatkozó reprodukálhatóság és a gyógyszeripar által igényelt nagy mennyiségben történõ elõállítás kritériumainak is. Emellett, a gyógyszeriparban érvényes modern minõségbiztosítási követelmények megkívánják azt, hogy az elõállított liposzomális készítmények stabilak legyenek. Stabilitás alatt egyrészt fizikai, másrészt kémiai és biológiai stabilitást értünk. A fizikai stabilitás a liposzómák méreteloszlásának, diszperzitásának idõbeli állandóságát jelenti, ami pl., fényszórásméréssel ellenõrizhetõ. További, a fizikai stabilitást jellemzõ fontos paraméter a bezárási hatásfok idõbeli stabilitása. A liposzómák méreteloszlásának a meghatározása és annak idõbeli nyomon követése különleges jelentõségû, mert amellett, hogy az aggregációra, fúzióra fényt derít, a liposzómák egy olyan jellemzõ paraméterérõl (átlagos átmérõ) kapunk információt, amely meghatározza az úgynevezett plazma farmakokinetikát és a szervekben történõ eloszlást. A kémiai stabilitás biztosítása a ph változásának, a foszfolipid zsírsavlánc-peroxidációnak, a hatóanyag elbomlásának, esetleg a koleszterin autooxidációnak és a foszfolipidek hidrolízisének a kivédését ill. megengedett határok közé szorítását jelenti. A biológiai-, mikrobiológiai stabilitás a készítmények steril és pirogénmentes voltát kívánja meg [38] Az ultraibolya fény és hatásai Az elekromágneses spektrum 200 nm-tõl 400 nm-ig terjedõ tartományában található az ultraibolya- (UV) sugárzás. A biológiai hatás szempontjából az UV- tartomány az ózonrétegben teljesen elnyelõdõ UVC ( nm), a részben elnyelõdõ UVB ( nm), és az azon átjutó UVA ( nm) tartományokra bontható fel, bár az UVA, -B, -C osztályozás nem a légköri abszorpción, hanem az UV-sugárzás biológiai hatásain alapul. Amellett, hogy bizonyos élettani folyamatok igénylik az UV-fényt (D-vitamin képzõdéséhez szükséges), az UV-fotonok számos determinisztikus és stochasztikus ká- 18

21 rosodás kialakulásáért tehetõek felelõssé, és szerepet játszanak a fototoxicitás és a fotoallergia létrejöttében is [7]. A fototoxicitás és fotoallergia elkülönítése Epstein nevéhez fûzõdik, aki a szulfonamid antibiotikumok által okozott fotoszenzitivitást vizsgálta [39]. A fototoxicitás bárkiben kialakulhat abban az esetben, ha megfelelõen nagy gyógyszeradagot alkalmazunk viszonylag nagy dózisú sugárzással egyidejûleg. Ezzel szemben, a fotoallergia csak azokban jön létre, akik elõzetesen immunológiailag szenzibilizálódtak a fotoaktivált hatóanyaggal szemben [40]. Ezzel magyarázható, hogy a fotoallergia elõfordulása ritkább, mint a fototoxicitásé. A fotoszenzibilizációt elõidézõ molekulák skálája rendkívül széles, a palettán számos, terápiában alkalmazott hatóanyag is megtalálható. A gyógyszerek közül számos antibiotikum, mint tetraciklinek, fluorokinolonok, szulfonamidok vezethetnek nem kívánatos bõrreakciókhoz. További példaként megemlíteném az antiarritmiás hatású amiodaron, a diuretikus hatású hidroklorotiazid, valamint klortiazid, az antidepresszáns protriptilin fotoszenzibilizáló tulajdonságát [41-43]. Az elmúlt évtizedekben a fluorokinolonok bizonyultak a legjelentõsebb gyógyszerészeti fototoxinoknak. Az általában összetett hatásmechanizmus tisztázása, a szerkezet és a fotoszenzibilizáló hatás közötti összefüggések felderítése hozzájárulhat ahhoz, hogy a jövõben kisebb számban jelenjenek meg a gyógyszerpiacon fotoszenzibilizáló mellékhatással rendelkezõ gyógyszerkészítmények A nalidixsav és a fluorokinolonok fototoxicitása A nalidixsav terápiába való bevezetését követõen viszonylag hamar, már a 70- es évek elején, számos közlemény jelent meg a hatóanyag fototoxicitásáról, és a nalidixsav lépett elõ a leggyakrabban fototoxicitást okozott hatóanyaggá [44-46]. A betegekre jellemzõ klinikai kép a szélsõségesen erõs napégéshez hasonló volt. Ennek a nem kívánatos hatásnak a kiküszöbölése érdekében számos, szerkezetileg rokon, nagy potenciálú, széles spektrumú antibiotikumot szintetizáltak [40, 47-49]. 19

22 2. táblázat: Néhány (fluoro)-kinolon származék klinikai használatba való bevezetésének éve és a 8-as pozícióban lévõ szubsztituense (Fluoro)-kinolon neve Food and Drug Administration (FDA) jóváhagyás éve a 8- as pozíció szubsztituense Nalidixsav 1962 a.) Ciprofloxacin 1990 b.) Ofloxacin 1992 c.) Lomefloxacin 1992 F Moxifloxacin 1999 OCH 3 a.) A 8-as pozícióban nitrogénatom található; b.) a 8-as pozícióban szénatom található; c.) morfolingyûrû az 1-pozicióban lévõ N-atommal. 6 O COOH CH 3 N N C 2 H ábra. A nalidixsav konstitúciós képlete, és a szerkezet-fototoxikus hatás öszszefüggése szempontjából lényeges pozíciók (6-os C-atom és 8-as N- atom) A származékok kisebb-nagyobb módosításokkal tartalmazzák a 4-oxo-1,8- naftiridin-3-karboxilsav kémiai szerkezetet (2. táblázat). Valamennyi fluorokinolon esetén nyilvánvaló az, hogy a nalidixsavtól eltérõen 6-os pozícióban fluor kapcsolódik a gyûrûhöz. A fototoxikus hatás hordozója azonban a 8-as pozícióban lévõ szubsztituens. Amennyiben 8-as pozícióban semmilyen szubsztituenst sem találunk, akkor a fototoxicitás enyhe, mint például a ciprofloxacin esetében. Attól függõen, hogy milyen szubsztituens helyezkedik el 8-as pozícióban, a fototoxikus aktivitás eltérõ mértékû. Néhány szubsztituenst tüntettem fel fototoxikus aktivitásuk csökkenõ sorrendjében (Cl > F > OC 2 CH 3 > N > C > OCH 3 ). Bár az újabb származékok kevésbé fototoxikus hatá- 20

23 súak, mint a nalidixsav például a lomefloxacin esetében a páciensek 1-2%-a szenved fototoxikus bõrreakciótól [57], a moxifloxacin esetén eddig nem számoltak be a hatóanyag ilyen hatásáról [58] humán és állatkísérletes vizsgálatok nagy száma bizonyítja, hogy a fototoxikus mellékhatást nem sikerült tökéletesen kiküszöbölni [50-56]. A fluorokinolonok az UVA-tartományban a nm közötti hullámhossz tartományban rendelkeznek abszorpciós csúccsal, és ennél is jelentõsebb a ~ 270 nm-nél lévõ abszorpciós csúcs. Azt mondhatjuk tehát, hogy a fluorokinolonok az UVB- tartományban abszorbeálnak. 0,8 extinkció 0, [nm] 4. ábra. Lomefloxacin abszorpciós spektruma PBS oldatban ph=6,8-on. A jelölt terület az UVB-tartománynak ( nm) felel meg. Szinte bizonyos, hogy a fototoxikus hatás kialakulásában szerepet játszanak a folyamat során képzõdõ reaktív oxigén intermedierek (ROI), mint a hidrogén-peroxid, szuperoxid, szinglet oxigén és a hidroxil gyök [59-61]. A reaktív szinglet oxigén láncreakciót indíthat el, ami a lipid-peroxidáción keresztül a sejtek líziséhez vezethet. Fujita és Matsuo szerint az elõbbi mellett a non-szinglet oxigén út is szerepet játszik a károsodások létrejöttében [62]. Shimoda szerint a fototoxicitásért [63] sokkal inkább a ciklooxigenáz származékok, semmint a (non-)/szinglet oxigén mechanizmus(ok) felelõs(ek). Komplett reakcióláncot vázol fel az a teória, ami a 8-as pozícióban fluort tartalmazó származékok (lomefloxacin, fleroxacin) fotolízisére támaszkodik. Az UVAbesugárzást követõ fluor-lehasadás reaktív karbén képzõdéséhez vezet, amely a továb- 21

24 biakban reakcióba lép a jelenlévõ oxigénnel és vízzel. A reakció eredményeként hidrogén-peroxid képzõdik, majd hidroxil gyökök jönnek belõle létre. A karbén, a hidrogénperoxid és a hidroxil gyök együttesen vesznek részt a sejtek károsodásának kialakításában, amely megnövekedett prosztanoid-szintézisben valamint gyulladásos reakcióban nyilvánul meg [64, 65] Az UVA-sugárzás hatása sejtmembránokon Az UVA-sugárzás sejtekre gyakorolt hatása ma is a tudományos érdeklõdés homlokterében áll. Az UV-sugárzások közül elsõsorban a biológiailag veszélyesebb - nek bizonyult UVB-és UVC-sugárzást vizsgálták. Erre a két utóbbi tartományra vonatkozó eredmények szerint a különbözõ DNS-sérülések a jellemzõek, s az UV-sugárzás hatása elsõsorban primer hatásként jelentkezik a DNS molekulákon. Ezzel ellentétben, az UVA-sugárzás biológiai hatását mint oxidatív sérülésbõl kialakuló folyamatot fogják fel. Ezek az oxidatív sérülések mind a DNS, mind a sejtben lévõ különbözõ fehérjék, membránok szintjén jelentkezhetnek [66-79]. A sejtmembránok szintjén a fotooxidatív stressz elsõdleges célpontja a membránok telítetlen zsírsav összetevõi [73,74]. Morliere és munkatársai vizsgálták a lipidperoxidáció szerepét a membránsérülésekben mind fibroblaszt mind keratinocita sejtek esetén, és ezen kísérletek eredményeként a hatásspektrumot is meghatározták [76-79]. Az eddigi ESR spektroszkópiai munkákban elsõsorban kismolekulájú, pl. TEMPO, spinjelölõket alkalmaztak az UV-sugárzás hatásainak vizsgálatára [80-82]. Részletes, dózisfüggõ kísérleti eredmények a sejtmembránba inkorporált zsírsav típusú jelölõkkel azonban nem ismertek az irodalomban. Ugyanakkor a sejtmembránba inkorporált spinjelölt zsírsav azzal az elõnnyel is rendelkezik, hogy az UVA-sugárzás hatására a membránban bekövetkezõ fluiditás változásokat, valamint a képzõdõ ROI-k hatását a bevitt szabadgyök redukcióján keresztül megfigyelhetõvé teszi. A sejtmembránban bekövetkezõ sérüléseket igen sok, más módszerrel is vizsgálják, amelyek közül néhány a sejtmembrán direkt sérülését, más módszerek a sejt metabolizmusában bekövetkezõ változásokon keresztül, a sejt élõképességét/túlélési hányadát méri. A sejt élõképességének mérésére kidolgozott módszerek közül elsõsorban a tripánkék, a neutrál-vörös és a különféle formazán-származékokat alkalmazó teszteket használják. E három módszer közül, a tripánkék teszt az, amit ma úgy fognak föl, mint az a módszer, 22

25 ami a külsõ sejtmembrán sérüléseit tükrözi. A neutrálvörös teszt a lizoszómák és a Golgi-apparátus sérüléseit indikálja. Az MTT-teszt pedig a sejt metabolikus aktivitását méri a mitokondriális dehidrogenáz enzim aktivitásán keresztül, bár a tesztben megfigyelt formazán redukció nem kizárólagosan csak az elõbbi enzim aktivitásával van kapcsolatban [83,84]. Az ESR-mérések segítségével az inkorporált szabadgyökök redukciójának sebessége alapján becslést adhatunk a sejtek redukciós képességére, s ezen keresztül a sejtek metabolitikus aktivitásával kapcsolatban lévõ jellemzõ definiálható. Az értekezésben bemutatom a sejtmembrán fluiditásában, nagy dózisú UVAbesugárzás hatására bekövetkezõ változásra vonatkozó ESR spektroszkópiai eredményeimet, valamint a redukciós képesség és az elõzõekben említett túlélési tesztek eredményeit hasonlítom össze, különbözõ dózisú UVA-besugárzás mellett. 23

26 2. CÉLKITÛZÉSEK A különféle, gyógyszeres terápiában alkalmazott hatóanyagok liposzómába zárásával olyan gyógyszereket formulálhatunk, amelyek farmakokinetikája, hatás-és mellékhatás-spektruma kedvezõbb a hagyományos gyógyszerformákénál. A liposzómába zárás sikere, és a szervezetbe történõ bejuttatást követõen a hatóanyag megfelelõ helyen történõ elõre ütemezett felszabadulásának érdekében fontos megismernünk azokat a molekuláris kölcsönhatásokat, amelyek a liposzómába zárt hatóanyag és a liposzómák falát alkotó lipidek között lépnek fel. A major analgetikumok családjának és a kemoterápiás szerek egyre szélesebb körû terápiás felhasználást nyerõ csoportjának, a (fluoro)kinolonoknak a liposzómába zárása nagy jelentõségû lehet a humán gyógyszeres terápiában. A fluorokinolonok egyik legkellemetlenebb, sok szempontból tisztázatlan mechanizmusú mellékhatása a fototoxicitás. Az UV-fény hatására szabad gyökök keletkeznek, amik a liposzomális készítmények stabilitását is befolyásolhatják. Munkám során célul tûztem ki: I. A major analgetikumok csoportjába tartozó morfin és néhány származékának (kodein, N-metil-morfin, N-metil-kodein) DPPC-liposzómákba történõ zárása. I.1. Bezárási hatásfok meghatározása, a lipidekkel kialakuló kölcsönhatások jellegének, hõmérsékletfüggésének tanulmányozása, a hatóanyagok membránbeli lokalizációjának vizsgálata; I.2. Kapcsolat keresése a hatóanyagok kémiai szerkezete és a lipiddel kialakult kölcsönhatások között. II. Nalidixsavból, ofloxacinból és lomefloxacinból extruderes illetve ultrahangos eljárással liposzóma alapú potenciális gyógyszerek elõállítása. II.1. I.1.-hez hasonló vizsgálatok elvégzése mellett a lipidösszetétel szerepének tanulmányozása, különös tekintettel a telítetlen zsírsavat tartalmazó lipideknek (DOPC) a hatóanyagokkal kialakult kölcsönhatását befolyásoló szerepére; 24

27 II.2. A liposzómakészítmények stabilitásának vizsgálata fényszórásméréssel és felületi töltés mérésével; II.3. Lomefloxacin esetén a ph szerepének tanulmányozása a hatóanyag-lipid-zsírsav kölcsönhatásban. III. IV. Az UV-fény modellmembránokra kifejtett hatásának megismerése érdekében tanulmányozni kívántam: III.1. Az UVB fény különbözõ dózisainak a hatását a nalidixsavliposzómamembrán kölcsönhatásra; III.2. Az UVB fény jelenlétében végbemenõ gyökképzõdés kinetikáját a különbözõ fototoxikus mellékhatású antibiotikumok esetén. Az UVA-fény biológiai membránokra gyakorolt hatásának vizsgálata humán fibroblaszt sejtvonalon. 25

28 3. ANYAGOK ÉS MÓDSZEREK 3.1. Anyagok Liposzómák elõállításához?-l-dipalmitoil-foszfatidilkolin (DPPC) és?-ldioleoil-foszfatidilkolin (DOPC) lipideket használtunk, amiket a Sigma Chemical Cotól szereztünk be, és amelyek tisztasága legalább 99%-os volt. A lipidek oldásához analitikai tisztaságú etil-alkoholt használtunk. A lipidfilmek hidrálásához desztillált vizet (ph=6,8) illetve foszfáttal pufferelt (ph = 5,0; 6,8; 8,0) izotóniás sóoldatokat (PBS) alkalmaztunk. A pufferoldatok ph-ját Na 2 HPO 4 x 2 H 2 O illetve KH 2 PO 4 megfelelõ arányának segítségével állítottuk be a kívánt értékre. A morfint és származékait (morfin-klorid, kodein-klorid, N-metil-morfin-klorid, N-metil-kodein-klorid) az Alkaloida Gyógyszergyártól (Tiszavasvári) kaptuk. A nalidixsavat (NANa), valamint a vizsgálatainkhoz használt ofloxacint (OFLX) és lomefloxacint (LMFX) a Sigma Chemical Co-tól vásároltuk. Spinjelölõként 5-doxil- (5-DOX), 7-doxil- (7-DOX) és 12-doxil-sztearinsavat (12-DOX) (ICN Biomedicals Inc., Ohio), valamint 16-doxil-sztearinsavat (16-DOX) (Sigma Chem. Co.) és 5-doxil-metil-sztearátot (5-DMS) (Sigma Chem. Co.) használtunk. A sejtek vizsgálatához MRC5-V1 típusú, transzformált humán tüdõ-fibroblaszt sejteket alkalmaztunk (Dr. A. Sarasin, CNRS, Villejuif, Franciaország), Dulbecco féle Eagle táptalajon növesztve, amelyben 10 % FCS (fetal calf serum, GIBCO) és gentamycin antibiotikum (Biochemie, Ausztria) volt. A méréshez alkalmazott sejtek közel konfluensek voltak, 14 és 24 közötti passzázsszámmal. 26

29 3.2. Módszerek Unilamelláris és multilamelláris liposzómák elõállítása ESR és DSC mérésekhez Az MLV-ket DPPC-bõl ill. DPPC/DOPC 70/30; 80/20; 90/10 vagy 95/5 mólarányú keverékeibõl állítottuk elõ vékonyréteg hidratációs technikával. 10,0 mg lipidet 200 µl abszolút alkoholban oldottunk fel, majd a szerves oldószert nitrogén árammal távolítottuk el. Az esetleges oldószermaradványok tökéletes eltávolítása érdekében kétszer 15 percig vákuumszivattyúra helyeztük és egy éjszakán át exszikátorban tartottuk a mintákat. Az ESR-mérésekhez a mintákat a következõképpen készítettük: a hidrálás során, a kémcsõ falán létrejött lipidfilmhez 100 µl-es adagokban az adott ph-jú foszfát-puffer 1,0 ml-ét adtuk, és a fõ fázisátalakulási hõmérséklet feletti hõmérsékleten (~50 o C), vízfürdõben történõ 20 percig rázattuk. Ekkor nagyméretû, sok lipidréteggel határolt liposzómákat nyertünk. A végsõ lipidkoncentráció 13,6 mmól/l volt. A DSCmérések céljára a mintákat a mérõmûszerhez szükséges nagyobb lipidkoncentráció elérése érdekében 40 µl pufferoldattal hidráltuk. Az elõállítás valamennyi egyéb körülménye megegyezett az ESR-minták készítésének lépéseivel. Hatóanyagot tartalmazó liposzómák készítésénél a morfin-kloridot (M t =376 g/mól), a kodein-kloridot (M t =372 g/mól), az N-metil-morfin-kloridot (M t =391 g/mól) és az N-metil-kodein-kloridot (M t =387 g/mól) a hidráló desztillált vízben elõzetesen feloldottuk. Az alkalmazott koncentrációt a molekulatömegek ismeretében úgy határoztuk meg, hogy a végsõ lipid/hatóanyag mólarány 10:1 legyen. Ez az arány érvényes mind az ESR, mind a DSC mintákra. A nalidixsavat tartalmazó liposzómák ESR-méréseinkhez történõ elõállítása esetén a nalidixsav nátrium-sóját (Mt=254 g/mól) 1 mm-os koncentrációban tartalmazó puffer-oldattal végeztük a hidrálást. DSC-méréseinkhez a nalidixsavat olyan mennyiségben adtuk a hidráló pufferhez, hogy annak végkoncentrációja 10:1 lipid:nalidixsav mólaránynak feleljen meg. A fluorokinolonokat tartalmazó liposzómák készítésének érdekében az ofloxacin és a lomefloxacin hatóanyagokat a liposzómák elõállításának kezdeti fázisában azok rossz vízoldékonysága miatt a lipiddel együtt oldottuk fel az abszolút alkoholban. A hidráló puffer-oldatban lévõ ofloxacin (Mt=361 g/mól) koncentrációja 1 mm-os, a lomefloxacin (Mt=388 g/mól) esetén ugyanez 0,5; 1; 3; 5; 7 ill. 27

30 10 mm-os volt. LMFX esetében a liposzómák hidrálására különbözõ ph-jú PBSpufferoldatokat alkalmaztunk a ph=5 és ph=8 közötti tartományban. SUV-ok elõállítása ultrahangos eljárással Annak érdekében, hogy homogén méreteloszlású, egyetlen kettõs membránnal határolt 100 nm-nél kisebb hidrodinamikai átmérõjû liposzómákat kapjunk, a pontban ismertetett módon elõállított MLV-ket kétszer 10 perces ultrahangos besugárzásnak vetettük alá. Az alkalmazott frekvencia 20 khz, a hullám amplitúdó 8 µm volt. A kezelés 50 o C-on történt, a besugárzások között 10 perces szünetet tartva. SUV-ok elõállítása extrudálással Az extudáláshoz szükséges MLV-ket az elõzõekben leírt módszerrel állítottuk elõ, kivéve, hogy az alkalmazott lipidkoncentráció 1 mg/ml volt (5. ábra). A liposzómák viszonylag heterogén, multilamelláris populációját különbözõ pórusátmérõjû (400 nm, 100 nm, 50 nm) polikarbonát membrán-filtereken préseltük át (Avestin típusú extruder). Annak érdekében, hogy a SUV-ok mérettartományába esõ liposzómákat kapjunk, 400, 100 ill. 50 nm pórusátmérõjû polikarbonát membrán-filteren 50-szer, 100-szor ill. 150-szer nyomtuk át a mintákat. A liposzómák jelölése ESR-méréshez Spinjelölõként 5-doxil-sztearinsavat, 7- doxil-sztearinsavat, 12-doxil-sztearinsavat, 16-doxil-sztearinsavat és 5-doxil-metilsztearátot alkalmaztunk. Az alkalmazott spinjelölõ- és a lipid molekulák mólaránya minden esetben 1:100 volt. 28

31 5. ábra. A mintakészítés során használt Avestin típusú extruder Liposzómák UV-besugárzása Amennyiben NANa-t ill. fluorokinolon antibiotikumot (OFLX, LMFX) zártunk liposzómába, a minták UVB-besugárzását FS20 (Westinghouse) lámpával végeztük 0-15 kj/m 2 dózistartományban. A besugárzás során az ESR-mérésre váró mintákat lezárt kvarcküvettában, a DSC-méréshez elõkészített mintákat kvarcbúrával lefedett alumínium DSC mintatartókban tartottuk. A besugárzási dózist és a besugárzási intenzitást VLX-3W dózismérõvel, egy ahhoz csatlakoztatott CX-312 típusú szenzor segítségével 312 nm-en mértük. Az alkalmazott intenzitás 14 W/m 2 volt Bezárási hatásfok meghatározása Morfint és kodeint tartalmazó liposzómák elõállítása és a bezárási hatásfok meghatározása A liposzómák elõállítása a vékonyréteg hidratációs technikával történt. 200,0 mg DPPC-t 3,0 ml abszolút alkoholban oldottunk fel. A gömblombik folyamatos forgatása mellett nitrogén árammal eltávolítottuk a szerves oldószert. A szerves oldószer tökéletes eltávolítása érdekében kétszer 10 perces vákuumszivattyúzás következett, majd egy éjszakán át exszikátorban tartottuk az ily módon képzõdött filmet. A hidrálást morfin-klorid ill. kodein-klorid 0,1 M-os koncentrációjú desztillált vizes oldatával végeztük, ami 37,6 mg/ml ill. 37,2 mg/ml-es hatóanyag koncentrációknak felel meg. A hidrálás a hidráló oldat 3,0 ml-ével történt ~50 o C-os hõmérsékleten. A hidrálást köve- 29

32 tõen a lipidkoncentráció 67 mg/ml volt. A multilamelláris liposzómákból a pontban megadott körülmények közötti ultrahangos kezeléssel nyertünk kis unilamelláris liposzómákat. A bezárási hatásfok meghatározásához a liposzómába bezárt morfin/ kodein ill. a szabad formájú morfin/kodein elválasztására volt szükség. A szétválasztást 1,5 x 40 cm-es Sephadex G-50 oszlopon gélfiltrációval végeztük. A lecsepegett frakciókat 2,0 ml-enként gyûjtöttük. A liposzómamentes frakciókban a morfin/kodein mennyiségét közvetlenül spektrofotometriásan határoztuk meg. A mérés a 207,2 ill. a 208,4 nm-es hullámhosszakon történt, ahol a morfin ill. kodein abszorpciós maximummal rendelkezik. A bezárt opiátok mennyiségének meghatározásához a liposzómákat nagy koncentrációjú polietilén-glikol 1540-nel szolubilizáltuk (2,0 mg PEG 1540/ 1,00 ml lipid diszperzió) [85]. A szolubilizálást követõen 4 napos 4 o C-on történõ dialízissel választottuk el egymástól a lipideket és a morfint/kodeint, 20kD-os molekulatömegnél elválasztó dialízis-membránt alkalmazva. Ezt követõen a morfin/kodein mennyiségét spektrofotometriásan mértük. A bezárási hatásfok %-ban kifejezett értékét az abszorbanciák ismeretében határoztam meg. Nalidixsavat tartalmazó liposzómák elõállítása és a bezárási hatásfok meghatározása A nalidixsavra vonatkozó bezárási hatásfokot DPPC-bõl készült SUV-okra, MLV-kre, valamint DPPC-t és DOPC-t 70/30 mólarányban tartalmazó SUV-okra nézve is meghatároztuk. A MLV-ket a pontban, a SUV-okat a pontban leírt módszerrel állítottuk elõ. Az alkalmazott NANa-végkoncentráció minden esetben 10 mm volt. Az MLV vagy SUV minták 400 µl-ét Eppendorf centrifugával (20 perc, g), Microcon YM-10 filteres centrifugacsövecskében centrifugáltuk, ahol a filter 10 kd molekulatömegnél választott el. Elõzetesen megbizonyosodtunk arról, hogy semmilyen specifikus ill. adszorpciós kölcsönhatás nem lép fel a NANa és a filter között. A NANa mennyiségét a hidráló ill. a centrifugálás során filtrálódott oldatokban spektrofotometriásan határoztuk meg, 258 és 334 nm-es hullámhosszakon mérve a minták abszorbanciáit [86]. A be nem záródott hatóanyag mennyiségét a megfelelõ abszorbanciák hányadosaiból határoztuk meg, a bezárt anyagmennyiséget ezután az elõbbi ismeretében számoltuk ki. 30