6. gyakorlat: Immunszerológia 1. precipitáció, agglu;náció

Átírás

1 6. gyakorlat: Immunszerológia 1. precipitáció, agglu;náció Az immunológia alapjai PTE-KK, Immunológiai és Biotechnológiai Intézet Pécs, 2016.

2 A szerológia fogalma A vérszérum és más testnedvek laboratóriumi vizsgálata, a gyakorlatban elsősorban az azokban található an*testek kimutatását ér;k alama. Emlékeztek? Vérplazma: alvadásgátolt vér felülúszója Vérszérum: alvadt vér felülúszója Ezek is an*gén-an*test reakción alapulnak (mindkemő kimutatható). Milyen módszerek tartoznak ide? Precipitáción alapulók Agglu*náción alapulók Immunoassay vizsgálatok (ELISA, ELISPOT, radioimmunoassay, stb., lásd jövő héten) Immunoblot technikák (Western blot, Dot blot, lásd jövő héten) Indirekt immunfluoreszcens mikroszkópia Főbb klinikai felhasználás: Fertőző betegségek diagnosz;kája (pl. a kórokozók ellen termelt an;testek kimutatása) Autoimmun betegségek diagnosz;kája (kóros autoan;testek kimutatása) Immunhiányos állapotok diagnosz;kája (an;testek szintjeinek mérése) Vércsoport meghatározás

3 Specificitás, szenzi;vitás FN = Fals negaev FP = Fals poziev Nega^v Határérték Pozi^v Fogalmak: [1.] Specificitás= Valódi negatív/összes Szenzitivitás= Valódi pozitív/össze Egészséges Beteg Az ideális vizsgálat 100%-os szenzi;vitással és specificitással rendelkezik, de ilyen vizsgálat NINCSEN. FN FP Normális tartomány? Kóros tartomány

4 Fals pozi^v eredmény Fals nega^v eredmény Ön nem várandós. Ön gyermeket vár.

5 Precipitáció An;gén An;test Ha az oldatban lévő an;gén mellem megfelelő arányban van jelen az azt felismerő an;test is, akkor nagyobb fehérje komplexeket hoznak létre. An;test mennyisége An;test túlsúly Ekvivalencia zóna Precipitátum képződik An;gén túlsúly A nagyobb komplexeknek csökken az oldékonysága és kicsapódnak (precipitáció). Ezen alapul: Immundiffúzió Immunelektroforézis An;gén mennyisége

6 Immundiffúzió I. Radiális immundiffúzió An*test az agar gélbe ágyazva KeKős immundiffúzió An*test Az an;gén körkörös diffúziója An*gén Precipitációs ív An*gén Egyszerűen kivitelezhető, de ma már elavult technikák. Agar gél Precipitáció

7 Immundiffúzió II. Mancini-féle [2.] radiális immundiffúzió: Ouchterlony-féle [3.] k e M ő s immundiffúzió: Az agar gél egyenletes koncentrációban tartalmaz an;gént. Hozzáadják a vizsgált szérumot, az abban található an;test kör irányba elkezd diffundálni. Amint az an;gén-an;test arány eléri az ideális tartományt, kicsapódnak. Szemikvan*taEv módszer. A gél középső rése az an;gént, a körülöme található rések pedig a különböző szérumokat tartalmazzák. Ahogy az an;gén és a szérumokban található an;test egymás felé diffundál, precipitációs íveket hoznak létre. Szemikvan*taEv módszer.

8 Fehérje elektroforézis + - Anód Elektródák Katód Áramforrás Az elektromos töltéssel bíró molekulák, köztük a fehérjék is, elektromos erőtér hatására a töltésükkel ellentétes pólus irányába vándorolnak. A vándorlási sebességük függ: A közeg ellenállásától (standardizálható) Az alkalmazom feszültségtől (standardizálható) A fehérjék méretétől és töltésétől (utóbbi ph-függő) Az eltérő sebességgel futó fehérjék így fizikailag elválaszthatók. A közeg lehet: Szilárd (pl. papír, nitrocellulóz) Fél-folyékony (pl. agaróz vagy poliakrilamid gél) Folyékony

9 Szérum protein elektroforézis A vérszérumot enyhén alkalikus közegben fumatják, ilyen körülmények közöm a szérum fehérjék többsége a pozi^v elektróda felé mozdul el, láthatóvá pedig nem-specifikus fehérje festékekkel tehetők. [4.] Minta Albumin α1-globulinok α2-globulinok β-globulinok γ-globulinok Arne Tiselius 1948-as Kémiai Nobel-díj: Az elektroforézis és az adszorpciós analízis terén végzem kutatásaiért, különös tekintemel a szérum fehérjék komplex természetét feltáró eredményeiért. [5.]

10 Szérum elektroforézis analízise Néhány példa az egyes frakciókban futó fehérjékre: [6.] Legnagyobb frakció az albumin. α1-globulinok: α1-an*tripszin Szérum amiloid A Re;nol-kötő fehérje Transzkor;n α2-globulinok: Cöruloplazmin Angiotenzinogén Haptoglobin β-globulinok: β2-mikroglobulin Transzferrin Plazminogén γ-globulinok: Immunglobulinok Szérum elektroforézis normális mintázata és az abból készült denzitometriás diagram. Gyulladásos citokinek hatására (pl. TNFα, IL-1, IL-6) az akut fázis reakció során a termelésük: Növekszik (pozi^v akut fázis fehérjék, legfőbb képviselőjük a CRP, ami a β- és a γ-frakció közöm fut [7.] ) Csökken

11 Példák kóros szérum elektroforézisre I. Poliklonális gammopathia Monoklonális gammopathia M csúcs Több B-sejt klón á l t a l t e r m e l t immunglobulin többlet, valamilyen gyulladásos folyamat áll mögöme: [7.] Fertőzés Autoimmun betegség Daganat Májbetegség (pl. hepa;;s, cirrhosis) Egyetlen B-sejt klón által termelt immunglobulin többlet, plazmasejtes daganat áll mögöme: [7.] Myeloma mul;plex Waldenström macroglobulinaemia MGUS (Monoclonal gammopathy of undetermined significance)

12 Példák kóros szérum elektroforézisre α1-an*tripszin hiány [8.] Csökkent α1-globulin frakció II. α1-an*tripszin (A1AT): Májban termelődik. A neutrophilek által termelt elasztázt semlegesí* a gyulladásos reakciókban. α1-an*tripszin deficiencia: Gene*kai betegség. Nem szekretálódik, hanem a májsejtekben felhalmozódik az α1-an;tripszin. A vérben jelentősen csökken a szintje, ami már fiatalkorban szövődményekhez vezet: PAS-reakcióval p o z i ^ v, felhalmozódom A1AT szemcsék Májkárosodás (felhalmozódó A1AT miam) Tüdőkárosodás (hiányzó A1AT miam a tüdőben zajló gyulladásos folyamatok fokozoman károsítják a tüdőszövetet) Krónikus hasnyálmirigy-gyulladás (hiányzó A1AT miam)

13 Egyéb tesxolyadékok elektroforézise Liquor cerebrospinalis (CSF) albumin γ-globulin Kontroll CSF Beteg CSF Kontroll szérum Beteg szérum Vizelet elektroforézis: Myeloma mul;plex gyanúja esetén, szérum elektroforézissel egy időben végzik, a vesében kórosan filtrálódó immunglobulin könnyű láncot (Bence Jones fehérje [11.] ) keresik. A beteg esetében több, különböző csík látszik a gamma-globulin frakcióban, ami azonban eltér a szérumában található mintázamól. Kóros immunglobulin termelődik helyileg a közpon; idegrendszerben. (oligoklonális gammopathia, pl. sclerosis mul*plex esetén [9.] ) HáMér információ: Az immunglobulinok normálisan nem jutnak át a vér-agy gáton. [10.]

14 Immunelektroforézis I. 1. Szérum minták elektroforézise 1. minta (kontroll) 4. Precipitációs ívek keletkeznek 2. minta (páciens) 5. Ívek megfestése 2. An;-humán ellenanyag hozzáadása 6. Ívek összehasonlítása a kontrollal 3. Diffúzió An;-humán ellenanyag

15 Immunelektroforézis II. albumin α2-makroglobulin transzferrin IgM IgA IgG A látható íveket mindig normál kontrollal hasonlítják össze. [12.] Poliklonális ellenanyagok használata esetén a formálódó ívek száma amól függ, milyen an;-humán szérumot használnak (ló, nyúl, kecske, stb.). Monoklonális ellenanyagok segítségével egy-egy szérumfehérje specifikusan azonosítható a mintában. Szemikvan*taEv vizsgálat, a klinikai gyakorlatban ma már nem használják.

16 1. Poliklonális hipergammaglobulinémia (Rheumatoid arthri*s) An;-λ An;-κ Norm. 1:1 1:2 1:4 1:8 1:1 1:1 (Magyarázat: Az 1. betegnél autoimmun folyamat eredményeként több B- sejt klón ak;válódom és termelt ellenanyagot, míg a 2. betegnél egyetlen daganatos klón szaporodom fel, az utódsejtek mindegyike ugyanolyan izo^pusú immunglobulint termel.) Szérum ELFO Poliklonális ielfo An;-IgG An;-λ An;-κ Norm. 1:1 1:2 1:4 1:8 1:8 1:32 1:64 1:1 1:4 1:1 2. Monoklonális gammopathia (IgG λ immunglobulint termelő myeloma mul*plex)

17 Immunfixáció I. Elektroforézis - + An;-humán M csúcs An;-IgG An;-IgA An;-IgM An;-κ An;-λ 1. Több párhuzamos szérum elektroforézist végeznek ugyanabból a betegmintából. [13.] 2. Ezt követően az egyes megfumatom géleken an;testekkel mutatnak ki meghatározom fehérjéket. (A hozzáadom an;test az an;génnel precipitátumot képez, mely vagy szabad szemmel, vagy valamilyen festék hozzáadásával látható. Az an;gének az esetek többségében maguk a humán immunglobulinok.) Felhasználás: Általában plazmasejtes daganatok diagnosz;kája a rájuk jellemző kóros monoklonális an;testek ( paraprotein ) kimutatásán keresztül a szérumban. [14.] IgG κ izo^pusú monoklonális ellenanyagot termelő myeloma mul;plex

18 Immunfixáció II Normális szérum 2. Myeloma mul;plex IgG paraproteinnel 3. Waldenström macroglobulinaemia IgM paraproteinnel 4. Myeloma mul;plex IgA paraproteinnel Körülírt csonthiányos gócok a koponyáról készült röntgenfelvételen myeloma mul;plexben. [15.]

19 Rakéta immunelektroforézis An;test az agaróz gélben Precipitációs ív ( rakéta ) + A precipitációs í v e k távolsága az an;gének betöltéséhez használt vályútól arányos a vizsgált an*gén koncentrációjával. BetöltöM an;gén Elektroforézis Alkalmas a koncentráció meghatározására. [16.] - Növekvő an;gén koncentráció

20 2D Immunelektroforézis Precipitációs ív An;test a gélben Ag2 Ag1 Minta Első fumatás Második fumatás Az első elektroforézis során a mintában található fehérjék méret szerint elválnak. A második fumatásnál a korábban méret szerint szeparált an;géneket belefumatják a poliklonális szérumot tartalmazó gélbe. Precipitációs ívek jönnek létre. A precipitációs ív helyzete a vizsgált an*gén méretével, az ív alaj terület pedig az an*gén koncentrációjával arányos. [17.]

21 Nefelometria, turbidimetria Az oldatban található makromolekulák (pl. immunkomplexek) a molekulatömegükkel arányosan szórják a fényt. Spektrofotométer (turbidimetria) Fényforrás Lencse Detektor (90 -os fényszórás, nefelometria) Szemköz; detektor (nefelometria) Nefelométer s e g í t s é g é v e l a fényszórás alapján azonosítható a vizsgált komplex, turbidimetria esetén pedig a küvemán átjutom fény intenzitásának csökkenését mérik. [18.] Felhasználásuk: Immunkomplexek mérése, pl. össz IgA, IgM, IgG szintek meghatározása, könnyű lánc szint mérése (pl. myeloma mul;plexben)

22 Agglu;náció Ha az an;testek nagyobb par*kulumokat (pl. sejteket, latex gyöngyöket) kötnek keresztbe, azok összecsapzódnak. = agglu*náció (ha vörösvérsejtek csapzódnak össze, akkor hemagglu*náció) Az agglu;náció az an*testek egyik élekani funkciója is, a kórokozók agglu;nációja hátráltatja a fertőzések terjedését. [19.] Lehet direkt vagy indirekt, illetve akev vagy passzív. Számos laboratóriumi teszt agglu;náción alapul, melyek szabad szemmel is láthatók. An;- A IgM Vörösvérsejt Hemagglu;náció Vércsoport A an;génnel meghatározás: A, Rh(D)

23 Az agglu;náció élemani szerepe Epitóp Vírus An;test

24 Direkt vagy indirekt Direkt agglu*náció: Indirekt agglu*náció: IgM Epitópok Baktérium Ugyanaz az an;test képes keresztbe kötni a par;kulumokat. Az IgM izo^pusú an;testekre jellemző. Egy másodlagos an;test kö; keresztbe a részecskéket.

25 Ak^v vagy passzív AkEv agglu*náció: Passzív agglu*náció: IgM Epitópok Baktérium A sejt a saját, sejxelszíni an*génjével vesz részt a reakcióban. Példa: Vércsoport meghatározás Bakteriális sejxelszíni an;gén kimutatása A reakcióban résztvevő hordozó részecskére mesterségesen van rákötve az an*gén. Példa: Latex agglu;nációs tesztek (lásd következő diákon)

26 Az agglu;náció orvosi jelentősége Az an;testek egyik élemani funkciója, a kórokozók elleni védelem része. Bizonyos kórállapotokban (pl. autoimmun haemoly;cus anaemia, AIHA) in vivo is létrejöhet hemagglu;náció. Diagnosz;kai tesztek: Latex agglu*nációs tesztek: Autoimmun kórképek (autoan;testek kimutatása) Fertőzések (kórokozó an;génjét vagy az ellene termelt an;testet mutatják ki) Egyéb fehérjék (pl. CRP, hcg, D-dimer) kimutatása Hemagglu*nációs tesztek: Vércsoport meghatározás Coombs-teszt Hemagglu;nációs assay Hemagglu;náció-gátláson alapuló vizsgálatok: Vírus hemagglu;ninek azonosítása Vírus hemagglu;nineket neutralizáló an;testek tesztelése

27 Felhasználás: Autoimmun kórképek diagnosz*kája, pl.: Rheumatoid arthri;s (rheumatoid faktor, RF [20.] ), SLE (különböző autoan;testek) Fertőző betegségek diagnosz*kája Kórokozó elleni an;testek kimutatása (pl. an;-streptolizin O an;test, ASO/ AST [21.] ) Bakteriális an;gének kimutatása Egyéb fehérjék kimutatása, pl.: C-reakEv protein (CRP, akut fázis fehérje [22.] ), D-dimer [23.] (vérrögképződés jele lehet), humán choriogonadotropin (hcg, terhességben) Latex agglu;nációs teszt Latex gyöngyök felszínére van kötve a reakcióban résztvevő an;gén/an;test. Pozi^v Nega^v Ha a hozzáadom mintában jelen van a vizsgált an;test/an;gén, akkor az a gyöngyök összecsapzódását idézi elő.

28 Terhességi gyorsteszt hcg Pozi^v Vizelet Nega^v A megtermékenyülést követően az embrió által termelt hcg megjelenik a vizeletben. Mobilis enzimjelölt an;-hcg IgG A hcg számos immunológiai módszerrel (ELISA, agglu;náció) kimutatható, a gyorstesztek kromatográfián alapulnak. [24.] KötöM an;-hcg KötöM an;-igg Csík akkor jön létre, ha megkötődik az enzim-jelölt an;test. Ha nincs hcg a vizeletben, akkor ez csak a kontroll esetében következik be és egy csík látható.

29 Agglu;náció gyakorlat Gyakorlat menete: 1. Az asztalokon különböző latex agglu;nációs kitek vannak kihelyezve. 2. Szérumminta nincsen, csak a kithez adom nega^v és pozi^v kontrollt vizsgáljátok. 3. A kit leírása szerint külön karikákba cseppentsetek egy-egy cseppet a nega^v és a pozi^v kontrollból is. 4. Keverjétek össze a mellékelt pálcikákkal vagy döntögessétek. 5. Kis idő elteltével a pozi^v kontrollban szemmel látható agglu;náció megy végbe. HÚZZATOK KESZTYŰT!

30 Direkt Coombs-teszt (DAT [25.] ) Vérvétel + An;-humán immunglobulin an;test Beteg vörösvérsejtjein kóros autoan;testek Hemagglu;náció In vivo hemagglu;náció Felhasználása: Immun-mediált haemolysisek diagnosz;kája, [26.] pl.: AIHA-s betegben. AIHA (autoimmun haemoly;cus anaemia, anaemia=vérszegénység) Erythroblastosis foetalis (Alloimmun magza; haemoly;cus vérszegénység)

31 Indirekt Coombs-teszt (IAT) Recipiens széruma + An;-humán immunglobulin an;test + Donor vörösvérsejtjei Hemagglu;náció Felhasználás: Vérátömlesztések elő an;test szűrés [27.] (ABO és Rh mellem egyéb an;testek jelenlétét keresik a recipiens szérumában.) Terhesgondozás során a placentán átjutó, erythroblastosist okozó Rh(D)-ellenes an;testek szűrése. [28.]

32 Hemagglu;nációs assay 1:20 1:40 1:80 1:160 1:320 1:640 Kontroll Minden résbe ugyannyi vörösvérsejtet helyeznek, majd a mintát sorozatos feles hígításokban adják hozzájuk. PoziEv reakció esetén a vörösvérsejtek összecsapzódnak és nem tudnak lesüllyedni a rés aljára. (HA ;ter: a legkisebb hígítás, ami még agglu;nációt okoz) Hemagglu;náció Nega^v NZB: New Zealand Black egértörzs [29.] (autoimmun állatmodell) BALB/c: albínó házi egér (kontroll)

33 Hemagglu;náció-inhibíciós assay Összetevők Vvt Vírus Vvt Reakció Értékelés Nincs reakció Hemagglu;náció Egyes vírusok olyan fehérjékkel rendelkeznek, melyek segítségével in v i t r o hemagglu;nációt tudnak létrehozni ( hemagglu;ninek ). Pl.: Influenza hemagglu*nin Kanyaró hemagglu;nin Mumpsz hemagglu;nin Vírus An;test Nincs reakció H5 N1 Vvt Az egyes hemagglu;ninek azonosítására használható módszer, gyakorla; jelentősége a vírusok an*gén-szerin* besorolása, [30.] pl.: H5N1 = 5-ös ^pusú hemagglu;nint (és 1-es ^pusú neuraminidázt) hordozó influenza vírus. Védőoltások hatására a hemagglu;ninek ellen termelt ellenanyagok vizsgálata az oltom egyénekben. [30.]

34 Hivatkozások Akobeng AK 1 : Understanding diagnos*c tests 1: sensi*vity, specificity and predic*ve values. Acta Paediatr Mar;96(3): Mancini G, Carbonara AO, Heremans JF: Immunochemical quan*ta*on of an*gens by single radial immunodiffusion. Immunochemistry Sep;2(3): Ouchterlony O: In vitro method for tes*ng the toxin-producing capacity of diphtheria bacteria. Acta Pathol Microbiol Scand. 1948;25(1-2): Tiselius A 1 : Electrophoresis of serum globulin: Electrophore*c analysis of normal and immune sera. Biochem J Sep;31(9): Nobelprize.org: The Nobel Prize in Chemistry 1948 (hmp:// laureates/1948/) 6. Jain S 1, Gautam V, Naseem S: Acute-phase proteins: As diagnos*c tool. J Pharm Bioallied Sci Jan; 3(1): doi: / O'Connell TX 1, Horita TJ, Kasravi B: Understanding and interpre*ng serum protein electrophoresis. Am Fam Physician Jan 1;71(1): Stoller JK 1, Aboussouan LS: Alpha1-an*trypsin deficiency. Lancet Jun 25-Jul 1;365(9478): Link H 1, Huang YM: Oligoclonal bands in mul*ple sclerosis cerebrospinal fluid: an update on methodology and clinical usefulness. J Neuroimmunol Nov;180(1-2): Epub 2006 Sep AbboM NJ 1, Patabendige AA, Dolman DE, Yusof SR, Begley DJ: Structure and func*on of the blood-brain barrier. Neurobiol Dis Jan;37(1): doi: /j.nbd Epub 2009 Aug Marshall T 1, Williams KM: Electrophore*c analysis of Bence Jones proteinuria. Electrophoresis Jun; 20(7):

35 Hivatkozások Csako G 1 : Immunoelectrophoresis: a method with many faces. Methods Mol Biol. 2012;869: doi: / _ Csako G 1 : Immunofixa*on electrophoresis for iden*fica*on of proteins and specific an*bodies. Methods Mol Biol. 2012;869: doi: / _ Rajkumar SV 1, Kyle RA 1 : Protein electrophoresis and immunofixa*on for the diagnosis of monoclonal gammopathies. JAMA Nov 26;312(20): doi: /jama Vincent Rajkumar S 1 : Mul*ple myeloma: 2014 Update on diagnosis, risk-stra*fica*on, and management. Am J Hematol Oct;89(10): doi: /ajh Walker JM 1 : Rocket immunoelectrophoresis. Methods Mol Biol. 1984;1: doi: / : Walker JM 1 : Two-dimensional (crossed) immunoelectrophoresis. Methods Mol Biol. 1988;3: doi: / : Mali B 1, Armbruster D, Serediak E, OMenbreit T: Comparison of immunoturbidimetric and immunonephelometric assays for specific proteins. Clin Biochem Oct;42(15): doi: / j.clinbiochem Epub 2009 Jun Cooper NR, Nemerow GR: The role of an*body and complement in the control of viral infec*ons. J Invest Dermatol Jul;83(1 Suppl):121s-127s. 20. Anuradha V 1, Chopra A: In the era of nephelometry, latex agglu*na*on is s*ll good enough to detect rheumatoid factor. J Rheumatol Dec;32(12): Kodama T 1, Ichiyama S, Morishita Y, Fukatsu T, Shimokata K, Nakashima N: Determina*on of an*- streptolysin O an*body *ter by a new passive agglu*na*on method using sensi*zed toraysphere par*cles. J Clin Microbiol Apr;35(4): Komoriya T 1, Terashima Y, Ogawa M, Moriyama M, Kohno H: Development of a high-sensi*vity latex reagent for the detec*on of C-reac*ve protein. J Immunol Methods Oct 28;373(1-2):63-6. doi: /j.jim Epub 2011 Aug 26.

36 Hivatkozások Froehling DA 1, Elkin PL, Swensen SJ, Heit JA, Pankratz VS, Ryu JH: Sensi*vity and specificity of the semiquan*ta*ve latex agglu*na*on D-dimer assay for the diagnosis of acute pulmonary embolism as defined by computed tomographic angiography. Mayo Clin Proc Feb;79(2): Braunstein GD 1 : The long gesta*on of the modern home pregnancy test. Clin Chem Jan;60(1): doi: /clinchem Epub 2013 Sep Zantek ND 1, Koepsell SA, Tharp DR Jr, Cohn CS: The direct an*globulin test: a cri*cal step in the evalua*on of hemolysis. Am J Hematol Jul;87(7): doi: /ajh Epub 2012 May Barcellini W 1 : Immune Hemolysis: Diagnosis and Treatment Recommenda*ons. Semin Hematol Oct;52(4): doi: /j.seminhematol Epub 2015 May Bri;sh CommiMee for Standards in Haematology 1, Milkins C, Berryman J, Cantwell C, EllioM C, Haggas R, Jones J, Rowley M, Williams M, Win N: Guidelines for pre-transfusion compa*bility procedures in blood transfusion laboratories. Bri*sh CommiKee for Standards in Haematology. Transfus Med Feb; 23(1):3-35. doi: /j x. Epub 2012 Dec Abbey R 1, Dunsmoor-Su R: Cost-benefit analysis of indirect an*globulin screening in Rh(D)-nega*ve women at 28 weeks of gesta*on. Obstet Gynecol May;123(5): doi: /AOG Yoshida S 1, Castles JJ, Gershwin ME: The pathogenesis of autoimmunity in New Zealand mice. Semin ArthriHs Rheum Feb;19(4): Pedersen JC 1 : Hemagglu*na*on-inhibi*on assay for influenza virus subtype iden*fica*on and the detec*on and quan*ta*on of serum an*bodies to influenza virus. Methods Mol Biol. 2014;1161: doi: / _2.