H-8200, Veszprém, Egyetem u. 10., Hungary. H-1111, Budapest, Műegyetem rkp. 3-9., Hungary

Átírás

1 Szilárd-gáz fázisú enzimkatalitikus reakciók Enzymatic reactions in solid-gas phase Csanádi Zsófia 1, Vozik Dávid 1, Gubicza Krisztina 2, Zvjezdana Findrik Blazevic 3, Bélafiné Bakó Katalin 1 1 Pannon Egyetem, Biomérnöki, Membrántechnológiai és Energetikai Kutatóintézet H-8200, Veszprém, Egyetem u. 10., Hungary 2 Budapesti Műszaki és Gazdaságtudományi Egyetem, Vegyészmérnöki és Biomérnöki Kar, H-1111, Budapest, Műegyetem rkp. 3-9., Hungary 3 University of Zagreb, Faculty of Chemical Engineering and Technology, Department of Reaction Engineering and Catalysis, Savska c. 16, Zagreb, Croatia Summary During the last years much attention has been paid to the development of new, environmentally friendly biocatalytic processes. Solid-gas phase biocatalysis offers a clean technology compared to the organic solvent systems and has several advantages over solid-liquid systems: the biocatalyst thermo-denaturation is limited since it is (partially) dehydrated, mass transfer of components is more efficient in gas phase and diffusion limitation is reduced due to the low gas viscosity, production of by-products is reduced or avoided and very high conversion yields can be achieved, products and unconverted substrates can be easily recovered with condensation, therefore the risk of microbial contamination is lower, stability of biocatalyst is higher. Gas-solid phase biocatalytic reactions offer economic and environmentally sound ways to produce ester compounds, which can be used as natural flavour components, and other types of value-added products. In this work the aim was first to construct a solid-gas phase laboratory scale experimental set-up and then to carry out experiments on the continuous esterification of ethyl-acetate from acetic acid and ethanol applying Candida antarctica lipase B enzyme in this bioreactor and to determine the effects of initial substrate composition, applied temperature and amount of used enzyme on the esterification reaction. It was found that there was a well-defined correlation between the yield of the ethyl-acetate product and the temperature and the amount of used enzyme, while the correlation between the initial substrate composition and the product yield could not be described so easily. The activation energy of the esterification was found to be much lower in our system than that of the same enzymatic reaction carried out in other reaction media, such as organic solvent system, ionic liquid, etc. Bevezetés Az utóbbi időben megnövekedett érdeklődés tapasztalható a nem-hagyományos közegben lejátszódó enzimatikus reakciók tanulmányozása iránt, hiszen bebizonyosodott, hogy az enzimek képesek megőrizni aktivitásukat a hagyományos, természetes vizes közegüktől eltérő környezetben is [1]. Nem-konvencionális közegként alkalmazhatóak szerves oldószerek, az egyik szubsztrát feleslegében lejátszódó oldószermentes rendszerek, ionos folyadékok, szuperkritikus állapotú fluidumok, ezek mellett pedig az elmúlt években a szilárd-gáz fázisok határfelületén lejátszódó enzimatikus reakciók vizsgálata is előtérbe került [2]. Az ilyen rendszerekben a biokatalizátor szilárd formában, valamilyen hordozóhoz rögzítetten van jelen, míg a kiindulási anyagok, valamint a keletkező termékek gáz fázisban találhatók meg. Ezáltal a hagyományos reakcióközegekhez viszonyítottan lényegesen előnyösebb anyagátadási viszonyok kialakítása válik lehetővé [3]. A kutatás témája meglehetősen új, ezt jól mutatja a viszonylagosan kis számú rendelkezésre álló szakirodalmi eredmény. A 80-as évek végéről származik az első

2 vizsgálat, melyben szilárd-gáz fázisok határfelületén sikerrel tesztelték enzimek működését [4]. Bebizonyosodott, hogy nyers és tisztított enzimek egyaránt képesek működni ezen reakcióközeg alkalmazása esetén. Hatékonysági oldalról megközelítve az ilyen rendszerekről elmondható, hogy kis üzemi méretükhöz viszonyítottan nagy produktivitással rendelkeznek. Emellett a szilárd-gáz fázisú biokatalízis megvalósításának számos előnye lehetséges összehasonlítva a hagyományos reakcióközegben lejátszódó folyamatokkal szemben. Ezek a következők [5,6,7]: az alkalmazott biokatalizátor hőmérsékletdenaturációja csökkentett, a komponensek áramlása és az anyagátadás sokkal hatékonyabb a gáz fázisban, a diffúziós limitáció következtében a gáz viszkozitása kisebb lesz, magas konverzió elérése válik lehetővé, a keletkező termék(ek) és az át nem alakult szubsztrát(ok) könnyen visszanyerhetővé válnak kondenzáció révén, a biokatalitikus reakciók, illetve biorektorok működtetése során reális hátráltató tényezőként fellépő mikrobiális szennyeződés kockázata alacsonyabb szilárd-gáz fázisban, az alkalmazott biokatalizátor és esetleges ko-faktorainak stabilitása várhatóan magasabb ezen reakcióközeg esetében. A felsorolt előnyök kihasználásának érdekében jelen munkánk során célkitűzésünk volt egy szilárdgáz fázisú enzimes reakciók végrehajtására és vizsgálatára alkalmazható kísérleti berendezés összeállítása és működésének tesztelése. Egy kiválasztott lipázos észterezési reakció nyomon követése mellett célul tűztük ki az optimális működési paraméterek meghatározását, a rendszer működésének tanulmányozását. Anyagok és módszerek Biokatalizátorként Novozym 435 enzimkészítményt, azaz immobilizált Candida antarctica lipáz B-t használtunk (Novozymes). Egyéb felhasznált vegyszerek: ecetsav %), etanol (96%), etil-acetát (Reanal). A minták elemzése gázkromatográf segítségével történt. Az analízist HP 5890A típusú gázkromatográffal, HP-FFAP kolonna és FID detektor segítségével hajtottuk végre. Eredmények Kísérleteink során egy egyedi konstrukciójú, szilárd-gáz fázisú enzimes reakciók kivitelezésére alkalmas kísérleti berendezést állítottunk össze, melyben az alkalmazott enzimet, mint szilárd fázist rögzített formában helyeztük el. A kiindulási szubsztrátokat, illetve a biokatalitikus reakció során keletkező termék(ek)et gőz fázisban érintkeztettük az enzimmel. A kiindulási anyagokat első lépésben elpárologtattuk, majd folyamatos és egyenletes sebességű N 2 -gáz, mint vivőgáz áramoltatása mellett juttattuk a biokatalizátorral töltött reaktorba. Az anyagmérleg nyomonkövetése érdekében az át nem alakult szubsztrátokat és a keletkező terméket kondenzáltattuk. A kísérleti berendezés az 1. ábrán látható. A kialakított rendszer működésének vizsgálata érdekében kiválasztottunk egy lipázos észterezési modell-reakciót, melynek segítségével egyszerűen követhetjük nyomon a berendezés működését: etanol és ecetsav reakciójában etil-acetát keletkezését vizsgáltuk. A folyamat nyomon követésére az egyik szubsztrát, az ecetsav, illetve a keletkező termék, az etil-acetát mennyiségének meghatározását végeztük el gáz, illetve folyadék fázisú minták elemzése révén. Kísérleteink során célunk volt az optimális működési paraméterek megállapítása.

3 elpárologtatásának hőmérsékleténél. Az alkalmazott hőmérséklet a következőképp alakultak: 30 C, 40 C, 50 C, 60 C). A kapott konverzió értékeit a 3. ábrán láthatjuk. 1. ábra: Szilárd- gáz fázisú kísérleti berendezés A vivőgáz áramlási sebességének hatása A vivőgáz áramlási sebessége hatással van a reaktorban kialakuló tartózkodási időre és a produktivitásra, ezért érdemes vizsgálatával foglalkozni. A gáz áramlási sebességét az alábbi értékekre állítottuk be: 2, 3, 4, 5 dm 3 h -1. A kiindulási szubsztrát arány folyadékfázisban 80:20 cm 3 cm -3 volt, mindemellett 11 g enzimkészítményt alkalmaztunk a reaktorban, 50 C hőmérsékleten. A konverzió alakulását a 2. ábrán tüntettük fel. 3. ábra: Az alkalmazott hőmérséklet hatása a konverzióra A kiindulási szubsztrátösszetétel hatása A kiindulási szubsztrátösszetétel esetében fontos megjegyeznünk, hogy a folyadékfázisban, illetve az elpárologtatás után a gőzfázisban tapasztalható szubsztrátösszetétel az eltérő forráspontnak köszönhetően változó. A közöttük lévő összefüggés bemutatására szolgál az 1. táblázat. 1. táblázat: Szubsztrátösszetétel összefüggései 2. ábra: A vivőgáz áramlási sebességének a konverzióra gyakorolt hatása Az alkalmazott hőmérséklet hatása A reaktorban alkalmazott hőmérséklet a lejátszódó reakció sebességére gyakorol hatást. A szilárd biokatalizátor felületén esetlegesen kialakuló kondenzáció elkerülése érdekében értéke nem lehet alacsonyabb a szubsztrátok Szubsztrátösszetétel a folyadékfázisban AcAc:EtOH (cm 3 cm -3 ) Szubsztrátösszetétel a gázfázisban EtOH:AcAc (g g -1 ) 80:20 2,0 ± 0,04 75:25 3,5 ± 0,05 65:35 1,0 ± 0,03 50:50 0,9 ± 0,05 25:75 0,2 ± 0,06 A kapott eredmények a 4. ábrán láthatóak. A kiindulási szubsztrátarány értékei a folyadékfázisban kialakított értékeket jelölik.

4 4. ábra: Kiindulási szubsztrátarány hatása Az aktiválási energia meghatározása Kísérleteink során meghatároztuk a vizsgált rendszerben mérhető aktiválási energia értékét, melyet összehasonlítva korábbi, egyéb nemkonvencionális közegekben szintén lipázos észeterzési folyamat során megállapított aktiválási energia értékeivel, lényegesen jobb eredményt tapasztaltunk (2. táblázat). 2. táblázat: Az aktiválási energia értékének alakulása eltérő reakcióközegek alkalmazása esetén Reakcióközeg Aktiválási energia (kj mol -1 ) szilárd-gáz fázis 9,2 [bmim][pf 6 ] típusú ionos folyadék [8] 21,7 n-hexán [9] 30,6 oldószermentes közeg [9] 52,9 vizsgáltuk a kiindulási szubsztrát összetételének, az alkalmazott hőmérsékletnek és a vivőgáz áramlási sebességének hatását a reakció során kialakuló konverzióra. A megállapított optimális paraméterek a következők voltak: 2 dm 3 h -1 N 2 vivőgáz áramlási sebesség, 50 C hőmérséklet, 75:25 ml ml -1 kiindulási szubsztrátarány. Emellett meghatároztuk a reakció aktiválási energiáját, melynek értéke 9,2 kj mol -1 értéknek adódott. Ez lényegesen alacsonyabb érték az egyéb reakcióközegekben tapasztalt értéknél. További terveink között szerepel a reaktor konstrukciójának átalakítása a kedvezőbb fázisérintkeztetés érdekében, illetve egyéb, illékony aromakomponensek előállításának vizsgálata szilárgáz fázisú enzimes észterezési reakciók során. Köszönetnyilvánítás A kutatómunkát a TÁMOP /1/ azonosító számú Élhetőbb környezet, egészségesebb ember Bioinnováció és zöld technológiák kutatása a Pannon Egyetemen című pályázat Az ionos folyadékok, mint zöld oldószerek alkalmazása biokatalitikus átalakításokban és szeparációkban című alprojekt és a HR-26/2008 számú horvát-magyar TéT pályázat támogatásával végeztük. Összefoglalás Munkánk során ecetsav és etanol észterezési reakciójában kialakuló etil-acetát előállítását, az alkalmazott paraméterek hatásait vizsgáltuk egy saját konstrukciójú szilárd-gáz fázisú enzimes reakciók kivitelezésére alkalmazható bioreaktorban. Az alkalmazott enzimkészítmény egy kereskedelmi forgalomból származó Candida antarctica lipáz B (NOVOZYM 435) termék volt. Kísérleteinkben Irodalomjegyzék [1] Kilbanov, A.M.: Enzymes that work in organic solvents. Chemtech, 16, (1986) [2] Vermue, M.H., Tramper, J.: Biocatalysis in non-conventional media: medium engineering aspects. Pure Appl. Chem., 67, (1995)

5 [3] Cantone, S., Hanefeld, U., Basso, A.: Biocatalysis in non-conventional media-ionic liquids, supercritical fluids and the gas. Green Chem., 9, (2007) [4] Barzana, E., Klibanov, A.M., Karel, M.: Enzyme catalyzed, gas phase reactions. Appl. Biochem. Biotechnol., 15, (1987) [5] Lamare, S., Legoy, M.D.: Working at controlled water activity in a continuous process-the gas-solid system as a production. Biotechnol. Bioeng. 45, (1995) [6] Leonard, V., Lamare, S., Legoy, M.D., Graber, M.: Enantioselective acylation of R-2- pentanol in a solid/gas reactor catalysed by lipase B from Candida antarctica. J. Mol. Catal. B: Enzym. 32, (2004) [7] Letisse, F., Lamare, S., Legoy, M.D., Graber, M.: Solid/gas biocatalysis: an appropriate tool to study the influence of organic components on kinetics of lipase-catalyzed alcoholysis. Biochim. Biophys. Acta, Proteins Proteomics. 1652, (2003) [8] Gubicza, L., Belafi-Bako, K., Feher, E., Frater, T.: Waste-free process for continuous flow enzymatic esterification using a double pervaporation system. Green Chem. 10, (2008) [9] Belafi-Bako, K., Badr, A.K., Nemestothy, N., Ehrenstein, U., Gubicza, L.: Kinetics of ethyl acetate formation by lipase in organic solvent and solvent-free system. Chem. Pap. 57, (2003)