Hordozóra felvitt lipid kettısréteg vizsgálata OWLS módszerrel

Átírás

1 Tudományos Diákköri Dolgozat KOBZI BALÁZS Hordozóra felvitt lipid kettısréteg vizsgálata OWLS módszerrel Prof. Kiss Éva ELTE TTK Fizikai Kémiai Tanszék Dr. Horváth Róbert MFA Kutatóintézet Fotonika Osztály Eötvös Loránd Tudományegyetem Természettudományi Kar Budapest, 2011

2 Tartalomjegyzék Bevezetés... 3 Célkitőzés... 5 Irodalmi áttekintés... 6 Kvarckristály mikromérleg QCM... 6 Ellipszometria... 7 Felületi plazmon rezonancia SPR... 9 Optikai hullámvezetı spektroszkópia OWLS Lipid kettısréteg A szilárd felület hatása A széthasadás folyamata Az elektrolit koncentráció hatása Pozitív töltéső ionok hatása (egyszeresen és kétszeresen töltött fém ionok) A ph és a koncentráció hatása A liposzóma méretétıl való függés A hımérséklet hatása Kísérleti rész Felhasznált anyagok Mintaelıkészítés OWLS szenzor tisztítása Liposzómák elıállítása Vizsgálati módszerek Eredmények és kiértékelésük POPC liposzóma kiterülésének vizsgálata az OWLS szenzoron POPC lipid kettısréteg kölcsönhatása a hidrofóbizált PEI molekulákkal Összefoglalás Köszönetnyilvánítás Rövidítésjegyzék Hivatkozásjegyzék

3 Bevezetés A mai modern biokémiai kutatásokban egyre nagyobb szerepet kap a modellezés, melyben a vizsgált biológiai rendszer csak bizonyos elemeit használják fel. Ennek a célja az eredmények jobb átláthatósága és az egyéb zavaró hatások kiküszöbölése. Egy sejtfalat jól reprezentál az azt felépítı lipid membránja. Egy ilyen lipid membránon jól követhetıek a külsı ı körülmények változásai által kiváltott hatások. Emiatt élénk érdeklıdés dés követi a lipid membránok kialakításához, a sejtfal modellezéséhez használható módszereket. A lipid membrán egy kettısréteg, amelyben a lipid molekulák rendezett sorokban helyezkednek el egymás mellett. 1. ábra A lipid molekulákat hidrofil Lipid kettısréteg illusztrációja [1] fejcsoport és hosszú hidrofób szénláncok alkotják. Mivel, mint a fejcsoport hidratációja sokkal kedvezményezettebb, mint a hidrofób láncoké, a lipid molekulák igyekeznek olyan struktúrákat felvenni, melyben a hidrofób láncok a lehetı kisebb felületen érintkeznek a vízmolekulákkal. Ilyen szerkezetek például a micellák is. Apoláris közegben fordított eset áll fent, ilyenkor inverz micellák képzıdnek, ahol a fejcsoportok vannak rejtve az oldószer molekulák elıl. Monorétegek is kialakulhatnak, amikor a vizes közeg felszínén a lipid molekulák egymás mellett felsorakozva egyenletes filmet hoznak létre, úgy hogy a fejcsoportukkal a közeg felé orientálódnak (Langmuir-filmek). Fontos megjegyezni, hogy ezek a szerkezetek a körülményekhez igazodva önrendezıdve, külsı beavatkozások nélkül alakulnak ki a molekulákból. Két lipid monoréteget a hidrofób részükkel egymás felé fordítva megkaphatjuk a sejtmembránt alkotó kettısréteget (1. ábra). Ez a réteg így már kívülrıl l hidrofil tulajdonságokat mutat, belül pedig a hidrofób láncok miatt apoláris jellegő. A sejtfalat specifikusan foszfolipidek (foszfogliceridek) alkotják, melyek legtöbbje a foszfatidinsav származéka. A foszfatidinsavban egy foszforsav és két zsírsav észteresít egy 3

4 glicerin molekulát. Ehhez kapcsolódó csoportok határozzák meg a foszfolipidet, az élıvilágban széles körben elterjedt a kefalin és a lecitin, melyek az állati sejtek membránjának fı alkotórészei. 2. ábra Egy foszfolipid fejcsoportja és hidrofób láncai [2] A lipid kettısrétegek kulcsfontosságú szerepet játszanak a sejtfal mőködésében. Mivel kiválóan alkalmas annak modellezésére, ezért kialakításának módszere széles körben kutatott téma. Ezeket a rétegeket általában egy hordozóra, egy szilárd felületre fektetik ki, melyen a lipid film helyhez kötött lesz. Ilyen formában több vizsgálat lehetıvé válik. A hordozó javarészt üveg, márvány, fém-oxid, ritkábban arany szokott lenni. Hordozóra felvitt kettısréteg kialakításához a legelterjedtebb eljárás a liposzómák adszorpciója, majd azok kiterülése a felületre. A foszfolipidekbıl geometriájukból adódóan vizes közegben gömbbé záródott lipid kettısrétegeket, liposzómákat lehet képezni. Ezek a liposzómák lehetnek többfalúak, amikor több kettısréteg egymásba hagymahéjszerően be van ágyazva. Rövidítésük MLV (multilamellar vesicle) a többrétegő vezikula elnevezésbıl adódik. A hordozón viszont csak az egyfalú vezikulák (SUV small unilamellar vesicle) képzenek megfelelıen homogén kettıs réteget (3. ábra). Liposzómák elıállítása egyszerő, és a kihasadás is mostanra már egy gyakorlatban rendszeresen alkalmazott és reprodukálható módszer. Ugyanakkor maga a mechanizmusa és kinetikája még nem teljesen tisztázott. 3. ábra Liposzóma kiterülése szilárd hordozón [3] 4

5 Célkitőzés A dolgozatom a lipid kettısrétegek kialakításával és mérésével foglalkozik. Ehhez olyan mérési módszert választottam, amelyben egy lézerfény segítségével a folyadék/szilárd határfelületen történı változások nagy pontossággal végigkövethetıek. Az optikai hullámvezetı spektroszkópiában (OWLS) a hullámvezetı szenzor szolgáltatja a mérıeszközt, illetve a lipid kettısréteg hordozójaként is funkcionál [4,5]. A technika a hullámvezetı felületére folyadékfázisból kialakuló molekuláris réteg vastagságáról, illetve törésmutatójáról ad információt. Fontos jellemzıje ennek az optikai módszernek nagy érzékenysége valamint, hogy nem szükséges semmiféle idegen anyag, jelölıszer (mint pl. a fluoreszcens méréseknél) a detektáláshoz. A módszer általánosságban homogén és izotróp törésmutatójú filmek vizsgálatára használatos. Az általam vizsgált rendszer, a lipid kettısréteg anizotróp volta miatt a mérések értékelése nehézségekbe ütközik. Célom egy olyan modell használata a kettısrétegekkel végzett mérésék kiértékelésére, amely figyelembe veszi a lipid kettısréteg anizotrópiáját, és így reális eredményt szolgáltat a rétegvastagságok változására. Az anizotrópia mértékét megismerve rendkívül értékes információhoz juthatok. A lipid kettısrétegnek anizotrópiát detektálva szerkezetbeli változásokra, kölcsönhatásokra következtethetek. Lehetıség nyílik arra, hogy ha a lipid réteg más anyaggal érintkezik, eldönthetı legyen, hogy az milyen változásokat idéz elı a membránban. Az anizotrópia meghatározásával a lipid membránban az anyag kicserélıdése is megfigyelhetı. Ezek a folyamatok más módszerekkel nehezen, költségesen és gyakran csak segédanyagok, jelzımolekulák alkalmazásával tanulmányozhatók. Munkámban az anizotrópiát figyelembe vevı modell alkalmazását lipid kettısréteg vizsgálatán mutatom be az OWLS technikában. Tanulmányozom továbbá, milyen kölcsönhatás alakul ki a lipid kettısréteg és antibakteriális polimer molekulák között. 5

6 Irodalmi áttekintés Felületekre felvitt bevonatok, filmek vastagságának mérésére több mérési módszer fejlıdött ki az évek során, amelyek a nanométeres tartományban (néhány nm-es rétegek) is jól használhatóak. Ezek közül több is alkalmas arra, hogy segítségükkel meghatározzuk e filmek idıbeli változását. A lipid kettısréteg kialakulásának végigkövetésére alkalmas módszerek kevésbé ismertek. Ezek közül bemutatok pár technikát és pontosságukat, használhatóságukat összehasonlítom az általam alkalmazott mérıeszközével. Kvarckristály mikromérleg QCM A QCM módszer a kvarckristály piezoelektromos tulajdonságát használja ki [6]. A piezoelektromosság lényege, hogy bizonyos kristályok esetén (pl.: kvarc, nádcukor) nyomás, mechanikai feszültség hatására a kristályban elektromos tér indukálódik. Az összenyomás mértékével és irányával szabályozható az elektromos tér, illetve a feszültség nagysága. Ennek a jelenségnek a fordítottja is kivitelezhetı (elektrostrikció), melyben a kristályt elektromos térbe helyezve az deformációt szenved. Váltófeszültséget alkalmazva a kristály deformációja is periodikusan fog változni, így kialakul egy rezgı mozgás. A rezgı mozgás frekvenciája függ a kristály tulajdonságaitól (tömegétıl). Ezt a jelenséget használják ki a QCM-ben érzékeny tömegmérésre. Egy piezoelektromos kristály lapkát alkalmaznak, amelyet rezgésbe hoznak váltófeszültséggel és a rezgés frekvencia változását mérve következtethetünk a kristály felületi rétegvastagság változására. A következı egyenlet (Sauerbrey egyenlet) alapján megadható a frekvenciaváltozás és a tömegváltozás közötti összefüggés, ahol a rezgés módusszáma, pedig a kristály lapkára jellemzı konstans: Mérve a frekvencia változását az idı függvényében rendkívül pontos képet kaphatunk a felületen adszorbeálódott rétegek mennyiségérıl. Ehhez a méréshez kvarckristályból alakítanak ki érzékelı chipeket, melyek felületét viszonylag könnyedén lehet módosítani az 1 6

7 adott méréshez. A módszer pontossága 2. A fenti egyenlet (1) nem minden esetben adja meg egzaktul a tömeget, mivel ez csak merev rétegekre igaz, ha a méréskor a kristály légtérben van. Általában ez nem teljesül, a rétegeket folyadékáramban viszik fel a felületre, továbbá e rétegek nem mindig szilárdak, ahogyan a lipid kettısréteg sem. Ilyen esetekben a tömeget alulbecsüli a módszer. A frekvenciaváltozás mellett mérhetjük az ún. disszipáció mennyiséget is, amely a réteg szerkezetérıl ad egy további információt. Ha a rezgést gerjesztı feszültséget megszüntetjük, akkor a kristály egy csillapított harmonikus oszcillátorként fog viselkedni. Az amplitúdó (A) idıbeli változása a következıképpen adható meg: / sin 2 2 ahol a csillapítási együttható, az oszcillátor fázisszöge és a rezgés maximális kitérése. A disszipáció (D) pedig annak a mértéke, hogy a chip milyen gyorsan válaszol a feszültség megszüntetésére, vagyis milyen mértékő az amplitúdó lecsengés: 1 3 Ha az adszorbeált réteg nem túl merev és kis sőrőségő, akkor a rezgés gyorsan lecseng, így a disszipáció nagy lesz. Ha pedig a réteg sőrő, merev, akkor a disszipáció kicsi. Ugyanakkor, függetlenül a szerkezettıl, a réteg vastagság növekedésével a disszipáció is nıni fog. A QCM-es mérésekkel felületi sőrőséget (egységnyi felületen adszorbeált tömeget) kapunk eredménynek, vastagságot az anyag tulajdonságait ismerve tudunk ebbıl számolni. A módszerrel nagyon sok lipid kettısréteg kiterülést vizsgáltak már, és a mai napig elıszeretettel használják erre a technikát. Ellipszometria A technikával a mérendı film vastagságát igen pontosan, roncsolás mentesen lehet mérni [6]. A mintát lineárisan polarizált fénnyel világítják meg, melynek egy része visszaverıdést szenved, másik része pedig belehatol a filmrétegbe, majd visszaverıdéssel távozik a filmbıl. További többszöri visszaverıdés is elıfordulhat (4. ábra). A lineárisan polarizált fénynek a 7

8 mintával való kölcsönhatása során megváltozik a polarizációja, és így a teljes visszaverıdött sugár már elliptikusan polarizált lesz. A polarizációt a fény elektromos térerısség vektor iránya határozza meg. A vektor komponensei, közül a terjedési irányra merıleges síkban lévık fognak benne szerepet játszani (a terjedés irányába mutató komponens 0 hiszen a fény transzverzális hullám). 4. ábra A fény terjedése a szubsztráton (hordozón) lévı filmben [7] p-irány s-irány Elliptikusan polarizált Lineárisan polarizált 5. ábra A fény polarizációja a minta visszaverıdése elıtt és után [8] Ahol, a komponensek amplitúdói, k a hullámszámvektor, r a hely, t az idı, a fény körfrekvenciája, és pedig a komponensek fázisszögei. A fény polarizációs állapota megadható a két térerısség komponens hányadosával az ún. polarizációs együtthatóval:. Felírható a polarizációs együttható külön a beérkezı fénysugárra és a mintáról visszavertre is (5. ábrán látható jelölésekkel). 8

9 Így az ellipszometria alapegyenlete a következı: Ψ 5 ahol a beesı illetve a visszavert fénysugár fáziskülönbsége. A és mérésével számítógépes modell segítségével kiszámolható a film vastagsága és törésmutatója. A mérés 0,2 pontosságú adatokat tud szolgáltatni a vastagságról. Fontos megjegyezni, hogy csak jól definiált, optikailag homogén, azaz izotróp filmekrıl kaphatunk ilyen módszerrel a megadott pontosságú adatokat. Felületi plazmon rezonancia SPR Ezzel a technikával is lehetséges a felületre kötıdı vékony réteg vastagságának és törésmutatójának meghatározása [6]. A módszer lényege, hogy egy lézerfényt egy nagyobb törésmutatójú közegbıl (n 1 ) egy kisebb törésmutatójú közeg (n 2 ) felé irányítva totális reflexió jön létre, ha a beesési szög nagyobb a határszögnél. A határszög (. ) a következı egyenlet segítségével számolható ki:. arcsin 6 6. ábra SPR módszer vázlatos ábrázolása [9] A 6. ábrán látható a felépítése, ahol is a nagyobb törésmutatójú közeget egy prizma szolgáltatja, melyet egy vékony fém réteg választ el a vizes (n 2 ) közegtıl. A lézerfény a határszög felett behatol ebbe a vékony rétegbe evanescens hullámot létrehozva a behatolási mélység kb. 100 nm. Az evanescens hullámok a fémben ún. plazmon rezgéseket gerjesztenek. A beesı fénysugár szögétıl függ az evanescens hullámok intenzitása, ahol ez maximális, azt nevezik felületi plazmon rezonancia szögének. Mivel ezek a rezgések a felületen 9

10 terjednek, így rendkívül érzékenyek annak változására, a felületen képzıdı réteg vastagságára, illetve törésmutatójára: ü 7 ahol c 1 és c 2 konstansok, ü felületen kialakult réteg törésmutató változása, vastagság változása. Az egyenletbıl jól látszik, hogy a két hatás együttesen változtatja meg a értékét. Ezért ahhoz, hogy külön megmondható legyen a vastagság változása és a törésmutatóé, egyéb támogató méréseket kell alkalmazni. Ezzel a mérési technikával is, ahogyan a QCM-mel is lehetséges a felületi változásokat mérni az idı függvényében. A mérés pontossága nagyban függ attól, hogy milyen független mérésekkel tudják meghatározni a mérni kívánt film törésmutatóját illetve vastagságát. A fehérjékre például 10 az elérhetı pontosság. Optikai hullámvezetı spektroszkópia OWLS A vizsgálataimat ún. OWLS módszerrel végeztem, melynek neve az Optical Waveguide Lightmode Spectroscopy rövidítésébıl ered [4,5,10]. Az optikai hullámvezetı spektroszkóp lelkét egy chip alkotja, mely egy integrált optikai szenzorként mőködik. Ez a szenzor egy üveghordozóra felvitt vékony, nagy törésmutatójú SiO 2 -TiO 2 keverékébıl álló hullámvezetı réteg, melyben egy optikai rácsot alakítottak ki. Ezt lézerfénnyel megvilágítva gerjesztıdnek a hullámvezetı módusai, és a fény becsatolódik ebbe a rétegbe. Ez a becsatolódás csak két jól meghatározott szög alatt történik meg. Ha a felületen bárminemő törésmutató változás történik, egy anyag adszorbeálódik vagy eltávozik, a rezonancia szög megváltozik. Ezt a változást végigkövetve, a módszer lehetıséget nyújt adszorpciós 7. ábra Hullámvezetıben terjedı fény ábrázolása, a közegek rövidítésének jelölései [11] 10

11 folyamatok nagy részletességő vizsgálatára. A technika érzékenysége 1. Mint azt az SPR-es technikánál is láthattuk, a beesési szögnek a határszögnél nagyobbnak kellett lennie, hogy az evanescens hullámok kialakuljanak. A teljes visszaverıdésben haladó fény elıállítását itt az optikai rács segíti elı, mellyel a diffraktált fény terjed a hullámvezetıben (7. ábra). A rétegben kialakuló hullámok csak a hullámvezetı tulajdonságai által megszabott módusokban tudnak terjedni. A módusok egyértelmően jellemezhetıek az ún. effektív törésmutatóval (N), amely a fény vákuumban és a hullámvetıben mért fázissebességének a hányadosa. Felírhatjuk ezt a hullámszámvektorral (k) is: 8 ahol a hullám terjedési irányába mutató hullámszámvektor komponense, a lézerfény hullámhossza, az optikai rács rácsállandója, a levegı törésmutatója, a becsatolás szöge (7. ábrán a jelölés) és pedig a becsatolódott diffrakciós rend. Ezek a szenzorok egymódusúak, ami azt jelenti, hogy a hullámvezetıben kizárólag a legalacsonyabb rendő módus tud terjedni. Ezt az egy módust (m = 0) általában egy diffrakciós rend gerjeszti, az pedig az 1, ezen belül a fény két féle polarizációjú állapotban lehet: TE illetve TM módus. A TE módus az ún. transzverzális elektromos, ahol az vektor merıleges a beesési síkra, illetve a TM módus az ún. transzverzális mágneses, ahol pedig az párhuzamos a beesési síkkal. A becsatolt fény intenzitását a szenzor két széléhez közel elhelyezett fotodetektorral mérjük. Mind a két módust mérve két független, a rétegre jellemzı tulajdonságot számolhatunk ki. A TE és TM hullámok eltérnek az effektív törésmutatójukban is: 9 A Maxwell-egyenletek segítségével megkapható egy összefüggés a törésmutatók között, amikor a chipen még nincs adszorbeálódott anyag. Ezt nevezik háromréteges hullámvezetı módusegyeneletnek, melyben a szubsztrát (üveghordozó), a hullámvezetı és az e felett levı közeg adja a három réteget. arctan 10 11

12 Az egyenletben a a hullámvezetı vastagsága, a a hullámvezetı törésmutatója, a a közegé és az pedig az üveghordozóé. A jelöli a két különbözı polarizáltságú módus közötti különbséget, TE-re 0, a TM-re pedig 1 az értéke. Ahhoz, hogy adszorpciót tudjunk mérni, az anyagot rá kell juttatnunk a szenzor felületére. Ezt leginkább folyadék lassú áramoltatásával érik el a chip felett. A chip felszínére egy gumigyőrő segítségével egy küvettát erısítenek. A küvetta egyik nyílásán az anyagot tartalmazó folyadékot bejuttatják, a másik nyílásán pedig a felesleg távozik. Ebben az esetben a közeg ( ) törésmutatója a folyadék törésmutatójával fog megegyezni. Az adszorbeálódott réteggel együtt már négy rétegünk van, erre az esetre levezethetı a négyréteges hullámvezetı linearizált módusegyenelte feltéve, hogy a film vékony : arctan 1 1 arctan 11 ahol az adszorbeálódott réteg vastagsága és pedig a törésmutatója. A két külön módusra felírva az egyenletet ismerve,,, értékét megadható és. Ha a felületegységenkénti adszorbeált tömeget szeretnék meghatározni, azt a következı összefüggés alapján tehetjük: 12 ahol az adszorbeált anyag törésmutató inkrementuma, ami a törésmutató változás mértékét adja meg egységnyi koncentráció változására. A mérési módszer sok esetben nagyon pontos eredményeket tud produkálni, viszont a mögötte húzódó elmélet csak vékony és izotróp rétegekre jó közelítés. A kísérleteimben viszont a lipid kettısréteg nem izotróp réteg, ezért alkalmaztam egy anizotróp filmekre kidolgozott modellt. A és jelölésekben a hullámvonal azt jelzi, hogy ezek az izotróp réteget feltételezı modellbıl adódó értékek. Az Eredmények és kiértékelésük 12

13 fejezetben az anizotróp modell részletes kifejtése, valamint a kétféle modellbıl kapott értékek összehasonlítása is megtalálható. Lipid kettısréteg Ahhoz, hogy a bioszenzor felületére egy lipid kettısréteg vigyek fel, egy már jól bevált módszert alkalmaztam. A felhasznált lipidbıl megfelelı eljárással liposzómákat készítettem egy meghatározott összetételő sóoldatban. Ezt rávezetve a bioszenzor felületére a liposzóma széthasad és kiterül, lipid kettısréteget képezve. Maga a lipid kettısréteg két fázisban lehet jelen a hordozó felületén. A hımérséklettıl függıen gél fázisról és folyadékkristályos fázisról lehet beszélni. A két fázis közötti átmenet hımérsékletét megadja a lipid olvadáspontja. A gél fázisban egy tömörebb, kevésbé mozgékony kettısréteg alakul ki, melyben a lipid molekulák csak forgásra képesek. Az olvadáspont felett, a folyadékkristályos állapotban a réteg lazább szerkezető, mobilisabb [12]. Ez az ún. fázisátalakulási hımérséklet jellemzı a lipidre, és az élı szervezetben betöltött funkciójára. A modell lipid kettısrétegeket célszerő a folyadékkristályos fázisból kialakítani, hiszen ebben az állapotában a liposzóma felhasadása végbe tud menni [13]. A hordozó és az azon kialakított kettısréteg között a fejcsoportok hidrofilitása miatt mindig lesz egy vékony víz réteg, ami hidratálja azokat. Ezt a hidrát-réteget vékonyítani lehet a felület és a lipid réteg közötti kölcsönhatás növelésével [14]. Az irodalomban közölt mérések nagy részét POPC (1-palmitoil-2-oleoil-foszfatidil-kolin) lipiddel végzik a -2 C-os fázisátalakulási hımérséklete miatt [15]. Így nem szükséges a liposzóma kiterülésnél melegíteni a rendszert, hiszen a szobahımérséklet jóval a fázisátalakulási hımérséklet felett van. A folyamatnak, melyben a liposzóma oldatot egy felület felett áramoltatjuk, és a benne lévı liposzómák a felülettel érintkezve kihasadnak és adszorbeálódnak, több feltétele és befolyásoló tényezıje van. Ezeket végignézve teljesebb képet lehet kapni a kiterülés folyamatáról és ebbıl kiválaszthatóak a legmegfelelıbb körülmények a saját méréseimhez. Az alábbiakban ismertetem bizonyos paraméterek hatását. 13

14 A szilárd felület hatása A felület anyagi minısége kulcsfontosságú a kiterülés szempontjából. Egy korai Kvarckristály mikromérleges mérésekrıl szóló tanulmányban tojáslecitin liposzómákat használtak (10 mm Tris, 100 mm NaCl, ph = 8) három különbözı felületen [16]. Az elsı egy alkil-tiolos arany felület volt, mely erısen hidrofób jellegő, emiatt a liposzómákból csak egy monoréteg adszorbeálódott az alkil csoportokra. alkil-tiolos arany SiO 2 oxidált arany disszipáció (10-6 ) frekvencia (Hz) idı (s) idı (s) idı (s) 8. ábra Különbözı felületre kapott eredmények liposzóma használatával [16] A SiO 2 felületen megtörtént a liposzóma adszorpció majd a széthasadás és a kettısréteg képzıdés is. Ez a folyamat jól követhetı a QCM technikával mind a frekvencia, mind a disszipáció változásban. A frekvencia-idı függvényében látható gödör legalacsonyabb pontjáig az adszorpció történik, majd utána megkezdıdik a széthasadás, és a végleges kettısréteg kialakulására beáll egy konstans értékre. A disszipációban látható változás is a liposzóma adszorpcióját majd széthasadását mutatja. 14

15 Utolsóként pedig egy oxidált arany felületet használtak, melyen a liposzóma adszorpció megtörténik, de a kiterülés nem. Ezt jól alátámasztja a disszipációban bekövetkezett változás is, amely itt nem áll vissza az eredeti értékre. Ez arra utal, hogy egy vastagabb, lazább réteg képzıdött [16]. Több más tanulmányban hasonló eredményeket kaptak a SiO 2 felületre, így arról kijelenthetı, hogy kedvezı a lipid kettısrétegek kialakulása számára [16, 17]. Ezzel szemben a TiO 2 felületen hasonlóan a fent említett oxidált Au-hoz, a liposzómák adszorbeálódnak ugyan, de nem történik meg a széthasadás [17]. A TiO 2 viselkedése fontos, mivel az általam használt OWLS technikában a hullámvezetı anyaga nagy részben TiO 2. A felület anyagi minısége és a kiterülés kinetikájának kapcsolatára ugyan vannak meggyızı és részletes elemzések, de eddig teljes mértékben nem tudták megmagyarázni az okait, leírni elméletét. A kiterülést legfıképpen az intermolekuláris erık közül az elektrosztatikus vonzás és a hidrogénkötés befolyásolja. 9. ábra Számolt termodinamikai adatok különbözı felületeken való adszorpcióra az egyes ionok esetén (ionsugár függvényében); fontosabb felületek: - kvarc, 〇 - TiO 2 (rutil), - amorf SiO 2, - Al 2 O 3 (korund) [18] A fém-oxidok esetén a lipid hidrofil fejcsoportja a felületen levı szabad OH csoportokkal tud kölcsönhatásba lépni. Ez esetben hidrogénkötés jöhet létre, amelyhez a fejcsoportban a P=O rész adhatja a nagy elektronegativitású oxigént, mivel a foszfolipid 15

16 molekulának a kolin részét képezı N(CH 3 ) + 4 hidrogénkötésre [18]. kvaterner amin csoport nem képes A ph-tól függıen a felületi szabad OH csoportok O - formája is megjelenik, nagy ph értékeknél ez lesz túlnyomó többségben. Ebben az esetben viszont az elektrosztatikus erık játszhatnak nagyobb szerepet az adszorpcióban. A tanulmányban szereplı modellt említve általánosan felírhatjuk egy pozitív ion adszorpcióját a negatív töltéső oxid felületen: 13 ahol egy tetszıleges ion. Több ionra megvizsgálva felállítható egy affinitási sorrend, amely igaz Al 2 O 3 -ra (korund) és TiO 2 -ra (rutil), kvarcra és amorf SiO 2 -ra pedig a fordított sorrend áll fenn: Az adszorpció szabadentalpia változását megvizsgálva az összes oxidra exoterm a reakció, túlnyomórészt entalpia kedvezményezett. Az entrópia változás - az amorf SiO 2 -t kivéve mindig negatív elıjelő [18] (9. ábra). Ezen adatok alapján a TiO 2 termodinamikai szempontból a legkedvezıbb a fontosabb oxidok között, viszont a tapasztalatok nem ezt mutatják, így valószínősíthetı, hogy más effektusok játszanak szerepet az adszorpció hajtóerejében. Ha a rendszerben -ok is jelen vannak, akkor versengés alakul ki a és között az adszorpcióban. Viszont a pozitív ionok jelenlétének egy másik hatása, hogy a felület és a lipid molekulában lévı negatív töltéső foszfatidinsav rész közötti taszítását kompenzálja [14]. Ez is arra mutat, hogy az adszorpció igen komplex folyamat. 16

17 A széthasadás folyamata Egy közleményben arról számoltak be, hogy számítógépes szimulációval modellezhetı az adszorpció utáni liposzóma felhasadás és kiterülés kinetikája [19]. Apró frakciókra gyöngyökre felbontható a liposzóma fala, és így végigkövethetı e gyöngyök orientációja és helyzete a felhasadás során. A hımozgás következtében a gyöngyök folyamatos, véletlenszerő mozgásban vannak, ez persze nem befolyásolja a globális, a liposzóma tömegközéppontjára vonatkozó mozgást. Az adszorpció után e véletlenszerő kitérések között lesz egy olyan, mely a két részecske (gyöngy) közötti távolságot annyira megnöveli, hogy az elér egy kritikus pontot, melynél a közöttük lévı vonzóerı már nem lesz elég ahhoz, hogy összetartsa azokat (elindul egy irreverzibilis folyamat). Az így a keletkezı lyuk elkezd tágulni, majd végül a liposzóma felszakad. Ebben a szimulációban, csak azt az esetet vizsgálják részletesen, melynél a liposzóma a felület azon pontján hasad fel, amely szomszédságában már van egy lipid kettısréteg darabka kiterülve. Azt az esetet, ami egyetlen liposzóma kiterülése egy tiszta felület részen játszódik le, elenyészıen kicsinek találja (11. ábra). Ez a kinetika eddig még nem lett tisztázva. Az viszont elmondható, hogy ez a már jelen levı lipid kettısréteg darabka fontos szerepet játszik a további liposzómák kiterülésében [19]. A paramétereket POPC liposzómákhoz és SiO 2 felülethez igazították. A felhasadásnak a valószínőségét ábrázolja egy bizonyos hımérsékleti tartományban (11. ábra), amely 271 K 315 K-ig terjed. Ez k B T-ben kifejezve, ha k B T = 1 egységet vesszük 300 K-en: 0,90 1,05 lesz. A felhasadás valószínősége a következı alakban írható fel: 1 exp ábra A modellben a gyöngyöknek megfelelı lipid kettısréteg darabkák [19] ahol aktiválási energai, a fent említett 315 K és a a maximális felhasadási valószínőség, amely a szimulációból kijöhetett [19]. A POPC rendszert különbözı liposzóma átmérıkre vizsgálva hasonló eredményeket kaptak. Így megállapítató, hogy a mérettıl nem függ a kiterülés valószínősége. A 11. ábrán a hımérséklet függvényében látható a 17

18 valószínőség változása, a két függıleges sáv között található a biológiai szempontból is fontos tartomány. A csillaggal ( ) jelölt görbe pedig azt az esetet mutatja be, melynél nincs az adszorbeált liposzóma szomszédságában lipid kettısréteg. Látható hogy ez ténylegesen 0 közeli érték. 11. ábra Felszakadás valószínősége a hımérséklet függvényében. A liposzóma átmérık 30, 40, 50 és 60 gyöngybıl álló rendszerre 50, 65, 80 és 95 nm-nek felelnek meg [19]. Variálva a szimulációban definiált egyik paramétert az -t a liposzóma méretét 65 nmen tartva, amely a felület és a lipid kettısréteg közötti kohéziós erı erısségét szabályozza, már nagyobb különbségek láthatóak a hasadási valószínőségében. 40 alatti érték már a TiO 2 felülethez hasonlít, amin a kísérleti eredményekbıl is látható, hogy a liposzóma nem terül ki kettısréteget képezve [17]. 12. ábra A felszakadás valószínősége többféle felületet modellezve a hımérséklet függvényében [19] 18

19 Bár a pontos mechanizmusát nem értjük, kísérletekkel a liposzóma kiterülés körülményeit optimalizálhatjuk. Megállapítható, hogy a paraméterek milyen határai között kapunk lipid kettısréteget. Az elektrolit koncentráció hatása A közeget vizsgálva meglepı eredmények kaphatóak, ugyanis ha a közeg csupán víz, akkor nem történik liposzóma kiterülés (vagy nagyon lassú a folyamat). Az ionerısséget növelve, NaCl-dal elérhetünk egy kritikus koncentrációt, melynél már létrejön a kettıs réteg. Ezt SiO 2 nanorészecskéken ( ~300 mérték PC (foszfatidil-kolin tipusú lipid) liposzómákkal (~70 -es átmérıvel) [20]. 13. ábra Ionerısség függvényében az adszorbeált lipid mennyisége a SiO 2 nanorészecskéken [20] A 13. ábrán látható, hogy a lipid koncentrációt növelve a lipid kettısréteg kialakulása után már nem változik az adszorbeált lipid mennyisége. Ez a mennyiség egyezik a részecskét maximálisan beborító lipid kettısréteg mennyiségével. Ahol pedig a kiterülés nem történik meg, ott növekedés figyelhetı meg a teljes tartományban. 19

20 Pozitív töltéső ionok hatása (egyszeresen és kétszeresen töltött fém ionok) ~100 -es átmérıvel rendelkezı DPPC (1,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-foszfatidil-kolin) liposzómák kiterülését tanulmányozták QCM-mel SiO 2 felületen. A puffer 100 mm Tris., ph = 7,3 volt, amelyet nélkül illetve 2 mm CaCl 2 jelenlétében használtak. Érdekesnek találták a hatását a kiterülés kinetikájára [13]. A DPPC átalakulási hımérséklete fölött mért eredmények, hasonlóak lettek az eddigi tapasztalatokhoz, miszerint a lipidek adszorbeálódnak a felületen (gyors csökkenés a frekvenciában), majd megkezdıdik a széthasadás (frekvencia legkisebb értékén) és a lipid kettısréteg kialakulása (frekvencia megnövekszik, majd beáll egy stabil, a kiinduló értéknél alacsonyabb értékre). A kalcium ionok hatására ez a folyamat gyorsabban játszódott le [13,14]. A a DPPC átalakulási hımérséklete alatti méréseknél is elısegíti a kettısréteg képzıdést, ugyanakkor a szét nem hasadt liposzómák megkötıdését is elıidézi. 14. ábra Ca 2+ hatása a liposzóma kiterülésekre fázisátalakulási hımérséklet felett (A,B) illetve alatta (C,D) [13] 20

21 A jelenségeket a kalciumion híd képzése magyarázhatja, mely két negatívan töltött (negatív parciális töltéssel rendelkezı) részecske között hoz létre vonzó kölcsönhatást. Az egyik oldalon a SiO 2 felületén lévı >SiO - csoportok a másik oldalon pedig a lipidek foszfát csoportjában lévı oxigént kapcsolja össze. Ez a jelenség kimutatható NMR-rel, kalorimetriás módszerekkel [13]. Ezzel magyarázható a felgyorsuló kettısréteg kialakulás. A kötıdése a hımérséklet csökkenésével megnı a lipid molekulán emiatt a liposzómák között is megnı az összekapcsolódási hajlam. Így ezekben a kísérletekben liposzóma aggregáció is felléphet, mely segíti a megkötıdésüket [13]. A pozitív töltéső ionokról egy átfogóbb kísérlet is szól, melyben a POPC liposzómák kiterülésének mechanizmusát vizsgálták SiO 2 -on különbözı kétszeres, illetve egyszeres töltéső fémionok mellett [14]. A kétszeres töltéső ionoknál minden mintában 10 mm Tris és 100 mm NaCl volt, három mintát készítettek 5 mm-os MgCl 2, CaCl 2 és SrCl 2 jelenlétében. Az egyszeresen töltött ionok esetén 10 mm Tris hozzáadásával a három mintában 100 mm LiCl, NaCl és KCl szerepelt külön-külön. A ph minden esetben 8 volt [14]. Az eredményekbıl kitőnik, ahogy az már fent is látható volt, hogy a kettısréteg kialakulását egy liposzóma adszorpció elızi meg, amely a QCM-es mérésekben a frekvenciaváltozásban egy csökkenés látszik. A gödör legmélyebb pontját hívják kritikus sőrőségnek, mivel ekkora liposzóma sőrőség kell ahhoz, hogy a felületen meginduljon a kettısréteg képzıdés. 15. ábra A hídképzés ábrázolása [14] A kétszeresen pozitív ionoknál a kritikus sőrőség az atomsugár csökkenésével lecsökken. Ez arra enged következtetni, hogy a tapasztalt hídképzés a kisebb atomsugárnál nagyobb mértékő. A kisebb atomsugárral rendelkezı ionok kevésbé polarizálhatóak így kisebb a hidratációs burok, így könnyebben tud kapcsolódni a lipid negatívan töltött foszfát csoportjához. Az összekapcsolódás dinamikus, tehát az összekapcsolódott fémionok száma állandó, viszont ugyanaz a részecske rövid ideig tartózkodik a foszfát csoport közelében [14]. 21

22 Hasonlóan elmondható ez az egyszeresen töltött ionokra is, amelyeknél viszont a kapcsolat sokkal gyengébb és kevésbé stabilis. Az adszorbeálódott liposzómák közötti 16. ábra Kétszeresen (a) illetve egyszeresen (b) töltött pozitív ionok hatása a liposzóma kiterülésre [14] kölcsönhatásról eddig nem esett szó, ennek ellenére ez kulcsfontosságú, hiszen feltehetı, hogy a kritikus sőrőség léte miatt a kiterülés megindulása liposzómák közötti kölcsönhatáson alapul. Ezt a mozzanatot viszont még nem sikerült megérteni. A kísérletekben tapasztalt kritikus sőrőség csökkenése megmagyarázható a felület-liposzóma kölcsönhatásának megerısödésével. Hiszen ha ez a pozitív ionoknak köszönhetıen nagyobb lesz úgy az adszorbeálódott liposzóma jobban fog deformálódni, lapultabb lesz. Így a liposzómaliposzóma kölcsönhatáshoz, ahhoz hogy érintkezésbe kerüljenek egymással, egységnyi felületen kevesebb liposzóma szükséges [14]. A ph és a koncentráció hatása A közeg tulajdonságai közül a ph is fontos szerepet játszik a liposzóma kiterülésében. Errıl is Kvarckristály mikromérlegen mért adatok szolgáltatnak információt. DMPC (1,2- dimrisztoil-glicero-3-foszfokolin) liposzómákat alkalmazva (0,05 mg/ml) széles (3-12) ph tartományon mértek [19]. Fixen tartva a ph-t (ph=7,4; 33 ) a liposzóma koncentráció függvényében is vizsgálták a kiterülés mechanizmusát. Minden oldatban 150 mm NaCl és 2 mm CaCl 2 volt oldva, a ph-t pedig NaOH-dal illetve HCl-al állították be [21]. A ph változtatásával kétféle mechanizmus olvasható ki az 17. ábrából, a savas tartományban (ph = 3-7,4) kimarad a liposzómák adszorpciója és rögtön kiterülnek. Savas 22

23 közegben a fent már említett hidrogénkötés dominálhat. A lúgos tartományban (ph = 7,4-10) megjelenik a kritikus sőrőség (Θ a görbe legméllyebb pontja), amit el kell érni ahhoz, hogy meginduljon a liposzómák kihasadása. Ez a ph növekedésével egyre nı, egyre több liposzómának kell adszorbeálódnia a felületen, hogy széthasadjanak. Ebbıl kitőnik, hogy a ph drasztikusan meg tudja változtatni a lipid kettısréteg kialakulásának kinetikáját [21]. 17. ábra A ph (A) és a koncentráció (B) függés [21] A liposzóma koncentráció változásánál csupán a kiterülés ideje változik, az egyes esetekben, a Θ nem. Az, hogy létezik ez a kritikus sőrőség alátámaszthatja azt a fent említett tényt is, hogy a liposzóma megbomlásának a valószínősége igen csekély, ha nincs a szomszédságában már kiterült kettısréteg darabka. Ha a koncentrációt növeljük, akkor több liposzóma érintkezik a felülettel kevesebb idı alatt, így elıbb bekövetkezhet ez a megbomlás. Ezt a megbomlást elısegítheti a liposzóma-liposzóma közötti kölcsönhatás is, mely nagyobb koncentrációnál nagyobb valószínőséggel következhet be. 23

24 A liposzóma méretétıl való függés A liposzóma milyensége is befolyásolhatja a mérések kimenetelét, ezért a lipid kettısréteg kiterülését a liposzóma méretének függvényében érdemes vizsgálni. Errıl készült egy QCM-es tanulmány, melyben tojáslecitin liposzómát használtak SiO 2 felületre kiterítve (részletes anyag és körülmény leírás nem szerepelt a tanulmányban). A mérettartomány 25 nm-tıl 200 nm-es átmérıig terjedt [17]. Minden esetben kialakult a kettıs réteg, a 18. ábra A kritikus sőrőség nagysága a méret függvényében [17] kinetikát tekintve is hasonló eredményekhez jutottak. Itt is megjelent a kritikus sőrőség, az egyes mérések ennek nagyságában tértek el (18. ábra). Minél nagyobb volt a liposzóma átmérıje, annál nagyobb kritikus sőrőség kellett a felhasadáshoz. Látszólag ez olvasható le az eredményekbıl, viszont a liposzóma méretével nı az adszorbeálódott liposzómák deformációja is. A kisebb liposzómák jobban megırzik a gömb alakjukat, így a QCM-es szenzorhoz szinte pontszerően rakódnak le, mellyel a mőszer sokkal kisebb tömeget fog észlelni, mint a nagyobb, jobban kilapultabb liposzómáknál amik nagyobb felületen érintkeznek a felülettel. Ez is lehet az oka annak, hogy a mérettel nıtt a kritikus sőrőség. 24

25 A hımérséklet hatása Liposzóma kiterülésének a hımérséklet függését is lehet vizsgálni. Ez csak abban a tartományban történt meg, melyben a lipid folyadékkristályos fázisban van jelen, pontosan 278 K és 313 K között. POPC lipidet alkalmazva SiO 2 felületen (~45 -es átmérı) minden esetben kialakul a kettıs réteg [22]. Itt is ahogy a méretfüggésnél, csak a kritikus sőrőségben és a kiterülés idıtartamában látható különbség. A kritikus sőrőség és a kettısréteg kialakulásához szükséges idı a hımérséklet növekedésével lecsökken (19. ábra). A folyamat megértéséhez a fent említett szimulációhoz [19] hasonlót végrehajtva a kísérletekkel egyezı eredményeket kaptak. A szimulációban a felületet kicsiny darabkákra osztották fel, és kiszámolták, hány darabkát borít be 19. ábra A felület lefedettsége a modellben kicsiny részekre felosztott felület azon aránya, hogy mennyire kell lefednie liposzómának, hogy a felszakadás meginduljon, ez arányos a kritikus sőrőséggel (Surface coverage(%)). Ez van feltüntetve a hımérséklet függvényében (T(K)) [22]. egy liposzóma adszorpciója. Kiderült, hogy a hımérséklet csökkentésével az adszorbeálódott liposzómák száma megnı (a kritikus sőrőség nı) a felszakadás valószínőségének lecsökkenése miatt. Ezzel magyarázható a 19. ábrán látható tendencia is. 25

26 Kísérleti rész Felhasznált anyagok A mérésekhez minden esetben POPC (1-palmitoil-2-oleoilfoszfatidilkolin) lipidet használtam, amely lecitinekhez hasonló, a sejtmembránban gyakran elıforduló lipid. - POPC (M = 760,10 g/mol), Avanti Polar Lipids, 20 mg/ml kloroformos oldata A kísérletekben a lipid kettısréteg és egy polimer sorozat kölcsönhatását is tanulmányoztam. Ezeket az anyagokat a németországi Aacheni Egyetemtıl együttmőködés kapcsán kaptuk kutatási célokra [23]. Elágazó polietilén-imint (PEI, BASF, M = g/mol) módosítottak alkil láncok kémiai kapcsolásával. A négy polimer származék megegyezett abban, hogy azonos mennyiségő alkil láncot kapcsoltak a molekulára, és csak a láncok hosszúságában volt eltérés. A fontosabb adatai az 1. táblázatban láthatóak. A polimereket a liposzóma közegeként is használt sóoldatban oldottam fel és 0,025 mg/ml-es koncentrációban alkalmaztam. 1. táblázat A használt polimerek adatai Jelölés 20. ábra POPC szerkezeti képlete [15] Szénlánc hossza a polimeren belül Moláris tömeg (g/mol) S HYC S HYC A további anyagokat részben oldószerként, oldatok elkészítéséhez illetve a szenzor tisztítására használtam. - CaCl. 2 2H 2 O szárított, a.lt., Reanal Finomvegyszergyár ZRt. - NaCl kiizzított, puriss., Sigma-Aldrich Co. 26

27 - H 2 O 2 30 % oldata, puriss, Molar Chemicals Kft. - H 2 SO 4 95 % - 97 % for analysis, Molar Chemicals Kft. - Krómkénsav, laboratóriumi célra, Molar Chemicals Kft. - Kloroform, HPLC tisztaságú, Fisher Scientific Inc. Mintaelıkészítés OWLS szenzor tisztítása A bioszenzorokként mőködı az OWLS-be való chipeket igen körültekintıen kell kezelni, hiszen a lipid kettısréteg képzıdésnél fontos a felület minısége. Meg kell gyızıdni róla, hogy a felülete minden szerves szennyezıdéstıl (elızı mérésbıl rátapadt lipidtıl vagy polimertıl) mentes. Ehhez két féle módszert próbáltam ki, egy perkénsavas, illetve egy krómkénsavas mosást. A perkénsavas mosáshoz elıkészítettem 1:2 térfogatarányban hidrogén-peroxid ( 30 % és tömény kénsav (95 % - 97 %) elegyét. Az elegyítés hatására felforrósodott keverékbe lehőlés után 5 percre belemártottam a chipet, majd utána kétszer desztillált vízzel lemostam róla a savat. A tiszta chipet a mérés megkezdéséig olyan a sóoldatban tartottam, amilyenben a liposzómák is készültek. Ez azért fontos, hogy a chip felülete és az oldat között kialakuljon az egyensúly (szilanol csoportok és a fémionok között), így a mérésnél az alapvonal rövid idı alatt beáll. A mérés kezdetekor a chipet leöblítettem kétszer desztillált vízzel, majd levegı fújásával megszárítottam. A krómkénsavas mosásnál ugyanezeket a lépéseket hajtottam végre, csak a sav elegy helyett, krómkénsavat használtam. Ez egy enyhébb tisztítás, ugyanakkor a króm ionok miatt környezetszennyezıbb. A kezdetben használt perkénsavas mosás a chip felületén lévı hullámvezetı réteget még az 5 perces kezelés során is érzékelhetıen megmarta. Nem csak vékonyodott a réteg, hanem az érdessége is növekedett. Ez a tisztítás 5-6 alkalommal végezhetı el, ezután a chip tovább nem használható. A tisztítást krómkénsavval végezve a felület és a rács sérülése sokkal kisebb mértékő, így a chip élettartam meghosszabbítható. 27

28 Liposzómák elıállítása A liposzómát tartalmazó oldat elkészítéséhez egy gömblombikba bemértem a megfelelı mennyiségő lipidet és kloroformban feloldottam. A kloroformos oldatot rotációs vákuumdesztillálón (Büchi, Rotavapor-R) teljesen szárazra pároltam. Így a gömblombik falára egyenletes rétegben felkerült a lipid, ezt egy napra vákuumszekrénybe (Ichor /7) helyeztem, hogy az oldószer maradék is távozzon a lipid rétegbıl. A vizes oldat, mellyel hidratáltam a lipidet fiziológiás sóoldat (w = 0,9% NaCl), amely CaCl 2 -ot is tartalmazott (2 mm). A kiszárított lipid rétegre bemértem az adott mennyiséget a sóoldatból, és ultrahangos vízfürdın (VWR Ultrasonic cleaner, 90 W) hidratáltam a POPC-t. Ezzel a hidratációval egy opálos, átlátszatlan folyadékot kaptam, melyben a lipid többrétegő vezikula formájában van jelen. Ezek a liposzómák széles mérettartományban mozognak, és igen változatos számú lipid kettısréteg alkotja a falukat. Az ultrahangos rázást legalább 1 órán keresztül folytattam, amíg az oldat áttetszıvé nem vált. Ekkor a liposzómák túlnyomó többsége már csak egy kettısrétegő fallal rendelkezı, kismérető vezikula. 21. ábra A mini extrúder összeállítása [15] Ahhoz hogy a liposzómák közel egyforma méretőek (monodiszperzek) legyenek, az ún. extrudert használtam (Avanti Mini-Extruder Set, 21. ábra). Az eljárás lényege, hogy az extrudálni kívánt oldatot egy Hamilton fecskendıvel (Avanti Mini-Extruder Set) felszívtam, és az eszközben elhelyezett 100 nm-es membránon átnyomtam a szemben lévı fecskendıbe. Amibıl ugyanúgy vissza is nyomható az oldat az elızı fecskendıbe. Ekkor a nagyobb mérető MLV-k az átpréselés során felaprózódnak, és végül kb. 10-szeri átnyomás után az oldatban tisztán csak 100 nm körüli átmérıjő, SUV liposzómák maradnak. Fontos, hogy a végsı átnyomás sose abba a fecskendıbe érkezzen, mellyel felszívtuk a nyers, átextrudálatlan lipidet, mivel a membrán azon oldalán maradhatnak nagyobb mérető liposzómák, melyek nem 28

29 préselıdtek át a membránon. Az így kapott liposzómákat az adott méréshez megfelelı hígításban használtam fel. Ez az oldat 4 -on tartva 3-4 napig áll el [15]. Vizsgálati módszerek A mérések teljes idıtartama alatt folyadékfázisban dolgoztam. Az OWLS chipekre (OW 2400, Mikrovákuum Kft.) a liposzómákat oldatfázisban vezettem rá, ahogy azt a rákövetkezı polimerrel is tettem, ehhez a chip felületén ki kell alakítani egy folyamatos folyadékáramlást. A szenzort egy erre speciálisan kialakított tartóba tesszük, amely jó alátámasztást biztosít, és megkönnyíti a küvetta ráhelyezését a chip felületére. Egy gumigyőrő gondoskodik arról, hogy a folyadék a küvetta belsejében szivárgás mentesen tudjon áramlani. A küvettán két nyílás biztosítja a be és a kifolyást, melyet ezekre erısített csövekkel oldottam meg. A chipnek a két széle és a közepén lévı rács alulról szabad, elıbbi a becsatolt fény detektálására, utóbbi pedig a lézerfény bevezetésének céljából. Ezt az összeszerelt elemet könnyedén be lehet csúsztatni a mőszeren (ASI BIOS-1) lévı két detektor közé. Méréskor ez a fejrész egy goniométer segítségével el tud fordulni, így az alulról bevezetett lézerfény és a chip közötti szög folyamatosan változtatható. 22. ábra A hordozó és a küvetta sematikus ábrája A folyadékáramlást egy perisztaltikus pumpával (HP ) biztosítottam. Ezen a pumpán középen egy kör alakú forgó alkatrész van, melynek a kerületén görgık helyezkednek el. Egy flexibilis csövet ráerısítve a görgıkre, azok forgás közben összenyomják, majd elengedik az egyes csırészletet áramlást indukálva a csıben. A pumpa esetén ez a mozgás annál egyenletesebb, minél több görgıt helyeznek el a pumpán, az általam használt készüléken 8 található. A felhasznált csı átmérıje 2 mm volt, a görgık pedig olyan sebességgel forogtak mellyel ~ 2 / -os áramlási sebességet biztosítottak. Ez a sebesség állandó volt, és minden egyes mérésben ezt használtam. Az egyenletes 29

30 folyadékáramoltatásnak azért van jelentısége, mert az OWLS szenzor nyomásra is érzékeny, és fontos, hogy az esetleges folyadék lökések ne zavarják a mérést [11]. A küvettát és a perisztaltikus pumpa csövét 1 mm átmérıjő teflon csövekkel kötöttem össze. A mérések közben az oldatcseréket egyszerően meg tudtam oldani, leállítva a pumpát áthelyeztem az egyik oldatból a másikba a bevezetı csövet. A mérések után a csı belsejét acetonnal öblítettem át (esetleges lipid és egyéb szerves anyagok lerakódása miatt) majd kétszer desztillált ízzel. A tefloncsövek jól bírják az acetonos mosást viszont a pumpához tartozó flexibilis csı nem. Ezért a pumpát a kivezetı csıre kapcsoltam, és szívást alkalmaztam, hogy a késıbbi méréseknél a friss oldat csak a tefloncsıvel érintkezzen, mielıtt a szenzorra érkezik. A chip 48 mm x 16 mm x 0,6 mm mérető [24], amin a hullámvezetı réteg 170 nm 200 nm vastagságú. Ebben a rétegben a rács középen 2 mm széles csíkban helyezkedik el, a rács periódusa Λ 416,6 nm, ami megfelel 2400/ vonalsőrőségnek. A fényforrás egy He-Ne lézer ( 632,816 nm), amely a chip ~ 1 felületét világítja meg, a mérésekben ekkora mérető felületrıl kapunk információt. A küvetta ennél nagyobb, ~ 1 átmérıjő felületet borít be. A fotodetektorok erısítését és a lézerfény polarizációját a mérés elıtt be kell állítani, ehhez egy számítógépes program nyújt segítséget, amely a mérési eredményeket jegyzi fel és ábrázolja a mérés alatt. A méréshez szükséges törésmutató adatokat egy refraktométer segítségével mértem meg (asztali Rudolf refraktométer, 633 nm). 23. ábra Az OWLS készülék fényképe, a két szélén láthatóak a detektorok (a számok az erısítés állításához valóak) ami közé becsúsztatható a küvetta 30

31 24. ábra A gumigyőrő és a chip tartó küvetta a folyadék be- és kimenetekkel 31

32 Eredmények és kiértékelésük Az OWLS technikában a mérések kiértékelésére leggyakrabban alkalmazott a homogén izotróp réteget feltételezı modell. A lipid kettısrétegre a molekulák orientált elrendezıdése miatt nem teljesül az optikailag izotróp követelmény (25. ábra). Anizotrópia jellemzı a rétegre, vagyis a törésmutató nem egyforma minden irányban. Két törésmutatót definiálhatunk: az egyik az ordinárius (n o ), ami horizontálisan fekszik és az extraordinárius törésmutató (n e ), mely erre merıleges. Ez okozza a kettıstörés jelenségét is például a kalcit kristályokban. Az anizotrópiát definiálhatjuk e két törésmutató különbségeként: 16 Egy anizotróp réteget az izotróp modellel értékelve a kapott vastagság és törésmutató értékekbıl következtethetünk az anizotrópia jelenlétére és jellegére [26]. Negatív anizotrópia esetén az izotróp modellbıl adódó törésmutató mindig nagyobb, mint a valós, a rétegvastagságra pedig valamivel kisebb értéket kapunk a valósnál. Az egységnyi felületen adszorbeálódott tömeg értékében az eltérés 1 % alatt, attól függıen, hogy az izotróp vagy az anizotróp modellt használjuk. Pozitív anizotrópiánál az átlagos törésmutató kisebb, mint a valós, míg a rétegvastagságot a folyadékfázis törésmutatójától és a tényleges, értékektıl függıen alul, illetve felül is lehet becsülni. Az egységnyi felületen adszorbeálódott tömeg értékében nagyobb eltérések is lehetnek bizonyos törésmutató értékek határain kívül. Ha például az anizotrópia átlépi a 0,06-os értéket, és az átlagos törésmutató kisebb, mint 1,36, a relatív hiba akár 6 %-nál nagyobb is lehet [26]. 25. ábra Anizotrópia a membránban [25] 32

33 Ha a rétegvastagság sokkal kisebb, mint a lézerfény hullámhossza akkor a következı egyenleteket kapjuk a valós vastagság és az izotróp modellbıl (a mőszer leírásakor ismertetett egyenletekbıl) kapott vastagság között, illetve a valós törésmutatók és az izotróp modellbıl kapott törésmutatók között : ahol az ordinárius és az extraordinárius törésmutató [26]. Fontos megjegyezni, hogy a lipid kettısrétegre az anizotrópia pozitív értékeket vesz fel és az átlagos törésmutatója 1,47 körüli [27]. Ebbıl következik, hogy izotróp réteget tekintve a felületi sőrőség, illetve felületi tömegkoncentráció értékek megbízhatóak mivel a rétegvastagság és törésmutató értékek kompenzálják egymást. Amennyiben ábrázoljuk az izotróp modellbıl kapott vastagságot, vagy ennek relatív hibáját az anizotrópia függvényében, akkor bizonyos értékeknél szingularitásokat kaphatunk (26. ábra). Pozitív anizotrópia esetén, mivel az izotróp modell alkalmazása miatt a törésmutatót alá becsüljük, értéke eléri a közegét, ami irreális vastagság értékekhez, illetve a szingularitáshoz vezet. Ez részben azt mutatja, hogy a modell nem megfelelı az adott rendszer leírásához, de az is megtudható a kialakult réteg szerkezetérıl, hogy pozitív anizotrópiát mutat. 26. ábra Szingularitások ábrázolása az izotróp modellbıl kapott vastagság hibájára (a), magára a vastagságra (b) 3 n e értéknél [26] Ahhoz, hogy a molekulárisan rendezett rétegre jellemzı két független törésmutató éréket mérni tudjuk több információra van szükségünk a mérésbıl Erre megoldás lenne két 33

34 különbözı hullámhosszon mérni a becsatolási szöget, ezzel a módszerrel megfelelı mennyiségő összefüggést kapnánk ahhoz, hogy megadjuk mind a két törésmutató komponenst. Egy másik módszer a közelítés. Ha fix értéken tartjuk a átlagos törésmutatót ( ) vagy a vastagságot, akkor elegendı független egyenlet áll rendelkezésre, hogy a mért adatokból meg lehessen állapítani az anizotrópia mértékét. A mérés körülményeitıl függ melyik feltételezés a valósághoz közelibb, pontosabb közelítést. Mivel az általam végzett kísérletekben az adszorbeálódott anyag mennyisége változik, így célszerőbb a vastagság változását megengedni és inkább a törésmutatót rögzíteni. Ezt a réteg átlagos törésmutatójával tettem meg, amely (19) egyenlettel definiálható: A kiértékeléseknél az anizotróp modellhez egy programot használtam, amely a nyers adatokból, a relatív törésmutató TE és TM módusaiból számolta ki a kívánt eredményeket. POPC liposzóma kiterülésének vizsgálata az OWLS szenzoron A liposzóma szilárd felületen való kiterülésének feltételei között nagy jelentıségő a felület anyagi minısége. Több kísérletet is végrehajtottak TiO 2 felületen, és ugyanazt az eredményt kapták, miszerint ezen nem történik meg a liposzómák felhasadása, csak a kettısréteg adszorpciója [16,17]. Az OWLS chipek esetén - a hullámvezetı réteg összetételét tekintve, ami,, [24] - felmerül a kérdés, vajon itt megtörténik-e a kettısréteg képzıdés. Ehhez elkészítettem egy liposzóma koncentráció sort, mellyel megmértem a liposzóma kiterüléseket. Továbbá vizsgáltam a kialakuló réteg állandóságát oly módon, hogy bizonyos idıközönként megváltoztattam a folyadékfázis összetételét. Tudomásom szerint ilyen kísérleteket korábban nem végeztek. Kiterülés után sóoldattal mostam a rendszert, majd újabb liposzómákat vezettem rá, végül egy újabb mosás következett a sóoldattal. A méréseket 25 -on végeztem, melynél a 1,3326 volt a közeg törésmutatója. Különbség nem adódott a sóoldat, liposzóma oldat illetve a késıbbiekben felhasznált polimer oldatok 34