Helicobacter pylori által kiváltott sejtkinetikai változások a gyomor premalignus elváltozásaiban. Unger Zsuzsa

Átírás

1 Helicobacter pylori által kiváltott sejtkinetikai változások a gyomor premalignus elváltozásaiban Unger Zsuzsa Témavezeto: Dr. Prónai László Bírálók: Dr. Rácz István Prof. Dr. Papp János Szigorlati bizottság: Elnök: Prof. Dr. Schaff Zsuzsanna Tagok: Dr. Székely György Prof. Dr. Banai János Semmelweis Egyetem Doktori Iskola, Gasztroenterológia Budapest, 2003

2 Dolgozatomat Albert Karola emlékének ajánlom 2

3 Tartalomjegyzék 1. Összefoglalás Magyar nyelvu összefoglaló Angol nyelvu összefoglaló 7 2. Rövidítések jegyzéke Bevezetés Háttér A Helicobacter pylori, mint carcinogen ágens A gyomornyálkahártya vizsgálata Célkituzések Beteganyag és módszerek Beteganyag A sejtproliferáció vizsgálata PCNA meghatározás A nucleolaris organizátor régiók detectálása Apoptosis vizsgálata A TUNEL reakció EGFR kimutatás Oncoprotein expresszió vizsgálata - p53 kimutatás Statisztikai módszerek Eredmények Sejtroliferáció a PCNA és AgNOR módszerek összehasonlítása Az apoptosis vizsgálatának eredményei EGFR expresszió vizsgálatának eredményei A p53 oncoprotein expresszió vizsgálatának eredményei Összehasonlító elemzés Megbeszélés Az eredmények megbeszélése Következtetések 56 3

4 7. Köszönetnyilvánítás Irodalomjegyzék Felhasznált irodalom Az értekezés témájában megjelent saját közlemények Az értekezés témájában megjelent saját közlemények különlenyomatai 74 4

5 1. Összefoglalás 1. 1 Magyar nyelvu összefoglaló Helicobacter pylori általt indukált sejtkinetikai változások a gyomor premalignus elváltozásaiban Unger Zsuzsa Témavezeto: Dr. Prónai László Budapest, SOTE Doktori Iskola, Gasztroenterológia 2003 Háttér: A H. pylorit 1994-ben a gyomor carcinogenesisében betöltött szerepe miatt elsodleges carcinogen ágensnek nyilvánították. A pontos mechanizmus azonban, ami a rák kifejlodéséhez vezet, ma még nem teljesen ismert. Nem tisztázott, hogy a kórokozónak milyen szerepe van a gyomornyálkahártya homesostasisának megbontásában, milyen hatása van a növekedési faktorok expressziójára, és az sem ismert, hogy hogyan befolyásolhatja az egyik leggyakoribb humán tumorokban eloforduló gén, a p53 mutációját. Bár a H. pylori eradikációja képes megfordítani a legtöbb molekuláris elváltozást, még nincs egységes álláspont arra vonatkozóan, hogy mely betegcsoportban szükséges az eradikációs kezelést elvégezni. Célkituzések: Az irodalmi adatok áttekintése után elsodleges feladat volt megvizsgálni a H. pylori fertozés szerepét a gyomornyálkahártya proliferációs és apoptoticus folyamatainak változásában. További célkituzés volt megmérni, hogy befolyásolja-e a H. pylori pozitivitás az EGF receptor expresszióját. A lehetséges genetikai instabilitás tisztázása érdekében történt a p53 expresszió vizsgálata. A vizsgálat fontos feladata volt megmérni a H. pylori eradikációs kezelésének hatását. Beteganyag és módszerek: A vizsgálatban 121 beteg vett részt (ebbol 61 no, 60 férfi, átlag életkoruk 58,5+14,3 év). Rutin gastroscopia során nyert biopsiás mintákból formalinban fixált paraffinba ágyazott metszetek készültek. A minták osztályozása négy szövettani csoportba történt: ép nyálkahártya; gyulladás, intestinalis metaplasia jelenléte nélkül; gyulladás, intestinalis metaplasiával; carcinoma. A gyulladásos esetek H. pylori hiánya vagy jelenléte alapján további alcsoportokba kerültek. A metszeteken 5

6 proliferációs aktivitás vizsgálata PCNA és AgNOR módszerekkel, apoptosis mérés TUNEL technikával, EGFR és p53 expresszió vizsgálata pedig immunhistochemiai módszerrel történt. Eredmények: A H. pylori nem okozott szignifikáns proliferáció változást. Intestinalis metaplasia nélküli gyulladásban H. pylori hatására az apoptosis szignifikáns mértékben gyorsult (0,013+0,001 vs. 0,029+0,012). Az EGFR expresszió az intestinalis metaplasiás csoportban H.pylori hatására szignifikánsan csökkent (48,30+23,70 vs. 32,80+30,40). A p53 index az intestinalis metaplasiás gyulladásban szignifikánsan nott az intestinalis metaplasia nélküli esetekhez képest mind a H. pylori negatív (18,33+19,65 vs. 68,50+28,96), mind a H. pylori pozitív (35,55+31,16 vs. 70,16+22,54) esetekben. Eradikációs kezelés után valamennyi paraméter a normál értékekhez közelire visszaállt. Következtetések: Az eredmények azt mutatják, hogy a H. pylori fertozéskor tapasztalható gyorsult sejtproliferációt nem a baktérium okozza, hanem a gyulladásra adott aspecifikus válasznak tekintheto. H. pylori az apoptosist csak akkor fokozza, ha intestinalis metaplasia nincs jelen. Intestinalis metaplasiában a H. pylori pozitív esetekben csökken az EGFR expresszió. A p53 mutációja korai esemény a gyomorrák carcinogenesisében. Eradikációs kezelés hatására a paraméterek a normálhoz közeli értékre visszaállhatnak, így a kezelés elvégzése indokolt az intestinalis metaplasiás betegeken. 6

7 2.2 Abstract Helicobacter pylori induced cell kinetics changes in premalignant lesions of the stomach Zsuzsa Unger Consultant: László Prónai Budapest 2003 Background: Based on its possible effect in gastric carcinogenesis, H. pylori was clarified as I. class carcinogen in The exact patomechanism leading to cancer, however is still not cleared and the role in upsetting the balance of gastric epithelium is not well documented. Results are controversial about the effect of the bacterium on EGFR expression. It is not known how H. pylori influences the p53 mutation. Although the eradication of H. pylori reverses most of the molecular changes, there is still no consensus which patients need H.pylori eradication. Aims: 1) To investigate the role of H. pylori infection on gastric epithelial cell proliferation and apoptosis. 2) To evaluate the influence of H. pylori on EGFR and p53 expression. 3) To evaluate the effect of H. pylori eradication therapy on these parameters. The study also summarizes the current literature. Patients and methods: Antral biopsies were taken from 121 patients who underwent routine upper endoscopy (60 men, 61 women, mean age 58,5 years). Biopsies were fixed in formalin and embedded in paraffin. Patients were classified into four histological groups: (1) as normal epithelium, (2) gastritis, without intestinal metaplasia, (3) gastritis, with intestinal metaplasia and (4) carcinoma. Based on presence/absence of H. pylori the gastritis cases were classified into subgroups. Cell proliferation was measured by PCNA and AgNOR techniques, apoptosis was measured by TUNEL reaction and to evaluate the EGFR and p53 expression immunohistochemical method was used. Results: H. pylori did not cause significant change in cell proliferation. In gastritis cases - in the absence of intestinal metaplasia - H. pylori significantly increased apoptosis (0,013+0,001 vs. 0,029+0,012). Expression of EGFR was significantly lower in cases 7

8 when intestinal metaplasia was present (48,30+23,70 vs. 32,80+30,40). In the group of gastritis with intestinal metaplasia the p53 index increased both in H. pylori negative (18,33+19,65 vs. 68,50+28,96) and in H. pylori positive (35,55+31,16 vs. 70,16+22,54) cases. H.pylori eradication reversed these parameters close to the normal. Conclusions: The results suggest that the hyperproliferation in H. pylori infection is not caused by the bacterium itself, but it is rather an non-specific reaction to inflammation. H. pylori can increase the apoptosis only in the absence of intestinal metaplasia. EGRF expression during H.pylori infection is decreased only if intestinal metaplasia is present. Mutation of p53 is an early event in gastric carcinogenesis. H.pylori eradication normalises altered cell kinetics, thus it is suggested in all cases with intestinal metaplasia. 8

9 2. Rövidítések jegyzéke PCNA AgNOR TUNEL EGFR LSD PBS DAB caga vaca proliferating cell nuclear antigen argyrophil nucleolaris oraganizátor régió terminal deoxynucleotidyl transferase(tdt)-mediated deoxyuridintriphosphate-biotin (dutp) nick end labelling epidermal growth factor receptor least square deviation phosphate buffer saline diamino-benzidin citotoxin-asszociált gén vakuolizáló citotoxin 9

10 3. Bevezetés 3. 1 Háttér A Helicobacter pylori, mint carcinogen ágens Csökkeno incidenciája ellenére a gyomorrák ma még világszerte vezeto helyen áll a rákos megbetegedések okozta halálozásban. Széles köru ismeretanyag áll rendelkezésre a betegség epidemiológiájáról, pathogenesisérol, pathológiájáról, azonban kulcsfontosságú kérdések még mindig megválaszolásra várnak. Nem tisztázott, hogy hogyan alakulnak ki a rákmegelozo állapotok és ezek milyen szerepet töltenek be a carcinoma kifejlodésében. A Helicobacter pylori 1983-as újrafelfedezése óta a kutatások jelentos része új irányvonalon halad, és igyekszik tisztázni, hogy a kórokozónak milyen szerepe van a gyomorrák keletkezésében. A H. pylori jelenlétérol a gyomorban már 1893-ban beszámoltak, de csak Warren és Marschall 1983-as közleménye irányította rá a figyelmet, és azóta közlemények sokasága igazolta, hogy összefüggés van a H. pylori fertozés fennállása és egyebek mellett a gyomorrák, a fekélybetegség, a chronicus activ gastritis és a MALTlymphoma kialakulása között. A H. pylori az emberiség 50%-ában megtalálható, jelenlegi álláspont szerint a terjedés útja feco-oralis, esetleg oro-oralis, így a szeroprevalencia jelentos eltérést mutat az eltéro ökoszociális helyzetu területek között. A H. pylori spirálisan csavarodott vagy ívben enyhén meghajlított, 2-3? m hosszú, 0,5-1? m átméroju Gram-negatív baktérium. Microaerophil, spórákat nem képez, 1-7 flagellaris horoggal rendelkezo, fejvégu ostora segíti mozgását, tenyésztése speciális táptalajt igényel. A kórokozót a gyomornyálkahártya sejtjeihez való kötodése segíti abban, hogy egy gyors, nem specifikus immunválasz ne tudja eliminálni. Nem tisztázott, hogy ebben az adherenciában transcriptio vagy protein szintézis segíti a baktériumot (106). Az adherencia a kolonizáció biztosításán túl, a direkt epithelkontaktus során bekövetkezo cytosceleton károsítása révén is károsítja a mucosát. A H. pylori kolonizációját segíti, hogy a bakteriális ureázok között egyedülálló - két alegységbol álló enzim segítségével - boséges mennyiségu ureáz termelésére képes. Az ureáz az ureát ammóniára és szén- 10

11 dioxidra bontja, ezzel magasabb ph-jú mikrokörnyezetet képes a gyomor savas közegében teremteni, és ezáltal biztosítja a baktérium túlélését. Ráadásul feltételezheto, hogy az ammónia rediffúzió révén károsítja a nyálkahártyát. Ezt segítheti a kórokozó által termelt lipázok nyákot gyengíto hatása és proteáz termelése, ami a helyi viszkozitás csökkentésével segíti a motilitást. Chemotacticus faktorok termelése révén neutrophil és lymphocytamigrációt okoz, ezzel szabad gyökök, lysosomalis enzimek, tumor necrosis faktorok termelését is beindítja. A fertozést követo gastritis kialakításához lokális immunválasz kiváltása is hozzájárul. Ezt átmeneti hypochlorhydria után a fertozést fokozott savsecretio és hypergastrinaemia kíséri. A H. pylori törzsek rendelkeznek vaca génnel, ami a vakuolizáló citotoxintermelést kódolja. Ez egy 34 és egy 58 kd-os fragmentbol álló protein, a kórokozóknak azonban csak 60-65%-a képes termelni ezt az epithelsejtek vakuolizációját és pusztulását okozó toxint. A caga gén a vakuolizáló citotoxin aktivitás markere, a baktériumok mintegy 60%-a hordozza, ez egy kb. 128 kd-os fehérjét kódol. A cag pathogenitási sziget magasabb arányban fordul elo azokban a betegekben, ahol gyomorrák vagy pepticus fekélybetegség alakul ki, ellentétben azokkal a betegekkel, ahol gastritis fejlodik ki (6). A caga és vaca gének szoros összefüggése genetikai kapcsolatot feltételez. A vaca genotípusok egy része termel egy másik gyulladást kiváltó citotoxint, az icea-t (induced by contact with epithelium). A cagi. régión belül pedig leírták a pica és picb géneket, amelyek közül a picb-nek szerepe lehet a H. pylori kiváltotta gyulladásban. In vitro tanulmányok szerint a H. pylori direkt kontaktussal, valamint enzimek és citotoxinok útján károsítja a gyomornyálkahártya sejtjeit, így a fertozött személyekben kialakuló sejtkárosodások nagy részéért felelos lehet (106, 116, 90). Bár számos tanulmány kutatja, hogy milyen szerepe van az egyed fogékonyságának, a környezeti tényezoknek a H. pylorihoz kapcsolódó gastroduodenalis betegségek pathogenesisében, kiújulásában, még mindig nem tisztázott, hogy fertozöttekben miért csak 15%-ban fejlodik ki fekély, és az sem világos, hogy mitol függ, hogy fekély vagy tumor irányába halad a betegség. 11

12 A gyomornyálkahártya vizsgálata Ma már kétségtelennek tunik, hogy a H. pylori az arra fogékony betegekben képes a gyomornyálkahártya egyensúlyát felborítani. Ennek az egyensúlynak a fenntartásáért két alapveto élettani folyamat felelos, a sejtproliferáció és a programozott sejthalál, más néven apoptosis. A sejtmegújulás a gyomornyálkahártyán csakúgy, mint az emésztotraktus más területein gyors. A proliferatív zóna a nyálkahártya mirigyei isthmusának és nyaki régiójának megfelelon, valamint a mirigyek alapján, basalisan található (17, 2). A sejtek érésük során a nyaki régióban két irányba mozognak: a mucinosus sejtek fölfele, a foveolaris zónába, a parietális sejtek és a mucinosus sejtek kis része pedig lefele, a mirigy bázisa felé. Ezalatt a sejtek differenciálódnak, csökken a replikációs kapacitásuk, és végül elhalnak (1. ábra). 1. ábra A gyomornyálkahártya sejtjeinek kétirányú migrációja a sejtosztódás/differenciálódás folyamata során (Anti nyomán). 12

13 Ha ez az egészséges egyénekben egyensúlyban lévo folyamat felborul és a fokozott proliferáció irányába tolódik el, egyrészt teret ad a replikációs hibák számának növekedésére és a gyorsult osztódásokkal lépést tartani nem tudó repair miatt no a genetikai változások esélye, másrészt a sejtproliferáció során elonyösebb helyzetbe kerülnek a genetikai károsodást szenvedett sejtek, az ossejtek proliferációja pedig növeli a késobbi malignus transzformáció lehetoségét. Amennyiben az egyensúly a sejtpusztulás felé tolódik el, az atrophia vagy fekély kialakulásának kedvez. A kutatócsoportok egyetértenek abban, hogy a felgyorsult sejtproliferáció korai esemény a gyomorrák carcinogenesisében és így jó biomarkere a gyomorrák megnövekedett kockázatának, azonban a fokozott proliferációval párhuzamosan zajló apoptosis változásról kevés illetve ellentmondásos adat áll csak rendelkezésre. A sejtproliferáció mérésére számos technikát alkalmaznak a különbözo kutatócsoportok, de az eltéro módszerekrol csak kevés összehasonlító tanulmány készült, így nehéz eldönteni, hogy melyik módszer milyen pontossággal tükrözi a sejtosztódást (69, 70). A kórokozó proliferációs és kolonizáló képességének vizsgálatára szolgáló módszerek nagyon hatékonyak, ám nagyon idoigényesek. A haemocytometer segítségével történo direkt sejtszámlálás gyors, olcsó és kevés anyagot igényel. Sejtpopulációkban alkalmazhatóak a DNS szintézisen alapuló mérések, mint pl. a [ 3 H]- TdR, BrdU, metabolicus aktivitáson alapul az MTT, XTT (microtiter plate, különbözo terazolium sók felhasználásával) módszer. Amennyiben nem áll rendelkezésre sejttenyészet a vizsgálatokhoz, az osztódás vizsgálható a sejtciklus asszociált antigének kimutatásával immuncytochemiai és immunhistochemiai módszerekkel, ilyenek a Ki67 és a PCNA, vagy vizsgálható a DNS szintézis kimutatásával autoradiographiaval, immuncytochemiai és immunhistochemiai módszerekkel. Ezek közül a módszerek közül a laboratóriumunkban korábban már sikeresen alkalmazott tecnikát, a PCNA-t használtuk és az így kapott eredményeket hasonlítottuk össze egy olcsóbb és gyorsabb módszer, az AgNOR tecnika eredményeivel. A PCNA, vagyis a proliferáló sejt nuclearis antigén egy sejtciklus szabályozó fehérje, a repair mechanizmusban vesz részt. A DNS polimeráz enzim??kofaktora, egy 36 kd súlyú molekula, amely leginkább a késoi G 1 és az S fázisban mutatható ki, gyakorlatilag azonban a sejtciklus minden szakaszában megtalálható. A G 1 és az M fázisokban akkumulálódik, a mitózis végére eltunik. Az evolúció során szerkezete nagyrészt 13

14 megorzodött, növényekben is megtalálható, emberi borben ultraibolya sugárzás hatására megjelenik (30, 33). Az adatok azonban arra utalnak, hogy ez a módszer a DNS polimeráz hosszú fél-életideje miatt kissé túlbecsüli az osztódó sejtek arányát (23). A PCNA módszerrel a H. pylori pozitív gastritisben kialakult DNS károsodáson átesett sejtek túléloi (az úgynevezett malgun sejtek), nemcsak a proliferációs zónában, hanem a felszínen is pozitív festodést mutatnak, míg Ki67-tel csak a proliferációs zónában festodnek ezek a sejtek (58). Az AgNOR technika a nucleolaris organizátor régiókhoz kötött proteinek jelenlétét mutatja ki az interfázisban, a riboszóma szintézist reprezentálja. Méretük és számuk utal a sejtproliferáció ütemére, a transzformációra, cytometriával mért aneuploidiával korrelálva a malignus elfajulásra. Sigmabélben és rectumban vizsgálva az AgNOR-ok mérete és száma negatívan korrelál egymással, jóindulatú elváltozásokban kevés, de nagy méretu dot, carcinomában azonban kisebb, de több dot figyelheto meg (91, 126). A módszert eredményesen alkalmazták, pl. lymphomák, lágyrész tumorok, tüdo tumorok diagnosztikájában (15, 96), és számos szerzo beszámol arról, hogy az emésztorendszeri elváltozások meghatározásában is értékes segítséget jelenthet. Rüschoff az AgNOR technika értékének bizonyítására meningeomát, vese- és hólyag tumorokat vizsgált, és azt találta, hogy a módszer könnyen kivitelezheto, olcsó, jól reprodukálható, ezen felül kiválóan alkalmazható mind formalinban fixált, paraffinba ágyazott metszeteken, mind pedig cytologiai mintákon. Az eredmények jól korrelálnak az osztódó sejtek arányával, és alkalmasnak tunik a tumorok osztályozására (92). Gyomorcarcinomás betegekben összefüggést találtak az AgNOR paraméterek változása és a nyirokcsomó metastasisok megjelenése között, így a módszer alkalmas a klinikai prognózis megítélésére (49, 41). Az AgNOR gyomorban is, colonban is független prognosztikai paraméternek bizonyult, ezért preoperatív vizsgálatként javasolják a tumor agresszivitásának megítélésére, az operáció kiterjesztésének és az adjuváns therapiának a kiválasztására (49, 91, 130). Számos tanulmány alátámasztja azt, hogy az AgNOR mutatók szorosan korrelálnak a többi proliferációs módszer eredményeivel (130, 30). Az irodalomban azonban fellelheto olyan adat is, miszerint az adenocarcinomás betegek prognózisa és az AgNOR szám között nincs összefüggés, és a formalinban történo fixálás zavarhatja a NORasszociált proteinek detectálását (31). 14

15 A homeostasis fenntartásáért a proliferáció mellett a programozott sejthalál felelos. Az apoptotizáló sejteket azonban nehéz fénymikroszkóppal vizsgálni, ráadásul a vizsgálómódszerek standardizálása is nehéz, mivel minden módszer igen érzékeny a protokoll minimális változtatására. A vizsgálatot nehezíti, ha egyidejuleg gyulladás is fennáll, azonban az apoptosist fémjelzi az endonukleázok által okozott, lépésrol-lépésre bekövetkezo DNS degradáció, minek során a kettosláncú DNS spirálból rövid fragmentumok töredeznek le. Ezek detectálására dolgozták ki a ma már széles körben elfogadott módszert, a terminális deoxynucleotidyl [TdT]-mediált deoxyuridinetriphosphate [dutp] nick end labelling (TUNEL) technikát (74), amely során a feltöredezett kettosszálú DNS rövid fragmentjeinek 3 szabad végét jelölik terminális uridin transferase segítségével. Kasagi 1994-ben eloször használta ezt a módszert gyomorcarcinoma vizsgálatára. Elotte a rutin histologiai módszerekkel a morfológiai változások rövid idotartama és a látszólag alacsony incidenciája miatt az apoptosis csak nehezen volt detectálható, így a pathológusok rendszerint csak kevés figyelmet fordítottak erre a mechanizmusra a gyomorrák vizsgálata során. TUNEL-lel azonban jól differenciált carcinomában alacsonyabb apoptosis indexet találtak, mint a rosszul differenciált carcinomában, ami magyarázhatja utóbbi lassúbb növekedési ütemét (50). A jelenlegi adatok alapján úgy tunik, hogy a H. pylori fertozés során bekövetkezo változások egyik kulcsfontosságú kérdése az apoptosis indukálása. Nem tisztázott, hogy ezt direkt mechanizmus útján képes elérni, vagy indirekt módon, a gyulladásos reakció kiváltásával. Moss eredményei a direkt mechanizmust valószínusítik, mivel nem találtak korrelációt az apoptotizáló sejtek aránya és a gastritis foka között. A H. pylori fertozésre bekövetkezett apoptosis fokozódás stimulusa lehet a kompenzatorikus hyperproliferativ és potenciálisan preneoplasticus válasznak (71). Wagner adatai alapján a H.pylori direkt mechanizmus útján fokozza az apoptosist. A fertozés hatására növekedés gátlást tapasztalt, amit kompenzatorikus DNS szintézis fokozódás kísért. Ez nagy H. pylori koncentráció mellett megszunt, mivel a kórokozó direkt gátolta a DNS szintézist (117). A 2. ábra azt szemléltei, hogy hogyan változtatja meg a H. pylori fertozés a gyomornyálkahártya homeostasisát. 15

16 2. ábra A gyomornyálkahártya sejtjeinek forgalma egészséges és H. pylori-asszociált betegségekben (Wagner nyomán) : gyomor nyálkahártya sejt, : proliferáló epithel sejt, : apoptotizáló epithel sejt Már a H. pylori fertozésnek a gyomor carcinogenezisében betöltött szerepére irányuló kutatások sorozata elott kitunt, hogy egy soklépcsos, multifactorialis folyamatról van szó. A carcinogenezisre vonatkozó modellek közül ma a Correa által 1992-ben felállított modell a legszélesebb körben elfogadott, miszerint a többlépcsos folyamat chronicus gastritisen, atrophián, intestinalis metaplasián, dysplasián át vezet carcinomához (12). Munkánkban mi is ezt a modellt vettük alapul, és mivel úgy tunik, hogy intestinalis metaplasiában a molekuláris változások még visszafordíthatók és a H. pylori fertozés hatása is más, mint a korábbi stádiumokban, figyelmünket erre az állapotra fordítottuk. Scotiniotis azt tapasztalta, hogy a H. pylori infekció fokozta az apoptosist és a proliferációt is, azonban intestinalis metaplasiában már csak a 16

17 proliferáció fokozódás volt megfigyelheto, az apoptosis mértéke változatlan maradt, így feltételezi, hogy intestinalis metaplasiában ez a változás már visszafordíthatalan, így ez lehet a gyomor carcinogenesisének kulcslépése (97). A 3. ábra összefoglalja a H. pylori indukált apoptosis feltételezett szerepét a gyomor carcinogenesisében. A sejtosztódást fiziológiás és pathologiás körülmények között is számos tényezo befolyásolhatja. Ezek közé tartoznak a növekedési faktorok, amelyekrol az utóbbi évtizedekben egyre szélesebb köru ismeretanyag áll rendelkezésre. Az 1962-ben elsoként azonosított növekedési faktor, az epidermalis növekedési faktor (EGF) és a vele rokon növekedési faktorok fontos szerepet töltenek be a gyomornyálkahártya védelmében és gyógyulásában. Az EGF egy 53 aminosavból álló saválló, mitogén fehérje, gátolja a sav secretiot, védi a nyálkahártyát az akut károsodással szemben, befolyásolja annak alkalmazkodó képességét, és mind kísérleti, mind pedig klinikai körülmények közt gyorsítja a gyomorfekély gyógyulását. Képes redukálni számos külso noxát, mint pl. az aszpirin, az etanol, a taurokolát hatását, és csökkenti a stressz és az ischaemia gyomor és vékonybél károsító hatását (78, 51, 16). A gyomor valószínuleg nem szintetizál EGF-t, a benne található EGF nagy része a nyálból származik, kisebb részét a Brunner-mirigyek és egy UACL (ulcer-associated cell lineage)-nek nevezett mirigyes struktúra szekretálja (84). A legfontosabb EGF-szeru növekedési faktort, a TGF-? -t a normál gyomorban a nyaki régió mucinosus sejtjei termelik. Az EGF és TGF-? biológiai hatásai hasonlóak, bár az EGF háromszor hatékonyabbnak bizonyult. A TGF-? önmagában is képes fokozni a migrációt, a proliferációt és gátolni a sav secretiot, a TGF-? -val összhangban, pedig in vitro körülmények között a sejt transzformációban van szerepe (69, 85). Az EGF-nek nagy szerepet tulajdonítanak a fekély pathogenesisében és gyógyulási folyamatában, Calabro aktív és inaktív fekélyben is azonos mértéku expressziót mért, míg gyógyult fekélyben azt az egészséges nyálkahártyáéval megegyezo mértékunek találta (7). Ezen kívül, állatkísérletek alapján, szerepet játszhat a portalis hypertensiot követo regenerációban is (118). 17

18 H. pylori fertozés H. pylori által termelt toxikus molekulák Gyulladásos/immun válaszok és Pl.: ureáz, polyliposacharid, phospholipázok, VacA stb. szabad oxigén gyökök felszabadítása, mint pl. a nitrogén-oxid, TNF-?, IL-8, IFM-?, stb. Atrophiás gastritis apoptosis DNS károsodás Intestinalis metaplasia, Sejt proliferáció génmutáció, mint pl. dysplasia p53, bcl-2, stb. Neoplasia 3. ábra H. pylori által indukált apoptosis feltételezett szerepe a gyomor carcinogenesisében. ( ) stimuláció vagy indukció, ( ) gátlás vagy szuppresszió (Xia nyomán) Az EGF és a TGF-? hatásukat egy közös specifikus receptoron fejtik ki. Az EGF receptor gén amplifikációját és fokozott expresszióját többféle tumorban leírták, mint pl. agy, emlo, oesophagus és egyéb fej-nyaki tumorokban is (105, 60, 36, 46, 25). Az EGFR amplifikáció gyomorrákban kevesebbnek bizonyult, mint egyéb humán tumorokban (34). A receptornak két típusa ismert, az I. típusú EGFR expressziója gyomorrákban ritkán, míg a II. típusú EGFR expressziója gyakran fokozott. Utóbbi homológ a c-erb-b2 protooncogennel, ami szerepet játszik az emlo carcinoma 18

19 pathogenesisében és korrelál a relapsussal és a túléléssel (105). Az EGF receptor egy 170 kd-os glycoprotein, áll egy sejtfelszíni ligand-köto domainból, egy egyszeru hydrophob transmembran domainbol és egy sejtplazma tirozin kináz domainbol. Az extracellularis domain köti meg a receptor-specifikus ligandokat és aktiválja a sejtplazma domaint, ami beindít egy cascade folyamatot a sejtplazmából a sejtmag felé, ami végül mitogenezist eredményez. Amikor létrejön a receptor-ligand kötodés, a receptor-ligand komplexek csoportosulása, dimerizációja és internalizációja következik be. Az EGFR egy aktin köto fehérje, ráadásul az EGF által triggerelt signal transductio egyéb cytoskeleton asszociált komponenseket is magában foglal, mint pl. DAG kináz, PI kináz, PLC-?? Ez a kapcsolat a cytoskeleton és az EGF triggerelt cascade között magyarázhatja az EGF indukált sejtmigráció mechanizmusát. (34, 84, 78). Mivel az EGFR foleg az enterocyták basolateralis membránján található meg, normál bélben a lokálisan termelt TGF-? hozzáférhet a receporhoz, ezzel szemben az EGF, ami csak a lumenben van jelen, nem képes hozzáférni a receptorához. Ehhez járul, hogy az EGFR eloszlás a nyálkahártya károsodása során megváltozhat, ami arra utal, hogy míg a TGF-? elsosorban a normál növekedésben és differenciálódásban vesz részt, addig az EGF a repair stimulálásában játszhat nagyobb szerepet (84). Az EGFR expresszió a nyaki régióban a proliferációs zónában az apicalis és basolateralis membránon figyelheto meg, mint a proliferáció stimuláció célpontja, valamint néhány parietalis sejten, ami a lehetséges savsecretio gátlást jelzi (1, 113). Állatkísérletek alapján az EGFR a nyálkahártya károsodás bekövetkezése után a repair mechanizmus késobbi, lassúbb fázisában vesz részt, amikor az elveszett sejtek sejtosztódás által pótlódnak és ebben az EGFR tirozin kináz aktivitása játssza a fo szerepet. Ez a reparatív képesség az öregedés folyamán csökken (61). Gyomorban az EGFR szerepét a legtöbb tanulmány a fekélygyógyulás folyamán illetve a kifejlett gyomorrák eseteiben vizsgálja. A fekélybetegségben és a gyógyulás folyamán is igen magas EGFR expresszió mérheto (a normál nyálkahártyához képest 75-szörös emelkedés), és a gyógyulás után még 1 cm-re az ép mucosaban is emelkedett értékek detectalhatók (113, 78). EGF jelenléte humán gyomorrákban több szerzo adatai alapján is egy magasabb malignitási potenciált tükröz. A fokozott EGFR expresszió rossz prognosztikus jel, gyorsabb nyirokcsomó áttét megjelenésével kell számolni (34, 127, 115, 39). Arról azonban, hogy hogyan változik az EGFR expresszió a carcinogenesis 19

20 során, vagy hogyan befolyásolja annak mértékét a H. pylori infekció, csak kevés és ellentmondásos adat áll rendelkezésre. A H. pylori fertozés kapcsán bekövetkezo változások sorozatában további tisztázásra vár az a kérdés, hogy a H. pylori fertozés hatására kialakuló sejtkinetikai változások mennyire függetlenek az egyed genetikai tulajdonságaitól. Egy esetleges genetikai instabilitás szerepét tisztázhatja a p53 oncoprotein expressziójának vizsgálata. Humán tumorokban valószínuleg a leggyakoribb mutáció a p53 gén mutációja (69). Elofordulása igen gyakori tüdo, oesophagus, hólyag, colon és szájüregi tumorokban, de leírták egyebek között pancreas, gyomor, ovarium és emlo tumorokban is (75, 108). P53 expressziót metastaticus szövetben is sikerült kimutatni (125). A p53 tumorszupresszor gén a 17-es kromoszóma rövid karján található. Szerepe a normális sejtciklus szabályozásában van, a G-S fázisba történo átmenetet gátolja (101). Fél-életideje normális sejtekben rövid, így az általa kódolt fehérje nem éri el a kimutatható mennyiséget. A mutáns p53 gén terméke esetében a fél-életido megno, így az már kimutatható mennyiségben felszaporodhat. Úgy tunik, hogy normális muködés esetén a mucosa károsodásakor a p53 gén aktiválódik, és amíg a hiba nem szunik meg, a sejtproliferáció gátlódik. Ha pedig a hiba hosszabb ideig fennáll, az apoptosis mértéke fokozódik (4, 64). A p53 oly módon képes részt venni a tumor szuppresszióban, hogy leállítja a sejtciklust és ezzel utat ad a DNS repair mechanizmusnak, vagy pedig apoptosishoz vezet (108, 132). Ellentmondásos eredmények születtek arra vonatkozóan, hogy a fokozott p53 expressziónak a carcinogenesis során melyik stádiumban van jelentosége, korai vagy késoi eseménynek tekintendo-e az elváltozás (20, 28, 48, 88, 121). A gyomor adenocarcinomájában a 17p helyen történo mutáció elofordulása 36 és 64% közötti (131). A bekövetkezett mutáció a különbözo területeken homogén eloszlást mutat (5). Csak a vad-típusú p53 képes szupprimálni a ráksejtek burjánzását, a mutáns típus nem. Ezt bizonyítja Matozaki vizsgálata, ami során gyomorrákban azt találta, hogy egy p53 gén elveszett, a megmaradó allélon pedig pontmutáció volt megfigyelheto, és így elveszett a p53 gén produktuma okozta sejtnövekedés szupresszió. A pontmutációt a 173-as és a 251-es kodonokon találta, ami egyéb tumorokban igen ritkán figyelheto meg. Állatkísérletek azt bizonyítják, hogy a vad-típus segít megelozni a H. pylori indukált carcinogenesist is (69, 64). 20

21 A vizsgálatok jelentos része a p53 mutációját csak tumoros elváltozásokban vizsgálja. Ezek alapján megállapítható, hogy intestinalis típusú gyomorrákban sokkal gyakoribb az elofordulása, mint a diffúz típusúban. Az intestinalis típusban észlelheto 50% feletti mutációs arány a tumor stádiumával nem változott, diffúz típusban azonban szignifikánsan magasabb exprssziós arány figyelheto meg az elorehaladott állapotban a korai carcinomához viszonyítva (64, 122). Az intestinalis típusú gyomorrák magasabb incidenciája magyarázhatja, hogy több szerzo beszámol arról, hogy nem talál összefüggést a p53 mutáció megjelenése és a tumor differenciáltsági foka között, ugyanis ezekben a tanulmányok a carcinoma típusát nem veszik figyelembe (48, 64). Több szerzo vizsgálata mutatja, hogy a p53 expresszió összefügg a túléléssel. A közepes p53 indexek jobb prognózist jelöltek, mint a negatív és magas indexek, ahol szignifikánsan alacsonyabb túlélési idot találtak (62, 98, 32). A tumorok pathologiai jellemzoi, mint a nyirokcsomó infiltráció, az invázió mélysége, a nekrózis vagy az érfal érintettség, valamint a tumor stádiuma és differenciáltsági foka azonban nem mutatott szignifikáns eltérést a p53 pozitív és p53 negatív tumorok között (32). Érdekes megfigyelés, hogy erosen dohányzó egyéneknél és vinyl-chlorid expoziciónak kitett személyeknél is magas p53 index figyelheto meg, ami hasznos lehet a tüdocarcinoma és a máj angiosarcomájának korai felismerésében (108). Ellentmondásos eredmények születtek arra vonatkozóan, hogy a carcinogenesis során melyik stádiumban jelenik meg a p53 mutáció. Normál nyálkahártyán p53 expresszió nem figyelheto meg (122, 48, 64), azonban Shiao ép megjelenésu nyálkahártyán 25%- ban detectált p53-at, ami azt mutatja, hogy egészséges egyének mucosáján is elofordulhatnak mutáns p53 gént hordozó sejtek (99). Ellentmondó adatok találhatók a gyomor adenomájára vonatkozóan is, van, aki egyáltalán nem detectált p53 expressziót, van, aki azt már irreverzibilis elváltozásnak találta (56, 128). Néhány tanulmány beszámol arról, hogy már gyulladásban is bekövetkezik a mutáció, sot összefüggés mutatkozik a H. pylori fertozés és a p53 expresszió között (42, 73). Szignifikáns összefüggés figyelheto meg a proliferatív zóna destructioja és a p53 expresszió között is (95). Intestinalis metaplasiaban a p53 akkumuláció a generatív zónában figyelheto meg, 22 és 50% közötti elofordulási arányról számolnak be (65, 99, 73, 28, 119, 42, 128). Még dysplasiában is igen eltéro elofordulási arányokról számolnak be az egyes szerzok, Joypaul és munkacsoportja enyhe és közepes fokú dyspalsiában egyáltalán nem, csak a 21

22 súlyos fokú dysplasiában mutatott ki p53 expressziót, így késoi eseménynek tekinti a p53 mutációt a gyomor carcinogenesisében (48), Miracco szintén csak súlyos fokú dysplasiában talált p53 expressziót (66). Mások dysplasiában akár 67 %-os incidenciát is kimutattak, így ok korai eseménynek tartják a soklépcsos folyamatban (99, 64, 119). Wu és munkatársai pedig az intestinalis típusú carcinoma mellett megtalálható metaplasiás területeken talált p53 expressziót, a diffúz típusnál nem, így az intestinalis típusú carcinoma kialakulása során korai eseménynek, diffúz típusú carcinoma kialakulása során pedig késoi eseménynek tekinti (121). Azzal, hogy ismertté vált az összefüggés a H. pylori fertozés és a fekélybetegség illetve a gyomorrák pathogenesise között, új therapias lehetoség került elotérbe. Mivel rendelkezünk a kórokozó ellen hatékony antibiotikummal, kézen fekvonek tunt a megoldás a kezelést illetoen. Fekélybetegségben a kórokozó kiirtása sokszor végleges gyógyuláshoz vezet, gyomorrák esetében azonban ez nem jelent megoldást, és jelenleg csak akkor van esélyünk sikerre, ha a kórokozó eradikációjára irányuló therapia még abban a stádiumban történik, amikor még nem következett be irreverzibilis elváltozás. Így kulcsfontosságú annak tisztázása, hogy a carcinogenesis soklépcsos folyamatának melyik stádiumában lehet még visszafordítani a H. pylori okozta sejtkinetikai változásokat, és fontos lenne egy (vagy több) olyan mutatót találni, amely jelzi ezt a pontot. Az eradikációs kezelés hatásáról született eddigi eredmények meglehetosen ellentmondásosak. Született olyan eredmény, ahol intestinalis metaplasiában a proliferáció üteme eradikáció után már nem csökkent vissza a normális mértékure, arra utalva ezzel, hogy ebben a stádiumban a proliferáció fokozódás már a baktériumtól független (38). Leung és munkatársai ezzel szemben azt találták, hogy kezelés után a gyorsult sejtproliferáció intestinalis metaplasiaban is és nem mataplasticus szövetben is szignifikánsan csökkent, az apoptosis ütemének helyreállását azonban csak a nem metaplasticus szöveten tapasztalták, intestinalis metaplasiaban változatlan maradt (59). Xia összefoglaló tanulmányában azt állapítja meg, hogy az eradikációs kezelés intestinalis metaplasiaban is visszacsökkentette az apoptosist (124), míg Moss sikertelen eradikációs kezelés után is a mutatók normál értékekhez való közelítését észlelte (69). 22

23 3. 2 Célkituzések A H. pyori fertozés carcinogenesisben betöltött szerepével igen nagy számú tanulmány foglalkozik, eredményeik azonban sokszor kulcsfontosságú kérdésekben is ellentmondásosak. Dolgozatomban igyekeztem összegezni az irodalomban jelenleg leginkább elfogadott eredményeket és álláspontokat. Munkám egyik célja volt megvizsgálni, hogy a H. pylori fertozés milyen módon vezethet a homeostasis felborulásához. A proliferatív és apoptoticus folyamatok párhuzamos mérésével igyekeztem tisztázni, hogy a H. pylori a proliferáció fokozásán keresztül vezethet-e carcinoma kifejlodéséhez, vagy a hyperproliferáció csak a fertozésre adott nem specifikus gyulladásos válasz részjelensége, esetleg képes direkt módon apoptosist indukálni, és atrophiás gastritis kifejlodése révén fokozni a gyomorrák kockázatát. A sejtosztódás vizsgálatára két módszert is alkalmaztam. A már elfogadott, ám idoigényes és drága immnuhistochemiai technika, a PCNA mellett AgNOR technikával is mértem a sejtosztódás ütemét. Az eredmények összevetésével igyekeztem bizonyítani, hogy az AgNOR technika gyors, olcsó és megbízható módszer, így jól alkalmazható a mindennapi klinikai gyakorlatban is. A gyomor carcinogenesisében legnagyobb probléma megadni azt a pontot, ahol a preneoplasticus laesio malignussá változik. Mivel a gyomor esetében még nem sikerült egy olyan kulcsfontosságú mutációt kimutatni, mint pl. az APC oncosupressor gén mutációja a colon carinogenesie során, további célkiuzés volt megvizsgálni a H. pylori által okozott genetikus instabilitás esetleges szerepét is. Ezzel párhuzamosan megmértem, hogy hatással van-e a H. pylori fertozés az EGR expresszióra, és ez összefüggésben áll-e a sejtkinetikai paraméterek változásaival. A kutatómunka további feladata volt, hogy fényt derítsen arra, hogy a proliferációs és apoptoticus aktivitás, a p53 oncoprotein expresszió és az EGFR expresszió hogyan változik a premalignus laesioként ismert intestinalis metaplasiában. Az így kapott eredményeket összehasonlítottam a nem metaplasticus, valamint a tumoros epitheliumon mért eredményekkel. 23

24 Munkám célja volt ezen kívül, hogy megvizsgáljam a H. pylori eradikációs kezelésének hatását a fent említett paraméterekre, és megjelölni azt a pontot, ahol az elváltozások még reverzibilisek és a kezelés elvégzése feltétlenül szükséges.? 24

25 4. Beteganyag és módszerek 4. 1 Beteganyag? A vizsgálatban 121, a II. Belklinika Gastroenterologiai Ambulanciáján a has felso részére lokalizálódó panaszok miatt jelentkezett, és felso panendoscopos vizsgálatra került beteg vett részt. Átlagos életkoruk 58,5 + 14,3 év volt, közülük 60 férfi és 61 no. A legfiatalabb beteg 24, a legidosebb 90 éves volt. A kiválasztott betegek egyike sem volt korábban ismert fekélybeteg, nem részesült eradikációs kezelésben és nem szedett tartósan nem szteroid gyulladás gátlót sem. (1. táblázat). A vizsgálat idopontjában a betegek 6,6 %-a számolt be rendszeres, 33 %-a alkalmankénti alkohol fogyasztásról, 32,2 %-uk napi 5-15 szál cigarettát szívott. Nemek szerinti megoszlás (ffi/no) 60/61 Átlagéletkor 58,5 + 14,3 Eradikációs kezelésben részesültek 44 Ebbol sikeres eradikáció 36 Összesen 121 eset 1. táblázat A vizsgált betegek nem és életkor szerinti eloszlása, eradikációs kezelésben részesültek száma A betegeket a gastroscopiákat végzo szakorvos szóban és írásban tájékoztatta a vizsgálat menetérol, majd a betegek írásbeli beleegyezésüket adták. Minden betegnél rutin felso gastroscopia történt. A vizsgálatokat Olympus GIF V2 és Olympus CFQ-140 készülékekkel végezték. A vizsgálatok során biopsziás mintát vettek az antrumból, amelyet azonnal formalinban fixáltak, majd az I. sz. Pathológiai és Kísérleti Rákkutató Intézetben paraffinba ágyaztak, itt történt az esetek szövettani értékelése is, amelyet minden esetben pathológus végzett. Itt készültek a 3? m vastag metszetek, majd a szövettani feldolgozáshoz haematoxylin-eosin festéssel festették meg oket. Ezek értékelésekor a metszeteket négy csoportba soroltuk be, a következo képpen: ép 25

26 nyálkahártya, gyulladás, intestinalis metaplasia és carcinoma. Minden metszetet megvizsgáltak módosított Giemsa festéssel is, így 52 esetben volt megállapítható H. pylori pozitivitás. A 121 eset szövettani feldolgozásának eredményét a 2. táblázat foglalja össze. Ép nyálkahártya 15 Gastritis, intestinalis metaplasia nélkül - H.pylori negatív 34 Gastritis, intestinalis metaplasia nélkül - H.pylori pozitív 40 Gastritis, intestinalis metaplasiával H.pylori negatív 12 Gastritis, intestinalis metaplasiával H.pylori pozitív 12 Carcinoma 8 Összesen 121 eset 2. táblázat A vizsgált esetek szövettani diagnózis szerinti eloszlása Azokban az esetekben, ahol a szövettan H.pylori pozitivitást talált, az eradikációs kezelés lehetoségét az elso Maastrichti Consensuson tett javaslat alapján mérlegelték (63), így összesen 44 esetben történt kezelés. Ez egy hétig tartó, hármas kombinációval történt: 2 x 1g amoxycillin + 2 x 0,5g clarythromycin + 2 x 20mg omeprazole. Négy héttel a kezelés befejezése után kontroll endoscopia és biopszia vétel történt. Az eradikáció sikerességének leméréséhez elvégezték a 13 C-urea kilégzési tesztet is (Infrared spectrophotometer, Wagner Analytic System, Germany). A kezelés 36 esetben volt elso próbálkozásra sikeres A sejtproliferáció vizsgálata A sejtproliferációt kétféle módszerrel vizsgáltuk: az egyik egy immunhistologiai módszer, a PCNA volt, amely idoigényes, de korábbi tanulmányainkban már sikeresen alkalmaztuk (111), a másik pedig az AgNOR technika volt, amely egyszeru, gyorsan kivitelezheto és szintén elvégezheto paraffinba ágyazott metszetekbol. 26

27 PCNA meghatározás A paraffinba ágyazott biopsziákból 3? m vastagságú metszetek készültek. A metszeteket xylolban történt deparaffinálás után leszálló alkoholsorban rehydráltuk. Ezután 3%-os H 2 O 2 -ban 5 percig endogén peroxidáz bénítás történt, amit kétszer 5 perces PBS-es lemosás után ph 7,5-os citrát pufferben való inkubálás követett mikrohullámon (5 percig, 75O W-on). Ezt újból kétszer 5 perces PBS-es lemosás követte, majd a nem specifikus ellenanyagokat 1%-os bovin szérum albuminnal gátoltuk szobahon, nedves kamrában 20 percig. Ezt az elsodleges antitesttel történo inkubáció követte (Monoclonal Mouse Anti PCNA Clone PC 10, DAKO), 37 fokon, 90 percig, nedves kamrában, 1:80-as higításban. Majd háromszor 5 perces PBS-es lemosás következett. Ezután a metszeteket 30 percig biotinnal jelölt másodlagos antitesttel inkubáltuk szobahon 60 percig, ismét öblítettük PBS-ben kétszer 5 percig, majd a metszeteket 37 fokon 25 percre streptavidin peroxidázba helyeztük. Újabb kétszer 5 perces PBS-es lemosás után a metszeteket chromogénnel elohívtuk, chromogénként 3- amino-9-ethylcarbazolt használtunk, majd haematoxylines háttérfestést alkalmaztunk. Pozitív kontrollként ismert PCNA-pozitív metszetet használtunk, negatív kontrollként pedig az egyik metszetet elsodleges antitest helyett PBS-ben hagytuk. Az értékelésnél az elváltozást reprezentáló területrol 40-szeres nagyítás mellett 1000 sejtet számoltunk meg, a pozitívan festodött sejtek számát százalékos arányban adtuk meg.? A nucleolaris organizátor régiók detektálása Az egylépcsos ezüstözési technikát Crocker után kis módosításokkal végeztük (15). A paraffinba ágyazott biopsziákból ebben az esetben is 3? m vastagságú metszetek készültek. A metszeteket ennél a módszernél is xylolban deparaffináltuk, majd leszálló alkoholsorban rehydráltuk. A mintákat ezután 32 percig inkubáltuk sötétkamrában, frissen eloállított ezüst kolloid használatra kész oldatában. Az optimális festési idot szigorú ellenorzés mellett elozetesen határoztuk meg. Az oldatot a következo képpen készítettük: 50 ml desztillált vízben 1 g zselatint feloldottunk, ehhez 0,8 ml hangyasavat 27

28 adtunk (I.oldat); 50ml desztillált vízben 25 g AgNO 3 -ot feloldottunk (II.oldat); az I.oldatból 25 ml-t adtunk a II.oldat 50 ml-éhez. Háromszor 1 perces desztillált vizes lemosás és leszálló alkoholsorban történt dehydrálás, majd xylolos tisztítás után a metszeteket lefedtük. Ellenfestésre nem volt szükség. Ezt követoen 100-szoros nagyítású, immersios lencsét használva, metszetenként 200 sejtmagot megvizsgálva, abszolút AgNOR számot számoltunk a mirigyek nyaki régiójában. A NOR régiók detectálásra elozetesen kipróbáltuk az Öffner által javasolt nedves autoklávban történo elokezelést is (77), ám az elokezelt és az elokezelés nélkül egy lépcsoben festett metszetek eredményei között nem volt különbség, így azt a továbbiakban szükségtelennek láttuk alkalmazni Apoptosis vizsgálata Az apoptosis vizsgálatára számos cég kidolgozott jól alkalmazható és már bevált módszereket (pl. caspase-ok és az ezzel összefüggo reagensek, Fas ill. Fas ligand család tagjai, Bcl-2 család tagjainak vizsgálata, DNS festés permeabilizálás után ill. anélkül, stb.). Módszerünk kiválasztásánál fontos szempont volt, hogy a vizsgálatot el tudjuk végezni a már meglévo, paraffinba ágyazott biopsziákból, valamint a reagensek árát is figyelembe kellett vennünk A TUNEL reakció A reakció elvégzéséhez módosításokkal a Gavrieli szerint leírt metodikát alkalmaztuk (26). A metszeteket ebben az esetben is eloször deparaffináltuk xylolban, majd rehydráltuk felszálló alkoholsorban. Desztillált vízben 5 percig mikrohullámon (370 W) antigén feltárást végeztünk. Ezután a mintákat 20 percig proteináz K-val emésztettük (20? g/ml) szobahomérsékleten, majd kétszer 10 perces PBS-es lemosás után endogén peroxidáz bénítás következett 3%-os H 2 O 2 / methanolban 30 percig szobahon. Kétszer 10 perces PBS-es lemosás után a metszeteket elokezeltük 5 percig szobahon terminális 28

29 transfer pufferrel (200 mmol/l kálium cacodylate, 25 mmol/l TRIS-HCl, ph 6,6, 0,2 mmol/l EDTA, 0,25 mg/ml bovin serum albumin), majd TUNEL reakció eleggyel inkubáltuk (terminális transferase puffer, 1 mmol/l CoCl, 0,01 nmol biotin 16-dUTP és 0,5 U/? l terminális transferase (Boehringer Mannheim, Germany)). A reakcióelegy fényérzékeny, így a lemezeket alufóliával takartuk a reakció ideje alatt. A reakciót nátrium klorid (300 mmol/l) és nátrium citrát oldattal (30 mmol/l) állítottuk le. Ezután inkubáció következett peroxidáz conjugált anti-digoxigenin Fab fragmentekkel 1:300 koncentrációban 100 mm TRIS-HCl, 150mM nátriumban, ph 7,6 30 percig. Háromszor 5 perces PBS-es lemosás következett. Elohíváshoz a metszeteket 3-6 percre DABoldatba helyeztük, háttérfestésnek haematoxylint alkalmaztunk, majd lefedés következett. Pozitív kontrollként a TUNEL reakció elegy használata elott 10 percig DNázzal inkubált mintát használtunk (1? g/ml). Negatív kontrollnál pedig a TUNEL reakcióeleggyel való inkubálást kihagytuk. Minden metszeten 1000 sejtet számoltunk meg, az apoptoticus indexet a pozitívan festodött sejtek százalékos aránya adta EGFR kimutatás Az EGFR receptorok detectálására ismét immunhistochemiai módszert alkalmaztunk. Deparaffinálás és rehydrálás, majd kétszer 5 perces desztillált vizes lemosás után 30 percig szobahomérsékleten 30%-os H 2 O 2 és methanol 1:100 arányú keverékében endogén peroxidáz blokkolást végeztünk. Kétszer 5 perces PBS-es lemosás után antigén feltárás következett ph 6, 0,01 M-os citrátpufferben kétszer 7 percig, mikrohullámon (700 W). A nem specifikus ellenanyagok blokkolására anti-nyúl szérumot használtunk nedves kamrában, szobahomérsékleten, 20 percig. Ezután következett az elsodleges antitesttel történo inkubálás (EGFR (1005)-G: sc-03-g, Santa Cruz Biotechnology, Inc.) 90 percig nedves kamrában, 37 fokon. Ezt háromszor 5 perces PBS-es lemosás követte, majd a biotinilált másodlagos antitesttel inkubáltuk a metszeteket szobahomérsékleten, 60 percig, szintén nedves kamrában. Kétszer 5 perces PBS-es lemosás után 60 percre streptavidin peroxidázzal fedtük a metszeteket, továbbra is szobahomérsékleten, majd az ismételt lemosás után következett a DAB-bal történo elohívás, ami 10 másodpercenkénti mikroszkópos ellenorzés mellett 2 perc után tunt a 29

30 legmegfelelobbnek metszeteink esetében. Csapvizes lemosás után haematoxylines háttérfestést alkalmaztunk. Felszálló alkoholsorban történt dehydrálás után a metszeteket négyszer 1 percre helyeztük xylolba, majd DePex-szel fedtük le azokat. Pozitív kontrollként ismert EGFR pozitív chronikus pancreatitisbol származó metszeteket használtunk, negatív kontrollként pedig egy metszetet elsodleges antitesttel való inkubálás helyett PBS-ben hagytunk. A kiértékelésnél a többi módszerhez hasonlóan jártunk el: 40-szeres nagyítás mellett az elváltozást reprezentáló területrol történt 1000 sejt megszámlálása után a pozitívan festodo sejtek arányát százalékosan adtuk meg Oncoprotein expresszió vizsgálata - p53 kimutatás Az elozo vizsgálatnál leírtakhoz mindenben hasonlító immunhistochemiai módszert alkalmaztunk ebben az esetben is. A 3-5? m vastagságú metszeteket deparaffináltuk és rehydráltuk xylolban és leszálló alkoholsorban. Ezt endogén peroxidáz bénítás követte 3%-os H 2 O 2 /methanol keverékében, 30 percig. PBS-ben való lemosás után antigén feltárás következett, a metszeteket 2 x 7 percig kezeltük mikrohullámon, citrátpufferben (0,01M, ph 6). Kihulés után ismét mosás következett PBS-ben, majd a metszeteket 20 percig inkubáltuk normális nyúl szérummal nedves kamrában. Ezt a liofilizált elsodleges antitest alkalmazása követte, teljes éjszakai inkubációs idovel (Novocastra, UK). PBS-es lemosás után 30 percig inkubáltuk a metszeteket biotinilált nyúl anti-egér másodlagos antitesttel. Ismét lemosás következett, majd a metszeteket ABC-vel (avidinbiotin-complexszel) fedtük 30 percre. Chromogénként DAB-ot, háttérfestésnek haematoxylin-eosint alkalmaztunk, majd dehydrálás után fedtük a lemezeket. Pozitív kontrollként ismert p53 pozitív kissejtes tüdorákot használtunk, negatív kontrollként pedig ugyanilyen metszetet elsodleges antitest helyett PBS-be helyeztünk. A metszetek értékelése is az eddigiekhez hasonlóan történt, a kiválasztott területrol megszámlált 1000 sejtbol adtuk meg a pozitívan festodoek százalékos arányát.? 30

31 4. 6 Statisztikai módszerek Az egyes paraméterek jellemzése a középértékek és a szórások megadásával történt. Az adatok elemzésekor egyváltozós variancia anlízist (Kruskal-Wallis) és LSD (legkisebb négyzetes eltérés) tesztet alkalmaztunk. A paraméterek és a szövettani csoportok közötti összefüggéseket Pearsons-féle korrelációs koefficiens számolásával elemeztük. Az alkalmazott proliferációs módszerek összehasonlításánál kiszámítottuk a Spearman-féle rangkorrelációs együtthatót is, ami robosztusabb eredményt ad, mivel a rangsorolással kiküszöböli az adatok tényleges eloszlásának a hatását. A null hipotézist minden esetben p < 0,050 szignifikancia szint esetén vetettük el. A számítások a CSS Statistica (Statsoft, USA) software segítségével készültek. 31