Budapesti Műszaki és Gazdaságtudományi Egyetem Vegyészmérnöki és Biomérnöki Kar Alkalmazott Biotechnológia és Élelmiszertudományi Tanszék

Átírás

1 Budapesti Műszaki és Gazdaságtudományi Egyetem Vegyészmérnöki és Biomérnöki Kar Alkalmazott Biotechnológia és Élelmiszertudományi Tanszék Írta: NÉMETH ÁRON Lektorálta: REZESSYNÉ SZABÓ JUDIT IPARI MIKROBIOLÓGIA Egyetemi tananyag 2011

2 COPYRIGHT: , Dr. Németh Áron, BME Vegyészmérnöki és Biomérnöki Kar Alkalmazott Biotechnológia és Élelmiszertudományi Tanszék LEKTORÁLTA: Dr. Rezessyné Szabó Judit, Budapesti Corvinus Egyetem Creative Commons NonCommercial-NoDerivs 3.0 (CC BY-NC-ND 3.0) A szerző nevének feltüntetése mellett nem kereskedelmi céllal szabadon másolható, terjeszthető, megjelentethető és előadható, de nem módosítható. TÁMOGATÁS: Készült a TÁMOP /2/A/KMR számú, Multidiszciplináris, modulrendszerű, digitális tananyagfejlesztés a vegyészmérnöki, biomérnöki és vegyész alapképzésben című projekt keretében. KÉSZÜLT: a Typotex Kiadó gondozásában FELELŐS VEZETŐ: Votisky Zsuzsa AZ ELEKTRONIKUS KIADÁST ELŐKÉSZÍTETTE: Benkő Márta ISBN KULCSSZAVAK: biotechnológia, ipari mikrobiológia, alkalmazott mikrobiológia, mikrobiológiai műveletek, mikrobiális anyagcsere, mikrobiális rendszertan, ipari baktériumok, ipari gombák, ipari algák, kevert tenyészetek alkalmazása. ÖSSZEFOGLALÁS: Az elmúlt években vitathatatlan biotechnológiai fejlődésnek voltunk és vagyunk tanúi, amely fejlesztések során mindig feltűnnek a mikroorganizmusok, akár mint termelő biokatalizátorok, akár mint termékek, vagy egyre gyakrabban mint gén/enzim források. Ennek köszönhetően a biotechnológiai/biomérnöki képzésben az Általános mikrobiológiát egy specifikus Ipari mikrobiológia követi, amelynek célja rendszerezetten összefoglalni a mikrobák nyújtotta lehetőségeket, potenciálokat, illetve az ezek kiaknázásához szükséges alapismereteket. Ezt szem előtt tartva a jegyzet először a bevezetés után a mikroorganizmusokkal és kezelésükkel kapcsolatos műveleteket és alapismerteket (fiziológiai, biokémiai) tekinti át, majd pedig a mikrobiális rendszertant követve abból kiemelve az ipari vonatkozású törzseket bemutatja a mikrobákban rejlő ipari lehetőségeket, és utal a már működő technológiákra.

3 Tartalom 3 TARTALOM 1. ALAPISMERETEK, IPARI MIKROBIOLÓGIAI MÓDSZEREK Bevezetés az ipari mikrobiológiába... 5 Vörös biotechnológia... 5 Fehér biotechnológia... 6 Zöld biotechnológia... 6 Esettanulmány 1. Lizingyártás... 7 Esettanulmány 2. 1,3-propándiolgyártás (Ipari) Mikrobiológiai műveletek Törzsizolálás Törzsfenntartás Törzs-screening Identifikáció Törzsfejlesztés Mikroorganizmusok ipari alkalmazása Az oxigén szerepe Aerobok tenyésztése Anaerob fermentációk (erjesztések) Szubmerz kontra felületi fermentáció AZ IPARI MIKROBIOLÓGIA BIOKÉMIAI ÉS FIZIOLÓGIAI HÁTTERE Szénforrások hasznosulása, különleges metabolizmusok C1-források hasznosulása C2-metabolizmus C3-metabolizmus C4-metabolizmus C5-metabolizmus C6-metabolizmus C7-metabolizmus Speciális energianyerő metabolizmusok (biometallurgy) Primer metabolitok Szekunder metabolitok De novo szekundermetabolit-termelés Szteroid- (szekunder metabolit) konverzió AZ IPARI MIKROORGANIZMUSOK ÉS TECHNOLÓGIÁK TÁRGYALÁSA TÖRZSRENDSZERTANBA ILLESZTVE Mikrobiális rendszertan Klasszikus rendszertan Filogenetikus rendszertan Bakteriális filogentika A baktériumok törzsének elágazási sorrendje Az indelmodell megbízhatósága és prediktív lehetőségei Ipari szempontból fontos (ős)baktériumok Archeák Firmicutes Actinobacterek Thermotoga Fusobacteriumok Deinococcus-Thermus Chloroflexi Cyanobacterek Spirohaeták , 12,. 13. Chlorobik, Fibrobacterek, Bacteroidesek... 82

4 4 1. Alapismeretek, ipari mikrobiológiai módszerek 14., 15., 16. Planctomyceta-k, Verrucomicrobiumok, Chlamydiák Aquificae , 19., 20., 21., 22. Proteobacterek Ipari szempontból fontos gombák Basidomycotak Ascomycotak Zygomycotak Iparilag jelentős algák Vegyes tenyészetek alkalmazása A vakcinagyártás mikrobiológiája A MIKROORGANIZMUSOK IPARI FELHASZNÁLÁSÁNAK ETIKAI ÉS KOCKÁZATI KÉRDÉSEI KITEKINTÉS SZÓSZEDET ÖNELLENŐRZŐ KÉRDÉSEK AZ IPARI MIKROBIOLÓGIA CÍMŰ JEGYZETHEZ Tesztmegoldó kulcs HIVATKOZÁSOK ÁBRÁK, ANIMÁCIÓK, VIDEÓK, TÁBLÁZATOK JEGYZÉKE Ábrák, animációk, videók Táblázatok

5 1. Alapismeretek, ipari mikrobiológiai módszerek 5 1. ALAPISMERETEK, IPARI MIKROBIOLÓGIAI MÓDSZEREK 1.1. Bevezetés az ipari mikrobiológiába Az 1990-es években sok olyan jóslat látott napvilágot, melyek szerint a XXI. sz. a biotechnológiai forradalmat követően a biotársadalommal lesz jellemezhető. Valóban, az utóbbi évtizedek mikrobiológiai, biokémiai, genetikai, molekuláris biológiai és biotechnológiai fejlesztései lassan a hétköznapi emberhez is ilyen vagy olyan formában eljutnak, és különösen a környezetvédelmen keresztül szélesebb társadalmi csoportokban is érezhetővé válnak. A biotechnológiát amely tehát a Biotársadalom meghatározó része sokféleképpen definiálták már. Talán a legegyszerűbb úgy megadni, mint egy olyan fogalom, amely a biológiai rendszerek emberi célú (gyakran termelés orientált) felhasználását jelenti. Annak bemutatására, hogy az utóbbi évtizedekben mekkorára duzzadtak a biotechnológia kutatási és alkalmazási területei az táblázatban került összefoglalásra a különböző szakterületeket jelző színkódrendszer táblázat: Színkódrendszer a Biotechnológiai területek jelölésére Szín Biotechnológiai kutatási és alkalmazási terület Vörös Egészségügyi, orvosi, diagnosztikai biotechnológia Fehér Ipari biotechnológia Zöld Mezőgazdasági, környezetvédelmi biotechnológia Kék Vízparti és tengeri biotechnológia Barna Száraz, sivatagi biotechnológia Fekete Bioterror, biológiai fegyverek Bíbor Biotechnológiai találmányok, szabadalmak Sárga Élelmiszer- és táplálkozástani biotechnológia Arany Bioinformatika, nanotechnológia Szürke Klasszikus fermentáció és Bioprocess Noha az egyes színek használata még nem széleskörűen elterjedt, és olykor diszkrepanciával terhelt, a táblázatban szereplő első három területet már szinte egy évtizede e három színkóddal jelölik, ezért ezeket hasonlítjuk össze az alábbiakban az ágazatot jellemző termékek, mikrobiológiai, biokémiai és technológiai igények szempontjából. Vörös biotechnológia Mivel a vörös biotechnológia termékeit az egészségügyben gyógyászati célokra használják (diagnosztikumok, vakcinák, gyógyszerek), ezért termékoldalról kis mennyiség nagy érték (low volume high value) jellemzi őket. Ez azt jelenti, hogy az éves világtermelés termékenként néhány száz tonna, amelyek ára viszont igen magas (penicillin: $/kg, vakcinák: $/dózis). A vörös biotechnológiai termékek előállításakor legyenek azok (rekombionáns) fehérjék vagy biokonverzióval nyert másodlagos anyagcseretermékek (ld. később) enzimeket vagy nyugvó-, illetve aktívan szaporodó tenyészeteket használnak. Biokémiai szempontból a termelő törzsekkel szemben támasztott követelmény, hogy jó hozammal, kevés szennyező melléktermék kíséretében termeljék a célterméket. Ezt gyakran törzsfejlesztéssel érik el, illetve a termelő mikroorganizmussal szemben támasztott másik mikrobiológiai elvárás gyakran a jó expressziós képesség (megfelelő fehérjeszerkezet kialakítása mind a 4 szinten 1, lehetőleg extracellulárisan). Technológiai oldalról talán a legmeghatározóbb a minőség- 1 Fehérjeszerkezet 4 szintje: Elsődleges szerkezet: aminosavsorrend; másodlagos sz.: hosszabb szakaszok térrendeződése a-hélix vagy b-redő formába; harmadlagos szerkezet: 3D feltekeredés, amelyet másodlagos kötések stabilizálnak; negyedleges: alegységek kapcsolódási szerkezete (pl.: )

6 6 Ipari mikrobiológia biztosítás, amelynek szinte mindent alárendelnek, és amely a költségeket is jelentősen befolyásolja (=mindig ugyanolyan kiváló minőség). Fehér biotechnológia A fehér biotechnológia célja a vegyipar kifehérítése, azaz környezetkímélőbbé tétele. Ez céljaiban hasonló a széleskörűen használt zöldkémia kifejezéssel, ám míg ez utóbbi a kémiai szintézisek környezetkímélőbbé tételét kívánja elérni, addig a fehér biotechnológia a kémiai szintézisek mellett biológiai gyártásokat kíván a vegyiparban meghonosítani, mivel ezek energiaigénye és környezetterhelése általában kisebb az azonos terméket előállító vegyipari eljárásnál. A vegyipar jelenleg is fennálló struktúrája kőolajalapú, azaz ásványi olajból nyerik finomítással az elsődleges alapanyagokat, illetve az energiát is. Ennek analógiájára a fehér biotechnológia eredményeit felhasználva kb. egy évtizede terjed a biofinomító elnevezés, amely tehát olyan biokombinát, amely megújuló alapanyagból fedezi a nyersanyag- és energiaigényét is. A biofinomítókhoz szorosan kapcsolható a platformalkotó vegyület fogalma, amelyet olyan vegyületekre használunk, amelyeknek egy sor piacképes, értékes származékát konvencionális vegyipari folyamatokkal elő lehet állítani. A platformvegyületeket általában szénatomszám szerint csoportosítják, így léteznek C3-C4-C5-C6-C7 platformok. A biofinomítók gyakran biológiai úton megújuló nyersanyagból ilyen platform kemikáliát állítanak elő. A fehér biotechnológia termékeit is a vegyipari termékekhez hasonlóan amelyek más iparágak (kozmetikai, oldószer, polimer iparok) viszonylag olcsó tömeges alapanyagaiként szolgálnak a nagy tömeg kis érték (high amount low value) jellemzi, és általában de novo fermentációs eljárással készülnek (pl.: oldószerek 0,4-1,4 $/kg). Biokémiai szempontból az olcsó tömegtermékek miatt a jó szubsztráthasznosulás még fontosabb, illetve a megfelelő metabolikus utak aktiválása és a többi inaktiválása is csökkenti a feldolgozási (downstream) és termékkinyerési költségeket. Mikrobiológiai szempontból a termelő törzs terméktoleranciája fontos, és a törzsfejlesztésnek itt is fontos szerepe van. Technológiai aspektusból az abszolút költséghatékonyság a cél mindenekfelett (olcsó up/downstream). A kis termelői és kereskedelmi árrés miatt a hatékony technológia mellett nagy mennyiségek előállítása, azaz nagy termelőkapacitások szükségesek minimális műveleti lépés mellett. Zöld biotechnológia A zöld biotechnológiába korábban beleértették a környezetvédelmi, mezőgazdasági és élelmiszer-ipari ágazatokat, ám ezek lassan külön színkódot kapnak. Az viszont mindegyikre igaz, hogy a termékeik nagy tömegben kerülnek előállításra kicsi vagy közepes értékkel (takarmányok, étrend- kiegészítők, biopeszticidek, talajjavítók stb.). Biokémiai szempontból a speciális ízek kialakításhoz az egy termékű de novo fermentációk helyett a heterofermentatív anyagcseréjűek kedvezőbbek, illetve a speciális tápértékek kialakításához különböző anyagok (fehérjék, vitaminok) akkumulációjára képes mikrobák kerülnek felhasználásra. Olykor enzimes technológia is előfordul (izocukorgyártás). Ehhez mikrobiológiai szempontból különösen a biopeszticidek gyártásakor szükséges továbbá a haszonnövény-károkozó viszonyának, és a károkozás mechanizmusának ismerete. Technológia szempontból különösen az élelmiszer-ipari termékeknél a minőségbiztosítás ismét jelentős szerephez jut, amely erősen felhasználó centrikus (kedvező színű, szagú, halmazállapotú termék). A fenti BIOTECHNOLÓGIAI példákon igyekeztünk demonstrálni, hogy noha a biotechnológia mára egy sok területet átölető ágazattá vált, az egyes szakterületek közös pontja a MIKROBA, amely az egyes technológiákat és termékeket alapvetően befolyásolja. Például egy tejsav-fermentációnál az alkalmazott tápközegnek olcsónak kell lennie, de a mikroba valamennyi igényét (C, N, vitaminforrás) ki kell elégítenie úgy, hogy a feldolgozási műveletek a lehető legegyszerűbben (és legolcsóbban) nyerhessék ki a terméket. Ahhoz, hogy a biotechnológia kulcsszereplőjét, a mikrobát megismerjük, és céljainknak megfelelően a leghatékonyabban kihasználjuk, a mikrobatudománnyal, de legalább annak ipari mikrobiológiai részével kell tisztában lennünk.

7 1. Alapismeretek, ipari mikrobiológiai módszerek 7 E jegyzet célja, hogy az iparban használatos mikrobiológiai műveleteket, élettani jelenségeket, potenciálokat bemutassa. A napjainkban egyre nagyobb méretet öltő szövettenyésztési eljárások azonban nem kerülnek tárgyalásra. Amint azt a vörös/fehér/zöld biotechnológia rövid bemutatásánál láttuk, az ipari mikrobiológia 3 tudományterület között elhelyezkedő interdiszciplináris tudomány: Biokémia, Mikrobiológia, Mérnöki tudományok ( ábra) ábra: Az ipari mikrobiológia helye a tudományban Az ipari mikrobiológia tárgya tehát szükségképpen a termelő mikroorganizmusok (természetes és rekombináns törzsek, illetve kevert tenyészetek), valamint a hozzájuk kapcsolódó (mikrobiológiai) műveletek. Bevezetésként következik két esettanulmány az ipari mikrobiológia eredményeinek demonstrálására. Esettanulmány 1. Lizingyártás [1] O HO NH 2 NH ábra: A lizin képlete A lizin egy esszenciális aminosav ( ábra), ezért előállítása mind az állati takarmányozás, mind a humán élelmezés szempontjából fontos. A lizinpiac évi t terméket produkál, amely évente további 5-7%-kal bővül (2005). Az előállítás első kulcslépése a fermentáció. Ezt glükóz/szaharóz- vagy melaszalapon végzik, és 30-40%-os hozammal képződik a lizin ( g/l koncentrációban). A fermentációt Corynebacterium glutamicum-mal végzik, amelyet először 1956-ban izoláltak egy korabeli új módszer segítségével (bioautográf technika) glutaminsavtermelés céljából. A módszer lényege, hogy az izolátumokat Petri-csészében lévő agar tápközegen kinövesztik, replika módszerrel a Petri-csészéről másolatot készítenek, majd a másolaton kinőtt telepeket UV-val elölik, végül föléje egy

8 8 Ipari mikrobiológia újabb agaros tápközeget rétegeznek, amelybe a keresett metabolitra hiánymutáns mikrobát szuszpendálnak, és újra inkubálják. Ennek következtében az elölt izolátumok már nem, a hiánymutánsok pedig csak ott fognak kinőni a 2. agar felszínén, ahol az alsó agaron kinövesztett izolátum a hiányzó metabolitot termelte ( animáció) [2]. Számos izolátum vizsgálatából kiderült, hogy a glutaminsav-termelők lizintermelésre is alkalmasak, mert mindkét aminosav a citrátkör (TCA ciklus) intermedieréből eredeztethető ( ábra) animáció: A bioautográf módszer A mikroorganizmus által szénforrásként elfogyasztott cukrok a glikolízisen keresztül bomlanak le piroszőlősav foszfoenolpiruvát acetil-koenzim-a útvonalon. Az utóbbi molekula az acetilcsoportját egy oxálecetsavnak átadva citromsavat hoz létre, amely két lépésben dekarboxileződik (2 széndioxid keletkezése közben) és oxálecetsav marad vissza, a következő acetil-csoport eloxidálására. A körfolyamat egyes intermedierjei azonban az aminosavfermentáció esetén beépülnek az előállítandó aminosavba, így a körfolyamat megszakadna. Ennek ellensúlyozására működnek az anaplerotikus (feltöltő) reakciók, amelyek szintén a cukrokból a piruváton át vagy akár a foszfoenolpiruvátból közvetlenül is oxálecetsavat termelnek. Az ábrán az is látható, hogy a TCA-ból a lizin felé vezető metabolikus út elágazik, és homoszerinen keresztül további aminosavak (treonin, metionin, izoleucin) képződnek, csökkentve ezzel a bevitt cukrok lizinre történő hasznosulását (hozamát). Ennek okán a kezdeti ( 60-as évek, 20%-os hozam [1]) törzsfejlesztések homoszerin útvonal nélküli törzsek kialakítására irányultak, amelyek előállításához a klasszikus random mutáció szelekció ciklikus ismétléses módszerét alkalmazták. A sejtek élettani funkcióihoz azonban szükség volt azokra az aminosavakra is, amelyek a homoszerin útvonalon képződtek, így a homoszerin hiánymutáns (Hom - ) törzsek termelőképessége nem az elvárt mértékben javult. Ennek kiküszöbölésére a hiányzó aminosavakat a tápközegbe kellett adagolni, ami növelte az eljárás költségeit. Ennek elkerülésére kifejlesztették a leaky mutáns (csepegő, áteresztő) módszert, amely olyan mutánsok szelektálását célozta meg, amelyekben nem eltűnt, hanem jelentősen lecsökkent egy útvonal kulcsenzimének aktivitása. Így a mellékútvonal csak kis anyagáramot (fluxust) pocsékolt el, viszont egyetlen aminosavból sem volt teljes hiánya a sejteknek. A következő, még mindig klasszikus törzsfejlesztéssel kivitelezett cél olyan regulációs mutánsok létrehozása volt, ahol a negatív visszacsatolások eliminálódtak. Például a képződött lizin az aszparagin-kináz enzimet magasabb koncentrációban már gátolja, amely így az aszparagin lizin útvonal leállásához vezet. Mivel az ipar számára a költséghatékonyabb termelés és léfeldolgozás a cél azaz a magas termékkoncentráció az előnyös, az ipari fermentáció számára fontos volt, hogy az ezt akadályozó regulációs mechanizmusokat kiiktassák. A leaky mutánsok szabályozási (regulációs) szempontból is jelentősnek bizonyultak, mivel a csökkent fluxus kisebb koncentrációkat eredményezett a melléktermék-útvonalon, így a melléktermékek negatív feedback mechanizmusa elhanyagolhatóvá vált. A modern kori ( 80-as évek) törzsfejlesztések során új módszereket vetettek be. Ezek közé tartozik a metabolikus fluxus analízis (MFA), amelyet izotópos nyomkövetéssel is alátámasztottak. Ezekkel a módszerekkel megállapítást nyert, hogy anyagáram szempontjából az anaplerotikus reakciók jelentik a szűk keresztmetszetet. Megállapították azt is, hogy a két lehetséges feltöltő mechanizmus közül a piruvátkarboxiláz enzimen keresztül vezető út felel az anaplerotikus aktivitás 90%-áért. A fenti törzsfejlesztések eredményeképpen napjainkban 150 g/l végtitert és kb. 50%-os hozamot lehet elérni a lizinfermentáció során.

9 1. Alapismeretek, ipari mikrobiológiai módszerek 9 Esettanulmány 2. 1,3-propándiolgyártás ábra: Glutaminsav- és lizinmetabolizmus Az 1,3-propándiolgyártás az utóbbi két évtizedben futott fel közel t/év mennyiségre ( ábra). Ennek a gyors és intenzív növekedésnek az alapja a megnövekedett piaci igény. Korábban csak

10 PD [t/év] 10 Ipari mikrobiológia oldószerként, kenőanyagként és fagyállóként alkalmazták, ám a 90-es évek óta a műanyagipar használja fel legnagyobb mennyiségben a poli-trimetilén-tereftalát (PTT) előállítására. A PTT különleges szerkezettel rendelkezik a hasonló célokra hagyományosan használt polietilén-tereftaláthoz (PET) és polibutilén-tereftaláthoz (PBT) képest. ( ábra) ábra: Az 1,3-propándiol-előállítás alakulása az utóbbi két évtizedben ábra: A propándiol okozta különleges szerkezetű PTT polimer (PET: polietilén-tereftalát, PTT: poli-trimetilén-tereftalát, PBT: polibutilén-tereftalát, ET: etilén, PR: propilén, BU: butilén, TFS: tereftálsav) Az ábráról látszik, hogy a propándiollal alkotott kopolimer szerkezete különleges hajtogatással rendelkezik. Ennek oka az, hogy míg mind az etilén, mind a butilén esetében a diol OH csoportok szimmetrikusak egymáshoz képest és tökéletes cisz vagy transz helyzetűek, addig a propándiol esetében az OH csoportok hidrogénjei (amelyek helyére a ftálsav köt) egymással szöget zárnak be ( animáció). Ez a különleges szerkezet igen előnyös tulajdonságokat kölcsönöz a PTT-nek, amelynek következtében egyre kiterjedtebben használják fel textiliák, szálak, szövetek, ecsetszőrök gyártásában animáció: 1,3-PD különleges szerkezete

11 1. Alapismeretek, ipari mikrobiológiai módszerek 11 Noha mindkét monomert napjainkig javarészt szintetikusan állítják elő kőolaj-alapanyagon (PD: akrolein hidrolízisével vagy etilénoxid hidroformilezésével), az 1,3 propándiolt fermentációs úton is előállítják, így a belőle készített műanyagok megújulóvá váltak (a fermentáció alapjául szolgáló cukrot növényekből nyerik). A szintetikus eljárások esetén nagy nyomást és hőmérsékletet, valamint nehézfém-katalizátorokat használnak ( ábra), ugyanakkor a DuPont és a Tate & Lyle által közösen felépített fermentációs üzem pedig ehhez képest 30%-kal kevesebb energiát igényel és 55%-kal kevesebb üvegházhatású gázt termel az enyhébb körülményeknek köszönhetően. H H 2 O, H + H H 2, Ni Degussa: Akrolein O C HO O 135bar, C Shell Chemicals: O Etilénoxid katalizátor + CO + H C, 100bar HO OH 1,3-propándiol C C Dupont+Tate&Lyle: kukorica mag keményítõ glükóz glicerin E.coli ábra: az 1,3-propándiol-előállító technológiák Ipari mikrobiológiai szempontból a termelő törzset érdemes megvizsgálni. A természetben előforduló mikroorganizmusok közül a lactobacillusok, klebsiellák, citrobacterek, enterobacterek, clostridiumok [5] képesek glicerin anaerob (levegő kizárt) fermentációjával 1,3- propándiolt előállítani. Amint az az ábrán látható, a fenti mikrobák a glicerint egy oxidációs lépést követően (glicerin-dehidrogenáz enzim EC ) a glikolízisen és a citrátkörön keresztül hasznosítják. Mind a glikolízis, mind pedig a TCA-ciklus redukált koenzimet termel (NADH 2 ), amely aerob esetben a terminális oxidációban a légköri oxigén segítségével víz keletkezése mellett oxidálódik vissza (regenerálódik). A felsorolt mikrobák egyik része fakultatív anaerob anyagcseréjű, azaz levegő jelenlétében is és anaerob körülmények között is képes szaporodni, a másik részük pedig obligált anaerob metabolizmussal rendelkezik. 1,3-propándiol azonban kizárólag az anaerob körülmények mellett jelenik meg, mert élettani szerepe a terminális oxidáció pótlása, azaz a koenzim visszaoxidálása anaerob körülmények mellett. Mindezek alapján a következő megfontolások tehetők: 1) a természetes termelő törzsek nem alkalmasak ipari termelésre, mert A) patogének, B) sok más metabolit mellett kevés 1,3-propándiolt termelnek C) szubsztrát inhibíció vagy termékgátlás áll fent, D) csak glicerinből képesek 1,3-propándiol előállítására (a glicerin mint alapanyag csak a biodízelgyártás elterjedése és a szennyezéstűrő metanol, sók, katalizátorok mikrobák kifejlesztésével vált jelentőssé). 2) A biotechnológusok háziasított mikrobája, az Escherichia coli csak valamelyik természetes propándiol termelő törzs enzimjeinek segítségével tehető képessé a propándiol-előállításra, ám ehhez még szükséges valamilyen mikrobiális (Saccharomyces) gén és géntermék, amelyekkel a glükózból a glicerin előállítható. 3) Jól termelő törzs kifejlesztéséhez tehát ezúttal nem a klasszikus izolálás-screening-mutáció screening műveletsorral, hanem rekombináns technikával jutottak. A természetes 1,3-propándiol-termelő törzsekből 4 kulcsenzimet volt szükséges az Escherichia coli-ba átvinni: 1) gliceirn-dehidrogenáz (GDH, EC , NAD + koenzim segítségével a glicerint 1,3-

12 12 Ipari mikrobiológia dihidroxiacetonná alakítja; 2) glicerin dehidratáz (GDHt, EC , amely B 12 koenzim segítségével gyökös reakcióban vizet hasít le a glicerinről); 3) 1,3-propándiol-oxidoreduktáz (PDOR, EC , amely redukált NADH 2 koenzim segítségével redukálja a vízkilépéssel kapott 3-hidroxipropionaldehidet 1,3-propándiollá ( ábra). Ezáltal a sejten belül a glicerin diszproporciója valósul meg ábra: Az anaerob glicerin metabolizmus

13 1. Alapismeretek, ipari mikrobiológiai módszerek 13 DHA-foszfát Glikolízis C H 2 H 2 C OH O OH GDH C H 2 HC H 2 C OH OH OH DHA NADH 2 NAD+ Glicerin H 2 O C H 2 HC H 2 C OH OH OH GDHt HC O CH 2 H 2 C OH PDOR C H 2 OH CH 2 H 2 C OH Glicerin HPA PD ábra: A glicerinmetabolizmus enzimei: GDH, GDHt, PDOR, (DHA: dihidroxiaceton, HPA: hidroxipropionaldehid, PD: 1,3-propándiol) A 4. kulcsenzim (ez idáig rendszertanba nem sorolt) a GDHt kulcsenzim reaktivációjához szükséges, mivel a GDHt minden molekula átalakítása után a B 12 koenzimével komplexben marad, ahonnan ez az enzim szabadítja fel mind a koenzimet, mind a kulcsenzimet ATP energia segítségével. Ahhoz, hogy glükózalapon lehessen 1,3-propándiolt előállítani, még további 2 enzimre volt szükség: G3DH (glicerin-3-foszfát-dehidrogenáz) és GPP (glicerin-3-foszfatáz). Ezekkel a génátvitelekkel már képessé tették az E.coli-t az 1,3-propándiol-termelésre, de még ipari használatra nem volt alkalmas. A gyártásba való bevonás előtt a termékinhibíció hatását ki kellett küszöbölni (terméktoleráns mutánsok), illetve a melléktermékeket (további metabolitokat) termelő útvonalakat kellett minimalizálni. Mindezek végére az elkészült törzs 160 g/l PD-t is képes előállítani, ha a B 12 koenzimet adagolják (ezt nem termli az E. coli). Az 1,3-PD technológiája követhető nyomon az hiperpicture-ön hyperpicture: A rekombináns PD fermentációs technológia A technológia első lépése a kis léptékű oltóanyag-előállítás 2L-es rázatott lombikban. A laboratóriumi steril 2YT tápközeget oltják be a termelő E.coli fenntartó (ld. Törzsfenntartás, ferde agaros kémcső, Petri-csészés tenyészet, liofilizált ampulla) tenyészetéről. A fermentáció 34 C-on zajlik, és egyéb C-forrás hiányában a szerves nitrogénforrások széntartalmából (tripton, élesztő) épülnek fel a kultúra sejtjei. A rázatás a keverés mellett a levegőztetést is biztosítja. Mintegy 10h tenyészidő után kerül az oltóanyag az előkészített (tápközeggel feltöltött lesterilezett) 1500 L-es oltóreaktorba. A rekombináns technológia alkalmazásának egyik hátránya, hogy a termelő hasznos mutánsok megtartásának érdekében állandó szelekciós nyomást kell fenntartani, és ezt ez esetben is mint általában antibiotikum hozzáadásával oldják meg, mivel az antibiotikum-rezisztencia a heterológ génekhez van kapcsolva. Ebben a léptékben tehát már antibiotikum (Spectinomycin 250g/10m 3 ) hozzáadásával védik a termelőképesség megmaradását, illetve tápközegnek nem egy hagyományos laboratóriumi, hanem a termelő törzsre optimált tápközeget használnak. A fermentációt

14 14 Ipari mikrobiológia C-on és ph=6,8-on végzik 0,3VVM (DO=10%) levegőztetés mellett kevert levegőztetett bioreaktorban, szakaszos technikával 21h hosszan. A termelő reaktorban ugyanezen körülmények és 34%-os hozam mellett történik glükózalapon 42h hosszan az 1,3-propándiol fermentációja. A termékképzést B 12 koenzim hozzáadásával (két részletben) indukálják, mivel a gazdaszervezet (E.coli) nem képes ennek szintézisére, ugyanakkor a GDHt (2. kulcsenzim) aktivitásához szükséges. A termelő reaktorban azonban a glükózt rátáplálással biztosítják, és mintegy 10g/L körüli értéken tartják. Az elkészült fermentlevet visszasterilezés után (75 C-os inaktiválás 45 p-en keresztül) átadják a feldolgozóüzemnek, ahol első lépésként az elölt és részben flokkulált sejtektől mikroszűréssel szabadulnak meg (termék a permeátumban található). További membrán műveletekkel (ultra-, majd nanoszűrés) és ipari kromatográfiával szabadulnak meg előbb a fehérjék nagy részétől, később valamennyi kísérő szennyező anyagtól. A fenti két példa megmutatta, hogy a klasszikus véletlenszerű mutáció-szelekció folyamat és rekombináns DNS technika miként hasznosulhat technológia szinten, illetve hogyan térülhetnek meg a mikrobiológiai törzsfejlesztésre fordított források (Ipari) Mikrobiológiai műveletek Minden iparban használt mikroba őse egy természetből szándékkal vagy véletlenül kiválasztódott (=izolált) mikroba. Az ipari termékspektrum, illetve termelési hatékonyság növelése érdekében fontos további hasznosítható metabolitok, illetve mikrobák felkutatása, valamint gyakran a korábbinál hatékonyabb termelők keresése. E folyamat három lépésből áll: kinyerés (izolálás), szűrővizsgálat (screening), azonosítás (identifikáció). E három művelet igen szorosan épül egymásra, hiszen egy fajokban dús természetes élőhelyről nagyon sok fajta mikroba tenyészthető ki, ezért a nagyobb hatékonyság érdekében az izolálást már előszűréssel kombinálják, vagyis az adott feladatnak megfelelő tulajdonságokra szelektíven történik az izolálás. Törzsizolálás A mikroorganizmusok legnagyobb számban és diverzitásban a különböző talajok felső rétegeiben fordulnak elő, de természetesen (tenger)vízből és levegőből is lehet mikrobákat izolálni. A talaj kulcsfontosságát a mikrobák izolálásában mi sem tükrözi jobban, mint hogy a törzskereséssel és fejlesztéssel foglalkozó intézmények (törzsgyűjtemények, gyógyszergyárak) gyakran őriznek talajmintákat a világ legkülönbözőbb helyeiről, és ezekről indítják az izolálást. Az izolálási technika függ attól, hogy A) célzottan, egy a szakirodalom alapján megfelelőnek vélt mikrobát találjunk, vagy B) minden potenciális mikrobát szeretnénk kinyerni, amelyek egy adott tulajdonsággal rendelkeznek. Szilárd mintából A szilárd mintából/ról történő izolálást foglalja össze az ábra. A) Ha egy célmikrobát szeretnénk izolálni, akkor az első szelektív lépés lehet a minta különböző intenzitású szárítása, amelynek következtében először a vegetatív sejtek (hifák, baktériumok) pusztulnak el, aztán az egyre kitartóbb spórák is. B) Ha minden kedvező tulajdonságú (pl. enzimtermelő) mikroba potenciális kiválasztott lehet, akkor nem célszerű szárítással frakcionálni a talajminta mikroflóráját. A mintát tehát előszárítással vagy anélkül 1) folyékony tápközegbe juttatjuk, és hígítás után vagy anélkül szélesztjük (soil-dilution-plate method), vagy 2) Petri-csészés agarlemez felszínére szórjuk, és steril vízzel nedvesítjük, majd szétkenjük (soil-plate method), vagy 3)steril pálcával a mintafelszínéről veszünk mintát, és ezt érintkeztetjük Petri-csészés vagy folyékony tápközeggel.

15 1. Alapismeretek, ipari mikrobiológiai módszerek ábra: Izolálás szilárd mintáról Talajmintából történő izolálást mutat be az videofilm videó: Izolálás Bármelyik módon is került a minta érintkezésbe a tenyésztő tápközeggel, általában a homogenitás a cél, illetve inkubálással kinöveszteni az izolátumo(ka)t. Az izolálás során preszelekció céljából a tápközeget különböző adalékokkal egészíthetik ki. Az adalékok célja lehet a másfajtájú mikrobák elnyomása (pl. baktériumok izolálásakor gombák, penészek visszaszorítása), illetve a célmikroba iránti szelektivitást lehet így növelni (speciális szubsztrátok sók alkalmazása). A klasszikus ipari mikrobiológia során szintén talajmintából izolálták a főbb antibiotikum termelő törzseket. Mivel az antibiotikumok általában gyógyszerként kerülnek piacra, ezért az izolálástól a termék- (és profit) termelésig hosszú út vezet, amely során a tiszta tenyészet izolálását követően

16 16 Ipari mikrobiológia fermentációs fejlesztéseket (tápközeg-optimálás, ph-, hőmérséklet-, cukorprofil stb. meghatározása), biológiai-, majd kémiaiaktivitás-teszteket végeznek, végül toxikológiai és klinikai vizsgálatok (3 fázisban) után kerül sor a piaci bevezetésre. Folyadékmintából A folyadék fázisú minta előnye, hogy könnyen érintkeztethető a tápoldattal, viszont általában kevesebb csírát tartalmaz, ezért első lépésként dúsításra van szükség. Ennek érdekében vagy 1) magát a mintát inkubálják, és ezt követően adják a tápoldathoz, majd az újabb inkubáció után oltják agarlemezre, vagy 2) tápoldattal együtt inkubálják, és erről oltanak szilárd táptalajra, vagy 3) steril szűrőmembránon átszűrik a mintát, és a membránt inokulumként adják a tápközeghez (oldatba vagy agarlemezre). Levegő-(gáz)mintából Ez esetben a legkisebb a csíraszám, ezért itt 1) intenzív dúsítást alkalmaznak a gáz átszűrésével vagy 2) nyitott Petri-csészés agarlemezzel exponálnak. Ilyenkor a nyitott és tápközeggel töltött agarlemez érintkezik a gáztérrel, és a benne lévő mikrobák inkubáció után megjelenhetnek az agaron. Az alábbiakban különböző rendszertani csoportok izolálásakor alkalmazott körülményeket mutatjuk be. 1. Fonalas baktériumok (Actinomyces-ek) izolálása Előfordulás: leggyakrabban a Streptomyces és Micromonospora fajok fordulnak elő mezőgazdasági talajokban, tavak folyók és tenger üledékeiben. Termofil fajták silókban és komposztban is megtalálhatók. Az Actinplanes fajok (antibiotikum ((teichoplanin)) termelő) avarból és talajból izolálhatóak, különlegességük, hogy aktívan mozgó spórákkal rendelkeznek, amelyek kemotaxissal keresik meg a kedvezőbb körülményeket (huminsav, KCl, kitin). Streptosporangiumok (szintén antibiotikumtermelők) száraz, alkalikus talajból izolálhatóak. Az Actinomycesek közé tartoznak a Corynebacterium-ok is (ld. Lizingyártás, illetve 3. fejezet Actinomyceták). Mintavétel: a talaj felső 4-5cm-es részéből történik, a minta tárolása ideálisan C között lehetséges. A minta kíméletes szárításával a konkurens Gram-negatív baktériumok elölhetőek, magasabb hőmérséklet (120 C, 1h) alkalmazásával pedig minden vegetatív baktérium és gomba eliminálódik. Tápközeg: gyakran gombaölő szerekkel (cikloheximid, nystatin) akadályozzák meg az izolátum penészesedését. Az adalékolással az izolálás céljaira a kemotaxis is kiaknázható. Szelektív szénforrásként kolloid kitint vagy sók, vitaminok kíséretében huminsavat szoktak alkalmazni. Kitenyésztés: a mezofilek (T opt.:25-30 C) 7-14 nap alatt nőnek ki, a termofilek (T opt.: C) 2-5 nap alatt. 2. Anaerobok izolálása Előfordulás: levegőtől elzárt, gyakran extrém élőhelyeken, mint például bendőben (biogáztermelő metanogének), mélytengeri üledékekben (Streptomyces griseus B 12 -gyártáshoz), gejzírekben, hőforrásokban (termostabil enzimek Archea baktériumokból (= Ősbaktériumok ) Mintavétel: Hungate technikával, amely részletesen a weboldalon olvasható (szeptumos tenyésztő edényt injekciós fecskendőbe zárt inert gázzal öblítik át, majd szintén a tűn keresztül oltják be, illetve vesznek mintát). A szigorúan anaerob mikrobák érzékenyek a légköri oxigénre (amely reaktív peroxid gyököket okoz a sejtben), ezért a minták kezelésekor a levegő teljes kizárására kell törekedni.

17 1. Alapismeretek, ipari mikrobiológiai módszerek 17 Tápközeg: szükséges oxigéninikátor (pl.: resazurin), és gyakran redukált komponensek alkalmazása (ezek oxidálódjanak a sejtkomponensek helyett), mint például: NaSH, DiTioTreitol (DTT), cisztein stb. Kitenyésztés: Anaerob boksz gázadszorbenssel vagy gáztér átöblítés oxigénmentesített (oxigénmentesített) (lugol oldaton átbuborékoltatott) inert (N 2 ) gázzal ( ábra). A gázadszorbens működhet úgy, hogy citromsavat, mészkövet és diatóma földet kevernek össze, és nedvesítés után zárják be az anaerob tenyésztőedénybe. Ekkor a diatóma föld megköti az oxigént, a savas közegben a karbonát CO 2 -t bocsát ki, azaz kicserélődik a levegő oxigénje CO 2 -ra. Egy másik esetben az adszorbensből H 2 és CO 2 fejlődik, és előbbi palládiumkatalizátor mellett vízzé reagáltatja az oxigént. Az inert gázzal történő átöblítést az edény másik csonkjának megvákuumozásával is elő lehet segíteni ábra: Anaerob tenyésztőrendszerek 3. Fonalas gombák izolálása Előfordulás: heterotróf szaprofita fajaik talajban, illetve rothadó szerves anyagokon találhatók meg minden égövben. Egyes fajaik szimbionita életformában zuzmókban, illetve mikorrhizában fordulnak elő, de vannak paraziták is, amelyek a gazdanövényről, rovarról, halról, emlősről stb. izolálhatóak. Mintavétel: mivel szinte mindenhol előfordulnak, kétféle megoldás használatos: 1) Ökológiai megközelítés : a kívánt tulajdonságnak megfelelő élőhelyről próbálnak izolálni (pl.: termostabil gombákat hőforrásokból, vegyszerlebontókat szennyezett talajból stb.) 2) Taxonómiai (rendszertani) megközelítés : rokonok tulajdonságai alapján pl.: citromsavtermelő faj rokonait is be lehet vonni izolálás+screening programba jobb citromsavtermelő keresésekor. 3) Csalétek módszer : lebontandó anyagot párás melegbe helyezik, így az megpenészedik, azaz olyan fonalas gombák kolonizálják, amelyek képesek lebontani és felhasználni a csalétket. Előkészítés: kíméletes szárítással vagy hűtéssel (+5-18 C). Tápközeg: széles irodalommal rendelkeznek. Általában enyhén savanyú (ph=4,5-6), magas C- forrás- tartalmú tápközegeket használnak, amelyekben a N-forrás gyakran csak ammónia vagy nitrát, de a leggyakoribb fonalasgomba-táptalajok szerves nitrogénforrást is tartalmaznak (pl.: PDA, kukoricaliszt agar, malátakivonat stb.). Ezek a tápközegek szelektívvé vagy félszelektívvé tehetők ( mg/l) antibiotikum kiegészítéssel, illetve a gyorsan kolonizáló ( burjánzó ) penészek ellen adalékokkal kiegészíthetőek.

18 18 Ipari mikrobiológia Fonalas gombák izolálásánál és tenyésztésénél komoly gondot okozhatnak az atkák, amelyek a gombával táplálkoznak, és keresztbe fertőzhetik a Petri-csészés kultúrákat. Inkubálás: mezofilek: C 7 14 nap, termofilek: C 2 5 nap A fonalas gombák különböző rendszertani egységei annyira különböznek egymástól, hogy izolálásukban is eltérhetnek: A) Ascomycetes, Deuteromycetes (Imperfekt): ubiquiterek (széles körű előfordulás), jól sporulálnak, ezért könnyű az izolálásuk (aspergillusok, penicilliumok, fusariumok). B) Basidomycetes: makroszkopikusak: (kalapos, pöffeteg, tapló) termőtestből, mikorrhizából történhet az izolálás mikroszkopikusak: (rozsda és üszöggombák ) mikorrhizából, de nehéz fenntartani, mert csak az élő gazdanövényen szaporodik. Jól tűrik a benomylt (gombaellenes növényvédőszer), ezért 0,5-5mg/l benomyl melletti izolálás esetén javarészt ezek nőnek ki, a többi gomba visszaszorul. C) Zygomycetes: ezek is ubiquiterek, és a legburjánzóbb növekedésűek. A Petri-csészén általában az első kinövők (Mucor, Rhizopus, Trichoderma) A fonalas gombák izolálásának jelentőségét széles körű felhasználásuk is indokolja ( táblázat) Elsődleges metabolitok Másodlagos metabolitok Enzimek előállítása Tradicionális élelmiszerek Egyéb 4. Élesztőgombák izolálása táblázat: Fonalas gombák ipari felhasználása Fonalas gomba Aspergillus terreus A. niger A. niger, Yarrowia lipolytica Eremothecium ashbyii Aureobasidium pullulans Saccharomyces cerevisiae Penicillium chrysogenum Cephalosporium acremonium Aspergillus fumigatus Claviceps purpurea Penicillium sp. A. niger A. oryzae A. awamori Mucor sp. Mucor, Rhizopus kevert tenyészet Trichoderma polysporum Rhizopus, Fusarium Termék Itakonsav glükuronsav citromsav riboflavin pullulan etanol penicillinek cefalosporinok fumagillin ergot alkaloidok griseofulvin lipáz α-amiláz glucoamylase rennin ragi shoyu ciklosporinok szteroidkonverziók Előfordulás: fermentatív fajaik, amelyek cukrok felhasználásával nyerik a szükséges energiát, cukortartalmú gyümölcsökön, bogyókon, virágokon találhatók meg. Ezek esetében többnyire a terminális elektronakceptor nem a légköri oxigén, hanem a cukormolekula degradációs termékei (így keletkeznek az elsődleges metabolitok.) aerob fajaik: nehezen fermentálható C-forrásokon találhatók főleg meg, mint például C4-C5, metanol, etanol, és különböző poliolok (növényeken, gombákon, rovarokon, kevés a talajban, némely azonban csak ott). Mintavétel: steril zacskóba, üvegbe kell gyűjteni a mintát, amely nem tárolható jól. Talajminta esetén a felső 10 cm-ből célszerű az izolálást végezni.

19 1. Alapismeretek, ipari mikrobiológiai módszerek 19 Előkészítés: dúsítás lehet szükséges: ph=3,5-4 rázatott lombikban (levegőztetve), így előszaporítva. Tápközeg: Malátakivonat (maltextract), krumplifőzet (potatoe-dextrose-agar, PDA), de a ph 3,8 kell legyen, azaz savasabb, mint a fonalas gombákénál mg/l kloramfenikol hozzáadásával baktériummentes izolátum nyerhető. Általában ozmotoleránsok, azaz 30-40% glükóz mellett is tenyészthetők Inkubálás: mezofileket C-on, a pszichrofileket C-on szüksées tenyészteni. A következő két csoport rendszertantól független, ezért egyaránt tartalmaz baktériumokat, gombákat stb-t. 5. Alkalofilek izolálása Az alkalofilek lúgos ph optimumú mikrobák, jelentőségük az antibiotikumok, mosószerenzimek gyártásában van. Előfordulás: alkalikus (szikes) talajok Mintavétel: szilárd mintából/ról Előkészítés: vizes szuszpenzió Tápközeg: glükóz vagy keményítő, peptonnal élesztőkivonattal, sókkal kiegészítve, ph=8,5-12 Kitenyésztés: általában mezofilek, így C-on 2-3 nap alatt érhető el. 6. Termofilek izolálása A termofilek magas hőmérsékleti optimummal (55-75 C) rendelkező mikrobák. A termofilhőmérséklet-optimum a mezofil és az extrém termofil között helyezkedik el, és különbözik a termotoleráns fogalomtól: míg előbbieknél az optimális növekedési hőmérséklet alapján történt a besorolás, addig a termotoleráns csak elviseli (esetleg növekszik is) a magasabb hőmérsékleten, de messze nem maximális sebességgel szaporodik és termel. A termofilek között baktériumok, gombák és ősbaktériumok is megtalálhatók, mint ipari termelő vagy enzim-, illetve génforrás mikroorganizmusok: - fonalas gombák: mivel C között számos gomba izolálható, de 62 C-on már egy sem, úgy tűnik, hogy az eukarióták növekedésének 60 C körül korlátja van, amelynek oka feltehetően, hogy nem tudnak termostabil jól funkcionáló belső membránokat létrehozni [166]. Termofil fonalas gombára példa a Thermomyces lanuginosus (50 C optimummal [167]), a Sporotrichum thermophile (45-50 C [168]), és a Rhizomucor miehei (35-45 C [169]). - baktériumok: thiobacillusok (acidophilek), bíborbakt: (fotoszint), cianobakt, actinomiceták. - továbbá algák, protozoák, ősbaktériumok Előfordulás: geotermikus hőforrások (gejzírek), spontán melegedő szubsztrátok (siló), fűtött környezet (erőművi hűtővíz), talaj, édesvízi és tengeri üledékek ( táblázat) Mintavétel: gyakran obligát anaerobok (pl.: Thermotoga maritima), hiszen vagy az élőhelyük levegőtől elzárt, vagy a magas hőmérsékleten nem oldódik be az oxigén a vizes közegbe, ezért a mintavételhez Hungate-technika (ld. Anaerobok izolálása) javasolt. Előkészítés: párologtató szükséges, hogy ne száradjon ki a tenyészet a magas hőmérsékleten Tápközeg: komplex tápközeg ajánlott, amelynek összetétele az eredeti élőhelynek megfelelő (mélytengeri, vulkanikus stb.). A szokásos szilárdító ágens (agar-agar) legfeljebb 65 C-ig használható, efelett gellán gumi (100 C) vagy gelrite (+Ca 2+ és Mg 2+ sók) használata javasolt a magasabb olvadáspont miatt. Inkubálás: párologtató, esetleg anaerob kamra lehet szükséges.

20 20 Ipari mikrobiológia Lelőhely Geotermikus hőforrások (savas-semleges-alkalikus) Spontán melegedő szubsztrátok (silók, komposztok) További fűtött környezetek (erőművi hűtővíz, konzervek stb.) Nem fűtött szubsztrátok (talaj, por, levegő, üledék) Törzsfenntartás táblázat: Termofil mikroorganizmusok lelőhelyei faj Thermoproteus spp. Thiobacillus spp. Clostridium spp. Thermoanaerobium spp. Thermus spp. Bacillus spp. Thermotoga spp. Bacillus spp. Thermoactinomyces spp. Streptomyces spp. Thermomyces spp Talaromyces spp. Thermoascus spp. Clostridium spp. Thermomonospora spp. Thermus spp. Dactilarya spp. Methanospirillium spp. Methanogenium spp. Thiobacillus spp. Bacillus spp. Lactobacillus spp. Clostridium spp. baktériumok baktériumok baktériumok baktériumok baktériumok baktériumok ősbaktériumok baktérium baktérium fonalas baktériumok fonalas gomba fonalas gomba fonalas gomba baktérium baktérium baktérium fonalas gomba ősbaktériumok baktériumok baktériumok baktériumok baktériumok baktériumok A természetből izolált és/vagy mutációkkal nyert színtenyészetek fenntartása szintén kiemelkedő fontosságú területe az ipari mikrobiológiának. Gondoljuk csak meg, hogy egy működő üzemnél, ahol lehetőleg saját izolálású vagy fejlesztésű termelő mikrobát alkalmaznak, micsoda következménye lenne a termelő törzs elvesztésének, tönkremenetelének. Ennek szem előtt tartásával tehát a törzsfenntartás célja, hogy eredeti állapotában, azaz ugyanolyan szaporodó és termelőképességű formában tartsa fenn a termelő törzset az üzem indításától a bezárásáig, kedvező esetben akár évtizedekig (persze közben mindig kicsit újabb és újabb fejlesztésű sejtvonalat használnak, de a törzs általában azonos marad). Az izolátumok eltartására kétféle mód létezik: A) inaktív, és B) aktív formában. Az aktív formában történő törzsfenntartást mutatja be az videó videó: Törzsfenntartás aktív formában Az inaktív forma jelenti a természetes szaporítóképletek (pl.: spórák) eltartását különböző megoldások segítségével (folyadékszuszpenzióban, szilárd hordozóra adszorbeáltatva, micéliummal együtt megszárítva stb.). Az aktív forma jelenti a nagyobb kihívást, hiszen ilyenkor a vegetatív sejtek fenntartásáról beszélünk, amelyek érzékenyek a környezeti hatásokra, és bár lassan, de szaporodnak, ami pedig a genetikai változás (mutációk) veszélyét is magában hordozza. A vegetatív sejtek legjobban eltartható

21 1. Alapismeretek, ipari mikrobiológiai módszerek 21 aktív formája a liofilezést (fagyasztva szárítást) követően kapott sejtpor. Az eljárás lényege, hogy kíméletes fagyasztást követően a tápközegből és a sejtekből egyre nagyobb vákuum alkalmazásával elszublimáltatják a jeget, és végül csak a szárazanyag-tartalomnak megfelelő por marad vissza. A kíméletes fagyasztás következtében azonban a sejtmembrán nem sérül, így steril folyadék (víz, fiziológiás sóoldat, puffer vagy tápközeg) hozzáadásával a sejtek rehidratálhatóak, és ismét tenyészhetőek. Ezt az eljárást hosszabb távú (évtizedes) tárolás esetén alkalmazzák, például a törzsgyűjteményekben, így az onnan beszerzett mikrobák rendszerint ilyen formában kerülnek a megrendelőhöz. A mindennapi használat során azonban aktívan növő tenyészeteket használnak, amelyek szaporodási sebessége a hűtőszekrény 6-10 C-os környezetében rendkívül lelassul, így általában kb. 1 hónapig eltarthatók túlöregedés nélkül. Ehhez Petri-csészébe öntött, megszilárdított (pl.: agaros) tápközeget lehet alkalmazni, vagy helytakarékosság okán, illetve anaerob esetekben kémcsőben és esetenként ferdén szilárdított tápközegen történik az eltartás. Az anaerob esetekben a tenyészet fölé paraffinolaj rétegezése is bevett szokás, illetve gyakran a szokásos agarfelszínre oltás helyett oltótűvel szúrt tenyészeteket hoznak létre ( ábra) ábra: Ferdeagaros, anaerob és szúrt tenyészetek, Petri-csészék és oltókacsok Az ilyen formában tárolt tenyészetekről való átoltással egyrészt a termelő fermentációk inokulumai kerülnek beoltásra, másrészt az öregedés ellen is a tárolt tenyészetet át kell időről időre oltani. Az átoltást steril fülke alatt vörös izzásig leégetett steril oltókaccsal végzik autoklávban (vagy egyéb módon) sterilezett tápközegre. Az átoltás után inkubálni kell a tenyészetet, amíg megjelennek a telepek és/vagy a csíkozott tenyészetek, majd ezt követően kerülnek vissza a hűtőszekrénybe újabb 1 hónapos fenntartásra, vagy esetleg időközben fermentáció indításához való felhasználásra. Törzs-screening Az előbbiekben bemutatott mikrobaizolálási eljárásokkal különböző fajtájú, képességű, eredetű és tulajdonságú mikrobák tucatjaira tehetünk szert létrehozva egy törzsgyűjteményt. Amikor azonban ezek között keresünk egy adott tulajdonsággal rendelkezőt, akkor ezt a több tucat mikrobát kell szűrővizsgálat alá vetni. Az ilyen vizsgálatok jellemzője, hogy adott tulajdonságot keres, lehetőleg gyorsan, több száz minta analízisén keresztül. Az ipari mikrobiológiában a szűrővizsgálatot jobb termelőképességű egyedek keresésére is használják, ilyenkor tehát nemcsak a kvalitatív szűrővizsgálatot, hanem a kvantitatívot is el kell végezni, azaz nem elég kiválogatni a termelő- képes mikrobákat, hanem a legjobb termelőképességűeket kell kiválasztani (a legnagyobb hozamút, produktivitásút, végtiterűt. A szűrővizsgálat tehát nagyfokú automatizáltságot kívánna meg, mivel nagyszámú mintát lehetőleg gyorsan és kvantitatív esetben pontosan kell elemezni. Ugyanakkor minden feladat más természetű, más indikációjú, tehát nem lehet rutinfeladatként végrehajtani. A szűrővizsgálatok első lépcsőjében (általános vizsgálat nem optimált körülmények mellett) még minden potenciális jelöltet ki kell szelektálni, a bizonytalanokat is, amelyek a későbbi lépcsőkön esetleg elvéreznek, de az is lehet, hogy optimált körülmények között azok lesznek a legjobb termelők. Ezért szükséges az automatizált szűrővizsgálatok manuális felügyelete, esetleg felülbírálata is.

22 22 Ipari mikrobiológia A nagy hatékonyságú és kapacitású analitikával ellátott szűrőrendszereket HTS-nek (High Throughput System) nevezzük. A szűrővizsgálati módszer nagyban függ attól, hogy milyen céltulajdonságot keresünk (pl.: 1. adott enzimtermelő mikrobát, 2. primermetabolit-termelőt, 3. valamely szekunder metabolitot termelő mikrobát). A klasszikus szűrővizsgálatok során enzimtermelő mikrobák keresésekor alapvetően az enzimaktivitás-méréssel (assay) azonosítják a termelőket, illetve szelektív tápközeggel segítik ezek izolálását is. A primermetabolit-termelőket klasszikusan szelektív tápközegen vizsgálják, és valamilyen nagy kapacitású és hatékonyságú analitikai módszerrel (GC, HPLC) követik nyomon a metabolitok keletkezését. Ugyanez igaz a klasszikus szekunder metabolitot termelők screeningjére is, azzal kiegészítve, hogy esetükben további analitikai vizsgálatokat is végeznek, mint például a biológiai aktivitás és MIC- (minimal inhibitory concentration) meghatározás. A modern eljárások a screening vizsgálatokat miniatürizálták, és egy kb. 10x16cm-es műanyag lap 96 furatában párhuzamosan végezhetővé tették. Ehhez szükséges, hogy valamilyen indikációja legyen a pozitív eredménynek (pl.: színreakció), amelyet egy plate-reader (lemezleolvasó) fotométerrel és a hozzákapcsolt megfelelő szoftverrel lehet kiértékelni ( ábra). Klasszikus módszerek a szűrővizsgálatokhoz A) Enzimtermelők szűrése ábra: Microplate reader HTS szűrővizsgálathoz Proteázok termeléséhez a proteolitikus aktivitás indikációja szükséges, ezért a táptalajba kicsapott fehérjét kevernek. A pozitiv eredményt a telep körül megjelenő tisztulási zóna adja, mivel a kicsapott turbid fehérjét feloldja a proteáz termelő izolátum.

23 1. Alapismeretek, ipari mikrobiológiai módszerek 23 A keményítőbontó amiláztermelő mikrobák izolálása hasonló elven történik, de a kicsapott fehérjék helyett vízben nem oldodó (=emiatt turbid) keményítőt alkalmaznak, és az amiláztermelő mikrobák ezt oldják fel szintén tisztulási zónát eredményezve a telep körül. Az ipari szempontból érdekes további két enzim (celluláz és lipáz) esetében is ugyanezt az elvet alkalmazzák, előbbi esetében cellulózrostok, utóbbi esetében olaj emulzió feloldása eredményezi a tisztulási zónát a pozitív telepek körül. A legnagyobb enzimgyártók egyike a Novo, amelyik az 1970-es években mosószerenzimek előállítása céljából keresett termostabil alkalikus proteázokat. Ennek okán az alkalikus talajmintákat kíméletesen megszárították, így a vegetatív sejteket elölték, csak a spórás mikrobák maradtak izolálhatóak. Az ezután kinövő telepeket ph=9-10-re állított, kicsapott haemoglobint tartalmazó agarra vitték, és C-on inkubálták. A kinőtt telepek közül a kioltási (tisztulási) zónával rendelkezőket tovább vizsgálták. Mivel a lombikos fermentációk során kapott proteolitikus aktivitás nem korrelált a tisztulási zóna méretével, a kisebb zónájú telepeket is érdemes volt tovább vizsgálni. B) Primermetabolit-termelők keresése Az elsődleges anyagcseretermékeket hatékonyan előállító mikrobák izolálásakor két módszert használnak. Az egyik (ld. bioautográf módszer animáció) szerint a keresett metabolitra hiánymutáns mikrobát hoznak először létre random mutagenezissel, majd ezt szuszpendálják a táptalajba. Az izolátumok ráoltása után inkubálják, majd az izolátumokat UV-val elölik, és újabb inkubáció következik a hiánymutánsok tenyésztésére. Ezek csak ott tudnak kinőni, ahol az izolátum a hiányzó keresett metabolitot előzőleg megtermelte, így itt nem tisztulási zónát, hanem új telepet kerestek. Ennek a módszernek egyszerűbb formája, ha létezik olyan természetes törzs, amely a keresett metabolitot tovább hasznosítani tudja, így nem kell hiánymutánst létrehozni. Erre példa a tejsavtermelők keresésekor propionsav baktériumok használata (ld C3 metabolizmus). A másik módszer a szerves savak nem specifikus indikációjára alkalmas. Ebben az esetben mészkőport (CaCO 3 ) kevernek a táptalajba, amelyet a képződött szerves savak feloldanak ismét tisztulási zónát eredményezve. C) Szekundermetabolit-termelők keresése A fermentációs ipar történetének legtöbb szekunder metabolitja az antibiotikumok közé tartozik. Az ezek előállításhoz szükséges termelő mikrobák keresésekor a táptalajba a szenzitív mikrobát szuszpendálták, amely ellen hatékony antibiotikumot kerestek. Az antibiotikum termelő izolátumok körül kioltási zónát lehet tapasztalni. Az antibiotikumok detekátlására agarkorongos módszert szoktak használni, amely módszert szintén lehet screening célra adaptálni. Az agarkorongos módszer során egy steril papírkorongot átitatnak az antibiotikummal, és olyan táptalajra helyezik, amelybe a szenzitív mikrobát előre szuszpendálták, és ismét kioltási zónát vizsgálnak inkubáció után. Modern HTS szűrővizsgálatok A) Enzimtermelők szűrése megoldható kapcsolt enzimes reakcióval, ahol a kapcsolt reakció szubsztrátja vagy koenzime (pl.: NAD + /NADH 2 340nm-en mérhető) nyomon követhető fotometriásan. Hasonlóan optikailag követhető a kromogén vagy fluorogén szubsztát vagy szubsztrát analógok használata a célenzimet termelő mikrobák esetében. Ilyenkor a fent bemutatott készülékben ( ábra) nagyszámú izoltáumot lehet nyomon követni speciális lemezeken (plate), amelyek furataiba a kromogén/fluorogén szubsztrátot/szubsztrátanalógot előre adszorbeáltatják, így a pozitív választ adó izoltáumokat a platereader (lemezolvasó) készülék azonosítani tudja. B) Esetenként kromogén/fluorogén szenzorokat alkalmaznak az előbbihez hasonló reakciók kimutatására mikrotiterlemez-olvasó készülék helyett.

24 24 Ipari mikrobiológia C) Szintén a modern módszerek közé tartozik a microarray technika. Ehhez fejlett bioinformatikai adatbázisra van szükség, mivel a módszer elve, hogy a keresett tulajdonságot kódoló gén klompenter DNS-ét kromogén/fluorogén jelzéssel ellátva adszorbeáltatják egy mikrolemezre ( DNS chip ), és az izolátumokkal együtt inkubálják. Ezt követően a nem kötődött, jelzett DNS-t eltávolítják, és a kötött DNS-eket detektálják (pozitív izolátumok esete). D) Gyakran nincs lehetőség a keresett tulajdonság azonnali in-situ indikációjára az inkubációval paralell, ilyenkor a HTS rendszerek csak a nagyszámú kis térfogatú minta tenyésztésére használhatók, és a tenyésztés végén online vagy off line analitika (GC, HPLC, MS, infraspektroszkópia, NMR stb.) szükséges. Az alábbiakban néhány ipari példát mutatunk be termelő törzs szűrővizsgálatban történt szelekciójára. 1. Antibiotikum-termelők szűrésére bevált módszer, hogy a potenciális termelőtörzzsel egy agarlemez kb. 1/3-ad nagyságú körszeletét oltják be, és az inkubáció során a biomasszaképződés mellett az esetlegesen termelt antibiotikum az agar be nem oltott részei felé is diffundál. Az első inkubációt követően tesztorganizmusokat oltanak a be nem oltott 2/3-adra, és ismét inkubálják az agarlemezeket. A tesztorganizmus(ok) növekedéséből megállapítható, hogy volt-e és milyen mértékű antibiotikum-termelés (több antibiotikum messzebbre diffundál, rövidebb teszttelep ábra) ábra: Antibiotikum-termelők szűrővizsgálati tesztje 2. Egy japán gyógyszergyárban új enzimtermelő mikrobát kerestek szűrővizsgálattal. A cél a 7- aminocephalosporánsav (7-ACA) oldallánc-módosításával félszintetikus cephalosporinszármazékok előállítása volt, amihez 7-ACA-deacetiláz enzimre volt szükség. A 7-ACADA enzimtermelők kiválogatása érdekében a táptalajba 7-ACA-t adtak egyedüli szénforrásként, így csak az ennek hasítására képes mikrobák szaporodhattak el. A vizsgált különböző fajok közül a Rhodotorula glutinis élesztő került ki győztesen a feladatra. 3. Enziminhibítorok keresésére sikerrel alkalmazták a mikrotiter módszert, amelynek feltétele valamilyen kis léptékben is alkalmazható színreakció. A β-laktamáz inhibítorok keresésekor az enzimaktivitás-csökkenést követték nyomon valamilyen színreakcióval (pl.: penicillin esetében a β-laktamáz enzimaktivitásának eredményeként keletkező penicilloinsav sztöhiometrikusan oxidálható jóddal, így a keményítő-jód kék komplexe elszíntelenedik, β-laktamáz inhibítor jelenlétében kék marad).

25 1. Alapismeretek, ipari mikrobiológiai módszerek A gyógyszergyártás során gyakran szükséges a gyógyítás eléréséhez valamely receptor blokkolása vagy egy anyag receptorhoz kötésének megakadályozása kompetitiv receptor antagonistával. Az erre alkalamas metabolitok keresésekor általában a receptort kipreparálják és mikrotiterlemezre immbolizálják színreakcióval kombinálva. 5. Új biotranszformációkhoz szükséges mikrobák szűrővizsgálatára példa a múltból és a jelenből is [6] a compactin-pravastatin átalakítás esete. A compactin egy penicilliumok fermentációjával előállítható vegyület, amelyből szelektív hidroxilezéssel pravastatint lehet előállítani, amely a máj koleszterinszintézisét szelektíven gátolja, ezzel elősegítve a kardiovaszkuláris betegségek gyógyítását. A szűrővizsgálat során különböző szénforrások mellett 500 mg/l compactint adtak az agaros tápközeghez, és több mint 100 compactin rezisztens mikroba közül sikerült két jó hidrexilező aktivitásút kiválasztani (Pseudonocardia autotrphica, Streptomyces griseolus). 6. A szűrővizsgálatokat egyre gyakrabban alkalmazzák olyan metabolitok keresésére, amelyek az immunrendszerre hatnak (pl.: immunszupresszánsok). Ilyenkor a screening során a fehérvérsejtekkel (limfocitákkal) való reakciót vizsgálják. 7. Az agrár-biotechnológia területén rovarkárosító metabolitokra végeznek gyakran szűrővizsgálatokat. Ilyenkor a screening rendszer a célrovart vagy annak hernyóját is alkalmazza. Mikrobiológiai szűrővizsgálatokat alkalmaznak továbbá új gyomirtószerek, haszonnövénynövekedést serkentő (auxinhatású) metabolitok keresésére is tesztnövény screeningbe iktatásával. Gyakran van szükség egy ismert hatóanyag jogvédett előállításának alternatívájára is, ilyenkor szintén szűrővizsgálattal keresnek másik termelő mikroorganizmust. Végezetül meg kell említeni, hogy a törzsfejlesztés (ld. Törzsfejlesztés) során is alkalmaznak szűrővizsgálatokat az új mikrobák között a kedvezőbbek kiszűrésére. Identifikáció A mikrobiológiai azonosítás (identifikáció) célja az új izolátumok rendszertani meghatározása, besorolása. Ehhez számos tulajdonságot kell megvizsgálni, amelyekkel az adott faj egyértelműen meghatározható. A rendszertan (taxonómia) valamilyen hasonlóságaik alapján rendszerezi az élőlényeket. A(z ipari) mikrobiológia hőskorában a rendszertani besoroláshoz a külső megfigyelések és (később) a biokémiai tulajdonságok alapján osztályozták a mikroorganizmusokat. Napjainkban a rendszertan átalakulás alatt van, mert a modern géntechnikák lehetővé tették a molekuláris (gén) szintű rokonságok feltérképezését, és ez gyakran eltér a külsőleg megfigyeltektől. Meg kell jegyezni, hogy az ipari mikrobiológia területén gyakran szükséges ugyan az új izolátumok azonosítása, ám sok esetben ezeket a költséges és munkaigényes vizsgálatokat nem, vagy csak részben végzik el iparjogvédelmi célzattal, hogy ne lehessen könnyen lemásolni a technológiát. A klasszikus rendszertani besoroláshoz a következő vizsgálati szempontok szerint írják le az izolátumokat: makroszkopikusan: telep morfológiája, színe, szaga, mérete mikroszkopikusan: A) vizuálisan: sejt mérete, alakja, mozgásszerve, sejtmagja B) mikrobiológiai festésekkel: Gram-festés (sejtfal), spórafestés, csillószínezés, tokfestés stb. biokémiai reakciók: oxidázpróba (aerotolerancia), továbbá indol-, ureáz-, kénhidrogén-, arginin-, xilóz-, ammoncitrátpróbák, aerob/anaerob dextróz fogyasztása. A rendszertannal bővebben foglalkozik e jegyzet a 3. fejezetben.

26 26 Ipari mikrobiológia Törzsfejlesztés A fermentációs iparban kevés természetből izolált eredeti mikrobát használnak. Mivel egy fermentáción alapuló technológia költségét alapvetően befolyásolja a termelő mikrobatörzs hatékonysága (hozam, produktivitás, végtiter), ezért különösen a régebbi technológiák az eredeti termelő törzset mára már jelentősen továbbfejlesztették. Noha a felsorolt 3 kulcsparaméter (hozam, produktivitás végtiter) jelentősen javítható technológiaoptimálással (ph, oldott oxigén, hőmérséklet, keverés, lépték stb.), de csak bizonyos korlátokig, ám jobb termelő törzzsel optimálás után még sokkal jobb hatékonyság érhető el. Mivel a fenotípusos tulajdonságokat a genom (genotípus) határozza meg, ezért ezt kell megváltoztatni a fejlesztés érdekében. Klasszikus törzsfejlesztés videó: Klasszikus törzsfejlesztés A klasszikus technika véletlenszerű mutációk segítségével változtatta meg a termelő mikroba genomját, majd a megváltozott képességű utódok közül szelektálta a jobban teljesítőket (=random mutagenezis+screening). Ilyen UV-val generált random mutagenezist mutat be az videó. A véletlenszerű mutációk generálása, majd a kedvezőbb klónok szelekciója azt eredményezi, hogy a kívánt cél eléréséhez igen nagyszámú mutánst kell létrehozni, és így igen sok mutáns utód közül kell kiszűrni a jobban teljesítőket. Ez azt is jelenti, hogy noha a termelési körülmények eltérnek a laboratóriumitól, mégis kizárólag kis léptékben lehet gazdaságosan törzsfejlesztést véghezvinni. A laborléptékben jól teljesítő mutánsokat azután fokozatos léptéknöveléssel (pilot plant = kísérleti (fél) üzemi léptéken keresztül) lehet a termelési szintre juttatni. Általában a törzsfejlesztés olyan ciklikus folyamat, ahol a fent leírt random mutagenezis+screening kombinációt folyamatosan ismétlik. Az egyetlen lehetőség a véletlen mutációk irányítására a szelekciós nyomás alkalmazása, azaz olyan körülmények alkalmazása, amely már a célnak megfelelő mikrobák kitenyésztését segíti, a nem megfelelőkét hátráltatja. A modern géntechnológiák lehetővé tették, hogy a korábbi véletlenszerű (random) mutációk helyett célzott genetikai változást lehessen eszközölni, és így a vizsgálandó mutánsok száma is radikálisan lecsökkent, ami a törzsfejlesztés (költség)hatékonyságát nagyban megnövelte. A célzott genetikai beavatkozásokhoz ismerni kell a genom és a funkció kapcsolatát, az anyagcsereutakat és azok szabályozását (gén azaz expresszió szintű szabályozás, vagy fehérje szintű szabályozás (aktivátor/inhibítor), előre/visszacsatolások) Noha hatékonysága kisebb, mégis napjainkban is gyakran használt módszer a klasszikus mutagenezis+screening kombinációja a törzsfejlesztés céljából. A random (véletlenszerű) mutációk előidézésére kémiai vagy fizikai mutagéneket alkalmaznak. Míg fizikai behatásként UV besugárzást szokás alkalmazni, a leggyakoribb kémiai ágens a nitrozoguanidin (ami a DNS-t változtatja meg), illetve bázisanalógok, amelyek hibás DNS-replikációt eredményeznek, valamint a frame shift mutagének (általában akridin festékek, amelyek eltolják egy vagy néhány bázispárral a leolvasási kódot). Bár a random mutagenezis+screening rendkívül egyszerű (és olcsó, ezek miatt használatos még ma is), komoly kihívást jelent a megfelelő mutagén dózis megtalálása. Túl nagy dózis esetén annyi mutáció jut egy sejtre, hogy az elpusztul, és a mutációk után nem marad túlélő. Túl alacsony dózis pedig nagyon kisszámú mutációt eredményez, amelyek között kisebb valószínűséggel található

27 1. Alapismeretek, ipari mikrobiológiai módszerek 27 kedvező fenotípusú egyed. Az UV sugárzásnál a besugárzási idő és a fény intenzitása a két optimálható paraméter, amelyek függenek a gazdaszervezettől. A kémiai mutagéneknél az egyik paraméter a kontaktidő, a másik a mutagén koncentrációja. Mivel ezek fajtól függetlenül a DNS-t változtatják meg, általában rákkeltőek! A random mutációt követő szűrővizsgálat is kétféle elven történhet: A) a random módszer minden izolátumot megvizsgál termelőképességre, míg a B) racionális módszer valamely biokémiai tulajdonsághoz köti a termelőképességet, és ezt a biokémiai tulajdonságot monitorozza (pl.: antimetabolit rezisztens törzsek sokkal több metabolitot termelnek, ha túlélnek). Modern törzsfejlesztés anyagcsere-mérnökség (metabolic engineering) [21] A modern törzsfejlesztés során a genetikai eszközök kihasználásával a klasszikus véletlenszerű (random) genomváltozásokat lehet kiváltani célzott változtatásokra. Ezáltal jelentősen megnő az esélye a kívánt tulajdonságú mikroba elérésének (nem kell sok véletlen mutációra várni), és jelentősen lecsökken a fölöslegesen vizsgált (a nem megfelelően mutálódott) minták száma. Ezzel együtt is a modern törzsfejlesztés a klasszikushoz hasonlóan gyakran cirkuláris (ismétlődő) műveletsorból áll ( ábra) ábra: A modern törzsfejlesztés vázlata A fejlesztés a meglévő törzs metabolikus fluxus analízisével kezdődik, majd ennek módosítását kell megtervezni a célnak megfelelően (melléktermékképző útvonalak kikapcsolása, új útvonal génjeinek bevitele, kofaktoregyensúly megtartása stb.), majd a szintézis során a terveknek megfelelő mikrobát lehet létrehozni. Ezt követően ismét analízisre van szükség, és esetleg ennek során további fejlesztés (tervezés+szintézis) lehetősége merül föl, illetve kiderülhetnek olyan, korábban ismeretlen szabályozási mechanizmusok, amelyek a megváltoztatott genom következtében megzavarják, megváltoztatják a mikroba valódi metabolizmusát a tervezettől eltérően. Azokban az esetekben, amikor heterológ fehérjeexpresszióra van szükség a termelő mikroba kialakításához (azaz pl.: új terméket kell előállítani egy adott gazdaszervezettel, vagy ki kell terjeszteni a szubsztrát spektrumát), a metabolic engineering folyamat metabolikus útvonaltervezéssel kezdődik. Ez tartalmazhat empirikus terveket vagy kivitelezhető in silico analíziseket, azaz a sejtek részletes metabolizmus modelljét. Ezután az útvonaltervezés után a tervezett törzs elkészítése, majd további optimalizálás következik a metabolic engineering ciklus szerint. Míg a molekuláris biológia gyors fejlődésével a szintézislépés sok esetben viszonylag triviálissá vált (még ha az ipari törzsek fejlesztése az alacsony transzformációs hatékonyság miatt fáradtságos is), addig a gyors és hatékony iparszerű környezetben végezhető fenotípus-meghatározás eszközei az analízis lépéshez hiányosak. A teljes genomszekvenciák rendelkezésre állása új HighThroughput System (HTS) analitikai technikákat eredményezett a transzkriptom, proteom, metabolom számára. Ezek a technikák azonban további finomításra szorulnak, hogy a szabályozókat azonosítani lehessen, amelyek kulcsszerepet játszanak a másodlagos anyagcsere útvonalak fluxusainak szabályozásában.

28 28 Ipari mikrobiológia Mivel ezen a területen gyakran esik szó egy szervezet valamilyen típusú molekuláinak összességéről, ezért ezekre a készletekre a gén genom analógiájára -om végződéssel (angolban omics ) bevezettek további fogalmakat. A gén genom felől indulva az RNS-készlet következik transzkriptom elnevezéssel, majd a proteom (fehérjekészlet), illetve az ezek regulátorainak összessége, az interaktom (kölcsönhatók). Bevezették továbbá a metabolitok összességére a metabolom és a fluxusok összességére a fluxom elnevezéseket is. A biológia központi alapelve ( central dogma of biology ), hogy az információ a DNS-en tárolódik, onnan íródik át az RNS-re, amiről pedig a fehérjék szintetizálódnak. Kiderült azonban, hogy számos olyan szabályozási funkció létezik, amelyek miatt egy-egy génhez nem lehet egyértelműen funkciót rendelni. Ezért létre jött egy új kutatási terület a funkcionális genomika (functional genomics), amelynek feladata, hogy egy adott gén által kódolt fehérje funkcióit feltérképezze. Ehhez azonban szükséges volt a sejten belüli folyamatok analitikájának fejlődésére. Az anyagcsere-mérnökség legfőbb célja, hogy genetikai manipulációkkal fejlessze a termelő törzs metabolikus fenotípusát. A kapott fenotípusok ennek ellenére gyakran szuboptimálisak és nem kielégítőek a genetikai módosítások közvetett hatásai vagy ismeretlen szabályozó kölcsönhatások miatt. Ezért erősen ajánlott a teljes metabolikus szabályozást figyelembe venni az anyagcseremérnökség során. A metabolizmus szabályozása vagy enzim, vagy gén szinten fordul elő. Utóbbi globális szabályozók és/vagy szigmafaktorok hatása alatt áll. A génszabályozások változnak az idővel a tenyésztési feltételektől vagy a sejt állapotától függően. A klasszikus metabolikus mérnöki megközelítések egyik hátránya, hogy ezt nem veszik figyelembe, vagy kevés figyelmet tulajdonítanak ennek. Bőséges információ áll rendelkezésre a lokális genetikai szabályozásról és a sejtmetabolizmus biokémiájáról, illetve fiziológiájáról, de meglepően keveset tudunk a teljes anyagcsere átfogó szabályozásáról. Sőt, noha a HTS technikákban benne van a lehetőség, hogy a transzkriptomok, proteomok, metabolomok és fluxonomok közötti mehanizmust feltárja, többségük csak pillanatképet ad egy állapotról, és az a módszer, ami a különböző szintű információkat egységbe foglalná még ismeretlen. Így még mindig messze vagyunk a szabályozási elvek sejtszintű megértésétől. Bár már sikerült megalkotni az Escherichia coli teljes sejtmodelljét, még fontosabbá vált az in vivo vizsgálatok analízise és a posztgenomikai kutatásokhoz a sejtek egész rendszerének együttes kezelése. Ezen cél eléréséhez fontos az anyagcsere átfogó szabályozásának vizsgálata a különböző szintek (genom, transzkriptom, proteom stb.) információinak integrált figyelembe vételével A legfontosabb információ a komplex anyagcsere-szabályozás mechanizmusának megértésében a centrális anyagcsere fluxusainak eloszlása lehet, mivel ez a gén- és fehérjeexpresszió (vagy enzimaktivitás) és az intracelluláris metabolitok kifejeződése. A metabolikus fluxus analízise a kulcsmetabolitok anyagmegmaradási elvén alapszik. A sejten belüli fluxusokat a mért fluxusokból anyagmérlegek segítségével határozzák meg. A mérhető külső fluxusok száma korlátozott, és a sztöhiometriai korlátok miatt gyakran alulhatározott algebrai rendszert kapunk. Ezért kofaktor anyagmérlegeket is néha be kell vonni a sztöhiometriai modellbe, vagy egy optimalizálandó objektív függvényt kell bevezetni. A centrális anyagcsere anabolikus és katabolikus funkciókat is ellát (felépítő és lebontó is), hiszen kofaktorokat és építőköveket szolgáltat a makromolekulák szintéziséhez (anabolizmus), csakúgy, mint az energiatermeléshez (katabolizmus). Az optimálást a katabolizmus vagy az anabolizmus, vagy mindkettő szempontjából el lehet végezni a sztöhiometriai korlátok mellett. A fluxusmérleg-analízist széleskörűen használják a steady state (állandósult állapot) metabolikus fluxusainak becslésére a sejtnövekedés maximalizálásának érdekében. Az E. coli szinte optimálisan hasznosítja a szénforrást, ami ennek a törzsnek a különleges előnye. Ennek ellenére a fluxusszámítások pontossága a kofaktorbecslések megbízhatóságától függ, és a megfelelő objektív függvényválasztástól. Ismeretlen reakciók jelenléte, amely kofaktort generál vagy fogyaszt, érvénytelenítheti azt a megközelítést, hogy a kofaktor koncentrációja egyensúlyban marad, és a kiválasztott objektív függvény nem lesz megfelelő, vagy a megbízhatósága csak bizonyos sejtállapotokra fog korlátozódni. Egy alternatív megközelítés az izotóp-nyomkövetés, ami mérhető mennyiségeket határoz meg az intracelluláris fluxuseloszláshoz kapcsolódóan. Izotóppal jelzett szubsztrátot lehet adni a sejtnek, és a

29 1. Alapismeretek, ipari mikrobiológiai módszerek 29 jelölt szénatom el fog oszlani az anyagcsere-hálózaton. A végső izotópdúsulás a sejten belüli metabolitkészletben mérhetővé válik. A biomassza-hidrolizátumokban az aminosavak sokkal nagyobb feleslegben vannak jelen, mint prekurzoraik a centrális metabolizmusban. Így könnyebb következtetni a proteinogén aminosavak jelölt mintázatából az intracelluláris metabolitok jelölési mintájára a prekurzor aminosav kapcsolat alapján. A nyomjelző kísérletek általában NMR spektroszkópiát használnak vagy GC-MS technikát. Az NMR-t a C 13 helyi dúsulásának meghatározására egydimenziós H 1 NMR-rel végzik, vagy az izotopomerek mennyiségi meghatározására egydimenziós C 13 NMR-t, vagy kétdimenziós C 13 H 1 COSY NMR-t alkalmaznak. Bár a C 13 NMR egy hatékony és vonzó technika a metabolikusfluxus-analízis számára, nagy mennyiségű mintát igényel, és a módszer nem képes detektálni a metabolitokat 10-4 M-os koncentráció alatt. Másrészt a GC-MS módszer könnyen analizál 10-7 M-os koncentrációban is. Mindezek miatt a GC-MS megfelelő lehet az alacsony biomassza-koncentrációjú tenyészetek fluxusanalíziséhez is. Pillanatnyilag ezek a nyomkövető technikák a közvetlen extracelluláris fluxusmérésekkel kombinálva a legmegfelelőbb módszerek az intracelluláris metabolikus fluxuseloszlások (metabolic flux distribution=mfd) megállapítására, csupán néhány modellezési feltételezést használva. Emellett a fluxusarány-analízis is használható az elágazások fluxusainak megállapítására. Bár alkalmazásaikban a TCA ciklusra korlátozódnak, néhány további analitikai megoldást a jelölési kísérletekhez számba kell még venni. A becsült fluxusok konfidencia-intervallumát statisztikai analízissel lehet megadni. A jelölési kísérletek tervezésének optimalizálására is fejlesztettek már ki módszereket, és így azonosíthatósági analíziseket is bevezettek. Bár a C 13 fluxusanalízist széles körben alkalmazzák az olyan mikrobákra, mint E. coli, Corynebacterium glutamicum, Saccharomyces cerevisiae, Bacillus subtilis, más élőlényekre is kiterjesztették, mint például cianobaktériumok, növényi sejtek és emlős sejtek (köztük egér-, agyi és idegsejtek, valamint rákos sejtek). Az proteogén aminosavak izotopomer eloszlásainak használata esetén egy jelentős korlát, hogy csak steady-state esetben alkalmazható. Annak érdekében, hogy az analízist az iparilag érdekes szakaszos tenyésztésekre vagy dinamikus analízisre lehessen kiterjeszteni, az intracelluláris metabolitokat kell először meghatározni. Ezek mérhetőek CE-TOF-MS, GC/MS-MALDI/TOF, MS, LC-MS/MS, vagy LC-MS technikákkal 2. A fluxus dinamikáját GC-MS rendszerrel egymagában is lehet mérni 1,3-propándiolgyártás során. A nem stacionárius fluxusok analíziséhez gyakran kinetikai modelleket is felhasználnak. Mivel az elsődleges metabolitkészlet nagyságrenddekkel kisebb, mint a proteogén aminosavakból felépített molekulakészlet, az izotópeloszlás hamarabb éri el az állandósult állapotot. A fluxusváltozás becsülhető a készletméretekkel felírt differenciálegyenletekkel. Mind a számításos fluxusmérleg-analízis (fluxus balance analysis FBA), amely mátrix műveletek segítségével képes kezelni a több tucat metabolikus reakcióegyenletet, mind pedig a fluxusok meghatározására bevezetett kísérletes MFD módszerek hasznosak a sejtfiziológia megértésében. FBA egyszerre tud kezelni több száz metabolikus útvonalat, míg a kísérletes megközelítés hasznos a főbb metabolikus útvonalak elsődleges meghatározásában. A fluxuseredményeknek összhangban kell lennie vagy integrálva kell lennie más információkkal, mint például az anyagcserefluxusok irányával, az enzimek metabolitok általi allosztérikus szabályozásával és transzkripciós szabályozásokkal stb., mivel a metabolikus háló funkcionális viselkedése a génexpresszió, fehérjeexpresszió és az intracelluláris metabolitok koncentrációjának eredménye. A jelentős méréstechnikai fejlődésnek köszönhetően minden szintű omics -nak a globális monitorozása lehetséges. Annak érdekében, hogy a metabolikus szabályozás tisztázódhasson, nagyon fontos a metabolikus fluxusok és a többi omics integrálása. Ez a systems biology-nak keresztelt, viszonylag új tudományterület feladata. Meg kell jegyezni, hogy a génexpresszió, fehérjeexpresszió, sejten belüli metabolitkoncentráció közvetlenül mérhető, míg a metabolikus fluxusok vagy reakciósebességek nem, ezért becsülni kell őket. A számos megvalósult példa közül az Escherichia coli-n végzett szisztematikus anyagcseremérnökséget mutatjuk be. Az E. coli teljes levegőztetés mellett is termel jelentős mennyiségű ecetsavat, amely 10-30%-a is lehet a teljes szénfluxusnak. Ennek oka az, hogy nem megfelelően kontrollált a glükóz felvétele, és a túl sok intracelluláris glükózlebontási terméket (azaz piruvátot) a citrátkör nem tudja elég hatékonyan feldolgozni, ezért vagy előbb acetil-coa, majd abból ecetsav képződik (Pta+Ack, azaz PhosphateAcetylTransferase+Acetil-kináz), vagy a piruvátból közvetlenül (pox azaz 2 Balla József: Analitikai kémia, Budapest, BME

30 30 Ipari mikrobiológia piruvát-oxidáz) is ecetsavat állít a sejt elő, előbbi esetében ATP is keletkezik. A glükóz elfogyása után az ecetsavat visszaalakítja a sejt ATP segítségével acetil-coa-vá, és a citrátkörön és a terminális oxidáción keresztül energiatermelésre fordítja. Mivel az ecetsavképződés jelentős szubsztráthányadot elhasznál, illetve citotoxikus metabolitként a sejtnövekedést gátolja, a kiküszöbölése alapvető fontosságú az E. coli-val végzett rekombináns (heterológ) fehérjeexpresszió és -előállítás során. Az egyik lehetőség, hogy csökkent aktivitású glükóztranszferrel rendelkező mutánsokat kell létrehozni a piruvát akkumlációjának elkerülésére, vagy lehet a glükózkoncentrációt rátáplálásos technika segítségével alacsony értéken tartani, illetve lehet a foszfotranszferáz rendszer (PTS) glükózspecifikus enzimének expresszióját csökkenteni egy represszor molekula expresszáltatásával. Ezeken felül lehetőség van a citrátkör és a glioxilát ciklus intenzifikálására is. Ez utóbbi enzimeit az acebak gén kódolja az izocitrát-dehidrogenázzal együtt. Ez a gén ecetsavon vagy zsírsavakon történő növekedéskor aktív, glükózon, glicerinen és piruváton represszálva van. A regulon transzkripciós faktorai közül a fadr mutációjával elérhető, hogy az utóbbi szénforrásokon is aktív legyen az acebak gén. Így tehát a citotoxikus és szubsztrátveszteséget okozó ecetsav képződése kiküszöbölhető az E. coli-nál ( ábra) ábra: E. coli ecetsav képzésének eliminációja: A) glükóz transzfer deficiens mutáns, B) acebak génekkel megnövelt glioxalát- és citrátkör- aktivitás.

31 1. Alapismeretek, ipari mikrobiológiai módszerek 31 A tejsav fermentatív előállításának régóta ismert problémája, hogy a jól termelő lactobacillustörzsek igen összetett tápanyagforrásokat (pl.: élesztőkivonat) igényelnek, amelyek viszonylag költségesek, és feleslegük drágítja, illetve nehezíti a downstream folyamatokat. Ezért E. coli-t is módosítottak úgy, hogy elfogadható tejsavtermelővé váljon. Ehhez a törzs glükóz- specifikus PTS fehérjéjének, illetve a piruvát-formiát-liáz enzimének, valamint a saját laktátdehidrogenázának génjét inaktiválták, és egy lactobacillus eredetű L-LDH (laktát-dehidrogenázt) expresszáltattak vele. Így az E. coli alkalmassá vált több mint 70 g/l koncentrációban tejsavat termelni 77%-os hozammal ecetsav, etanol, formiát és D-tejsav nélkül Mikroorganizmusok ipari alkalmazása A mikroorganizmusok ipari alkalmazásakor a leghatékonyabb termelés érdekében különböző igényeik (tápkomponens, levegőztetés, ph stb.) figyelembe vétele és kielégítése a biotechnológus feladata. Részletesen ezekkel a feladatokkal a Biomérnöki műveletek 3 foglalkozik, de néhány mikrobiológiai aspektust e jegyzet keretein belül is célszerűnek véltünk tárgyalni. Az oxigén szerepe A mikrobák centrális (központi) anyagcseréje a következő sémával szemléltethető ( ábra) G L I K O L Í Z I S Terminális oxidáció ábra: A mikrobák centrális anyagcseréje A központi anyagcsereút során a szénforrás lebontása (pl.: cukrok) a glikolízissel kezdődik és a piroszőlősavig tart. Az ebből képződő acetilcsoport lép be a citrátkörbe, ahol az oxálecetsavval összekapcsolódik, és a képződött citromsav két lépésben dekarboxileződik, és CO 2 kerül kibocsátásra (ld ábra). A citrátkör során a szén-dioxid-távozás mellett redukált koenzimek is keletkeznek (NADH 2 ), amelyek a terminális oxidációban a légköri oxigén segítségével a respirációnak nevezett folyamatban regenerálódnak jelentős ATP energia keletkezése közben. Ha a mikroba légköri oxigént használ, akkor gyakran találkozik peroxigyökökkel, amelyek igen reaktívak, és így kártékonyak a sejtekre. Ezek közömbösítésére az aerotoleráns és/vagy aerob mikrobák kataláz enzimeket termelnek (gyakran peroxiszómában), amelyek a káros peroxidgyököket ártalmatlanítják. A fermentatív anyagcsere esetében azonban nincs lehetőség a légköri oxigén felhasználására a redukált koenzimek regenerálása céljából így energianyerésre sem, ezért különböző szerves vegyületek (metabolitok) segítségével történik meg az oxidáció és a kisebb mértékű, de nélkülözhetetlen 3 Lásd Sevella Béla: Biomérnöki műveletek és folyamatok. Budapest, Typotex Kiadó, 2011

32 32 Ipari mikrobiológia energiatermelés. Ezek a különböző erjedési folyamatok, amelyek megkülönböztetendők az anerob légzéstől (amikor is az elektrondonor szerves molekula, pl. cukor), de az elektronakceptor sem nem a légköri oxigén ((légzés)), sem szerves anyag (fermentáció), hanem oxigéntől eltérő szervetlen molekula). Oxigénigény szempontjából a mikrobák lehetnek aerobok (életfunkcióhoz szükséges a légköri oxigén), aerotoleránsok (nincs szükségük oxigénre, de el tudják viselni ((általában kataláz pozitívak)), fakultatív anaerobok (ha van oxigén, használják, ha nincs, akkor is élnek és szaporodnak), obligát anaerobok (nincs szükségük oxigénre, és nem tudják elviselni sem (toxikus rájuk nézve). A jegyzetben tárgyalt anyagcsere utakat foglalja össze a 2. fejezetben részletesen tárgyalt Anyagcsere utak összefoglalása című hyperpicture. Aerobok tenyésztése Az oxigén egy különleges szubsztrát, mert gázhalmazállapotban kell a rendszerbe juttatni, és a redoxegyensúlyon keresztül az oxigén mennyisége befolyásolhatja a mikroba anyagcseréjét. Egyes fermentációk a termék-előállításhoz oxigénfelesleget igényelnek (ekkor maximális a termékhozam), mások pedig különleges oxigénprofilt, esetleg oxigénlimitet. Mindezek miatt az aerob fermentációknál vagy felületi tenyésztést kell alkalmazni (szilárd fázisú fermentáció, nem igazán lehet az oxigénszintet szabályozni), vagy a fermentlébe beoldódott oxigén mennyiségét mérni és gyakran szabályozni kell, amihez a legcélszerűbb az oxigénelektród használata (pl.: Clark-féle elektród 4 ). Az elektród szolgáltatta jel alapján több helyen lehet beavatkozni: 1) keverési sebesség növelésével csökken a buborékméret és nő az anyagátadási felület, tehát javul az oxigénellátottság; 2) a levegő térfogatáramának növelésével szintén több oxigén juttatható a fermentlébe; 3) nagyobb nyomású levegő alkalmazásával is több oxigén vihető be; 4)végső esetben oxigénnel dúsított levegőt is lehet használni. Noha a hőmérséklettől jelentősen függ a telítési oxigénkoncentráció (amitől pedig az oxigénbeoldódás hajtóereje függ), az alkalmazott hőmérsékletet általában a mikroba hőmérsékleti optimuma határozza meg. A magas hőmérsékleten végzett fermentációknál tehát komoly gondot jelent a megfelelő levegőztetés biztosítása, mert C-on már rosszul oldódik az oxigén (pl.: Thermus thermophylus) Az ipari fermentációknál (pl.: citromsav- vagy fehérjetermelés E. coli-val) gyakran jelent problémát, hogy a nagy léptékű reaktorok alja és teteje között jelentős hidrosztatikai nyomáskülönbség van, ami miatt az oxigénbeoldódás is különbözik, tehát inhomogénné válhat a reaktor. Ennek kiküszöbölésére több helyen vezetnek be levegőt a fermentorba. A fejtérbe vezetett levegővel a habzás mértéke is visszaszorítható. Anaerob fermentációk (erjesztések) A fejezet elején már részletesen bemutattuk az oxigént hasznosító és nem hasznosító mikroorganizmusokat. Az oxigént nem igénylő mikrobákat (obligát anaerobok, aerotoleránsok, fakultatív anaerobok) tenyésztési szempontból most egyszerre tárgyaljuk. Mindegyik fajta tenyésztésekor mentesülünk a levegőztetés okozta problémáktól (oxigénlimit, magas keverő fordulatszám és nyíróerő, habzás stb.). A szigorúan anaerobok esetében azonban inert gáz bevezetésére és alapos eloszlatására (diszpergálására) van szükség, pont, mint az oxigén esetében, ezért ilyenkor gyakran ugyanazt a gázbevezető rendszert használják, mint a levegőztetéskor. A klasszikus fermentációs ipar a primer metabolitok termelésével alakult ki. Ezek nagyobb, iparilag is hasznosítható mennyiségben a különböző erjesztések során keletkeznek, amikor a cukor részben savakká és alkoholokká oxidálódik, részben pedig az eközben keletkezett redukált koenzim (NADH2) regenerációjakor redukált szerves vegyületekké alakul (pl. piroszőlősavból tejsav képződik stb.). Ezeket az erjesztéseket tekintjük át az alábbiakban. 1. Etanolos erjedés A hexózok erjesztésekor élesztők (Saccharomyces cerevisiae) és egyes baktériumok (Zymomonas mobilis) metabolizmusa során 1:1 arányban etilalkohol és szén-dioxid keletkezik a piroszőlősavon (glikolízis) keresztül. Az első lépés a hexokináz katalizálta szubsztrát 4 Lásd Sevella Béla: Biomérnöki műveletek és folyamatok. Budapest, Typotex Kiadó, 2011

33 1. Alapismeretek, ipari mikrobiológiai módszerek 33 foszforilezés, majd a foszfo-frukto kináz által végzett második foszforilezés eredményeként a 6 szénatomos szubsztrát 2 db 3 szénatomos glicerin-aldehid foszfátra bomlik, amelyek a glikolízisben foszfoenolpiruvát-piroszőlsav-acetaldehid-etanol útvonalon alakulnak át a termékké. A szubsztrát felvétele történhet A) támogatott diffúzióval vagy B) aktív transzporttal. Előbbire azért van szükség, mert noha a sejten kívüli térben található magasabb koncentrációban a szubsztrát így a spontán diffúzió is a felvételt segíti, de viszonylag nagy molekulájúak a monoszacharidok, amelyek ezért csak lassan tudnak a sejtmembránon átjutni, ezért hordozó molekulák segíthetnek. A termékleadás egyszerű diffúzióval történik, így a magas termékkoncentráció gátolhatja a saját képződését. A diszacharidok különböző utakon jutnak el a lebontó apparátushoz: a szacharóz esetében az invertáz enzim a periplazmás térben hasítja két monoszacharidra a szubsztrátot, amelyek onnan a fenti mechanizmus szerint hasznosulnak; a laktóz először transzportálódik, majd intracelluláris β-galaktozidáz hidrolizálja; maltóz esetében ugyanez a helyzet, de α-glükozidáz végzi az első intracelluláris hasítást Napjaink kutatásainak fókuszában állnak azok a mikroorganizmusok (pl.: Pichia stipitis), amelyek pentózokból képesek etanol előállításra, mivel a 3. generációs bioetanol-előállítás hemicellulóz-tartalmú növényi hulladékok felhasználását tűzte ki célul (a keményítő- és cellulózalapú technológia után). Az etanolos erjedés melléktermékei lehetnek az acetaldehid (néha akkumlálódik, de etanollá alakulhat), illetve a glicerin-aldehid-3-foszfát akkumlációjával a glicerin jelenik meg melléktermékként. Tapasztalatok szerint az optimális erjesztéshez némi oxigén is szükséges (a biomasszanövekedéshez, mert teljesen anaerob körülmények mellett erre képtelenek az élesztők). Az alkoholos erjedésnél két szabályozási mechanizmust kell figyelembe venni: Pasteur-effektus az oxigénlimitben műkődő tenyészet anaerob metabolizmusra vált (lassabb szaporodás, ami oxigént igényel és etanoltermelés); Crabtee-effektus: magas cukorkoncentráció esetén a biomassza-képződés helyett az aerob fermentáció anaerob anyagcserére helyezi a hangsúlyt, mert korlátozott a terminális oxidációs kapacitása a mikrobának. Az etanoltermelés során így szubsztrát- és termékinhibíció is fellép, utóbbi kb g/l titernél, ami épp a gazdaságosan kinyerhető termékkoncentráció határán mozog. A termék etanolfelhasználása széles körben ismert, mint például fertőtlenítőszerek, tisztítószerek, italok, üzemanyagok, szintézisek stb. 2. Tejsavas erjedés A tejsav termelődése igen gyakori az élővilágban a mikrobáktól kezdve az emberig bezárólag. A mikrobák esetében a legjelentősebb tejsavtermelők a tejsavbaktériumok (lactobacillusok, lactococcusok, pediococcusok, streptococcusok, leuconostoc fajok stb. ), bacillusok, egyes gombák (pl.: Rhizopus) és élesztők (pl.: Kluyweromyces lactis). A tejsavas erjedés tipikus példája a terminális oxidáció pótlásának: oxigén hiányában a redukált koenzim (NADH 2 ) visszaoxidálásához a centrális metabolizmus molekuláját a piroszőlősavat használják a molekulát a laktát-dehidrogenáz enzim segítségével, így a koenzimből NAD a piroszőlősavból tejsav keletkezik. A lactobacillusok emellett a saját biomasszájuk felépítésére szerves nitrogénforrásokat igényelnek, amelyek nitrogéntartalma mellett a széntartalom is tápanyagként szolgál, az emellett jelen lévő szénhidrátok bontásával pedig a piroszőlősavon keresztül történő tejsav-előállítás során energiát termelnek, így bizonyos esetekben a cukor szinte kizárólag tejsavvá alakul (magas ~95-99%-os hozammal). Míg a szubsztrát általában aktív transzportal jut be (pl.: glükóz, laktóz permeáz segítségével), a termelt tejsav disszociálatlan formában szabadon ki/be jut, ám ez toxikus a sejtekre nézve. A laktátion a protonokkal együtt szimport formában transzportálódik.

34 34 Ipari mikrobiológia A bejutott szubsztrát metabolizmusa szerint a tejsavtermelőket két csoportra szokás osztani: homofermentatívak és heterofermentatívak. Előbbiek esetében a hexózok az Embden Meyerhof Parnas (glikolízis) útvonalon keresztül 1:2 mólarányban tejsavat képeznek, míg a heterofermentatívak előbb dekarboxilezik a hexózt (a szén-dioxid távozását buborékolás jelzi), majd a képződött pentózból tejsavat (3 szénatom) és valamely 2 szénatomos mellékterméket képezik, általában ecetsavat vagy alkoholt. Nyilván a fehér biotechnológia számára a homofermentatívak a kedvezőek a magas hozammal és konverzióval, de a heterofermentítvak is iparilag jelentősek: az élelmiszeriparban használatosak, ahol a melléktermékek aránya adja a kívánt aromát, ízt. A tejsavtermelők általában fakultatív anaerobok, ami ipari szempontból szintén kedvező, hiszen nincs szükség költséges levegőztetésre, sem inert gázra, a spontán beoldódó oxigén viszont nem zavarja a mikrobákat, ugyanakkor gázbevezetés híján habzással sem kell számolni, ettől a reaktor is jobban kihasználható. A termék tejsav széles körű felhasználással rendelkezik az élelmiszeriparban, gyógyszer- és higiéniás termékekben, polimer,- bőriparban stb. Egy speciális eset a Rhizopus oryzae, amely oxigén jelenlétében a cukrokat szén-dioxiddá oxidálja, és biomasszát képez, anoxikus (kevés oxigén) körülmények között tejsavat termel, ám teljesen anaerob körülmények között etanol a főtermék. Noha a termékprofil nagyban függ a morfológiájától, a fenti három eset általános e fonalas gombánál. A tejsavtermelés szempontjából a pelletes morfológia a legkedvezőbb, amelynek kialakulása viszont igen sok tényezőtől függ ábra [7]. Anyagátadási szempontok miatt az optimális pelletek sima felületűek és 1-2 mm átmérőjűek. Egy ilyan pellet felszínét mutatja be az video, illetve különböző morfológiák láthatók az ábrákon. Szilárd részecskék Keverés Törzs Felület aktív anyagok Polimerek Spóra konc. Spóra kora Tápközeg ph Pellet képződés ábra: A pelletképződést befolyásoló tényezők Pelletes morfológia

35 1. Alapismeretek, ipari mikrobiológiai módszerek ábra: Bolyhos pellet (1-2mm) ábra: Óriás (1cm) pellet és szabálytalan alakú pellet ábra: Amorf és óriás (2-3 cm) pellet 3. Homoacetogén erjedés ábra: Pelletfelszín mikroszkópos képe (400-szoros nagyítás) Az ecetsavról mint melléktermékről már több esetben említést tettünk, létezik azonban olyan erjedési folyamat, amely a fermentlébe az ecetsavat bocsátja ki fő termékként, és emellett szén-dioxidgáz képződik és távozik a rendszerből. Ilyenkor egy hexózból 2 ecetsav és 2 CO 2 keletkezik, melléktermékként etanol fordulhat elő. A hexózok a glikolízisen át, a pentózok pedig a pentóz foszfát cikluson kersztül bomlanak le piroszőlősavvá, amelyből képződik közvetlenül vagy acetil-foszfáton keresztül az ecetsav. A szubsztrátfelvételre és a termékleadásra a tejsavhoz hasonlóan aktív transzport és disszociálatlan forma jellemző, amely utóbbi ez esetben is citotoxikus hatású. A termelő mikrobák gyakran termofilek (pl.: Clostridium thermoaceticum, Acetogenium kiwi), a képződött ecetsavat pedig jellemzően a vegyipar használja fel (az élelmiszeriparban ezek a mikrobák nemkívánatosak). 4. Propionsavas erjedés A propionsav jellemzően heterofermentációs folyamatok terméke, ahol a főkomponens, a propionsav és mellette az ecetsav, a borostyánkősav és a tejsav is megjelenhet. A termelő anyagcsere során a hexózok a glikolízisen keresztül eljutnak a piroszőlősavig, majd részben tejsavvá és ecetsavvá, részben oxálacetáttá alakulnak, amely utóbbi a fumársav-borostyánkősavpropionilcoa-án keresztül propionsavat képez. Jellemzően mezofil, anaerob mikrobák végzik ezt a fajta fermentációt, mint például Propionibacterium acidipropionici, vagy P. shermanii. A propionsav-baktériumok tejsavból is képesek propionsavat erjeszteni. A megtermelt propionsavat takarmány- és élelmiszer-ipari tartósításra, polimerek és peszticidek gyártására, valamint antifungális szerként is használják.

36 36 Ipari mikrobiológia 5. Butanolos erjedés Butanol fermentációs úton kétféle anyagcserével is keletkezhet: A) hexózok bontásából a glikolízisben piroszőlősav keletkezik, amelynek acetilcsoportját a koenzim-a (CoA) a citrátkörbe szokta vinni, ám két acetil-coa-ból aceton keletkezhet, illetve háromból butiril- CoA, majd abból butanol, és emellett közvetlenül a piroszőlősavból etanol (=ABE), valamint a citrátkörben szén-dioxid; B) izopropil-alkohol képződik egy dehidrogenáz-enzim segítségével az acetonból a butanol és az etanol mellett (=IBE) A technológia nehézsége, hogy a butanol erősebb sejtméreg még az etanolnál is, ezért csak igen kis koncentrációban halmozzák fel a termelő mikroorganizmusok (0,5-1,0% ~10 g/l). Emiatt desztillációs, extrakciós és kihajtásos (strippelés) technológiák szükségesek a feldolgozási műveletek során, amelyek viszonylag magas fajlagos költséget eredményeznek. A legáltalánosabb butanoltermelő mikroba az anaerob mezofil Clostridium acetobutylicum. Ipari butanolos fermentációk az I. világháború utáni német hadiipar számára termeltek butanolt, a későbbiekben a kőolajalapú technológiák alacsonyabb költségei miatt a butanolfermentációs üzemeket bezárták. Napjainkban azonban a bioetanol analógiájára szintén energiahordozóként éli reneszánszát biobutanol elnevezéssel immár a genetikai ismeretek kiaknázásával a butanol fermentációs előállítása. 6. Diolok, triolok, poliolok erjesztéses előállításának áttekintése A) etilénglikol: toxikussága ellenére a borhamisítás kulcsvegyülete, szintetikusan olcsóbb az előállítása B) 1,3-propándiol: (bővebben: 1.1.fejezet 1,3-propándiol előállítás) az enterobakterek, klosztridiumok, egyes tejsavbaktériumok és egyes citrobakterek fajai képesek anaerob körülmények között a glicerinből (a belső redox egyensúly megőrzésének érdekében) 1,3- propándiolt előállítani, miközben a redukált NADH 2 koenzimet visszaoxidálják. Az 1,3- propándiol minden esetben heterofermentatív anyagcserével keletkezik, azonban a melléktermékek a termelő mikrobára jellemzőek (pl.: 2,3-butándiol a Klebsiellákra, vajsav a Clostridiumokra stb.). Glükóz kofermentációja gyakran segíti az 1,3 propándiol képződését (mert több NADH 2 keletkezik a glükóz lebontásakor, amit a propándiol útnak kell regenerálni.) C) 2,3-butándiol: az enterobakterek jellegzetes terméke, amely 2 piroszőlősavból keletkezik. Gumigyártásra és metil-etil-keton (MEK) előállítására használják, amely utóbbival az üzemanyagok oktánszámnövelése érhető el. D) Glicerin (triol): élesztők glükózból termelhetik akár főtermékként is. A bor erjedésekor is keletkezik pl.: Saccharomycesek, Pichiák közreműködésével. A glicerin felel a bor testességért, éppen ezért a bor glicerines feljavítása borhamisításnak minősül. A glicerin régen a szappanfőzés mellékterméke volt, napjainkban egyes biodízeltechnológiák (metanollal történő növényolaj átészterezése estén) melléktermékeként keletkezik nagy mennyiségben némileg szennyezett (metanol, katalizátor, lúg stb.) formában. E) Xillit: xilán hidrolízisével xilóz nyerhető, amelyből pl. Pichiák segítségével xillit állítható elő, és édesítőszerként forgalmazható. F) Szorbit(ol): élesztők (pl.: Zymomonas mobilis) képesek glükózból az etanol mellett szorbitot (az ol végződés az angolból ered, magyarul enélkül is használatos, ez esetben szorbit ) előállítani. Fentiekben tehát különböző anaerob fermentációt, erjesztést soroltunk fel. A levegőztetés problematikája a szubmerz (folyadék fázisú, szuszpenziós) fermentációk óta áll fent, és egy másik klasszikus fermentációs technikával a felületi vagy szilárd fázisú fermentációval részben kiküszöbölhető.

37 1. Alapismeretek, ipari mikrobiológiai módszerek 37 Szubmerz kontra felületi fermentáció Noha a biomérnöki fermentációs tanulmányok során megszoktuk, hogy a mikrobatenyészet az egy adott faj vizes szuszpenziója, és ezzel a természetben is találkozhatunk (aludttej, joghurt stb.), egy adott szubsztrát felszínén történő tenyésztés szintén mindennapos (pl.: penészes kenyér), és ugyanezen folyamat kiaknázható klasszikus technikaként egyes régiókban (főleg Ázsiában). A szilárd fázisú fermentáció (Solid State Fermentation SSF; amely csak rövidítésében azonos az egyidejű cukrosítás és fermentációval Simultan Saccharification and Fermentation!) során a biomasszaszaporítás és termékképzés olyan nedves szubsztráton vagy inert hordozón történik, ahol csak kötött víz található (=vízaktivitás). A természetben ilyen folyamat a komposztálás, silózás vagy a talajszemcsék ökoszisztémája. A felületi tenyésztés előnye a szubmerz technikával szemben, hogy egyszerűbb eszközök és tápközegek használatosak, kevesebb szennyvizet termel, és néha a feldolgozási-tisztítási műveletek egyszerűbbek (könnyebb a biomassza-eltávolítás különösen). Ugyanakkor hátránya, hogy nem minden mikrobával végezhető (pl. baktériumok jelentős része), meglehetősen nehezen kontrollálható, inhomogén rendszer, amitől lassabb a metabolizmus (nincs mindenütt optimális körülmény), és a reakció ez esetben is a kevés kötött vizes fázisban zajlik. Ezért főleg tradicionális ázsiai (pl.: japán) ételek előállításakor használják. Szubsztrát/hordozó oldalról a következő 3 szempontot kell figyelembe venni: 1) Anyaga: lehet mezőgazdasági hulladék (hidrolízis nélkül is hasznosíthatók, szemben a szubmerz fermentációval), szervetlen, nagy szemcsés őrölt kőzet, szintetikus műanyag (poliuretán). 2) A szubsztrát/hordozó karakterisztikáját megadja a porozitás, vízmegkötő képesség, mechanikai tűrés. 3) Szubsztrát/hordozó előkezelést igényel-e, úgymint fizikai előkezelések (aprítás, sterilezés hővel vagy besugárzással), vagy kémiai módszerek (savas/lúgos hidrolízis, extrakció), vagy e kettő kombinációja. Bioreaktor oldalról a következő megoldások használatosak: 1) Forgódobos bioreaktor citromsav-előállításhoz Aspergillus niger fonalas gombával ( ábra) [8] ábra: Forgódobos bioreaktor

38 38 Ipari mikrobiológia 2) Tálcás reaktor (Koii, ábra) [9] ábra: Koji tálcás reaktor A fenti reaktor előnye, hogy a reaktorban a páratartalmat mérni és szabályozni lehet, a tenyészeteket tartó tálcásmodulok pedig alulról csővezeték segítségével fűthetőek/hűthetőek. 3) Töltött ágyas bioreaktor A töltött ágyas reaktoroknál egy oszlopszerű reaktorba durva apríték (darabos) szubsztrátot helyeznek el, amelyet bepermeteznek a termelő mikrobával, és alulról enyhén levegőztetik. 4) Fluidágyas reaktor Nagyon hasonló a töltött ágyas reaktorhoz, de ebben az esetben könnyű a hordozó/szubsztrát, és magasabb a levegő térfogatárama, így a szilárd szubsztrát lebeg. Az intenzívebb levegőztetés miatt könnyebben kiszárad a tenyészet. 5) Toronyreaktor Az elve hasonlít egy rektifikáló kolonnára: fentről engedik be a szubsztrátot, amely halad lefelé, és eközben érintkezik az alulról bevezetett (szembeáramú) levegővel. 6) Alagúttípusú reaktor Lassú futószalag felett növényházszerűen fóliából készült reaktor komposztálási célra.

39 1. Alapismeretek, ipari mikrobiológiai módszerek 39 A fenti reaktorokat mind azzal a céllal fejlesztették ki, hogy a lehető legegyenletesebben szolgálják ki a tenyészet igényeit, és ugyanezen célból legyen beavatkozási lehetőség, azaz bizonyos paramétereket szabályozni lehessen. Szabályozni lenne érdemes a páratartalmat, oxigénkoncentrációt, ph-t, hőmérsékletet. Az alábbiakban néhány példát sorolunk fel ipari szilárdfázisú fermentációra. A) Élelmiszerek előállítása: Penicillium camember, Aspergillus sojae B) Enzimek előállítása: α-amilázok, proteázok Aspergillus oryzae-vel, cellulázok, pektinázok Aspergilus niger. C) Növényvédőszerek: bioinszekticid Beauveria bassiana (ld. később), biopeszticid Fusariumok- ellen antagonista gomba (Trichoderma harzianum) termelése SSF technikával. D) Csiperke (Agaricus bisporus) és laska (Pleurotus ostreatus) gombák termesztése. E) Komposztálás kevert tenyészettel, szabadban. Fontos a levegő arány és a páratartalom. Önmelegedő folyamat. Alkalmas technika a szennyvíziszapok (veszélyes hulladék) kezelésére.

40 40 Ipari mikrobiológia 2. AZ IPARI MIKROBIOLÓGIA BIOKÉMIAI ÉS FIZIOLÓGIAI HÁTTERE 2.1. Szénforrások hasznosulása, különleges metabolizmusok A mikroorganizmusok anyagcsere-folyamatai rendkívül szerteágazóak ezért célszerű valamilyen rendszerben tárgyalni őket. A legegyszerűbb megoldás a szénforrások szénatomszáma szerinti sorbarendezés. C1-források hasznosulása [19] Az 1 db szénatomot tartalmazó szubsztrátok száma igen csekély, ám a mikrobák szerepe itt sem elhanyagolható. Ide sorolhatók a metán (CH 4 ), metil-halogenidek (CH 3 X, X: Cl, Br, stb.), metanol (CH 3 OH), metil-amin (CH 3 -NH 2 ), hangyasav (HCOOH), metilszulfid ((CH 3 ) 2 S)) és a szén-dioxid (CO 2 ). A szén-dioxid-hasznosító mikrobákat metanogéneknek, a többi C1 szubsztrátot hasznosítót metilotrófnak szokás nevezni. Előbbiek definíció szerint szén-szén kötés nélküli szubsztrátot használnak, többnyire oxigén segítségével (tehát aerobok), a metanogének jellemzője pedig a metántermelés. A felsorolt szubsztrátok hasznosítására képes mikrobákat a természetes szubsztrátok környezetéből lehet izolálni: metanolt növények felszínéről (metanol=faszesz), metilamin a halak és növények bomlásakor keletkezik, metilhalogenidet és metilszulfidot pedig a tengeri algák termelnek nagyobb mennyiségben. A C1 szubsztrátok hasznosítása olyan előnyökkel jár, mint a csekély verseny (ipari szempontból ez könnyebb containmentet jelent, azaz csökken a fertőzésveszély), és olcsó kőolajalapú nyersanyagok jöhetnek számításba (ez mindig relatív). Metilotrófok a környezetvédelemben A földi élet szempontjából fontos tevékenység, hogy a metilotrófok az üvegházhatást okozó anaerob lebontások végtermékeként keletkező metánt (21x több hőt tart vissza, mint a szén-dioxid) széndioxiddá oxidálják. Másik fontos metilotróf tulajdonság, hogy számos olyan környezetre káros anyagot képesek átalakítani kevésbé toxikus vagy ártalmatlan vegyületté, amelyek nem igazi szubsztrátjai a mikrobának (nem kerülnek be a sejtbe és haladnak végig valamelyik anyagcsereúton), így a metilotrófok talajremediációban is hasznosíthatók szennyezők, illetve hulladékok lebontására. Metilotrófok a biokatalízisben Kissé szokatlannak tűnhet a metanol (és társai) mint szubsztrát (ok), ám a XX. Század közepén az olajárak kedvező szintjén komoly próbálkozások és beruházások történtek, például a brit ICI vállalatnál kőolaj eredetű metanolon történő SCP (single cell protein) gyártásra. Akkor a metilotróf mikroba összetételét találták táplálkozástanilag megfelelőnek (emberi és) állati fogyasztára. A metanolhasznosítás és a Metanolalapú társadalom ma reneszánszát éli, és ennek jelentős magyar vonatkozása is van. Az 1994-ben kémiai Nobel-díjjal kitüntetett Oláh György kémikus 2005-ben jelentette meg A kőolaj és földgáz után: a metanolgazdaság című értekezését [10]. Ebben 4 érvet sorol fel a metanol mint a gazdaság központi és meghatározó szereplője mellett: 1) a fosszilis készletek (kőolaj, földgáz, szén) fogytán vannak, 2) a légköri CO 2 -ből és CH 4 -ből (üvegházhatást okozó gázok) előállítható, 3) egyszerre lehet energia- és nyersanyagforrás, és 4) könnyen tárolható. A Nobeldíjat egy különleges reakciómehanizmus felfedezéséért kapta Oláh György, amely reakcióban carbocation keletkezik intermedierként. Ugyanez a köztitermék fordul elő a metánból történő bázikuskatalizátor melletti oxidáció, illetve szén-dioxidból induló redukció során. Az már

41 2. Az ipari mikrobiológia biokémiai és fiziológiai háttere 41 ismert volt, hogy metán oxidációjával hangyasav vagy formaldehid keletkezik, de az új reakciómechanizmussal e két termék reakcióját is lehetett magyarázni, amely reakció viszont metanolt termel ( ábra) ábra: Metanol-előállítás szén-dioxidból és metánból Ezek szerint a metanol a természetben is előfordul, és viszonylag környezet- illetve költségkímélő módon szintetikusan is előállítható, tehát egy állandóan rendelkezésre álló, olcsó, tiszta szubsztrát. Ez alapján a jövő biotechnoógiájának egyik kihívása lehet, hogy a metilotrófokat kiaknázhatóvá tegye, azaz a metabolizmus fő fluxusait a főtermék felé lehessen átirányítani, és ezt a fluxust a költséghatékonysághoz szükséges szintre lehessen emelni, illetve a melléktermékképzést (tárolás során képződő metabolitok vagy bomlástermékek, szekretált fehérjék, védekezőrendszerek ((enzimek, antibiotikumok)) lehessen csökkenteni. Mindehhez azonban a metilotrófok anyagcseréjét kell jól ismerni. A metilotrófok a metanolból és a metilaminból is a toxikus intermediert, a formaldehidet képezik, amelyből szén-dioxidot és energiát termelnek, utóbbit redukált koenzimek (NADH 2 ) formájában, illetve a formaldehid vagy ribulóz 5-foszfáthoz kapcsolódik és a RuMP ciklusba kerül (ehhez kapcsolódnak a bioszintetikus utak), vagy szerint képez, és a szerin-cikluson keresztül kapcsolódik a többi asszimilációs úthoz. A metanogének ugyanezt az elvet követik, de első lépésként metánmonooxigenáz-enzimmel (pmmo) a metánból metanolt képeznek, ahonnan már azonosak az anyagcsereútjaik a metilotrófokéval ( hyperpicture) hyperpicture: Az ipari mikrobiológiában fontos anyagcsereutak összefoglalása C2-metabolizmus Az egyedüli, cukrokhoz kissé hasonló kétszénatomos molekula a glikolaldehid. A legegyszerűbb cukorszerű molekula, ezért dióznak is lehet nevezni. A pterin szintézisben játszik szerepet (purinbázis, GTP-ből), és ezen keresztül a fólátok előállításában, amelyek bioszintézisek kofaktorai. A szénhidrátok szintézisének első lépcsője, hogy a formóz reakcióban két formaldehidből glikolaldehid keletkezik, majd újabb formaldehid beépülésével glicerinaldehid, amiből izomerizációval dihidroxiaceton, és ez a glicerinaldehiddel ribulózt, izomerizáció után ribózt eredményez ( ábra).

42 42 Ipari mikrobiológia ábra: Cukorképződés glikoladldehiden keresztül [11] Ezzel együtt azon tulajdonsága miatt is kutatják, hogy 2 formaldehidből keletkezik egy glikolaldehid, és ezt a reakciót (a saját képződését) a glikolaldehid katalizálja, tehát ez az első önreplikáló mehanizmus. A spontán ribózképzés és az önreplikációs képesség miatt az élet nyomainak világűrbeli keresése során az űrkutatás fókuszában áll, továbbá szerin, triptofán, gyógyszer és agrokemikáliák szintézisében is használatos. Reaktív volta miatt azonban természetben nemigen fordul elő, így klasszikus szénforrásként nem áll a mikrobák rendelkezésére. Előállítható szintetikusan és enzimesen etilén-glikolból (pl.: Pichia pastoris alkohol-oxidáz 1 segítségével, vagy Aspergillus japonicus glicerinoxidáz enzim segítségével) is etilén-glikolból. A kétszénatomos vegyületek közül az etanolt is képesek a mikrobák hasznosítani és ecetsavvá oxidálni. Míg a már említett crabtree effektus esetén a terminális oxidáció enzimjeinek túlterheltsége miatt NADH 2 -felesleg keletkezik aminek segítségével az alkohol-dehidrogenáz-enzim (ADH) redukálja az acetaldehidet etanollá, addig a katabolitrepresszió elmúlásával (azaz a cukor elfogyása után) az etanolt NADH 2 (~energia)- termelés mellett ecetsavvá oxidálja a mikrobák egy része szintén ADH segítségével. C3-metabolizmus A három szénatomos cukrok (triózok) az első olyan molekulák, ahol a cukormolekulának aldehid (glicerin-aldehid) és keto formája (1,3-dihidroxiaceton) is létezik. Ezek mellett maga a glicerin is (ami ketocsoport nélküli triol) népszerű három szénatomos szénforrrás. A propionsav-baktériumok pedig a tejsavat is képesek három szénatomos szubsztrátként hasznosítani. A glicerinmetabolizmus útvonalait az 1.1. fejezetben már bemutattuk ( ábra) A tejsav mikrobiális előállítását az 1.3. fejezetben már tárgyaltuk. A tejsav felhasználását a propionsav-baktériumok úgy végzik, hogy első lépésben piroszőlősavvá oxidálják (NAD + független laktát-dehidrogenáz (LDH) segítségével), majd az bekerül a citrát-körbe (oxálecetsavval), és onnan kerül ki propionil-coa formájában. Általában 3 tejsav molekulából 2 propionsav és 1 ecetsav keletkezik 1 szén-dioxid távozása mellett.

43 2. Az ipari mikrobiológia biokémiai és fiziológiai háttere 43 A propionsav-baktériumok tejsavfogyasztó tulajdonságát a tejsavtermelő mikrobák keresésekor is kihasználják a screening vizsgálatoknál a következőképpen: a tápagaron kinövesztik az izolátumokat, UV-val elölik azokat, s föléjük újabb agarréteget öntenek, amelyben nincs szénforrás, és amelyet Propionibacterium shermanii-val beoltanak. Ez egyéb metabolizálható szénforrás híján csak azon izolátumok fölött fog kinőni, amelyek termeltek tejsavat. C4-metabolizmus Négy szénatomos cukor- (szerű) molekulák a glicerin (glycerol) analógiájára az eritrittel (másnéven eritritollal) kezdődnek, amelynek mind a 4 szénatomján 1-1 OH-csoport található ( ábra). Jelentősége, hogy belőle Gluconobacter sejtek fermentációjával eritrulózt lehet előállítani a kozmetikai ipar számára, mert bőrbarnító szerként (a dihidroxiacetonra érzékenyek részére) forgalmazzák. Az eritrulóz (ketoforma) aldóz formáját eritróznak nevezzük ábra: Eritrittől az eritrózig A négy szénatomos cukrok közé tartozik a treóz is, amely az eritróz izomerje. A két középső OHcsoport nem transz, hanem cisz helyzetű a treóz esetében. Az eritróz metabolizmusról keveset lehet tudni (leszámítva, hogy Bertrand már 1900(!)-ban leírta a Gluconobacter suboxydans tenyészet eritrit-ertiróz átalakítóképességét), de nagy valószínűséggel foszforilálódik, majd pedig vagy észterképződik belőle, és szedoheptulóz formájában hasznosul [12], vagy a pentózfoszfát-ciklusba kerül, és energiatermelésre fordítódik [13]. C5-metabolizmus ábra: Pentóz-foszfát ciklus [14]

44 44 Ipari mikrobiológia Az öt szénatomos cukrok javarészt a pentóz-foszfát ciklusban (PFC, angolul: PPP-Penthose phosphate pathway) hasznosulnak ( ábra). Ennek funkciója egyrészt, hogy redukált koenzimet (NADH 2 ) termeljen, amelyből a terminális oxidáció energiát raktároz ATP formájában. Ezen felül a ciklusban számos alapvegyület található, amelyek előállítása is a PFC feladata (ribulóz 5-foszfát, szedoheptulóz- 7-foszfát, Fruktóz-6- foszfát, glicerin-aldehid-3-foszfát stb.). Amint az ábráról is látszik, a ciklus egy oxidatív, és egy nem oxidatív szakaszra bontható. Előbbi feladata a dekarboxilezés, utóbbié a cukrok felépítése, illetve a lebontó anyagcsere számára a glicerin-aldehid-3-foszfát előállítása. C6-metabolizmus A cukorhasznosítás központi útvonala a glikolízis. A hat szénatomszámú cukrok elsősorban ezen keresztül jutnak el a piroszőlősavig, majd a TCA cikluson keresztül szén-dioxidként a légkörbe és NADH 2 -ként a terminális oxidációba kerülnek aerob körülmények esetén. Egyes esetekben (pl. heterolaktikus erjesztés) egy dekarboxileződés után a pentózfoszfát-ciklusba kerülnek, és azon keresztül jutnak el a piroszőlősavig. C7-metabolizmus A hét szénatomos cukrok kevésbé jellemzőek a mikrobiális anyagcsere-folyamatokban, mint kisebb szénatomszámú társaik. Leggyakoribb képviselőjük a szedoheptulóz ( ábra). OH OH HO O OH OH OH ábra: Szedoheptuloz Nevezéktanuk is eltér a kisebb cukormolekuláktól: a hét szénatomos szerkezetet általában két kisebb szénatomszámú cukor nevéből nevezik el ( ábra) Jelentőségük a mikrobiális liposzaharidokban van. H OH OH OH OH OH OH OH D-gluco D-glicero ábra: D-glicero-D-gluko-heptulóz Speciális energianyerő metabolizmusok (biometallurgy) A szénforrások gyakran az energiaforrás szerepét is betöltik, az alábbiakban azonban olyan különleges mikrobák kerülnek bemutatásra, amelyek szokatlan reakciókkal nyerik a szükséges energiát. Ilyenkor gyakran különböző fémek redox átalakításának pozitív energiamérlegét aknázzák ki a mikrobák, ezért iparilag is fontos lehetőséget rejtenek ezek a metabolizmusok a biobányászat (biometallurgia) területén. Az érckinyerés és feldolgozás együttes neve a metallurgia. Ebben tudnak a speciális anyagcseréjű mikrobák segíteni, ezért nevezik ezt biometallurgiának. A metallurgiában az ásványokban kötött fémek kinyerésére vagy a klasszikus olvasztást használják, vagy valamilyen kioldást (=angolul: leaching ). A leaching során 4-féle eljárás áll rendelkezésre:

45 2. Az ipari mikrobiológia biokémiai és fiziológiai háttere 45 1) savas kioldás (pl.: Zn), 2) lúgos kioldás (pl.: Al), 3) magas hőmérsékletű kioldás (pl.: S 2- ), 4) kioldás komplex képzéssel (Au). Ilyen kioldási folyamatot képesek a mikrobák is előidézni ( bioleaching ), például a kalkopirit ( ábra, legelterjedtebb rézásvány, CuFeS 2 )-ből a réz kioldására képesek az Acidiphilium-törzsek (A. multivorum, A. cryptum, A. organovorum) a egyenlet szerint. Az Acidiphiliumok az alfaproteobakterek közé tartozó valódi baktériumok ábra: Kalkopirit [15] CuFeS 4Fe 2Fe Cu 2 2S 5Fe 3 2H 0,5O 2Fe H O egyenlet Ezeket a szokatlan és nemrégiben felfedezett mikrobákat Peng és mtsi [16] a következőkkel jellemezte: Gram-negatív spórátlan pálcák, amelyek hőmérsékleti optimuma 40 C, ph optimuma 3,5 (!). A tenyésztésükhöz használható tápközeget a táblázat mutatja be, amelyen 40 óra alatt lezajlik a fermentáció táblázat: Acidiphiliumok tápközege Komponens Koncentráció (g/l) (NH 4 ) 2 SO 4 3 MgSO 4 *7H 2 O 0,5 K 2 HPO 4 0,5 KCl 0,1 Ca(NO 3 ) 2 0,01 Szerves anyag 2 Élesztő kivonat 0,01% A tenyészetet FTIR-rel vizsgálva megállapították, hogy polihidroxibutyrate-ot termel. Jó növekedést tapasztaltak ramnóz, xilóz, mannit, fruktóz, glutaminsav és glicerin szénforrásokon, de nőtt szaharózon, laktózon, hisztidinen, glutaminon és etanolon is. Tetraciklinnel és ampicillinnel szemben érzékenynek találták ezeket a mikrobákat, míg a sejtfalszintézist gátlókkal (penicillinek cefalosporinok) szemben nem.

46 46 Ipari mikrobiológia Rendszertanilag a valódi baktériumok (Eubaktériumok)\Alfaproteobakterek\Nitrospira csoportba tartoznak közeli rokonaikkal a Leptospirillumokkal együtt. Ez utóbbi baktériumok vasoxidálók, ezért a vaskinyeréshez használják iparszerűen óriási folyamatos üzemű oxidáló tartályokban. Nagy hasonlóságot mutatnak, de a filogenetika szerint nem közeli rokonok a fentiek a szintén acidofil vasoxidáló Ferroplasmákkal. Például a Ferroplasma acidophilum egy 35 C-os hőmérsékleti optimummal rendelkező (mezofil) savkedvelő mikroba 1,7(!) ph optimummal, amely főleg a savas bányameddőben (salak) található meg, különösen a pirit- (FeS) tartalmúban. Általában azért ezekben a savas ércmaradványokban tenyészik, mert itt már más mikrobák (pl.: Leptospirillumok és Acidiphilumok) lesavanyították a ph-t, olyan mértékben, amely az autotróf Ferroplasma számára optimális. Ilyen körülmények között Ferroplasma már tud energiát nyerni a pirit Fe 2+ ionjainak oxidálásával, amelyhez O 2 -t használ terminális akceptorként. A folyamat során melléktermékként kénsav termelődik. Ez tovább savanyítja a tápközeget Primer metabolitok Az életfolyamatok következtében a tápközegbe kikerülő metabolitokat nevezzük elsődleges (primer) metabolitoknak. Az életfolyamatokat a hasznosítandó szubsztrátok szerint csoportosítva már bemutattuk (2.1. fejezet). Általában a különböző erjedések (amelyeket már szintén tárgyaltunk 1.3. fejezet) termékei tartoznak ide, mint etanol, ecetsav, tejsav, propionsav, 1,3-propándiol, aceton, butanol, vajsav. Ezek némlyikét élelmiszer-ipari, de főleg vegyipari célokra, illetve bioüzemanyagként használják. Mindezek azt jelentik, hogy nagy mennyiségben alacsony áron kell ezeket előállítani, ezért igen hatékony anyagcseréjű termelő mikrobákra van szükség, amely képes jó hozammal jó konverziót elérni viszonylag gyorsan (=jó produktivitás). Fiziológiai szempontból általában az energiatermelő folyamatok (NADH 2 regenerálás, glikolízis, TCA ciklus stb.) melléktermékei Szekunder metabolitok De novo szekundermetabolit-termelés A primer metabolitokkal szemben a szekunder metabolitok termelése nem a normál életfolyamatok következménye, hanem a speciális környezeti feltételek által kiváltott reakcióé. A szekunder metabolitok funkciója ugyanis előnyszerzés biztosítása megromlott életkörülmények (megváltozott ph, csökkent tápanyag, csökkent élettér) esetén. Ilyen helyzeti előnyök kovácsolásával elősegíthető az egyed és a faj fennmaradása nehéz időkben is. Társadalmi szempontból a mikrobiális és növényi szekunder metabolitok játszanak fontos szerepet. A szekunder metabolitokkal kapcsolatban néhány fogalmat illik tisztázni: anti- biosz=élet elleni, tehát az antibiotikum minden élőlény elleni szer inhibítor=gátlószer, ami lassítja, vagy megállítja a növekedést sztatikum= leállítja a növekedést (pl.: fungisztatikum) cid=pusztító (bakteriocid, fungicid, viricid) A helyzetielőny-szerzésre különböző stratégiák közül választhat egy adott élőlény: A) Mozgás (baktériumok, protozoák mozgásszervvel rendelkezhetnek, és vizes közegben képesek a helyváltoztatásra, növények pedig helyzetváltoztatásra). B) Terjeszkedő típusú növekedés (pl.. fonalas gombák gyors kolonizációja, mindent beborító penészfonalak, ehhez szükséges a félnedves szubsztrát). C) ph megváltoztatása metabolitokkal: savtermelők (ph-t le), ammonifikálók (ph-t fel) D) Hőmérséklet lokális megváltoztatása a mikrokörnyezetben (pl.: nagy mennyiségű metabolikus hő termelése, ami megemeli a hőmérsékletet (pl.: komposztban, silóban), és ez kedvez a termofileknek. E) Sziderofórok (erős fémkomplexképzők) közegbe bocsátásával az enzimek esszenciális fémkofaktorainak elszívása.

47 2. Az ipari mikrobiológia biokémiai és fiziológiai háttere 47 F) Antibiotikumok (szekunder metabolitok) termelése, amelyek a többi élőlényre káros hatással vannak (sejtfalszintézist, fehérjeszintézist gátolnak stb.). G) Extracelluláris enzimek termelése több célból is, például a nehezen hozzáférhető szubsztrátok mobilizálására (amilázok, cellulázok stb.), vagy a konkurencia bontására (lizozim, kitináz stb.) Az ipari mikrobiológia szempontjából az F) és G) pontok az érdekesek, ám figyelembe kell venni, hogy a természetben az így kibocsátott anyagok (szekunder metabolitok és extracelluláris enzimek) csak mikrokörnyezetben kell hogy hassanak, ezért a természetből izolált termelő törzsek csak kis koncentrációban termelik ezeket az ágenseket, illetve a túl nagy dózis a termelő mikrobát is károsíthatja. A legfontosabb szekunder metabolitokat foglalja össze táblázat táblázat: A legfontosabb mikrobiális szekunder metabolitok. A szekunder metabolitok működését hatásuk szerinti csoportosításban mutatjuk be [17].

48 48 Ipari mikrobiológia Antagonizmusok kialakítása 1A) gomba és baktérium küzdelme során a Cephalosporium gramineaum fonalas gomba a baktérium sejtfalszintézisét gátló antibiotikumot termeli, de csak az őszi búza felszínén (in vitro Petri csészén nem) 1B) mikoparazitizmus: egyik gomba a másik élősködője. Pl.: az északi fenyő parazitája egy rozsdagomba (Monocillin nordinii), amelyen élősködik a Cronartium coleosporioides gomba, és ezt antibiotikum termeléssel éri el. Ezt az antibiotikumot fel lehet használni a fenyőkártevő ellen. 1C) bakteriális predáció áll fenn a Mixobaktériumok és áldozataik között, amely utóbbiakat antibiotikum segítségével ölik el Olykor előfordul olyan is, hogy saját fajtársai ellen termel antibiotikumot egy mikroba, pl.: Pseudomonas phenazinium (fenazin típusú antibiotikumot termel), és az antibiotikumot nem termelő fajtársaikat alaposan túlnőtték. 1D) bakteriális kompetíció: az amőbák általában baktérimokat esznek, de egyes baktériumok (pl.: Serratia marcescens) piros pigmentanyagot termelnek, ami elöli a protzoát (az albino, azaz pigmentmentes fehér baktérium nem váltott ki cisztásodást, spóraképzést pusztulást az amőba részéről) 1E) mikroorganizmus kölcsönhatása magasabb rendű élőlényekkel: gyakran toxintermelés (növény ellen fitotoxin, ami gyakran más mikrobákra is antagonizmussal hat, mintegy antibiotikum), amire a növény fitoalexin (~növényi antibiotikum) kiválasztásával válaszol. 1F) mikrobák inszekticid hatására példa a Beauveria bassiana (fonalas gomba) rovarok ellen, illetve a Bacillus thüringiensis endospórájának ciklikus δ-toxinja a szúnyogok ellen. A kullancsok is rendelkeznek letalitással járó gombás parzitával. A kullancsok természetes ellenségeinek felhasználása a kullancspopuláció visszaszorítása érdekében a Biokontroll. Mivel 4 ellenségét ismerjük a kullancsoknak, ők a potenciális jelöltek a biokontroll-funkció betöltéséhez. a) sisakos guineai madár kullancsokkal táplálkozik, ám ha sikerülne vele kullancslétszámot csökkenteni, akkor a madárpopuláció is csökkenne, ettől megint nőhetne a kullancsok száma, ekkor a madarat újra kellene telepíteni b) kullancsok rovar parazitája az Ixodiphagus, amely a darázsfélékhez tartozik, és 0,1-5 mm-es nagyságú. Petéit a kulllancsba rakja, amelyek kikelésükkor megölik a kullancsot c) fonalféreg- (nematóda) parazitával, de ez csak a vérrel magát jól teleszívott nőstény kullancson hat d) fonalas gombák parazitizmusa: Metarhizium anisopliae (zöld mészkór), Beauveria bassiana (fehér mészkór), Lecanicillium psalliotae, Paecilomyces fumoroseus). A Metharizium anisopliae [18] már rendelezik ipari felhasználással a maláriaszúnyog, kullancs- és termeszirtások során. Az imperfect gombák aszkomiceta csoportjába tartozik óta ipari lipáztemelő is, mert az indiai biodízelgyártás során szobahőmérsékleti optimummal rendelkező lipázokra volt szükség. Inszekticid hatásának kifejtésekor megkapaszkodik a konidiospórája a rovar felszínén, és kutikulumbontó enzimekkel hifát növeszt a rovar kültakarójába. Amint átér a rovar páncélján, találkozik annak immunrendszerével, ezért vagy maszkíroznia kell magát, hogy az immunrendszer ne taszítsa ki, vagy immunszupresszánsok termelésével csökkenti az immunrendszer hatékonyságát. A M. anisopliae metabolitjai a destruxinok, amelyek 5 aminosavból és hidroxisavból felépülő cirkuláris fehérjék. Ez lehetőséget teremt a rekombináns biopeszticid termelésre. A destruxinok egyébként citotoxikusak, mert Ca 2+ transzportot végeznek, és így az izmokat is blokkolják. Már több mint 30-féle destruxin szerkezetét derítették fel és írták le.

49 2. Az ipari mikrobiológia biokémiai és fiziológiai háttere 49 1G) Mikrobák antagonizmusa magasab rendű álatok (és ember) felé: például a fuzáriumos búza nem alkalmas még takarmányozási célra sem, mert a károsító fuzáriumok mikotoxinokat termelnek, amelyek mind a haszonállatot, mind az embert veszélyeztetik. A ragadozók is a mikrobák temelte mikotoxinok miatt esznek általában friss húst, kivéve a dögevők. A poshadt víz ivásakor a vízben lévő algák termelte toxinok okoznak rosszullétet. 2) Fémionszállító metabolitok A fémionok (főleg kationok) fiziológiai szerepe meghatározó, mivel az enzimkatalízis kofaktorai, ezért egyes esszenciális fémionok elszívása a konkurencia elől komoly előnyhöz juttatja a fémionszállító metabolit termelőjét. A nitrogénfixáló baktériumok esetében például a nitrogenáz- enzim Mo 2+ jelenlétében a legaktívabb, más fémionokkal csökkent aktivitású. A fémionszállító metabolitok általában ionofórok, azaz olyan transzmembrán ágensek (többnyire peptidek), amelyek az ionok (elsősorban alkáli, és alkáliföldfém) áramlását a sejtmembránon keresztül meghatározzák vagy aktív transzporttal, vagy csatornaképzéssel. A vasszállító faktorok (=sziderofórok) sok esetben antibiotikus hatásúak. A primer és szekunder metabolitok határán helyezhetők el, mert ugyan nem szükségesek a növekedéshez, de vashiányos körülmények között stimulálják a növekedést. A mikrobasejteknek kétféle fémszállító rendszere van: egy kis és egy nagy affinitású. Utóbbihoz tartoznak a sziderofórok is. Amíg van elegendő fémion jelen, addig a kis affinitású rendszer működik. Ám a fémion csökkenése (pl.: valamilyen kelátképző megjelenése miatt) aktiválja a sziderofórtermelést. Számos Streptomyces, Nocardia és Micromonospora faj termel sziderofór faktorokat. A sziderofórok antibiotikus hatása abban nyilvánul meg, hogy termelőjük kiéhezteti a konkurenciát vas szempontjából, mivel az nem képes a vas-szideramin komplex felvételére, és így nem jut vashoz. A sziderofór termelője pedig komplex formában lévő vasat veszi fel. Ilyen antibiotikum a nocardamin és a desferritriacetilfusigen. Az ionofórok feladata mikrobákban, hogy segítsenek fenntartani a magas intracelluláris K + /Na + arányt is, azaz a koncentráció gradiens miatt kijutott káliumionokat visszapumpálják a sejtbe, miközben a szintén koncetrációgradiens miatt bejutott nátriumionokat kipumpálják a közegbe. Az ionofór antibiotikumok közé tartoznak az enniatinok is, amelyek a destruxinokhoz hasonlóan ciklikus peptidek és a K + /Na+ transzportban vesznek részt [20]. Piacon lévő ionofór antibiotikumok a calcimycin, ionomycin, lysocellin és a lasalocid, amelyek a Grampozitív mikrobák ellen hatásosak. 3) Mikroba és növény szimbiózisa szekunder metabolitok segítségével 3A) Tipikus példa a növény-fonalas gomba szimbiózisára az ektomikorhiza, ahol a növényi tápanyagfelvételt a gyökér körül elhelyezkedő fonalas gomba segíti. Ilyenkor gyakran (pl.: fenyőféléknél) termelnek a növény védelme céljából antibiotikus hatású szekunder metabolitokat a baktériumok ellen, csökkentve a betegségveszélyt, és előnyhöz juttatva a szimbiózist a tápanyagversenyben. 3B) Sziderofórok segítségével baktériumok is élhetnek növényekkel szimbiózisban, ahol a sziderofórt termelő baktérium segíti a növény növekedését. A pszeudobaktin termelő Pseudomonas fluorescens vagy Pseudomonas putida például elszívja a vasat a kórokozók elől egy lineáris hexapeptid (sziderofór) segítségével. 4) Mikroba -nematóda szimbiózisa szekunder metabolit segítségével Xenorhabdus luminescens baktérium és rokonai a Xenorhabdus fonalférgek endoszimbionitái. Ez a szimbiózis együtt támadja meg a rovarokat, amelyeket a baktérium által termelt antibiotikum pusztít el, és amely antibiotikum a többi baktériumot is távoltartja a rovartetemtől.

50 50 Ipari mikrobiológia 5) Mikroba-rovar szimbiózist is lehetővé tesznek egyes szekunder metabolitok Erre példa a rizsen élő barna szöcske, amelyben élő Bacillus polymyxin polymyxin antibiotikumot termel (ami egy ciklopeptidből és egy hidrofób farokból áll, és a Gramnegatívak lipopoliszaharid rétegét károsítja), és így védi a szöcskét a rizs flórájától (pl.:xanthomonas campestris). 6) Ferromon szerepű szekunder metabolitok 6A) A Mucorales nemzettségnél hím(+) és nőstény(-) ivarú gaméták találkozásakor a heterotallikus (+ és -) hifákból történő zigóta kifejlődéséhez trisporinsav szükséges, de ennek bioszintetkus útvonala részben a +, részben a - ivarú fonalakon van kódolva. 6B) Allomycesek esetében a szirenin nevű szekunder metabolitra a mozgékonyabb hím gaméták a nőstények felé vándorolnak kemotaxissal. 6C) Egy különleges szimbiózis esetében a rovar (poszméh) nemi ferromonját az emésztőcsatornájában élő Aspergillus ochraceus termeli. 7) Morfológiai differenciálódást is befolyásolnak a szekunder metabolitok Az antibiotikum-termelés gyakran a prespora fázisban történik, a vegetatív forma hanyatló fázisában. A spórázás és az antibiotikum-termelés közötti kapcsolatot többféleképpen is bizonyították, például egyes asporogén mikrobák elvesztették antibiotikum-termelő képességüket, illetve a spóraképzés inhibitora gátolta az antibiotikum-termelést is. A Bacillus brevis a spórájának külső felszínére Gramicidin S-t (szekunder metabolitot) választ ki, amely gátolja az elektrontranszport láncot és a kicsírázást. Extracelluláris proteázzal le tudja hasítani, és így a csírázást megindítani. Penicillium brevicompactum mikofenolsavat termel a kondidium tartók kifejlődésekor, aminek hatására a tartó a fény felé fordul. A másodlagos anyagcsere a primer anyagcsere során keletkező metabolitokból építi fel a szükséges szekunder metabolitokat. A főbb útvonalak az acetil-coa-ból keletkező lipidek, illetve az oxálecetsavból induló szekunder metabolitok, valamint a szintén acetil csoportból induló terpenoidok. A szekunder metabolitok előállítását számos tényező befolyásolja. Mind szén-, mind nitrogénforrás tekintetében a nehezebben hozzáférhető, limitált mennyiségű tápanyag kedvez a másodlagos anyagcseretermékek keletkezésének. Így szénforrásból a különböző poli- és/vagy oligoszacharidok kedvezőbbek az egyszerű cukroknál. Nitrogénforrásként a fehérjék alkalmazása nem javasolt, mert a belőlük keletkező aminosavak negatív visszacsatolással hatnak a saját szintézisükre, és ezen keresztül a szekunder anyagcserére. Foszforforrás tekintetében is a lassúbb növekedés (limitáció) a kedvező. Néha szükséges lehet egy-egy kulcsenzim termelődésének indukciója a hatékony másodlagos anyagcseréhez, mint például Acremonium crysogenum esetében metioninadagolással lehet a cephalosporin-szintézist fokozni, vagy a Claviceps törzseknél az ergot alkaloidok szintéziséhez triptofánadagolást alkalmaznak. További tényezők lehetnek a minor komponensek (fémionok) és az oldottoxigén-koncentráció, amelyek a szubsztrátokhoz hasonlóan hatnak (limitáció a kedvező), illetve a CO 2, amely gátolja például a penicillin képződését, vagy a fény, amelyről csak kevés adat áll rendelkezésre. A mikrobaszaporodási fázis (trofofázis) és a termék keletkezésének fázisa (idiofázis) a szekunder anyagcsere sajátosságaként különválik (míg a primer metabolitok termelése általában növekedéshez kapcsolt a termék képződése), és gyakran az idiofázis alatt alkalmazandó hőmérséklet alacsonyabb, mint a trofofázisé. Szteroid- (szekunder metabolit) konverzió A szteroidok közös vonása a kémiai alapváz ( ábra), hogy a másodlagos anyagcsere termékei, valamint hogy fontos fiziológiai szerepük van az alacsonyabb rendű és a magasabb rendű élőlények-

51 2. Az ipari mikrobiológia biokémiai és fiziológiai háttere 51 ben, így az emberben is. Ez utóbbi tulajdonságuknak köszönhetően a gyógyszeripar számára régóta fontos vegyületek, így előállításuk és hasznosításuk számos kutatás tárgya ábra: A szteránvázas alapvegyület a koleszterin szerkezete Bioszintézisük során a sejtek acetil-coa-ból építik fel több lépésben az allilpentenil-pirofoszfátot és az izopentenil-pirofoszfátot, amelyek addíciójából szkvalenon keresztül épül fel az alapvegyület, a lanosterin. A szteroidneogenezis során ennek módosításával keletkezik a többi szteránvázas vegyület. A szteroidok csoportosítása a funkció és a bioszintézis, valamint a termelő élőlény szerint történik ( ábra), így megkülönböztetünk: ábra: Szteroidok családfája [22] - Állati szteroidokat - ízeltlábúak szteroidjai - gerincesek szteroidjai - hormonok: a kortikoidok olyan hormonok, amelyeket a mellékvesekéreg termel (innen a név cortex kéreg). Megkülönböztetjük a sóháztartásban szerepet játszó mineralokortikoidokat és