Mikrobiológia laboratóriumi gyakorlat BMEVEMBA312

Átírás

1 Mikrobiológia laboratóriumi gyakorlat BMEVEMBA312 Tárgyfelelős: Dr. Fekete-Kertész Ildikó Segédanyag a közös mikroszkópos gyakorlatokhoz Dr. Fekete-Kertész Ildikó Dr. Janzsó Béla Dr. Molnár Mónika Tolner Mária

2 A mikroszkóp története Mi a mikroszkóp? precíziós optikai műszer - lencsék kombinációja nagymértékben felnagyított képet ad kisméretű élőlényekről vagy apró tárgyakról - Mikor hasznos? - Ha a vizsgálandó tárgyak/élőlények annyira kicsik, hogy puszta szemmel láthatatlanok. Mi a mikroszkopizálás? Különféle apró tárgyak, élőlények, minták vizsgálata mikroszkóp segítségével. Ki találta fel a mikroszkópot? Nem köthető egy ember nevéhez! 1590 körül két holland szemüvegkészítő, Zaccharias Janssen és fia, (10x- vagy 30x) 1609-ben Galileo Galilei a lencsékkel kapcsolatos munkássága során továbbfejlesztette az élességállításhoz szükséges, eredetileg Janssen által készített eszközt. A dán Anton von Leeuwenhoeket tartják a mikroszkóp atyjának az általa bevezetett újítások és fejlesztések miatt (270x nagyítást ért el). Ez vezetett el végül az első, valóban használható mikroszkópokhoz. Robert Hooke (17. század) Parafa kéreg vizsgálata, sejt szó megalkotása ben Anton elsőként láthatta és írhatta le, miként fest egy baktérium, az élesztőgomba, egyes növények és maga az élet nyüzsgése egyetlen csepp vízben. Az 1930-as évek elején az első elektronsugárral működő mikroszkópokat is kifejlesztették, amelyek valódi áttörést jelentettek ezen a területen, mivel az elérhető nagyítást az addigi 1000x-esrol akár x-re is növelték.

3

4 Mikroszkóp képalkotása 1. B: preparátum c : az objektív által alkotott, fordított állású nagyított valódi kép c : az okulár által c -ről alkotott nagyított virtuális kép Mikroszkóp nagyítása: objektív x okulár

5 A mikroszkóp felbontóképessége d = az a legkisebb távolság a tárgyon, amelynek végpontjait a mikroszkópos képen még különállónak látjuk Abbe d = λ / sinµ ill. λ / n sinµ ahol λ: a megvilágító fény hullámhossza, µ: a beeső fény-nyaláb félkúpszöge n: a preparátum és az objektív közötti közeg törésmutatója n sinµ = A (NA) az objektív numerikus aperturája levegő n = 1 immerziós olajok n = 1,3-1,6 Olajimmerzió használata csak speciális objektívvel!

6 A mikroszkóp felbontóképessége (folyt.) Az optikai tengellyel párhuzamos megvilágítás esetén: d= λ / n sinµ = λ / A Ferde megvilágítás esetén: d= λ / 2 n sinµ = λ / 2A

7 Mikroorganizmusok Az egyedfejlődés bizonyos szakaszaiban szabad szemmel nem látható élőlények A szöveti differenciálódás nem indult el Max. sejtes szerveződési szint Egysejtűek: prokarióták vagy eukarióták Többsejtűek: fonalas telepes lemezes Cönocita: nem valódi többsejtű (Pl. pseudo micéliumos gomba) Magasabb rendű organizmusok Olyan többsejtű szervezetek, ahol a szöveti differenciálódás már megindult.

8 Az élőlények öt világa Vírusok? Önálló szaporodásra, anyagcsere tevékenységre nem képesek Obligát paraziták

9 Tápközegek o Mi minden szükséges a sejt felépítéséhez? Biogén elemek, nyomelemek, ásványi anyagok o Szilárd (szilárdító komponens?) o Folyékony o Természetes (Pl?) o Mesterséges (szintetikus) o Steril legyen! o Törzstenyészetek

10 Élesztőgombák vizsgálata A) natív egyszerű vizes készítmény B) egyszerű színezés Zsírtalanítás Kikenés Szárítás (lámpabúrán) Rögzítés (láng fölött) Színezés (metilénkék, metilzöld, szafranin) Mosás Megtisztítás Vízbe ágyazás Lefedés C) tartós készítmény

11 Élesztőgombák Saccharomyces cerevisiae (sütő- vagy pékélesztő) Sejtjei oválisak, 5 10 m átmérőjűek, sarjadzással, más néven bimbózással szaporodik.

12 Élesztőgombák Schizosaccharomyces pombe Sejtjei lekerekedett végű henger alakúak. Hasadással szaporodik. Átmérője kb. 3,5 m, hossza pedig kb m. A sarjadzó élesztővel (S. cerevisiae) ellentétben a S. pombe osztódása szimmetrikus: két (közel!) azonos méretű leánysejt keletkezik.

13 Fonalasgombák (penészgombák) vizsgálata o A) natív egyszerű vizes készítmény o B) Lupéval (okulár) o C) Telepmorfológia sztereomikroszkóppal o D) Vájt tárgylemezen

14 Penészgombák Mucor sp. (fejespenész) Mucor mucedo tenyészet Mucor racemosus spóratartó fejek (sporangia) spórákkal

15 Penészgombák Rhizopus sp. Rhizopus stolonifer spóratartó fej Rhizopus nigricans tenyészet kenyéren lépegető penész

16 Penészgombák Aspergillus sp. Aspergillus niger (feketepenész vagy korompenész) konídiumtartóról lesodródott konídiumok konídiumtartó térhatású felvételen

17 Penészgombák Penicillium sp. Penicillium expansum ecsetszerű konídiumtartók és lesodródott konídiumok konídiumtartó térhatású felvételen Penicillium sp. tenyészet Petri-csészében

18 Baktérium sejtformák

19 Baktériumok mozgásszervei (falgellumok) A monotrich B lofotrich C amfitrich D peritrich

20 Endospórás baktériumok példa: (Kivéve a Clostridium nemzetség) Sterilezés!!!

21 Fonalas baktériumok (sugárgombák) Actinobacteria (Actinomycetes)

22 Fonalas baktériumok fejlődési ciklusa

23 Baktériumok Streptomyces sp. (fonalas baktériumok) Streptomyces coelicolor tenyészete Petri-csészében Streptomyces rimosus

24 Streptomyces platensis fonalas sejtek és a fonalak végéről lefűződő és szabaddá vált spórák

25 Baktériumok Lactobacillus plantarum Scanning elektronmikroszkópos felvétel Mikroszkópos felvétel festett preparátumról

26 Baktériumok Lactococcus (Streptoccocus) lactis Scanning elektronmikroszkópos felvétel Mikroszkópos felvétel Gram színezett tenyészetről (Gram+ baktérium)

27 Baktériumok Escherichia coli Fakultatív anaerob, pálcika alakú baktérium. Általában peritrich csillós, de lehet csillótlan is. Könnyen és jól tenyészthető. Rendszerint melegvérű állatok tápcsatornájának alsó szakaszában él. A legtöbb szerotípus ártalmatlan, de vannak emberben ételmérgezést okozó változatai is. Fekális eredetű szennyezés indikátora. A veszélytelen törzsek az emésztőrendszer normális flórájához tartoznak, K2-vitamint termelnek. Jelenlétük megnehezíti egyes patogének elszaporodását a bélrendszerben. Gram festés szerint negatív

28 Baktériumok Pseudomonas fluorescens Nagyon változatos metabolizmussal rendelkező, talajban, természetes vizekben gyakran előforduló, ún. ubikviter baktérium. Obligát aerob, pálcika alakú, többszörös flagellummal rendelkezik. Tenyészete UV fényben zöldeskék színben fluoreszkál. Gram szerint (az E. coli -hoz hasonlóan) negatív festődésű.

29 Baktériumok Bacillus subtilis Szénabacilus néven is ismert, a talajban, növényeken általánosan fellelhető Gram+, baktérium. Pálcika formájú, aerob, endospórás. Sok ostora van, ezért gyors mozgásra képes. Bacillus endospórák spóraszínezéssel Scanning elektronmikroszkópos felvétel

30 Speciális és összetett színezési módszerek Mikroorganizmusok minőségi vizsgálata Többféle színezék alkalmazása Célok Mikroorganizmusok differenciálása Speciális sejtalkotórészek kimutatása

31 Gram-színezés Tok kimutatása Mitokondrium kimutatása Glikogén kimutatása Spóraszínezés a/partes-de-la-celula-procariota

32 Baktériumok sejtfaltípusai Szervezet Mollicutes (pl. Mycoplasma sp.), L-forma, szferoplaszt, protoplaszt (pl. Bacillus megaterium), Archea (Thermoplasma, Ferroplasma) Gram-pozitív baktériumok Gram-negatív baktériumok Archea (pl. Halobacterium sp.) Mycobacterium sp. Lampropedia hyalina Sejthatároló felület összetétele Citoplazma-membrán Sejtfal (egyrétegű), citoplazma-membrán Sejtfal (többrétegű), citoplazma-membrán S-réteg (fehérjék), citoplazma-membrán Lipidek és viasz, citoplazma-membrán Külső kettős köpeny, cementálóréteg, sejtfal, citoplazma-membrán Speciális jellemzők Nincs sejtfal Vastag peptidoglikán (murein) réteg, Mgribonukleát Vékony peptidoglikán réteg, lipoproteinek, külső membrán, lipopoliszacharidok Nincs peptidoglikán (kiv. metanogének pszeudopeptidoglikánja) Nincs peptidoglikán?

33 Különleges sejtfalak =Mycoplasma%20hominis&limit=1400 Halobacterium, Owens Lake, California Mycoplasma hominis Lampropedia hyalina (Blu Nilo festék)

34 A peptidoglikán

35 Gram - és Gram + sejtfal felépítése

36 Gram-színezés Hans Christian Joachim Gram (dán kutató) Elv: trifenil-metán típusú színezék + jód oldat jódpararozanilin komplex Gram+ sejtekből nem mosható ki, Gram- sejtekből igen + kontraszt színezés Eredmény abmanua/lab6/images/ecoli01_scale.jpg bios312/labprocedures/gramposcocci.jp g ology/bi_bacteriology/cl_clostridi a/m_bi_cl_20small.jpg Japán Gram-próba (40 % KOH)

37 Tok kimutatása Tok: nyálkaburok, körülveszi a sejtet Anyaga: homogén vagy heterogén, poliszacharid, polipeptid, aminocukor, fehérjelipopoliszacharid Egyszerű vagy bordás Szerepe: patogének virulenciája, véd a fagocitózis ellen véd a kiszáradástól tartalék tápanyag lokalizáció tápanyag-adszorpció Kimutatás: negatív festés

38 Mitokondrium és glikogén kimutatása Mitokondrium : kémiai energia átalakítása és termelése Kimutatása: o Redox festékkel (mitokondriumban oxidált állapotban marad) Glikogén: tartaléktápanyag, glükóz poliszacharid, gyorsan mobilizálható tápanyag Kimutatása: o Lugollal

39 Endospóraképzés Bacillus, Clostridium, Sporosarcina sp. A szülősejt kitartó állapota, nincs anyagcseréje A túlélést teszi lehetővé Rendkívül ellenálló Elhelyezkedés: terminális, centrális, szubterminális, Alak: szubtilisz (1,2), klosztrídium (3,4,5,6) logia/agr%20mikro%201.pdf

40 Az endospóra szerkezete

41 Módszerek lépésről lépésre

42 Gram-festés menete 1. Kenet készítés 2. Szárítás 3. Rögzítés 4. Festés kristályibolyával 2 percig /leönteni!/ 5. Lugol 2 perc 6. Mosás aceton-etanollal 7. Mosás csapvízzel 8. Festés szafraninnal 2-3 perc 9. Mosás csapvízzel 10. Mikroszkópizálás (40x) 11. Szárítás 12. Olajimmerzió Bacillus cereus Gram (+) Escherichia coli Gram ( ) Gram (+) sejt kék Gram ( ) sejt piros

43 Speciális sejtalkotórészek kimutatása Tok, mitokondrium, glikogén Tokfestés Schizosaccharomyces pombe Egy csepp tusban szuszpendálunk egy kacsnyi 72 órás mikrobát. Mitokondrium festés Saccharomyces cerevisiae (T22) Egy csepp Janus zöld oldatban szuszpendálunk 1 kacsnyi 24 órás T22-t. Glikogén festés Saccharomyces cerevisiae (T22) Egy csepp Lugol oldatban szuszpendálunk 1 kacsnyi 24 órás T22-t.

44 Spóraszínezés Malachitzölddel 1. Szuszpenzió készítése 2. Szárítás 3. Rögzítés /láng felett áthúzni 2-3 szor / percig szárítópadkán malachitzölddel melegítjük /ne száradjon be/ 5. Mosás 1/2 percig vízzel 6. Szafraninos festés 3 perc 7. Mosás csapvízzel 8. Mikroszkópizálás (40x) Spóra: zöld Vegetatív sejt: piros Karbolfuxinnal 1. Szuszpenzió készítése 2. Szárítás 3. Rögzítés /láng felett 2-3szor áthúzni/ percig szárítópadkán Ziehl-Nielsen féle karbolfuxinnal melegítjük /ne száradjon be/ 5. Vizes öblítés 6. 10%-os kénsavval mosás 7. Vizes öblítés 8. Festés metilénkékkel 2-3 perc 9. Mosás csapvízzel 10.Mikroszkópizálás (40x) Spóra: piros Vegetatív sejt: kék

45 Mérés mikroszkóppal Okulár mikrométer (a mikroszkóp szemlencséjébe kell beilleszteni) Objektív mikrométerrel kalibrálandó 100 osztást tartalmaz Objektív mikrométer mérőskálát tartalmazó, csiszolt tárgylemez, amelyen 1 osztás 10 m 1 mm = 100 rész (0,01 mm = 1 rész)

46 Okulár mikrométer kalibrálása Az okulár mikrométeren egy 5 vagy 10 mm hosszú vonalszakasz 100 részre van osztva. Ezt a mérőokulárba helyezzük. Az objektív mikrométer egy csiszolt tárgylemez, amelyen egy 1 mm-es vonalszakasz 100 részre van osztva és fedőlemezzel le van fedve. Mikroszkópos méréshez meg kell állapítani az okulár mikrométer 1 osztásközének az értékét. Ehhez az objektív mikrométert a tárgyasztalra helyezzük, az objektív mikrométer osztásait élesre állítjuk. A látótérben most a két mikrométer-osztást egyszerre látjuk. A tárgyasztal mozgatásával és az okulár elfordításával a két mikrométer-osztást fedésbe hozzuk úgy, hogy a két kezdőpont egybeessen. Megkeressük a két skálán azt a pontot, ahol a két osztásvonal egybeesik. Megszámoljuk az objektív- és az okulár mikrométer osztásvonalainak számát eddig a pontig. Az okulár mikrométer 1 osztásközének értéke μm-ben: (objektív mikrométer-osztások száma 10) / (okulár mikrométer-osztások száma). Különböző nagyításoknál különböző értékeket kapunk. Dr. Horváth Sándor: Mikrobiológiai praktikum, Tankönyvkiadó, Budapest, 1980

47 Az okulár mikrométer kalibrálása után mérhetünk a mikroszkóppal sejtek méretét (átmérő, hossz, vastagság), szálas anyagok vastagságát, mikroszkópikus részecskék méreteit stb. -Mérés mikrométer csavarral: 1 teljes fordulat 0,1 mm-nek felel meg -Vörösvértest (2,5 µm)

48 Mai feladatok? Szálas anyagok vastagságának meghatározása - természetes szálas anyagok: gyapjú, selyem, gyapot, kender (B. macerans) - mesterséges: orlon Saját hajszál (füzetbe bejegyezni!) Élesztő sejtszuszpenzió sejtszámának meghatározása (db sejt/ml) + hibahatár megadása (füzetbe bejegyezni!)

49 Mikroszkópos számlálókamra: Bürker Élesztők és penészgomba konídiumok, spórák számlálására A számlálókamrák különlegesen kiképzett tárgylemezek, amelyeken ismert területű beosztás található. A fedőlemez feltételével meghatározott magasságú réteg keletkezik és ezáltal a beosztásban elhelyezkedő folyadék térfogata ismert. A Bürker kamra két négyzethálós beosztású teret tartalmaz. Kamra mélysége: 0,1 mm X: 1/400 mm 2 Y: 1/25 mm 2

50 Számlálás Bürker kamrában A Bürker-kamra két egymástól vájattal elválasztott négyzetes beosztást tartalmaz, így akár két különböző szuszpenzió vizsgálatára alkalmas. A megszámlálandó négyzeteket a számlálókamra egész felületéről véletlenszerűen választjuk ki. A számlálásnál célszerű következetesen a felső és a jobb oldali határvonalon levő sejteket a négyzet belsejében levőkhöz adni. Az 1 ml-ben lévő sejtszámot úgy számítjuk ki, hogy a kis négyzetekhez tartozó átlagos sejtszámot nal, a nagy négyzetekhez tartozót 2, nel szorozzuk.