(11) Lajstromszám: E (13) T2 EURÓPAI SZABADALOM SZÖVEGÉNEK FORDÍTÁSA. (54) Eljárás DNS-fragmentáció meghatározására állati spermiumokban

Átírás

1 !HU000007T2! (19) HU (11) Lajstromszám: E 007 (13) T2 MAGYAR KÖZTÁRSASÁG Magyar Szabadalmi Hivatal EURÓPAI SZABADALOM SZÖVEGÉNEK FORDÍTÁSA (21) Magyar ügyszám: E (22) A bejelentés napja: (96) Az európai bejelentés bejelentési száma: EP (97) Az európai bejelentés közzétételi adatai: EP 173 A (97) Az európai szabadalom megadásának meghirdetési adatai: EP 173 B (1) Int. Cl.: C12Q 1/68 (06.01) (87) A nemzetközi közzétételi adatok: WO PCT/IB 0/ () Elsõbbségi adatok: ES (72) Feltalálók: GOSALVEZ BERENGUER, JaimeUniv Autonoma Madrid, Madrid (ES); FERNANDEZ GARCIA, José Luis, Univ dad de la Coruna, 1006 La Coruòa (ES); GOYANES VILLAESCUSA, VicenteUniv dad de la Coruna, 1006 La Coruòa (ES) (73) Jogosult: Universidad Autónoma de Madrid, Madrid (ES) (74) Képviselõ: Lengyel Zsolt, DANUBIA Szabadalmi és Jogi Iroda Kft., Budapest (4) Eljárás DNS-fragmentáció meghatározására állati spermiumokban HU 007 T2 A leírás terjedelme 22 oldal (ezen belül lap ábra) Az európai szabadalom ellen, megadásának az Európai Szabadalmi Közlönyben való meghirdetésétõl számított kilenc hónapon belül, felszólalást lehet benyújtani az Európai Szabadalmi Hivatalnál. (Európai Szabadalmi Egyezmény 99. cikk (1)) A fordítást a szabadalmas az 199. évi XXXIII. törvény 84/H. -a szerint nyújtotta be. A fordítás tartalmi helyességét a Magyar Szabadalmi Hivatal nem vizsgálta.

2 A találmány területe A találmány alkalmazási területe az egészségügyi szektorban van, elsõsorban amely a biológiai reprodukcióval kapcsolatos, különösen az ondó minõségének meghatározására szolgáló eljárásokra és procedúrákra vonatkozik állatokban A találmány háttere Jelenleg a nyugati országokban a termékeny korú férfiak 6%¹ának van valamilyen betegsége, amely megakadályozza normális reprodukciót. Ebbõl a célból az Egészségügyi Világszervezet (WHO) összeállított egy sorozat laboratóriumi procedúrát egyetlen protokollban, amely standardizálja az ondó minõségi elemzését a nemzetközi környezetben. Ezeknek a vizsgálatoknak a központi elemei a spermium koncentrációjának, morfológiájának (Ankem Murali K. és munkatársai, Novel assay for determining DNA organization in human spermatozoa: Implications for male factor infertility, Urology, 9, 4, 02. április) és motilitásának meghatározása, kiegészítve bizonyos funkcionális tesztekkel, valamint az ondó biokémiai és enzimatikus paramétereinek (US A 808) meghatározásával (WHO, 1999). A tesztek ezen csoportja megbecsüli az ondó teljes térfogatát és a spermiumok koncentrációját milliliterenként, és képes azt diagnosztizálni, hogy a férfi terméketlensége az ejakulátumban található spermiumok hiánya (azoospermia) vagy mennyiségének nyilvánvaló csökkenése (oligospermia) miatt van. Meghatározza a mobilitási problémák (asthenozoospermia) lehetséges jelenlétét is, ami lehetetlenné teszi ezen sejtek számára a méh üregén való átjutást és a méhkürt külsõ harmadának a sikeres elérését. Azt is elemzi, hogy van¹e súlyos morfológiai probléma a komponenseikben (fej, nyak, farok) (teratozoospermia), mivel ezeknek a variációknak hatása van a nõi petesejt hatékony megtermékenyítésére. Emellett hasonlóképpen felderítik a mirigyek, mint például prosztata és ondóhólyagok részvételét (fertõzések, agenezis). Végül in vitro funkcionális tesztekkel, mint például a HOS teszttel (a sejtmembrán ionpermeabilitása) vagy a spermium in vitro elõrejutási képessége, képet alkotnak az ondó termékenyítõképességérõl. Végezetül ezeket a laboratóriumi vizsgálatokat kiegészítik hormonprofilokkal, herebiopsziával és/vagy a kariotípus (örökléstani kromoszómavizsgálat, ami meghatározza egy személy férfi vagy nõ nemét) meghatározásával és/vagy molekuláris genetikai tesztekkel. A klinikai és laboratóriumi tesztek ellenére a terméketlenség okát nem lehet meghatározni a terméketlen férfiak körülbelül 0%-ában, amit idiopátiás terméketlenségnek neveznek. Újabban felismerték, hogy a spermium DNS-károsodása megmagyarázhatja ezen esetek nagy százalékát (Evenson és munkatársai, 1999; Larson és munkatársai, 00), ily módon a spermium DNS¹e a fragmentálásának vizsgálata aktív kutatás tárgya folyamatos publikációkkal specializált folyóiratokban (Evenson és munkatársai, 02). Bekövetkezhetnek kromatin-anomáliák, vagy akár a spermium nukleáris DNS-ének károsodása, vagy akár a DNS-pakolódás anomáliáinak az eredménye is lehet, ami a spermatogenezis folyamán következik be (Sailer és munkatársai, 199). Akár még az is lehetséges, hogy ezek olyan szabad gyökök miatti károsodás eredményei lehetnek, amelyek oxidatív stresszt okoznak (Aitken és munkatársai, 1998), ami egy lehetséges apoptózis folyamat következménye (Gorczyca és munkatársai, 1993). Különbözõ eljárások vannak a humán spermium kromatin/dns integritásának az értékelésére. Ezek között elõtérben van a DNS szakadása in situ jelzett nukleoidok beépítésével olyan enzimek alkalmazásával, mint például terminális transzferáz (TUNEL) vagy DNS-polimeráz (in situ nick-transzláció ISNT) (Gorczyca és munkatársai, 1993). Ezek az eljárások enzimek tárgylemezekre rögzített spermiumon történõ alkalmazásán alapszanak. Emiatt a hatékonyságuk nem túl magas, mivel csak a megjelölt törések érhetõk el az enzim számára, ami az eredmények viszonylag alacsony reprodukálhatóságát eredményezik. A reagensek is drágák, tehát a módszereket csak a kutatásban alkalmazzák, nem lehetséges az alkalmazásuk az ondó klinikai értékelésére. Egy másik módszer az üstökös vizsgálati eljárás (Hughes és munkatársai., 1996). A spermiumot agaróz biogélbe foglalják be egy tárgylemezen, és lízisoldattal kezelik a membránok és fehérjék extrahálására. Ily módon nukleoidokat, azaz deproteinizált sejtmagokat kapnak, amelyekben a DNS-hurkok ki lettek tekerve a kinyújtás miatt. A nukleoidokat elektroforetizálják pufferrel megtöltött tartályban, oly módon, hogy a DNS-szálak az anódhoz vándorolnak, ami egy üstökös képét hozza létre, fejjel és az elektroforetikus migráció irányába mutató farokkal. Ezeket az üstökösöket megfestik floureszcens festékkel, hogy megfigyeljék fluoreszcens mikroszkóp alatt. Ha sejtmagban fragmentált a DNS, azok nagy mennyisége elvándorol, és az üstökös farkában koncentrálódik. Ez egy eléggé érzékeny teszt, de viszonylag költséges és komplikált egy hagyományos klinikai laboratórium számára. Tény, hogy különösen szokatlan berendezést igényel: elektroforézis tápegységet és tartályt, fluoreszcens mikroszkópot, és képfeldolgozó rendszert, és annak elemzését. Ezen okok miatt nem alkalmazható az ondó klinikai vizsgálatára sem, és csak kutatási célokra alkalmazzák. A jelenlegi referencia módszer a spermium DNS¹e fragmentálódásának vizsgálatára az Evenson-féle kromatin-szerkezeti vizsgálati eljárás (SCSA: Sperm Chromatin Structure Assay ; Evenson és munkatársai., 1980; 00; Evenson és Jost, 1994). Ebben a módszerben a szuszpenzióban lévõ spermiumot savas denaturáló oldathoz adják hozzá. Azokban a spermiumokban, amelyek DNS¹e nem tartalmaz töréseket és rezisztens a savas denaturációra, a DNS kétszálú marad. Azonban a fragmentált DNS¹û spermiumok maguk denaturálják a DNS-üket, ami átalakul egyszálú DNS¹sé. Ezek azután megfestõdnek akridin-naranccsal. Ez a festék zöld fluoreszcenciát emittál, amikor kétszálú DNS-hez kötõdik. Azonban a denaturált, egyszálú DNS¹t tartalmazó spermiumokban ez a flou- 2

3 rokróm vörös fluoreszcenciát emittál. A denaturált DNS¹t tartalmazó spermiumot áramlási citometriával határozzuk meg, ami megkülönbözteti a két típusú fluoreszcenciát. Az SCSA széles körben elterjed klinikai módszer, amelyet nagyszámú páciensen teszteltek. Ezen rendszer alkalmazásával megállapították, hogy amikor egy személynek % vagy több a fragmentált DNS¹û spermiuma, a terhesség valószínûsége kevesebb mint 1%, és érvényes a természetes megtermékenyítésre és a mesterségesre is (Evenson és munkatársai., 1999; Larson és munkatársai, 00). A fragmentált DNS¹û spermiumok százaléka többé-kevésbé állandó lehet egy személy különbözõ spermatogenezis ciklusaiban, de változhat is exogén tényezõk hatására, mint például intenzív lázas epizódok, mint például influenza esetében (Evenson és munkatársai, 00). Ily módon sorozatos vizsgálatokat lehet végezni azon minták kiválasztásával, amelyekben alacsonyabb mértékû a fragmentáció, amelyek azután mesterséges megtermékenyítési módszerekben alkalmazhatók. Fontos figyelembe venni, hogy az ondóminták folyékony nitrogénben történõ lefagyasztása nem változtatja meg a DNS-fragmentáció szintjét, tehát ez a teszt végrehajtható fagyasztott mintákon, amelyeket késõbb alkalmazni lehet megtermékenyítésre, IVF¹re (in vitro megtermékenyítésre) vagy ICSI¹re (Intracitoplazmatikus Spermium Injekció). Ennek nagy a gyakorlati jelentõsége a páciens és a laboratórium számára. Az SCSA módszer, habár robusztus és nagyon jól reprodukálható, költséges rendszer, nehéz megvalósítani és nem nagyon hozzáférhetõ a rutin laboratóriumban (De Jonge, 02). Emiatt a spermium DNS minõsége még mindig nem állapítható meg rutinszerûen, a terméketlenségi vizsgálatokban igazolt klinikai értéke ellenére sem. Újabban a kutatócsoportunk elõzetesen ismertetett egy módszert, amely lehetõvé tette a humán spermium kromatinjának az in situ diszpergálását, demonstrálva, hogy a kromatin diszpergálásra képtelen spermiumok fragmentált DNS¹t tartalmaznak (Fernandez, J. L. és munkatársai, Journal of Andrology, 03, 24, l, old.; The Sperm Chromatin Dispersion Test: a simple method for the determination of sperm DNA fragmentation ). Ezen eljárás alkalmazásával ondó mintáit kezeltük egymás után agaróz mikrogélben savas denaturáló oldattal, két lízisoldattal és mosóoldattal oly módon, hogy azok azután megszáríthatók és megfesthetõk. Ez a módszer amelyet Sperm Chromatin Dispersion (SCD) tesztnek nevezünk szélsõségesen agresszív reagenseket és körülményeket alkalmaz. Az ismertetett eljárás nem ad konzisztens eredményeket, ami az ismételt értékeléseket nehézzé teszi. Másrészrõl a kapott kép minõsége és kontrasztja és az eredmények reprodukálhatósága nem elég jó a kereskedelmi forgalomban történõ alkalmazáshoz. Emellett a spermium szerkezete megváltozik, és a farok nem látható a mintákban. Ez egy fontos probléma, mivel a spermium nem különböztethetõ könnyen meg a minta többi sejtjeitõl, ami a késõbbiekben hibát okoz a károsodott kromatin/dns-tartalmú spermiumok számának meghatározásában. Tehát továbbra is szükség van megbízható eljárásra, amely rutinszerûen és könnyen alkalmazható az ondó minõségének vizsgálatára állatokban és különösen a kromatin/dns integritásának értékelésére. Az eljárásnak robusztusnak, könnyen megvalósíthatónak, olcsónak és elérhetõnek kell lennie az alaplaboratórium számára. Meg kell oldani a korábban említett problémákat. Homogén eredményt kell adnia a laboratóriumok között és alkalmasnak kell lennie automatizálásra. A találmány célja A találmány célja olyan eljárás, amely gyors és pontos spermiumsejtek kromatin/dns¹e integritásának értékelésére állatokban, és beépíthetõ bármilyen analitikai, állatorvosi vagy humán reprodukcióra specializált laboratórium rutin aktivitásába. Tehát a találmány célja eljárás állat spermiuma kromatin/dns¹e integritásának értékelésére, amely eljárás magában foglalja a következõket: a) a spermiumot tartalmazó minta kezelésének lépése DNS-denaturáló oldattal, b) egyetlen kezelési lépés lízisoldattal a sejtmagi fehérjék extrahálására, c) a spermium kromatin/dns integritásának értékelési lépése, azzal jellemezve, hogy a lízisoldat nem tartalmaz fehérjét denaturáló detergenst és lényegében a spermium farka nem megy tönkre. Általában elõnyös, hogy az a) lépés megelõzi a b) lépést. Amint említettük, a lízisoldat megválasztása kritikus a találmány céljainak elérése érdekében. A nem alkalmazandó fehérjedenaturáló detergensek közé tartoznak az anionos és kationos detergensek, például SDS, nátrium-dodecil-szulfát, alkil-benzol-szulfonát, glikolsav hidratált sója stb. Ezek olyan detergensek, amelyek nagymértékben megzavarják a membránokat, lizáló hatásúak és ugyanakkor hatékonyak a fehérjék denaturálására. Ezeket denaturáló elektroforézisben alkalmazzák, ahol a fehérjék vándorolnak, teljes denaturáció közepette (a háromdimenziós szerkezet elvesztése mellett). Ezek különösen aktívak savas ph¹n, elõnyösen Gram-pozitív baktériumokon. Az aktivitásuk a detergensek között magas. A találmány szerinti eljárásban elõnyösen nemionos, fehérjét nem denaturáló detergenst alkalmazunk, azaz olyan detergenst, amely szolubilizálja a fehérjéket de nem denaturálja azokat. Az elõnyösek közé tartozik a toktil-fenoxi-polietoxi-etanol (Triton X¹0), N,N-bisz(3¹D-glukonamidopropil) kolamid (bigchap), Brij(r) P, N¹dekanoil-N-metil-glukamin, digitonin, dodekanoil-n-metil-glukamid, heptanoil-n-metilglukamid, elágazó oktil-fenoxi-poli(etilén-oxi) etanol (Igepal CA¹6), N¹nonanoil-N-metil-glukamin, Nonidet P, N¹nktanoil-N-metil-glukamin, Span oldat, Poliszorbát (Tween ). A Triton X¹0 különösen elõnyös a kapott jó eredmények és a könnyû elérhetõsége miatt. 3

4 Elõnyös, ha a lízisoldatnak elegendõ az ionereje a lízis folyamat elõsegítésére denaturálás nélkül. Igazoltuk, hogy a hatásos oldat olyan, amely 1 M és 3 M közötti mennyiségû nátrium-kloridot, 0,001 M és 2 M közötti mennyiségû ditiotreitolt (DTT), 0,001 M és 2 M közötti mennyiségû 2¹amino-2-(hidroxi-metil)-1,3 propándiolt (Tris) és 0,1% és 3% közötti mennyiségû Triton X¹0¹at tartalmaz. Különösen alkalmas az olyan oldat, amely körülbelül 2, M NaCl¹t, körülbelül 0,2 M DTT¹t, körülbelül 0,2 M Tris¹t, körülbelül 1% Triton X¹0¹at tartalmaz és körülbelül 7, a ph¹ja. A DNS-denaturáló oldat elõnyösen sav, például a sósav, ecetsav, salétromsav és ezek keverékei által alkotott csoportból kiválasztott sav. Elõnyösen az sósavoldat. A találmány szerinti eljárásban értékeljük a spermium kromatin/dns integritását az a) és b) lépések utáni lépésben. Habár számos alternatíva létezik erre az értékelésre, elõnyösen az vizuális. Ebbõl a célból az eljárás egy mintafestési lépést tartalmaz az a) és b) lépések után. A kiváló eredményeket adó és a spermium farkának, valamint a jellegzetes fényudvarnak a vizualizálását lehetõvé tévõ oldat hasonlít a Wright-oldathoz. Egy elõnyös variációban a spermiumokat szuszpenzióhoz hasonló közegbe foglaljuk be, elõnyösen mikrogélbe, különösen agaróz mikrogélbe. A találmány tárgyát képezi továbbá reagenskészlet állati spermium minõségének értékelésére, amely tartalmazza a következõket: a) DNS-denaturáló oldat, b) lízisoldat, amely extrahálja a sejtmagi fehérjéket, azzal jellemezve, hogy a lízisoldat nem tartalmaz fehérjét denaturáló detergenst és lényegében nem teszi tönkre a spermium farkát. A reagenskészlet lehetõvé teszi az ismertetett találmány szerinti eljárás végrehajtását. Az ábrák ismertetése 1. ábra. A humán spermium fényudvara méretének meghatározására alkalmazott paraméterek a találmány szerinti módszer szerint. 1a: A nukleoid, ami megfelel a spermium nagymértékben deproteinizált sejtmagjának, és két részbõl áll: a spermiumsejtmagjának a körvonala, amit magnak nevezünk a központi részen, és a kromatin/dns diszperzió periferiális fényudvara. A spermium farka látható. 1b: relief szûrõ a fényudvar és a mag közötti határok jobb vizualizálására és meghatározására. 1c: A mag (a) kisebb átmérõjét és a fényudvar (b) vastagságát mint a mérés mintáját alkalmazzuk a fényudvar különbözõ mértékének megállapítására, amint a találmány szerinti módszerben elmagyarázzuk. 2. ábra. A spermium különbözõ típusai, amint a fényudvar méretével definiáljuk a találmány szerinti módszer alkalmazása után. 2a: Spermium nagyméretû fényudvarral b: Spermium közepes méretû fényudvarral. 2c: Spermium kisméretû fényudvarral. 2d: Spermium fényudvar nélkül. 2e: Spermium fényudvar nélkül és degradálódva. 2f: Általános látómezõ, amelyben a korábban ismertetett különbözõ típusú spermiumok láthatók. 3. ábra. A DAPI-val (a¹e, fluoreszcein-kék) végzett festés után vizualizált különbözõ fényudvarméretek és a teljes humán genomiális DNS-próba alkalmazásával kapott in situ hibridizációs szignál korrelációja a DBD- FISH módszer szerint (a ¹e, fluoreszceinvörös) a DNS-fragmentáció szintjének vizualizálására. 3a: Spermium fényudvarral és alacsony szintû hibridizációs szignállal (3a ). 3b: Spermium közepes fényudvarral és alacsony szintû hibridizációs szignállal, bár az kissé magasabb, mint az elõzõ esetben (3b ). 3c: Spermium kis fényudvarral, és megfigyelhetõ emelkedéssel a hibridizáció szintjében (3c ). 3d: Spermium fényudvar nélkül és magas szintû hibridizációval (3d ). 3e: Degradált spermium és amely szabálytalan hibridizáció-eloszlást mutat (3e ). 4. ábra. A találmány szerinti eljárás alkalmazása a következõ fajok spermium-mintáira: egér (Mus musculus), bika (Bos taurus), rombuszhal (Scophthalmus maximus) és földigiliszta (Lombricus terrestris). 4a, bika; 4b, c, d egér; 4e földigiliszta; 4f rombuszhal.. ábra. Magas szintû leukocitospermiában szenvedõ páciens mintája. Megfigyelhetõ a leukociták farkának a hiánya, ami lehetõvé teszi azok megkülönböztetését a többi sejttípustól. A találmány részletes leírása Amint részletezni fogjuk, a találmány szerinti eljárás és reagenskészlet egyszerû és megbízható rendszerek a fragmentált DNS¹û spermiumok gyakoriságának meghatározására. A módszer alkalmazható andrológiai laboratóriumokban és mesterséges megtermékenyítési klinikákon és állattenyésztési laboratóriumokban. Nagyon sokoldalú rendszer, mivel lehetséges a minták lefagyasztása és szükség szerinti elemzése, anélkül, hogy az elemzés eredményének megváltozását okozná. A találmány szerinti eljárás amely lehetõvé teszi a kromatin/dns és a spermium integritásának elemzését tartalmazza a következõ lépéseket: a) a spermiumot tartalmazó minta kezelésének lépése DNS-denaturáló oldattal, b) egyetlen kezelési lépés lízisoldattal a sejtmagi fehérjék extrahálására, amely nem tartalmaz fehérjét denaturáló detergenst és lényegében nem teszi tönkre a spermium farkát; c) a spermium kromatin/dns integritásának értékelési lépése. 4

5 Mások mellett a találmány szerinti eljárás alapvetõ eltérése a technika állása szerinti módszerek és különösen a Fernandez, J. L. és munkatársai Journal of Andrology, 03, 24, l, old. irodalmi hely vonatkozásában a lízis és festés területére esik. Ily módon egyetlen lízisoldatot alkalmazunk, kettõ egymás utáni helyett. Az összetétel is eltérõ, és nem tartalmaz SDS¹t (anionos fehérjedenaturáló detergens) vagy EDTA¹t (komplexképzõ ágens). Viszonylag enyhe, semleges, nem denaturáló detergenst alkalmazhatunk, mint például Triton X¹0¹at. Mûszakilag ezek a különbségek a spermium farkának megtartásához vezetnek. Ez egy kulcsfontosságú elõrelépés, mivel a detektálásuk nélkülözhetetlen adat annak megkülönböztetésében, hogy a nukleoidok képe valójában a spermiumból származik, vagy más jelen lévõ sejttípusokból, például a genito-urináris csatorna lehámlott sejtjei, gyulladási sejtek, vér stb. Ezt a megmaradást sokkal kevésbé agresszív lízissel érjük el, valamint az SDS alkalmazásának kizárásával. Emellett az enyhébb lízis eléri a kromatinszálak kitekeredését, jobban megõrizve a fej vagy mag morfológiáját, és így diszperziós fényudvarokat eredményez, amelyekben nagyobb a kromatin anyag denzitása, ami azok intenzívebb festõdéséhez vezet. Ennek eredményeképpen a fényudvarok különbözõ méreteinek a kontrasztja és vizualizációja sokkal jobb, különösen amikor Wright-féle festéket alkalmazunk. Egy másik szignifikáns elõny az, hogy a fehérjedenaturáló detergens, mint például SDS hiánya lehetõvé teszi az itt ismertetett módszer egymás utáni alkalmazását másokkal, amelyek lehetõvé teszik más sejtkomponensek vizualizálását. Ily módon a találmány szerinti módszerrel kapott nukleoidokon fehérjék, laminin fehérjetípusok vagy más sejtmagi fehérjék immunológiai detektálására szolgáló eljárásokat alkalmazhatunk, valamint a sejtmagi mátrixszal kapcsolatos RNS detektálására szolgáló eljárásokat, mivel a DNS-kinyújtott, és a sejtmagi szerkezet annyira megõrzött, amennyire csak lehetséges. Ez fontos a spermiumsejtmagi szerkezetét vizsgáló bizonyos kutatási területeken. Egy további elõny a reagensek kisebb mennyiségének az alkalmazása, és ennek következtében a kisebb költség. Például a DTT különösen drága, és a koncentrációjának a példákban ismertetett csökkentése (a cikkben ismertetettnek a negyede) szignifikáns a költség szempontjából. Ami a fentiekbõl következik az az, hogy a találmány szerinti eljárás a spermium nukleoidjainak sokkal jobb és reprodukálhatóbb képét eredményezi a technika állásához viszonyítva. Lehetséges annak megkülönböztetése, hogy a nukleoidok a spermiumból származnak¹e vagy más sejttípusokból, és a fényudvar kategorizálása sokkal pontosabb és megbízhatóbb. Ennek következtében a találmány szerinti eljárással a minta DNS-fragmentálódási szintjének meghatározása sokkal megbízhatóbb, ami azt jelenti, hogy az rutinszerûen és egyszerûbben alkalmazható kis költséggel. Az alkalmazása releváns különbözõ laboratóriumokban, klinikai körülmények között és humán mintákon, valamint állatorvosi laboratóriumokban állati minták vizsgálatára. Ez nagyon fontos, mivel ez egy lehetséges klinikailag alkalmazható teszt páciensek számára. A minta kezelésének lépései bármilyen sorrendben végezhetõk, elõször a DNS-denaturáló oldattal, majd a lízisoldattal végzett kezelési lépés, vagy fordítva. De elõnyös ha a mintát elõször a DNS-denaturáló oldattal kezeljük és azután a lízisoldattal, mivel ez jobb eredményeket ad. Egy másik változatban (lízis majd a DNS denaturálása) a fragmentált DNS¹û spermium eltérõ módon viselkedhet. Ebben az esetben a kromatin/dns fragmensei diszpergáltak, ami nagyobb méretû fényudvarokat eredményez. A lízisoldattal történõ egyetlen kezelés is elég lehet ezen viselkedés megfigyeléséhez, habár a fényudvarok méretének megkülönböztetése nem nagyon pontos. A találmány szerinti eljárást az alábbiakban részletesen bemutatjuk, bizonyos változtatásokkal és opcionális lépésekkel együtt. A módszerben járatos szakember számára nyilvánvaló, hogy vannak más megvalósítási módok és más lehetõségek, amelyekben az ismertetett alapvetõ aspektusok megmaradnak. Az elsõ lépés a minta preparálása. Azt a szakterületen szokásos eljárások alkalmazásával szerezzük be, és meghatározzuk a mintában a spermiumok koncentrációját. Az elemzésre alkalmas koncentráció 0,1 és millió sejt per milliliter között változik. Ha a minta túl tömény, azt alkalmas koncentrációra állítjuk be tenyésztõ tápközeggel vagy foszfát-pufferelt sóoldattal (PBS) vagy hasonlóval történõ meghígítással. Az ondómintát hordozóra kell helyezni a találmány szerinti feldolgozáshoz, és az értékelés megkönnyítéséhez. Ez elõnyösen üveg tárgylemez, amely adott esetben be lehet fedve szokásos agaróz filmjével. Ehhez 0,2% és 1% közötti szokásos agarózoldatot állítunk elõ desztillált vízben Coplin-edényben vagy hasonlóban. Letakarjuk mûanyag gézzel, és mikrohullámú sütõbe tesszük. A mikrohullámú sütõt 0 W és 00 W közötti, például 00 W fokozatra állítjuk, a tartályt felrázzuk, hogy javítsuk az agaróz feloldódását, és hagyjuk felforrni. Ezt a procedúrát szabályozható hõmérsékletû fürdõvel is végrehajthatjuk. Amikor az agarózoldat teljesen átlátszóvá válik, azután azt ml és 20 ml közötti méretû függõleges tartályokba tesszük. Ezeket a tartókat korábban fel kellett melegíteni C 0 C¹ra, például 70 C¹ra fürdõben, hogy az agarózoldatot folyékony állapotban tartsuk. Mielõtt a tárgylemezeket bejuttatjuk az agarózoldatba, azokat megtisztítjuk törlõruhával, hogy eltávolítsuk a lehetséges szennyezõdéseket. A tárgylemezeket függõlegesen merítjük be, és a homályos részüknél fogva csipesszel tartjuk 1 másodpercig, kivesszük és visszamerítjük 1 és közötti alkalommal, amíg homogén film alakul a tárgylemezen. Azokat vízszintesen sima felületre tesszük, például üvegre vagy fémre, és lehûtjük 1 C és 1 C közé, elõnyösen 4 C¹ra. Ezt a lemezt a tárgylemezekkel hûtõszekrénybe tesszük 4 C¹on percre, amíg igazoljuk, hogy az agaróz begélesedett a tárgylemezek felszínén. A tálcákat eltávolítjuk a hûtõszekrénybõl, és a tárgylemeznek a lemezzel

6 érintkezésbe került felszínét letisztítjuk itatóspapírral. Azután a tárgylemezeket vízszintesen szárítószekrénybe tesszük 37 C és 0 C közötti hõmérsékleten, amíg az agaróz teljesen megszárad és az üveghez tapadó finom filmet alkot. Az így kapott tárgylemezeket azonnal alkalmazhatjuk vagy több hónapig tárolhatók jól záródó dobozban környezeti (szoba) hõmérsékleten. A spermiumot tartalmazó minta feldolgozásának megkönnyítésére azt olyan közegbe foglalhatjuk be, amelynek hasonlóak a jellemzõi, mint a szuszpenzióé, mint például agaróz mikrogélbe. Ebben az esetben alacsony olvadáspontú/gélesedésû agarózoldatot állítunk elõ desztillált vízben 0,% és 2% közötti koncentrációban. Ezen agar gélesítését mikrohullámú sütõben vagy szabályozott hõmérsékletû fürdõn végezzük, amelyet azután C és 37 C között tartunk szabályozott hõmérsékletû fürdõn vagy szárítókamrában. Az ondót és az agarózoldatot óvatosan összekeverjük Eppendorfcsõben vagy hasonlóban, oly módon, hogy az utóbbi koncentrációja 0,3% és 1% közötti. Például 70 mikroliter agarózoldatot + mikroliter mintát. Fontos, hogy az agarózoldat nem melegebb, mint 37 C, hogy ne károsítsa a sejteket. Végezetül a mintának a hordozóra való felviteléhez a lefedett tárgylemezeket sima és hideg üveg vagy fém felszínre helyezzük, amelynek a hõmérséklete 1 C és 1 C között változik, elkerülve a légbuborékok kialakulását. Javasolt, hogy a keverékbõl mikropipettával egy 0 mikroliter közötti méretû cseppet tegyünk le, és fedjük le a cseppet fedõlemezzel. Elõvigyázatosságképpen javasolt, hogy mindegyik mintát két párhuzamosban dolgozzunk fel, és mindig alkalmazzunk kontroll mintát, amikor a módszer alkalmazzuk. A lemezt a tárgylemezekkel hûtõszekrénybe helyezzük 4 C¹on 2 percre, amíg bekövetkezik az agaróz megfelelõ gélesedése. Ha egyszer a gélesedés végbement, a tárgylemezeket azután nagyon óvatosan kivesszük hûtõszekrénybõl, vigyázva arra, hogy a mikrogél ne károsodjon. Ha egyszer a mintákat megfelelõ módon elõkészítettük a könnyû és ismételt kezelésükhöz, azután azokat kezeljük a találmány szerinti kezelési lépéssel a DNS-denaturáló oldattal és a lízis lépéssel a sejtmagi fehérjék extrahálására. Egy elõnyös változat szerint a mintákat tartalmazó tárgylemezeket elõször vízszintes helyzetben tartályba tesszük, amely tartalmazza a denaturáló oldatot. A DNS-denaturáló oldat lehet sav, például ecetsav, salétromsav, kénsav oldata, vagy lúg, mint például nátrium-hidroxid, bárium-hidroxid, kálium-hidroxid-oldata, kis koncentrációban. Egy elõnyös variációban sósavoldatot alkalmazunk 0,01 N és 0, N közötti, elõnyösen 0,1 N és 0,3 N közötti, különösen elõnyösen körülbelül 0,2 N koncentrációban. Javasolt, hogy ezt az oldatot ugyanazon a napon készítsük el, mint amikor a tesztet végezzük, és a tárgylemezeket 1 1 percen keresztül inkubáljuk 1 C és 37 C közötti, elõnyösen 18 C 2 C, elõnyösen 22 C hõmérsékleten. Ha egyszer az eljárás ezen része véget ért, azután végrehajtjuk a minta lízisét egyetlen lízisoldattal, amely elegendõen enyhe ahhoz, hogy ne károsítsa a spermiumok farkát. Ehhez az egyes tárgylemezeket vízszintes pozícióban bemerítjük egy másik tartályba, amely azt tartalmazza. Amint korábban említettük, a lízisoldatot úgy választjuk meg, hogy eléri a kromatinszálak kitekeredését és jobban megõrzi a fej-szekció morfológiáját, és ezáltal a kromatinállomány jellegzetes fényudvarai nagyobb denzitással alakulnak ki. Elegendõen enyhének kell lennie ahhoz is, hogy megõrizze a spermiumok farkát. Ezt azáltal érjük el, hogy biztosítjuk az agresszív detergensek és fehérjedenaturáló szerek elkerülését. Ezenfelül az ion-koncentráció szabályozása lehetõvé teszi ezen effektus modulálást is. Egy elõnyös variációban ez az oldat a következõ összetételû: nátrium-klorid 1Més3Mközött, elõnyösen2més3mközött; ditiotreitol (DTT) 0,001 M és 2 M között, elõnyösen 0,01 M és 0,8 M között; 2¹amino-2- (hidroxi-metil)-1,3-propándiol (Tris) 0,001 M és 2 M között, elõnyösen 0,01 M és 0,4 M között; és Triton X¹0 0,1% és 3% között, elõnyösen 0,% 1,% között. Az oldat ph¹ját 6, és 8, közé, elõnyösen 7 7, értékre állítjuk be. Vannak más alternatív lízisoldatok, vagy a koncentrációkat és az oldat inkubációs idõit és hõmérsékleteit megváltoztathatjuk, amennyiben annak funkcionális jellegzetességeit megtartjuk. Emellett a DTT alternatívájaként léteznek olyan vegyületek mint például bétamerkaptoetanol és más redukálószerek. A Tris alternatívájaként más pufferoldatok, mint például Hepes, Mops és Pipes alkalmazhatók. A Triton X¹0 alternatívájaként más semleges detergensek alkalmazhatók, amint fent említettük. Az alkalmazott oldattól és a minta típusától függõen a preparátumokat a lízisoldatban 1 és perc között, elõnyösen 1 és perc között inkubáljuk, ahol a körülbelül 2 perc különösen elõnyös; és a hõmérséklet 1 C és 37 C közötti, elõnyösen 18 C 2 C, és a C 22 C közötti hõmérséklet különösen elõnyös. A korábban ismertetett eljárások teljes alternatívájaként a denaturáló és lízisoldatokban való inkubálás sorrendjét megfordíthatjuk. A spermium kromatinjára gyakorolt hatások lehetõvé teszik a károsodott kromatin/dns¹û spermium megkülönböztetését a többi spermiumtól. A kapott eltérések részleteit a 6. példában ismertetjük. A DNS-denaturáló oldattal és a lízisoldattal történõ kezelés után a preparátumokat megmoshatjuk az oldatok maradványainak eltávolítása érdekében. Ehhez a lehetõ legenyhébb mosóoldatot alkalmazzuk, elkerülve a komplexképzõ ágenseket és detergenseket. Például vízszintes pozícióban bemerítjük azokat olyan tartályba, amely bõséges mennyiségû desztillált vizet vagy pufferoldatot vagy fiziológiás sóoldatot tartalmaz, 1 és perc közötti idõtartamra. A mintát azután dehidratáljuk. Ehhez alkohol növekvõ koncentrációit alkalmazhatjuk. Például a tárgylemezeket kiemeljük és alámerítjük vízszintes pozícióban olyan tartályokba, amelyek etanol növekvõ koncentrációit tartalmazzák % és 0% között, má- 6

7 sodperc és perc közötti idõtartamra, és azután a preparátumokat hagyjuk megszáradni levegõn. Az etanolsorozatban történõ inkubálások alternatívájaként a preparátumokat dehidratálhatjuk különbözõ alkoholokban, mint például metanolban történõ inkubálással, vagy akár hagyhatjuk megszáradni levegõn vagy szárítókamrában. Ha egyszer megszáradtak, az ondómintát tartalmazó már feldolgozott tárgylemezeket hónapokig tárolhatjuk tároló dobozokban környezeti (szoba) hõmérsékleten. Ez segíti a találmány szerinti kezelési folyamatok és a spermium kromatin/dns integritásának értékelése azt követõ lépésének elválasztását. A tárolás lehetõvé teszi az ugyanattól a személytõl származó különbözõ idõpontokban vett több minta értékelését. Ha egyszer a mintákat kezeltük a találmány szerint, azokat továbbvisszük az értékelési lépéshez. Számos lehetséges eljárás van a spermium kromatin/dns integritásának értékelésére, amint korábban jeleztük. A találmány szerint kezelt mintáknak az az elõnye, hogy sokkal tisztábban lehet vizualizálni a fényudvart és a spermium szerkezete megõrzõdik, különösen a farkak integritása, ami lehetõvé teszi azok egyértelmû megkülönböztetését más sejttípusoktól. Egy elõnyös variációban olyan festéket alkalmazunk a mintában, amely elõsegíti a vizuális értékelést. Az alkalmas festési körülmények megválasztásával jó minõségû képeket kaphatunk és magas szintû konzisztenciát az értékelési eredményekben. Számos stratégia van a festésre, attól függõen, hogy hagyományos fénymikroszkópot vagy fluoreszcens mikroszkópot alkalmazunk Festés fénymikroszkóp alatti megfigyeléshez Ebben az esetben az alkalmazható festékek a Wright, Giemsa, Orcein, Schiff reagens, Acetic Carmine, tiazin típusok és Romanowsky típusok vagy a fent említettek származékai (lásd Chromosome banding, AT Sumner, old.). Az olyan festékek, mint például a Wright-féle elõnyösek a minta, és különösen a fényudvarok intenzívebb festõdése miatt. Ezekkel a festékekkel a kontraszt és a különbözõ méretû fényudvarok vizuális megkülönböztetése szignifikánsan jobb. Azért is elõnyösek, mert olcsóbbak és elérhetõbbek bármilyen típusú laboratórium számára. Az alkalmazásuk lehetõvé teszi a farkak vizualizálását, mivel ezek normálisan nem láthatók fluoreszcens mikroszkópokban alkalmazott fluorokrómokkal végzett DNS-festéssel. Fontos annak hangsúlyozása, hogy ez a festés nagyon könnyen kezelhetõ megfelelõ festési szint elérésére, amely nem érhetõ el Diff-Quik¹el vagy hasonlókkal. Más festékek, mint például a Diff-Quik, amelyet a Fernandez, J. L. és munkatársai, Journal of Andrology, 03, 24, l, old. irodalmi helyen ismertetnek, számottevõen gyengébbek, és nem eredményezik a fényudvar megfelelõ kontrasztját a háttérhez képest. Ennek következtében amikor a fényudvar diszpergáltabb, normál esetben nehéz vizualizálni annak perifériás körvonalát, néha összekeverve azt egy kis fényudvarral, ily módon fragmentációs kategóriát rendelve olyan spermiumhoz, amely intakt a DNS¹t tartalmaz. Azaz az irodalmi hely szerinti eljárás hajlamos túlbecsülni a fragmentációs szinteket, különösen fénymikroszkópos festés esetében. Ez egy elég célszerûtlen egy olyan teszt esetén, amelynek lehetséges alkalmazásai vannak személyek esetében. Tehát nyilvánvaló, hogy ennek a fejlesztésnek rendkívüli fontossága van a módszer megbízhatóságában. A minta festésének egy variációjában Wright-féle oldatot (Merck ) keverünk össze 6,88 ph¹jú foszfát-pufferoldattal (Merck ) 1: és :1 arányban (v/v). Egy réteg festéket teszünk vízszintesen a száraz mikrogélre. Az optimális kontraszt eléréséhez szükséges festési idõ változik másodperc és perc között. Javasolt, hogy alkalmanként fújjunk rá a festékrétegre. A felesleges festéket dekantáljuk, a tárgylemezeket óvatosan megmossuk folyóvízzel és hagyjuk megszáradni. Ha a festés túlzott, lemosható ugyanolyan intenzitással vízben. Egy másik lehetõség festéktelenítés etanolban, megszárítani és újrafesteni. Ha a festés gyenge, különösen a kromatin diszperziós fényudvari régióiban, ismét megfesthetjük közvetlenül Wright-féle oldattal. Más megoldásképpen más festékeket is alkalmazhatunk, molekula Hemacolor-2¹t (Merck ) és Hemacolor-3¹at (Merck ), Giemsa¹t, valamint ugyanebbõl a családból való más festõoldatokat. Festés fluoreszcens mikroszkóp alatti megfigyeléshez A fluoreszcens szûrõk elérhetõségétõl függõen a mintákat megfesthetjük DNS¹re specifikus DAPI típusú fluorokrómokkal, Hoechst 3328¹al, etídium-bromiddal, propídium-jodiddal stb., halványulást gátló közegben (például Vector H¹00). Ha állandó preparátumokat akarunk, a feldolgozott és megfestett tárgylemezeket befoglaló közegbe tehetjük (például Entellan; Merck ). Végezetül a spermium kromatin/dns integritását a sejttípusok megkülönböztetésével értékeljük. Amint már említettük, a találmány szerinti eljárás ezt az értékelést sokkal könnyebbé teszi a technika állása szerinti módszerhez képest. A kapott képeket közvetlen vizuális elemzéssel tanulmányozhatjuk vagy digitalizált képeket elemzõ szoftvert alkalmazhatunk, amelyeket a mikroszkópokhoz kapcsolt analóg vagy digitális kamerákkal kaptunk. Kezdetben javasolt minimum 00 spermiumot tanulmányozni mintánként, a következõ alapvetõ kritériumok alapján (lásd az 1. és 2. ábrát): 1. Kromatin diszperziós fényudvar nélküli spermiumok (1. ábra). 2. Kromatin diszperziós fényudvar nélküli és degradált spermiumok: amelyek fényudvar nélküliek, a fejük granulumokká fragmentálódott vagy amelyek nagyon gyenge festést mutatnak (1. ábra). 3. Kisméretû diszperziós fényudvarú spermiumok: a fényudvar vastagsága kisebb vagy egyenlõ mint a mag kisebb átmérõjének 1/3¹a (1. ábra). 7

8 4. Közepes méretû diszperziós fényudvarú spermiumok: a fényudvar vastagsága nagyobb vagy egyenlõ mint a mag kisebb átmérõjének 1/3¹a és kisebb mint a mag átmérõje (1. ábra).. Nagyméretû diszperziós fényudvarú spermiumok: olyan spermiumok, ahol a fényudvar nagyobb vagy egyenlõ mint a mag átmérõje (1. ábra). 6. Egyebek: sejtmagok, amely nem spermiumokhoz tartoznak. Egy olyan morfológiai jellegzetesség, amely megkülönbözteti azokat, az a farok hiánya. A fragmentált DNS¹û spermiumnak azokat tekinthetjük, amelyek kromatin diszperziós fényudvar nélküliek 1, amelyek kromatin diszperziós fényudvar nélküliek és degradáltak 2, és amelyeknek kisméretû a diszperziós fényudvara 3. A közepes vagy nagyméretû kromatin diszperziós fényudvarú és fragmentált DNS¹û spermiumok a DBD-FISH módszer alkalmazásával kapott eredményekbõl származnak ( DNA Breakage Detection-Fluorescence In Situ Hybridization ; Fernandez és munkatársai., 1998; 00; 02; Fernandez és Gonsálvez, 02). Ez az eljárás lehetõvé teszi a DNS-töréseket tartalmazó sejtmagok detektálását és mennyiségi meghatározását, deproteinizálással és a DNS kontrollált denaturálásával. Ez a denaturálás egyláncú DNS-szakaszokat hoz létre a törések végeibõl, amelyeket in situ hibridizálással detektálunk fluorokrómmal megjelölt teljes genomiális próba alkalmazásával, ami látható fluoreszcens mikroszkóp alatt. Amikor a sejt DNS-ének törési szintje nagyobb, nagyobb a hibridizált próba mennyisége és a megfigyelt fluoreszcencia is nagyobb. A találmány szerinti eljárással feldolgozott minták egyláncú DNS¹t tartalmaznak, amit a denaturáló oldat hoz létre a DNS-ben megtalálható törések lehetséges végeinél. Tehát a hibridizáció intenzitása teljes genomiális DNS-próba alkalmazásával kapcsolatban lesz a spermiumsejtmagjában található törések mennyiségével. Ily módon igazoltuk, hogy a fényudvar nélküli vagy sokkal kisebb méretû fényudvarral rendelkezõ nukleoidok intenzív jelölõdést mutatnak DBD-FISH¹el, ami demonstrálja a DNS¹ük intenzív fragmentálódását (2. ábra). A többi nukleoid nagyon alacsony szintû markert mutat ezzel a próbával, ami megfelel a kromatinkezeléssel kapott hibridizáció mélységének. A találmány tárgyát képezi reagenskészlet is állati spermium kromatin/dns integritásának értékelésére. Ez a reagenskészlet DNS-denaturáló oldatot, a sejtmagi fehérjéket extraháló lízisoldatot tartalmaz, amelyet az jellemez, hogy a lízisoldat nem tartalmaz fehérjedenaturáló detergenst és lényegében nem teszi tönkre a spermiumokat. Az elõnyös DNS-denaturáló oldatok és az elõnyös lízisoldatok a fent ismertetettek. Adott esetben a reagenskészlet tartalmaz elõkezelt hordozót is, például agarózzal, valamint oldatot olyan közeg elõállítására, amely hasonló tulajdonságú, mint a mintát tartalmazó szuszpenzió. Például alacsony gélesedési pontú agarózt, amely lehetõvé teszi mikrogél elõállítását. A találmány szerinti reagenskészlet tartalmát és használati utasítását az alábbiakban részletezzük: A reagenskészlet tartalmának ismertetése Elõkezelt tárgylemezek* Eppendorf-csövek, amelyek alacsony gélesedési pontú agarózt tartalmaznak, (A) csõ 37% HCl¹t tartalmazó csõ, (B) csõ Lízisoldatot tartalmazó csövek, C csõ*. Összetétel: 2, M NaCl, 0,2 M DTT, 0,2 M Tris, 1% Triton X¹0, ph 7, A denaturáló oldatot és lízisoldatot befogadó feldolgozótartályok. Szike Úszka az Eppendorf-csöveknek *A leírásban korábban ismertetett módon elõállítva. A szükséges anyagok és eszközök Fény- vagy fluoreszcens mikroszkóp (immerziós objektív javasolt) Hûtõszekrény 4 C Inkubáló fürdõ 37 C¹on Mûanyag kesztyûk Üveg fedõlemezek (18 18 mm, mm vagy 24 mm) Mikropipetták 4 vízszintes tartály az inkubáláshoz Desztillált víz 70%, 90%, 0% etanol Használati utasítás A minták elõkészítése a tárgylemezekre 1) Végy egy C tartályt és tedd a lízisoldatot környezet hõmérsékletre (22 C) 2) Hígítsd meg az ondómintát tenyésztõ tápközegben vagy PBS-ben, millió per milliliter koncentrációra. Friss vagy közvetlenül nitrogénben lefagyasztott minták alkalmazhatók. Az agaróz mikrogél elkészítése 3) Óvatosan ütögesd le az alacsony gélesedési pontú agarózt tartalmazó Eppendorf-csövet (A csõ) függõleges helyzetben, hogy az agaróz a csõ aljára kerüljön. 4) Adj hozzá 1 mikroliter desztillált vizet, elkerülve a buborékok kialakulását, és szuszpendáld fel. ) Tedd be az A csövet az úszkába a kupak szintjéig, és hagyd lebegni percen keresztül 90 0 C¹on, amíg az agaróz feloldódik. Az agaróz felolvasztását más megoldásképpen mikrohullámú sütõben is végre lehet hajtani. 6) Vidd át az A csövet az úszkával együtt 37 C¹os szabályozott hõmérsékletû fürdõbe, és hagyd percig a hõmérsékletet kiegyenlítõdni. 7) Adj hozz mikroliter ondómintát az A csõ tartalmához és szuszpendáld fel. 8) Tedd az elõkezelt tárgylemezt hideg felületre, 4 C¹on (például fém- vagy üveglemezre). 9) Ha egyszer a tárgylemezek lehûltek, tedd rá az A csõben található szuszpenziót, és fedd le mûanyag fedõlemezzel, elkerülve a levegõbuborékok kialakulását. Javasolt 11, 17 és 0 mikroliteres cseppek alkalmazása a mm, mm vagy 24 mm méretû fedõlemezekhez. 8

9 ) Tedd a hideg lemezt a tárgylemezekkel a hûtõszekrénybe és hagyd a mintát gélesedni percig. A minták feldolgozása 11) A denaturáló oldat elkészítése. Ehhez adj 80 mikrolitert a B csõbõl mikroliter desztillált vízhez, keverd össze és rakd be a zöld dobozba. 12) Távolítsd el a fedõlemezeket, óvatosan elcsúsztatva, és azonnal tedd a tárgylemezt vízszintesen a denaturáló oldatba, és hagyd inkubálódni 7 percen keresztül környezeti hõmérsékleten (22 C). 13) Emeld fel a tárgylemezeket a szike segítségével, kesztyût használva. Tartsd azokat vízszintesen, és vízszintesen tedd a fehér tartályba, amely ml lízisoldatot tartalmaz (C csõ azonos hõmérsékletre hozva). Inkubáld 2 percen keresztül. 14) Emeld fel a tárgylemezeket és tedd azokat vízszintesen bõséges desztillált vizet tartalmazó tartályba a lízisoldat lemosásához. Hagyd ott percig. 1) Tedd a tárgylemezeket vízszintesen 70% etanolt (2 perc), azután 90% etanolt (2 perc) és végül 0% etanolt (2 perc) tartalmazó tartályba. 16) Hagyd megszáradni levegõn. Ha egyszer a feldolgozott tárgylemezek megszáradtak, azokat kartotékszekrényben lehet tartani környezeti (szoba) hõmérsékleten hónapokig. A minták festése Festés fénymikroszkóp alatti megfigyeléshez Keverd össze a Wright-oldatot foszfátpufferrel (1:1), és tegyél egy réteg festéket vízszintesen a száraz mikrogélre, ami lefedi. Hagyd festõdni percen keresztül, alkalomadtán ráfújva. Dekantáld, mosd meg óvatosan folyó vízzel és hagyd megszáradni. Ha a festés túlzott, festékteleníthetõ etanolban, megszárítható és újrafesthetõ. Ha festés gyenge, különösen a fényudvarokban, újra festhetjük több Wright-oldattal. Egy másik lehetõség percig inkubálni függõlegesen Coplin-edényben Hemacolor¹2 oldattal (Merck ), hagyni lecsepegni másodpercen keresztül, és azután egy másik Coplinedényben inkubálni Hemacolor¹3 oldattal (Merck ), percen keresztül. Végül óvatosan megmosni desztillált vízben és hagyni megszáradni. Ha állandó preparátumot akarunk, azt Entallan-ban rögzíthetjük. Festés fluoreszcens mikroszkóp alatti megfigyeléshez A fluoreszcens szûrõk variabilitásától függõen a mintákat megfesthetjük DNS¹re specifikus DAPI típusú fluorokrómokkal, Hoechst 3328¹al, Etídium-bromiddal, Propídium-jodiddal stb., halványodást megakadályozó közegben (például Vectashield, Vector, ref: H¹00). Biztonságosság és környezet Kerüljük el a az inhalációt és az érintkezést a mellékelt oldatokkal A B és C oldat sósavat, ditiotreitolt és Triton X¹0¹at tartalmaz. Tanulmányozzuk a gyártó által biztosított bizonyítványokat. Ne dobjuk el a felhasznált terméket a környezetbe. Kövessük a toxikus termékek tárolásával és kezelésével foglalkozó központ iránymutatásait. A biológiai mintákat potenciálisan fertõzõként kell kezelni. Tárolás és stabilitás Tároljuk környezeti (szoba) hõmérsékleten, kivéve a C oldatot, amelyet 4 C¹on kell tárolni. Lejárat: a reagensek és anyagok stabilak legalább 6 hónapos idõszakon keresztül. Javallott, hogy a B és C oldatot függõleges helyzetben és jól lezárva tároljuk. A találmány alkalmazása különbözõ területekre vonatkozik. A humán alkalmazása nyilvánvaló. Például terméketlen személyek mintáiban, akiknek a szeminogram paraméterei normálisak, ismételten elvetélõ párok esetében, mesterséges megtermékenyítésre alkalmazott mintákban, a here teljes eltávolítása miatt késõbbiekben mesterséges megtermékenyítésben alkalmazott lefagyasztandó (krioprezervációs) mintákban. Olyan páciensekben is, akik kemoterápián és/vagy radioterápián mennek át onkológiai betegségek miatt, és vazektómia végrehajtása elõtt. A találmány szerinti eljárással és reagenskészlettel végrehajtott vizsgálat javítja a spermiumdonor jelöltek kiválasztását, valamint kiegészíti a donoroktól származó minták periodikus értékelését a spermabankokban. Lehetséges az elõrehaladott kornak a spermiumok minõségére és a termékenységre való hatásának az elemzése is. Az alkalmazása érdekes olyan betegségekben szenvedõ páciensek értékelésére, amelyek befolyásolhatják a spermiumok integritását: láz, fertõzések, bárányhimlõ, stressz, genotoxikus ágensek hatása a munkahelyen vagy balesetben (peszticidek, sugárzás, környezeti ösztrogének stb.), hormonkezelések vagy ismétlõdõ hõhatás (forró sütõkkel, kerámiával, üveggel kapcsolatos munkások, vagy jármûvezetõk). Ezeket a személyeket periodikusan is értékelhetjük. Végezetül a találmány hasznos az alap- és klinikai kutatásban. Hasonlóképpen a találmány alkalmazható állatorvosi laboratóriumokban is. Lehetséges a DNS-fragmentáció tanulmányozása különbözõ állatfajokban, például tenyészkanokban, tárolt mintákban, beteg folyamatokban, kihalástól fenyegetett fajok hímjeiben, és toxikus ágensek által okozott károsodás értékelésében. Szabadalmi példák A találmányt példák alapján ismertetjük, amelyek részletesebben bemutatják némelyik korábban ismertetett jellegzetességet. 1. példa Friss ondómintában az ismertetett módszert kromatin diszperziós fényudvarok elõállítására alkalmazzuk. Ehhez a PBS-ben millió per milliliter koncentrációra 9

10 meghígított mintát összekevertük 1% folyékony alacsony gélesedési pontú agarózzal, ami az utóbbi 0,7% koncentrációját eredményezte. Miután a mikrogél begélesedett a tárgylemezen, a mintát 22 C¹on inkubáltuk 8 percen keresztül a 0,08 M HCl összetételû denaturáló oldatban, és azután a 2, M NaCl¹t, 0,2 M DTT¹t, 0,2 M Tris¹t, 1% Triton X¹0¹at ph 7,¹ön tartalmazó lízisoldatban 2 percen keresztül. A tárgylemezeket megmostuk desztillált vízben percen keresztül, dehidratáltuk etanolfürdõkben, és levegõn megszárítottuk. Azután egymás után ugyanazokon a sejteken DBD-FISH¹t ( DNA Breakage Detection-Fluorescence In Situ Hybridization ; Fernandez és munkatársai, 1998; 00; 02; Fernandez és Gosalvez, 02) hajtottunk végre teljes genomiális DNS-próba alkalmazásával. Ez az eljárás lehetõvé teszi a DNS-töréseket tartalmazó sejtmagok detektálását és mennyiségi meghatározását, deproteinizálással és a DNS kontrollált denaturálásával. Ez a denaturálás egyláncú DNS-szakaszokat hoz létre a törések végeibõl, amelyeket in situ hibridizálással detektálunk fluorokrómmal megjelölt teljes genomiális próba alkalmazásával, ami vörös fluoreszenciát emittál (Cy3). Minél magasabb a sejt DNS¹e töréseinek a száma, annál nagyobb a denaturáló oldat által okozott egyláncú DNS mennyisége, és annál nagyobb hibridizált próba mennyisége és a megfigyelt vörös fluoreszcencia is magasabb. A találmány szerinti eljárással feldolgozott minták egyláncú DNS¹t tartalmaznak, amelyeket a denaturáló oldat hoz létre, a DNS végeinek lehetséges töréseibõl. Tehát a teljes genomiális DNS-próbával végzett hibridizáció intenzitása függeni fog a spermiumsejtmagjában található törések mennyiségétõl. 20 véletlenszerûen kiválasztott sejtet számláltunk le. A kromatin diszperziós fényudvarok DAPI-val megfestett képeit hûtött CCD-kamerával vettük fel két szûrõ alkalmazásával a diszperziós fényudvarok, ami kék színben látható, és a hibridizációs szignál, ami vörös színben látható egyidejû vizualizálására. A végcél a korreláció megállapítása volt a kromatin diszperziós fényudvarok mérete és a DNS-törések markerének szintje között. Az eredmények fordított korrelációt demonstráltak a kromatin diszperziós fényudvarok relatív területe és a DNS-törések markerének szintje között DBD-FISH alkalmazásával (1. táblázat). Nagy fényudvar 1. táblázat Fényudvar terület/összes Összes MD Átlag 0,8 13,07 Standard deviáció 0,0 7, Szám Közepes fényudvar Fényudvar terület/összes Összes MD Átlag 0,73 24,8 Standard deviáció 0,07 12,2 Szám Kis fényudvar Fényudvar terület/összes Összes MD Átlag 0,48 180,28 Standard deviáció 0,14 117,82 Szám Fényudvar nélkül Fényudvar terület/összes Összes MD Átlag 7,34 Standard deviáció 22,69 Szám Degradált Fényudvar terület/összes Összes MD Átlag 1 Standard deviáció 86 Szám 7 7 Megjegyzendõ, hogy ahogyan a fényudvar relatív mérete csökken, a hibridizáció teljes átlagos denzitása (MD) növekszik. Ennek eredményeképpen a kromatin diszperziós fényudvarok találmány szerinti eljárással történõ egyszerû meghatározása a humán spermiumok kromatin/dns integritásának egyszerû és közvetlen becslését biztosítja. 2. példa Kiegészítõ eljárás a mesterséges megtermékenyítési módszerekben alkalmazott spermiumdonorok értékelésére. Mesterséges megtermékenyítési klinikán ondódonor mintát vettünk. A rutin spermogram kiegészítéseként meghatároztuk a DNS-fragmentáció mértékét ezekben a mintákban. Személyenként 00 sejtet számláltunk le. Ebben az esetben az eredményeket a találmány szerinti kromatin diszperziós fényudvar mérési teszttel generáltuk. A mintákat agaróz mikrogélbe foglaltuk be, inkubáltuk a savas és lízisoldatokban, mostuk, dehidratáltuk és hagytuk megszáradni, amint az 1. példában ismertettük. A festést ebben az esetben nem DAPI-val, hanem a Wright-festékkel végeztük, fénymikroszkópiához. Ehhez a Wright-oldatot összekevertük foszfátpufferrel (1:1), és egy réteg festéket tettünk vízszintesen a száraz mikrogélre, ami lefedi. Hagytuk festõdni percen keresztül, alkalomadtán ráfújva. Folyó vízben történõ mosás után hagytuk megszáradni, és a nukleoidokat vizualizáltuk. Az eredményeket a 2. táblázatban mutatjuk be. Az átlagos fragmentációs szint ebben a csoportban kevesebb mint % volt minden esetben (1,4±3,1).

11 2. táblázat Minta száma Nagy fényudvaros Közepes fényudvaros sejtek %¹a Kis fényudvaros Fényudvar nélkül Degradált sejtek %¹a Fragmentált n1 76,2 7,4,2,0 1,2 16,4 n2 74,4 7,0 11,2 7,4 18,6 n3 72,6 16,4 6,2 4,8 11,0 n4 78,6 6,0 7,4 6,6 1,4 1,4 n 81,6,8 7,0,4 0,2 12,6 n6 69,4 11,0 12,6 6,0 1,0 19,6 n7 73,2 7,2 9,6 8,8 1,2 19,6 n8 80,2,4 8,4,0 1,0 14,4 n9 8,2 2,6,0 6,8 0,4 12,2 n 79,8,6 6,8 7,0 0,8 14,6 A fényudvarok méretkategóriáinak százalékos eloszlását ondódonornál állapítottuk meg. A fragmentált DNS¹û spermiumok százaléka a kis fényudvarú, fényudvar nélküli és fényudvar nélküli/degradált spermium kategóriák összege volt példa Terméketlen páciensek klinikai értékelése. Mesterséges megtermékenyítési klinikán 17 mintát vettünk spermadonoroktól. A rutin spermogram kiegészítéseként meghatároztuk a DNS-fragmentáció mértékét ezekben a mintákban. Személyenként 00 sejtet számláltunk le. Ugyanúgy mint az elõzõ példában, az eredményeket a találmány szerinti kromatin diszperziós fényudvar mérési teszttel generáltuk. Az eredményeket a 3. táblázatban mutatjuk be. Az átlagos fragmentációs szint ebben a csoportban több mint % volt minden esetben (49,9±,7). 3. táblázat Minta száma Nagy fényudvaros Közepes fényudvaros sejtek %¹a Kis fényudvaros Fényudvar nélkül Degradált sejtek %¹a Fragmentált p1 47,0 12,0 16,2 22,4 2,4 41,0 p2 38,4 3,2 1,2 42,2 1,0 8,4 p3 39,6 1,6 13,2 44,6 1,0 8,8 p4 3,4,6 11,0 17,6 7,4 36,0 p 42,4,2 1,2,8 1,4 2,4 p6 0,0,8,0 32,9 1,2 44,2 p7 39,0 11,2 22,6 21,2 6,0 49,8 p8,6 4,8 9,4 22,8 2,4 34,6 p9 69,4 3,2 7,4 19,0 1,0 27,4 p,6 4,4,4 24,0 0,6,0 p11 11,3 3,0 6,0 7,8 4,0 8,8 p12 6,6 4,2 2,4 24,4 3,4,2 p13 16,7 11,9 24,3 46,8 0,3 71,4 p14 8,4 4,4 18,6 67,0 1,6 87,2 p1 64,7 8,2 11,2 13,7 2,2 27,1 p16 14,6,0,6 63,4 6,4 80,4 p17 6,8,8 9,4 17,4 1,6 28,4 11

12 A fényudvarok méretkategóriáinak százalékos eloszlását 17 páciensnél állapítottuk meg. A fragmentált DNS¹û spermiumok százaléka a kis fényudvarú, fényudvar nélküli és fényudvar nélküli/degradált spermium kategóriák összege volt. 4. példa A találmányt alkalmaztuk a humán spermiumokat befolyásoló toxikológiai károsodások értékelésére. Károsodás exogén és endogén ágensek hatására. Szemléltetõ példaként olyan vizsgálatot mutatunk be, amelyben nitrogén-oxid (NO) donor kémiai ágenssel indukált DNS-károsodást elemeztünk. Ehhez normál személy teljesen friss ondómintájának 0 mikroliteres aliquotjait inkubáltuk 1 órán keresztül környezeti (szoba) hõmérsékleten nátrium-nitroprusszát (SNP) különbözõ dózisaival. A kezelt mintákat azután óvatosan lecentrifugáltuk, eldobtuk a felülúszót az SNP elmosására. PBSben való újra felszuszpendálás után a mintákat feldolgoztuk a találmány szerinti eljárásnak megfelelõen. Az eredményeket a 4. táblázatban mutatjuk be. Azt figyeljük meg, hogy ahogyan az NO donor koncentrációja emelkedett, a károsodott kromatinú/dns¹û spermiumok százaléka növekedett. 4. táblázat SNP koncentráció (mikrom) Nagy fényudvaros Közepes fényudvaros sejtek %¹a Kis fényudvaros Fényudvar nélkül Degradált sejtek %¹a Fragmentált 0,0 61,8 14,1 12,0 12,1 0,0 24,1 62, 38,0 23,2 19,6 19,2 0,0 38, ,8 24,2 32,6 23,1 0,0, ,9 19,0,3,1 0,0 70,4 00 3,8 22, 39,6 34,1 0,0 73,7 A nitrogén-oxid (NO) donor ágens különbözõ koncentrációival kezelt ondómintával kapott fényudvar-kategóriák eloszlási százaléka. A fragmentált DNS¹û spermiumok százaléka a kis fényudvarú, fényudvar nélküli és fényudvar nélküli/degradált spermium kategóriák összege volt.. példa A vizsgálati eljárás reprodukálhatósága fagyasztott ondóminták alkalmazásával. Két olyan tényezõt vizsgáltunk, amelyek befolyásolhatják a minták minõségét, mint például a fagyasztás és a hígítás, a kromatin fényudvar diszperzió mértékének elemzésével. Ehhez különbözõ donoroktól származó 4 friss mintát és folyékony nitrogénben lefagyasztott aliquotokat elemeztünk. A minták elemzését a különbözõ típusú nukleoidok (00 sejt) közvetlen vizuális leszámlálásával hajtottuk végre két különbözõ tárgylemezen és minimum két alkalommal mintánként és kísérleti pontonként. A számlálás reprodukálhatósága. Kiszámítottuk az osztályon belüli korrelációs koefficiens (R) az egyes tárgylemezeken végrehajtott különbözõ mérésekre. Az egyes sejttípusok indexeinek és a két számlálás átlagának számításainak eredményeit 0,78 és 0,92 között változott, és mivel az R értékek 0 és 1 között változnak, azt mutatja, hogy a kapott reprodukálhatóság magas volt (. táblázat).. táblázat Átlag 9%¹os konfidencia határok Nagy fényudvaros sejtek %¹os különbsége 0,78 ( 1,98; 0,42) Közepes fényudvaros sejtek %¹os különbsége 0,6 ( 0,17; 1,29) Kis fényudvaros sejtek %¹os különbsége 0,36 ( 0,48; 1,) Fényudvar nélkül sejtek %¹os különbsége 0,19 ( 0,88; 0,0) Fényudvar nélkül és degradálódott sejtek %¹os különbsége 0,04 ( 0,; 0,43) Fragmentált DNS¹û sejtek %¹os különbsége 0,21 ( 0,67; 1,09) Fagyasztás. A kapott eredményeket összehasonlítottuk kétfaktoros varianciaanalízis alkalmazásával (tartósítási eljárás és minta). Kimutattuk, hogy nem voltak szignifikáns különbségek (P>0,0) a frissen és folyékony nitrogénben lefagyasztottan feldolgozott minták fragmentáltságának szintjében. Látszólag a fagyasztottan eltöltött idõ sem befolyásolja a fragmentált DNS¹û spermiumok arányát (6. táblázat). 12

13 6. táblázat Minta Minta állapota Átlag Standard deviáció 1. S. friss 19,8 0,22 S. fagyasztott, 1,48 2. S. friss 13,38 1,87 S. fagyasztott 13,39 1,86 3. S. friss 12,7 3,04 S. fagyasztott 11,3 1,92 4. S. friss 22,13 0,74 S. fagyasztott 21,6 2,68 Összefoglalva, demonstráltuk az eredmények reprodukálhatóságát a közvetlen vizuális elemzést követõen. 6. példa Humán spermium kromatin/dns integritásának elemzése a denaturáló és lízisoldatok inkubálási sorrendjének variálásával: Ebben a változatban miután a spermiumokat betettük az agaróz mikrogélekbe, azokat az elsõ lépésben a reagenskészletnél ismertetett lízisoldatban inkubáljuk 2 percen keresztül 22 C¹on. A tárgylemezeket azután bemerítjük a 0,88 HCl összetételû denaturáló oldatba. Végül desztillált vizes mosás után a tárgylemezeket dehidratáljuk és megfestjük Wright-oldattal, és megvizsgáljuk fénymikroszkóp alatt. Ezen mûszaki variáció alkalmazásával a fragmentált DNS¹û spermiumok eltérõ módon viselkednek. Ebben az esetben a kromatint/dns fragmenseket diszpergálva nagyobb méretû fényudvarokat eredményeznek példa A módszer különbözõ állati spermium mintákon történõ alkalmazásának eredményei. A javasolt módszer univerzális jellege értékelésének céljával különbözõ fajok hím egyedeit választottuk ki a spermiumuk DNS-fragmentáltsága vizsgálatának végrehajtására és azok farkának, mint megkülönböztetõ celluláris elemeinek a párhuzamos vizualizálására. Spermiummintákat vettünk a következõ fajokból: egér (Mus musculus), bika (Bos taurus), rombuszhal (Scophthalmus maximus) és földigiliszta (Lombricus terrestris). Mindegyik fajban a módszer alkalmazása kromatin diszperziós fényudvarokat eredményezett és a farkukat fel lehetett ismerni, beleértve azokat is, amelyeknek normális DNS¹e volt, és azoknál is, amelyeknek fragmentált (4. ábra). A spermium formája és a keletkezett fényudvar típusa jellemzõ az egyes fajokra (4a a bikáé; 4b, c, d az egéré; 4e a földigilisztáé; 4f a rombuszhalé). A spermium morfológiája akár fragmentált DNS¹t tartalmazott, akár nem különbözött a fajok között és különbözött az emberekben találttól is. Mindegyik esetben a kromatin diszperzió párhuzamos és összemérhetõ azzal, amit a humán spermiumminták esetében tapasztaltunk. Azaz a különbözõ méretû kromatin diszperziós fényudvarok keletkeztek és a spermium farka vizualizálható. A különbözõ fajok morfológiája és fényudvarmérete és a kapott eredmények a következõk: A bika esetében független mintákat elemeztünk különbözõ megfigyelõ alkalmazásával. Ebben az esetben különbségeket találtunk a fragmentált DNS¹t tartalmazó sejtmagok százalékában az egyes egyedekben, de nem figyeltünk meg különbségeket az egyes megfigyelõk által kapott százalékok között (7. táblázat). 7. táblázat Összesen % nagy % közepes % kicsi % fényudvar nélkül % degradált % fragmentált Ob1 00 7,8 9,8 7,2 7,2 0 14,4 Ob ,2 12 3,6 0,2 1,8 Ob ,8 0,2 1 Ob ,8 11,4 8, ,8 Ob ,2 8,2 7,6 0 1,8 00 7,1 9,4 9,1,9 0,1 1,3 Ob ,6 6,2 3,2 0 9,4 Ob , ,8 0 9,8 Ob ,4 8,4 6, ,2 13

14 7. táblázat (folytatás) Összesen % nagy % közepes % kicsi % fényudvar nélkül % degradált % fragmentált 00 81,7 8,8 6,1 3,3 9, Ob ,2 6,2,8 11,4 0,4 22,6 Ob ,8 4,6 14,6 0 24,6 Ob3 00 7,6 12 7,2 0,2 19,4 Ob 00 72,2 6,8 14,2 6,4 0, ,3,7 12,7 8,6 0,3 21,8 Ob2 00 8,2 8,4 3,8 2,6 0 6,4 Ob ,4 3,2 2,4 0,6 Ob ,8 12,8 4 2,4 0 6, ,4,2 3,7 2, 0 6,1 Az egér esetében két különbözõ törzset alkalmaztunk, egy normált (M1 32NNC) és egy másik apai ágon rokont (M2 32BC). A különbözõ típusú fényudvarokra kapott százalékok egyértelmû különbségeket mutatnak a normál (7.1) és a vérrokon (2.1) törzs között (8. táblázat). 8. táblázat Összesen % nagy % közepes % kicsi % fényudvar nélkül % degradált % fragmentált M2 32BC 63 11, 18,1 6,9 0,1 2,1 M1 32NNC 86,2 6, 4,6 2, 0,2 7,1 A rombuszhal specifikus esetében meg lehetett különböztetni a nagy kromatin diszperziós fényudvarú és kismagú spermiumokat azoktól, amelyeknek kis diszperziós fényudvaruk és nagy magjuk volt, és végezetül amelyeknek nem volt diszperziós fényudvaruk. Az eredményeket a 9. táblázatban mutatjuk be. % nagy fényudvar/kis mag 9. táblázat % kis fényudvar/nagy mag % csak fej fényudvar nélkül 94,6 0,4 92,8 7 0,2 9,6 4 0,4 94,1,4 0,3 72,2 2,2 2,6 71,6 2,4 3 77,2 2,8 73,6 23, 2,8 7,2 18,4 6,4 71,2 22 6, ,7 18,2 6,7 A földigiliszta esetében a fényudvarok dinamikus kialakulása hasonló, mint a korábbi esetekben ismertetett, és ebben az esetben a spermiumok feje és farka 4 0 szintén tökéletesen megkülönböztethetõ. A fragmentált DNS¹t tartalmazó spermiumok becsült százaléka 2 vizsgált egyedben (egy fiatal és egy felnõtt) 1% és 22% volt. Ebben az esetben a spermiumok feje részlegesen fényudvarosnak tûnik, aminek a szignifikanciáját jelenleg vizsgáljuk (lásd a 4.e ábrát). 8. példa A kromatin diszperziós fényudvarok, spermium farkak és leukociták ugyanazon citológiai preparátumának vizualizálása. A leukocitospermia hatásának értékelése a DNS integritására spermiummintákban. A leukocitospermia egy nemkívánatos invazív folyamat, ami a leukociták számának abnormális megemelkedéséhez vezet az ondófolyadék mintáiban (> 6 /ml). A leukocitospermiát a terméketlen férfiak %-ában detektálták. Úgy tûnik, hogy az ondóban jelen lévõ neutrofil sejtek, valamint makrofágok ROS¹t ( Reactive Oxygen Species ) képesek létrehozni, ami oxidatív stresszt okoz, és a DNS-károsodását eredményezi a spermiumban (Omu és munkatársai, 1999; Erenpreiss és munkatársai, 02; Henkes és munkatársai, 03). Valóban, a leukocitospermiát kapcsolatba hozták különbözõ a spermium minõségének elemzésére használatos klasszikus paraméterek abnormalitásaival. Például míg az abnormális spermiumok a leukocitospermiában nem szenvedõ személyeknek csak a 47%-ában fordulnak elõ, a százalék 88%¹ra emelkedik, amikor a leukocitospermia jelen van ( 14

15 Nagymértékû, különbözõ etiológiájú (prosztatitisz, és chlamydomonas és bakteriális ágensek miatti fertõzések) leukocitospermiában szenvedõ páciens mintájában tanulmányoztuk a módszerre adott választ, hogy egyértelmûen megkülönböztessük az ondómintákban jelen lévõ leukociták százalékát és a DNS-fragmentáció szintjét ugyanazon minták spermiumaiban. A két sejttípus közötti különbség, amikor a mintákat ugyanúgy kezeltük egyértelmû, mivel a fragmentált DNS¹û spermiumok és a nem fragmentáltak mutatják a farkat, ami jellemzi õket. A farok hiánya a leukocitákban lehetõvé teszi azok megkülönböztetését a többi sejttípustól (. ábra). Ily módon közvetlen korrelációt állapíthatunk meg a leukociták mintánkénti szám és a spermium DNSfragmentációja között, a. táblázat bemutatja a leukociták számát, különbözõ etiológiájú leukocitospermiás páciens ondómintájában és a normális DNS¹û spermiumok százalékát (nagy és közepes; LM) és fragmentált (kis fényudvar és fényudvar nélküli (S/WH).. táblázat % leukociták % L/M fényudvaros sejtek % P/WH fényudvaros sejtek 1. minta 6,1 73,9 2. minta 1,,3 29,2 3. minta 17 48,2 34,8 4. minta 22 31,7 46,3. minta 2,6, 43,9 Hivatkozások Aitken RJ, Gordon E, Harkiss D (1998) Relative impact of oxidative stress on the 1 functional competence and genomic integrity of human spermatozoa. Biol. Reprod. 9: De Jonge C (02) The clinical value of sperm nuclear DNA assessment Hum. Fertil. :1 3 Erenpreiss J, Hlevicka S, Zalkalns J and Erenpreisa JJ (02) Effect of Leukocytospermia on Sperm DNA Integrity: A Negative Effect on Abnormal Semen Samples. Journal of Andrology 23:. Evenson DP, Darzynkiewicz Z, and Melamed, MR (1980) Relation of mammalian sperm heterogeneity to fertility. Science 2: Evenson DP and Jost LK (1994) Sperm chromatin structure assay: DNA denaturability. In: Darzynkiewicz Z, Robinson JP, Crissman HA. eds. Methods in Cell Biology Vol 42. Flow Cytometry 2nd ed. Orlando. Fla: Academic Press 42:19 176) Evenson DP, Jost L K, Corzett M, Balhorn R (00) Characteristics of human sperm chromatin structure following an episode of influenza and high fever: a case study. J. Androl. 21: Evenson DP, Jost LK, Marshall D, Zinaman MJ, Clegg E, Purvis K, de Angelis P, Claussen OP (1999) Utility of the sperm chromatin structure assay as a diagnostic and prognostic tool in the human fertility clinic. Hum. Reprod. 14: Evenson DP, Larson NJ, Jost LK (02) Sperm Chromatin Structure Assay: its clinical use for detecting sperm DNA fragmentation in male infertility and comparisons with other techniques. J. Androl 23:2 43 Fernández JL, Goyanes VJ, Ramiro J, Gosálvez J (1998) Application of FISH for in situ detection and quantification of DNA breakage. Cytogenet. Cell Genet. 82:21 26 Fernández JL, Vázquez-Gundin F, Delgado A, Goyanes VJ, Ramiro-Diaz J, de la Torre J, Gosálvez J (00) DNA breakage detection (DBD-FISH) in human spermatozoa: technical variants evidence different structural features. Mutat. Res. 43:77 82 Fernández JL, Gosálvez J (02) Application of FISH to detect DNA damage: DNA breakage Detection-FISH (DBD-FISH). Methods Mol. Biol. 3: Fernández JL, Goyanes Y, Gosalvez J (02) DNA Breakage Detection-FISH (DBD-FISH) In: Rautenstrauss B, Liehr T. eds. FISH technology-springer lab manual. Heideberg: Springer-Verlag; Fernández JL, Muriel L, Rivero MT, Goyanes Y, Vázquez R, Alvarez JG (03) The sperm chromatin dispersion test: a simple method for the determination of sperm DNA fragmentation. J. Androl. 24: 9 66 Henkel R, Maass G, Hajimohammad M, Menkveld R, Stall T, Villegas J. Sanchez R, Kruger TF, Schill WB. (03) Urogenital inflammation: changes of leucocytes and ROS. Andrologia. :9 13. Larson KL. DeJonge C, Barnes A, Jost L, and Evenson DP (00) Relationship between assisted reproductive techniques (ART) outcome and status of chromatin integrity as measured by the Sperm Chromatin Structure Assay (SCSA). Hum Reprod. 1: Gorczyca W, Gong J, Darzynkiewicz Z (1993) Detection of DNA strand breaks in individual apoptotic cells by the in situ terminal deoxynucleotidyl transferase and nick translation assays. Cancer Res. 3: Hughes CM, Lewis SE, McKelvey-Martin VJ, Thompson W (1996) A comparison of baseline and induced DNA damage in human spermatozoa from fertile and infertile men using a modified comet assay. Mol Hum Reprod 2: Omu AE, AI¹Qattan F, Al¹Abdul-Hadi FM, Fatinikun MT, Fernandes S. (1999) Seminal immune response in infertile men with leukocytospermia: effect on antioxidant activity. Eur J Obstet Gynecol Reprod Biol 86:19 2 (1999) Sailer BL, Jost LK, Evenson DP (199) Mammalian sperm DNA susceptibility to in situ denaturation associated with the presence of DNA strand breaks as measured by the deoxynucleotidyl transferase assay. J Androl. 16: Sumner AT (1990) Chromosome banding. Unwin Hyman. London. 1

16 World Health Organization (1999) WHO laboratory manual for the examination of the human semen and semen-cervical mucus interaction. Fourth Edition. Cambridge University Press, Cambridge, UK. SZABADALMI IGÉNYPONTOK 1. Eljárás állat spermiumsejtje kromatin/dns integritásának értékelésére, amely eljárás magában foglalja a következõket: a) a spermiumot tartalmazó minta kezelésének lépése DNS-denaturáló oldattal, b) egyetlen kezelési lépés lízisoldattal a sejtmagi fehérjék extrahálására, ahol a lízisoldatban található detergens nemionos, fehérjét nem denaturáló detergens, és c) a spermium kromatin/dns integritásának értékelési lépése a spermiumsejtek fényudvar méretének mérése alapján. 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a nemionos detergens a következõk által alkotott csoportból van kiválasztva: toktil-fenoxi-polietoxi-etanol (Triton X¹0), (3¹D-glukonamidopropil) kolamid (big- CHAP), Brij(r) P, N¹dekanoil-N-metil-glukamin, digitonin, dodekanoil-n-metil-glukamid, heptanoil-n-metilglukamid, elágazó oktil-fenoxi-poli(etilén-oxi) etanol (Igepal CA¹6), N¹nonanoil-N-metil-glukamin, Nonidet P, N¹oktanoil-N-metil-glukamin, Span oldat, Poliszorbát (Tween ) és ezek keverékei, elõnyösen Triton X¹0. 3. Az 1 2. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a lízisoldat tartalmaz nátriumkloridot 1 és 3 M között, ditiotreitolt (DTT) 0,001 és 2 M között, 2¹amino-2(hidroxi-metil)-1,3-propándiolt (Tris) 1 2 0,001 M és 2 M között és Triton X¹0¹at 0,1% és 3% között. 4. Az 1 3. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a lízisoldat 2, M nátrium-kloridot, 0,2 M DTT¹t, 0,2 M Tris¹t, 1% Triton X¹0¹at tartalmaz és a ph¹ja 7,.. Az 1 4. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a DNS-denaturáló oldat sav. 6. Az. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a DNS-denaturáló oldat a következõk által alkotott csoportból kiválasztott savat tartalmaz: sósav, ecetsav, salétromsav és ezek keverékei. 7. A 6. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a DNS-denaturáló oldat sósavat tartalmaz. 8. Az 1 7. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az a) és b) lépések után festési lépés van. 9. A 8. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a festés Wright-típusú oldattal van elvégezve.. Az 1 9. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a spermiumot tartalmazó minta szuszpenzióhoz hasonló közegbe van befoglalva, elõnyösen mikrogélbe. 11. A. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a spermiumot tartalmazó minta agaróz mikrogélbe van befoglalva. 12. DNS-denaturáló oldat és lízisoldat 1. igénypont szerinti eljárásban történõ alkalmazása, ahol a lízisoldatban található detergens nemionos, fehérjét nem denaturáló detergens. 13. A 12. igénypont szerinti alkalmazás, azzal jellemezve, hogy a lízisoldat tartalmaz nátrium-kloridot 1 M és 3 M között, ditiotreitolt (DTT) 0,001 M és 2 M között, 2¹amino-2-(hidroxi-metil)-1,3-propándiolt (Tris) 0,001 M és 2 M között és Triton X¹0¹at 0,1% és 3% között. 16

17 HU 007 T2 Int. Cl.: C12Q 1/68 17

18 HU 007 T2 Int. Cl.: C12Q 1/68 18

19 HU 007 T2 Int. Cl.: C12Q 1/68 19

20 HU 007 T2 Int. Cl.: C12Q 1/68