DOKTORI ÉRTEKEZÉS. Sebıková Agneša (Sebık Ágnes)

Átírás

1 DOKTORI ÉRTEKEZÉS Gyógyszermaradványok és más szerves szennyezık elemzése szennyvizekben, s a Dunavízében: trimetilszilil (oxim) éter/észter származékokként, GC-MS módszerrel Sebıková Agneša (Sebık Ágnes) Témavezetı: Perlné Dr. Molnár Ibolya egyetemi tanár Eötvös Loránd Tudományegyetem Kémiai Intézet, Analitikai Kémiai Tanszék Kémiai Doktori Iskola Vezetı: Dr. Inzelt György egyetemi tanár Analitikai, kolloid- és környezetkémia, elektrokémia program Programvezetı: Dr. Záray Gyula egyetemi tanár Budapest, 2009

2 Köszönetnyilvánítás Köszönettel tartozom mindazoknak, akik disszertációm elkészítésében segítségemre voltak: Perlné Dr. Molnár Ibolya egyetemi tanárnak, témavezetımnek, iránymutatásáért, önzetlen segítségéért, bátorításáért és tanácsaiért, Dr. Záray Gyula egyetemi tanárnak, az Analitikai Kémiai Tanszék tanszékvezetıjének, hogy kutatómunkámat lehetıvé tette és támogatta, Zsigrainé Dr. Vasanits Anikó egyetemi tanársegédnek a minták feldolgozásában és az eredmények értékelésében nyújtott segítségéért, a Fıvárosi Csatornázási Mővek, a Fıvárosi Vízmővek és a GEN-LAB Kft. kutatásaimhoz nyújtott anyagi támogatásáért. 2

3 Tartalomjegyzék: 1. Bevezetés, célkitőzések Rövidítések jegyzéke Irodalmi áttekintés A nem szteroid típusú gyulladásgátlók A nem szteroid típusú gyulladásgátlók jellemzése A nem szteroid típusú gyulladásgátlók származékká alakítási lehetıségei Az ibuprofen, a naproxen, a ketoprofen és a diklofenak meghatározásának lehetıségei Az epesavak Az epesavak jellemzése és biológiai szerepük Az epesavak elemzésének kromatográfiás lehetıségei Sok összetevıt elemzı rendszerek A növényvédı szerek meghatározásának analitikai lehetıségei Az eltérı eredető környezeti szennyezık különbözı csoportjainak (beleértve a növényvédı szereket is) meghatározására alkalmas módszerek A mőveleti üres használatának irodalmi áttekintése Kísérleti rész A kémszerek A minták Az eszközök A módszerek A reagens oldatok A modell oldatok A származékká alakítás Szilil-származékokká Oxim- és szilil-származékokká A miták elıkészítése A kísérleti eredmények értékelése Alapkutatás A nem szteroid típusú gyulladásgátló gyógyszerek tanulmánya A származékká alakítás optimálása és a származékok fragmentum-analitikai tanulmánya A külsı és a belsı ionizációs technika összehasonlítása A TIC és a SIM üzemmód jellemzése

4 Az oximmá alakítás A modell vegyületek mérési reprodukálhatósága Visszanyerési tanulmány Az epesavak minıségi-mennyiségi meghatározása Származékképzési tanulmány Az epesavak szelektív fragmentum ionjaik elemzése A sok összetevıjő elemzı rendszer A szennyezık kiválasztása Származékképzések értékelése A szennyezık fragmentum-analitikai tanulmánya Linearitás és reprodukálhatóság Visszanyerési tanulmány Két különbözı SPE-töltet teljesítményének összehasonlítása A ph hatása a visszanyerés hatásfokára A különbözı mennyiségek visszanyerése A reagens mőveleti üres és az SPE mőveleti üres mérések kérdése Analitikai alkalmazások A négy nem szteroid típusú gyulladásgátló: az ibuprofen, a naproxen, a ketoprofen, a diklofenak minıségi-mennyiségi meghatározása befolyó és elfolyó szennyvíz mintákban Az ibuprofen, a naproxen, a ketoprofen és a diklofenak meghatározása Duna-víz mintákban A sok összetevıjő elemzı rendszer felhasználása befolyó és elfolyó szennyvizek szennyezıinek azonosítására és mérésére A sok összetevıjő elemzı rendszer felhasználása a Duna-víz szennyezıinek azonosítására és mérésére Melléklet: A 63 vegyület szerkezeti képlete, azonosítószáma (megegyezik a 14a.Táblázattal) és neve Új tudományos eredmények; Összefoglalás Summary Irodalmi hivatkozások Az értekezés anyagából készült dolgozatok, szakmai elıadás és poszterek

5 1. Bevezetés, célkitőzések Az utóbbi években számos közlemény és tanulmány hívja fel a figyelmet a környezeti vizeinket, termıföldjeinket elárasztó, az élı szervezetekre káros gyógyszermaradványok, s a 21. század életvitelébıl származó legkülönfélébb szennyezı anyagokra, e környezeti szennyezık minıségi és mennyiségi ismeretének jelentıségére, eltávolításuk szükségességére. Környezeti szennyezık közé tartoznak pl. a gyógyszerek (gyulladásgátlók, antibiotikumok, antiepileptikumok) és metabolitjaik, a testápolószerek, a tisztítószerek, a mőanyaglágyítók, a növényvédı szerek, ezek mindegyike káros hatással lehet a vizek élıvilágára és az emberre egyaránt. Több európai és tengerentúli országban az elmúlt évtizedekben monitoring program készült a felszíni vizekbe került gyógyszermaradványok felkutatására. Ezen programok a vizsgált vizekben számos hatóanyag jelenlétét igazolták. Kutatócsoportunk a hazai környezeti vizekben (befolyó és elfolyó szennyvízben, Duna vízben, ivóvizekben) található gyógyszermaradványok minıségi és mennyiségi meghatározására elsıként indított kutatásokat. A Magyarországon eladott gyógyszermennyiségek alapján ismertek a legnagyobb mennyiségben eladásra került gyógyszerek, ezek elsısorban a nem szteroid alapú gyulladásgátló és fájdalomcsillapító készítmények. Munkám fı célja volt olyan módszerek bevezetése, amelyek alkalmasak a környezeti vizek szennyezıinek azonosítására és mérésére. Az európai és tengerentúli gyakorlatnak megfelelıen szennyvíztisztítók és folyóvíz minták szennyezettségének nyomonkövetésére. Munkám három fı részre tagozódik, úgymint, (a) a nem szteroid típusú gyulladásgátló gyógyszermaradványok, (b) az epesavak elemzésére, valamint, (c) a sok összetevıjő elemzı rendszer kidolgozására. Elsı lépésként négy, gyakran használt nem szteroid típusú gyulladásgátló és fájdalomcsillapító, az ibuprofen, a naproxen, a ketoprofen és a diklofenak származékképzési, fragmentum-analitikai és visszanyerési tanulmányát terveztük. Ezen vizsgálatok eredményeit felhasználva optimáltuk a négy gyulladásgátló minıségi és mennyiségi meghatározását befolyó és elfolyó szennyvizekben és a Duna-vízben egyaránt. További kutatásaink az epesavak elemzésére vonatkoztak. Az epesavakkal elsısorban az orvostudományok területén találkozhatunk, különbözı biológiai minták vizsgálataival kapcsolatban, szennyvizekben eddig az epesavakat nem azonosították. Egyes epesavak, hasonlóan a gyógyszermaradványokhoz, a szervezetbıl való távozásuk után a szennyvizekbe, a szennyvizekbıl a nem megfelelı kezelés után a felszíni vizekbe kerülhetnek. Az epesavak elemzését a modellvegyületeik részletes származékképzési, fragmentum-analitikai és visszanyerési tanulmányával 5

6 indítottuk, majd az optimált körülmények mellett minıségi és mennyiségi meghatározásukat a befolyó és az elfolyó szennyvíz mintákban, valamint a Duna-víz mintákban hasznosítottuk. A különbözı vízminták számtalan alkotót tartalmaznak, ezért célul tőztük ki egy sok összetevıt, egyidejőleg, elemzı rendszer kialakítását. E rendszer alkotóinak származékképzési, fragmentum-analitikai és visszanyerési tanulmánya nem kevés feladatot állított elénk: a nagyszámú vegyület dúsítását, valamint együttes, egy oldatból, egyetlen felvételbıli GC-MS mérését. 6

7 2. Rövidítések jegyzéke APCI BSA BSTFA C 18 -polimér CAR CI CE CE-MS CW DAD DAI DMESI DVB ECD µecd EI ESI FID FL FTD GC GC-MS GLC HMDS HPLC HRGC LC-MS LLE LOD LOQ MS MS/MS MSTFA MTBSTFA MBTFA MTBE NI NPD PA PDMS PFB PFBBr PI PIR RAM REACH RSD SBSE SIM SPE SPME TBA-HSO 4 TBDMSCl TBDMS TD TFE TIC TLC TMCS TMS TMSH TMSI TSD UPLC USE UV atmoszférikusnyomású kémiai ionizáció N,O-bisz(trimetilszilil)- acetamid N,O-bisz(trimetilszilil)- trifluoracetamid 18 szénatomú polimér carboxen kémiai ionizáció kapillárelektroforézis kapillárelektroforézistömegspektrometria carbowax diódasoros detektor direkt injektálás dimetiletilszilil-imidazol divinilbenzol elektronbefogásos detektor µ-elektronbefogásos detektor elektronütközéses ionizáció elektrospray ionizáció lángionizációs detektor fluoreszcencia láng-termoionos detektor gázkromatográfia gázkromatográfiatömegspektrometria gáz-folyadék kromatográfia hexametil-diszilazán nagyhatékonyságú folyadékkromatográfia nagyfelbontású gázkromatográfia folyadékkromatográfiatömegspektrometria folyadék-folyadék extrakció kimutatási határ meghatározási határ tömegspektrometria tandemtömegspektrometria N-metil-N-trimetilszililtrifluoracetamid N-metil-N-terc.- butildimetilszililtrifluoracetamid N-metilbisz(trifluoracetamid) metil-terc.-butiléter negatív ionizációs mód nitrogén-foszfor detektor poliakrilát polidimetilsziloxán pentafluor-benzil pentafluorbenzil-bromid pozitív ionizációs mód piridin korlátolt hozzáférhetıségő anyag vegyianyagok nyilvántartása, értékelése és engedélyezése relatív standard deviáció keverıbabás extrakció szelektív ion monitoring szilárdfázisú extrakció szilárdfázisú mikroextrakció tetrabutil-ammóniumhidrogénszulfát terc.-butildimetil-klórszilán terc.-butildimetilszilil termál deszorpció trifluorecetsav összion-áram vékonyréteg-kromatográfia trimetil-klórszilán trimetilszilil trimetil-szulfónium-hidroxid N-trimetilszilil-imidazol termoionos specifikus detektor ultranagyhatékonyságú folyadékkromatográfia ultrahangos extrakció ultraibolya 7

8 3. Irodalmi áttekintés Számos funkciós csoportot tartalmazó összetevı - gyógyszerek, kozmetikumok, testápoló szerek és metabolitjaik, mőanyaglágyítók, koffein - egyidejő minıségi-mennyiségi meghatározására szennyvizekben, folyóvizekben és ivóvizekben a gázkromatográfiatömegspektrometria az elınyben részesített analitikai módszer [1-3]. A gyógyszerek és maradványaik elemzéséhez a két leggyakrabban alkalmazott eljárás a gázkromatográfia-tömegspektrometria és a folyadékkromatográfia-tömegspektrometria. Ezen kromatográfiás módszereket különbözı mintaelıkészítési folyamat elız meg. A környezeti minták elıkészítése leggyakrabban off-line szilárd fázisú extrakcióval történik, melyhez más és más szorbenst (szilárd fázist) használnak; legjellemzıbb a C 18 polimér és a hidrofil-lipofil egyensúly (HLB = hydrophyl-lipophyl balance) alapján mőködı, N-vinilpirolidondivinilbenzol polimér tartalmú fecskendıtest oszlop, valamint korong formában. A mintákat kis ph értékő oldatból extrahálják [1], majd az extraktumot származékká alakítás nélkül LC- MS, vagy származékká alakítás után GC-MS eljárással mérik. 3.1 A nem szteroid típusú gyulladásgátlók A nem szteroid típusú gyulladásgátlók jellemzése Az általunk elsıként választott négy vegyület, az ibuprofen, a naproxen, a ketoprofen és a diklofenak, a nem szteroid típusú gyulladásgátló gyógyszerekhez tartozik. A nem szteroid gyulladáscsökkentık széles körben elterjedt gyógyszercsoport: csillapítják a fájdalmat, alkalmazhatók gyulladásos eredető enyhe vagy közepesen erıs fájdalommal járó ízületi gyulladások, izom és ér eredető fájdalmak kezelésére. Hatásosak fejfájás, fogfájás, szülés utáni fájdalmakban és idült operáció utáni fájdalmak csillapításánál. Ezenkívül mérsékelik a lázat és csökkentik a gyulladást kiváltó anyagok képzıdését. Az ibuprofen, a naproxen, a ketoprofen és a diklofenak szerkezeti képletei a 6. Melléklet részben láthatóak A nem szteroid típusú gyulladásgátlók származékká alakítási lehetıségei A választott vegyületek mindegyike karboxil-csoportot tartalmaz, kevéssé illékonyak, ezért minıségi-mennyiségi meghatározásuk GC-MS módszerrel elınyösen, származékká 8

9 alakítás után lehetséges. E négy vegyület meghatározását metil- [4-11], butil- [12], pentafluorbenzil-származékokként [14-18] és szilil-észterekként [13, 19-30] egyaránt javasolták. A szilil-származékok képzésére különbözı reagenseket, a legkülönbözıbb feltételek mellett alkalmazták. SPE-t követıen [19-27], két lépéses eljárást alkalmaztak a származékképzésre: elsıként MSTFA-t szobahıfokon 30 percig, második lépésként a hidroxil-csoportokat acilezték MBTFA-val 60 C hıfokon 5 percig [19-21]. MSTFA-val szobahıfokon 12 óráig sötétben kevertetve [22], szobahıfokon 35 percig, majd 60 C hıfokon 10 percig tartott a származékká alakítás [23, 24]. Az MTBSTFA-t alkalmazták 60 C hıfokon, 1 órán keresztül [25, 26], valamint 60 C hıfokon 90 percig [27]. Négy különbözı szililezı reagens hatásfokát a hımérséklet és a reakció idı függvényében modellezték [28]: a) BSTFA + 1% TMCS, 60 C és 70 C hıfok, 10 perc és 20 perc, b) MSTFA + 1% TMCS, 23 C és 60 C hıfok, 15 perc és 30 perc, c) TMSI, 23 C és 70 C, 20 perc, 30 perc és 60 perc d) TMSI:BSA:TMCS = 3:3:2 arányban, 60 C hıfok, 180 perc és 360 perc. Az a)-d) pontokban részletezett tapasztalatok szerint [28] a BSTFA + 1% TMCS elegy a legeffektívebb reagens, 70 C hıfok és 20 perc reakció idı alkalmazásakor. Ezt a reagenst piridinnel, a BSTFA:PIR = 2:1 (v/v) arányban használták. Az SPME dúsítást követı származékkészítést [29, 30] egyrészt BSTFA-val [29] (40 C, 1 óra), másrészt MTBSTFA-val (szobahıfok, 30 perc) készítették: utóbbi esetben a szorbensen (on fibre). Tudomásunk szerint a választott négy, nem szteroid típusú gyulladásgátló gyógyszer származékká alakítására ezideig a HMDS-TFE-t nem alkalmazták. Korábbi tapasztalatok alapján [31-35] a HMDS-TFE piridint tartalmazó oldatban, a szabad karbonil-csoportok oximmá alakítását követıen, elınyösen alkalmazható: a természetes mátrixok legkülönbözıbb funkciós csoportú összetevıinek egyidejő elemzésében Az ibuprofen, a naproxen, a ketoprofen és a diklofenak meghatározásának lehetıségei Az 1. Táblázat az ibuprofen, a naproxen, a ketoprofen és a diklofenak meghatározásának irodalmi elızményeit tartalmazza; rendre a mátrixokat, a vizsgált vegyületeket, a mintaelıkészítés módját és körülményeit, az alkalmazott analitikai 9

10 módszereket, a visszanyeréseket modell oldatból vagy/és szennyvízbıl és a vizsgált eredmények országok szerinti megoszlását. Az 1. Táblázat alapján elmondható, hogy: a) a vizsgálatok jelentıs részét szennyvíz [4, 5, 12, 13, 16, 17, 20, 25, 26, 29, 30, 39-41, 43, 44, 46, 48-51], nagy részét folyóvíz [4-6, 12, 20-22, 29, 39, 42-45, 47, 49-51], egy-egy ivóvíz [27, 43, 49], néhány felszín alatti víz [12, 18, 39], egy tengervíz [10], valamint egy esetben folyó üledék [28] mintákban végezték; b) a négy választott vegyület közül a vizsgálatok felében mind a négyet [4, 5, 12, 13, 17, 18, 22, 25, 26, 30, 39, 41, 43, 47, 48, 50, 51], ötödében hármat [10, 27, 28, 42, 44, 46], valamint negyedében kettıt [6, 9, 16, 20, 21, 29, 40, 45, 49] határoztak meg; c) az esetek nagy többségében mintaelıkészítésként szilárdfázisú extrakciót [4-6, 9, 10, 12, 13, 16-18, 20-22, 25-27, 29-30, 39-51], szilárd fázisú mikroextrakciót [29, 30], folyadék-folyadék extrakciót [10, 29] és mikrohullámú extrakciót [28] alkalmaztak; d) a választott vegyületeket metil- [4-6, 9, 10, 20, 47, 50], TBDMS- [13, 25-27, 30, 51], PFB- [16-18], TMS- [21, 22, 28, 29, 43, 45, 49] és butil-származékokként [12, 42], valamint származékká alakítás nélkül [39-41, 44, 46, 48] mérték; e) az elválasztásokhoz általában GC-t [4-6, 9, 10, 12, 13, 16-18, 20, 22, 25-30, 43, 45, 47, 49], ritkábban LC-t [39-41, 44, 46, 48], néhány esetben GC-t és LC-t is [21, 50, 51], valamint egy esetben LC-t és CE-t [42] alkalmaztak. A detektálást tömegdetektorral [4-6, 9, 10, 12, 13, 16-18, 20-22, 25-30, 39, 40, 42-51] és DAD-FL-el [41] készítették; f) a visszanyerések hatásfoka ng/l koncentráció tartományban az ibuprofen, a naproxen, a ketoprofen és a diklofenak eseteiben rendre %, %, % és értékek voltak; g) a méréseket elsısorban európai országokban [4, 6, 9, 10, 16-18, 20-22, 25, 26, 29, 30, 39-43, 47, 50, 51], néhányat amerikai [5, 13, 27, 28, 45, 46, 48, 49], valamint két ázsiai országban [12, 44] végezték. 10

11 1. Táblázat Az ibuprofen, a naproxen, a ketoprofen és a diklofenak meghatározásának kromatográfiás lehetıségei. Mátrix Vegyület Szennyvíz, folyó víz, tó víz Szennyvíz, folyó víz, tó víz I, N, K, D I, N, K, D Folyó víz I, D Biofilm reaktor Tenger víz I, K, D Szennyvíz, folyó víz, felszín alatti víz Mintaelıkészítés Extrakció SPE: Oasis 60mg/3mL, ph=3, v=15 ml/perc, E: 6 ml etil-acetát:aceton (50:50, v/v) SPE: Supelclean LC mg/6mL, ph=2, v=10 ml/perc, E: 3 3 ml metanol SPE: Oasis 200mg/6mL, ph=7, v=15 ml/perc, E: 5mL n-hexán, 5 ml etil-acetát, 14 ml metanol I, D SPE: LiChrolut-EN 200 mg, ph=7 I, N, K, D Szennyvíz I, N, K, D Szennyvíz I, D Soxhlet extrakció: 200 ml n-hexán:etil-acetát (6 óra), SPE: Bakerbond SDB-1, 2g, v=500 ml/perc, E: 90 ml etilacetát, 50 ml n-hexán:etil-acetát (4:1, v/v), 50 ml metanol SPE: Oasis 60mg/3mL, ph=5, v=4-6 ml/perc, E: 2 ml metanol SPE: Oasis MAX 150mg/6mL, ph=3, v=15 ml/perc E: 5 ml metanol, 10 ml metanol (2% hangyasavval) SPE: Backerbond Polar Plus C18, ph<2, v=8 ml/perc, E: 2,5 ml metanol Származékképzés Diazometán (metilszármazék) BF3/metanol (metilszármazék) Metilklórformiát (metilszármazék) TMSH (metilszármazék) Metilklórformiát (metilszármazék) TBA-HSO4 (butilszármazék) MTBSTFA +1%TBDMSCl (terc.-butildimetilszililszármazék) PFBBr+2% toluén (pentaflourbenzilszármazék) Analitikai módszer Hozzáadott mennyiség/ ng/l Visszanyerések, %: modell oldat/szennyvíz I N K D Ország Irod. GC-MS Svájc [4] GC-MS/MS 50, Kanada [5] GC-MS Németország [6] GC-MS/MS Németország [9] GC-MS Északi-tenger [10] GC-MS / 50 91/ / 83 92/ 54 Taiwan [12] GC-MS 100, Kanada [13] GC-MS Görögország [16] Szennyvíz I, N, K, D SPE: Strata-X 500mg/6mL, ph=2, v=6 ml/perc, E: 7 ml acetonitril PFBBr (pentaflourbenzil -származék) GC-MS Németország [17] 11

12 Talaj víz I, N, K, D SPE: RP-C 18 1g, ph=3, E: 4 ml aceton Szennyvíz, folyó víz, I, D [7, 19, 20] szerint Folyó víz I, D SPE: ph=2 és 7,5 [7, 19, 20] szerint Folyó víz I, N, K, D SPE: Strata-X 60mg/3mL, ph=2,6, v=1-2 ml/perc, E: 0,5 ml metanol Szennyvíz I, N, K, D SPE: Oasis 60mg/3mL, ph=2,5, v=15 ml/perc, E: 2 ml etil-acetát Szennyvíz I, N, K, D SPE: Oasis 60mg/3mL, ph=2, E: 3 ml etil-acetát Ivóvíz, felszíni víz I, N, D SPE: Oasis 60mg/3mL, ph=2, v=10 ml/perc, E: 6 ml etil-acetát:aceton (50:50, v/v) Folyó üledék I, N, K Mikrohullámú feltárás, metilén klorid:metanol (2:1, v/v) Szennyvíz, folyó víz, I, N Szennyvíz I, N, K, D Szennyvíz, folyó víz, felszín alatti víz I, N, K, D SPE: LiChrolut-EN 100mg és LiChrolut-RP-C18 250mg keveréke, ph=2, v=3 ml/perc, E: 3 ml aceton, 1 ml metanol SPME: PA 85µm, PDMS-DVB 65µm, Carbowax-DVB 65µm, ph=2 LLE: 50 ml n-hexán, ph=2 SPE: Oasis 60mg/3mL, ph=2-2,5, E: 2 ml etil-acetát, SPME: PA 85µm, CAR-PDMS 75µm, PDMS-DVB 65µm, CW-DVB 65µm, ph=2-6 SPE: Oasis 60mg/3mL, Oasis MCX 150mg/6mL, Isolute C18 500mg/3mL, Isolute ENV+ 200mg/3mL, ph=2 és 7, v=10 ml/perc E: 2 4 ml metanol PFBBr (pentaflourbenzil -származék) Diazometán (metilszármazék) Szilil-származék MSTFA (trimetilszililszármazékok) MTBSTFA (terc.-butildimetilszililszármazék) MTBSTFA (terc.-butildimetilszilil- származék) MTBSTFA (terc.-butildimetilszilil- származék) BSTFA (trimetilszililszármazék) BSTFA (trimetilszililszármazék) MTBSTFA (terc.-butildimetilszililszármazék) - GC-MS Németország [18] GC-MS, GC- MS/MS GC-MS, LC- MS/MS Németország [20] Németország [21] GC-MS 20, Szlovénia [22] GC-MS / /88 95/ / 105 Spanyolország [25] GC-MS Spanyolország [26] GC-MS Kanada [27] GC-MS USA [28] GC-MS Németország [29] GC-MS Spanyolország [30] LC- MS/MS / 99 73/ /53 81/ 89 Spanyolország [39] 12

13 Szennyvíz I, D Szennyvíz I, N, K, D Folyó víz I, N, D Szennyvíz, ivóvíz, felszíni víz Szennyvíz, folyó víz, I, N, K, D I, N, D Folyó víz I, N Szennyvíz I, N, D SPE: Strata-X 200mg/6mL, ph=3, v=10 ml/perc E: 3 2 ml metanol SPE: Oasis 60mg/3mL, ph=2 és 7, v=15 ml/perc, E: 3 1 ml etil-acetát SPE: Bondesil ODS 500mg/6mL, ph=2, v=10 ml/perc E: 2 ml metanol SPE: Oasis MCX 60mg/3mL, ph=2, v=12-15 ml/perc, E: 3 ml etil-acetát, 3 ml etil-acetát:aceton (50:50, v/v), 3 ml etil-acetát:aceton:ammónium-klorid (48:48:2,v/v/v) SPE: Oasis, ph<2, v=15 ml/perc, E: metanol:terc-butil-metil-éter (10:90, v/v) SPE: C18, SDB-CX korong, ph=2-3, v=10-15 ml/perc, E: 10 ml metanol, 10 ml aceton, 10 ml diklórmetán SPE: Oasis 500mg/6mL, ph=2, v=15 ml/perc, E: 5 ml metanol:terc-butilmetil-éter (10:90, v/v) Folyó víz I, N, K, D SPE: RP-C 18 1g/6mL, ph<3, E: 10 ml aceton Szennyvíz I, N, K, D Szennyvíz, ivóvíz, folyó víz Szennyvíz, felszíni víz Szennyvíz, folyó víz I,N I, N, K, D I, N, K, D SPE: LiChrolut 100 RP-18, 500mg/6mL, ph=2, v=20 ml/perc, E: 6 ml n-hexán, 3 ml aceton, 6 ml metanol SPE: SDB-XC Empore korong, ph<2, v=100 ml/perc, E: 50 ml metanol, 50 ml DCM, 50 ml metanol SPE: Lichrolut EN 200 mg/6ml, ph=2, v=10 ml/perc, E: 1 ml aceton, 2 ml metanol, 2 ml aceton SPE: Oasis 60mg/3mL, ph= 7, v= 10 ml/perc E: 2 4 ml metanol - HPLC-MS MTBE+ trietilamín - - Metil-kloroformiát (metil-származék) - BSTFA (trimetilszililszármazék) BF3/metanol (metilszármazék) MTBSTFA (terc.-butildimetilszililszármazék) HPLC- DAD-FL HPLC-MS, CE-MS Egyesült Királyság [40] Spanyolország [41] Ausztria [42] GC-MS Franciaország [43] MSTFA (trimetilszililszármazék) LC- MS/MS Dél-Kórea [44] GC-MS USA [45] BSTFA (trimetilszililszármazék) LC- MS/MS USA [46] GC-MS Svédország [47] LC- MS/MS Kanada [48] GC-MS USA, Kanada [49] LC-MS, HRGC- MS GC-MS, LC-MS Spanyolország [50] Spanyolország [51] Jelmagyarázat: a Rövidítések jegyzékében, Irod. = felhasznált irodalom, I = ibuprofen, N = naproxen, K = ketoprofen, D = diklofenak, E = elúció, - = nincs adat 13

14 3.2 Az epesavak Az epesavak jellemzése és biológiai szerepük szerkezete: Az epesavak az emberi epében található szterán/kolán vázas vegyületek. A kolánsav 12 COOH 3 7 A kolánsav származékok a megjelölt 3, 7, 12-es számú szénatomokon egy vagy több hidroxil- és keto-funkciós csoportot tartalmaznak. Szerkezetük a 6. Mellékletben láthatóak. Az emberi epesavak az epe karbonsav-jellegő szteroidjai. Az epében nem szabad állapotban találhatók, hanem glicinnel (glikokólsav) és taurinnal (taurokólsav) képezett peptidszerő vegyületekként. Az ember epéjében többféle epesav található, viszonylag sok kólsav, kevesebb dezoxikólsav és még kevesebb litokólsav és kenodezoxikólsav van. Az epesavakat a máj termeli a koleszterin enzimes átalakításával. Biológiai rendeltetésük az, hogy a vízben nem oldódó lipidek felszívódását és hasznosítását elısegítsék. Az epesavaknak és sóiknak egyik bizonyított hatása a zsírnemő anyagok emulgeálása, ami fizikailag lehetıvé teszi a lipáz hatékonyabb mőködését, azaz a zsírok, zsírsavakra és glicerinekre bontását. A irodalom megkülönböztet i) elsıdleges epesavakat: a kólsav és a kenodezoxikólsav, és ii) másodlagos epesavakat: a litokólsav és a dezoxikólsav (a bél baktériumflórájának termékei). Az orvostudományok területén vizsgálatokat végeztek az epesavak káros hatásának megállapítására a különbözı biológiai folyamtokban [80-82]. E vizsgálatok eredménye szerint a kenodezoxikólsav súlyosbítja/elısegíti, az urzodezoxikólsav gátolja/csökkenti az apoptózist patkány idegsejttenyészetben [80]. Az apoptózis a sejthalál egyik formája. Más kutatások eredménye, hogy az epesavak apoptózist és nekrózist (szövetelhalás) idéznek elı, ezzel károsítva a mitokondriumot [81]. Egyes kólsavak a vesesejtek károsodását idézik elı [82]. 14

15 3.2.2 Az epesavak elemzésének kromatográfiás lehetıségei Az epesavak minıségi-mennyiségi meghatározása GC-MS módszerrel az 1970-es évekig nyúlik vissza, és napjainkban is ez az elınyben részesített elválasztási technika [52-79]. A gázkromatográfiás méréseket származékká alakítási folyamat elız meg. A tanulmányok kétlépéses származékképzésrıl számolnak be: észteresítésrıl és acilezésrıl. Ez a származékképzési folyamat szerepel a javaslatok nagy többségében, kevés kivétellel [52, 69, 79]. Elsı lépés a karboxil-csoportok különbözı észterekké alakítása [53-60, 63, 65-68, 70-75]. A metilészterré alakítás diazometánnal [53-56, 60, 63, 65, 67, 68, 70-75], 5% HCl-t tartalmazó metanollal [56, 63, 65, 67, 74, 75] és acetil-klorid:metanol = 1:2 arányú elegyével; az etilészterré alakítás 5% HCl-t tartalmazó etanollal [57]; a butilészterré 50 mm HCl-t tartalmazó butanollal [58, 76]; és a benzilészterré alakítás pentafluorbenzil-bromiddal történik [59, 66]. Második lépés a hidroxilcsoportok származékká alakítása, valamilyen szililezı reagenssel [53, 55, 56, 58-60, 63-75, 77]. A szilil-származékká alakításhoz HMDS:TMCS = 2:1 elegyet [53, 55, 65, 68, 70, 72, 74, 76, 77], TMSI-t [56, 57, 64, 67], DMESI-t [56, 57, 59, 66], valamint MSTFA-t [58] és BSTFA-t [79] használtak. Az egy lépésbeni származékká alakítás során a hexafluor-izopropanolt (észteresítés) trifluorecetsav-anhidriddel (acilezés) együtt alkalmazták [52]; mást, a TMSI [69] és a BSTFA [79] alkalmazását javasolják. A minıségi-mennyiségi meghatározásokhoz egyrészt GC-MS módszert [53, 54, 57-60, 66, 67, 69-73, 75, 78, 79, 85, 86, 91], másrészt GC-FID [52, 55, 56, 61, 63-65, 68, 74, 76, 77], és néhány esetben LC-MS [61, 76, 87-90] eljárást választottak. Az epesavakat jellemzıen biológiai mátrixokban: vér (vérsavó, vérplazma), vizelet, máj, epe, széklet, vizsgálták. A mintákat eltérı elıkészítések és származékká alakítások után mérték. A 2. Táblázat az 5 leggyakrabban vizsgált szabad epesav elıkészítési és kromatográfiás mérési lehetıségeit, valamint a mátrixokat tartalmazza a közlemények országok szerinti megoszlásában. Több közleményben különbözı epesav-konjugátumokat (szulfát-, tauro-, glikokonjugátumok) [85, 87-93, 97, 98] valamint egy-egy esetben az epesavak szintézisét [61, 69, 70, 73, 78] vizsgálták. A 2. Táblázatból kitőnik, hogy: a) a mátrixok jelentıs része humán [52, 55, 57, 60, 62, 63, 66, 74-76, 86, 89, 90, 94-96, 100], kisebb része állati [54, 58, 72, 77, 79, 92, 93] eredető volt; 15

16 b) az esetek több, mint felében mintaelıkészítésként extrakciót [55, 62, 63, 66, 72, 75-77, 79, 86, 89, 90, 94-96, 100] és származékká alakítást [52, 55-60, 63, 66, 72, 74-77, 79, 86, 94, 95, 100] alkalmaztak; c) az elválasztásokhoz elsısorban GC-t [52, 54-60, 63, 66, 72, 74, 75, 77, 79, 86, 94, 95, 100], néhányszor LC-t [89, 90, 96, 99], három esetben TLC-t [62, 92, 93], egy esetben GC-t és LC-t is [76] használtak, MS [52, 54, 57-60, 66, 72, 74, 75, 79, 86, 89, 90, 10], FID [52, 55, 56, 63], UV [99] és fluorimetriás [62] detektálással; d) közel azonos számú méréseket végeztek európai [55, 58, 62, 63, 72, 75, 89, 90, 96, 99, 100], amerikai [74, 77, 79, 86, 92-95], valamint ázsiai [52, 54, 56, 57, 59, 60, 66, 76] országokban. 2. Táblázat Az 5 leggyakrabban vizsgált szabad epesav: a kólsav, a litokólsav, a kenodezoxikólsav, az urzodezoxikólsav, a dezoxikólsav kromatográfiás mérési lehetıségei. Mátrix Vegyület Mintaelıkészítés, származékká alakítás Analitikai módszer Ország Irod. Biológiai folyadék Patkány epe Humán vérsavó Standard oldat Humán májszövet Patkány máj Modell oldat Humán vérsavó Humán széklet Humán ürülék Vér, vizelet Patkány máj, epe KS, LKS, KDKS, UDKS, DKS KS, LKS, KDKS, UDKS, DKS KS, LKS, KDKS, DKS KS, LKS, KDKS, UDKS, DKS KS, LKS, KDKS, UDKS, DKS KS, LKS, KDKS, UDKS, DKS KS, LKS, KDKS, UDKS, DKS KS, ilks, idks KS, LKS, KDKS, UDKS, DKS KS, LKS, KDKS, UDKS, DKS KS, LKS, KDKS, UDKS, DKS KS, LKS, KDKS, UDKS, DKS Hexafluor-izopropanol + trifluorecetsav-anhidrid Frakcionálás: ioncserélı kromatográfia Extrakció, enzimatikus hidrolízis, metilezés, szililezés Metilészter, dimetilalkilszilil-éter (DMES, DMnPS, DMiPS) Etilészter, trimetiletilszilil-éter Pentaflourbenzil-észter, dimetiletilszilil-éter GC-FID, GC-MS GLC, GLC-MS Japán [52] Japán [54] GLC-FID Svájc [55] GC-FID Japán [56] GC-MS (SIM) Japán [57] GC-MS Franciaország [58] GC-MS Japán [59] Metilészter, trimetilszilil-éter GC-MS Japán [60] Extrakció Extrakció: dietil-éter, származékká alakítás: metilészter, TMS-éter SPE: 9 etanol, származékká alakítás: PFB-észter, DMES-éter Izobutil/metil-észter, trimetilszililéter TLC- Fluorimetria Németország [62] GLC-FID Németország [63] GC-MS Japán [66] SPE, metilészter, trimetilszilil-éter GC-MS Spanyolország [72] 16

17 Vérplazma, epe, vizelet Fekáliák Vérsavó és epe Fekete medve vérplazma Malac, ló, tehén, csirke ürülék Széklet Humán vérsavó 1.Vérplazma, vérsavó, vizelet, 2.májszövet Vizelt, patkány Vérsavó Plazma, vizelet, epe, ürülék Vérsavó Standard oldatok Vérsavó KS, KDKS, UDKS, DKS KS, LKS, KDKS, UDKS, DKS KS, LKS, KDKS, UDKS, DKS KS, LKS, KDKS, UDKS, DKS KS, LKS, KDKS, UDKS, DKS KS, LKS, KDKS, UDKS, DKS KS, LKS, KDKS, UDKS, DKS + konjug. KS, LKS, KDKS, UDKS, DKS + konjug. LKS + konjug. KS, LKS, KDKS, UDKS, DKS KS, LKS, KDKS, UDKS, DKS KS, LKS, KDKS, DKS KS, KDKS, UDKS, DKS KS, KDKS, UDKS, DKS Centrifugálás, Metilészter, TMS-éter Sil-Prep (Supelco) Liofilizálás, extrakció: dietil-éter, metilezés, szililezés Hidrolízis, extrakció: etil-acetát, n- butilészter, TMS-éter GLC-MS USA [74] GC-MS Németország [75] GLC, HPLC Japán [76] SPE, metilészter, trimetilszilil-éter GC USA [77] Liofilizálás, extrakció: kloroform:metanol 2:1=v/v, TMSszármazék (BSTFA:PIR=1:1,v/v) Soxhlet extrakció, származékképzés: n-butilészter és trimetilszilil-éter GC-MS USA [79] GC-MS USA [86] On-line extrakció (RAM-töltet) UPLC-MS Spanyolország [89] 1.Fehérjementesítés, liofilizálás, oldás, 2.extrakció, liofilizálás, oldás LC-MS Hollandia [90] Szolvolízis, hidrolízis, TLC USA SPE: C 18 aceton, n-butilészter, trimetilszilil-éter (Sil-Prep) Extrakció, n-butilészter, trimetilszililéter [92-93] GC-FID USA [94] GLC USA [95] SPE: C 18 Sep-Pak, amidated CA HPLC Portugália [96] - HPLC-UV Olaszország [99] SPE, metil-oxim, trimetilszilil-éter GC-MS Egyesült Királyság [100] Jelölések: a Rövidítések jegyzékében, 1. Táblázatban, valamint KS = kólsav, LKS = litokólsav, KDKS = kenodezoxikólsav, UDKS = urzodezoxikólsav, DKS = dezoxikólsav, DMES = dimetil-etilszilil, DMiPS = dimetil-izopropilszilil, DMnPS = dimetil-n-propilszilil, ilks = izolitokólsav, idks = izodezoxikólsav, - = nem alkalmaztak, + konjug. = és konjugátumaik 17

18 3.3 Sok összetevıt elemzı rendszerek Az elmúlt években a környezetanalitika területén az úgynevezett multiresidue, azaz sok összetevıs elemzés nagyszámú közleményben címszóként szerepel. Az irodalom áttanulmányozása után felmerül a kérdés, mit is jelent valójában a multiresidue megjelölés? Számos közleményben állítják, hogy sok összetevıs elemzésrıl van szó, jóllehet e megjelölést különbözı módon értelmezik. A környezeti vízminták szennyzıinek meghatározását két csoportba sorolhatjuk függetlenül attól, hogy a mérésekhez milyen kromatográfiás módszert használnak gázkromatográfiát [ ], folyadékkromatográfiát [1, 2, 40-42, , ], vagy kapillárelektroforézist [42], (beleértve 2 összefoglalót is [132, 133]): úgy mint 1) a növényvédı szerek meghatározására, valamint, 2) az eltérı eredető környezeti szennyezık különbözı csoportjainak meghatározására javasolt eljárások, beleértve a növényvédı szereket is A növényvédı szerek meghatározásának analitikai lehetıségei SPE-t követı GC-MS analitikai módszert javasoltak 5-féle tartósító szer azonosítására és mérésére tengervízben [112] és 24 növényvédı szer meghatározására forrásvízben és ivóvízben [114]. SPE-GC- ECD/NPD eljárással mértek 24 eltérı polaritású növényvédı szert vörösborban [113]. 17 növényvédı szer elemzését felszíni és ivóvízben SPME-GC-ECD/TSD eljárással [115], 23 növényvédı szer mérését folyóvízben SPME-GC-MS/FID [116], valamint 35 növényvédı szer meghatározását tehéntejben SPME-GC-µECD [120] csatolt technikákkal követték. Sok összetevıs elemzésnek nevezik az eltérı számú növényvédı szerek minıségimennyiségi meghatározását eltérı detektálási technikával [ , 126]. 22 vegyületet folyóvízben SPE-LC-UV-DAD és/vagy SPE-LC-APCI-MS, PI és NI módban [122], 12 semleges jellegő növényvédı szert különbözı víz mintákban SPE-LC-ESI-MS [123], 4 rovarölı szert ivóvízben SPE-LC-ESI-MS [124] és 7 növényvédı szert ivóvízben és a Carlo Alberto-csatorna vizében SPE-HPLC-UV/MS [126] módszerrel mérték. 18

19 3.3.2 Az eltérı eredető környezeti szennyezık különbözı csoportjainak meghatározására javasolt eljárások, beleértve a növényvédı szereket is Az ide tartozó közlemények sorából meggyızıdésünk szerint sok összetevıs elemzésrıl beszélünk abban az esetben, ha az elemzés egyetlen injektálásból történik. Ezek az eljárások mind GC [ , 127], mind LC [40-42, 121, 125, ] elválasztásokon alapulnak. Az SBSE-GC-MS módszert korlátozott sikerrel alkalmazták [ ]. 35 kevéssé illékony növényvédı szer és poliaromás szénhidrogén minıségi-mennyiségi elemzését optimálták [117] és validálták [118] vízmintákban. A módszer korlátait jelzi, hogy a keresett 35 vegyületbıl mindössze 6-ot találtak, jóllehet látványos LOQ mutatókkal (MS: full-scan üzemmódban, LOQ = 0,1-36 ng/l). 46 savas jellegő, poláros szennyezıanyag TBDMS-származékoká alakítását az injektorban, elemzését SBSE-GC-MS módszerrel, nagytérfogatú injektálással tanulmányozták [119] többféle víz mintában (folyóvíz, csapvíz, forrásvíz, szennyvíz). A 37 szennyezıanyag meghatározására optimált eljárással mindösszesen 15 szennyezıanyagot mértek kezelés nélküli szennyvízben. Két módszert párhuzamosan, SPE-HLPC-MS-t és SPE-CE-MS-t javasoltak 9 gyógyszermaradvány meghatározására [42] folyó víz mintákban. Jóllehet a CE-MS módszer kimutatási határa µg/l, a HPLC-MS módszeré 4,8-19 ng/l-nek bizonyult, mindkét azonosítási eljárással 4-4 gyógyszermaradványt mértek. Spanyol [40] és angol kutatók [121] SPE-HPLC-ESI-MS/MS módszerrel többféle gyógyszermaradvány minıségét/mennyiségét mérték szennyvizekben (befolyó/elfolyó), felszíni vízben, felszín alatti vízben és folyó vizekben. A kimutatási határ mindkét esetben nagy volt ([40]: LOD = ng/l; [121]: LOD = 0,017-1,25 µg/l). Sok összetevı mérését javasolták 27 gyógyszermaradvány [125], 5 növényvédı szer, 1 gyomirtó szer és 1 gombaölı szer [126], valamint 33 különbözı tulajdonságú szennyezıanyag [127] elemzésére. A meghatározásokhoz egyrészt SPE-LC-MS/MS [ ] technikát, majd SPE- GC-MS [125, 127] és SPE-HPLC-UV [126] módszereket alkalmaztak. Egy svéd Szennyvíztisztító Telep kifolyó szennyvizében a GC-MS technika nagy érzékenységének köszönhetıen 27 szennyezıanyagot mértek metilezett származékként és származékkészítés nélkül együttesen, 0,01-7,97 ng/l koncentráció tartományban, 2 különbözı oldatból [125]. 5 növényvédı szer, 1 gyomirtó szer és 1 gombaölı szer minıségi-mennyiségi elemzésére, felszíni vízben HPLC-UV-t és HPLC- MS/MS-t alkalmaztak [126]. 80 % feletti visszanyerési értékeket, valamint, a két különbözı detektálással hasonló LOQ értékeket mértek (UV: 48,3 ng/l, MS/MS: 26,9 ng/l) [126]. A REACH-rendszer 33 kiemelten veszélyes szennyezıit egy ugyanazon SPE extraktumból, két különbözı eljárással, LC-MS/MS-sel és GC-MS-sel [127] mértek. A két módszerrel összesen 12 19

20 különbözı vízmintát: 5 befolyó szennyvizet, 2 elfolyó szennyvizet, 3 talajvizet és 2 felszíni vizet [127] vizsgáltak. 8 szennyezıt, GC-MS módszerrel, 0, µg/l koncentráció tartományban határoztak meg. A további 25 szennyzıanyagot: 9 vegyületet 2 mintában, 4 vegyületet egy-egy mintában rendre 2,2 ng/l-13,2 µg/l, valamint, 0,063-9,6 µg/l koncentráció tartományokban, LC- MS-sel mértek. 2 vegyületet csak detektáltak mind a 12 mintában, 5 vegyületet a minták felében detektáltak és 3 vegyületet egyik vízmintában sem találtak. A közelmúltban megjelent [ ] közlemények ugyanazon laboratóriumból egy új technika, az UPLC-ESI-MS/MS felhasználásával készültek. Ezen új technikát folyamatosan bázisos/semleges gyógyszerek és tiltott szerek meghatározására bıvítették. A dúsítást Oasis szorbenssel készítették. Elıször 25 különbözı bázisos/semleges gyógyszer és tiltott szer [128], majd 25 savas/semleges gyógyszer és testápoló szer elemzését felszíni vízben [129] írták le, ESI + detektálást alkalmazva mindkét esetben. Késıbb a módszert 56 vegyület (gyógyszer, testápoló szer, tiltott szer) meghatározására bıvítették [130, 131]. Az elemzést ugyanazon SPE extraktumból, párhuzamosan ESI + (1mód) és ESI - (2mód) módban követték. Az UPLC-MS/MS technika látványos elınyei az 1mm átmérıjő oszlopba töltött 1,7 µm részecskemérető etilsziloxán/szilika hibrid részecskéknek köszönhetı. A módszer LOQ eredményei felszíni víz esetében a tized ng/l és a 10 ng/l, szennyvíz esetében az 1 ng/l és a néhány 100 ng/l koncentráció tartományokban változtak. A sok összetevıjő rendszernek minısített irodalmi eljárások részletezését: a módszer mátrixait, a vegyületek számát, a mintaelıkészítést, az analitikai módszereket LOD és LOQ értékekkel, a mért koncentráció tartományokat, a visszanyerések hatásfokát és a közlemények országok szerinti megoszlását a 3. Táblázat tartalmazza. A táblázat alapján elmondható, hogy: a) a szennyezıket elsısorban felszíni vizekben és talajvizekben (beleértve a forrásvizet és a csapvizet is) [18, 40, 42, 43, 101, 112, 114, , , , 130, 131, 135, 139, 145], valamint szennyvizekben [16, 41, 43, 119, 121, 125, ], néhány ivóvízben [43, 101, 114, 123, 124], és tehéntejben [120] mérték, b) a vizsgálatok fele gyógyszermaradványokra [16, 18, 40-43, 101, 121, 125, 135, 139, ], fele növényvédı szerekre [112, 114, 116, 120, , 126, 135] és egyéb szennyezıkre [ , 125, 127, 128, 130, 131, 139, 140, 145] irányult, c) a mintaelıkészítéshez nagy részt SPE-t [16, 18, 40-43, 101, 112, 114, , 130, 131, 135, ], három esetben SBSE-t [ ], két esetben SPME-t [116, 120], három esetben származékképzést [40, 119, 139] is alkalmaztak, d) a méréseket általában GC-vel [16, 112, 114, , 139, 143, 145], vagy LC-vel [40, 41, , 126, 127, 130, 131, 135, 141, 142, 144], esetleg mindkettıvel [18, 101, 125, 127, 140], 20

21 valamint LC-vel és CE-vel [42] végezték, a detektálásokhoz fıként MS-t és/vagy MS/MS-t [16, 18, 40, 42, 101, 112, 114, , , 130, 131, 135, ], egyszer-egyszer FTD-t [116], ECD-t [120], UV-t [122, 126], DAD-t [41, 122], FL-t [41] használtak, e) az LOD és LOQ értékek módszertıl függıen változtak (LOD: 0, ng/l, LOQ: 0, ng/l), f) a vegyületeket a különbözı mátrixokban 0,2 ng/l-tıl 83,2 µg/l-ig terjedı koncentráció tartományban mérték, 5% és 163% közötti visszanyerésekkel, g) az elemzések jelentıs részét európai [16, 18, 40-42, 101, 112, 114, , 130, 131, 135, 141, ] és néhányat amerikai [139, 140, 142] országokban végezték. 3.4 A mőveleti üres használatának irodalmi áttekintése A környezeti vízminták elemzése során kevés a mőveleti üresekre vonatkozó irodalmi tapasztalat [ ], a jelzettek közül kettıben [135, 136] nincs szó mőveleti üres mérésekrıl. Stoob és munkatársai [137, 138] az analitikában általános érvényő keresztszennyezıdésre hívják fel a figyelmet, s a megoldást a rutin szerő mosó/tisztító folyamatokban látják. Az elsı számszerő értéket 2004-ben a Németországi Lippe folyó szennyezésével [139] kapcsolatban írták le: a ftalátok, a szkvalán és az n-karbonsavak együttes mennyisége legfeljebb 25 ng/l-nek bizonyult. A szennyezıdés eredetérıl nincs adat. Egy, a földigilisztákban felhalmozódó belsı elválasztású mirigyeket károsító szerek elemzésekor [140] a mőveleti üres mérésekben ftalátokat és biszfenol-a-t találtak. E szennyezıkrıl úgy vélik, hogy az extrakció folyamatából származnak [140]. A mőveleti üres minták szennyezıit számszerő adatokkal is jellemezték [141, 142]. Gibson és munkatársai [141] gyógyszerek maradványainak meghatározását végezték szennyvízben és forrásvíz mintákban GC-MS módszerrel. Feltételezéseik szerint a mőveleti üres mintákban mért szennyezıanyagok a nonilfenolok (3,7 ng/l) és a ftalátok (dietilhexil-ftalát 14,5 ng/l, butilbenzilftalát 0,6 ng/l) voltak, amelyek az oldószerekbıl és a SPE fecskendıtest oszlopok anyagából származnak. Trenholm és társai [142] háztartási vegyszerek elemzését GC-MS/MS és LC-MS/MS módszerekkel végezték. A szerzık valamennyi mintában dibutil-ftalátot mértek 130 ng/l mennyiségben. További szennyezıanyagok voltak: N,N-dietil-m-toluamid 0,27 ng/l, oxibenzon 1,3 ng/l, propilparabén 0,29 ng/l, izobutilparabén 0,22 ng/l, 3,4,4 -triklórdifenil-karbamid 0,17 ng/l és triklozán 1,6 ng/l koncentráció tartományban. 21

22 3. Táblázat Sok összetvıt elemzı rendszerek alkalmazása különbözı környezeti vízminták szennyezıinek elemzésére. Mátrix Vegyületek száma Mintaelıkészítés Analitikai módszer LOQ/LOD Mért koncentráció tartomány Visszanyerés, % Ország Irod. Ivóvíz, 16 terápiás folyóvíz, folyó üledék # gyógyszer SPE (Lichrolut EN, Oasis MCX) HPLC-MS/MS, GC-MS/MS LOD: 0,02-4,30 ng/l, LOD # : 0,5-375 ng/kg 0,4-241,9 ng/l, ng/kg # >70 Olaszország [101] Tenger víz Nyersviz, kezelt víz, talajvíz Folyóvíz Talajvíz, csapvíz, felszíni víz Folyóvíz, csapvíz, forrásvíz, szennyvíz Tehéntej 5 növényvédı szer 22 növényvédı szer 23 gyomirtó-, rovarölı-, gombaölı szer 35 félillékony vegyület 46 szerves szennyzı 35 növényvédı szer Folyóvíz 8 gyógyszer Elfolyó szennvíz, felszíni víz 13 gyógyszer SPE (Oasis HLB, 200mg/6mL) SPE (Bakerbond spe, 200mg/6mL) SPME (PDMS, 100µm), SPE (C18 korong) GC-MS (EI, CI) LOD: 0,5-3,0 ng/l ng/l Spanyolország [112] GC-MS (EI) LOD: 5-60 ng/l ng/l Spanyolország [114] GC-MS, GC-FTD SBSE (PDMS) TD-GC-MS SBSE (PDMS), LD (etil-acetát), származékká alakítás (MTBSTFA) SPME (PDMS, PDMS-DVB, PA, CAR-PDMS, CW- DVB, µm ) SPE (Bondesil ODS, 500mg/6mL) SPE (Strata-X, 200mg/6mL, Bond Elut C18 LOD: 3-80 ng/l ng/l Görögország [116] LOQ: 0,1-36 ng/l, LOD: 0,04-10,7 ng/l - - Spanyolország [117, 118] GC-MS (EI) LOD: ng/l ng/l Spanyolország [119] GC-µECD HPLC-MS, CE-MS HPLC- MS/MS (ESI) LOQ: ng/l, LOD: ng/l LOD b : 0,05-20 µg/l, LOD d : µg/l Spanyolország [120] 1,6-392,1 ng/l ~60 Ausztria [42] LOQ: ng/l < ng/l 0, Egyesült Királyság [40] 22

23 Szennyvíz 8 gyógyszer SPE (Isolute C18, 500mg/3mL) LC-MS/MS (ESI) LOD: ng/l Spanyolország [121] Folyóvíz 22 növényvédı szer SPE (ENVI-Chom-P, 250mg) LC-UV/DAD, LC-MS (APCI) LOD a : ng/l, LOD b : 6-15 ng/l ng/l Franciaország [122] Ivóvíz, felszíni víz 12 növényvédı szer Szennyvíz 6 gyógyszer Ivóvíz 4 rovarölıszer Folyóvíz, szennyvíz Felszíni víz 31 gyógyszer és egyéb szennyezıanyag 7 növényvédı szer Vízminták 33 vegyület Felszíni víz 56 szennyezıanyag Talajvíz 60 gyógyszer SPE (LC mg/3mL, Oasis HLB, 200mg/6mL, Bond-Elut, 500mg/3mL) SPE (Oasis HLB, 60mg/3mL) SPE (LiChrolut EN, 200mg) SPE (RP-C18, 1g/6mL) SPE (Strata RP-18 E, Strata-X, LiChrolut EN) SPE (Strata C-18, 200mg/3mL) SPE (Oasis MCX) SPE (RP-C18, 1g, Bond Elut, 200mg, LiChrolut EN, 200mg, Isolut ENV+, 100mg) HPLC-MS (ESI) HPLC-DAD- FL LOD: 0,5-3,0 ng/l LOQ: ng/l, LOD: ng/l Portugalia, Belgium [123] 0, µg/l Spanyolország [41] LC-MS (ESI) LOD: ng/l <100 ng/l Olaszország [124] GC-MS (EI), LC-MS/MS (ESI + ) HPLC-UV, HPLC-MS (ESI) LC-MS/MS, GC-MS UPLC- MS/MS (ESI) GC-MS, HPLC- MS/MS (ESI) Szennyvíz 5 gyógyszer SPE (Bakerbond C18) GC-MS Tó víz 28 antibiotikum, növényvédı szer online SPE (Oasis HLB) LC-MS/MS (ESI) - LOQ a : 31,2-48,3 µg/l, LOD a : 9,4-14,5 µg/l, LOQ b : 16,7-26,9 µg/l, LOD b : 5-8,1 µg/l LOD b : 7,5-220 ng/l, LOD c : 0,2-88,9 ng/l LOQ: 0,15-60 ng/l, LOD: 0,05-20 ng/l 0,001-7,97 µg/l, 0,02-41 µg/l Svédország [125] Olaszország [126] 0, µg/l Franciaország [127] ng/l Egyesült Királyság [128, 130, 131] LOD: 1,8-13 ng/l ng/l Németország [18] LOQ: 1,6-990 ng/l, LOD: 0,6-340 ng/l ng/l Görögország [16] LOD: 0,5-5 ng/l Svájc [135] 23

24 Szennyvíz, forrás víz Szennyvíz Szennyvíz, felszíni víz, ivóvíz 17 gyógyszer és egyéb szennyzıanyag 28 háztartási vegyszer 17 gyógyszer Szennyvíz 20 gyógyszer Szennyvíz 20 gyógyszer Szennyvíz 10 gyógyszer Szennyvíz 8 gyógyszer Folyóvíz, talajvíz 24 illékony szerves szennyzı SPE (Oasis HLB, 200mg), származékká alakítás (BSTFA, MTBSTFA) SPE (Oasis HLB, 200mg) SPE (HLB, C18, MCX), származékká alakítás (MSTFA) SPE (Strata-X, 200mg/6mL) SPE (Oasis HLB, 500mg/6mL), USE SPE(Oasis HLB, 200mg/6mL) SPE (Oasis HLB, 200mg/6mL) GC-MS (EI) LOD: 0,5-100 ng/l LC-MS/MS, GC-MS/MS 0, µg/l, 0,01-25 ng/l Mexikó [139] - 0, ng/l USA [140] GC-MS LOD: 0,1-28,6 ng/l 0, ng/l Franciaország [43] LC-MS/MS (ESI) LC-MS/MS (ESI) GC-MS/MS (EI) HPLC-MS LOQ: ng/l, LOD: ng/l 0,002-9,17 µg/l - Írország [141] LOD: 0, ng/l 0,002-56,9 µg/l USA [142] LOQ: 0,7-401ng/L, LOD: 0,2,-120 ng/l LOQ: 0,6-22 ng/l, LOD: 0,2-6,5 ng/l ng/l Spanyolország [143] ng/l Spanyolország [144] - DAI-GC-MS LOD: ng/l Svájc [145] Jelölések: a Rövidítések jegyzékében, 1. Táblázat, # = folyó üledékre vonatkozik, a = HPLC-UV és/vagy LC-UV módszerre vonatkozik, b = HPLC-MS és/vagy LC-MS és/vagy LC-MS/MS módszerre vonatkozik, c = GC-MS és/vagy GC-MS/MS módszerre vonatkozik, d = CE-MS módszerre vonatkozik 24

25 4. Kísérleti rész 4.1 A kémszerek A felhasznált anyagok és reagensek mindegyike analitikai tisztaságú volt. A hidroxilamin-hidrokloridot, az etil-acetátot, a HCl-t a Reanaltól (Budapest, Magyarország) vásároltuk. Az n-hexán, a metanol, a piridin, a hexametil-diszilazán, az N,O-bisz(trimetilszilil)- trifluoracetamid, az N-metil-N-(trimetilszilil)-trifluoracetamid, az N-metil-N-terc.- butildimetilszilil-trifluoracetamid, a trifluorecetsav, a benzoesav, a fenilecetsav, a (±)-3- fenilpropionsav, a dimetil-ftalát, a kaprinsav, a 4-hidroxi-metilbenzoát, a szalicilsav, a fahéjsav, a 2,4-diterc.-butilfenol, a 3-hidroxi-benzoesav, a 4-hidroxi-etilbenzoát, a klofibrinsav, a dietil-ftalát, az ibuprofen, a 4-hidroxi-benzoesav, a 4-hidroxifenil-ecetsav, a laurinsav, a ftálsav, a paracetamol, a tereftálsav, a 2,5-dihidroxi-benzoesav, a 3-(4- hidroxifenil)-propionsav, a vaníliasav, az azelainsav, a mirisztinsav, a koffein, a gemfibrozil, a β-indolecetsav, dibutil-ftalát, a fenoprofen kalcium sóhidrát, a palmitolajsav, a palmitinsav, a (±)-metoprolol (+)-tartarát só, a ferulasav, a naproxen, a kávésav, a (±)- propranolol hidroklorid, a linolénsav, az olajsav, a ketoprofen, a sztearinsav, a diklofenak nátrium só, a szebacinsav, a karbamezapin, az arahidinsav, a fenofibrát, a metotrimeprazin, a dioktil-ftalát, az ösztron, a β-ösztradiol, a koleszterin, a kólsav, a litokólsav, a kenodezoxikólsav, az urzodezoxikólsav, a 7-ketolitokólsav, a dehidrokólsav a Sigma (St. Louis, MO, USA) termékei voltak. 4.2 A minták A szennyvíz minták: a befolyó és az elfolyó szennyvíz minták, 24 órás mintavételbıl, a Fıvárosi Csatornázási Mővek, Észak-Pesti Szennyvíztisztító Telepérıl származtak. A Duna víz minták: 1) a Csepel sziget mellıl (a továbbiakban Dunavíz 1), 2) a Szentendrei sziget mellıl (a továbbiakban Dunavíz 2), 3) az ELTE-TTK épülete elıl (a továbbiakban Dunavíz 3), 4) a Csepeli Vízmő mellıl (a továbbiakban Dunavíz 4), 5) az épülı új szennyvíztisztító közelébıl (a továbbiakban Dunavíz 5), valamennyi Budapest térségébıl származott. 25

26 4.3 Az eszközök Mintaelıkészítés: A minták szőrésénél üvegszőrıpapírt GF/A, d = 125mm (Whatman Maidstone, UK), a szilárd fázisú extrakcióhoz 12 mintafeltétes vákuumkádat (Supelco, Bellefonte, PA, USA), különbözı szorbenst tartalmazó fecskendıtest oszlopokat használtunk: Oasis HLB 200mg/6mL, Oasis HLB 500mg/6mL, Oasis MAX 60mg/3mL és Oasis MCX 60mg/3mL (Waters, Milford, MA, USA), Strata-X 200mg/6ml (Phenomenex, Torrance, CA, USA), DSC mg/6mL és ENVI ChromP 200mg/6mL (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA). A minták oldószermentesítése Büchi Rotavapor R-200 (Flawil, Switzerland) készüléken, Büchi vákuumpumpa V-700 segítségével, a származékká alakítás termosztálható, a kémcsövekkel/reakciócsövekkel egyezı mérető fémbetétő kályhákban (Kutesz, Magyarország) történt. Gázkromatográfia-tömegspekrometria: A méréseket a 4000 GC-MS/MS jelő, Varian gyártmányú (Walnut Creek, CA, USA) készüléken végeztük, amely ioncsapda rendszerő tömegszelektív detektorral, automata mintaadagolóval és szeptummal ellátott programozható injektorral rendelkezik. Az elválasztásokat SGE BPX5 (30 m 0,25 mm, 0,25 µm filmvastagságú) kromatográfiás oszlopon végeztük. A vivıgáz hélium volt (1 ml/perc). A transfer line hıfoka 280 C, az ioncsapda hıfoka 210 C, a manifold hıfoka 80 C, az ionizációs feszültség 70 ev volt. A GC paraméterei (az injektor és a kolonna főtési programjai) a 4. Táblázatban láthatóak. Az ioncsapda detektor optimális mérési paramétereit a készülék-szoftver (Varian MS Workstation software, version 6.5.) segítségével ellenıriztük, a tömegtartomány: amu, Fil/Mul késleltetés: 306 sec volt. A tömegspektrométer adatfelvételi sebessége 0,54 sec/scan és 0,67 sec/scan volt. 26

27 4. Táblázat Az injektor és a kromatográfiás oszlop hımérsékletprogramjai 1. Program Injektor Idı/perc 0,10 0,60 1,70 2. Program Injektor Idı/perc 0,10 0,85 3,00 3. Program Injektor Idı/perc 0,50 0,85 3,00 4. Program Injektor Idı/perc 0,50 0,85 3,00 C C C C C/perc 0, ,0 C/perc 0, ,0 C/perc 0, ,0 C/perc 0, ,0 Oszlop Idı/perc C 1, , , Elemzési idı: 23,5 perc Oszlop Idı/perc C 1, , , Elemzési idı: 16,5 perc Oszlop Idı/perc C 1, , ,0 300 Elemzési idı: 31 perc Oszlop Idı/perc C 1, , ,0 300 Elemzési idı: 21 perc C/perc 0,0 10,0 0,0 C/perc 0,0 20,0 0,0 C/perc 0,0 10,0 0,0 C/perc 0,0 20,0 0,0 4.4 A módszerek A reagens oldatok Oximmá alakítás reagense: A 2,5% hidroxilamin-hidroklorid oldatot 1,25 g hidroxilaminhidroklorid 50 ml piridinben való oldásával készítettük. Szilil-származékká alakítás reagensei: A HMDS, a BSTFA, az MSTFA, az MTBSTFA és a TFE analitikai tisztaságú vegyszereket további tisztítás nélkül használtuk. 27

28 4.4.2 A modell oldatok A modell vegyületek mg/100 ml bemérése analitikai pontossággal, feloldása etanolban, desztillált vízben, valamint desztillált víz:etanol = 1:1 (v/v) arányú elegyében történt. A ftalátok feloldásához diklórmetánt használtunk. Az 56 modell vegyületbıl közös törzsoldatot készítettünk, az eredetihez képest 50-szeres hígítást. Az így készített oldatok µl-ét vákuumlepárló készülékhez csatlakoztatható, teflonnal fedett, csavarmenettel ellátott reakciócsövekbe (szükség szerint 2 és 4 ml térfogatúak) mértük, és C hıfokú vízfürdıbıl, vákuumlepárló készüléken szárazra pároltuk A származékká alakítás Szilil-származékokká Az elızı pontban leírt módon elıkészített, lepárolt modell vegyületek maradékát négy féle reagenssel reagáltattuk: a) 125 µl piridinben oldottuk, majd 225 µl HMDS és 25 µl TFE adtunk hozzá, b) 150 µl piridinben oldottuk, majd 150 µl BSTFA adtunk hozzá, c) 150 µl piridinben oldottuk, majd 150 µl MSTFA adtunk hozzá, d) 150 µl piridinben oldottuk, majd 150 µl MTBSTFA adtunk hozzá, 60, 70, 80 C hıfokon 30, 60, 90, 120 percen keresztül szilileztük. Az oldatokat szobahıfokra hőtés után, eltérı hígításokban 1 µl-eket injektáltunk egymást követıen 3-5-ször Oximmá és szilil-származékokká A fentebb említett módon lepárolt modell vegyületek maradékát a) 125 µl 2,5% hidroxilamin-hidrokloridot tartalmazó piridinben oldottuk, 70 C és 100 C hıfokon 30, 60, 90, 120 percen keresztül oximáltuk, b) majd 225 µl HMDS és 25 µl TFE reagens hozzáadása után 70 C és 100 C hıfokon 60, 90, 120 percen keresztül szilileztük A miták elıkészítése A szennyvíz minták elıkészítése az alábbi pontok szerint történt: 1. a befolyó és az elfolyó szennyvizeket üvegszőrı papíron szőrtük (1. Kép), majd homogenizáltuk. 28

29 2. Az 500 ml és 1000 ml térfogatú minták ph értékét 1M HCl oldattal ph = 2, ph = 4, és ph = 7-re változtattuk (2. Kép), minden mintából 3-3 párhuzamos mérést készítettünk. 3. A szilárd fázisú extrakció alkalmazásánál, a fecskendıtest oszlopok (Oasis HLB 200mg/6mL, Oasis HLB 500mg/6mL, Oasis MAX 60mg/3mL és Oasis MCX 60mg/3mL, Strata-X 200mg/6ml, DSC mg/6mL, ENVI ChromP 200mg/6mL) elıkészítéséhez: a) 5 ml n-hexánt, 5 ml etil-acetátot, 10 ml metanolt és 10 ml desztillált vizet, vagy b) 4 ml aceton:etil-acetát (50:50, v/v) elegyét, 4 ml metanolt és 6 ml desztillált vizet használtunk. 4. A szennyvízmintákat vákuumkád használatával, 4 ml/perc, 10 ml/perc és 14 ml/perc átfolyási sebességekkel a töltetekre felvittük (3. Kép), majd a szorbenseket vákuum segítségével szárítottuk. 5. A megkötött vegyületeket: c) 5 ml n-hexán, 5 ml etil-acetát és 14 ml metanol, vagy d) 15 ml aceton:etil-acetát (50:50, v/v) elegyével oldottuk le (4. Kép). Az a) és b) pont szerinti elıkészítés után rendre a c) és d) pont szerinti leoldásokat használtuk. 6. Az extraktumokat lépcsızetesen: vegyifülkében (5. és 6. Kép), majd az oldott levegı eltávolítása (7. Kép) után, C hıfokú vízfürdıbıl vákuumlepárló készüléken szárazra pároltuk (8. Kép). 7. Az oldószer mentesített minták vegyületeit származékokká alakítottuk a részben leírtak szerint (9. Kép). 8. A trimetilszilil (oxim) éter/észter származékokat GC-MS módszerrel mértük (10. Kép). 1. Kép 2. Kép 29

30 3. Kép 4. Kép 5. Kép 6. Kép 8. Kép 7. Kép 30

31 9. Kép 10. Kép A Duna-víz minták: A Duna-víz minták feldolgozásakor mindenben a pont szerint jártunk el, azzal a különbséggel, hogy az 1 és 3 L-nyi mennyiségeket az a) pont szerinti elıkészítés után, a c) pont szerint oldottuk le. 31

32 5. Kísérleti eredmények értékelése 5.1 Alapkutatás A nem szteroid típusú gyulladásgátló gyógyszerek tanulmánya A származékká alakítás optimálása és a származékok fragmentum-analitikai tanulmánya Magyarországon, mint szerte a világon, gyakran használt fájdalomcsillapító és gyulladásgátló gyógyszerek az ibuprofen, a naproxen, a ketoprofen és a diklofenak. Ezért elsı lépésként e vegyületek származékká alakítását optimáltuk. Az ibuprofen, a naproxen, a ketoprofen és a diklofenak szilil-származékká alakítására az irodalomban különbözı adatokat találtunk. Következésképp célszerőnek tőnt a 4 leggyakrabban használt szililezı reagens (a BSTFA, az MSTFA, a HMDS-TFE, az MTBSTFA) hatásfokát eltérı hıfokok (60, 70, 80 C) és különbözı reakció idık (30, 60, 90, 120 perc) után összehasonlítani. A 5. Táblázatban az eltérı reakció körülmények között nyert válaszjeleket foglaltuk össze. Mint kitőnik, az értékelések a származékok szelektív fragmetum ionjai alapján történt, amelyek a következık: a) az ibuprofen-tms: m/z = 278 = [M], m/z = 263 = [M-CH 3 ] +, m/z = 234 = [M-COO] +, m/z = 160 = [M-TMSCOOH] + (1. Ábra, 1B spektrum), b) a naproxen-tms: m/z = 302 = [M], m/z = 287 = [M-CH 3 ] +, m/z = 243 = [M- (COO+CH 3 )] +, m/z = 185 = [M-TMSCOO] + (1. Ábra, 2B spektrum), c) a ketoprofen-tms: m/z = 326 = [M], m/z = 311 = [M-CH 3 ] +, m/z = 282 = [M-COO] +, m/z = 267 = [M-(COO+CH 3 )] + (1. Ábra, 3B spektrum), d) a diklofenak-tms: m/z = 368 = [M], m/z = 277 = [M-TMSOH 2 ] +, m/z = 242 = [M- (TMSOH+HCl)] +, m/z = 214 = [M-(TMSCOOH+HCl)] + (1. Ábra, 4B spektrum). 32

33 5. Táblázat Az ibuprofen-, a naproxen-, a ketoprofen- és a diklofenak-tms származékainak különbözı reagensekkel, eltérı körülmények (70 C hıfok, 30, 60, 90, 120 perc) között nyert válaszjelei, szelektív fragmentum ionjaik (ibuprofen-tms: m/z = 278 = [M], m/z = 263 = [M- CH 3 ] +, m/z = 234 = [M-COO] +, m/z = 160 = [M-TMSCOOH] + ; naproxen-tms: m/z = 302 = [M], m/z = 287 = [M-CH 3 ] +, m/z = 243 = [M-(COO+CH 3 )] +, m/z = 185 = [M-TMSCOO] + ; ketoprofen-tms: m/z = 326 = [M], m/z = 311 = [M-CH 3 ] +, m/z = 282 = [M-COO] +, m/z = 267 = [M-(COO+CH 3 )] + ; diklofenak-tms: m/z = 368 = [M], m/z = 277 = [M-TMSOH 2 ] +, m/z = 242 = [M-(TMSOH+HCl)] +, m/z = 214 = [M-(TMSCOOH+HCl)] + ) alapján értékelve, GC-MS módszerrel mérve. 70 C Integrátor egység/pg (RSD%) Reagens HMDS-TFE BSTFA MSTFA Reakció idı, perc Ibuprofen Naproxen Ketoprofen Diklofenak Injektált pg (3,13) 4823 (2,53) 756 (5,3) 2703 (9,3) (1,49) 4944 (3,53) 807 (2,41) 4171 (5,1) (1,67) 5098 (4,34) 781 (3,67) 3853 (5,9) (2,25) 4823 (4,62) 781 (5,0) 3980 (6,8) (2,12) 5020 (1,85) 770 (1,50) 4045 (0,41) (1,24) 4823 (1,13) 816 (2,73) 4012 (2,62) (1,44) 4862 (3,84) 795 (7,6) 3821 (4,37) (1,93) 4902 (0,82) 812 (1,80) 3566 (5,3) (0,77) 4352 (11) 922 (2,70) 4713 (1,40) (1,92) 5294 (1,58) 830 (4,11) 4426 (0,55) (2,39) 5176 (0,68) 798 (1,23) 4333 (1,68) (2,43) 4823 (5,1) 765 (4,94) 3566 (12) Átlag 2837 (1,78) 4963 (3,30) 798 (2,54) 4080 (5,3) Jelölések: mint Rövidítések jegyzéke Az eredmények összehasonlítása után elmondható, hogy a) a 3 különbözı szililezı reagens mindegyike, azonos körülmények között, azonos trimetilszilil-származékot képez a modell vegyületeinkkel, b) a reakció idı 90 percre növelése jelentıs változást a válaszjelekben nem hozott egyik vegyület esetében sem, c) a 70 C hıfokon, 30 perc elteltével még nem kvantitatív a származékká alakítás, 60 perc és 120 perc reakció idı között már kvantitatív a reakció. Figyelembe véve, hogy célkitőzéseink között szerepelt egy sok összetevıjő elemzı rendszer kialakítása, a származékképzés optimális körülményeinek a 70 C hıfok és 90 perc reakció idı bizonyult. Származékképzési tanulmányunkat az MTBSTFA származékképzı reagenssel bıvítettük, amellyel a modell vegyületek terc.-butil-dimetilszilil-származékokat képeznek. 33

34 A származékká alakítás 70 C hıfokon, 4 különbözı (30, 60, 90 és 120 perc) reakció idı alkalmazásával történt. A mérések eredményei a 6. Táblázatban láthatóak, a válaszjelek a vegyületek terc.-butil-dimetilszilil-származékaira vonatkoznak, értékelésük a származékok szelektív fragmentum ionjai alapján történt. A terc.-butil-dimetilszilil-származékok szelektív fragmentum ionjai: a) ibuprofen-tbdms: m/z = 320 = [M], m/z = 305 = [M-CH 3 ] +, m/z = 263 = [M-C(CH 3 ) 3 ] +, m/z = 161 = [M-TBDMSCOO] + (1. Ábra, 1A spektrum), b) naproxen-tbdms: m/z = 344 = [M], m/z = 329 = [M-CH 3 ] +, m/z = 287 = [M-C(CH 3 ) 3 ] +, m/z = 185 = [M-TBDMSCOO] + (1. Ábra, 2A spektrum), c) ketoprofen-tbdms: m/z = 368 = [M], m/z = 311 = [M-C(CH 3 ) 3 ] +, m/z = 295 = [M- (C(CH 3 ) 3 +CH 4 )] +, m/z = 267 = [M-(CH 4 +SiC(CH 3 ) 3 ] + (1. Ábra, 3A spektrum), d) diklofenak-tbdms: m/z = 410 = [M], m/z = 353 = [M-C(CH 3 ) 3 ] +, m/z = 242 = [M- (TBDMSOH+HCl)] +, m/z = 214 = [M-(TBDMSCOOH+HCl)] + (1. Ábra, 4A spektrum). 1. Ábra: Az ibuprofen, a naproxen, a ketoprofen és a diklofenak terc.-butil-dimetilszilil- (a, c, e, g) és trimetilszilil-származékok (b, d, f, g) kromatogramjai és tömegspektrumai: 1A ibuprofen-tbdms, 1B ibuprofen-tms, 2A naproxen-tbdms, 2B naproxen-tms, 3A ketoprofen-tbdms, 3B ketoprofen-tms, 4A diklofenak-tbdms, 4B diklofenak-tms. 0 MCounts 4 a MCounts 1.5 b Spectrum 1A BP 263,1 1A Ibuprofen-TBDMS min Spectrum 1B BP 160, B Ibuprofen-TMS min m/z 34

35 MCounts c MCounts e A Naproxen-TBDMS 3A Ketoprofen- TBDMS 2.5 MCounts 5 4 d MCounts 2.0 f B Naproxen-TMS 3B Ketoprofen- TMS 0 MCounts g Diklofenak- TBDMS 4A min MCounts h Diklofenak- TMS 4B min Spectrum 2A BP 287, Spectrum 3A BP 311, Spectrum 4A BP 75, Spectrum 2B BP 185, Spectrum 3B BP 282, Spectrum 4B BP 213, m/z m/z m/z 35

36 A válaszjelek összehasonlításából látható, hogy a) MTBSTFA-val már 30 perc reakció idı elteltével, mind a 4 vegyület esetében kvantitatív a származékká alakítás, továbbá b) a terc.-butil-dimetilszilil-származékok esetében összemérhetıen magasabb válaszjeleket detektáltunk, mint az azonos koncentráció tartományban mért trimetilszilil származékok esetében (6. Táblázat, utolsó sor). 6. Táblázat Az ibuprofen-, a naproxen-, a ketoprofen- és a diklofenak TMS- és TBDMSszármazékok eltérı körülmények (70 C hıfok, 30, 60, 90, 120 perc) között nyert válaszjeleinek összehasonlítása, szelektív fragmentum ionjaik (TMS-származékok: mint az 5. Táblázatban, ibuprofen-tbdms: m/z = 320 = [M]; m/z = 305 = [M-CH 3 ] + ; m/z = 263 = [M-C(CH 3 ) 3 ] + ; m/z = 161 = [M-TBDMSCOO] + ; naproxen-tbdms: m/z = 344 = [M]; m/z = 329 = [M-CH 3 ] + ; m/z = 287 = [M-C(CH 3 ) 3 ] + ; m/z = 185 = [M-TBDMSCOO] + ; ketoprofen-tbdms: m/z = 368 = [M]; m/z = 311 = [M-C(CH 3 ) 3 ] + ; m/z = 295 = [M-(C(CH 3 ) 3 +CH 4 )] + ; m/z = 267 = [M- (CH 4 +SiC(CH 3 ) 3 ] + ; diklofenak-tbdms: m/z = 410 = [M]; m/z = 353 = [M-C(CH 3 ) 3 ] + ; m/z = 242 = [M-(TBDMSOH+HCl)] + ; m/z = 214 = [M-(TBDMSCOOH+HCl)] + ) alapján értékelve, GC-MS módszerrel mérve. 70 C Integrátor egység/pg (RSD%) Reakció idı, perc Ibuprofen Naproxen Ketoprofen Diklofenak Reagens Injektált pg (3,90) (9,1) (2,18) (7,7) (2,59) (1,54) (1,53) (1,89) HMDS-TFE (2,84) (6,1) (6,7) (8,0) (2,44) (2,79) (5,0) (4,50) Átlag (1,92) (1,38) (2,60) (2,99) (6,12) (3,24) (3,20) (3,51) (2,60) (4,20) (0,43) (2,01) MTBSTFA (2,39) (1,62) (0,54) (4,66) (1,45) (1,42) (6,9) (0,88) Átlag (0,20) (2,24) (3,51) (3,87) Válaszjelek aránya 2,8 1,9 4,3 1,4 Jelölések: mint az 5. Táblázatban A származékképzési tanulmányokat követıen a szennyvizek és a Duna-vizek elemzésénél a HMDS és a TFE alkalmazását részesítettük elınyben, mint származékképzı reagenst a következı okokból: a) ez a reagens azonos válaszjelet ad, mint a BSTFA és az MSTFA (5. Táblázat), 36

37 b) jóllehet, az MTBSTFA-val való származékká alakítással nagyobb válaszjeleket detektáltunk, de az irodalomból ismert, hogy a térben gátolt csoportoknál pl. ösztrogének, MTBSTFA-val nem kvantitatív a származékképzı reakció [37-39], c) anyagi okok miatt is a HMDS-re esett a választásunk. A es Sigma-katalógus árai alapján számolt értékek önmagukért beszélnek: 1 ml HMDS 0,19 -ba, 1 ml BSTFA 3,44 -ba, 1 ml MSTFA 8,08 -ba és 1 ml MTBSTFA 21,66 -ba kerül, vagyis az MTBSTFA több mint 100-szor drágább mint a HMDS (21,6/0,19=113,7). E méréseknél a 4. Táblázatban feltüntetett 1. Program hımérséklet programot alkalmaztuk A külsı és a belsı ionizációs módszer összehasonlítása Célkitőzéseink része volt Duna-vizek elemzése. A választott vegyületek környezeti mintákban a néhány ng/l koncentráció tartományban várhatók, ezért elengedhetetlen volt számunkra a lehetséges legnagyobb érzékenység használata. Mindezek alapján a külsı ionizáció módszerrıl áttértünk a belsı ionizáció technika alkalmazására. Tekintettel arra, hogy készülékünk mindkét technikával rendelkezik, lehetıségünk volt a módszerek közötti különbségek összehasonlítására (2-3. Ábrák). A belsı ionizáció (2. Ábra) elınye: az egyszerő szerkezet, nem tartalmaz lencséket, az ionok útja rövidebb, könnyen hangolható és kézben tartható. A módszer lényegében érzékenyebb. A külsı ionizáció (2. Ábra) elınye: a nagyobb terhelhetıség, jobb klasszikus spektrumok detektálása (elsısorban az alifás vegyületek esetében), hátránya: a kisebb érzékenység. A különbözı technikákkal mért eredményekbıl (3. Ábra) látható, hogy a belsı ionizáció technika alkalmazásával jelentıs, ször nagyobb érzékenységgel mértünk, mint a külsı ionizáció technika alkalmazásával. Azaz, a) a belsı ionizáció technikával ng/l (ibuprofen), ng/l (naproxen), ng/l (ketoprofen) és ng/l (diklofenak) koncentráció tartományban mért értékek összemérhetık b) a külsı ionizáció technikával ng/l (ibuprofen), ng/l (naproxen), ng/l (ketoprofen) és ng/l (diklofenak) koncentráció tartományban mért értékekkel. Következésképp a jövıbeni méréseknél a tömegdetektort belsı ionizációval használtuk. 37

38 2. Ábra A belsı és a külsı ionizáció technikák Belsı ionizáció Külsı ionizáció GC oszlop GC oszlop Lencsék Ionforrás 38

39 3. Ábra Az ibuprofen, a naproxen, a ketoprofen és a diklofenak külsı (sötétebb színő oszlopok) és belsı (világosabb színő oszlopok) ionizációval, eltérı koncentráció tartományokban, 375 µl oldatban, trimetilszilil-származékokként mért válaszjeleinek összehasonlítása. 4,5E+09 Ibuprofen ,0E+10 Naproxen ,5E+09 3,0E Ie Ie 5,0E+09 1,5E ,5E ,0E+00 0,0E+00 Belsı ionizáció ng/l Külsı ionizáció ng/l Belsı ionizáció ng/l Külsı ionizáció ng/l 3,0E+09 Ketoprofen ,4E+10 Diklofenak ,1E+10 Ie 2,0E Ie 7,0E ,0E ,5E ,0E+00 0,0E+00 Belsı ionizáció ng/l Külsı ionizáció ng/l Belsı ionizáció ng/l Külsı ionizáció ng/l Jelölések: Ie = integrátor egység A TIC és a SIM üzemmód jellemzése A szelektivitás növelése érdekében megvizsgáltuk a TIC és a SIM kromatogramokat. A választott 4 vegyület trimetilszilil-származékát alacsony koncentráció tartományban hasonlítottuk össze (4. Ábra), az injektált mennyiség 5 és 10 pg/µl volt. A TIC 39

40 kromatogramokat a TMS-származékok szelektív fragmentum ionjai (5. Táblázat) alapján értékeltük. A válaszjelek közötti különbség nem számottevı, a TIC/SIM válaszjel arány: 1,02 és 1,04 az ibuprofen-tms, 1,22 és 1,24 a naproxen-tms, 1,28 és 1,17 a ketoprofen-tms, valamint 1,28 és 1,45 a diklofenak-tms esetében. Jóllehet, a SIM technika szelektivitása jelentısen nagyobb, az arhiválás és a késıbbi felhasználás érdekében célszerő a TIC és a SIM üzemmódokat egymás mellett alkalmazni. 4. Ábra Az ibuprofen, a naproxen, a ketoprofen és a diklofenak TMS-származékok (5 és 10 pg/µl injektált mennyiségek) TIC (kék oszlopok), szelektív fragmentum ionok (5. Táblázat) alapján értékelve, valamint, SIM (lila oszlopok) üzemmódban mért válaszjelei. 5,00E+05 TIC SIM 4,00E+05 3,00E+05 Ie 2,00E+05 1,00E+05 0,00E+00 Ibuprofen Naproxen Ketoprofen Diklofenak Jelölések: a Rövidítések jegyzéke, 3. Ábra Az oximmá alakítás Az eredményekbıl (5. Táblázat, 4. Ábra) jól látható, hogy a ketoprofennek nagyon kicsi a válaszjele, ezért újabb változtatást vezettünk be, a származékká alakítás folyamatát két lépésre bıvítettük: 1. az oximmá alakításra és 2. az oxim-származékok trimetilszililszármazékká alakítására. Feltételeztük, hogy a keto-csoportot tartalmazó ketoprofen oximmá alakítható, majd az oxim-forma szililezhetı. Ez a gyakorlatban (a kromatogranom) az oximokra jellemzı duplacsúcs - a ketoprofen-oxim E és Z formái - megjelenésében nyilvánult meg. A ketoprofen-oxim-tms válaszjele 1,5-ször nagyobb, mint a ketoprofen-tms-é. A mérési eredmények részletezése a 15. Táblázatban látható. 40

41 A modell vegyületek mérési reprodukálhatósága A választott modell vegyületek mennyiségi meghatározásához szükséges a mérések lineritását meghatározni. A vizsgált koncentráció tartományt a szennyvizekben várt mennyiségeknek megfelelıen választottuk: 6,93-55,4 pg az ibuprofennél, 7,96-63,7 pg a naproxennél, 8,85-70,8 pg a ketoprofennél, valamint 9,83-78,9 pg a diklofenaknál (8. Táblázat), melyek 1-1 µl injektált mennyiségre vonatkoztak. A mérések reprodukálhatóságát relatív standard deviációval jellemeztük, százalékban kifejezve (RSD%). Minden koncentráció tartományhoz 2-2 párhuzamos mintát készítettünk és a mintákat 3-4-szer injektáltuk. Ezen mérésekbıl számított RSD% értékek a 8. Táblázat 3-6. soraiban zárójelben láthatóak. A táblázat utolsó sorában az RSD% értékek a válaszjelek átlagához tartoznak. Megállapítottuk, hogy a vizsgált koncentráció tartomány lineáris mind a négy vegyület esetében, valamint, az eredményeink a mért koncentráció tartományban reprodukálhatóak (átlag RSD% = 1,83%). 8. Táblázat Az ibuprofen, a naproxen, a ketoprofen, a diklofenak trimetilszilil- és trimetilszililoxim-származékok mérésének linearitása és reprodukálhatósága, szelektív fragmentum ionok (mint a 5. Táblázat, kivéve ketoprofen-oxim-tms: m/z = 413 = [M]; m/z = 398 = [M-CH 3 ] + ; m/z = 207 = [M-(TMSO+TMSCOO)] + ) alapján értékelve, GC-MS módszerrel mérve. Ibuprofen Naproxen Ketoprofen Diklofenak Injektált pg/µl Ie/pg (RSD%) Injektált pg/µl Ie/pg (RSD%) Injektált pg/µl Ie/pg (RSD%) Injektált pg/µl Ie/pg (RSD%) 6, (2,38) 7, (1,35) 8, (10) 9, (3,63) 13, (1,53) 15, (5,2) 17, (0,99) 19, (1,62) 27, (2,80) 31, (2,48) 35, (0,71) 39, (1,89) 55, (0,10) 63, (3,23) 70, (0,06) 78, (1,28) Átlag 8084 (2,29) Átlag (1,71) Átlag (2,04) Átlag (1,28) Jelölések: mint 5. Táblázat, 3. Ábra Visszanyerési tanulmány A közlemények többségében a szennyvizek elemzéséhez mintaelıkészítésként, szilárd fázisú extrakciót és Oasis HLB töltetet használnak. Saját vizsgálatainkhoz az Oasis HLB 200mg/6mL fecskendıtest oszlopot alkalmaztuk. Az 1-1 L, ph = 4 értékő elfolyó szennyvízhez 1-1,5 µg/l koncentráció tartományban adtuk a modell vegyületeket. Az Oasis HLB (200mg/6mL) szorbensek elıkészítése a

42 fejezet 3. a) és b) pontok, a megkötött vegyületek leoldása a fejezet 5. c) és d) pontok szerint történt. Minden esetben (hozzáadás nélkül és hozzáadással) 3 párhuzamos minta készült és minden mintát 3-szor injektáltunk. Az 5. Ábrán a választott vegyületek visszanyerésének összehasonlítása, két különbözı oldószercsoport alkalmazásával látható. Kitőnik, hogy míg az n-hexán, etilacetát, metanol oldószerek alkalmazásával a visszanyerések értéke átlag 10 (RDS% = 5,39%), addig az aceton:etil-acetát (50:50, v/v) alkalmzásánál átlag 84% a visszanyerések hatásfoka (RSD% = 5,3%). 5. Ábra Az ibuprofen, a naproxen, a ketoprofen és a diklofenak visszanyerési hatásfokának összehasonlítása, Oasis HLB 200mg/6mL szorbens, ph = 4, 1-1 L mintatérfogat, két különbözı oldószer csoport (aceton:etil-acetát = 50:50 (v/v), valamint n-hexán, etil-acetát, metanol) alkalmazása mellett Visszanyerés aceton:etil-acetát (50:50, v/v) hexán, etil-acetát, metanol % Ibuprofen Naproxen Ketoprofen Diklofenak Ezen eredmények szerint a választott vegyületek visszanyerését eltérı koncentráció tartományban, az n-hexán, etil-acetát, metanol oldószerek alkalmazásával vizsgátuk. E méréseknél a mintákhoz 0,46-6 µg/l koncentráció tartományban adtuk a 4 összetevıt. Az elfolyó szennyvíz a 4 vegyület hozzáadása nélkül 0,41 µg/l ibuprofent, 1,91 µg/l naproxent, 1,78 µg/l ketoprofent és 5,504 µg/l diklofenakot tartalmazott. Az 1-1 L térfogatú mintákat, ph = 4 értékő oldatból extraháltuk, a szorbensek elıkészítését a fejezet 3. a) pont és a 42

43 megkötött vegyületek leoldását a fejezet 5. c) pont szerint végeztük. Minden esetben 3 párhuzamos minta készült és minden mintát 3-szor injektáltunk. A 7. Táblázatból látható, hogy a visszanyerések 84% és 109% közötti értékek (kivéve az ibuprofent, amelynek visszanyerése a 0,46-0,61 µg/l hozzáadott mennyiségek tartományában 72% volt). 7. Táblázat Az ibuprofen, a naproxen, a ketoprofen és a diklofenak visszanyerési hatásfokának összehasonlítása, a vegyületek különbözı koncentráció tartományban való hozzáadása, Oasis HLB 200mg/6mL szorbens, ph = 4, 1-1 L mintatérfogat, egy ugyanazon oldószer csoport alkalmazása mellett. Koncentráció Visszanyerések, % tartomány Ibuprofen Naproxen Ketoprofen Diklofenak 4-6 µgl µgl ,5 µgl ,46-0,61 µgl Átlag (RSD%) 100 (5,7) 98 (9,5) 102 (6,8) 99 (4,8) Jelölések: mint az 5. Táblázat, valamint, a dılt betővel írott eredményeket a számításokból kihagytuk Az és fejezetekben leírt vizsgálatokat belsı ionizációval, a 4. Táblázat 2. Program (16,5 perces) hımérsékletprogrammal végeztük Az epesavak minıségi-mennyiségi meghatározása A vizsgált 6 különbözı epesav (a kólsav, a litokólsav, a kenodezoxikólsav, az urzodezoxikólsav, a 7-ketolitokólsav, a dehidrokólsav), mint kitőnik karboxil-, hidroxil- és keto-csoporto(ka)t (6. Melléklet) egyaránt tartalmaznak. Ezért a származékká alakításuk legegyszerőbb és egyben leghatékonyabb módszere a két lépésbıl álló eljárása volt: 1. oximmá alakítás, 2. trimetilszilil-származékképzés Származékképzési tanulmány Az epesavak teljeskörő származékká alakítását, a hidroxil-, a karboxil- és a ketocsoportok mennyiségi-minıségi meghatározását eltérı feltételek mellett végeztük. Bevezetı 43

44 tanulmányunk során az oximmá alakítást 70 C 30 perc, a szililezést 100 C 60 percen folytattuk. Ezt követıen a hıfokot és a reakció idıt változtattuk mind az oximmá (70 C, 100 C, 30, 60, 120 perc), mind a trimetilszilil-származékká (70 C, 100 C, 60, 90, 120 perc) alakításnál (9. Táblázat). A kromatogramokat a származékok szelektív fragmentum ionjai (10. Táblázat) alapján értékeltük. 9. Táblázat Az eltérı reakció feltételek hatása a kólsav, a litokólsav, a kenodezoxikólsav, az urzodezoxikólsav, a 7-ketolitokólsav, a dehidrokólsav TMS- és TMS-oxim-származékok válaszjeleinek nagyságára, szelektív fragmentum ionjaik (10. Táblázat) alapján értékelve. Reakció feltételek Kólsav Litokólsav Integrátor egység/pg Kenodezoxi kólsav Urzodezoxi kólsav 7-keto litokólsav Dehidro kólsav Injektált pg Átlag (RSD %) (1,64) Jelölések: mint a 1-8 Táblázatokban (4,57) (3,04) (3,50) 7286 (2,59) 2507 (4,90) Alkalmazott reakció feltételek: 1. trimetilszilil-származékká alakítás 70 C 90 perc 2. oximmá alakítás 70 C 30 perc és trimetilszilil-származékká alakítás 70 C 90 perc 3. oximmá alakítás 70 C 30 perc és trimetilszilil-származékká alakítás 100 C 60 perc 4. oximmá alakítás 70 C 30 perc és trimetilszilil-származékká alakítás 100 C 120 perc 5. oximmá alakítás 70 C 60 perc és trimetilszilil-származékká alakítás 70 C 90 perc 6. oximmá alakítás 100 C 30 perc és trimetilszilil-származékká alakítás 70 C 90 perc 7. oximmá alakítás 100 C 90 perc és trimetilszilil-származékká alakítás 70 C 90 perc 8. oximmá alakítás 100 C 120 perc és trimetilszilil-származékká alakítás 70 C 90 perc A 9. Táblázat eredményei alapján elmondhatjuk, hogy: 44

45 - a keto-csoportot is tartalmazó epesavak (7-ketolitokólsav, dehidrokólsav) érdekében az oximmá alakítás elkerülhetetlen. A trimetilszilil-származékká alakítás (9. Táblázat, 1. feltétel eredménye) nem elégséges. - Az epeavak válaszjeleit összehasonlítva látható, hogy mind az oximmá, mind a trimetilszililszármazékká alakításhoz a 70 C hıfok alkalmazása megfelelı, a válaszjelek közötti eltérés hibáinak figyelembe vételével. - Az eredmények összehasonlíthatóak a nem szteroid típusú gyulladásgátlóknál tapasztaltakkal, amelyeknél 30 perc volt az oximálás és 90 perc a szililezés optimális reakció idı. - Az epesavak jól illeszthetıek a sok összetevıjő elemzı rendszerünk összetevıi közé (5.1.3 fejezet) Az epesavak szelektív fragmentum ionjaik elemzése A fragmentum-analitikai tanulmányunk szerint az epesavak tömegspektrumaiban nagy m/z értékő, jellemzı ionokat kaptunk (6. Ábra, 10. Táblázat). A 6. Ábra és a 10. Táblázat együttes értékelésébıl kitőnik, hogy: - az epesavak trimetilszilil (oxim) éter/észter-származékok molekula-ionjai rendben: [M] = m/z = 696 (kólsav), [M] = m/z = 520 (litokólsav), [M] = m/z = 608 (kenodezoxikólsav és urzodezoxikólsav), [M] = m/z = 621 (7-ketolitokólsav) és [M] = m/z = 735 (dehidrokólsav). - A molekulaionból egy metil-csoport vesztéssel ([M-CH 3 ] + ) a keletkezı ionok: az m/z = 681 (kólsav), az m/z = 505 (litokólsav), az m/z = 593 (kenodezoxikólsav és urzodezoxikólsav), az m/z = 606 (7-ketolitokólsav) és az m/z = 720 (dehidrokólsav) voltak. - Az epesav-tms és az epesav-oxim-tms származékok fragmentációjára jellemzı a TMSO (m/z = [M-89] + ), valamint a TMSOH (m/z = [M-90] + ) csoport(ok) hasadása. További jellemzı ionként (6. Ábra) azonosítottuk: - az m/z = 343 = [M-(2TMSOH+C 4 H 8 COOTMS)] +, az m/z = 253 = [M- (3TMSOH+C 4 H 8 COOTMS)] + töredék ionokat (kólsav-tms származéknál, 6. Ábra, 1B spektrum), - az m/z = 257 = [M-(TMSOH+C 4 H 8 COOTMS)] + töredék iont (litokólsav-tms származéknál, 6. Ábra, 2A spektrum), - az m/z = 255 = [M-(2TMSOH+C 4 H 8 COOTMS)] + töredék iont (kenodezoxikólsav-tms és urzodezoxikólsav-tms származékoknál, 6. Ábra, rendre a 2B és a 3A spektrumok), - az m/z = 477 = [M-(C 2 H 3 COOTMS)] + töredék iont (7-ketolitokólsav-oxim-TMS származéknál, 6. Ábra, 3B spektrum), 45

46 - az m/z = 376 = [M-(TMSO+3TMSOH] + töredék iont (dehidrokólsav-oxim-tms származéknál, 6. Ábra, 4A és 4B spektrumok). Az epesavak származékképzési és fragmentum-analitikai tanulmányánál a 4. Program (4. Táblázat) hımérsékletprogramot használtuk. A 6. Ábrán az epesavak mellett a koleszterin TMS-származéka és tömegspektruma (1A) is látható. A reprodukálhatóság és a linearitás, valamint a viszzanyerési vizsgálatok a Táblázatokban találhatók. 10. Táblázat A kólsav, a litokólsav, a kenodezoxikólsav, az urzodezoxikólsav, a 7- ketolitokólsav és a dehidrokólsav trimetilszilil- és trimetilszilil-oxim-származékok szelektív fragmentum ionjai. Vegyületek 58. Kólsav-4TMS Litokólsav-2TMS Kenodezoxikólsav-3TMS 61. Urzodezoxikólsav-3TMS SFI, m/z [M] [M-CH 3 ] + További szelektív fragmentum ionok a 7-ketolitokólsav-2TMS b 7-ketolitokólsav-oxim-3TMS a Dehidrokólsav-1TMS b Dehidrokólsav-oxim-4TMS [M-2TMSOH] + = 516, [M-3TMSOH] + = 426 [M-TMSOH] + = 430, [M-2TMSOH] + = 340 [M-TMSOH] + = 518, [M-2TMSOH] + = 428, [M-(CH 3 +2TMSOH)] + = 413 [M-(TMSOH)] + = 444, [M-(TMSOH+H 2 O)] + = 426 [M-TMSO] + = 532, [M-(CH 2 COOTMS)] + = 490, [M-(C 4 H 8 COOTMS)] + = 448 [M-TMSOH] + = 384, [M-(TMSOH+H 2 O)] + = 366 [M-TMSO] + = 646, [M-(TMSO+TMSOH)] + = 556, [M-(TMSO+2TMSOH)] + = 466 Megjegyzés: a sorszámok a 14b. Táblázat folytatása 46

47 6. Ábra A koleszterin-tms, az epesav-tms és az epesav-oxim-tms származékok TIC kromatogramja és tömegspektrumai: 1A koleszterin-tms, 1B kólsav-tms, 2A litokólsav-tms, 2B kenodezoxikólsav-tms, 3A urzodezoxikólsav-tms, 3B 7- ketolitokólsav-oxim-tms, 4A és 4B dehidrokólsav-oxim-tms. MCounts 3B A 1B 2A 2B 3A 4A 4B Spectrum 1A BP 368, minutes Spectrum 2A Spectrum 3A Spectrum 4A BP 257,4 BP 518,3 BP 646, Spectrum 1B BP 253, Spectrum 2B BP 428, Spectrum 3B BP 477, Spectrum 4B BP 646, m/z m/z m/z m/z 47

48 5.1.3 A sok összetevıjő elemzı rendszer A sok összetevıjő elemzı rendszerünk alkotóinak kiválasztása több szempont alapján történt: részben saját kutatási tapasztalatok [18,19], részben irodalmi adatok [1-13, 20-45], és részben az Észak-Pesti Szennyvíztisztító Teleprıl származó befolyó és elfolyó szennyvíz mintákban azonosított összetevık alapján Az szennyezık kiválasztása Az fejezetben felsorolt szempontok alapján kiválasztott összetevık, az összesen 63 vegyület, az alábbi csoportokba sorolhatók: - gyógyszerek és metabolitjaik (nem szteroid gyulladásgátlók, fájdalocsillapítók: ibuprofen, naproxen, ketoprofen, diklofenak, szalicilsav, paracetamol, fenilecetsav, fenoprofen; lipidregulátorok: klofibrinsav, gemfibrozil, fenofibrát; antiepileptikum: karbamazepin; β-blokkolók: metoprolol, propranolol; antipszichotikum: metotrimeprazin; reuma elleni szer: 2,5-dihidroxi-benzoesav; koffein; koleszterin), - tartósítószerek (benzoesav és származékai, benzoátok, propionsavak), - mőanyaglágyítók és festékadalékanyagok (ftalátok, ftálsavak, 2,4-diterc.-butilfenol, azelainsav, szebacinsav, 3-hidroxi-benzoesav, 4-hidroxi-benzoesav, ), - kozmetikumok és piperecikkek összetevıi (fenilecetsav, fahéjsav, vaníliasav, kaprinsav, azelainsav, mirisztinsav, szebacinsav, dietil-ftalát), - élelmiszerek (ételek és italok: koffein, kávésav, ferulasav, vaníliasav, indolecetsav, fahéjsav, zsírsavak, koleszterin), - ösztrogének (tüszıhormonok: β-ösztradiol, ösztron), - koleszterin és epesavak (emberi, állati vagy növényi szervezetben: koleszterin; elsıdleges és másodlagos epesavak). A tanulmányozott 63 szennyezıanyag kémiai (pka érték, összegképlet, CAS-szám, molekulatömeg) és kromatográfiás (retenciós idı) jellemzıi a 14a. Táblázatban, a trimetilszilil (oxim) éter/észter származékok szelektív fragmentum ionjai a 14b. Táblázatban találhatók. A vegyületek szerkezeti képlete a 6. Melléklet fejezet táblázataiban láthatók. 48

49 14a Táblázat A sok összetevıjő elemzı rendszer alkotóinak kémiai (összegképlet, pka érték, CASszám, molekulatömeg) és kromatográfiás (retenciós idı) jellemzıi. Vegyületek Összegképlet pka CAS-szám t R, perc M t 1. Benzoesav C 7 H 6 O 2 4, ,52 122,1 2. Fenilecetsav C 8 H 8 O 2 4, ,12 136, Fenilpropionsav C 9 H 10 O 2 4, ,63 150,2 4. Dimetil-ftalát C 10 H 10 O 4 3, ,81 194,2 5. Kaprinsav C 10 H 20 O 2 4, ,95 172, Hidroxi-metilbenzoát C 8 H 8 O 3 3, ,59 152,2 7. Szalicilsav C 7 H 6 O 3 3, ,61 138,1 8. Fahéjsav C 9 H 8 O 2 4, ,78 148,0 9. 2,4-Diterc.-butilfenol C 14 H 22 O 12, ,93 206, Hidroxi-benzoesav C 7 H 6 O 3 4, ,29 138, Hidroxi-etilbenzoát C 9 H 10 O 3 3, ,48 166,2 12. Klofibrinsav C 10 H 11 ClO 3 3, ,59 214,7 13. Dietil-ftalát C 12 H 14 O 4 7, ,85 222,1 14. Ibuprofen C 13 H 18 O 2 4, ,99 206, Hidroxi-benzoesav C 7 H 6 O 3 4, ,02 138, Hidroxifenil-ecetsav C 8 H 8 O 3 4, ,14 152,2 17. Laurinsav C 12 H 14 O 2 5, ,26 200,3 18. Ftálsav C 8 H 6 O 4 4, ,31 166, Hidroxifenil-propionsav C 9 H 10 O * 10,60 150,1 20. Paracetamol C 8 H 9 NO 2 9, ,65 151, (3-Hidroxifenil)-propionsav C 9 H 10 O 3 6, ,14 166,1 22. Tereftálsav C 8 H 6 O 4 4, ,38 166, ,5-Dihidroxi-benzoesav C 7 H 6 O 4 4, ,49 154, (4-Hidroxifenil)-propionsav C 9 H 10 O 3 6, ,52 166,1 25. Vaníliasav C 8 H 8 O 4 6, ,53 168,2 26. Homovaníliasav C 9 H 10 O 4 7, , ,2 27. Azelainsav C 9 H 16 O 4 4, ,82 188,2 28. Mirisztinsav C 14 H 28 O 2 4, ,38 228,4 29. Szebacinsav C 10 H 18 O 4 4, ,78 202,1 30. (3-Metoxi-4-OHfenil)-propionsav C 10 H 13 O ,89 196,0 31. Koffein C 8 H 10 N 4 O 2 3, ,98 194,2 32. Gemfibrozil C 15 H 22 O 3 4, ,31 250,3 33. Indolecetsav C 10 H 9 NO 2 4, ,44 / 13,65 175,2 34. Dibutil-ftalát C 16 H 22 O 4 3, ,76 278,3 35. Fenoprofen C 15 H 14 O 3 4, ,99 242,0 36. Palmitolajsav C 16 H 30 O 2 5, ,16 254,4 37. Palmitinsav C 16 H 32 O 2 4, ,33 256, Klór-2-metil-indolecetsav C 11 H 10 ClNO * 14,60 295,0 39. Metopropol C 15 H 25 NO 3 8, ,73 267,4 40. Ferulasav C 10 H 10 O 4 4, ,86 194,0 41. Naproxen C 14 H 14 O 3 4, ,96 230,3 42. Kávésav C 9 H 8 O 4 6, ,04 / 15,13 180,2 43. Propranolol C 16 H 21 NO 2 9, ,77 259,3 44. Linolénsav C 18 H 32 O 2 6, ,86 280,4 49

50 45. Olajsav C 18 H 34 O 2 5, ,91 282,4 46. Ketoprofen C 16 H 14 O 3 5, ,94 / 16,00 254,3 47. Sztearinsav C 18 H 36 O 2 5, ,08 284,4 48. Diklofenak C 14 H 11 Cl 2 NO 2 4, ,86 295,0 49. Karbamazepin C 15 H 12 N 2 O 8, ,83 236,3 50. Arahidinsav C 20 H 40 O 2 4, ,63 312,5 51. Dioktil-ftalát C 24 H 38 O 4 4, ,67 390,5 52. Fenofibrát C 20 H 21 O 4 Cl 4, ,02 / 19,24 360,8 53. Metotrimeprazin C 19 H 24 N 2 OS 9, ,28 328,4 54. β-ösztradiol C 18 H 24 O 2 10, ,84 272,4 55. Ösztron C 18 H 22 O ,54 270,4 56. Kolesztén C 27 H 46 6, ,59 370,6 57. Koleszterin C 27 H 46 O 3, ,66 386,6 58. Kólsav C 24 H 40 O 5 5, ,87 408,6 59. Litokólsav C 24 H 40 O 3 4, ,91 376,6 60. Kenodezoxikólsav C 24 H 40 O 4 3, ,28 392,6 61. Urzodezoxikólsav C 24 H 40 O 4 3, ,81 392, Ketolitokólsav C 24 H 38 O ,28 390,6 63. Dehidrokólsav C 24 H 34 O 5 4, ,64 / 27,95 402,5 Jelölések: M t = alapmolekula molekulatömegei, t R = retenciós idı, * = trimetilszilil-származékokhoz tartozó CAS-szám, a NIST spektrumkönyvtárban található, a modell vegyület nem volt számunkra elérhetı, - = nem találtunk adatot A 14a. Táblázat CAS-számok oszlopban, a csillaggal (*) jelölt vegyületeknél a CAS-számok a trimetilszilil-származékokra vonatkoznak, melyeket a NIST (National Institute of Standards of USA) spektrumkönyvtár segítségével azonosítottuk. Az indolecetsav-1tms és az indolecetsav-2tms származékokat is képez az alkalmazott reakció körülmények között, ezért két retenciós idı tartozik hozzá. A kávésav TMS-származékhoz két jól elkülöníthetı csúcs és retenciós idı tartozik. A ketoprofen- és a dehidrokólsav-oxim-származékok két-két különbözı retenciós idıvel, az oximokra jellemzı duplacsúcsban (E és Z formák) jelenik meg a kromatogramon. A fenofibrát-oxim-tms egy intenzív csúcsban látható a kromatogramon, melyhez az elsı retenciós idı tartozik, e mellett egy kevésbé intenzív csúcs is megjelenik, mely a fenofibrát származékká nem alakult részét jelzi (ez a rész elenyészı az elızıhöz képest). A 14b. Táblázatban két csillaggal (**) jelölt vegyületeket alapállapotban, azaz nem trimetilszilil (oxim) éter/észter származékká alakított formában mértük. 50

51 14b. Táblázat A vizsgált, különbözı funkciós csoportokat tartalmazó szennyzıanyagok (az sorszámú vegyületek a 10. Táblázatban láthatók) trimetilszilil (oxim) éter/észter származékainak szelektív fragmentum ionjai. Vegyületek [M] [M-CH 3 ] + SFI, m/z További szelektív fragmentum ionok 1. Benzoesav-1TMS [M-TMSO] + = Fenilecetsav-1TMS [M-TMSOH] + = 118, [M-TMSCOO] + = Fenilpropionsav-1TMS [M-TMSCOOH] + = 104, [M-(CH 2 COOTMS)] + = Dimetil-ftalát 194** - [M-OCH 3 ] + = 163, [M-COOCH 3 ] + = Kaprinsav-1TMS [M-C 9 H 19 ] + = Hidroxi-metilbenzoát-1TMS [M-TMSO] + = Szalicilsav-2TMS [M-TMSO] + = Fahéjsav-1TMS [M-TMSO] + = 131, [M-TMSCOO] + = ,4-Diterc.-butilfenol [M-(TMSO+CH 2 )] + = Hidroxi-benzoesav-2TMS [M-TMSO] + = Hidroxi-etilbenzoát-1TMS [M-OC 2 H 5 ] + = 193, [M-(TMSO+CH 3 )] + = Klofibrinsav-1TMS [M-TMSCOOH] + = 169, [M-(TMSCOO+C 3 H 6 )] + = Dietil-ftalát 222** - [M-OC 2 H 5 ] + = 177, [M-COOC 2 H 5 ] + = Ibuprofen-1TMS [M-COO] + = 234, [M-TMSCOOH] + = Hidroxi-benzoesav-2TMS [M-TMSO] + = Hidroxifenil-ecetsav-2TMS [M-TMSCOO] + = 179, [M-(TMSCOO+CH 3 )] + = Laurinsav-1TMS [M-C 11 H 23 ] + = Ftálsav-2TMS [M-TMSO] + = Hidroxifenil-propionsav-2TMS [M-TMSCOOH] + = 192, [M-(TMSCOOH+CH 3 )] + = Paracetamol-1TMS [M-C 2 H 2 O] + = 181, [M-C 2 H 3 NO] + = (3-Hidroxifenil)-propionsav-2TMS [M-TMSCOOH] + = 192, [M-TMSCOOH+CH 3 )] + = Tereftálsav-2TMS [M-TMSO] + = ,5-Dihidroxi-benzoesav-3TMS [M-TMSO] + = (4-Hidroxifenil)-propionsav-2TMS [M-TMSCOOH] + = 192, [M-(TMSCOOH+CH 3 )] + = Vaníliasav-2TMS [M-{CH 3 } 2 ] + = 282, [M-{CH 3 } 3 ] + = 267, [M-TMSO] + = Homovaníliasav-2TMS [M-{CH 3 } 2 ] + = 296, [M-TMSCOO] + = Azelainsav-2TMS [M-C 7 H 14 COOTMS] + = Mirisztinsav-1TMS [M-C 13 H 27 ] + = Szebacinsav-2TMS [M-C 8 H 16 COOTMS] + = (3-Metoxi-4-hidroxifenil)- propionsav-2tms [M-CH 2 COOTMS] + = 209, [M-(TMSCOO+OCH 3 )] + = Koffein 194** - [M-C 2 H 5 ] + = 165, [M-C 3 H 3 NO 2 ] + = Gemfibrozil-1TMS [M-C 6 H 11 COOTMS] + = a Indolecetsav-1TMS [M-TMSCOO] + = c Indolecetsav-2TMS [M-TMSCOO] + = Dibutil-ftalát 278** - [M-C 4 H 9 O] + = 205, [M-C 8 H 17 O] + = Fenoprofen-1TMS [M-TMSCOOH] + = Palmitolajsav-1TMS [M-C 15 H 29 ] + =

52 37. Palmitinsav-1TMS [M-C 15 H 31 ] + = klór-2-metil-indolecetsav-1TMS [M-TMSCOO] + = Metopropol-1TMS [M-TMS] + = 266, [M-(TMS+C 3 H 7 )] + = Ferulasav-2TMS [M-{CH 3 } 2 ] + = 308, [M-TMSO] + = Naproxen-1TMS [M-(COO+CH 3 )] + = 243, [M-TMSCOO] + = Kávésav-3TMS [M-TMSO] + = 307, [M-2TMSO+H] + = Propranolol-1TMS [M-(TMS+C 3 H 7 )] + = 215, [M-TMSO+C 6 H 12 N] + = Linoleinsav-1TMS [M-C 17 H 31 ] + = Olajsav-1TMS [M-C 17 H 33 ] + = a Ketoprofen-oxim-2TMS [M-TMSO] + = 324, [M-(TMSO+TMSCOO)] + = b Ketoprofen-1TMS [M-COO] + = 282, [M-(COO+CH 3 )] + = Sztearinsav-1TMS [M-C 17 H 35 ] + = Diklofenak-1TMS [M-TMSOH] + = 277, [M-(TMSO+HCl)] + = 242, [M-(TMSCOO+HCl)] + = Karbamazepin-1TMS [M-TMSNCO] + = Arahidinsav-1TMS [M-C 19 H 39 ] + = Dioktil-ftalát 390** - [M-C 8 H 15 ] + = 279, [M-C 16 H 33 O] + = a Fenofibrát-oxim-1TMS [M-C 7 H 11 O 3 ]+ = 304, [M-(TMS+C 7 H 12 O 3 )] + = b Fenofibrát 360** - [M-COOC 3 H 7 ] + = 273, [M-C 13 H 19 O 4 ] + = Metotrimeprazin 328** - [M-{CH 3 +CH 3 O}] + = 282, [M-C 5 H 12 N] + = 242, [M-C 6 H 13 N] + = β-ösztradiol-2tms [M-TMSOH] + = 326, [M-(TMSOH+C 3 H 5 )] + = a Ösztron-1TMS [M-C 3 H 5 O] + = 285, [M-C 8 H 12 O] + = b Ösztron-oxim-2TMS [M-TMSO] + = Kolesztén 370** - [M-CH 3 ] + = 355, [M-C 8 H 17 ] + = 257, [M-C 11 H 23 ] + = Koleszterin-1TMS [M-TMSOH] + = 368, [M-(TMSOH+CH 3 )] + = 353, [M-(TMSO+C 3 H 4 )] + = 329 Jelölések: M = molekulaion, ** = a vegyületek alapállapotú, azaz nem trimetilszilil(oxim) éter/észter származékká alakított forma, a,c = trimetilszilil-származék, b = trimetilszilil-oxim-származék Származékképzések értékelése Az oximálás és szililezés területén szerzett korábbi tapasztalatok alapján a keto-csoportot is tartalmazó vegyületek származékképzése egyenként tanulmányozandó, ilyenek: a ketoprofen, a fenofibrát, az ösztron. A β-ösztradiol és a koleszterin két lépésbeni származékká alakítását ezidáig nem tanulmányoztuk. 52

53 Az eddig alkalmazott oxim-származékká (70 C 30 perc) és trimetilszilil-származékká alakítás (100 C 60 perc [14-17], 70 C 90 perc [18-19]) reakció körülményeket bıvítettük mind a hıfokok, mind a reakció idı tekintetében (15.Táblázat, 2-6. feltételek). 15. Táblázat A ketoprofen, a fenofibrát, az ösztron, a β-ösztradiol, a koleszterin válaszjeleinek összehasonlítása különbözı reakció feltételek alkalmazásakor, trimetilszilil- és trimetilszilil (oxim) éter/észter származékokként mérve, szelektív fragmentum ionjaik (14b. Táblázat) alapján értékelve. Reakció feltételek Integrátor egység/pg Ketoprofen Fenofibrát Ösztron β-ösztradiol Koleszterin Szilil. Oxim. Szilil. Oxim. Szilil. Oxim. Szilil. Szilil. t R, perc 9,69 9,60 11,24 11,10 11,66 12,13 11,72 14, Átlag (RSD %) (5,00) (4,61) (4,71) (4,58) (3,06) Jelölések: az 5. Táblázat, 14a. Táblázat, valamint, Szilil. = TMS-származékokként mérve, Oxim. = TMS-oxim-származékokként mérve, Átlag = a különbözı reakció feltételek (2-6. feltétel) mellett kapott eredmények átlagai, a dılt betőkkel jelölt értékek a trimetilszilil-származékokra vonatkoznak Reakció feltételek: 1. trimetilszilil-származékká alakítás 70 C, 90 perc, 2. oximmá alakítás 70 C, 30 perc + trimetilszilil-származékká alakítás 70 C, 90 perc, 3. oximmá alakítás 70 C, 60 perc + trimetilszilil-származékká alakítás 70 C, 90 perc, 4. oximmá alakítás 100 C, 30 perc + trimetilszilil-származékká alakítás 70 C, 90 perc, 5. oximmá alakítás 100 C, 90 perc + trimetilszilil-származékká alakítás 70 C, 90 perc, 6. oximmá alakítás 100 C, 120 perc + trimetilszilil-származékká alakítás 70 C, 90 perc. Az eltérı reakció körülményeknek megfelelıen a válaszjelek különböznek. A csak szililezés (1. reakció feltétel) és az oximálás és szililezés (2.-6. reakció feltétel) eredményeinek összehasonlításából kitőnik, hogy: - a fenofibrát és a ketoprofen esetében az oximmá alakítás a válaszjelek növekedését eredményezte (15. Táblázat, 2-3. oszlop, 7. Ábra). A ketoprofen-oxim-tms válaszjele 1,5-53

54 ször nagyobb, mint a ketoprofen-tms válaszjele (15. Táblázat), valamint a fenofibrát-oxim- TMS válaszjele 1,8-szor nagyobb, mint a származékká nem alakult fenofibráté (15. Táblázat), amely izopropil-észter. - A kromatogramokon (8. Ábra) látható, hogy az ösztron és a β-ösztradiol esetében az oximálás megfelelı elválasztást biztosít. Mind a mellett, az ösztron-származék válaszjele harmadára csökken (15. Táblázat, 4. oszlop). - A β-ösztradiol és a koleszterin azonos, jól reprodukálható válaszjeleket adott reakció körülménytıl függetlenül (15.Táblázat, 5-6. oszlop). E származékképzési tanulmány során a 4. Táblázatban található 4. Program hımérsékletprogramot alkalmaztuk. 7. Ábra Totál ion kromatogramok (a-b) és a származékok tömegspektrumai: a: 1A ketoprofen- TMS, 2A fenofibrát, b: 1B ketoprofen-oxim-tms, 2B fenofibrát-oxim-tms. MCounts a MCounts 2.5 b B 1A MCounts 0 MCounts B 2A Spectrum 1A BP 282, Spectrum 1B BP 324, Spectrum 2A BP 121, Spectrum 2B BP 230, m/z m/z 54

55 8. Ábra Totál ion kromatogramok (a-b) és a származékok tömegspektrumai: a: 3A ösztron-tms, 4A β-ösztradiol-tms, b: 3B β-ösztradiol-tms, 4B ösztron-oxim-tms. MCounts A4A 10 Spectrum 3A BP 342, Spectrum 4A BP 416, a MCounts b B 4B Spectrum 3B BP 285, m/z Spectrum 4B BP 340, m/z 55

56 A szennyezık fragmentum-analitikai tanulmánya A választott, lehetséges szennyezıkbıl az oximmá alakítást követıen, a szilezés során, 1-4 TMS-csoport kapcsolódhat (14b. Táblázat). 7 vegyületet változatlan formában mértünk: ezek a ftalátok (szám szerint 4), a koffein, a metotrimeprazin és a kolesztén. A fragmentum-analitikai vizsgálatok szerint a 63 vegyület legtöbbje eltérı fragmentációt mutat, néhány kivétellel: - hasonló fragmentációt tapasztaltunk a 2-hidroxi-benzoesav (9. Ábra, 1A spektrum), a 3- hidroxi-benzoesav (9. Ábra, 1B spektrum) és a 4-hidroxi-benzoesav (9. Ábra, 2A spektrum) TMS-származékoknál, melyek tömegspektrumai az m/z = 282 = [M], az m/z = 267 = [M- CH 3 ] +, az m/z = 209 = [M-TMS] +, az m/z = 193 = [M-TMSO] + ionokat tartalmazzák (14b. Táblázat). - A 2-hidroxifenil-propionsav (10. Ábra, 2B spektrum), a 3-(3-hidroxifenil)-propionsav (10. Ábra, 3A spektrum) és a 3-(4-hidroxifenil)-propionsav (10. Ábra, 3B spektrum) TMSszármazékoknál is azonos kötéshasadások tapasztalhatók. A tömegspektrumaik az m/z = 310 = [M] molekulaiont, az m/z = 295 = [M-CH 3 ] +, az m/z = 192 = [M-TMSCOOH] +, az m/z = 177 = [M-(TMSCOOH+CH 3 )] +, valamint az m/z = 179 = [M-(TMSCOOCH 2 )] + töredékionokat tartalmazzák (14b. Táblázat). A sok összetevıjő elemzı rendszerünk tartalmazza a dimetil-ftalátot, dietil-ftalátot, dibutil-ftalátot és a dioktil-ftalátot. Ezen vegyületek fragmentácójában megtalálható a dialkilftalátokra jellemzı m/z = 149 = [C 8 H 5 O 3 ] + töredékion (14b. Táblázat, 11. Ábra, spektrumok: 1A dimetil-ftalát, 1B dietil-ftalát, 2A dibutil-ftalát, 3B dioktil-ftalát). A vizsgált zsírsavak TMS-származékai hasonlóan fragmentálódnak, az m/z = 117, az m/z = 129 töredékionok, valamint az [M-15] + fragmension a jellemzık (14b. Táblázat, 10. Ábra, spektrumok: 1A kaprinsav, 1B laurinsav, 2A azelainsav, 2B mirisztinsav, 3A szebacinsav, 3B palmitolajsav, 4A palmitinsav, 4B olajsav, 11. Ábra, spektrumok: 2B sztearinsav, 3A arahidinsav). A méréseket összion-áram üzemmódban végeztük, a totál ion kromatogramokat a szelektív fragmentum ionok segítségével értékeltük (14b. Táblázat). Mind az azonosítások, mind a mennyiségi meghatározások tekintetében a 14b. Táblázatban összefoglalt m/z értékeket használtuk. 56

57 9. Ábra A modell vegyületek TIC kromatogramja és tömegspektrumai: 1A 2-hidroxibenzoesav, 1B 3-hidroxi-benzoesav, 2A 4-hidroxi-benzoesav, 2B 2-hidroxifenilpropionsav, 3A 3-(3-hidroxifenil)-propionsav, 3B 3-(4-hidroxifenil)-propionsav. kcounts A 1B 2A MCounts 150 2B 3A 3B Spectrum 1A BP 267, Spectrum 2A BP 267, minutes Spectrum 3A BP 205, Spectrum 1B BP 267, Spectrum 2B BP 192, Spectrum 3B BP 179, m/z m/z m/z 57

58 10. Ábra A modell vegyületek TIC kromatogramja és tömegspektrumai: 1A kaprinsav, 1B laurinsav, 2A azelainsav, 2B mirisztinsav, 3A szebacinsav, 3B palmitolajsav, 4A palmitinsav, 4B olajsav. 0.5 MCounts 1A 15 1B 2A 2B 3A 3B 4A 4B minutes Spectrum 1A Spectrum 2A Spectrum 3A Spectrum 4A BP 117,1 BP 317,2 BP 331,2 BP 117, Spectrum 1B BP 117, Spectrum 2B BP 117, Spectrum 3B BP 129, Spectrum 4B BP 117, m/z m/z m/z m/z 58

59 11. Ábra A modell vegyületek TIC kromatogramja és tömegspektrumai: 1A dimetil-ftalát, 1B dietil-ftalát, 2A dibutil-ftalát, 2B sztearinsav, 3A arahidinsav, 3B dioktil-ftalát. 0 MCounts 1A 4 1B 2A 2B 3A 3B minutes Spectrum Spectrum 1A 1A Spectrum Spectrum 2A 2A Spectrum Spectrum 3A 3A BP 163,0 BP 149,1 BP 117, Spectrum 1B BP 149, Spectrum 2B BP 117, Spectrum 3B BP 149, m/z m/z m/z 59

60 Linearitás és reprodukálhatóság A meghatározások linearitását, a mérések reprodukálhatóságát, valamint az egyes vegyületek meghatározási határ értékét a 16. Táblázatban foglaltuk össze. A modell vegyületek válaszjeleit különbözı koncentráció tartományban mértük. Az összetevık mennyiségeit a szennyvízben várhatókhoz igazítottuk, elıvizsgálataink és irodalmi adatok alapján. A vizsgált mennyiségek 4 µg/l és 80 µg/l között voltak. A modell vegyületek válaszjeleit (16. Táblázatban) integrátor egység/pg értékben adtuk meg, két-két párhuzamos minta 3-3 injektálásának átlagait jelentik, zárójelekben a hozzájuk tartozó RSD% értékek láthatók. A 16. Táblázat 7. oszlopában az átlag értékeket a különbözı mennyiségek átlagértékeibıl számoltuk és a ezekhez tartozó RSD% értékek a 8. oszlopban láthatóak. Az adatokból kitőnik, hogy a legtöbb esetben a különbözı mennyiségő összetevıkhöz, hibahatáron belül, RSD% = 0,71-1, azonos válaszjel tartozik, vagyis a mért tartományban teljesül a linearitás feltétele. A karbamazepin és a dehidrokólsav értékelése alapjául kalibrációs görbe szolgált. További hitelesítési feltételként a meghatározási határ (limit of quantification = LOQ) és a készülék meghatározási határa (instrument limit of quantification = ILQ) értékeket használtuk. A 16.Táblázat utolsó oszlopában e két paraméterhez tartozó értékeket tüntettük fel, valamennyi vegyületnél figyelembe vettük a mennyiségi meghatározásoknál elvárt minimális jel/zaj viszonyt: j/z 10. A különbözı összetevık meghatározási határa ng/l egységben értendı, a készülék meghatározási határa 1µL injektált mennyiségre vonatkozik. Az LOQ értékek 0,92 ng/l (4-hidroxifenil-ecetsav) és 600 ng/l (dehidrokólsav), az ILQ értékek 2,45 pg/1µl (4-hidroxifenil-ecetsav) és 1600 pg/1µl (dehidrokólsav) közöttiek voltak, összetevıtıl függıen. 60

61 16.Táblázat A meghatározások linearitása (2-7. oszlop), a mérések reprodukálhatósága (8. oszlop), valamint az egyes vegyületek meghatározási határ értékei (9. oszlop), trimetilszilil (oxim) éter/észter származékokként mérve, szelektív fragmentum ionjaik alapján értékelve. Modell vegyületek Származékká alakított mennyiségek, µg/l LOQ Átlag* RSD % ng/l/injektált Integrátor egység/pg (RSD%)** pg*** Benzoesav (2,49) (1,77) (1,07) (0,91) ,53 5,5 / 14,5 Fenilecetsav (1,46) 3009 (3,62) 3076 (5,1) 3410 (0,89) ,9 5,2 / 13,9 3-Fenilpropionsav (2,29) 1260 (3,84) 1337 (4,61) 1338 (4,98) ,1 15,6 / 42 Dimetil-ftalát (12) (18) (2,78) (2,64) ,3 6,8 / 18,2 Kaprinsav (4,73) (5,9) (0,45) (2,21) ,4 2,2 / 5,9 4-Hidroxi-metilbenzoát (4,44) (2,85) (3,45) (3,89) ,99 2,2 / 5,9 Szalicilsav (15) (2,01) (0,66) (2,83) (1,75) ,34 5,8 / 15,5 Fahéjsav (3,44) (3,70) ,7 1,8 / 4,9 2,4-Diterc.-butilfenol (1,51) (1,80) (6,9) (1,37) (4,60) ,33 2,0 / 5,3 3-Hidroxi-benzoesav (7,8) (2,37) (3,21) (4,09) (5,0) ,52 1,0 / 2,67 4-Hidroxi-etilbenzoát (5,6) (6,9) (3,87) (3,36) (2,67) ,85 3,3 / 8,8 Klofibrinsav (4,41) (2,88) (2,79) (2,11) ,97 1,1 / 2,93 Dietil-ftalát (4,28) (9,0) (7,7) (6,6) ,4 22,2 / 59 Ibuprofen (7,7) (8,4) (6,0) (6,8) (3,51) ,0 1,0 / 2,67 4-Hidroxi-benzoesav (4,10) (2,18) (1,92) (1,69) (4,10) ,56 0,93 / 2,48 4-Hidroxifenil-ecetsav (2,58) (3,24) (1,90) (1,74) (1,22) ,71 0,92 / 2,45 Laurinsav (6,9) (4,27) (2,09) (1,10) ,02 18,8 / 50,1 Ftálsav (8,2) (5,8) (4,21) ,91 3,4 / 9,1 Paracetamol 6379 (6,6) 6244 (4,70)) 6312 (1,95) 6424 (1,70) 6584 (5,8) ,02 12,3 / 33 Tereftálsav (1,73) (5,1) (3,83) (1,51) ,8 3,0 / 7,9 2,5-Dihidroxi-benzoesav (2,33) (0,19) (3,03) (0,90) (3,59) ,97 1,3 / 3,47 3-(4-Hidroxifenil)-propionsav (0,45) (3,05) 46332(1,56) (3,12) (2,07) ,37 2,2 / 5,9 Vanillinsav (3,84) (2,53) (5,8) (3,61) ,33 1,8 / 4,9 Azelainsav (10) 4617 (3,78) 5481 (0,58) 6169 (1,72) ,6 18,6 / 49,7 Mirisztinsav (3,73) (2,89) (1,28) (0,67) ,60 19,9 / 53,0 Szebacinsav 6092 (8,0) (4,41) 6693 (2,41) ,2 22,0 / 58,7 Koffein (2,33) (0,19) (3,03) (0,90) (3,59) ,97 4,0 / 10,8 Gemfibrozil (1,25) (3,95) (2,59) (1,38) (2,85) ,78 2,5 / 6,70 61

62 Indolecetsav (3,11) (3,90) ,91 34,1 / 91 Dibutil-ftalát (5,9) (5,7) (5,3) ,41 6,6 / 17,6 Fenoprofen 7234 (1,51) 6633 (1,41) 6596 (1,60) 6017 (3,52) 6154 (1,96) ,89 4,9 / 13,0 Palmitolajsav 6108 (3,60) 6052 (2,54) 6177 (2,78) 6120 (4,23) 6079 (3,93) ,77 23,1 / 61,7 Palmitinsav (1,55) (3,04) (3,19) (0,25) ,61 21,1 / 56,3 Metopropol 2264 (2,86) 2258 (0,38) 2235 (2,12) 2311 (4,60) 2471 (3,98) ,.13 26,6 / 71,0 Ferulasav 7299 (4,42) 7070 (2,92) 6985 (1,73) 6961 (8,3) 7046 (3,28) ,90 12,5 / 33,2 Naproxen (5,7) (7,7) (1,64) (2,29) (1,38) ,57 1,1 / 2,93 Kávésav 29151(1,24) (2,38) (8,9) ,6 2,0 / 5,4 Propranolol 2366 (2,77) 1947 (8,9) 2182 (2,83) 2573 (0,94) 2801 (3,98) ,9 26,9 / 71,8 Olajsav 7234 (1,51) 6633 (1,41) 6596 (1,60) 6017 (3,52) 6154 (1,96) ,89 97 / 258 Ketoprofen-oxim (7,0) (0,69) (0,58) (1,17) (3,30) ,64 2,6 / 6,83 Ketoprofen (2,41) (9,8) (3,92) (6,8) (10) ,67 3,9 / 10,2 Sztearinsav (1,71) (0,53) (2,76) (6,9) ,18 22,4 / 59,6 Diklofenak (8,4) (0,50) (6,5) (0,65) (2,95) ,20 1,4 / 3,73 Karbamazepin 1768 (6,7) 2552 (3,45) 3766 (15) 4358 (9,7) - Kalibrációs görbe 23,9 / 63,8 Arahidinsav (7,2) 7370 (5,3) 7628 (1,73) 7749 (1,36) ,55 20,0 / 53,3 Fenofibrát-oxim (10) (6,5) (5,1) (7,0) (5,0) ,10 2,7 / 7,2 Fenofibrát (2,41) (9,8) 39979(3,92) 38149(6,8) (10) ,67 5,0 / 13,3 Metotrimeprazin (0,16) 3259 (14) 3121 (9,8) 3370 (7,3) ,3 10,0 / 26,7 Dioktil-ftalát (12) 50366(2,13) (10) ,33 16,1 / 43 β-ösztradiol (1,76) (0,92) (1,78) (3,09) (1,87) ,60 8,6 / 22,9 Ösztron-oxim (8,1) (4,37) (12) (6,9) ,78 87 / 231 Koleszterin (3,58) (5,3) (4,28) (1,17) ,54 10,8 / 28,7 Kólsav (6,2) (4,15) (4,18) (4,89) ,9 3,2 / 8,6 Litokólsav (7,8) 8098 (6,0) 7238 (3,50) 6596 (6,0) ,0 32,3 / 86 Kenodezoxikólsav (7,2) (7,2) (8,4) (5,0) ,3 31,5 / 84 Urzodezoxikólsav (8,6) 9980 (6,7) 9038 (5,0) 7689 (5,0) ,0 32,6 / 87 7-ketolitokólsav (12) 3689 (4,27) 4490 (1,81) 4401 (8,1) / 800 Dehidrokólsav (2,90) 847 (2,10) 1848 (5,2) 2630 (10) Kalibrációs görbe 600 / 1600 Jelölések: mint 5-9. Táblázatok, valamint, * = a különbözı koncentráció tartományok integrátor egység/pg értékeinek átlaga; ** = minden vegyület esetében két minta kélszült és minden egyes mintát 3-szor injektáltuk; a dılt betıvel jelölt értékeket kihagytuk az átlag számításából; *** = 1µL minta injektálása, a 375 µl össsztérfogatú származékká alakított oldat hígítás nélkül injektálva (ng/l: injektált pg 375); LOQ = meghatározási határ jel/zaj 10 mellett 62

63 Visszanyerési tanulmány A környezeti összetevık elemzésekor a dusítás az eljárás elengedhetetlen lépése. Az irodalom alapján megállapíthattuk, hogy a környezeti minták szennyezıinek szilárd fázisú extrakciójához a Waters-cég Oasis HLB töltete a legjobb: a szorbensek elıkészítését a fejezet 3. a) pontja, és a megkötött anyagok leoldását a fejezet 5. c) pontja szerint végeztük. Ezután megvizsgáltuk az átfolyási sebesség és a mintatérfogat hatását a visszanyerésre. A kapott eredményekbıl megállapíthattuk, hogy a visszanyerés hatásfoka független az átfolyási sebességtıl (4 ml/perc, 10 ml/perc, 14 ml/perc), valamint az 500 ml és az 1000 ml térfogatú minták esetében, a minta térfogatától is Két különbözı SPE-töltet teljesítményének összehasonlítása A sok összetevıjő elemzı rendszerünk visszanyerését 2 különbözı tölteten (Oasis HLB 200 mg, valamint, Strata-X 200 mg) modelleztük. Az extrakciót szigorúan azonos körülmények között végeztük ml elfolyó szennyvíz mintát két különbözı ph értékő (ph = 2, ph = 4) oldatból extraháltuk. A mintákhoz a vizsgált vegyületek azonos, ismert mennyiségét, 1,67-25,74 µg/l (vegyülettıl függıen) adtuk. Az oszlopok elıkészítését és a megkötött anyagok leoldását a fejezet 3. a), valamint 5. c) pontokban leírtak szerint végeztük. Az eredmények a 12. Ábrán láthatók: a világosabb színő oszlopok az Oasis HLB-n, a sötétebb színő oszlopok a Strata-X-n kapott visszanyeréseket mutatják. A kék színő oszlopok a ph = 2, a lila színő oszlopok a ph = 4 értékő oldatból mért visszanyerési értékek. A Strata-X oszlopon a visszanyerések hatásfoka ph-tól független (ph = 2 értéken 86%, RSD% = 0,84-9,2%, valamint ph = 4 értéken 86%, RSD% = 1,44-9,4%). Ugyanezen visszanyerések az Oasis HLB tölteten, különbözı ph értéken (ph = 2, ph = 4) százalékkal magasabbak voltak. Az összehasonlító eredmények szerint kitőnik, hogy - a 2,5-dihidroxi-benzoesav visszanyerése a Strata-X tölteten, mindkét ph értéken (ph = 2: 13%, ph = 4: 32%) 2-3-szor alacsonyabb volt, mint az Oasis tölteten (ph = 2: 41%, ph = 4: ). - A metoprolol ph = 4 értékő oldatokból a Strata-X tölteten 72%, az Oasis HLB tölteten 94% visszanyerést mutatott. - A 4-hidroxifenil-ecetsav visszanyerése ph = 2 és ph = 4 értékő oldatokból a Strata-X tölteten egyaránt 7, az Oasis HLB tölteten 97% volt. - A 4-hidroxi-metilbenzoátot a Strata-X töltet alkalmazásakor ph-tól függetlenül nem nyertük vissza, az Oasis HLB tölteten ph = 2 értékő oldatból a visszanyerés 99%, valamint ph = 4 értékő oldatból 107% volt. 63

64 - A propranolol esetében a Strata-X bizonyult elınyösebbnek (ph = 2: 102%, ph = 4: 88%), az Oasis HLB tölteten ph = 2 értékő oldatból nem kaptuk vissza, ph = 4 értékő oldatból a visszanyerés 101% volt. - A paracetamol visszanyerése mindösszesen ph = 4-n, Oasis HLB töltetet használva 17% volt. - A koleszterin visszanyerése a két különbözı töltet alkalmazásánál egységesen alacsony. Összességében elmondhatjuk, hogy az Oasis HLB 200mg töltet a választott vegyületek extrakciójához elınyösebb mintaelıkészítési eszköz, mint a Strata-X 200mg töltet. 12. Ábra Az Oasis-HLB és a Strata-X szilárd fázisú töltetek teljesítményének összehasonlítása, két különbözı ph alkalmazása mellett. a % Visszanyerés Oasis, ph=2 Strata-X, ph=2 Oasis, ph=4 Strata-X, ph=4 0 Benzoesav Fenilecetsav 3-Fenilpropionsav 4-OH-metilbenzoát Szalicilsav 2,4-diterc.-butilfenol 3-hidroxi-benzoesav 4-OH-etilbenzoát Klofibrinsav Ibuprofen 4-hidroxi-benzoesav 4-hidroxifenil-ecetsav Paracetamol 2,5-dihidroxi-benzoesav 3-(4-OHfenil)-propionsav 64

65 b Visszanyerés Oasis, ph=2 Strata-X, ph=2 Oasis, ph=4 Strata-X, ph=4 90 % Koffein Gemfibrozil Dibutil-ftalát Fenoprofen Metoprolol Ferulasav Naproxen Propanolol Ketoprofen Diklofenak Fenofibrát Metotrimeprazin Béta-Ösztradiol Koleszterin Kólsav Jelölések: OH = hidroxi A ph hatása a visszanyerés hatásfokára A három, különbözı ph értékő (ph = 2, ph = 4, ph = 7), ml térfogatú elfolyó szennyvíz mintát a modell vegyületek hozzáadása nélkül és a modell vegyületek hozzáadásaval (1,67-25,74 µg/l, együlettıl függıen), dúsítás után mértük. Minden esetben 3-3 párhuzamos mintát készítettünk, és minden extraktumból 3-3-t injektáltunk. A visszanyerések eredményei és a hozzá tartozó RSD% értékek a 17. Táblázatban láthatóak. A visszanyerések hatásfoka a ph = 2 értékő oldatból átlagban 92% és a ph = 4 értékő oldatból átlagban 94% volt. A ph = 7 alkalmazásakor a visszanyerések átlag értéke 82% volt. További észrevételünk, hogy a benzoesav, a benzoesav-származékok és a dikarbonsavak ph = 7 értékő oldatból nem extrahálódnak. Az átlag értékek számolásakor a zsírsavakra, a 2,5-dihidroxi-benzoesavra, a paracetamolra és a koleszterinre vonatkozó értékeket kihagytuk. A zsírsavak mindhárom ph alkalmazásakor, átlagban 6 alattiak voltak. A paracetamol és a koleszterin esetében kis visszanyerési értékeket kaptunk, amelyeket tapasztalati szorzószámmal helyesbítettünk: a mért értékeket a paracetamol és koleszterin esetében, rendre, 5,5-tel és 10-zel szoroztuk. 65

66 17. Táblázat A szennyezıanyagok visszanyerési tanulmánya, 500 ml elfolyó szennyvíz minta eltérı mennyiségek hozzáadásával (A: 0,84-12,87 µg/l, B: 1,67-25,74 µg/l, C: 3,34-42,91 µg/l, vegyülettıl függıen), három eltérı ph értékő oldatból (ph = 2, 4, 7) extrahálva, TMS (oxim) éter/észter származékokként mérve, szelektív fragmentum ionjaik alapján (Táblázat 14b.) értékelve. Visszanyerés, % Vegyület ph = 2 ph = 4 ph = 7 B A B C B Benzoesav 101 (5,9) 101 (3,77) 104 (2,03) 95 (2,38) 0 Feniecetsav 97 (9,5) 100 (4,38) 99 (5,7) 98 (5,7) 0 3-Fenilpropionsav 104 (2,59) 102 (5,2) 97 (2,90) 95 (5,5) 0 Dimetil-ftalát 109 (1,91) - 69 (4,04) - 70 (8,8) Kaprinsav 61 (7,2) - 55 (3,32) - 70 (8,6) 4-Hidroxi-metilbenzoát 99 (3,28) 96 (7,0) 107 (5,9) 106 (3,44) 100 (5,9) Szalicilsav 104 (8,6) 101 (2,35) 104 (1,49) 100 (6,3) - Fahéjsav 100 (3,93) (3,55) - 14 (4,09) 2,4-Diterc.-butilfenol 62 (4,02) 61 (5,9) 60 (6,4) 57 (6,3) 101 (1,46) 3-Hidroxi-benzoesav 101 (2,46) 98 (4,12) 101 (8,3) 91 (4,93) - 4-Hidroxi-etilbenzoát 101 (3,43) 97 (3,73) 100 (3,66) 97 (4,54) 99 (6,3) Klofibrinsav 62 (7,5) 62 (3,95) 99 (6,1) 95 (7,9) 101 (8,0) Dietil-ftalát 97 (3,36) - 71 (2,58) - 38 (9,2) Ibuprofen 98 (9,4) 100 (1,43) 92 (2,32) 102 (4,19) 101 (2,86) 4-Hidroxi-benzoesav 99 (3,44) 103 (3,20) 102 (1,72) 100 (4,12) 0 4-Hidroxifenil-ecetsav 97 (6,8) 94 (2,34) 97 (1,67) 97 (1,52) 0 Laurinsav 71 (5,8) - 70 (1,82) - 81 (5,5) Paracetamol (9,5) 19 (7,8) 42 (8,3) Tereftálsav 96 (2,76) - 99 (3,32) - 0 2,5-Dihidroxi-benzoesav 41 (7,2) 26 (7,1) 75 (3,23) 96 (8,5) 0 3-(4-Hidroxifenil)-propionsav 96 (6,4) 99 (4,93) 93 (2,90) 100 (2,98) 0 Vaníliasav 97 (1,94) (1,78) - 0 Azelainsav 97 (3,16) - 92 (2,19) - 0 Mirisztinsav 63 (6,5) - 63 (5,4) - 71 (2,50) Szebacinsav 94 (2,70) - 93 (1,52) - 0 Koffein 102 (3,54) 92 (1,35) 92 (2,51) 91 (3,37) 100 (4,61) Gemfibrozil 101 (6,0) 98 (5,3) 103 (2,34) 95 (3,21) 98 (5,4) 3-Indolecetsav 29 (7,3) - 43 (9,2) - 45 (12) Dibutil-ftalát 92 (2,15) 99 (9,1) 93 (3,14) 92 (1,91) 101 (5,5 Fenoprofen 102 (5,9) 96 (4,20) 105 (4,47) 101 (3,04) 102 (5,8) Palmitolajsav 58 (4,35) - 63 (2,05) - 68 (3,40) Palmitinsav 60 (7,2) - 52 (0,91) - 51 (2,30) Metopropol 94 (7,4) 102 (6,7) 94 (3,86) 102 (9,0) 99 (6,6) Ferulasav 76 (2,34) 102 (3,78) 95 (2,64) 104 (1,58) 28 (7,7) Naproxen 99 (5,7) 99 (1,98) 105 (0,65) 101 (2,98) 103 (5,7) Kávésav 50 (0,95) - 49 (6,8) (6,8) Propranolol (8,8) 101 (8,8) 98 (3,81) 102 (3,80) Olajsav 70 (8,1) - 65 (1,36) - 59 (1,80) Ketoprofen 94 (2,28) 97 (3,54) 101 (2,42) 103 (2,24) 93 (4,38) Sztearinsav 52 (5,4) - 42 (2,89) - 41 (3,60) 66

67 Diklofenak 98 (4,66) 101 (3,32) 103 (3,91) 105 (1,56) 99 (5,3) Karbamezapin (26) 87 (8,8) Arahidinsav 40 (10) - 35 (8,0) - 33 (5,6) Fenofibrát 70 (4,94) 99 (4,32) 97 (3,15) 103 (2,55) 68 (5,8) Metotrimeprazin 100 (5,49) 93 (3,88) 97 (2,52) 97 (7,2) 35 (4,22) β-ösztradiol 94 (4,78) 103 (1,29) 107 (1,45) 102 (3,51) 98 (6,2) Koleszterin 25 (6,2) 7 (5,7) 9 (13) 13 (7,3) 25 (10) Kólsav 94 (6,5) 105 (5,0) 99 (3,80) 114 (6,8) 94 (5,6) Litokólsav 95 (4,40) - 95 (6,3) - 96 (3,68) Kenodezoxikólsav 77 (5,9) - 77 (0,10) - 90 (3,94) Urzodezoxikólsav 89 (5,1) - 92 (3,91) - 91 (2,54) 7-ketolitokólsav 99 (7,8) - 97 (7,8) - 95 (5,0) Dehidrokólsav 104 (10) - 94 (6,8) - 97 (11) Jelölések: mint 5-9. Táblázatok, valamint 0 = nem volt visszanyerés A különbözı mennyiségek visszanyerése Az eltérı mennyiségek visszanyerését ml térfogatú elfolyó szennyvíz mintához, három különbözı mennyiségben (A: 0,84-12,87 µg/l, B: 1,67-25,74 µg/l, C: 3,34-42,91 µg/l, vegyülettıl függıen) hozzáadott modell oldattal modelleztük, minden mintából 3-3 párhuzamosat készítettünk hozzáadás nélkül és hozzáadással is. Minden egyes extraktumból 3-3-t injektáltunk. A visszanyerések hatásfoka a 17. Táblázatban látható. Az eredményekbıl kitőnik, hogy a különbözı mennyiségek visszanyerési hatásfoka egyezı: az A, a B, a C esetekben rendre 96%, 94% és 98% volt A reagens mőveleti üres és az SPE mőveleti üresek kérdése A kutatásaink során elvünk volt, hogy valós és reprodukálható adatot kizárólag mőveleti üres mérések figyelembe vételével kaphatunk. Mindezek alapján a szennyezı összetevık eredetét tisztázandó, 2-féle mőveleti üres mérést készítettünk: a) a reagens mőveleti üres mintát, amely a származékkészítésbıl és a kromatográfiás elúcióból származik, valamint, b) az SPE mőveleti üres, amely többletként jelentkezik a reagens mőveleti üreshez képest, s amely az SPE extrakcióból származik. Vizsgálataink során hét különbözı, azonos módon elıkezelt SPE oszlop (a DSC mg, az ENVI ChromP 200 mg, az Oasis HLB 200 mg, az Oasis HLB 500mg, az Oasis MAX 60 mg, az Oasis MCX 60 mg, a Strata-X 200 mg) extraktumát és a reagens mőveleti 67

68 üres mintákat elemeztünk (18. Táblázat). Minden mőveleti üres mintából 2-2 párhuzamost készítettünk és a mintákat 3-4-szer injektáltuk. A sok összetevıjő elemzı rendszerünk szennyezıi közül 11-t találtunk a mőveleti üres mintákban, a meghatározott mennyiségeket, µg/l-ben, a 18. Táblázat tartalmazza. Az eredmények összevetésébıl kitőnik, hogy a 2,4-diterc.-butilfenolt és a dioktil-ftalátot (összhangban az irodalmi tapasztalatokkal [ ]), ideértve az alifás zsírsavakat is (melyekre irodalmi utalás nincs), mind a reagens mőveleti üres mérésben (18. Táblázat), mind az SPE mőveleti üresekben jelentıs mennyiségben mértük. A mőveleti üres minták szennyezıit (18. Táblázat) szigorúan azonos kísérleti körülmények között nyertük. Kitőnik, hogy: - a 7 különbözı SPE oszlop mintáiban nagyobb mennyiségő szennyezıt mértünk, mint a megfelelı reagens mőveleti üres mintáiban. - Mindezek alapján a) megerısítettük az irodalmi adatokat [ ], b) az irodalmi adatokhoz képest tanulmányunk számszerő adatokat tartalmaz, miszerint, c) a szennyezık nagy része az extrakciós folyamatból származik. d) Jelentıs különbség az oszlopok között nincs, kivéve az ENVI ChomP oszlop extraktumában mért a 2,4-diterc.-butilfenol mennyiségét: az átlag értékhez viszonyított (3,11 µg/l) 2,3-szor nagyobb mennyiséget (7,23 µg/l) mértünk (18. Táblázat). Az eredmények bizonyítják, hogy valós és reprodukálható elemzéshez a mőveleti üresek figyelembe vétele kötelezı. Következésképp, minden minta sorozathoz SPE mőveleti üres méréseket kell készíteni, és a szennyezık mért értékeibıl le kell vonni. A választott szennyezık jelentıs részét a mőveleti üres mérések nem zavarják, ezek szennyezıcsúcsok nélkül eluálódnak. A 13. Ábrán a reagens mőveleti üres, az SPE mőveleti üres és a befolyó szennyvízbıl származó kromatogrammok, valamint a vegyületek megfelelı tömegspektrumai láthatók. A példaként bemutatott felvételekbıl, kitőnik, hogy míg a 2,4- diterc.-butilfenolt mindkét mőveleti üres tartalmazza, addig a hidroxi-benzoesavak tartományában szennyezıcsúcs nincs (12. Ábra). 68

69 18. Táblázat 11 vegyület mennyiségi meghatározása reagens mőveleti üres mintában és 7 különbözı töltetes oszlop mőveleti üres mintájában, GC-MS módszerrel mérve és szelektív fragmentum ionjaik alapján értékelve. Szennyezı anyagok Üres minták Jelölések: RSD% = 2 párhuzamos mintából és 3 egymást követı injektálásból számolva 69 Kaprinsav 2,4 Diterc.-butilfenol Laurinsav Mirisztinsav Dibutil-ftalát Palmitolajsav Palmitinsav Olajsav Sztearinsav Arahidinsav Dioktil-ftalát Reagens mőveleti üres SPE mőveleti üres DSC-18, 500 mg ENVI ChromP, 200 mg OASIS HLB, 200 mg OASIS HLB, 500 mg OASIS MAX, 60 mg OASIS MCX, 60 mg Strata-X, 200 mg Koncentráció, µg/l (RSD%) - 0,59 (4,42) 0,36 (7,7) 0,98 (2,75) 0,11 (4,77) 1,37 (5,3) 2,06 (7,8) 1,98 (9,1) 1,13 (8,9) - 4,54 (8,6) 0,094 (7,2) 2,77 (3,47) 0,15 (6,8) 0,95 (4,3) 0,20 (7,6) 1,36 (1,68) 2,73 (4,02) 2,22 (7,0) 2,03 (3,58) 0,13 (6,5) 4,98 (6,5) 0,17 (7,6) 7,23 (2,18) 0,16 (7,9) 1,02 (6,7) 0,25 (8,8) 1,47 (2,06) 3,29 (7,8) 3,31 (9,4) 2,55 (9,0) 0,31 (8,2) 5,47 (5,7) 0,16 (6,2) 3,50 (4,99) 0,17 (11) 1,02 (5,7) 0,16 (5,1) 1,41 (2,88) 3,04 (3,23) 2,39 (2,37) 1,98 (4,14) 0,16 (8,1) 5,22 (3,19) 0,16 (4,15) 2,88 (0,98) 0,19 (7,0) 1,03 (3,68) 0,15 (9,1) 1,23 (9,1) 3,27 (9,1) 2,31 (2,49) 2,30 (9,1) 0,22 (0,98) 5,05 (6,4) 0,14 (4,10) 3,15 (2,15) 0,19 (2,33) 1,24 (5,8) 0,12 (9,1) 1,41 (3,02) 3,04 (9,9) 1,88 (8,2) 1,79 (5,9) 0,12 (1,78) 4,51 (2,78) 0,19 (6,1) 3,54 (0,68) 0,13 (5,3) 0,72 (4,19) 0,14 (3,15) 1,13 (8,5) 2,59 (6,9) 1,85 (4,57) 1,82 (4,60) 0,11 (3,06) 4,63 (5,3) 0,17 (5,1) 2,91 (7,6) 0,22 (3,61) 0,80 (7,8) 0,22 (5,4) 1,24 (8,7) 3,44 (10) 2,32 (10) 2,30 (3,10) 0,19 (0,60) 3,45 (7,9) Átlag 0,15 (20) 3,11 (11) 0,17 (18) 0,97 (18) 0,18 (24) 1,32 (9,4) 3,06 (10) 2,32 (21) 2,11 (13) 0,18 (39) 4,76 (14)

70 13. Ábra A reagens mőveleti üres (a, d), az SPE mőveleti üres (b, e) és a befolyó szennyvíz (c, f) TIC kromatogramjai, a szennyezık szelektív fragmentum ionjai (14b. Táblázat) alapján értékelve, valamint a vegyületek tömegspektrumai: 1A, 1B, 2A 2,4-diterc.-butilfenol, 2B 2-hidroxi-benzoesav, 3A 3-hidroxibenzoesav, 3B 4-hidroxi-benzoesav. MCounts a MCounts b MCounts c Apex: min. Area: 4,176e+6 Apex: min. Area: 3,454e+7 Apex: min. Area: 3,401e+8 1A 1B 2A Spectrum 1A BP 263,3 MCounts d MCounts e MCounts f Apex: min. Area: 1,037e+8 2B 3A Apex: min. Area: 1,754e+8 3B Reagens mőveleti üres SPE mőveleti üres Befolyó Apex: min. Area: 2,383e minutes Spectrum 2A Spectrum 3A BP 263,5 BP 267, Spectrum 1B BP 263, Spectrum 2B BP 267, Spectrum 3B BP 267, m/z m/z m/z 70

71 5.2 Analitikai alkalmazások A napjaink szennyvíztisztítási technológiái a szennyvízbe kerülı gyógyszermaradványok eltávolítására csak részben alkalmasak, így azok jó része a különbözı befogadókba, elsısorban a felszíni vizekbe jut. A gyógyszerek egy része változatlan, másik része átalakult formákban hagyja el a szervezetet és jut/juthat a szennyvízzel a természeti vizekbe [1, 16, 40, 146], ahol nem kívánt hatásokat idézhet elı. Budapest szennyvizének mindössze 51%-a kezelt (tisztítások: fizikai, biológiai és kémiai) [147], a maradék tisztítatlanul kerül a Dunába. A Duna Budapest fölötti szakaszán, a Szentendrei szigeten, valamint a folyó jobb és bal partján lévı védett területek alkotják a fıváros északi vízbázisát. Ezek a vízbázisok parti szőréső vizet termelnek, utánpótlásukat a Duna-vizébıl nyerik. Az itt kitermelt víz fertıtlenítés után közvetlenül kerül a vízhálózatba. A Duna Budapest alatti szakaszán a Csepel-sziget, Ráckeve és Szigetszentmiklós között elhelyezkedı terület a fıváros déli vízbázisa. Itt csáposkutakból nyerik a vizet, mely különbözı vízkezelési folyamatokat (ózonos kezelés, homokszőrés, adszorpciós (aktívszén) szőrés, fertıtlenítés) követıen kerül a vízhálózatba [148]. A tanszéken, a környezeti vizek szennyezıinek elemzésére a kutatások egyrészt a Fıvárosi Csatornázási Mővekkel (11. Kép: az Észak-Pesti Szennyvíztisztító Telep, 12. Kép: a Dél-Pesti Szennyvíztisztító Telep), másrészt a Fıvárosi Vízmővekkel (13. Kép: Budapest vízbázisai, a Szentendrei-sziget és a Csepel-sziget), együttmőködés alapján indult. 11. Kép Vízmő telep 13. Kép Szentendreisziget BUDAPEST 12. Kép Duna Ráckevei-Duna km