Tanulással kapcsolatos agyterületek és agypályák vizsgálata házi csirkében (Gallus domesticus)

Átírás

1 Semmelweis Egyetem, Doktori Iskola, Idegtudományok Doktori Program Tanulással kapcsolatos agyterületek és agypályák vizsgálata házi csirkében (Gallus domesticus) Mezey Szilvia Témavezető: Dr. Csillag András, egyetemi tanár Budapest, 2003

2 Rövidítések jegyzéke... 4 Bevezetés... 6 Anatómiai áttekintés... 6 A madáragy és az emlősagy anatómiájának rövid összehasonlítása... 6 Vitatott agyterületek azonosítása madárban... 9 A nucl. accumbens... 9 A madár prefrontális kéreg Viselkedésbiológiai vonatkozások A madarak tanulása A passzív elkerüléses tanulás élettani és morfológiai alapjai A memória kialakulásának folyamata A passzív elkerüléses tanulásban érintett agyterületek Az acetilkolin tanulásban betöltött szerepéről Célkitűzések Muszkarinos és nikotinos acetilkolin receptorok kötéserősségének változásai házicsirke előagyában, passzív elkerüléses tanulás hatására Bevezetés Az acetilkolin, receptorai és kimutatásuk Az acetilkolin és receptorainak előfordulása az agyban Az acetilkolin szerepe A muszkarinos acetilkolin receptorok kötéserősségének változása passzív elkerüléses tanulás hatására korábbi eredmények Eszközök és módszerek Passzív elkerüléses tanulás Az agyak előkészítése autoradiográfiához Receptor-autoradiográfia Képelemzés Statisztikai elemzés Eredmények Nikotinos acetilkolin receptorok kötéserőssége és annak változása passzív elkerüléses tanulás hatására Muszkarinos acetilkolin receptorok kötéserőssége és annak változása passzív elkerüléses tanulás hatására Megbeszélés Összehasonlítás a korábbi eredményekkel Az acetilkolin ill. receptorainak szerepe egyéb tanulási formákban Az acetilkolin szerepe a passzív elkerüléses tanulásban Adalékok a prefrontális kéreg-ekvivalens területek meghatározásához Striatotegmentalis neuronok hodológiai és morfológiai elemzése Bevezetés Eszközök és módszerek Pályakövetés Az agyak feldolgozása

3 Perfúzió További lépések hodológiai vizsgálatok A metszetek vizsgálata a hodológiai elemzéshez A sejtfeltöltés menete Elektronmikroszkópia Eredmények Módszertani megfontolások Egyszeres retrográd pályajelöléses kísérletek Striatonigralis projekciók Striatoventrotegmentalis projekciók Kettős retrográd pályajelölések Anterográd pályajelölések Retrográd pályakövetés - egysejtfeltöltés Fénymikroszkópos elemzés Elektronmikroszkópos elemzés és posztembedding immuncitokémia Megbeszélés Hodológiai vizsgálatok A jelen és korábbi eredmények összehasonlítása A nigralis és ventrotegmentalis striatalis afferensek és efferensek topográfiájának összehasonlítása Funkcionális összefüggések A középagyi dopaminerg magokba vetítő striatalis területek neurokémiai jellemzése Utalások a striatum - SN/AVT körben történő párhuzamos jelfeldolgozásra A madár nucl. accumbens elhelyezkedésének újragondolása Evolúciós vonatkozások A striatalis projekciós neuronok morfológiája Összehasonlítás a korábbi eredményekkel A lobus parolfactorius intrinsic kapcsolatrendszere A striato-ventrotegmentalis projekciós neuronokon végződő axonterminálisok eloszlása és ultrastruktúrája Sejttestek közötti közvetlen kapcsolat Funkcionális következtetések Következtetések Köszönetnyilvánítás Összefoglalás Abstract Irodalomjegyzék Saját közlemények jegyzéke Cikkek Kivonatok

4 RÖVIDÍTÉSEK JEGYZÉKE A archistriatum; Ac nucl. accumbens; ACh acetilkolin; AChR acetilkolin receptor; AL ansa lenticularis; AVT area ventralis tegmentalis; Bas nucl. Basalis; BDA biotinilált dextrán amin (10K); BGL basalis ganglionok; αbgt α-bungarotoxin; BgT [ 3 H]-α-bungarotoxin BNST a stria terminalis bed nucleusa; CA commissura anterior; CO chiasma opticum; DA dopamin; DAB 3,3'-diamino-benzidin; DAR dorsalis archistriatum; DLP nucl. dorsolateralis posterior thalami; DMA nucl. dorsomedialis anterior thalami; DAR dorsalis archistriatum; DYN dynorphin; E ectostriatum; ENK enkephalin; EPSP serkentő posztszinaptikus potenciál; FB Fast Blue; FG fluorogold; FPL fasciculus prosencephali lateralis; GABA γ-aminobutiric acid; GCt subst. grisea centralis; G-fehérje GTP-asszociált fehérje; Glu glutamát; GLv nucl. geniculatus lateralis, pars ventralis; 4OH-GTS 3-(4-hydroxy,2- methoxybenzylidene) anabaseine; GTS-21 3-(2-methoxybenzylidene) anabaseine; HA hyperstriatum accessorium; HCl hidrogén-klorid (sósav); HD hyperstriatum dorsale; HP hippocampus; HV hyperstriatum ventrale; IMHV intermedier és medialis hyperstriatum ventrale; INP nucl. intrapeduncularis; LMD lamina medullaris dorsalis; LNEO lateralis neostriatum; LPO lobus parolfactorius; LTP long term potentiation; LY Lucifer Yellow; MeA metilantranilát; machr muszkarinos acetilkolin receptor; MNEO medialis neostriatum; 4

5 MNH medialis neostriatum / hyperstriatum ventrale; N neostriatum; nachr nikotinos acetilkolin receptor; NCAM neural cell adhesion molecule; NCLd neostriatum caudolaterale, pars dorsalis; NgCAM neural-glial cell adhesion molecule; NMDA N-metil D-aszpartát; NO nitrogén-monoxid; OPT a basalis opticus pálya magja; OT tectum opticum; PA paleostriatum augmentatum; PB foszfát puffer; PBS foszfát puffer és sóoldat; PFC prefrontális kéreg; PLTd posterolateralis telencephalon, pars dorsalis; PLTv posterolateralis telencephalon, pars ventralis; PP paleostriatum primitivum; PVT paleostriatum ventrale; RM (red microspheres) vörös mikrogyöngyök; S septum; SN substantia nigra; SNr substantia nigra, pars reticularis; SNc substantia nigra, pars compacta; SNl substantia nigra, pars lateralis; SP substance-p; SPf substance-p mező; SV2 szinaptikus vezikula fehérje 2; TeO tectum opticum; TH tirozin-hidroxiláz; Thal thalamus; TO tuberculum olfactorium; TPc nucl. tegmenti pedunculopontinus, pars compacta; TrO tractus opticus; TSM tractus septomesencephalicus; QNB [ 3 H]-quinuclidinil-benzilát; VAR ventralis archistriatum; VL ventriculus lateralis. 5

6 BEVEZETÉS ANATÓMIAI ÁTTEKINTÉS A madáragy és az emlősagy anatómiájának rövid összehasonlítása A madár- és az emlősagy felépítésének párhuzamba állítását az eddigiekben sokban gátolta a madaraknál használt elavult nevezéktan, mely sokszor még a XX. század eleji felfogásokat tükrözte (pl. azt, hogy a madáragy felfújt striatumból áll). Ezért egy madár nomenclatura fórum 2002-ben modernizálta a madáragy atlasz elnevezéseit. A következőkben ezeket az új neveket is figyelembe véve ismertetném a madáragy anatómiájának főbb vonatkozásait. A dolgozat további részében azonban részben ragaszkodtam a hagyományos elnevezésekhez. A madár- és az emlősagy között a legjelentősebb különbség az, hogy a madarak előagyában nem található meg az emlősagyban meglévő, rétegesen szerveződött kéreg, hanem viszonylag jól körülhatárolt magok alkotják. Ennek következtében az emlős és madár agyterületek párhuzamba állítása meglehetősen bonyolult feladat. Ezért is volt sokáig széleskörűen elfogadott az a téves elképzelés, hogy a madár telencephalont főként striatalis területek alkotják. Innen ered a madár előagyi struktúrák nagy részének striatumhoz kötött elnevezése (pl. neostriatum, ectostriatum). A mai felfogás szerint azonban ezen agyrégióknak csak egy része striatalis vagy pallidalis terület (pl. paleostriatum augmentatum (PA) új nevén: lateralis striatum; paleostriatum primitivum (PP) új nevén: globus pallidus; paleostriatum ventrale (PV) új nevén: ventralis pallidum), más részük tulajdonképpen pallialis struktúra, melyek funkciójuk alapján kéreg-ekvivalens területek, kapcsolatrendszerük alapján pedig akár az emlős agykéreg adott rétegeinek is megfeleltethetők (pl. hyperstriatum dorsale új nevén: hyperpallium densocellulare elsődleges látókéreg, II-III. réteg; hyperstriatum accessorium új nevén: hyperpallium accessorium másodlagos látókéreg, V-VI. réteg) (104). A basalis ganglionok a madáragyban csakúgy, mint az emlősöknél, dorsalis és 6

7 Bevezetés ventralis striatumra és pallidumra oszthatók. Az emlős striatalis komplex megfelelője a madárban a lobus parolfactorius (LPO új nevén: medialis striatum), ami a striatum dorsomedialis részét alkotja, a nucl. accumbens (Ac), a tuberculum olfactorium (TO) és a stria terminalis bed nucleusa (BNST), melyek a ventromedialis striatum részei, valamint a PA, mely a lateralis striatumot adja. A madáragyban nem elkülöníthetők az emlős nucl. caudatusnak és putamennek megfelelő területek. A PP és a PV alkotják a madarak dorsalis ill. ventralis pallidumát. (1. ábra) A madár thalamus magjainak párhuzamba állítása az emlős thalamicus magokkal még A 11.8 A ábra A basalis ganglionok (kékkel jelölve), valamint az egyik prefrontális kéreg ekvivalensként felmerülő terület, a medialis neostriatum / hyperstriatum ventrale (MNH; zölddel jelölve) elhelyezkedése a madáragyban az A 11.8, A 9.4 és az A 8.8 síkban (85). (ld. Rövidítések jegyzéke) A 8.8 7

8 Bevezetés szintén nincs lezárva. A madár diencephalon rostromedialis határát alkotó dorsalis thalamicus zóna a dorsomedialis anterior (DMA) és posterior, a dorsolateralis anterior (csak a medialis területe, ez ui. döntően vizuális mag) és posterior (DLP) magokból, a dorsointermedialis posterior magból, valamint a lateralis subhabenularis magból áll és feltehetően az emlős intralaminaris, középvonali és mediodorsalis magkomplexum megfelelője (124, 170, 172) (2. ábra). A középagyban szintén nem egyértelmű a madár és az emlős agyterületek megfeleltetése. Így nem található pl. Kuenzel és Masson csirke atlaszában (84) a tág értelemben vett basalis ganglionokhoz tartozó substantia nigra (SN) helyett a nucl. A ábra A dorsalis thalamicus zónát alkotó magok (rózsaszínnel jelölve), valamint az egyik prefrontális kéreg ekvivalensként felmerülő terület, a caudolateralis neostriatum dorsalis részének (NCLd; zölddel jelölve) elhelyezkedése a madáragyban az A 6.4 és az A 5.2 síkban (85). (ld. Rövidítések jegyzéke) A 5.8 8

9 Bevezetés A ábra A TPc (SN) és az AVT elhelyezkedése a mesencephalicus tegmentumban, az A 3.4-es síkban (sárgával jelölve) (85). (ld. Rövidítések jegyzéke) pedunculopontinus, pars compacta (TPc) van feltüntetve. Újabb felfogás szerint azonban a TPc valójában nem az emlős nucl. pedunculopontinusnak, hanem a SN-nak (A9 dopaminerg magcsoport) felel meg (122). Az emlősök nucl. pedunculopontinusanak feltételezhető madár megfelelője egy, az 1. rhombomera tegmentumaban található kolinerg sejtekből álló terület, mely egy része a Kuenzel és Hodos atlaszban (1988) nucl. profundus mesencephali, pars ventralisként van megjelölve (101). Szintén a kibővített basalis ganglionokhoz tartozik még az area ventralis tegmentalis (AVT), mely az emlős A10-es dopaminerg magcsoport megfelelője a madárban (122). (3. ábra) Vitatott agyterületek azonosítása madárban A nucl. accumbens Az Ac a használatban lévő csirkeagy atlasz szerint a ventriculus lateralis (VL) ventralis csücskénél elhelyezkedő, félkör alakú terület. Caudalisan a commissura anterior síkjától pár milliméterrel rostralisabban terjed és a VL medialis irányú íve által alkotott mélyedésben fekszik (84). Az Ac lokalizációja azonban napjainkban megkérdőjeleződött, mivel - főleg a caudalis síkokban - nem egyezik meg az emlős Ac neurokémiai és sejtmorfológiai jellemzőivel (11, 13, 124, 127, 126), sokkal inkább ráillik a BNST lateralis részének leírása (11). A medialis striatum (LPO) ventromedialis határánál, közvetlenül a VL ventralis 9

10 Bevezetés csücske mellett található egy eddig el nem különített terület, mely neurokémiailag hasonlít az emlős Ac-re, mivel az ott található tüskés projekciós neuronokban a substance-p (SP) és az enkephalin (ENK) együttesen is előfordul. Nem ismertek azonban a terület hodológiai kapcsolatai. Emlősökben az Ac reciprok kapcsolatban áll az AVT-vel, míg a ventralis striatum szomszédos területei inkább a SN-val állnak kapcsolatban. Az AVT-be érkező afferentációk kiindulási területeinek feltérképezése a madár striatumban segítené az Ac helyzetének pontosabb meghatározását. A madár prefrontális kéreg Az emlős prefrontális kéreg (PFC) szerepe a szervezetet érő külső ingerek, valamint a test belső állapotáról szóló információk összegzése és ezek alapján az adott szituációnak megfelelő viselkedés kiválasztása a fennálló lehetőségek közül. A környezeti változókra adott válaszok alapján a PFC értékeli a viselkedés eredményét és ennek megfelelően megtervezi és végrehajtatja az esetleges újabb lépéseket. Mivel a madarak intelligenciája az emlősökével vetekszik, feltételezhető, hogy rendelkeznek olyan agyterülettel, amely az emlős PFC feladatait látja el. Ezt a területet a madáragyban eddig azonban még nem sikerült kétséget kizáróan azonosítani. Kapcsolatrendszere, neurotranszmitter tartalma és - léziós kísérletekkel vizsgált - funkciója alapján két agyterületről feltételezhető, hogy madárban a PFC-nek megfelelő terület: a mediorostralis neostriatum / hyperstriatum ventrale területe (MNH) (1. ábra A 11.8 sík) (106), vagy a caudolateralis neostriatum dorsalis része (NCLd, vagy posterolateralis telencephalon, pars dorsalis, PLTd) (45, 58, 115, 123, 130, 175) (2. ábra). Egyik agyterület sem felel meg azonban teljes mértékben az emlős PFC minden ismérvének (afferentáció a dorsomedialis thalamusból és az elsődleges érzőkérgekből, dopaminerg beidegzés a mesencephalicus ventralis tegmentumból, valamint magas dopamin (DA) / noradrenalin arány), ezért feltételezhető, hogy a madár PFC nem homológja, hanem funkcionális analógja az emlős PFC-nek. VISELKEDÉSBIOLÓGIAI VONATKOZÁSOK 10

11 Bevezetés A madarak tanulása A tanulás kapcsán a házi csirkék agyának vizsgálata számos előnnyel bír az emlősök agyának vizsgálatával szemben. Fészekhagyó madár lévén, a frissen kikelt csirke már percekkel a tojásból való kibújás után mutatja a felnőtt madárra jellemző mozgás- és viselkedésformák döntő többségét. Így a naposcsibe agya fejlett, ugyanakkor a fiatal állatokra jellemzően még rendkívül képlékeny, benne a különböző külső hatások jelentős változásokat okoznak. Továbbá, miután a csirkék a tojásban a külvilágtól viszonylag elzárva fejlődnek és röviddel kikelésük után már elég önállóak a tanuláshoz, minimális környezeti behatás éri őket a vizsgálat előtt. A madarak tanulásának két legvizsgáltabb paradigmája a bevésődés (imprinting) és a passzív elkerüléses tanulás. A bevésődés jelenségét Spalding írta le először 1873-ban (156). Egyik legismertebb formája a szülői bevésődés, mely során a fiatal állatok a születésük utáni korai időszakban megtanulják felismerni szüleiket. A szülői bevésődés legkönnyebben egy meglehetősen rövid érzékeny időszak, a kritikus periódus alatt megy végbe, ennek leteltével az állat bevésődéssel már kevésbé, inkább más tanulási formák segítségével (pl. asszociációs tanulással) képes megtanulni a szülők és a fajtársak jellegzetességeit. A bevésődés gyors tanulási forma, mely során az emléknyom hosszú távra rögzül és csak nehezen törölhető ki. A tanulás és a memória rögzülésének és előhívásának folyamata, valamint az ezekkel kapcsolatos változások kutatásának laboratóriumunkban használt modellje a házi csirke passzív elkerüléses tanulása, melyet Cherkin dolgozott ki (28). E tanulási forma lényege az, hogy a madár egy kellemetlen ízű anyagba mártott tárgy egyetlen megcsípése után a tárgy vizuális jellemzőit megjegyzi, azokat társítja a rossz ízzel és a tárgyat a továbbiakban elkerüli. A passzív elkerüléses tanulás előnye, hogy gyors, könnyen reprodukálható és az állatok nagy részét érinti ( 80%). A passzív elkerüléses tanulás alapját egy természetes viselkedési forma adja, mely során a naposcsibék - bár az első egy-két napban még a szikből is képesek táplálkozni - kikelésük után azonnal elkezdenek táplálék után kutatni és környezetükben megcsipkedik és megkóstolják a különböző tárgyakat. Ugyanekkor azt is megtanulják, hogy mely dolgok ehetők és melyek nem. A bevésődéshez hasonlóan, a passzív elkerüléses tanulás esetében is létezik egy 2-7 napig tartó kritikus periódus, amikor az 11

12 Bevezetés állatok könnyebben tanulnak, mivel ekkor még kísérleteznek és aktívan megcsipkedik a környezetükben lévő tárgyakat. Ennek a fogékony időszaknak az elteltével az új dolgoktól már inkább félnek és csak a táplálékra csípnek rá, egyéb tárgyakra kevésbé. A passzív elkerüléses tanulás élettani és morfológiai alapjai A memória kialakulásának folyamata A passzív elkerüléses tanulás során a memória kialakulásának folyamata időben három, különböző élettani, biokémiai és morfológiai változásokból álló szakaszra bontható (áttekintő irodalom: 137). A rövid távú memória a tanulási folyamat beindulását követő 5-10 percen keresztül tárolja az információt és többek között emelkedett glutamát (Glu) transzmisszió (35), NMDA receptor kötéserősség növekedés (157), a GABA transzmisszió csökkenése (31), Ca ++ -beáramlás (140), retrográd szinaptikus átvitel (NO) (64) és emelkedett plazma kortikoszteronszint (142, 143) jellemzik. A közép távú memória kialakulása során a tanulást követő perces időtartam alatt beindul azon gének aktivációja (c-fos, c-jun) (9), melyek géntermékei (de novo képződött fehérjék) (49) elindítják a hosszú távú memória során bekövetkező fehérjeszintézis második hullámát (pl. NCAM és NgCAM szintézis) (50, 113, 145, 146), amely a továbbiakban alapját képezi a különböző morfológiai változások kialakulásának (növekszik a szinapszisok sűrűsége és mérete) (138, 160), melyek feltehetően a memórianyomok hosszabb ideig való tárolásának morfológiai alapját adják. A passzív elkerüléses tanulásban érintett agyterületek Az előbb említett élettani, biokémiai és morfológiai változások nemcsak időben, hanem térben is jól behatárolhatóak és arra mutatnak, hogy a passzív elkerüléses tanulás során a memória kialakulásában leginkább két előagyi régió, a pallialis eredetű, szenzoros integrációs feladatokat ellátó intermedier és medialis hyperstriatum ventrale (IMHV) és a motoros szabályozásban és limbikus működésekben is résztvevő LPO érintett. A két agyfélteke nem egyformán vesz részt a memória rögzítésében. A rövidtávú memória kialakulásának feltétele a baloldali IMHV funkcionalitása. A középtávú 12

13 Bevezetés memória rögzítésében mind a bal, mind a jobb oldali IMHV részt vesz, míg a hosszútávú memória kialakulásához a bal IMHV-nak és mindkét oldali LPO-nak működőképesnek kell lennie (54, 120; áttekintő irodalom: 53, 66). A memória kialakulása során mutatkozó különbségek a két félteke régiói között valószínűleg a két oldal eltérő funkcionalitásának tudhatók be. Ismert, hogy bal szemével (jobb agyfélteke) a madár az adott tárgynak a környezetben elfoglalt helyzetét, míg jobb szemével (bal félteke) a tárgy topográfiai jellemzőit, így annak vizuális (és az ehhez kapcsolható ízbeli) jellemzőit figyeli meg (53). Ezért várható tehát, hogy a passzív elkerüléses tanulás során a szenzoros integrációt végző bal IMHV aktívabban vesz részt a tanulásban és a memória tárolásában, mint a jobb. Az LPO esetében azonban, mely inkább a motoros és limbikus funkciókban érintett, mindkét oldal egyaránt aktiválódik a tanulás során. Az acetilkolin tanulásban betöltött szerepéről A kolinerg rendszerek szerepének felismerére a kognitív funkciókban abból a tapasztalatból származik, hogy kolinerg antagonisták adagolása ill. kolinerg magok léziója a kognitív funkciók hasonló csökkenéséhez vezet, mint ami az öregedés ill. a dementia során megfigyelhető. Az acetilkolin (ACh) szabályzó neurotranszmitter, tehát hatása nem specifikus, hanem a neuronok alap aktivitásának befolyásolásával hat azok működésére (187). Feltételezhető, hogy nem közvetlenül, hanem inkább közvetetten, egyéb, a tanulásban és a memóriában érintett neurotranszmitterek (pl. Glu, DA) ürülésének szabályozásán keresztül vesz részt a tanulási és memória folyamatokban. Ezen szabályozó hatását az ACh különböző receptorain keresztül eltérő módon fejti ki, de általános tendenciaként elmondható, hogy serkenti a figyelemmel és tanulással kapcsolatos folyamatokat (áttekintő irodalom: 14). 13

14 Bevezetés CÉLKITŰZÉSEK Jelen dolgozat témája a madarak, közelebbről a házi csirke (Gallus domesticus) azon agyrégióinak és agypályáinak vizsgálata, mely területek részt vesznek a madarak fiatal kori tanulási folyamataiban. E célból a következő kísérleteket ill. vizsgálatokat kívántuk elvégezni: Az acetilkolin passzív elhárításos tanulás során játszott szerepének feltárása receptorai (kiemelten a muszkarinos és az α-bungarotoxin-érzékeny kolinerg receptorok) kötéserősség-változásainak vizsgálatán keresztül. A madár medialis striatum finomabb felosztása a mesencephalicus tegmentumba projiciáló pályák retrográd követése alapján. A madár nucl. accumbens pontosabb lokalizációja az area ventralis tegmentalisszal fennálló ismert reciprok kapcsolat alapján. Az area ventralis tegmentalisba projiciáló medialis striatalis sejtek fény- és elektronmikroszkópos struktúrájának és kapcsolatrendszerének feltárása. A prefrontális kéreg ekvivalens területek pontosabb lokalizációja madárban. 14

15 MUSZKARINOS ÉS NIKOTINOS ACETILKOLIN RECEPTOROK KÖTÉSERŐSSÉGÉNEK VÁLTOZÁSAI HÁZICSIRKE ELŐAGYÁBAN, PASSZÍV ELKERÜLÉSES TANULÁS HATÁSÁRA BEVEZETÉS Az acetilkolin, receptorai és kimutatásuk Az acetilkolin kémiai szerkezete a 4. ábrán látható. A neuronokban kolinból és acetil-koenzim A-ból szintetizálódik. A szinaptikus résbe kijutva az ACh a kolinészteráz enzim hatására lebomlik. A kolin 4. ábra Az acetilkolin visszadiffundál az idegsejtbe, ahol újra felhasználódhat. kémiai szerkezete Miután a kolinészteráz az ACh-t rendkívül gyorsan lebontja, az ACh közvetlen kimutatása viszonylag nehéz. Helyette rendszerint az ACh szintézisében (kolin-acetil-transzferáz), sejten belüli transzportjában (vezikuláris transzporterek), lebontásában (kolinészteráz), vagy a sejtbe történő újrafelvételében (membrán transzporterek) szereplő enzimek kimutatását végzik. Az ACh kétféle receptoron keresztül fejti ki hatását. A nikotinos (nachr) és a muszkarinos (machr) ACh receptorok nevüket rájuk szelektíven ható agonistáikról, a nikotinról és a muszkarinról kapták. Az agyban található nachr-ok 5 alegységből (α2-α6, α10 és β2-β4, ill. α7-α9 alegységek hetero-, ill. homo-oligomer variációi) álló Na + -csatornák melyek aktiválódásakor a Na + a koncentráció grádiensnek megfelelően beáramlik a sejtbe (189). Az egyes alegységek 4-4 transzmembrán fehérjéből (M1-M4) épülnek fel (5. A ábra). Az ACh és antagonistáinak kötőhelyei az α - γ és α - δ alegységek érintkezési pontjainál találhatók. Az α alegységeken található még a kígyók Bungarus genusának venomjából kivonható α-bungarotoxin (αbgt) kötőhelye, mely az ACh kompetitív agonistájaként nyitott állapotban blokkolja a receptorokat. A jelen vizsgálatban elemzett 15

16 Muszkarinos és nikotinos acetilkolin receptorok kötéserősségének változásai αbgt-érzékeny nachr az α7 alegység homopentamerje és a nikotint alacsony affinitással köti meg (30, 44). A machr-ok olyan G-fehérjével kapcsolt receptorok, melyek egyetlen, 7 transzmembrán hélixből felépülő alegységből állnak (5. B ábra). Patkányban 5 gén (m1 - m5) 4 farmakológiailag különböző machr-t kódol (M1 M4) (185). A machr-ok hatása lassabban alakul ki, mint a nachr-oknak. Az M1, M3 és M5 típusú receptorok Gq fehérjével kötődnek és foszfolipáz-c aktivációján keresztül emelik az intracelluláris Ca ++ -koncentrációt, ami kinyitja a Ca ++ -érzékeny K + & Na + -csatornákat és így EPSP-t vált ki. Az M1 machr-ok szelektíven serkentik az NMDA típusú Glu receptorokat, így valószínűleg jelentős szerepük van a corticostriatalis szinapszisoknál az LTP kialakulásában és ebből következően a tanulásban. Az M2 és M4 típusú receptorok Gi fehérjékkel kötődnek és az adenilát-cikláz aktivitásának csökkentése révén, vagy a Go NH 2 A B ligandkötő helyek COO EC NH 2 VII M1 M4 IC I COO G-fehérje - kötőhelyek 5. ábra A A nachr egy alegységének vázlatos felépítése. A négy transzmembrán hélix (M1-M4) közül az M1-hez kötött amino-terminális és az M4-hez kapcsolódó karboxi-terminális extracellulárisan (EC) található. A két ligandkötő hely az amino-terminális végen helyezkedik el. B A machr vázlatos felépítése. A receptor 7 transzmembrán doménből áll (I.-VII.). A G-fehérje kötő helyek intracellulárisan, az V. és VI. transzmembrán hélix közötti aminosav láncon találhatók. 16

17 Muszkarinos és nikotinos acetilkolin receptorok kötéserősségének változásai ill. Gi fehérjéken keresztül inaktiválják a Ca ++ /K + csatornákat, így csökkentik a Ca ++ - áramot és ezzel a neurotranszmitter kiáramlást (26). A machr-ok szelektív kompetitív agonistája a harci gázként is számontartott 3-quinuclidinyl benzilát, mely az ACh-t leszorítja a receptor kötőhelyeiről, ezzel blokkolva a kolinerg hatásokat. A receptorok kötéserősségének vizsgálatára használatos egyik legelterjedtebb módszer a receptor-autoradiográfia (168). Ennek során a receptorokhoz olyan ligandokat kötnek, melyek enyhén radioaktív [H 3 ]-mal, vagy [I 125 ]-dal vannak konjugálva. Az így jelölt receptorok elhelyezkedését és arányát azután a sugárzás hatására exponálódó trícium-érzékeny filmen lehet megjeleníteni. A film exponálódásának mértékéből megállapítható és számszerűsíthető a radioaktív ligandot kötött receptorok sűrűsége. Az autoradiográfia nem a receptorok számára utal egy adott régióban, hanem az aktív, ligand kötésére képes receptorok mennyiségét jelzi. A sok, liganddal jelölt receptort tartalmazó területek felett a film erősebben exponálódik és sötétebb lesz, mint a kevesebb ligandot megkötött területeknél. Az acetilkolin és receptorainak előfordulása az agyban Az ACh a szervezetben mind a perifériás, mind a központi idegrendszerben megtalálható. Madárban számos kolinerg (kolin-acetil-transzferáz tartalmú) neuron található a diencephalonban és a mesencephalonban pl. a medialis habenulában (efferentáció a nucl. interpeduncularisba), a nucl. spiriformis medialisban, a nucl. mesencephalicus profundusban, a tectum opticumban, a nucl. isthmi pars parvicellularisban, a nucl. semilunarisban és az oculomotoros, trochlearis és trigeminalis motoros magokban (154). Ezek szinte az egész agyat beidegzik kolinerg terminálisokkal. Az előagyban kolinerg neuronok a medialis septumban és a nucl. basalisban (madárban nem azonos az emlős nucl. basalisszal, az új nevezéktan szerint nucl. basorostralis) találhatók és a kéregbe (madárban a kéreg-ekvivalens területekbe) és a hippocampusba (HP) projiciálnak. Kolinerg interneuronok legnagyobb mennyiségben a striatumban találhatók (189). A machr és nachr eloszlása alapján madárban az egész előagy kap kolinerg beidegzést. Kolinerg receptorok legsűrűbben a dorsalis archistriatumban, valamint a PA-ban és az LPO-ban fordulnak elő (39, 155). A machr-ok közül madárban eddig az M1 és az M2 eloszlását írták le. M1 machr-ok a telencephalonban legnagyobb 17

18 Muszkarinos és nikotinos acetilkolin receptorok kötéserősségének változásai mennyiségben az archistriatumban, a neostriatumban, az LPO-ban, az Ac-ben és a paleostriatumban találhatók, míg az M2 típusú receptorok sűrűsége a nucl. basalisban a legnagyobb (78). Az M2 machr-ok pre- és posztszinaptikusan is előfordulnak, míg az M1 machr-ok legfőképpen posztszinaptikusan helyezkednek el. A nachr-ok esetében a két legelterjedtebb alegység kombináció az α4β2 és az α7 (147, 174). A nachr-ok pre- és posztszinaptikusan is előfordulnak, míg az αbgt-ra érzékeny nachr-ok pre-, poszt- és extraszinaptikusan is megtalálhatók (45, 169). A striatumban található ACh egyrészt a kolinerg striatalis interneuronokból, másrészt az emlős nucl. tegmenti pedunculopontinusnak megfelelő magból vetítő gyenge pályából származik. A kolinerg striatalis interneuronok viszonylag nagy (20-50 μm), dendrittüskékkel nem rendelkező idegsejtek, melyek a striatum neuronjainak kb. 1-2%- át teszik ki. Axon- és dendritfájuk kiterjedt területekről integrálja az információt és szintén kiterjedt területekre továbbítja azt. Beidegzésük főként glutamáterg, serkentő input a kéregből és a thalamusból, valamint kevésbé jelentős dopaminerg beidegzés a SN-ból és az AVT-ből, valamint GABAerg és SP-tartalmú afferentáció a projekciós neuronok axonkollaterálisaiból. A kolinerg striatalis interneuronok axonjai a striatalis projekciós neuronok dendrittüskéin, dendritjein és sejttestjén végződnek, melyekkel szimmetrikus szinapszisokat képeznek. Mivel a kéregből jövő glutamaterg terminálisok nagyrészt a projekciós neuronok dendrittüskéinek fején szinaptizálnak, a kolinerg szinapszisok így a projekciós neuronok aktivitásának változtatásával képesek befolyásolni a kéregből jövő glutamaterg transzmisszió által kiváltott posztszinaptikus potenciálokat. A kolinerg interneuronok számos axonvaricositassal is rendelkeznek, ezért feltételezhető, hogy a kolinerg hatás nem csak transzszinaptikusan, hanem paracrin módon is közvetítődik (áttekintő irodalom: 26). Az acetilkolin szerepe Az ACh részt vesz az éberség és a REM alvási fázis szabályozásában (a nucl. pedunculopontinus kolinerg projekciói révén a formatio reticularisba és a thalamusba), a szelektív figyelem kialakításában (a basalis előagy kérgi és thalamicus kolinerg projekciói révén), valamint a mozgási (a striatalis interneurokon keresztül) és a tanulási folyamatokban az agyban (121). Hasselmo és Bower (1993) a szaglókéregben végzett vizsgálatok alapján feltételezik, hogy a tanulás során az ACh preszinaptikus szerepe az 18

19 Muszkarinos és nikotinos acetilkolin receptorok kötéserősségének változásai előagyban kettős: szelektíven elnyomja a lokális szinaptikus átvitelt, míg az afferens pályák szinapszisaira nincs hatással. Ennek következtében a memória rögzülése során a lokális kapcsolatok gátlása megakadályozza, hogy az afferens pályákon érkező új információ interferáljon a korábban tárolt memória nyomokkal. Az ACh szintjének csökkenése ezzel ellenkező hatást ér el, amely viszont a memória előhívásának kedvez. Az ACh a kéregben szabályozza a piramissejtek érzékenységét a szenzoros stimulusokra (187). A kolinerg interneuronok a striatumban a kéregből jövő glutamaterg afferentáció hatására tonikusan tüzelnek, de egy kondicionáló stimulus váratlan fellépése esetén elhallgatnak (189). Általánosságban elmondható, hogy az ACh elősegíti az adott pillanatban a viselkedés szempontjából fontos stimulusok feldolgozását (187). Az ACh közvetetten is befolyásolja a tanulást és egyéb, viselkedéssel kapcsolatos folyamatokat. Számos neurotranszmitterről ismert, hogy az ACh hatással van az axonterminálisokból történő felszabadulásukra. Így pl. preszinaptikus M2 machrokon keresztül az ACh nem csak a saját, hanem a Glu és a GABA transzmisszióját is csökkenti a striatumban (163), aminek révén gátolja a corticostriatalis LTP kialakulását. Posztszinaptikus M1 machr-okon keresztül viszont az ACh az NMDA receptorok aktivációjával elősegíti az LTP kialakulását. Az LTP-re kifejtett hatásán keresztül az ACh képes lehet a memória tárolásának szabályozására (áttekintő irodalom: 26). Az ACh a preszinaptikus nachr-okon keresztül serkenti egyéb neurotranszmitterek, pl. a Glu és a DA ürülését (3, 55, 70, 100, 179, 189). Hasonló módon, az ACh felszabadulására is hatással vannak egyéb neurotranszmitterek. Legkutatottabb ezek közül a DA, mely a striatumban kétféleképpen is hathat az ACh-ra: D1 DA receptorokon keresztül növeli az ACh felszabadulást, míg D2 receptorokon keresztül hatva csökkenti azt (1, 37, 161). A muszkarinos acetilkolin receptorok kötéserősségének változása passzív elkerüléses tanulás hatására korábbi eredmények A machr kötéserősségének emelkedését figyelte meg Rose (1980) csirke előagy homogenizátumban, 30 perccel a passzív elkerüléses tanulás után. Tíz perccel és 3 órával az elkerüléses tanulás után a machr kötéserőssége nem mutatott változást. A jelen vizsgálat kibővíti az acetilkolin receptoroknak a passzív elkerüléses tanulásban 19

20 Muszkarinos és nikotinos acetilkolin receptorok kötéserősségének változásai betöltött szerepéről Rose által leírt eredményeket azzal, hogy nem csak a muszkarinos, hanem a nikotinos AChR-ok kötéserősségét is vizsgálja. A homogenizátumok elemzésével szemben, az általunk alkalmazott receptor-autoradiográfia lehetővé teszi a receptorok kötéserősségének nagyobb feloldású mérését, mivel a bekövetkező változások az egyes agyterületekben külön-külön elemezhetők. ESZKÖZÖK ÉS MÓDSZEREK Passzív elkerüléses tanulás Összesen 31, egy napos, szexálatlan Hunnia hybrid csibét használtunk a kísérlethez. A passzív elhárításos tanulás tréningjét Stewart (1991) leírása alapján végeztük. Az állatokat párosával, ill. hármasával egymás mellé állított farekeszekbe helyeztük. Egy óra szoktatási idő után kezdtük az előtréninget, mely során az összes csibének vízbe mártott apró fémgömböt nyújtottunk be a rekeszbe, amit a csibék rendszerint megcsíptek. Ezt még kétszer megismételtük és csak azok az állatok vettek részt a kísérlet további részében, amelyek legalább két alkalommal rácsíptek a gömbre. Az előtréning alkalmat ad arra, hogy kiszűrjük azokat az egyedeket, amelyek nem akarnak, vagy nem tudnak rácsípni a gyöngyre, mivel a kísérlet későbbi részében fontos elkülöníteni a "tanult" és a kevéssé motivált, vagy beteg madarakat. A tréning során a kontroll csoport állatai (n = 16) ismét vízbe mártott gömböt kaptak, míg a "tanított" csoport (MeA-csoport) állatainak (n = 15) hasonló színű és méretű, azonban cc. metilantranilátba (MeA) mártott gömböt nyújtottunk be. Mindkét csoport állatai rácsíptek a gömbre. A MeA-csoport állatai a keserű anyaggal bevont gömb megcsípése után undor reakciót mutattak, vagyis becsukták a szemüket és fejüket rázva elhátráltak a gyöngytől. A kontroll csoport állatai nem mutattak undorreakciót a gömb megcsípése után. Harminc perccel a tanítás után végeztük a tanulás tesztjét, amely során mindkét csoport állatainak vízbe mártott gömböt nyújtottunk be. A kontroll csoport állatai ismételten megcsípték a gyöngyöt, míg a MeA-csoportban az összes állat elkerülte azt, egyes madarak még az undor reakciót is mutatták. 20

21 Muszkarinos és nikotinos acetilkolin receptorok kötéserősségének változásai Ebben a tanulási paradigmában tehát azok az állatok tanultak, amelyek emlékeznek rá, hogy a gyöngy rossz ízű és passzívan elkerülik, vagyis nem csípnek rá. (Ismert az elhárításos tanulásnak aktív formája is, mely során az állatnak aktívan el kell kerülnie a kellemetlen ingert, pl. elfutni az áramütés elől.) Az agyak előkészítése autoradiográfiához A teszt után 5 percen belül az állatokat dekapitáltuk. Az agyakat 1 percen belül eltávolítottuk, izopentán / CO 2 keverékben lefagyasztottuk, majd további felhasználásig -25 C-on tároltuk. Az agyakból kriosztáton (Leica) 10 μm vastag koronális metszeteket vágtunk, két síkban. Az egyik sík az LPO-t és a HV-t, a másik az archistriatumot, a HVt és a thalamust tartalmazta. Mindkét síkból összesen 12 metszetet vágtunk, 3-3 metszetet a muszkarinos ill. a nikotinos receptorok kötéserősségének vizsgálatához és 3-at a nem specifikus jelölés ellenőrzésére. A metszeteket poly-l-lizinnel fedett tárgylemezre tettük, szabad levegőn megszárítottuk és további feldolgozásig -25 C-on tároltuk. Receptor-autoradiográfia A metszeteket szobahőmérsékleten 30 percig előinkubáltuk 50 mmol/l koncentrációjú Tris-HCl puffer (ph 7.4) és BSA (1 mg/ml) elegyében. A machr-kat [ 3 H]-QNB-vel (QNB; 1 nmol/l, 49 Ci/mmol), a nachr-kat pedig [ 3 H]-α-bungarotoxinnal (BgT; 0.5 nmol/l, 77 Ci/mmol) jelöltük. A QNB-vel kapcsolatos lépéseket sötétkamrában végeztük. A nem specifikus kötődés megállapításához a metszeteket a machr-ok esetében atropin-szulfátban (1 μmol/l), a nachr-ok esetében pedig hideg BgT-ban (1 μmol/l) inkubáltuk. A metszeteket 1 órán keresztül inkubáltunk 26 C-on, majd 0 C-os foszfát pufferes sóoldattal (PBS) öblítettük, a machr-ok esetében 3 x 1 percig, a nachr-ok esetében pedig 3 x 5 percig. Ezután a metszeteket 0 C-os desztillált vízbe merítettük és szabad levegőn megszárítottuk. A tárgylemezeket kartonpapírra ragasztottuk, [ 3 H]-Ultrofilmmel (Amersham) letakartuk és alumínium lemezek közé szorítottuk. A filmet a machr-ok esetében 30, a nachr-ok esetében pedig 120 napig sötétben exponáltuk. Standardizálás céljából [ 3 H]-leucin-tartalmú metszetsorozatot készítettünk Unnerstall és mtsai (168) leírása alapján, amit a többi metszettel együtt 21

22 Muszkarinos és nikotinos acetilkolin receptorok kötéserősségének változásai exponáltuk. A filmeket Agfa G150 előhívóban 20 C-on 4 percig hívtuk elő, majd Ilford Hypam fixálóban fixáltuk 3 percig és 1 órán keresztül mostuk folyóvíz alatt. Képelemzés Az autoradiográfiás filmek denzitometriás elemzését Joyce-Loebl Magiscan MD képanalízis rendszerrel végeztük. Az optikai denzitást a metszetekkel együtt inkubált, ismert mennyiségű radioakív ligandot tartalmazó agyhomogenizátumok optikai denzitása alapján felállított standard görbére alapozva, fmol radioaktív ligand / mg szövet mértékegységben fejeztük ki. Agyanként összesen 15 agyterületet rajzoltunk körbe a számítógép képernyőjén mindkét agyfélteke esetében (6. ábra). Az egyes agyterületek optikai denzitását az egész mért terület átlagaként fejeztük ki. Az optikai denzitás és a radioaktivitás összefüggését standard görbén ábrázoltuk. Miután a nem specifikus kötődést vizsgáló metszetek radioaktivitása elhanyagolható volt, ezért ezeket a további elemzéseknél nem vettük figyelembe. Az egyedek közötti variancia mind a kontroll, mind a MeA-csoportban magas volt, ezért az adatokat úgy transzformáltuk, hogy minden egyes agyterület esetében a mért denzitást az adott félteke átlagos denzitásának százalékában fejeztük ki és ezt az értéket megszoroztuk az összes agy azonos hemiszfériuma denzitásának átlagával. Az így kapott értékeket átlagoltuk az agyanként mért 3 metszet esetében. A B Statisztikai elemzés Az adatokat két utas ANOVA-val elemeztük, melyben az egyik tényező a csoport (kontroll/mea), a másik a félteke volt. A szignifikancia szint p < EREDMÉNYEK A statisztikai elemzés során nem találtunk szignifikáns interakciót a csoport és a félteke között egyik kísérleti csoport esetében sem. 6. ábra Az autoradiogrammokon elemzett agyterületek. A Az LPO és a rostralis HV síkja. B Az archistriatum, a caudalis HV és a thalamus síkja. (ld. Rövidítések jegyzéke) 22

23 Muszkarinos és nikotinos acetilkolin receptorok kötéserősségének változásai Nikotinos acetilkolin receptorok kötéserőssége és annak változása passzív elkerüléses tanulás hatására A kötött BgT egyenletes eloszlást mutatott az előagyban. Viszonylag nagyobb sűrűségben az LPO-ban és a PA-ban fordult elő (7. Ábra). Passzív elkerüléses tanulás hatására az LPO-ban szignifikánsan megnövekedett a megkötött BgT mennyisége (p<0.0001; F=16.128; d.f.=1) a MeA-csoportban. (1. táblázat) A jobb féltekében szignifikánsan több BgT kötődött meg, mint a bal féltekében a dorsalis archistriatum (p < 0.008; F = 8.347; d.f. = 1) és a PP (p < 0.033; F = 5.043; d.f. = 1) területén, mind a kontroll, mind a MeA-csoportban. Muszkarinos acetilkolin receptorok kötéserőssége és annak változása passzív elkerüléses tanulás hatására 7. ábra Frontalis csirkeagy metszetekről készített eredeti autoradiogrammok a kontroll csoportból, az A A 11.6 síkból (bal oldal) és a A síkból (jobb oldal) véve, [ 3 H]-quinuklidinil benzilát vagy 23 [ 3 H]-α-bungarotoxin kötődése után. (ld. Rövidítések jegyzéke)

24 Muszkarinos és nikotinos acetilkolin receptorok kötéserősségének változásai Mindkét csoportban a QNB heterogénen kötődött a különböző előagyi régiókban: alacsony volt a kötéserősség a posterolateralis telencephalon dorsalis részén (PLTd), az ectostriatumban és a HP-ban; közepes kötéserősséget figyeltünk meg a dorsalis archistriatumban, a ventralis archistriatumban, a hyperstriatum accessoriumban, a hyperstriatum ventraleban (HV), a lateralis neostriatumban, a medialis neostriatumban, a PP-ban, a substance-p mezőben, a thalamusban és a PLTv-ben. A legmagasabb kötéserősséget az LPO-ban és a PA-ban figyeltük meg. (7. Ábra) A kötött QNB mennyisége szignifikánsan alacsonyabb volt a MeA-csoportban, mint a 1. táblázat A [ 3 H]-QNB (QNB) és a [ 3 H]-α-BgT (BgT) átlagos transzformált kötési értékei 15 előagyi területen, a kontroll csoportban (n = 16) és a MeA csoportban (n = 15), 30 perccel a passzív ízelkerüléses tanulás után. Az értékek fmol / mg szövet (átlag ± S.E.) egységben vannak kifejezve. * = szignifikáns különbség a kontroll és a MeA csoport között (P < 0.05). Agyterület QNB BgT kontroll MeA kontroll MeA Archistriatum dorsale ± ± ± ± 0.09 Archistriatum ventrale 1647 ± ± ± ± 0.04 Ectostriatum 139 ± ± ± ± 0.32 Hippocampus* 589 ± 62* 310 ± 21* 3.97 ± ± 0.10 Hyperstriatum accessorium 1540 ± ± ± ± 0.04 Hyperstriatum ventrale* ± 4375* 7713 ± 704* 4.63 ± ± 0.03 Lateralis neostriatum 1162 ± ± ± ± 0.04 Lobus parolfactorius* ± ± * 46460* 5.52 ± 0.16* 6.57 ± 0.14* Medialis neostriatum 7305 ± ± ± ± 0.05 Paleostriatum augmentatum ± ± ± ± 0.08 Paleostriatum primitivum ± ± ± ± 0.13 Posterolateralis telencephalon, p. dorsalis* 816 ± 60* 445 ± 45* 4.56 ± ± 0.04 Posterolateralis telencephalon, p. ventralis 1030 ± ± ± ± 0.06 Substance-P mező ± ± ± ± 0.09 Thalamus ± ± ± ±

25 Muszkarinos és nikotinos acetilkolin receptorok kötéserősségének változásai kontroll csoportban, a HP-ban (p < 0.001; F = ; d.f. = 1), a HV-ban (p < 0.011; F = 7.247; d.f. = 1), az LPO-ban (p < 0.012; F = 7.038; d.f. = 1) és a PLTd-ben (p < 0.004; F = 9.446; d.f. = 1). (1. táblázat). A féltekék között nem volt szignifikáns különbség a megkötött QNB mennyiségében. MEGBESZÉLÉS Harminc perccel a passzív ízelkerüléses tanulást követően, a nachr-ok kötéserőssége szignifikáns emelkedést mutatott mindkét oldali LPO-ban, míg a machr-ok kötéserőssége szignifikánsan csökkent a bal és jobb LPO-ban, HV-ban, HP-ban és a PLTd-ben. Összehasonlítás a korábbi eredményekkel Rose és munkatársai (1980) korábbi eredményeivel ellentétben, a muszkarinos receptorok kötéserőssége a jelen vizsgálatban csökkent a passzív ízelkerüléses tanulás hatására a MeA csoportban. Az eltérés oka feltehetően a két vizsgálatban alkalmazott különböző módszereknek tudható be. Rose és mtsai a receptorok kötéserősségét homogenizált látólebeny és előagyi készítményekben vizsgálták, így együtt elemezték a passzív elkerüléses tanulásban résztvevő, ill. nem érintett agyterületeket. A jelen vizsgálatban alkalmazott receptor-autoradiográfia azonban lehetővé tette az egyes agyterületek külön-külön történő elemzését, így az adott területeken bekövetkező változások jól elkülöníthetők voltak. A madarak tanulását minden esetben teszteltük a további feldolgozás előtt, míg Rose és mtsai ezt nem tették meg. Ezért tehát elképzelhető, hogy Rose és mtsai a tanított csoport madarai között olyan madarak agyában is elemezték a muszkarinos receptorok kötéserősségét, amelyek valójában nem tanultak. A mi esetünkben viszont fennáll annak a lehetősége, hogy az általunk megfigyelt változások valójában nem a tanulás, hanem a memórianyomok előhívása során végbemenő folyamatok hatására következtek be. Bullock és mtsai (1987) a kolinerg szinaptikus vezikuláris marker SV2 titerének szignifikáns emelkedését írták le 2 órával a passzív elkerüléses tanulás után a jobb PAban és medialis HV-ban. Huszonnégy órával a tanulás után pedig az SV2 titerének csökkenését mutatták ki a baloldali PA-ban, valamint az ACh koncentrációjának 25

26 Muszkarinos és nikotinos acetilkolin receptorok kötéserősségének változásai csökkenését a jobb LPO-ban és a bal PA-ban. A tanulás tesztjét ebben a kísérletben is 30 perccel a tanulás után, közvetlenül az agyak eltávolítása előtt végezték el. Az acetilkolin ill. receptorainak szerepe egyéb tanulási formákban A madarak másik korai tanulási formája, a szülői bevésődés során Bradley és Horn (1981) nem mutattak ki különbséget a muszkarinos receptorok kötéserősségében az alul- és a túltréningezett madarak között. Ez azonban nem meglepő, hiszen a bevésődés számos egyéb szempontból is jelentősen különbözik a passzív elkerüléses tanulástól, mint pl. abban, hogy a bevésődés esetében a denritek és szinapszisok sűrűsége nem változik a tanulás során (17, 65), míg a passzív elkerüléses tanulás során nő (119, 160), a GABAerg transzmisszió az elkerüléses tanulással szemben nem csökken (31), hanem nő (98), valamint a bevésődés során nem mutatható ki a passzív elkerüléses tanulásban szerepet játszó retrográd NO transzmisszió élénkülése sem (64, 4) (áttekintő irodalom: 66, 97, 137). Emberben, patkányban és majomban a nikotin bizonyítottan javítja a kognitív funkciókat, mint pl. a munkamemóriát és a figyelmet (20, 90, 139). Szelektív α7 nachr agonisták adagolásával (pl. anabazein-rokon analógok, ARR17779) javítható a munkamemória, még a fimbria-fornix átvágás következtében csökkent emlékezőképességű állatokban is (10, 88, 108, 110). Akut nikotin adagolással javítható a teljesítmény számos tanulási paradigmában, mint pl. a passzív elhárításos tanulás (18, 183), Morris vízi útvesztő (151) és a késleltetett párosítási feladatok (19, 20, 47). Az utóbbi években a BgT-érzékeny nachr-ok szelektív részleges agonistái (GTS-21 és 4OH-GTS-21) a gyógyszerkutatások előterébe kerültek (108), mivel intracelluláris Ca ++ -függő transzdukciós mechanizmusok serkentésén keresztül javítják a memóriát, valamint neuroprotektív szereppel is rendelkeznek (91, 110), mely tulajdonságok rendkívül előnyösek lehetnek az Alzheimer-kór kezelésénél (75). A machr-ok kevésbé egyértelmű szerepet töltenek be a tanulásban. Azok a patkányok, amelyek centralis amygdalájában több machr-t expresszáló sejt volt, hosszabb ideig maradtak mozdulatlanok passzív elhárításos tanulás során, mint azok, amelyeknél kevesebb machr-t expresszáló sejtet figyeltek meg. Aktív elhárításos tanulás során azonban a machr-t expresszáló neuronok száma a centralis amygdalában 26

27 Muszkarinos és nikotinos acetilkolin receptorok kötéserősségének változásai negatívan korrelált a korrekt elkerülések számával (188). Téri tanulást (egér) vagy pislogási reflex kondicionálást (nyúl) követően a HP CA1 régiójában a piramis neuronok machr immunreaktivitása nőtt, míg az interneuronoké csökkent (184, 186). Passzív elhárításos tanulást követően patkányoknál a neocortexben nőtt az AChR immunreaktivitás a II.-III. és V. rétegben (185). Itt lényeges megjegyezni, hogy a machr-ok immunreaktivitása nem utal közvetlenül azok aktivitására. Az előbb említett vizsgálatokban használt M35 antitest ugyanis csak akkor képes a receptorhoz kötődni, ha annak epitopja ép és szabad. Az említett kísérletek szerzői szerint valószínűleg a már internalizált receptorok jelölhetők antitestekkel és ez a módszer így inkább csak a receptorváltozások relatív elemzésére alkalmas (187). Bár a jelen vizsgálatban használt receptor-autoradiográfia felbontása jelentősen kisebb, mint az immuncitokémiáé (ahol az egyes jelölt sejtek is megfigyelhetők), közvetlenül az aktív receptorokat jelöli, így pontosabb képet ad a tanulás során bekövetkező kolinerg változásokról. Az acetilkolin szerepe a passzív elkerüléses tanulásban A jelen vizsgálat és Bullock és mtsai (1987) eredményei egymást kiegészítik a tanulás során történő kolinerg hatások időbeli változásainak elemzésében. Jelen vizsgálat szerint, 30 perccel a passzív elkerüléses tanulás után a nachr-ok kötéserőssége emelkedik, míg a machr-ok kötéserőssége csökken. Mivel a kísérlet során az αbgt-ra érzékeny nachr-ok kötéserősségének vizsgálatára fókuszáltunk és egyéb nachr-ok esetleges változásairól nem áll rendelkezésre irodalmi adat, ezért azok itt nem kerülnek tárgyalásra. Az α7 nachr-ok kötéserősségének jelen vizsgálatban megfigyelt emelkedése a medialis striatumban egybeesik a D1 DA receptorok kötéserősségének növekedésével az LPO-ban passzív elkerüléses tanulást követően (159). A dopaminerg terminálisokon található preszinaptikus nachr-ok serkentően hatnak a DA ürülésére (179, 189), ezért feltételezhető, hogy a passzív elkerüléses tanulás során az α7 nachr-ok kötéserősségének emelkedése a DA transzmisszióra serkentőleg hat, amire a D1 DA receptorok kötéserősségének növekedése is utal. A D1 receptorokon keresztül ható, nigrostriatalis és ventrotegmento-striatalis DA emeli a striatalis projekciós neuronok serkenthetőségét (40), ami elősegítheti a tanulást a passzív elkerüléses tanulás során. 27

28 Muszkarinos és nikotinos acetilkolin receptorok kötéserősségének változásai Mivel azonban a DA is serkentőleg hat az ACh ürülésére (1, 37, 161), elképzelhető az is, hogy pontosan a DA az, amelynek hatására a D1 receptorokon keresztül hatva emelkedik az ACh és így közvetve a nachr-ok kötéserőssége. Annak eldöntésére, hogy a két elmélet közül melyik áll a kötéserősség változások mögött, részletes receptor-kinetikai vizsgálatok lennének szükségesek. A machr-ok kötéserősségének csökkenése az LPO-ban, HP-ban, HV-ban és PLTdben az aktív receptorok számának csökkenésére ( down-regulation ) utal. A machrok agonista (pl. carbachol) hatására konformáció változáson mennek keresztül, mely következtében csökken a receptor effektor kötődés, amit akár 5-10 percen belül a receptorok internalizációja követ (áttekintő irodalom: 185). Az acetilkolin szintjének feltételezhető emelkedése a passzív elkerüléses tanulás során tehát ebben az esetben a receptorok kötéserősségének csökkenésével jár. Az SV2 titerének emelkedése 2 órával a tanulás után arra utal, hogy növekszik a kolinerg vezikulák mennyisége, mivel az ACh az oldható formából valószínűleg átalakul vezikuláris formába (22). Ekkor a kolinerg hatás feltehetően még mindig aktív. Huszonnégy órával a tanulást követően mind a kolinerg vezikuláknak, mind magának az ACh-nak a mennyisége alacsonyabb, mint kontroll állatokban, mivel a kolinerg hatás eddigre már valószínűleg lecsengett (22). Adalékok a prefrontális kéreg-ekvivalens területek meghatározásához A PLTd (az NCLd-vel részben átfed) funkciója, elhelyezkedése és kapcsolatrendszere alapján az egyik lehetséges olyan terület, amely az emlős PFC megfelelője lehet (38, 42, 45, 58, 115, 130, 175, áttekintő irodalom: 123). A PFC anatómiai ismérveinek nagyrészt eleget tesz: pallialis afferenseinek jelentős része szekunder szenzoros területekről érkezik (81, 87), erős dopaminerg beidegzést kap a mesencephalicus tegmentum dopaminerg magjaiból, noradrenerg beidegzése azonban kevésbé jelentős (45), így a DA / noradrenalin arány magas (41, 42). Abban azonban nem egyezik meg az emlős PFC-vel, hogy thalamicus beidegzését nem a dorsomedialis thalamusból, hanem a thalamus dorsolateralis posterior magjából (DLP) kapja (87). A DLP valószínűleg az emlős thalamicus centralis lateralis, paracentralis és parafascicularis magoknak felel meg. 28