Filogenetikai vizsgálatok védett puhatestûeken

Átírás

1 Filogenetikai vizsgálatok védett puhatestûeken Fehér Zoltán, Varga András, Deli Tamás, Domokos Tamás, Szabó Krisztián, Bozsó Miklós és Pénzes Zsolt A hazai Mollusca-fauna általános képe A Kárpát-medence, illetve a történelmi Magyarország puhatestû-fajok elterjedésmintázatán alapuló elsõ állatföldrajzi felosztása Soós Lajos nevéhez fûzõdik (1. ábra). Bár azóta a figyelembe vett fajkészlet rendszertani megítélése valamelyest átértékelõdött és a rendelkezésre álló elterjedési adatbázis is jelentõsen bõvült, ez a felosztás alapvetõen máig érvényben maradt. Soós az egykori Magyarország területét három régióhoz sorolta: a központi medencét a Pannonicumhoz (I.), a Kárpátok és az Erdélyi-szigethegység területét a Carpathicumhoz (II.), a Szávától délre esõ hegyvidéket pedig az Illyricumhoz (III.). E felosztás szerint a mai Magyarországból az Északiközéphegység a Carpathicum része, a többi a Pannonicumé. Soós a Carpathicumot öt, a Pannonicumot három alrégióra bontotta: Északi-Kárpátok (II.1), Keleti-Kárpátok (II.2), Erdélyi-szigethegység (II.3.), Bánság (II.4.), Erdélyimedence (II.5.), illetve Alföld (beleértve a Kisalföldet is) (I.1.), Dunántúli-középhegység (I.2.), és Nyugat-Dunántúl 1. ábra A Kárpát-medence állatföldrajzi felosztása Soós szerint. Alpokalja (Praenoricum) (I.3). A legújabb kutatási eredmények tükrében indokolt az Alföldet tovább bontani, és a Nyugat-Dunántúl analógiájára a Kárpátokkal érintkezõ erdõsült peremterületeit is (mint Praecarpathicum), illetve a Mecseket és a Dráva-síkot is (mint Praeillyricum) külön alrégióként kezelni. A Carpathicumra jellemzõ az erdõlakó endemizmusok, továbbá a mészkõterületeken különösen a Déli-Kárpátokban a sziklalakó endemizmusok nagy száma. Bár az Északi-középhegység a Carpathicum többi részéhez képest fajszámban is és a szûk elterjedésû endemizmusok arányában is elmarad, mégis ez hazánk malakofaunisztikai szempontból legdiverzebb területe. Erdõlakó faunája kárpáti elemekben bõvelkedik, az országban egyedül itt fordulnak elû olyan kárpáti endemizmusok, mint a Spelaeodiscus triarius, a Macrogastra borealis bielzi, a Cochlodina cerata, a Vestia gulo, a Vestia turgida, a Cellariopsis deubeli (korábbi nevén Oxychilus orientalis), a Lozekia transsylvanica, a Petasina bakowskii, a Trichia lubomirskii és a Faustina faustina, vagy olyan szélesebb elterjedésû, de a Kárpátokra is jellemzõ erdõlakó fajok, mint a Vertigo substriata, a Discus ruderatus, a Cochlodina orthostoma, a Ruthenica filograna, vagy a forráslakó Bythinella austriaca. Külön ki kell emelnünk a kizárólag a Bükkben és a Gömör-Tornai-karszt területén elõforduló Bythinella pannonica (korábbi nevén Sadleriana pannonica) fajt, mert állományai mintegy 70%-ban magyar területen találhatók. A Pannonicumon belül a szûkebb értelemben vett Alföld faunája a legkevésbé jellegzetes, kevés faja van feltûnõen alacsony a szárazföldi tüdõscsigafajok száma, és azok is leginkább széles elterjedés? és széles ökológiai toleranciájú, generalista fajok. Bár a Kisalföldet nem szokás különválasztani az Alföldtõl, a Szigetköz külön említést érdemel. A viszonylagos fajgazdagság, a csak ott elõforduló nyugati kapcsolatú fajok (Aegopinella nitens, Trichia striolata) és a szûk elterjedésû szigetközi endemizmus, a Bythiospeum oshanovae révén a Szigetköznek 1

2 A KÁRPÁT-MEDENCE ÁLLATVILÁGÁNAK KIALAKULÁSA az Alföldtõl kissé eltérõ, egyéni jellege van. A Dunántúliközéphegység fajkészlete az alföldi generalistákon túl kiegészül általános közép-európai lomberdei fajokkal, de az Északi-középhegységre jellemzõ kárpáti elemek teljesen hiányoznak belõle. A szintén külön alrégióként kezelt peremterületek közül a Nyugat-Dunántúl (Praenoricum) jellegét olyan nyugati kapcsolatú színezõelemek határozzák meg, mint az Aegopis verticillus vagy az Urticicola umbrosus, a Soproni-hegységben (Pagodulina pagodula altilis, Cochlodina fimbriata, Macrogastra densestriata) és a Kõszegi-hegységben (Pseudofusulus varians) különösen erõsen érzõdik az alpi hatás. A Mecsek és a Dráva-sík külön alrégióként (Praeillyricum) való elkülönítését jellegzetesen balkáni fajok (Amphimelania holandri, Platyla banatica, Pomatias rivulare, Truncatellina callicratis, Petasina filicina, Trichia erjaveci, Faustina illyrica) egész sora indokolja. A terület különlegessége a mecseki karszt résvizeiben endemikus forráscsiga, a Bythiospeum hungaricum. A Praecarpathicumhoz sorolt területeken (a Szatmár- Beregi síkon, a Nyírségben, a Körösök és a Maros egykori árterein fennmaradt keményfás ligeterdõkben) olyan kárpáti fajok élnek, mint a Monachoides vicinus, a Balea stabilis, a Bielzia coerulans, a Perforatella dibothrion, a Drobacia banatica vagy a Kovacsia kovacsi. Ez utóbbi fajt korábban pannon endemizmusnak gondolták, ámde éppen az alábbiakban részletes ismertetésre kerülõ faunisztikai és molekuláris taxonómiai kutatások eredményeként ma már a Pannonicumba átnyúló szigethegységi endemizmusnak tartjuk. Bár kiderült, hogy nem kizárólag magyar területen fordul elõ, a faj konzervációbiológiai jelentõsége megmaradt, hiszen még mindig Magyarországról ismert állományainak nagyobbik része. A fent említett két Bythiospeum mellett a Pannonicumnak további két endemikus faja van, mindkettõ a teljes kipusztulás által erõsen fenyegetett reliktum-endemizmus. Az egyik a püspökfürdõi (Románia, Bihar megye) meleg vizû forrástóban élõ Melanopsis parreyssii, a másik a Theodoxus prevostianus, amellyel természetvédelmi jelentõsége miatt az alábbiakban részletesen foglalkozunk. A hazai puhatestû-fauna zömmel széles elterjedésû, európai, palearktikus és holarktikus fajokból álló, de kárpáti, illír, alpi és mõziai elemek által gazdagon és sajátos módon színezett fauna. Értékét a jelentõs részben vagy kizárólag hazánk területén elõforduló endemikus fajok (Bythiospeum hungaricum, Bythiospeum oshanovae, Theodoxus prevostianus, Bythinella pannonica, Kovacsia kovacsi) mellett azok az Európai Unió egészét tekintve kis areájú, ritka vagy sérülékeny fajok adják (pl. Theodoxus danubialis, Theodoxus transversalis, Anisus vorticulus, Vertigo moulinsiana, Vertigo angustior, Helix lutescens, Unio crassus stb.), amelyeknek nálunk még stabil állományai vannak. Ezeknek a fajoknak és élõhelyeiknek a megõrzésével kapcsolatban a hazai természetvédelme kiemelt felelõsség hárul. A molekuláris filogenetikai és filogeográfiai vizsgálatok természetvédelmi vonatkozásai Az elmúlt néhány évben a molekuláris módszerek új távlatokat nyitottak a taxonómiában és a filogeográfiában, a DNS-szekvenciák vizsgálatával az inter- és intraspecifikus diverzitás egy új szintjének vizsgálata vált lehetõvé. Számos példa van arra, hogy a molekuláris eredmények tükrében egyes fajok vagy magasabb taxonómiai egységek addig elfogadott rendszere gyökeresen átértékelõdött. Voltak olyan esetek, amikor morfológiailag egységesnek látszó fajokon belül mélyen szétvált génvonalak (monofiletikus leszármazási sorok) vagy akár kriptikus fajok létezésére derült fény, más esetekben meg éppen ellenkezõleg, morfológiailag vagy ökológiai igényét tekintve különbözõ, és ezért korábban külön fajként kezelt populációk bizonyultak közeli rokonoknak. Miután a biológiai diverzitáshoz a morfológiailag nem különbözõ, de genetikailag mélyen szétvált, önálló génvonalak éppen úgy hozzájárulnak, mint a morfológiailag is elkülönülõ formák, ezért indokolt önálló konzervációbiológiai entitásként (conservation unit) kezelni õket, különösen akkor, ha önálló areával is rendelkeznek. Az elméleti jelentõségén túl tehát a természetvédelmi prioritások objektív kijelöléséhez és a megalapozott természetvédelmi ajánlások megfogalmazásához is elengedhetetlen, hogy minél pontosabban ismerjük az egyes fajok elterjedését, morfológiáját, biotóppreferenciáját, õstörténetét, rendszertani kapcsolatait és genetikai diverzitását. Vizsgálatunk tárgyául két, a hazai természetvédelem szempontjából kiemelt jelentõségû fajt, a Kovacsia kovacsit (dobozi pikkelyescsiga) és a Theodoxus prevostianust (fekete bödöncsiga) választottuk. A Kovacsia kovacsi filogenetikai kapcsolatait a közeli rokon Lozekia transsylvanica (erdélyi pikkelyescsiga) és Lozekia deubeli (Deubelpikkelyescsiga) fajokéval összefüggésben vizsgáltuk. Elsõsorban a pannon endemizmusnak gondolt Kovacsia kovacsi kárpáti eredetével kapcsolatos sejtésünket szerettük volna igazolni, ezen túlmenõen a következõ kérdésekre kerestük a választ: Hol helyezkedik el a három faj a Hygromiinae alcsalád rendszerében? Milyen a Lozekia/ Kovacsia fajok legvalószínûbb elterjedéstörténete, hol lehetett az õsi formák elterjedési területe, hogyan és mikor alakulhatott ki a jelenlegi elterjedésmintázat? Milyen filogenetikai kapcsolat van a Lozekia transsylvanica északiközéphegységbeli és erdélyi populációi között? Eltérnek-e oly mértékben a Lozekia transsylvanica hazai állományai az erdélyi állományoktól, hogy indokolt lenne azokat önálló konzervációbiológiai entitásként kezelni? Ezek alapján hogyan változik a vizsgált fajok konzervációbiológiai megítélése és a velük kapcsolatos természetvédelmi prioritások? A Theodoxus prevostianus speciális biotóppreferenciája miatt különösen érzékeny az élõhely megváltozására, sok populációja pusztult ki emiatt az elmúlt évtizedek során, és az egyetlen megmaradt hazai populációjának hely- 2

3 Filogenetikai vizsgálatok védett puhatestûeken zete sem megnyugtató. Ritkasága és sérülékenysége miatt ez a legveszélyeztetettebb vízicsigánk. Molekuláris taxonómiai vizsgálatának vannak már elõzményei, Paul Bunje három (Bad Vöslau, Bad Fischau, Kács) T. prevostianus populáció és több észak-olaszországi, ausztriai és magyarországi T. danubialis (rajzos bödöncsiga) populáció mitokondriális citokróm-oxidáz I. alegység (COI) génjét vizsgálva nemrégiben arra a meglepõ következtetésre jutott, hogy a két faj nem kölcsönösen monofiletikus (reciprocal monophyly). Ezt azzal magyarázta, hogy az ausztriai és a magyarországi T. prevostianus populációk csak a T. danubialisból különbözõ idõpontokban, egymástól függetlenül levált vonalak, amelyek morfológiai hasonlósága csak a hasonló ökológiai körülményekre adott válaszként és nem igazi rokonságként értelmezendõ. Ha ezt elfogadnánk, akkor a továbbiakban az egész danubialis/prevostianus csoportot egységes fajként és azon belül a prevostianus formát önálló taxonómiai státus nélküli ökológiai változatként kellene kezelnünk. Ez pedig, túl azon, hogy alaposan felforgatná a genus jelenleg elfogadott rendszerét, két védett fajról lévén szó, gyakorlati természetvédelmi problémákat is felvetne. Emiatt döntöttünk úgy, hogy Bunje vizsgálatát további populációkból származó minták és egy további gén (nukleáris 28S) bevonásával és hagyományos morfológiai vizsgálatokkal kiegészítve megismételjük. Célunk az volt, hogy megpróbáljuk jobban feltárni a Theodoxus prevostianus és a Theodoxus danubialis filogenetikai kapcsolatrendszerét, hogy ésszerû alternatív magyarázatot keressünk a két faj parafiletikusságára, hogy felvázoljuk a két faj legvalószínûbb elterjedéstörténetét, és hogy eldöntsük, változik-e mindezek következtében a Theodoxusok eddigi rendszere, és változnak-e a velük kapcsolatos természetvédelmi prioritások. A Theodoxus prevostianus/ danubialis csoport A Theodoxus prevostianus pannon endemizmus, ismert elõfordulásai a Pannon-medence peremterületein, a Tisza, a Száva illetve a Duna vízgyûjtõterületén találhatók (2. ábra). Magyarországon néhány évtizeddel ezelõtt még több helyen élt Tata: Fényes-források, Tóváros, Angolkert; Sály: Latori-vízfõ, Kácsfürdõ; Miskolctapolca: fürdõ; Diósgyõr: vár tövében fakadó forrás; Budapest: Rómaifürdõ mára a kácsi kivételével az összes hazai állománya kipusztult. A faj típuslelõhelye a Bécsi-medence peremén fekvõ Bad Vöslau, itt és a közeli Bad Fischauban még stabil populációi élnek. Egykori Zágráb környéki lelõhelyeirõl (Velika, Podsused, Ivanec Bistranski) a szlovéniai Bušeca vas termálforrását kivéve mind eltûnt. Egykor élt a Bihar megyei Püspökfürdõn, ott néhány száz évvel ezelõtt halt ki, ma már csak fosszilis és szubfosszilis héjait találhatjuk meg ott. A szintén Bihar megyei Robogány hõforrás kifolyóiban ma is él még, azonban az ottani élõhelye annyira degradálódott, hogy ez a populációja is hamarosan el fog tûnni. Frivaldszky Imre szerint a 19. század közepén még lehetett gyûjteni a Margitsziget tövénél, a Duna medrében fakadó hõforrásokban, amelyek csak nagyon alacsony vízállás esetén kerültek felszínre. Ezt a helyet késõbb beépítették, bizonyító példányok hiányában Frivaldszky adata ma már ellenõrizhetetlen. Ezzel együtt érdekes lenne, ha egykor magában a Dunában is élt volna ez a faj. Vannak még olyan irodalmi adatai Bélai-mészalpok, Drechselhäuschen, 1600 m; Kelemen-havasok, Secu-torok; Bosznia, Sabljari, amelyeket késõbb nem sikerült megerõsíteni, illetve olyanok Dobrudzsa, Ak-Bunar, amelyekrõl bebizonyosodott hogy másik fajra (Theodoxus fluviatilis) vonatkoztak. A Theodoxus prevostianus testvérfaja, a Theodoxus danubialis nagyobb területen elterjedt folyami faj (2. ábra). Elsõsorban a Duna vízrendszerére jellemzõ, emellett a Fekete-tenger vízgyûjtõjén más folyókban, így a Bugban, a Dnyeperben és a Dnyeszterben, valamint észak-adriai folyókban (Pó, Piave, Adige) és tavakban (pl. Garda, Idro, Iseo) is elõfordul, sõt a Kaszpi-tenger medencéjébõl is jelzik elõfordulását. A Dunában Kelheimtõl a deltáig él, évtizedekkel ezelõtt az egész szakaszon igen gyakori volt, ám mára a szennyezés és talán a Theodoxus fluviatilis elõretörése következtében erõsen megritkult. A Duna mellékfolyóiban a Bécsi-medencétõl fordul elõ, leszámítva néhány kisebb patakot (Perschling-Mühlbach, Schöner Wasser), a Lajta az elsõ jobb oldali, a Morava meg az elsõ bal oldali mellékfolyó, amelyben elõfordul. Innen lefelé szinte az összes jelentõs jobb oldali mellékfolyóban megtalálható (Dráva, Száva, Velika Morava, Timok, Ogosta, Iskar, Vit, Jantra, Rusenski Lom, Zlatna Panega), a bal oldaliak közül az Északi-Kárpátokból érkezõ Vágban, Garamban, Nyitrában, Ipolyban, és a Déli-Kárpátok felõl jövõ Karasban és Nérában él csak, viszont a Nérától Elterjedés 2. ábra A Theodoxus danubialis és a Theodoxus prevostianus fajok fõbb kládjainak elterjedése az általunk gyûjtött minták (négyzetek) és GenBank adatok (körök) alapján. Üres szimbólum: T. danubialis, teli szimbólum: T. prevostianus. 3

4 A KÁRPÁT-MEDENCE ÁLLATVILÁGÁNAK KIALAKULÁSA a deltáig a többi bal oldali mellékfolyóból nem ismert. A faj elterjedését vizsgálva szembetûnõ, hogy a mellékfolyók többségébe nem hatol be kilométernél meszszebbre, kivételt ez alól a Nyugat-Balkán folyórendszerei képeznek; a Szávában közel 900 km-es szakaszon egészen Kranjig él, egyúttal messze felhatol a Száva összes jelentõsebb mellékfolyójába is (Krka, Kupa, Una, Vrbas, Bosna, Lašva, Drina, Lim). Messze elterjedt a Velika Morava, illetve a Dráva rendszerében, elõbbinél eléri a Nišavát, utóbbinál a Murát és a Kerkát is. Tulajdonképpen a Dráva vízrendszerénél kell említeni a Zala folyóban élõ állományait is, hiszen a Zala a Balaton holocénkori kialakulása elõtt szintén a Dráva vízrendszeréhez tartozott. A Tiszából és mellékfolyóiból teljesen hiányzik, ami azért különösen szembetûnõ, mert a hasonló élõhelyet igénylõ Theodoxus transversalis több helyen is elõfordul, vagy legalábbis nemrég még elõfordult a Tisza vízgyûjtõjén (Felsõ-Tisza, Bódva, Hernád, Szamos, Maros, Aranyos). A danubialis/prevostianus formakör legkorábban a felsõ pliocén rétegekben (>1,8-2,4 millió év) jelent meg a Kárpát-medencében (Újvidék, Kravarsko, Püspökfürdõ). Az alsó pleisztocénben már az egész Pannon-medencében igen elterjedt volt az a forma, amit hol serratilinea, hol fluviatilis parreysi, hol danubialis pannonicus, hol prevostianus néven említ az irodalom. A ma elfogadott álláspont szerint ez az õs-prevostianus valamiféle átmeneti forma volt a mai prevostianus és danubialis között. A fosszilis leletek elnevezése körüli zûrzavart az okozta, hogy kezdetben túl nagy jelentõséget tulajdonítottak a héj mintázatának, késõbb Kormos felismerte hogy az eltérõ színnek és rajzolatnak ezen a fajon semmi elkülönítõ értékük nincs. Ha igaz, hogy még a Theodoxus serratiliformis és a Theodoxus cantianus is ide tartozik, akkor ez az alakkör egykor igen széles területen, Angliától (Swanscombe) Hollandián és Dél-Németországon keresztül Lengyelországig, az Al-Dunáig (Nagornoje), sõt a Kaszpi-medencéig (Baku) terjedt el. Azután, mintegy 600 ezer évvel ezelõtt ez az õs-prevostianus hirtelen eltûnt a Pannon-medence folyóiból fiatalabb fosszíliái csak hõforrások mésztufáiból maradtak fent (Eger, Tata, Szomód, Vértesszõlõs, Rontó, Püspökfürdõ, Epöl) és már csak a holocén rétegekben bukkan fel a mai danubialishoz hasonló forma. Morfológia A tipikus Theodoxus danubialis héja félgömb vagy féltojás alakú, hosszúsága mm között változik, tekercse alacsony, csúcsa tompa. Héja finoman vonalkázott, 21/2-23/4 kanyarulatból áll, az utolsó kanyarulat felsõ részén többé-kevésbé szögletes váll fut végig (3-4. és 11. ábra). A Száva és a Dráva vízrendszerében élõ populációira egészen karakterisztikus válltaraj a jellemzõ, ezt a formát T. danubialis stragulatus néven külön alfajként is szokták kezelni (5-10. ábra). A szájadék külsõ szára ívesen hajlott, a válltarajnál szögletesen megtörik. A héj alapszíne rendesen világossárga vagy zöldesszürke, amelyet sötétbarna vagy lila, éles szélû, zegzugos vagy hullámos harántvonalak díszítenek, de kis számban találhatunk egyszínû sötétszürke vagy fekete példányokat is (10. és 12. ábra). A Theodoxus prevostianus általában kisebb termetû, szabályos félgömb vagy kissé megnyúltabb alakú, a héja szabálytalanul, néha erõsen vonalkázott. Színe és rajzolata változó. Recens populációi többnyire egyszínû, fényes fekete példányokból állnak ( ábra), melyek között csak elvétve fordulnak elõ egyszínû lila vagy zegzugos vonalakkal díszített példányok (23. ábra). Tatán ezzel szemben egyszínû lila illetve lila alapon fehér foltokkal, vagy fehér zegzugos harántvonalakkal díszített példányok éltek ( ábra), nagyon hasonlóak a püspökfürdõi fosszilis példányokhoz ( ábra). A Tatáról Rómaifürdõre áttelepített állatok ( ábra) utódai néhány tucatnyi nemzedék alatt nagyon megváltoztak, jórészt elvesztették mintázatukat, és egyszínû feketék, vagy sötétszürkék lettek. A pleisztocén folyami leletekben többségben vannak a zegzugos mintázatúak, de egyszínû lila példányok is elõfordulnak ( ábra). A genuson belül a szájfedõ felépítése általában fajspecifikus, ezért a fajok elválasztására alkalmasabb, mint a héjmorfológia. A T. danubialis és a T. prevostianus fajok operculuma mindössze annyiban tér el, hogy a T. prevostianus operculumának belsõ oldalán az oszlop tövében található apofizismaradvány gyengébben fejlett, mint a tipikus T. danubialisnál. A nagyfokú hasonlóság egyértelmûen közeli rokonságukat bizonyítja. Ráadásul az apofízis erõteljes visszafejlõdése megfigyelhetõ egyes T. danubialis populációknál is, így a szájfedõ morfológiája alapján nem különíthetõ el biztosan a két faj. A T. transversalistól eltekintve az európai Theodoxus fajok raduláinak eléggé egyöntetû a felépítése, ennek ellenére a két szóban forgó faj radulája között annyi eltérés mutatkozik, hogy a T. prevostianus belsõ laterális foga valamivel keskenyebb, ám ez a bélyeg sem annyira stabil, hogy a két faj biztos elválasztásához alkalmas legyen. A két faj héj-, szájfedõ- és radulamorfológiája tehát mindössze annyit igazol, hogy közeli rokon fajokról van szó, de sem a két faj kölcsönös monofiletikussága mellett, sem ellene nem hoz fel megdönthetetlen bizonyítékokat. Filogenetika Egy nemrég elvégzett felmérés szerint a vezetõ zootaxonómiai folyóiratokban 1990 és 2002 között publikált filogenetikai fáknak mintegy 23%-a volt parafiletikus. Ha feltételezzük, hogy a nehezen interpretálható eredmények egy részét nem is publikálták, akkor a parafiletikus fák tényleges aránya még ennél is magasabb lehet. A parafiletikusság lehetséges okai közül a vizsgált fajok helytelen rendszertani besorolása Bunje magyarázata a Theodoxus prevostianus esetére csupán az egyik. Szilárd alapokon nyugvó, stabil morfológiai bélyegek egész sorával alátámasztott rendszereknél is elõfordulhat, hogy egyik-másik gén alapján felállított filogenetikai fa (gén-fa) 4

5 Filogenetikai vizsgálatok védett puhatestûeken ábra Theodoxus danubialis. 3-4: Budapest, Duna; 5-6: Karlovac, Kupa; 7-10: Cate, Száva; 11-12: Gamzigrad, Crni Timok ábra Theodoxus prevostianus : Kácsfürdõ; 16: Bušeca vas; 17-18: Budapest, Rómaifürdõ; 19-22: Püspökfürdõ (fosszilis, holocén); 23: Bad Fischau; 24-28: Szabadhídvég (fosszilis, alsó pleisztocén); 29-31: Nagornoje, Al-Duna (fosszilis, alsó pleisztocén); 32-35: Tata. (Mérce = 5 mm). 5

6 A KÁRPÁT-MEDENCE ÁLLATVILÁGÁNAK KIALAKULÁSA parafiletikus. Minden egyes génnek saját evolúciós története van, és nem mindegyiké tükrözi a csoport tényleges filogenetikáját, azaz a valódi törzsfát. Az ilyen parafiletikus gén-fák leggyakoribb oka a fajok közti hibridizációkor létrejövõ introgresszió, illetve a génvonalak tökéletlen szétválása (incomplete lineage sorting) szokott lenni. A két ok között nem könnyû különbséget tenni, de mivel a mitokondriális gének általában hajlamosabbak az introgresszióra, mint a magi gének, és mivel kisebb effektív populációméretük miatt a mitokondriális génvonalak kiesése gyorsabb a magi génekénél, a nukleáris és a mitokondriális gén-fák együttes vizsgálata általában jobb támpontot ad a kérdés eldöntéséhez, mintha csak mitokondriális gén-fákat vizsgálnánk. Ezért néhány kiválasztott populációnál együtt vizsgáltuk a mitokondriális COI és a nukleáris 28S gént. Bár a maximum parszimónia módszerrel felépített 28S fa több tekintetben is eltér a mitokondriális COI-fától, abban konszenzus van közöttük, hogy a T. prevostianus és a T. danubialis közeli rokon testvérfajok, és hogy a két faj legközelebbi rokona a T. fluviatilis (36. ábra). Miként azt Bunje is kimutatta, a COI gén alapján a két faj nem kölcsönösen monofiletikus. A 28S gén azonban túl konzervatív ahhoz, hogy a fajok között különbséget tudjon kimutatni, ennélfogva a továbbiakban csak a COI-szekvenciákra támaszkodtunk a parafiletikusság okának keresésekor. A rendelkezésünkre álló danubialis és prevostianus COI-szekvenciák alapján nemcsak hagyományos kladogramokat szerkesztettünk, de medián-összekötõ módszerrel haplotípus-hálózatot is (37. ábra). A hagyományos módszerekkel szerkesztett filogenetikai fák definíció szerint dichotomikus szerkezetûek, ahol a vizsgált szekvenciák (Operational Taxonomical Unit, OTU) kizárólag a kladogram végsõ szögpontjaiban (az ágak végén) helyezkedhetnek el, a belsõ szögpontok pedig a feltételezett kihalt õsöket (Hypothetical Taxonomical Unit, HTU) reprezentálják. A haplotípus-hálózatok ezzel szemben tartalmazhatnak többszörös elágazásokat, és megengedik, hogy egyes megfigyelt haplotípusok belsõ szögpontokba kerüljenek, céljuk a teljes leszármazási sort vizsgáló hagyományos filogenetikai módszerekkel szemben a recens génáramlás, a közeli rokon kapcsolatok és intraspecifikus leszármazási viszonyok leírása. Ezért a danubialis/prevostianus fajcsoporton belüli finomabb kapcsolatok feltárásakor elsõsorban a haplotípus-hálózat eredményeit, míg a fajszintû kapcsolatok vizsgálatához és a gyökér helyzetének a megállapításához elsõsorban a hagyományos kladogramok topológiáját vettük figyelembe. A hálózat megszerkesztése után a haplotípusokat Templeton-féle algoritmussal több lépésben magasabb szintû csoportokká (kládokká) vontuk össze, az elsõ lépésben kialakított kládok jelölése 1-x, a második lépésben 36. ábra 28S és COI gének alapján maximum parszimónia módszerrel készült Theodoxus filogenetikai fák. Egymással szemben azonos populációkhoz tartozó génpárok vannak ábrázolva, az indeleket 5. bázis -ként tekintettük. A COI génre két, azonos topológiájú, a 28S génre három, eltérõ topológiájú fa adódott a leginkább támogatottnak. Ez utóbbiak közül a konszenzus-fával egyezõ topológiájút ábrázoltuk. T. transversalis TT1/TT23: Rábahídvég, Rába; TT2/TTB01: Szendrõ, Bódva; T. fluviatilis F54/TF23: Albánia, Bajram Curri, Valbonë; F34/TFP06: Paks, Duna; T. prevostianus TPA2/TPV02: Ausztria, Bad Vöslau; TPA1/TPB01: Ausztria, Bad Fischau; TPK/TP1: Kács; TPR/TPR01: Románia, Robogány; T. danubialis TDI/TD1: Ipolydamásd, Ipoly; TDKZ/TDK02: Kehidakustány, Zala; T. varius TFV/TF01: Albánia, Qeparo; GenBank adatok: T. fluviatilis AF120633/DQ279975: Spanyolország, Mallorca; Nerita funiculata DQ093517/DQ

7 Filogenetikai vizsgálatok védett puhatestûeken kialakítottaké 2-x, stb. A késõbbiekben az egyszerûség kedvéért többnyire az összevont kládokra hivatkozunk. A hálózat központi eleme az mv1 jelû mediánvektor, amelyrõl feltételezhetõ, hogy egy egykor létezett, de mára kihalt haplotípus. Ettõl a közös õstõl a kácsi prevostianus klád (2-7) hat, a robogányi prevostianus klád (2-7) egy, és a két legnagyobb areájú danubialis klád (2-1 és 2-2) központi haplotípusai szintén egy-egy mutációs lépésnyire vannak. A hálózat két hosszabb ága közül az egyik tizenöt mutációs lépésben kapcsolja az ausztriai prevostianus kládot (2-6) vagy az mv1 vagy a TDD1 haplotípusokhoz. A másik hosszú ág a TDI haplotípust hét lépésben köti össze az mv4 mediánvektorral, amely további két lépésre van a 2-3, illetve öt lépésre van a 2-4 kládtól. A haplotípus-hálózat az evolúció irányáról nem hordoz információt (gyökértelen), tehát ez alapján nem derül ki, hogy melyek az õsibb és melyek a leszármazott szekvenciák. Bunje feltételezése szerint az ausztriai prevostianus klád válhatott el leghamarabb a többitõl, ebben az esetben a haplotípus-hálózatban a gyökér a 2-6 és a 2-1 kládok közé esne (37. ábra: r1). Bunje hipotézisének teszteléséhez maximum parszimónia, valamint órafüggõ (constrained) és órafüggetlen (unconstrained) Bayes-analízissel hagyományos kladogramokat szerkesztettünk, és külcsoportok (T. fluviatilis, T. transversalis) bevonásával határoztuk meg a gyökér helyzetét. Bunje hipotézisét egyik módszer sem igazolta, az órafüggetlen Bayes-analízis 0%, az órafüggõ Bayes-analízis 36% poszterior valószínûséget rendelt hozzá. Minden esetben a P- és D-kládok közt volt a legbazálisabb szétválás (37. ábra: r2). A parszimónia és az órafüggõ Bayes-analízis olyan topológiát valószínûsítenek (38A. ábra), ahol a P-kládból elõször leválik az ausztriai prevostianus, azután pedig a kácsi prevostianus vonal, az órafüggetlen Bayes-analízis viszont a P-klád szétválását politómikusnak mutatja (38B. ábra). Nem szabad szem elõl tévesztenünk azt, hogy a hagyományos filogenetikai módszerek szigorúan dichotómiára épülnek, ha tehát a Bayes-analízis konszenzusfája valahol politómikus, az nem feltétlenül a radiáció jele, mindössze annyit jelent, hogy a módszer ott nem volt képes feltárni a tényleges leszármazási sorrendet. Mégis, a haplotípus-hálózat szerkezetét is figyelembe véve, azt gondoljuk, hogy itt ténylegesen radiációról van szó, tehát a P-klád génvonalai mind ugyanabból az egykor szélesen elterjedt, de mára kihalt közös õsbõl, az mv1 haplotípusból jöttek létre. A haplotípus-hálózatban egy hurok (loop) miatt nem egyértelmû, hogy a 2-8 klád közvetlenül az mv1 haplotípusból, vagy pedig a TDKZ haplotípusból ered, illetve az is, hogy ez a klád monofiletikus-e egyáltalán. A Bayesanalízissel szerkesztett fa a 2-8 kládot ugyan parafiletikusnak mutatja, de miután a három haplotípus szintopikusan fordul elõ, valószínûbb, hogy mindhárman ugyanattól a közös õstõl származnak. A 2-1 és 2-2 jelû danubialis kládok egymással vikarizálva nagy területen terjedtek el. Miután a 2-8 haplotípusai a 2-1 klád areáján belül egy szûk területen fordulnak csak elõ, valószínûtlen, hogy a két nagy klád közös õsének (mv1) egy harmadik független leszármazott vonalát képviselnék, sokkal valószínûbb, hogy a 2-1 kládból származnak. Egy másik hurok miatt az ausztriai prevostianus klád (2-6) eredete bizonytalan, ugyanis a medián összekötõ algoritmus ugyanakkora valószínûséggel kapcsolja ezt a kládot az mv1 és a TDD1 haplotípusokhoz. A Bayes-analízissel szerkesztett fa a 2-6 kládot a TDD1 haplotípushoz teszi a legközelebb, viszont a TDD1 haplotípusról az elterjedése alapján az feltételezhetõ, hogy a szávai klád area expanziója során a Drina vízrendszerében alakult ki a szélesebb elterjedésû TDKZ haplotípusból, ezért aligha van köze az ausztriai prevos- 37. ábra Medián összekötõ módszerrel készült haplotípus-hálózat T. danubialis (fehér körök) és T. prevostianus (fekete körök) COI-szekvenciák alapján. A fekete-fehér szimbólum a két fajban közösen elõforduló haplotípust jelöli. A szimbólumok átmérõje arányos a haplotípusok megfigyelt elterjedési területével. A legkisebb körök a hiányzó vagy kihalt haplotípusokat, az összekötõ vonalak az egyes mutációs lépéseket jelölik. A hurkok feloldása miatt a szaggatott vonalakkal jelölt mutációkat a további analíziseknél nem vettük figyelembe. A nem-szinoním mutációkat vastag vonalakkal, a gyökér lehetséges pozícióit (r1, r2) nyilakkal jelöltük. A haplotípusok csoportosítása több lépésben, a Templeton-féle algoritmus alkalmazásával történt, az ábrán csak a szövegben is szereplõ csoportokat tüntettük fel. 7

8 A KÁRPÁT-MEDENCE ÁLLATVILÁGÁNAK KIALAKULÁSA 38. ábra T. danubialis/t. prevostianus fajcsoport órafüggõ (A) és órafüggetlen (B) Bayes-analízissel felállított COI-fái. A két fán ugyanazok a haplotípusok vannak egymással szemben ábrázolva. A szétválások idõpontjának becslése (1. táblázat) az órafüggõ fa alapján történt. A külcsoportként használt többi Theodoxus faj nincs ábrázolva. tianus-populációkhoz. A két hurok feloldásakor tehát elsõsorban az elterjedési és gyakorisági adatokat vettük figyelembe (37. ábra). Az órafüggetlen Bayes-analízissel szerkesztett kladogram és a haplotípus-hálózat topológiája közötti legkomolyabb ellentmondás a TDI haplotípus helyzete. Ha ugyanis a gyökér a P- és a D-kládok közti ágon van, akkor a haplotípus-hálózat topológiája szerint a TDI lenne a P-klád legõsibb haplotípusa. Mivel ez nemcsak a 39. ábra A T. danubialis/t. prevostianus fajcsoport haplotípus-hálózatának és órafüggetlen Bayes-analízissel szerkesztett filogenetikai fájának konszenzusaként (vö. 37. és 38. ábra) kialakított törzsfái, amikor introgresszió (A), illetve a vonalak tökéletlen szétválása (B) a P-klád szintjén jelentkezõ parafiletikusság feltételezett oka. A fa csúcsai a haplotípus-összevonás során létrejött kládokat reprezentálják, a feltételezett introgressziókat szaggatott vonal jelöli. Bayes-analízis által valószínûsített filogenetikai fával van ellentmondásban, hanem azzal az empirikusan kialakított szabállyal is, mely szerint a több mutációs kapcsolattal rendelkezõ haplotípus az õsibb, azt valószínûsítjük, hogy a TDI haplotípus is az mv1 leszármazottja, a hálózatbeli pozícióját pedig homopláziával (pl. reverz mutáció) próbáljuk magyarázni. Mindezeket összegezve az tûnik a legvalószínûbbnek, hogy a T. prevostianus és a T. danubialis közös õse (õs-prevostianus) D- és P-kládokra vált szét, ezután a D-klád 2-3 és 2-4 kládokra, a P-klád pedig 2-1, 2-2, 2-5, 2-6 és 2-7 kládokra hasadt tovább (39. ábra). A 2-8 klád vélhetõen ugyanúgy a 2-1 klád legbazálisabb helyzetû haplotípusából (TDKZ) alakult ki, mint a 2-1 klád többi haplotípusa. A filogenetikai fa egyrészt parafiletikus a 2-8 klád szintjén, itt a TDPB haplotípus két danubialis, illetve egy hozzájuk földrajzilag igen közel esõ prevostianus populációból egyaránt kimutatható. Amikor két faj szimpatrikus populációiból kimutatható ugyanaz a földrajzilag jól behatárolt elterjedésû mitokondriális haplotípus, az a közelmúltban lezajlott introgresszió legbiztosabb jele szokott lenni. A Krka folyóban élõ danubialisok könnyen kapcsolatba kerülhetnek a Bušeca vasi forrásban élõ prevostianus-populációval, hiszen a forrás a folyótól mindössze néhány száz méterre fakad. Jó okkal feltételezhetjük, hogy az történt, hogy egy TDPB haplotípust hordozó danubialis feljutott a forrásba, a danubialis-gén introgresszióval átjutott a prevostianus-populációba, ahol elterjedt, és felváltotta az eredeti prevostianus-gént. A filoge- 8

9 Filogenetikai vizsgálatok védett puhatestûeken netikai fa másik pontján (P-klád) jelentkezõ parafiletikusság eredete már kevésbé egyértelmû. Közeli rokon fajokról lévén szó, nem hagyhatjuk figyelmen kívül azt a lehetõséget, hogy a parafiletikus gén-fa a vonalak tökéletlen szétválására vezethetõ vissza. Ebben az esetben azt kellene feltételeznünk, hogy a két faj szétválása késõbb történt az mv1 és mv4 haplotípusok radiációjánál, és a danubialis fajban ezért lehetnek jelen még együtt a P- és a D-klád vonalai. Viszont ez azt is jelentené, hogy az általunk prevostianusnak tartott vonalak is már azelõtt szétváltak, mint hogy a prevostianus faj kialakult volna, ami elég nehezen interpretálható, hacsak nem úgy, hogy három önálló faj komplexével állunk szemben (39B. ábra). Mitokondriális génrõl lévén szó, az introgresszió valószínûbb magyarázatnak tûnik, különösen azután, hogy a 2-8 klád kapcsán beigazolódott, hogy a két faj kontaktzónájában ilyesmi könnyen megtörténhet. Ez esetben ugyanaz a haplotípus (mv1), amelyik a prevostianus három önálló vonalának a közös õse is egyben, átkerülhetett a danubialisba, és ott két önálló vonalon fejlõdött tovább (39A. ábra). Filogeográfia A prevostianus földrajzilag izolált állományai genetikailag is elkülönülnek, Robogányban a 2-7, Bad Vöslauban és Bad Fischauban a 2-6, Kácson a 2-5 klád haplotípusai fordulnak elõ. A danubialisok közül az észak-adriai vízgyûjtõn a 2-4 klád terjedt el. A Dráva és a Száva vízgyûjtõjén a 2-1, illetve annak areáján belül egy kisebb területen, de vele szintopikusan az 1-4 klád él, a Dunában és a vízrendszerének többi folyójában a 2-2 és annak areáján belül vele szintopikusan az 1-3 fordul elõ. Az 1-3 és 1-4 kládok haplotípusai ritkábbak, ezért nem kizárt, hogy areájuk ténylegesen nagyobb, mint amekkorának az eddigi gyûjtések alapján látszanak (2. ábra). Ahhoz, hogy az egyes filogenetikai eseményeket idõben is el tudjuk helyezni, a szétválások idõpontjának ismeretére lenne szükségünk. Bunje már végzett ilyen becsléseket az egész genusra, õ a ma élõ Theodoxusok közös õsét (the Most Recent Common Ancestor, tmrca) millió évvel ezelõttre teszi, szerinte a legbazálisabb helyzetû transversalis már ekkor elvált a többi Theodoxustól, a minket leginkább érdeklõ danubialis/prevostianus vonalon belüli elsõ szétválás pedig mintegy 2-4 millió évvel ezelõtt volt. Bunje az idõbecsléséhez a prevostianus-fluviatilis szétválást vette kalibrációs pontnak. Azt feltételezte ugyanis, hogy az õs-prevostianus a Pannon-tó lefûzõdésekor, mintegy 12 millió évvel ezelõtt vált el a fluviatilis õsétõl, és a danubialis/prevostianus vonal innentõl kezdve evolválódott önállóan a Pannon-tóban. Azonban, mint láttuk, a rendelkezésre álló fosszilis leletek ezt a feltételezést egyáltalán nem támasztják alá. A Pannon-tóban nem élt prevostianus, így akármikor vált is szét a fluviatilistól, ez az esemény nem kalibrálható a Pannon-tó lefûzõdéséhez. Ennek következtében teljesen új idõbecslésre volt szükségünk, amihez új kalibrációs pontot kellett keresnünk. Mindössze egyetlen olyan szétválást találtunk, amely valamilyen paleogeográfiai eseményhez biztosan köthetõ volt, a T. fluviatilis észak-európai kládjának a radiációját. Az Észak-Európában elõforduló T. fluviatilis egyedek többsége egy a GenBank-ban F3-ként jelölt haplotípushoz tartozik, ezen kívül van még több ritkább, az F3- ból származtatható haplotípus, melyek attól egy vagy két nukleotidban térnek el. Az F3 haplotípus Észak-Olaszországban is elõfordul, a többiek elterjedése viszont csak egy-egy szûkebb Észak-Európán belüli területre korlátozódik. Ezek után kézenfekvõ a feltételezés, hogy az eredetileg észak-itáliai F3 haplotípus kolonizálta a faj északeurópai areáját, a többi észak-európai haplotípus pedig helyben alakult ki. Miután a T. fluviatilis csak a Würm eljegesedést követõen, a holocénben jelent meg Észak- Európában, az F3 vonal radiációja is legfeljebb évre vagy annál korábbra tehetõ. A fõbb szétválások idejét órafüggõ Bayes-analízissel becsültük, amihez a rendelkezésre álló valamennyi T. prevostianus, T. danubialis, T. transversalis és T. fluviatilis szekvenciát felhasználtuk. Miután korábban már arra a következtetésre jutottunk, hogy az órafüggõ Bayes-analízis a 2-6 kládot valószínûleg mert ezen a vonalon lényegesen magasabb ráta érvényesült rossz helyre teszi, a 2-6 kládra vonatkozó becsléseket figyelmen kívül hagytuk. A T. fluviatilis észak-európai kládjának radiációját évre kalibrálva 28,6%/millió éves rátát kaptunk, ami lényegesen magasabb, mint a fehérjekódoló mitokondriális géneknél általában feltételezett 1-2,5%-os szubsztitúciós ráta. Az irodalomban számos példa ismert, amikor a rövid idõintervallumon belül megfigyelhetõ mutációs ráta egy vagy akár két nagyságrenddel is meghaladja a hosszú idõtávon ható szubsztitúciós rátát. Anélkül, hogy a jelenség részleteibe belemennénk, feltételezzük, hogy ez esetben is errõl lehet szó. Egyetlen kalibrációs pontunk tehát csak az idõben hozzá hasonlóan közeli események meghatározására alkalmas. Az idõben távolabbi események becslésekor kénytelenek voltunk irodalomból vett fix szubsztitúciós rátákat (1%, 1,5% és 2,23%) alkalmazni priorként, emiatt a becsült szétválási idõket kritikával kell fogadnunk, és csak óvatos következtetéseket vonhatunk le (1. táblázat). A recens elterjedési adatok, a fosszilis leletek és az idõbecslés alapján a Theodoxus prevostianus és T. danubialis fajok kialakulásával és pannon-medencei õstörténetével kapcsolatban az alábbi hipotézist állítottuk fel. Véleményünk szerint a T. prevostianus és T. danubialis fajok õse (az õs-prevostianus) legközelebbi rokonától, a T. fluviatilistól csak mintegy 2,2-5 millió évvel vált szét, ez a szétválás sem idõben, sem térben nem köthetõ a Pannon-tó kialakulásához. Az eredetileg sós vizû Pannon-tó a miocén során fokozatosan feltöltõdött és kiédesedett, a pliocén elejére már csak a medence déli, mintegy 1/4-részét borító ún. Szlavón-beltó maradt meg belõle, amely akkor már teljesen édesvízû volt. Valamikor a pliocén során az addig lefolyástalan Pannon-medence az õs-duna révén újra öszszeköttetésbe került a Fekete-tenger medencéjével, a felsõ 9

10 A KÁRPÁT-MEDENCE ÁLLATVILÁGÁNAK KIALAKULÁSA pliocénre (1,8-2,4 millió évvel ezelõtt) pedig már olyan fluvio-lakusztrikus rendszer volt a Szlavón-beltó helyén, amelyiknek a rendesen áramló szakaszait tipikus folyóvízi fauna népesítette be. A fosszilis leletek tanúsága szerint az õs-prevostianus akárcsak a transversalis nagyjából ez idõ tájt érkezett a Pannon-medencébe. Az õs-prevostianus két nagy kládjának szétválását valamikor 1-2,3 millió évvel ezelõttre, tehát az alsó pleisztocén idejére becsüljük. Fosszilis leletek hiányában csak feltételezhetjük, hogy peripatrikus fragmentáció játszódhatott le; a nagy területen elterjedt P-kládtól (=szûkebb értelemben vett prevostianus) izolálódott egy vonal (D-klád=szûkebb értelemben vett danubialis), amely ettõl kezdve önállóan fejlõdött tovább. Az a terület, ahol a D-klád izolálódott, lehetett akár a Balkán északnyugati részén a Száva vízrendszere is, de korántsem biztos, hogy a Pannon-medencében kell keresnünk ezt a helyet, hisz ne felejtsük el, hogy az õs-prevostianus alakkör akkoriban Angliától egészen a Kaszpimedencéig elterjedt volt. Figyelemre méltó, hogy a pannonmedencei leletekben már az alsó pleisztocéntõl kezdve 1. táblázat A Theodoxus genusz és azon belül a prevostianus-danubialis csoport fõbb filogenetikai eseményeinek becsült ideje [millió év, my] és azok 95%-os konfidencia intervalluma. A becslés COI gén szekvenciák alapján, órafüggõ Bayes analízissel (strict-clock model) történt. A B C D E transversalis többi ( ) 4.68 ( ) 6.98 ( ) ( ) ( ) Theodoxus szétválása fluviatilis õs ( ) 2.23 ( ) 3.25 ( ) 5.13 ( ) ( ) prevostianus szétválása õs-prevostianus: ( ) 0.98 ( ) 1.42 ( ) 2.26 ( ) 5.38 ( ) D-klád P-klád szétválása P-klád: 2-6 többi ( ) 0.88 ( ) 1.37 ( ) 2.00 ( ) 4.82 ( ) klád szétválása* P-klád: 2-5 többi ( ) 0.39 ( ) 0.58 ( ) 0.92 ( ) 2.28 ( ) klád szétválása P-klád: ( ) 0.28 ( ) 0.45 ( ) 0.71 ( ) 1.67 ( ) kládok szétválása P-klád: a 2-2 kládon ( ) 0.09 ( ) 0.15 ( ) 0.23 ( ) 0.53 ( ) belüli radiáció P-klád: a 2-6 kládon ( ) 0.09 ( ) 0.13 ( ) 0.23 ( ) 0.49 ( ) belüli radiáció P-klád: a 2-5 kládon ( ) 0.04 ( ) 0.06 ( ) 0.10 ( ) 0.25 ( ) belüli radiáció D-klád: ( ) 0.47 ( ) 0.76 ( ) 1.10 ( ) 2.69 ( ) kládok szétválása D-klád: a 2-3 kládon ( ) 0.13 ( ) 0.19 ( ) 0.28 ( ) 0.71 ( ) belüli radiáció D-klád: a 2-4 kládon ( ) 0.11 ( ) 0.17 ( ) 0.24 ( ) 0.60 ( ) belüli radiáció fluviatilis: ( ) 0.13 ( ) 0.18 ( ) 0.29 ( ) 0.70 ( ) Észak-európai kládon belüli radiáció a molekuláris óra rátája (%/millió év) 28.6 ( ) 2.23 ( ) 1.50 ( ) 1.00 ( ) 0.41 ( ) * Miután jó okunk van feltételezni, hogy az órafüggõ Bayes analízis helytelenül pozicionálja a 2-6 kládot, a 2-6 klád szétválására kapott értékeket a késõbbiekben figyelmen kívül hagytuk. A: Kalibrációs pont a T. fluviatilis Észak-európai kládjának radiációja (normál prior, átlag=0.01 my, S.D.=0.001); B: A molekuláris óra rátája normál priorként rögzítve (átlag=0.023, S.D.=0.001); C: A molekuláris óra rátája normál priorként rögzítve (átlag=0.015, S.D.=0.001); D: A molekuláris óra rátája normál priorként rögzítve (átlag=0.01, S.D.=0.0015); E: Kalibrációs pont a T. fluviatilis/t. prevostianus szétválás (normál prior, átlag=12 my, S.D.=1). A priorokat vastag betûs szedés, a becsült idõk közül a legvalószínûbbeket kiemelés jelöli. 10

11 Filogenetikai vizsgálatok védett puhatestûeken idõnként fel-felbukkan a tipikus danubialis forma is, mintha csak a danubialis hosszú távú migrációval rendszeresen el-eljutott volna ide, ám talán éppen a két forma közeli rokonsága miatt tartósan nem tudott megmaradni. A D-klád szétválását mintegy 0,5-1,1 millió év közé becsüljük, ekkor feltehetõen az mv4 jelû haplotípus lehetett a Balkánon (a Szávában és talán a Drávában is) elterjedve, és ez kolonizálhatta az észak-adriai vízgyûjtõt. Ez az idõbecslés összhangban van azzal az elmélettel, mely szerint a danubialis valamikor a pleisztocénben az Idrjica mederváltása révén került át Észak-Itáliába (az Idrjica egykoron a Száva, ma az Isonzo vízrendszerének része). Az Isonzóba átjutott populáció ezt követõen szétterjedt az észak-adriai vízgyûjtõ más vizeibe is, és az eredeti vonaltól függetlenül evolválódott tovább (2-4 klád). A Balkánon maradt 2-3 klád struktúrája még egy további allopatrikus fragmentáció jeleit is mutatja: kimutatható egy, jelenleg a Dráva rendszerében (1-4) és egy, jelenleg a Duna felsõ szakaszán (1-3) elterjedt klád. Ez a fragmentáció az idõbecslés szerint kb. a holocén elejére, tehát jóval késõbbre tehetõ, mint a 2-1 és a 2-2 kládok szétválása. A prevostianus (P-klád) filogenetikai fája egy nagyjából egy idõben végbement allopatrikus fragmentáció jeleit mutatja, aminek az idejét 0,3-0,9 millió évre becsüljük. Az idõbecslés itt összhangban van a paleontológiai adatokkal, melyek szerint a prevostianus mintegy 0,6 millió évvel ezelõtt hirtelen eltûnt a Pannon-medence folyóiból. Valószínûleg az mv1 lehetett a legelterjedtebb haplotípus akkoriban, amikor feltehetõen az egyik glaciálisban a klímaváltozás kiszorította (kipusztította) a fajt a pannon folyókból. Néhány populáció azonban fenn tudott maradni meleg vizû forrásokban, amelyek ettõl kezdve izoláltan eltérõ mutációs rátával fejlõdtek, kialakítva mára a prevostianus elkülönült kládjait (2-5, 2-6 és 2-7). Feltételezésünk szerint nagyjából ez idõ tájt a prevostianus mv1 haplotípus introgresszió révén átjuthatott a danubialisba. Ez a két faj kontaktzónájában, valahol a Pannon-medence és a Balkán határán történhetett, majd nem sokkal ezután az új mitokondriumot hordozó danubialis két elkülönülõ refúgiumba szorult vissza. A két, mv1 haplotípusból levezethetõ danubialis-vonal jelenlegi vikarizáló elterjedése legalábbis erre enged következtetni, a 2-1 klád, beleértve a 2-8-at is, a Száva és a Dráva rendszerében, a 2-2 klád pedig a Dunában és egyes kisebb mellékfolyóiban terjedt el, tehát az egyik refúgium valószínûleg a Száva rendszerében, a másik pedig valahol az Al-Dunán lehetett. Persze az sem kizárható, hogy elõbb a danubialis visszaszorult a fenti refúgiumokba, és csak azután történt meg a két helyen külön-külön az introgresszió. A végeredmény azonos: az mv1 haplotípus a két danubialisrefúgiumban és a forrásokban rekedt prevostianus-populációkban egymástól független vonalakon fejlõdött tovább. Az al-dunai refúgiumban kialakult a TDI haplotípus, a szávaiban pedig a TDKZ. A fluviatilis F3 klád radiációja alapján kalibrált idõbecslések szerint jó okunk van feltételezni, hogy a 2-1 és 2-2 kládokon belüli szétválások (azaz a központi TDI és TDKZ haplotípusok körül 1-2 mutációnyira lévõ kisebb elterjedésû haplotípusok kialakulásai) minden bizonnyal holocénkori események voltak. A pleisztocén végén, az után, hogy a klíma megváltozásával a pannóniai folyókban az életfeltételek újra alkalmassá váltak a Theodoxus újbóli megtelepedésére, az aldunai (2-1) klád kezdte areaexpanzióval újrakolonizálni a Duna felsõ szakaszát és annak mellékfolyóit. A Tiszába, úgy tûnik, nem tudott behatolni. Ennek okai pillanatnyilag nem teljesen világosak, de elképzelhetõ egy olyan magyarázat, hogy a szilárd aljzat hiánya miatt nem tudott átjutni a Tisza alsó szakaszán. A Lozekia/Kovacsia csoport Elterjedés A Kovacsia kovacsi eredeti nevén Hygromia kovacsi a hazai puhatestû-fauna legkésõbb felfedezett és leírt faja ben, a Doboz melletti Marói-erdõben találta meg elsõ populációját Kovács Gyula békéscsabai malakológus, amelyet akkor még a Lozekia transsylvanica akkori nevén Hygromia transsylvanica fajhoz tartozónak véltek. Csak 1972-ben lett leírva, miután a dobozi példányokon végzett ivarszerv-anatómiai vizsgálatok nyilvánvalóvá tették, hogy egy addig ismeretlen új fajról van szó. Bizonyított elõfordulása egészen a közelmúltig csak Magyarországról, Békés megye néhány pontjáról volt ismert. Bár a Bihar-hegységbõl már korábban is kerültek elõ Kovacsia kovacsi-szerû héjak, anatómiai és molekuláris bizonyíték hiányában a faj esetleges romániai elõfordulása mind ez idáig kérdéses volt. Ennek következtében a Kovacsia kovacsit egészen a közelmúltig a Fekete- és a Fehér-Körös egykori árterén kialakult és azon belül elterjedt pannon endemizmusnak tartották. Többek között ennek köszönheti, hogy 2001-ben fokozottan védett fajjá nyilvánították. A Kárpát-medencei puhatestûek állatföldrajzának ismeretében azonban szokatlannak tûnt, hogy az Alföldön, különösen egy ennyire szûk területen endemikus szárazföldi csigafaj éljen, ezért feltételeztük, hogy a hazai Kovacsia kovacsi populációk eredetét és rokonságát a Carpathicumban, leginkább az Erdélyi-szigethegységben kell keresnünk. Elterjedésének feltérképezése céljából indított gyûjtõútjaink során várakozásunknak megfelelõen az Erdélyi-szigethegység nyugati oldaláról, a Zárándi-hegység, a Királyerdõ és a Béli-hegység számos pontjáról elõkerült. Viszont nagy meglepetésünkre két addig a Lozekia transsylvanica fajhoz tartozónak gondolt zempléni populációról (Kishuta: Kõkapu, Rostalló) is azt mutatta ki a DNS-vizsgálat, majd az ivarszerv-anatómia is megerõsítette, hogy azok a Kovacsia kovacsi fajhoz tartoznak. Ez alapján feltételezhetõ, bár még a késõbbiekben megerõsítésre szorul, hogy a többi zempléni transsylvanica-adat is erre a fajra vonatkozik, illetve hogy areája átnyúlik szlovák területre is. A Lozekia transsylvanica fõ areája a Déli-Kárpátok területén a Bánáttól a Fogarasi-havasokig terjed, Nagysze- 11

12 A KÁRPÁT-MEDENCE ÁLLATVILÁGÁNAK KIALAKULÁSA bennél eléri az Erdélyi-medence szélét, továbbá ismert az Erdélyi-szigethegység északkeleti részérõl (Gyalui-havasok, Tordai-hasadék), amirõl nem tudjuk, hogy az Erdélyiérchegységen és a Ruszka-havason keresztül összefügg-e a fõ areával. A fõ areától távoli, biztosan izolált elõfordulása ismert az Északi-középhegységben a Bükk, a Mátra, a Cserhát és a Medves hegységekben (ez utóbbiban areája szlovák területre is átnyúlik). A Lozekia deubeli elterjedésének központja Brassó környéke, attól északra és keletre a Gyergyói-havasokig és Moldváig, nyugatra pedig a Fogarasi-havasokig fordul elõ. Molekuláris és anatómiai vizsgálatokhoz a következõ helyekrõl használtunk fel anyagokat: K. kovacsi Póstelek; Szabadkígyós; Gyula; Sarkad; Mezõhegyes; Zemplén: Kõkapu, Rostalló; Zárándi-hegység: Troas [Torjás], Soimos [Solymosvár], Rosia Noua [Rósa]; Királyerdõ: Suncuius [Vársonkolyos], Vadu Crisului [Rév]; Bélihegység: Dezna [Dézna], Dumbravita de Codru [Havasdombró], Mierag [Mérág], Suncuis [Belényessonkolyos], Tarcaita [Tárkányka]. L. transsylvanica Bükk: Hór-völgy; Mátra: Oroszlánvár, Galyatetõ; Medves: Siatorska Bukovinka [Sátorosbánya]; Torockói-hegység: Cheile Turzii [Tordai-hasadék]; Erdélyi-medence: Sibiu [Nagyszeben]; Fogarasi-havasok: Talmaciu [Nagytalmács]; Lator-hegység: Ciungetu. L. deubeli Sinaia; Predeal; Busteni; Gyergyói-havasok: Baile Chirui [Kirulyfürdõ], Visafolio [Visszafolyó], Gheorgheni [Gyergyószentmiklós]; Fogarasihavasok: Vidra-tó környéke. Mindhárom faj héja rosszul fosszilizálódik, csak a transsylvanicának van néhány elszórt adata a felsõ-pleisztocénbõl: egri és a Nyitra megyei Bojnic [Bajmóc] melletti elõfordulása mutatja, hogy a Riss-Würm interglaciálisban a mostaninál szélesebb területen lehetett elterjedve az Északi-Kárpátokban. 40. ábra Lozekia/Kovacsia mintavételi helyek, valamint a fajok és fõbb kládjaik elterjedési területe a vizsgált minták alapján. Félig telt kör: K. kovacsi, üres négyzet: L. transsylvanica, üres háromszög: L. deubeli. Morfológia A Lozekia transsylvanica és a Kovacsia kovacsi fajok háza igen hasonló, gömbded-kúpos, eléggé kiemelkedõ tekerccsel (szélesség: 5-7 mm, magasság 4-5,7 mm), 41/2-5 kanyarulatból áll. Héja vékony, törékeny, áttetszõ, fénytelen, szarubarna, sûrûn egymás mellett sorakozó pikkelyekkel fedett, amelytõl a héj fénymikroszkóp alatt szemcsésnek látszik. A kanyarulat pereme kezdetben tompán szögletes, és ahogy a héj növekszik, fokozatosan megy át lekerekítettbe. A szájadék elõtt az utolsó kanyarulat kissé lehajlik. A szájadék széles tojásdad-hold alakú, majdnem kerek, szájadékpereme éles, ajakduzzanata nincs, csak a köldök táján hajlik kissé ki. Köldökük szûk, amelyet a kihajló szájadékperem részben elfed ( ábra). A Lozekia transsylvanica pikkelyei a másik fajhoz képest általában hosszabbak, ritkábban állók és oldalnézetben inkább háromszög alakúbbak ( ábra), a Kovacsia kovacsi pikkelyei valamivel rövidebbek, sûrûbben állók és oldalnézetben körszelet-alakúbbak (51. ábra). Ezzel együtt azonban mind a héjak, mind a pikkelyek morfológiai bélyegeiben olyan jelentõs intraspecifikus variabilitás mutatkozik, ami miatt nem alkalmasak a két faj biztos elkülönítésére. A Lozekia deubeli héja nagyobb, aránylag laposabb (szélesség: 7-9 mm, magasság: 5-6 mm), vöröses-barnább színezetû, 5-51/2 kanyarulatból áll, amelyek pereme kezdetben erõsen szögletes, s bár az utolsó kanyarulat felé fokozatosan kerekedik, de még a szájadék mögött is kissé tompán szegletes marad ( ábra). Pikkelyeinek mérete és sûrûsége attól függõen változik, hogy a kanyarulat melyik részén helyezkednek el, közvetlenül a varrat alatt akár háromszor-négyszer is rövidebbek és lényegesen sûrûbben állók a pikkelyek, mint a kanyarulat alsóbb részein (52. ábra). Ez a tulajdonság olykor megfigyelhetõ a másik két faj egyes példányain is, de sosem ennyire szembetûnõ. Mindhárom faj közös jellemzõje a pikkelyek között megfigyelhetõ szabályos harántstruktúra (53. ábra). Ivarszervük felépítése alapján a transsylvanica és a deubeli állnak közelebb egymáshoz, legfontosabb közös vonásaik a következõk: nyíltasakjuk vastag (a vagina vastagságának kb. kétszerese) és aszimmetrikus (a nyilat tartalmazó fõtasak nagyobb, mint az üres melléktasak); a nyíl hosszúkás és kissé hajlott; két nyálkamirigyük van, tehát a torkolati nyílások száma mindig kettõ, de a nyálkamirigyek már nem sokkal a beszájadzási pont fölött elágaznak; az epiphallusz belsõ fala nem végig redõzött; a péniszpapilla egyszerû felépítésû. A tipikus transsylvanica (Nagyszeben) és a tipikus deubeli (Brassó környéke) közti legfontosabb különbségek, hogy a transsylvanica péniszpapillája redõzött, a deubeli péniszpapillája sima; a transsylvanica flagelluma hosszú (kb. akkora, mint az epiphallusz), a deubelié rövidebb; a melléktasaknak a fõtasakhoz viszonyított redukciója a deubelinél még erõteljesebb; továbbá a deubelire jellemzõ a nyíltasak beszájadzásával szemközt a vagina falának a kidudorodása (ún. deubeli-könyök ) ( ábra). Elterjedésének nyugati 12

13 Filogenetikai vizsgálatok védett puhatestûeken szélén, a Fogarasi-havasokban a deubeli fajnak olyan populációi élnek, amelyeknek a héja kisebb, flagelluma pedig hosszabb, mint a tipikus formáé, tehát bizonyos tekintetben a héj- és az ivarszerv morfológiájuk is átmenetet mutat a transsylvanica felé (56. ábra). Miután ezek a populációk a COI-szekvenciáik alapján is jól elkülönülnek a tõlük keletebbre elterjedt tipikus deubeli-populációktól, akár még az egykori õs-transsylvanica fragmentációjakor létrejött önálló vonal képviselõinek is gondolhatnánk õket, ám pillanatnyilag kézenfekvõbbnek tûnik az a magyarázat, hogy ezek olyan hibrid állományok, amelyek a két faj areáinak korábbi átfedésekor jöttek létre. A kovacsi nyíltasakja vékonyabb a vaginánál, két nagyjából azonos méretû egységbõl áll, a fõtasakban a nyíl rövid és egyenes, a melléktasak üres. Négy nyálkamirigyük van, tehát a nyálkamirigyek torkolati nyílásainak száma mindig négy. Elõfordul, hogy egy vagy két nyálkamirigy jóval a beszájadzás fölött villásan elágazik. Az epiphallus ábra Lozekia/Kovacsia fajok héjmorfológiája. 41: L. transsylvanica, syntypus, Hermannstadt. 42: L. transsylvanica, Jungwald. 43: L. transsylvanica, Mátraszentimre. 44: L. transsylvanica, Tordai-hasadék : K. kovacsi, paratypus, Doboz, Marói-erdõ : L. deubeli, Busteni. (Mérce: 3 mm) ábra Lozekia/Kovacsia héjak utolsó és utolsó elõtti kanyarulat tájékának natív SEM felvételei. 49: L. transsylvanica, Galyatetõ. 50: L. transsylvanica, syntypus, Hermannstadt. 51: K. kovacsi, Gyula. 52: L. deubeli, Busteni. (Mérce: 500 µm). 53: L. transsylvanica, Galyatetõ. (Mérce: 100 µm). 13

14 A KÁRPÁT-MEDENCE ÁLLATVILÁGÁNAK KIALAKULÁSA belsõ fala már egészen a visszahúzó izomtól kezdve redõzött. Flagellumuk általában hosszú (még a transsylvanica flagellumánál is hosszabb), de egyes populációknál lehet rövid is (57. ábra). A péniszpapilla bonyolult felépítésû, kidudorodó végét egy sálszerûen rátekeredõ membránréteg burkolja. Élõhely-preferencia A Lozekia fajok leginkább üde erdõkben, patakparti acsalapus-égeres, csalános és magaskórós társulásokban fordulnak elõ, ahol az avar között, kövek és korhadó fatörzsek alatt, illetve a lágyszárú növények fonákján találhatjuk meg õket. Egészen a közelmúltig úgy tûnt, hogy a Kovacsia kovacsi ebben a tekintetben is elüt a másik két fajtól, miután a Körös menti lelõhelyein kimondottan kerüli a hullámtér üde erdeit, kizárólag a gátak mentett oldalán fordul elõ, sõt paradoxnak tûnõ módon ültetett akácosokban és nemesnyárasokban jóval nagyobb egyedszámban található, mint a természetközeli keményfa-ligeterdõkben. Újabb gyûjtéseink némileg árnyaltabbá tették a csoport biotóppreferenciájáról alkotott képet. Kimutattuk a Lozekia transsylvanicát is szárazabb élõhelyekrõl, Nagyszebennél például akáccal elegyes tölgyesben, a Cserna völgyében pedig sziklagyepben gyûjtöttük. Az is világossá vált, hogy a Kovacsia kovacsi sem kerüli az üde élõhelyeket, bár a Béli-hegységben voltak száraz akácosban és sziklagyepben is populációi, de a Zemplénben is és az ábra Lozekia/Kovacsia fajok ivarszervei. 54: L. transsylvanica, Nagyszeben. 55: L. deubeli, Predeal. 56: L. deubeli, Fogarasi-havasok, Vidra-tó környéke. 57: K. kovacsi, Vársonkolyos. a: atrium, bc: párzótáska (bursa copulatrix), bh: nyíltasak (bursa hastae), dh: hímnõs vezeték (ductus hermaphroditicus), ep: epiphallus, fl: flagellum, ga: fehérjemirigy (glandula albuminea), gm: nyálkamirigy (glandula mucosa), mrp: péniszvisszahúzó izom (musculus retractor penis), p: pénisz, pp: péniszpapilla, spo: spermoviductus, v: vagina, vd: spermavezeték (vas deferens). 14

15 Filogenetikai vizsgálatok védett puhatestûeken Erdélyi-szigethegységben is többnyire nedves erdõkben és patakpartokon találtuk. Ma már azt gondoljuk, hogy mindhárom faj alapvetõen üde élõhelyeket kedvelõ erdõlakó (silvicol) faj, de megvan bennük a képesség, hogy kényszerû helyzetekben szárazabb élõhelyeket is el tudjanak viselni, sõt olykor még szokatlan mértékû gradációra is képesek legyenek. A kovacsi a Körös hullámterét sem annak üdesége miatt kerüli, hanem feltehetõen azért, mert a jelenlegi hullámtéren belül igen rapszodikusan változik a vízszint, áradáskor a gátak közé szorított folyó az egész hullámteret megtölti, és a víz nagy sebességgel áramlik, amit sok puhatestûfajjal együtt a kovacsi sem képes tolerálni. Abban az idõben, amikor a kovacsi a Körösök menti területet kolonizálta, a keményfás ligeterdõk jól megfelelhettek az életfeltételeinek, ezt jelzi az is, hogy mai elterjedése nem terjed túl az egykori ártér határain. A ligeterdõk üdék voltak, mert a szabályozatlan folyó akár évente többször is elöntötte az árterét, de ilyenkor szétterült, a medertõl távolabb nem áramlott nagy sebességgel, és mindig maradhattak olyan száraz részek, ahová a csigák viszsza tudtak húzódni. A folyószabályozás után a gát mentett oldalára került, egykor üde ligeterdõk kiszáradtak, felszakadoztak, néhol szikesedés is beindult. Ezekben a kovacsi állományai erõsen megritkultak, sok helyütt el is tûntek. Ráadásul az Alföldön gyakori, hogy a vegetációs idõszakban egyszerre csak kis mennyiségû csapadék hullik, ilyenkor a csapadék nagy része fennakad a tölgyes jól rétegzett lombozatán, utána a száraz tölgyesekre jellemzõ vastag, összetapadt avarréteg a következõ akadály, ami megnehezíti, hogy a csapadék elérjen a talajszintig. Az ültetett akácosok és fõleg a nyárasok lombozata ritkább, avarjuk lazább, ezekben a csapadék könnyebben eljut a talajig, ráadásul a nyitottabb erdõkben a hajnali harmatképzõdés is jelentõsebb. Emiatt az egykori ártér keményfás ligeterdei még a telepített erdõknél is szárazabbak, vagyis az a jelenség, hogy a kovacsi jóval nagyobb abundanciában fordul elõ az ültetett erdõkben, az éppen az üdébb biotóphoz való vonzódását mutatja. Lozekia taxonba nem besorolható. Ezért Varga és Pintér a Hygromia név megtartása mellett érveltek. Nordsieck viszont a Lozekia taxont genusszintre emelte, a kovacsi fajt egy új, monotipikus genusba (Kovacsia) helyezte, és ezeket az alcsalád többi tribusától Lozekia-Gruppe néven különítette el. A legújabb Fauna Europaea rendszer ennél még tovább megy, megtartja a két genust, és azokat csak alcsalád (Hygromiinae) szinten tekinti rokonnak. A Bayes-analízissel szerkesztett COI-fa a három faj kölcsönösen monofiletikus elkülönülését mutatja, ezen túlmenõen mindhárom faj két-két intraspecifikus kládra válik szét (58. ábra). A COI-gén-szekvenciák neutrális eltérése a fajok között, de még a fajokon belül is igen jelentõs, ugyanakkor az aminosav-szekvenciák feltûnõen hasonlítanak. Fehérjeszinten azonos az összes kovacsi, illetve a transsylvanica t-1 kládjának két haplotípusa (HTD2 és HTT), amelytõl egy aminosavban tér el a transsylvanica t-2 klád, és egy másik aminosavban a deubeli d-2 klád haplotípusai által kódolt fehérje. Ez utóbbitól további egy aminosavban tér el a deubeli d-1 klád legbazálisabb haplotípusainak (HTY2, HTB1) fehérjéje. Mind a nukleotidszubsztitúciók átlagos száma (Dtranssylvanica deubeli: 12,6%, Dkovacsi deubeli: 14,4%, Dkovacsi transsylvanica: 13,7%), mind a haplotípus-hálózat azt mutatja, hogy a deubeli és a kovacsi esnek a legtávolabb egymástól Filogenetika A három faj rendszertani helyzetét más-más szerzõk eltérõen ítélték meg. Kimakowicz a deubelit a transsylvanica egy változataként írta le, és Soós is így tárgyalta a Kárpátmedence Mollusca-faunájáról írt monográfiájában. Varga az ivarszervek morfológiája alapján a két taxon fajszintû szétválasztása mellett érvelt, ugyanakkor a román irodalomban a deubelit még a múlt század végén is a transsylvanica szinonimájaként kezelték. Ellentmondásos a három faj tágabb értelemben vett rokonságának a megítélése is. Hudec, még a kovacsi felfedezése elõtt, a nyíltasak aszimmetrikus felépítése alapján Lozekia néven új subgenust különített el, és a transsylvanica fajt ebbe tette át. A kovacsi fajt leíró Varga és Pintér véleménye szerint a kovacsi közeli rokona a transsylvanica és a deubeli fajoknak, de miután azoktól éppen a nyíltasak felépítése révén különül el, a 58. ábra Lozekia/Kovacsia fajok órafüggetlen Bayes-analízissel felállított COI-fája. A gyökér helyzete Trichia lubomirskii, Trichia bielzi és Hygromia cinctella külcsoporttal lett meghatározva. 15

16 A KÁRPÁT-MEDENCE ÁLLATVILÁGÁNAK KIALAKULÁSA (59. ábra). A nukleotidszubsztitúciók alapján a transsylvanica és a deubeli, az aminosav-szekvenciák alapján és a Bayes-analízissel viszont a transsylvanica és a kovacsi kerül közelebb egymáshoz. Mint korábban láttuk, az ivarszerv anatómiája alapján a transsylvanica és a deubeli, a héjmorfológia alapján viszont a transsylvanica és a kovacsi tûntek közelebbi rokonoknak. Tágabb kontextusban vizsgálva a törzsfát az is látszik, hogy a három faj nemcsak lényegesen közelebb áll egymáshoz, mint a külcsoportként figyelembe vett többi fajhoz (Helix pomatia, Trichia lubomirskii, Trichia bielzi és Hygromia cinctella), de a Hygromia cinctella fajjal még csak nem is képeznek monofiletikus csoportot. A COI-szekvenciák alapján úgy tûnik, hogy három önálló, de közeli rokon fajjal állunk szemben. Bár a kovacsi ez alapján a gén alapján nem különül el a másik két fajtól, az ivarszerv felépítése alapján mégis indokolható a külön genusba való besorolása. A jelenlegi morfológiai és molekuláris ismeretek alapján tehát úgy gondoljuk, hogy a csoport tényleges rendszertani kapcsolatait Nordsieck rendszere közelíti leginkább, ha ezt a késõbbiekben más gének is megerõsítik, akkor a Hygromiinae alcsalád egy esetleges jövõbeni revíziójakor indokolt lehet egy tribus leírása a Lozekia/Kovacsia csoport számára. Filogeográfia A fajokon belüli kládok földrajzilag és a deubeli esetében morfológiailag is jól elkülönülnek egymástól. A deubelinek az a kládja (d-2), amelynél a héjmorfológia és az ivarszerv-anatómia is több tekintetben is átmenetet mutat a transsylvanica felé, és amelyik a haplotípushálózat alapján is közelebb esik a transsylvanicához, a 59. ábra Medián-összekötõ módszerrel készült haplotípus-hálózat Lozekia/Kovacsia COI-gén-szekvenciák alapján. Az ábrán látható szerkezet alapvetõen megegyezik az összes mutáció figyelembevételével szerkesztett hálózatéval, de a könnyebb áttekinthetõség érdekében itt csak a kodonok 1. és 2. pozícióiban bekövetkezett mutációkat ábrázoltuk, emiatt összevonva szerepelnek azok a haplotípusok, amelyek csak a kodon 3. nukleotidjában tértek el egymástól. A körök mérete arányos az összevont haplotípusok számával, a fekete pontok hiányzó vagy kihalt haplotípusokat reprezentálnak. Fogarasi-havasokban él. A másik deubeli klád (d-1) Brassótól keletre a Gyergyói-havasokig terjedt el (17. ábra). A transsylvanica szélesebb elterjedést mutató t-2 kládjának populációit találtuk az Északi-középhegységben, az Erdélyi-szigethegység keleti peremén (Tordai-hasadék), valamint a Déli-Kárpátokban. A másik transsylvanica klád (t-1) egyelõre csak Nagyszeben és a Vöröstornyiszoros környékérõl került elõ. A kovacsi k-1 jelû kládja az Erdélyi-szigethegység északi részén (Királyerdõ), a másik (k-2) a szigethegység déli részén (Zárándi-hegység, Bélihegység), a Körösök mentén és a Zemplénben fordul elõ. A három faj kialakulásával és elterjedéstörténetével kapcsolatban a molekuláris adatokat is figyelembe véve az alábbi hipotézist állítottuk fel. Feltételezésünk szerint a fajok közös õse valahol a Déli-Kárpátok nyugati részén alakult ki. Ezt a jelenlegi elterjedésmintázaton túl az is alátámasztani látszik, hogy a Kárpátok és a Balkán határán fekvõ Bánáti alrégió (1. ábra: II.4.) ismert endemikus gócpont, szûk elterjedésû saját endemizmusai mellett számos szélesebb elterjedésû fajnak is erre a területre esik a géncentruma. Miután sok más faj példáján is megfigyelhetõ a Bánát és az Erdélyi-szigethegység nyugati oldala illetve a Bánát és Brassó környékének a kapcsolata, feltehetõen ez az õs-transsylvanica is eljutott keleti irányban Brassó környékéig, északi irányban pedig az Erdélyi-szigethegységig. Ezután az õs-transsylvanica areája fragmentálódott, és ettõl kezdve a három faj külön-külön fejlõdött tovább. A mai elterjedésmintázat nyilvánvalóan az areák fokozatos kiterjedése (range expansion) és visszaszorulása, illetve esetenkénti nagy távolságra történõ ugrásszerû terjedések (long distance colonization, jump dispersal) és kihalások hatására alakult ki ilyenné. Az egyes interglaciálisok idején a jelenleginél nagyobb lehetett az areájuk, vagy legalábbis kolonizálhattak más területeket is, erre utalnak a pélmonostori és bajmóci pleisztocén korú fossziliák. A számunkra leginkább érdekes kérdés a hazai kovacsi és transsylvanica állományok lehetséges eredete. Sajnos a szétválási idõk meghatározására nem vállalkozhatunk, mert egyrészt hiányoznak a kalibrációs pontként figyelembe vehetõ fosszilis adatok, másrészt tudjuk, hogy a Helicoidea szuperfamília fajainál még a más gerinctelenek mitokondriális génjeinél alkalmazott, és erõsen kritizálható 1-2,5%/millió éves fix szubsztitúciós ráta sem alkalmazható. A Körös egykori árterén élõ kovacsi-állományokról mind a földrajzi közelség, mind a genetikai rokonság alapján joggal tételezzük fel, hogy a Béli-hegységben élt õsöktõl eredeztethetõk. Genetikai hasonlóságuk alapján azt feltételezzük, hogy ez idõben egy nem túl régi pleisztocén végi vagy akár holocénkori esemény lehetett. A terjedés vélhetõen areaexpanzióval történt, hiszen a szigethegység nyugati lejtõinek erdei egészen a közelmúltig összefüggtek a Körösök ártéri erdeivel. A zempléni állomány ugyanennek a vonalnak a további terjedése következtében jött létre. Nem teljesen elképzelhetetlen, hogy a kovacsi a Béli-hegységtõl végig a Körös és a Tisza ártere mentén areaexpanzióval ért el a Zemplénig, majd az areája 16

17 Filogenetikai vizsgálatok védett puhatestûeken feldarabolódott, de az is lehet, hogy a zempléni állomány inkább egy hosszú távú ugrásszerû kolonizáció eredményeként alakult ki. Bármelyik forgatókönyv szerint történt is a Zemplén kolonizációja, az biztos, hogy ez egy nagyon friss, holocénkori esemény kellett hogy legyen, hiszen a Körösök mentén elõforduló egyik haplotípus (KKM) van a Zemplénben is. A transsylvanica jelenlegi elterjedésmintázata és a genetikai rokonságok alapján úgy tûnik, hogy egy Déli- Kárpátokból származó populáció lehet a szigethegység északkeleti oldalán élõ állományok õse (hosszú távú kolonizáció vagy összefüggõ area?), az Északi-középhegységet benépesítõ kolónia pedig ez utóbbiak közül került ki. Fosszilis adatok alapján ismert, hogy a Riss-Würm interglaciálisban a transsylvanica élt a Bükkben, ez azonban önmagában nem bizonyítja, hogy a mostani északi-középhegységbeli állományok interglaciális reliktumok lennének, hiszen az is lehet, hogy a transsylvanica a Würm során kipusztult az akkori interglaciális fauna többi fajával együtt (pl. Drobacia banatica), majd a holocénben újra megtelepedett. A tordai és az északi-középhegységbeli transsylvanica genetikai távolsága valamivel nagyobb, mint amit a Béli-hegységbeli és a hazai kovacsi esetében tapasztaltunk. Miután a szétválási idõkkel kapcsolatban itt sem tudunk semmi biztosat mondani, nem zárhatjuk ki, hogy a tordai és az északi-középhegységbeli vonal már a Würm elõtt szétvált. Az viszont biztos, hogy a Medvesbõl, a Bükkbõl és a Mátrából származó populációk között alig van variancia, ami annak a jele, hogy szétterjedésük nagyon friss esemény, lényegesen késõbbi, mint a tordai vonaltól való szétválásuk. Ez vagy azt jelenti, hogy az északi-középhegységbeli állomány interglaciális reliktum, és a kis genetikai változatossága egy nemrégiben bekövetkezett palacknyak-hatás következménye, vagy pedig azt, hogy az Északi-középhegység kolonizációja friss, holocénkori esemény volt. Miután a szigethegység északkeleti része részben a Szamos vízgyûjtõjéhez tartozik, jó okunk van feltételezni, hogy az Északi-középhegység kolonizációja a Szamos-Tisza útvonal mentén történt. Nem zárható ki sem az areaexpanzió, sem a hosszú távú kolonizáció lehetõsége. Az eredmények természetvédelmi vonatkozásai A Theodoxus danubialis és Theodoxus prevostianus fajok közeli rokonságát a fosszilis és recens héjak, a radula és az operculum morfológiája, valamint a mitokondriális COI és a magi 28S gének alapján szerkesztett fák egyaránt alátámasztják. Miután az operculum és a radula morfológiájában néhány apró eltéréstõl eltekintve nincs olyan stabil karakter, ami alapján a két faj elválasztható lenne, a 28S gén pedig nem alkalmas ilyen kis filogenetikai távolságok vizsgálatára, nem tudjuk egyértelmûen cáfolni Bunje hipotézisét, miszerint a COI-fa a prevostianus helytelen rendszertani megítélése miatt parafiletikus. Ennek ellenére úgy gondoljuk, hogy többszöri introgressziókat feltételezve lehet realisztikusabb magyarázatot is adni a COI-fa parafiletikusságára. A kérdés végleges eldöntése különösen a faj természetvédelmi jelentõsége miatt lenne fontos, ebben nagyobb mutációs rátájú magi génszakaszok vizsgálata is segíthet. Addig viszont mindenképpen önálló fajként kell kezelni a Theodoxus prevostianust. A COI gén diverzitása és a fosszilis leletek alapján azt feltételezzük, hogy a prevostianus máig fennmaradt fõ génvonalai mintegy 0,6 (0,3-0,9) millió évvel ezelõtt váltak szét, és azóta evolválódnak önállóan. Ez a mély szétválás indokolja, hogy önálló természetvédelmi entitásként kezeljük õket. Ez esetben a hazai prevostianus-populáció nem csupán egy ritka faj néhány megmaradt populációinak egyike, hanem az általunk 2-5 kládként jelölt génvonal utolsó képviselõje is egyben. A faj számos populációjának közelmúltbeli kihalása jelzi, hogy a faj rendkívül sérülékeny. Ráadásul a kácsfürdõi élõhelye a Bükki Nemzeti Park területén kívül, magánterületen fekszik, ahol fennmaradása gyakorlatilag a terület tulajdonosának a jóindulatán múlik, ezért az egyetlen hazai prevostianus-populáció nagyon komoly veszélyben van. Mivel egykori lelõhelyei között vannak olyanok, ahol az életfeltételei még mindig, illetve már újra megvannak (mint pl. Tatán vagy Miskolctapolcán), érdemes lenne a faj túlélése érdekében komolyan megfontolni a visszatelepítését ezekre a helyekre. A Lozekia transsylvanica fajon belül a COI gén alapján két kládot különböztettünk meg, a hazai génvonal a Déli- Kárpátokban és az Erdélyi-szigethegység keleti oldalán is elõforduló t-2 kláddal mutat szoros rokonságot. A hazai populációk viszonylag alacsony genetikai variabilitása azt jelzi, hogy azok a holocén során terjedtek szét az Északiközéphegységben. A hazai génvonal akár egy olyan Riss- Würm interglaciális reliktum, amely egy holocénkori palacknyak-hatás nyomait viseli magán, akár holocénkori kolonizáció eredménye, a fõ areától való nagy földrajzi távolsága ellenére nem indokolt a hazai állományokat önálló természetvédelmi entitásként kezeli, vagyis a faj jelenlegi konzervációbiológiai megítélése és védettsége megfelelõ. Elõzetes feltételezésünket igazolva sikerült kimutatnunk a Kovacsia kovacsi populációit az Erdélyi-szigethegység több pontjáról is (Zárándi-hegység, Béli-hegység, Királyerdõ), ez alapján úgy gondoljuk, hogy a Kovacsia kovacsi a szigethegység területén kialakult kárpáti endemizmus, elterjedésének a súlypontja a szigethegység nyugati részén és az azzal határos alföldi területeken van. A COI gén alapján a szigethegységbeli populációk két mélyen szétvált, északi (Királyerdõ) és déli (Béli-hg., Zárándi-hg.) elterjedésû kládhoz tartoznak. A Körös menti állományok a Béli-hegységbeli klád felsõ pleisztocénkori vagy holocénkori areaexpanziója révén jöttek létre. Váratlan eredmény, hogy sikerült kimutatnunk a faj egy izolált elõfordulását a Zempléni-hegységben is, pontosabban a DNS- és az anatómiai vizsgálatok alapján két, korábban Lozekia transsylvanicának gondolt zempléni populációról kiderült, hogy azok valójában a Kovacsia kovacsi fajhoz 17

18 A KÁRPÁT-MEDENCE ÁLLATVILÁGÁNAK KIALAKULÁSA tartoznak. Ez alapján azt feltételezzük, hogy a kovacsi fordul elõ a Zemplén egész területén, ahol valószínûleg szlovák területre is átterjed. A Körös mentén élõ és a zempléni állományok nagyon szoros kapcsolatot mutatnak, genetikai hasonlóságuk alapján feltételezhetõ, hogy néhány ezer évnél nem régebben válhattak szét, vagyis a zempléni állomány holocénkori kolonizáció révén jött létre. A faj konzervációbiológiai jelentõségén nem változtatott az, hogy módosult az állatföldrajzi megítélése, hiszen változatlanul korlátozott elterjedésû endemizmusnak számít. Az újonnan felfedezett populációk alapján felül kellett vizsgálnunk a faj biotóppreferenciájával kapcsolatos korábbi elképzeléseinket is. Most már úgy látjuk, hogy a Kovacsia kovacsi, bár megvan benne a képesség, hogy szárazabb körülményeket is el tudjon viselni, alapvetõen üde biotópokat kedvelõ, erdõlakó faj. A faj megtelepedésekor a Körösök akkori árterén még lényegesen más volt az erdõk állapota, mint most, a folyószabályozás utáni szárazodás a faj életfeltételeit kedvezõtlen irányba változtatta meg ennek jeleként értékeljük azt, hogy az eredeti keményfa-ligeterdõ foltok helyett inkább az ültetett erdõket preferálja, és ezért a Körösök mentén élõ állományai feltehetõen sérülékenyebbek is, mintha optimálisabb életfeltételek között élnének. Miután populációinak jelentõs része továbbra is Magyarország területérõl ismert, ráadásul a másik két országban a védelme még nem megoldott, a faj megõrzésével kapcsolatban a magyar természetvédelemnek továbbra is globális felelõssége van. Miután ennek a fokozottan védett fajnak az újonnan felfedezett zempléni élõhelyei a faj életfeltételei szempontjából optimálisabbaknak tûnnek, nagyon fontos szerepük lehet a faj hazai megõrzésében, emiatt is fontos lenne a Kovacsia kovacsi zempléni állományainak alapos felmérése és folyamatos monitorozása. Köszönetnyilvánítás Ezúton szeretnénk köszönetet mondani mindazoknak a barátainknak és kollégáinknak akik munkánk során segítségünkre voltak. Dányi Lászlót, Erõss Zoltánt, Hunyadi Andrást, Kiss Mártát, Kontschán Jenõt, Kóra Juditot, Kovács Tibort, Murányi Dávidot, Lennert Józsefet, Páll-Gergely Barnát, Sarkadi Lászlót, Ioan Sîrbut, Jozef Šteffeket, Subai Pétert, Uherkovich Ákost és Váncsa Klárát a terepmunkában, Csõsz Sándort és Gubányi Andrást a fényképek elkészítésénél nyújtott segítségükért, Christian Albrechtet, Krolopp Endrét, Magyar Imrét, Müller Pált, Petró Edét, Thomas von Rintelent, Sólymos Pétert és Szekeres Miklóst pedig hasznos kritikáikért és tanácsaikért illeti köszönet. A kutatást a Nemzeti Kutatás-Fejlesztési Program támogatta, címe: A Kárpát-medence állattani értékei, faunájának gócterületei és genezise; a szerzõdés száma: 3B Irodalom Avise, J. C. (2000): Phylogeography. Harvard University Press, Cambridge, Massachusetts, 447 pp. Avise, J. C. (2004): Molecular Markers, Natural History and Evolution. Sinauer, Sunderland, Massachusetts, 684 pp. Bank, R. (2007): Fauna Europaea: Mollusca, Gastropoda. Fauna Europaea version 1.3, [Letöltve májusban.] Bodon, M. & Giovannelli, M. M. (1995): Sulla sistematica e distribuzione di Theodoxus danubialis (Pfeiffer, 1828) in Italia. Bolletino del Museo Regionale di Scienze Naturali Torino 13: Bunje, P. M. E. (2007): Fluvial range expansion, allopatry, and paralell evolution in a Danubian snail lineage (Neritidae: Theodoxus). Biological Journal of the Linnean Society 90: Bunje, P. M. E. & Lindbergh, D. E. (2007): Lineage divergence of a freshwater snail clade associated with post-tethys marin basin development. Molecular Phylogenetics and Evolution 42: Nordsieck, H. (1993): Das System der paläarktischen Hygromiidae (Gastropoda: Stylommatophora: Helicoidea). Archiv für Molluskenkunde 122: Pintér, L. & Suara, R. (2004): Magyarországi puhatestûek katalógusa hazai malakológusok gyûjtései alapján. In: Fehér, Z. & Gubányi, A. (szerk.): A magyarországi puhatestûek elterjedése II. Magyar Természettudományi Múzeum, Budapest, 547 pp. Sólymos, P. (2004): Magyarország szárazföldi Molluscafaunájának ritkaságon alapuló értékelése és alkalmazási lehetõségei. Természetvédelmi Közlemények 11: Soós, L. (1943): A Kárpát-medence Mollusca-faunája. MTA, Budapest, 478 pp. Varga, A. & Pintér, L. (1972): Zur Problematik der Gattung Hygromia Risso Folia Historico Naturalia Musei Matraensis 1: Varga, A. (1979): On the Genus Hygromia Risso, 1826 (Gastropoda: Helicidae). Annales Historico-Naturales Musei Nationalis Hungarici 71: